CN110257546B - 一个水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali及应用,位于水稻基因组第12染色体4.19–5.03Mbp的区间内,来源于耐盐品种Pokkali的等位基因可以提高水稻苗期耐盐水平,在IR29/Pokkali的RIL群体中耐盐基因簇的3个耐盐基因可分别解释12.8%、14.8%和10.2%的苗期叶片盐害级别、地上茎叶钠离子浓度和地上茎叶钾钠离子浓度比的变异,并获得了紧密连锁的遗传标记RM7619,有望用于新基因水稻耐盐基因簇qST12Pokkali的标记辅助选择育种。
Description
技术领域
本发明涉及一个水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali及应用。
背景技术
水稻是一种中度盐敏感作物,日益加重的土壤盐渍化已经成为制约水稻生产的重要因素。培育适宜于盐碱地种植的水稻耐盐新品种是提高水稻种植面积和产量的有效方法。分子遗传学研究表明,水稻耐盐性是多种耐盐生理生化反应的综合表现,是由多个基因控制的数量性状。
大量研究表明,水稻对盐胁迫的耐性在不同生长发育时期有所不同。其中,幼苗期和生殖生长期是两个盐敏感时期,而种子萌发期和营养生长期植株耐盐性相对较强。因此,大多数研究是针对水稻幼苗期和生殖生长期耐盐性来进行QTL分析的,常用的永久性群体以重组自交系(recombinant inbred lines,RILs)和渐渗系(introgression lines,ILs)为主。迄今为止,已有大量控制水稻耐盐的QTL被鉴定出来,分布于水稻的12条染色体上,其中苗期的耐盐QTL数量约占50%。由于水稻耐盐的复杂性,如此庞大数量的耐盐QTL中已被精细定位或克隆出的QTL数量极少。SKC1是一个位于1号染色体上的第一个被克隆的控制地上部K+含量的主效QTL,其编码一个HKT家族的离子转运蛋白,能将地上部过量的Na+转运回根部,提高水稻耐盐性。Saltol是利用Pokkali/IR29的重组自交系检测到一个控制水稻 Na+、K+含量的主效QTL,精细定位却发现Saltol与SKC1的位置十分接近,都能调控盐胁迫下水稻植株的K+/Na+平衡,故推测Saltol与qSKC1可能编码同一基因,目前Saltol的 MAS育种大大推动了水稻耐盐新品种的培育。DST基因是利用水稻突变体中克隆的一个基因编码C2H2型单锌指蛋白的耐盐基因,其通过直接调控H2O2平衡相关基因来控制气孔关闭,从而增强水稻的耐盐性。最近,一个高盐胁迫下控制水稻种子快速萌发和幼苗建成的候选基因qSE3(编码钾离子转运蛋白OsHAK21),被发现在盐胁迫下促进水稻种子萌发过程中 ABA积累和ABA信号通路基因表达,从而提高种子萌发过程中的耐盐特性。除此之外,通过反向遗传学方法得到的耐盐基因有SNAC1、SNAC2、NAP、ZFP252、ZFP182等。这些基因的定位和克隆有助于我们了解水稻耐盐形成的遗传基础,但其真正在育种实践中成功应用的事例仍十分有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为:如何提供一个水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali及其分子标记方法。
本发明的技术方案为:
水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali,位于水稻基因组第12染色体4.19–5.03Mbp的区间内,该位点的Pokkali等位基因能够显著提高水稻苗期耐盐水平。
基因簇qST12Pokkali的分子标记方法,用特异的PCR引物对RM7619,其正向引物序列为:TCTTGGTATGTATTGGCAGCGAAAGC(SEQ ID No.1),反向引物序列为:AGGATGTGAATGAAGGCGAATGG(SEQ ID No.2),共同PCR扩增带有品种Pokkali血缘的育种材料基因组DNA,如果引物对RM7619扩增出与Pokkali类似的143bp的片段,那么该育种材料含有qST12Pokkali的耐盐等位基因。
基因簇qST12Pokkali或子标记方法应用于水稻育种。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1.qST12Pokkali抗性等位基因来源于耐盐种质Pokkali,多个耐盐指标均可鉴定到qST12Pokkali,且Pokkali已经被反复验证是具有强耐盐性地方品种,因此其在耐盐育种领域具有较高的价值。
2.通过新基因标记的筛选,能够显著获得提高苗期耐盐水平的育种材料。
3.本发明的分子标记方法可用于苗期耐盐育种群体的基因型选择,通过多个耐盐指标相互佐证,有效地鉴别带有该基因的耐盐个体,便于及时的杂交转育,加快育种进程。
附图说明
图1利用与耐盐基因簇qST12Pokkali紧密连锁的分子标记RM7619经PCR扩增和3%琼脂糖电泳从IR29/HD68F2群体鉴定出双亲本纯合基因型两组个体的茎叶钠离子浓度表现。
图2利用与耐盐基因簇qST12Pokkali紧密连锁的分子标记RM7619经PCR扩增和3%琼脂糖电泳辅助鉴定IR29/HD68F2群体的标记基因型其对应的耐盐表型(1-29为随机选取的29个F2个体;M为DNA Ladder;P1为耐盐亲本Pokalli;P2为盐敏感亲本IR29;a为耐盐亲本带型,分子量为143bp,b为感盐亲本带型,分子量为179bp,同时带有a和b两条带型的为杂合型)。
具体实施方式
(一)耐盐新基因的连锁定位
1.供试材料
利用盐敏感品种IR29和引种自斯里兰卡的耐盐地方品种Pokkali杂交,收获杂种一代自交种子并采取多次单粒传手段形成148株系的重组自交系群体。
2.DNA提取及基因型分析
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法,对新本、各单株分别提取全基因组 DNA。选用基于本实验室3K种质资源重测序获得高密度SNP数据构建的Rice56K SNP芯片(56,897个均匀分布于水稻12条染色体上SNP标记)开展亲本、RIL群体的基因型鉴定。
3.连锁图谱构建及QTL定位
经过滤后,14470高质量均匀分而的多态SNP被转化成1467个bin基因型,bin的平均长度为255.7Kb,长度范围为50Kb至3.95Mb。采用JoinMap 4.0(Van Ooijen,2006)构建bin遗传图谱,1467个bin基因型构建的水稻遗传图谱长度为1680.9cM。
采用MapQTL 6.0(Van Ooijen,2009)软件包进行耐盐QTL定位。根据各后代单株的bin 基因型及其对应的耐盐相关性状表型数据按相应格式输入,在multiple QTL model(MQM)下,以LOD 3.0和95%的置信区间分析耐盐QTL区间、相关标记及其效应值。
筛选效应较大的主效基因位点。我们共获得了23个影响苗期叶片盐害级别和钠钾离子浓度等相关性状的主效QTL,其中位于第12染色体短臂4.19–5.03Mb区间定位到1个同时影响水稻苗期叶片盐害级别(SIS)、地上茎叶钠离子浓度(SNaC)和钾钠离子浓度比(SKNa)的位点qST12Pokkali。该位点来自耐盐种质Pokkali的等位基因提高上述耐盐相关性状的耐盐性,分别解释表型变异12.8%、14.8%和10.2%(表1)。
RM7619位于qST12Pokkali定位置信区间内部,与其紧密连锁,且该区间位点尚未有同时影响苗期叶片盐害级别和钠钾离子浓度相关主效QTL的报道,推测该区间存在一个新的主效耐盐基因。
表1利用IR29/HD68RIL群体检测到第12染色体上影响苗期叶片盐害级别、地上茎叶钠离子浓度和钾钠离子浓度比值的主效QTL
注:a表示QTL解释群体中该性状变异的百分比,b表示基因加性效应,。
(二)F2群体耐盐主效QTL(qST12Pokkali)的验证与标记辅助选择效果分析
1.供试材料
选用IR29与携带qST12Pokkali的耐盐重组自交系HD68杂交构建F2分离群体(200株),利用该分离群体用于qST12Pokkali基因的验证和连锁标记辅助选择效果的分析。
2.DNA提取、多态筛选及基因型分型
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法,于3叶1心时取叶对亲本和各单株分别提取全基因组DNA,取叶一周后4叶1心期对F2群体进行苗期耐盐鉴定,评价各单株相关耐盐表型。依据qST12Pokkali对应的参照基因组物理位置区间,从水稻SSR引物数据中筛选qST12Pokkali区间的SSR引物并进行聚合酶链式(PCR)反应和电泳基因型分析,确定与qST12Pokkali紧密连锁的高分辨率多态标记RM7619。后续采用该多态性标记对F2群体的各个单株进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,参考双亲的扩增条带,对后代单株的带型进行判别记录。
3.QTL验证
根据后代单株的RM7619标记扩增条带所表示的基因型,将F2群体中的个体分成两组,一组是带有IR29纯合基因型的个体,共计51株,记作SS基因型组;另一组是带有Pokkali纯合基因型的个体,共计45株,记作RR基因型组。将两组个体考察所得的SIS、SNaC和 SKNa的均值进行t测验,结果表明两组个体间SIS、SNaC和SKNa差异均达到0.001水平的极显著差异(表2,图1),表明分子标记RM7619附近确实存在一个影响叶片盐害级别、茎叶钠离子浓度及钾钠离子浓度比的主效基因qST12Pokkali,而且与分子标记RM7619紧密连锁。
表2 IR29/HD68F2群体在RM7619标记位点双亲纯合个体的叶片盐害级别、钠离子浓度和钾钠离子浓度比的表现
注:SS-IR29纯合基因型;RR-Pokkali纯合基因型,***表示两组均值差异达到0.001 的极显著水平。
4.标记辅助选择效果分析
RM7619引物扩增后F2群体获得与Pokkali大小相同的片段的单株数为45株,均表现为叶片耐盐级别较低(平均数为4.14,变幅为3.2-4.9)、地上部茎叶钠离子浓度较低(平均数为1.11,变幅为0.96-1.58)和较高的地上茎叶钾钠离子浓度比值(平均数为1.29,变幅为 0.86-1.62);与IR29扩增片段大小相同的单株数为51株,均表现为叶片耐盐级别较高(平均数为7.81,变幅为6.1-9.0)、地上茎叶钠离子浓度较高(平均数为2.16,变幅为1.99-2.68) 和较低的地上茎叶钾钠离子浓度比值(平均数为0.38,变幅为0.11-0.52);扩增出杂合基因型单株数为102株,叶片耐盐级别平均数为5.25,变幅为4.7-6.1,地上部茎叶钠离子浓度平均数为1.66,变幅为1.49-1.98、地上茎叶钾钠离子浓度比值平均数为1.02,变幅为0.51- 1.54。表明依据RM7619引物扩增出与Pokkali大小相同的纯合或杂合的片段,推测该单株带有qST12Pokkali耐盐等位基因,表现为苗期耐盐性强,反之,表现为耐盐性差(图2)。表明通过RM7619标记可以很好的鉴别qST12基因型,预测qST12基因的表现型。
序列表
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 一个水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
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<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
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Claims (2)
1.水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali的分子标记检测方法,其特征在于,所述水稻苗期耐盐新基因簇qST12Pokkali位于水稻基因组第12染色体4.19–5.03 Mbp的区间内,该位点的Pokkali等位基因能够显著提高水稻苗期耐盐水平,用特异的PCR引物对RM7619 PCR扩增带有品种Pokkali血缘的育种材料基因组DNA,如果引物对RM7619扩增出与Pokkali类似的143bp的片段,那么该育种材料含有qST12Pokkali的耐盐等位基因;所述引物对RM7619正向引物序列如SEQ ID No.1所示,反向引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的分子标记检测方法在水稻耐盐育种中的应用。
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Non-Patent Citations (4)
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Improvement of Salt Tolerance Using Wild Rice Genes;Ruidang Quan等;《Front Plant Sci.》;20180117;第1-11页 * |
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水稻苗期耐盐性基因SST分子标记的筛选与应用;彭江涛等;《福建农林大学学报(自然科学版)》;20170318(第02期);第48-53页 * |
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