CN113005221B - 甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用 - Google Patents

甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用 Download PDF

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Abstract

甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP‑392及其应用,属于植物分子遗传育种研究领域。所述分子标记SNP‑392的引物序列为:SNP‑392F:TGCATAATACTCATTCAACGCA,SNP‑392R:TTGATGCTTACTTTGGTGATGC。通过利用本发明提供的特异性引物对采用PCR方法检测待测甜瓜的基因组DNA,扩增CAPs分子标记SNP‑392,限制性内切酶AluI酶切后,甜瓜含有抗落蒂CmAL3基因在266bp产生扩增产物,而不含有抗落蒂基因CmAL3扩增条带经限制性内切酶Alu I酶切后,在244bp产生酶切产物,通过此分子标记可以准确对甜瓜进行抗落蒂基因CmAL3的筛选,用于筛选植株,大大提升了甜瓜的育种效率。

Description

甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用
技术领域
本发明属于植物分子遗传育种研究领域,具体涉及甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo.L)为世界栽培的重要经济作物,具有经济价值高、营养丰富等特点,在我国种植范围较广。近年来,甜瓜产业在部分地区已成为农民脱贫增收的支柱性产业,在乡村振兴中发挥着重要作用。虽然我国甜瓜产业取得了显著发展,但采收前的果实脱落(落蒂)现象仍会严重影响甜瓜产量,造成瓜农经济损失。落蒂为果实成熟的重要性状之一,受环境等多种因素的影响,在生产过程中较难通过表型鉴定其发生机制;从农业生产角度出发,果实脱落对于产量具有重大的影响,集中收获期之前脱落,易造成产量、品质的下降,因此控制甜瓜果实落蒂有利于机械化采收,减少人力物力的投入,降低生产成本。随着劳动力缺口逐渐增大,甜瓜采收的机械化与规模化生产势在必行,而明确调控落蒂性状的基础研究和控制机理成为选育抗落蒂甜瓜品种的关键问题。因此,克隆甜瓜抗落蒂基因CmAL3并明确其调控分子机制,为培育甜瓜抗落蒂品种提供理论支持具有重要意义。
多年来甜瓜落蒂性状研究一直围绕着乙烯含量相关位点挖掘分析。Pe′rin etal.(2002)利用F2分离群体对甜瓜果实落蒂性状及乙烯释放含量QTL开展定位分析,结果显示甜瓜落蒂受2对独立遗传基因(AL3和AL4)控制,这两个位点分别在甜瓜第8、9号染色体,同时检测到参与离层形成和乙烯自催化生物合成4个QTL,分布在甜瓜1、2、3和11号染色体。在此之前,Takada等(1975)也曾报道两个与果实成熟落蒂的相关基因AL1和AL2,由于当时甜瓜基因组数据及遗传图谱开发的限制,未能将这四个位点进行分析,因此尚不明确他们之间的关系。2005年Eduardo等利用非呼吸跃变亲本回交构建的近等基因系,鉴定了两个参与果实呼吸跃变的QTL位点(ETHQB3.5和ETHQV6.3);2013年,Vegas等将ETHQV6.3定位在甜瓜第6号染色体4.5Mb区间,确定候选基因为MELO3C016540(CmNAC-NOR),该基因与番茄NOR基因同源,因此推测甜瓜和番茄果实成熟可能具有相同的机制(Ríos et al.,2017)。2020年Pe′reira等利用重组自交系对成熟相关多个性状进行了QTL分析,共检测到5个脱落相关的QTL位点(ABSQV)分别位于甜瓜第2,5,6,7,8号染色体,其中第8号染色体上QTL位点ABSQV8.1位于基因组9,941,727~17,287,431,同时鉴定了乙烯相关的QTL位点ethqv8.1,该QTL位点所在区域(9,941,727~17,287,431)共包含11个与果实成熟相关QTL位点,候选区域与本发明CmAL3位点候选区域(10,774,778~10,839,486)重合。虽然CmAL3候选基因与ethqv8.1位点处于相同候选区域,但是利用渗透系对ethqv8.1进行精细定位发现,目标区域脱落位点ABSQV8.1不分离,说明这两者之间非相同基因,而ABSQV8.1与CmAL3是否为相同候选基因,目前尚不明确。
发明内容
本发明的目的是提供一种甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用。利用果实抗落蒂材料M2-10为母本(薄皮甜瓜,授粉后32左右成熟,成熟不落蒂),果实易落蒂材料ZT091为父本(薄皮甜瓜,授粉后28天左右成熟,授粉后25天左右自行落蒂),配制杂交组合,获得F1,单株自交获得189个F2单株和189个F3家系,随机选择12个F3家系(F2表现不落蒂),每个家系种植150个单株,调查分离比率,筛选F3符合单基因分离3:1的家系用于SLAF-BSA测序,结合对两个亲本进行高通量基因组重测序,设计CAPs标记,分析与甜瓜抗落蒂基因CmAL3连锁的区域,在该连锁区域内查找亲本间存在SNP突变的碱基区段,并分析SNP位点的酶切信息,获得存在CAPs突变的序列;针对突变序列设计引物,利用CAPs标记在甜瓜F3群体中进行抗落蒂基因CmAL3鉴定,分子标记的鉴定结果与表型鉴定结果一致。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392,所述分子标记SNP-392的引物序列为:
SNP-392F:TGCATAATACTCATTCAACGCA,
SNP-392R:TTGATGCTTACTTTGGTGATGC。
上述的分子标记SNP-392在鉴定甜瓜抗落蒂基因CmAL3中的应用。
进一步的,所述应用具体为:
(1)提取待测样品的DNA,采用分子标记SNP-392进行PCR扩增;
(2)PCR反应产物用于Alu I酶切反应,酶切反应在37℃水浴锅中温浴20min,加入4μL 6×loading buffer后于6%聚丙烯酰胺电泳125U电压电泳60min,在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照;
(3)待测DNA样品经过PCR扩增和Alu I酶切后,电泳方式能检测,266bp片段为含有抗落蒂基因CmAL3甜瓜材料,244bp片段为不含有抗落蒂基因CmAL3,表型为易落蒂甜瓜材料。
进一步的,步骤(1)中,PCR反应体系为:30ng/μL DNA 2μL,SNP-392引物上下游各0.2μL,10×PCRbuffer 1μL,2.5mM dNTp 0.3μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 6.4μL。
进一步的,步骤(1)中,PCR扩增条件为:94℃预变性2min、94℃变性20See、68℃退火1min、72℃延伸30Sec,共6个循环,每个循环温度降低2℃;94℃变性20See、58℃退火1min、72℃延伸30Sec,共6个循环,每个循环温度降低1℃;94℃变性20See、50℃退火30Sec、72℃延伸30Sec,共20个循环,最后72℃延伸5min。
进一步的,步骤(2)中,酶切体系为10μL:PCR产物5.0μL、无菌水3.4μL、内切酶AluI 0.6μL和10×NEB Buffer 1.0μL。
上述的分子标记SNP-392用于甜瓜分子标记辅助育种。
本发明相对于现有技术的有益效果为:
1、CAPs标记是以酶切位点产生单个碱基多态性的分子标记,由于该标记的特点是分布范围广,变异的稳定性强因此成为近年来进行基因定位的新一代标记。本发明根据高通量测序技术,得到甜瓜基因组数据,设计开发与甜瓜抗落蒂位点CmAL3的CAPs分子标记,通过分子标记辅助选择育种的方法,在甜瓜幼苗期就可以进行含有抗落蒂位点CmAL3的筛选,节省了育种的年限,并提高了育种的效率,克服了现有技术中只能在果实成熟采收期间区分甜瓜是否含有抗落蒂位点,从而表现是否抗落蒂性状而带来的育种效率低下的问题。
2、通过利用本发明提供的特异性引物对采用PCR方法检测待测甜瓜的基因组DNA,扩增CAPs分子标记SNP-392,限制性内切酶AluI酶切后,甜瓜含有抗落蒂CmAL3基因在266bp产生扩增产物,而不含有抗落蒂基因CmAL3扩增条带经限制性内切酶Alu I酶切后,在244bp产生酶切产物,通过此分子标记可以准确对甜瓜进行抗落蒂基因CmAL3的筛选,用于筛选植株,大大提升了甜瓜的育种效率。
3、目前国内外对甜瓜抗落蒂基因CmAL3连锁的分子标记未见相关报道,本发明的分子标记SNP-392与抗落蒂基因CmAL3紧密连锁,距离为3.6cM。
4、本发明分子标记在甜瓜生产实践、育种中具有非常重要的价值。
5、操作方法简单,稳定性强,为甜瓜分子育种提供了辅助选择的新方法。
附图说明
图1为甜瓜SNP-392标记检测F3群体甜瓜抗落蒂基因CmAL3的电泳图,图中,P1代表母本,抗落蒂,含有CmAL3;P2代表父本,易落蒂,不含有CmAL3基因,F3单基因分离群体共有48个单株,1-19为抗落蒂植株,20-32为易落蒂植株;33-48为抗落蒂杂合植株;抗落蒂植株在266bp为特异条带,酶切产物244bp为易落蒂植株;产生特异条带为抗落蒂植株条带,在两个位点都有条带的为抗落蒂杂合体。
图2为甜瓜SNP-392标记在30个自然群体中检测电泳图,图中M为marker,显示位点为250bp;1-4为表型为抗落蒂植株,5-20为表型为易落蒂植株,21-30为表型为抗落蒂植株。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一:本实施方式提供了一种甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392,其引物序列为:
SNP-392F:TGCATAATACTCATTCAACGCA,
SNP-392R:TTGATGCTTACTTTGGTGATGC。
上述分子标记SNP-392的获得方法如下:
1、甜瓜遗传群体的构建
对供试材料开展落蒂性状调查分析显示,母本M2-10授粉后32天成熟,果实成熟到腐烂也不落蒂,父本ZT091授粉后28天左右成熟,授粉后25天左右开始落蒂。配制杂交组合,F1为全部不落蒂,F2分离比率为9:7(不落蒂:落蒂),回交一代BC1P1群体不落蒂,BC1P2分离比率为1:3(不落蒂:落蒂)。因此确定甜瓜果实落蒂性状为2对基因控制的质量性状(CmAL3和CmAL4),基因间存在互补作用。
2018年3月F2群体自交获得189个F3家系。2018年7月,随机选择F2单株不落蒂植株自交的F3家系12个,在塑料大棚中每个家系种植120~150株不等,调查分离比率,筛选表型分离符合3:1的CmAL3单基因分离F3家系,共有5个家系符合,编号为83、46、57、97和110,分别自交,获得5个F4群体。2019年3月,选择83-F3为本发明群体,自交获得的146个83-F4家系,每个家系种植20个单株,调查落蒂性状,以F4表型确定F3纯合基因型,用于构建基因池;开展SLAF-BSA测序分析。
2、基因组DNA的提取和基因池构建
采用CTAB法提取144个F2单株的基因组DNA。
分别取F3-4家系中表现纯合的抗落蒂与易落蒂各30个单株,构建用于分离群体分组分析(Bulk SegregatingAnalysiS,BSA)的基因池,DNA浓度在100ng/μL。
3、CAPS连锁标记筛选
通过对抗落蒂亲本M2-10及易落蒂亲本ZT091进行高通量测序,得到两个亲本的基因组序列信息,分析比较两个亲本间差异性位点,利用BSA方法获得与甜瓜抗落蒂关键基因CmAL3紧密连锁的分子标记,共设计开发分子标记72对,在抗落蒂基因池和易落蒂基因池之间进行PCR扩增和多态性筛选,共筛选到25对引物。筛选与甜瓜抗落蒂基因CmAL3连锁的分子标记,其中发现SNP-392与甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁。
具体实施方式二:本实施方式提供了一种利用分子标记法检测甜瓜抗落蒂基因CmAL3的方法,具体步骤如下:
(1)提取待测样品的DNA,采用分子标记SNP-392进行PCR扩增。10μL PCR反应体系为:30ng/μL DNA 2μL,SNP-392引物上下游各0.2μL,10×PCR buffer1μL,2.5mM dNTp0.3μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 6.4μL。PCR扩增条件为:94℃预变性2min、94℃变性20See、68℃退火1min、72℃延伸30Sec,共6个循环,每个循环温度降低2℃;94℃变性20See、58℃退火1min、72℃延伸30Sec,共6个循环,每个循环温度降低1℃;94℃变性20See、50℃退火30Sec、72℃延伸30Sec,共20个循环,最后72℃延伸5min。
(2)PCR反应产物用于Alu I酶切反应,酶切方法为:酶切体系为10μL:PCR产物5.0μL、无菌水3.4μL、内切酶(Alu I,USA)0.6μL和10×NEB Buffer 1.0μL。酶切反应在37℃水浴锅中温浴20min,加入4μL 6×loading buffer后于6%聚丙烯酰胺电泳125U电压电泳60min,在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照。
(3)待测DNA样品经过PCR扩增和Alu I酶切后,电泳方式能检测出266bp片段的为含有抗落蒂基因CmAL3甜瓜材料,而片段大小为244bp的则是不含有抗落蒂基因CmAL3,表型为易落蒂甜瓜材料,如图2所示。将该分子标记在30个甜瓜自然群体中进行检测,开展抗落蒂基因CmAL3鉴定准确率为100%。因此,通过紧密连锁标记的扩增能准确区分CmAL3基因位点的不同基因型,达到辅助育种的目的。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 1
tgcataatac tcattcaacg ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 2
ttgatgctta ctttggtgat gc 22

Claims (7)

1.甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392的引物,其特征在于:所述分子标记SNP-392的引物序列为:
SNP-392F:TGCATAATACTCATTCAACGCA,
SNP-392R:TTGATGCTTACTTTGGTGATGC。
2.权利要求1所述的分子标记SNP-392的引物在鉴定甜瓜抗落蒂基因CmAL3中的应用。
3.根据权利要求2所述的分子标记SNP-392的引物在鉴定甜瓜抗落蒂基因CmAL3中的应用,其特征在于:所述应用具体为:
(1)提取待测样品的DNA,采用分子标记SNP-392的引物进行PCR扩增;
(2)PCR反应产物用于AluI酶切反应,酶切反应在37℃水浴锅中温浴20min,加入4μL 6× loading buffer后于6%聚丙烯酰胺电泳,125V电压电泳60min,在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照;
(3)待测DNA样品经过PCR扩增和AluI酶切后,电泳方式检测,266bp片段为含有抗落蒂基因CmAL3甜瓜材料,244bp片段为不含有抗落蒂基因CmAL3,表型为易落蒂甜瓜材料。
4.根据权利要求3所述的分子标记SNP-392的引物在鉴定甜瓜抗落蒂基因CmAL3中的应用,其特征在于:步骤(1)中,PCR反应体系为:30ng/μL DNA 2μL,SNP-392引物上下游各0.2μL,10×PCR buffer 1μL,2.5mM dNTP 0.3μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 6.4μL。
5.根据权利要求3所述的分子标记SNP-392的引物在鉴定甜瓜抗落蒂基因CmAL3中的应用,其特征在于:步骤(1)中,PCR扩增条件为:94℃预变性2min、94℃变性20Sec、68℃退火1min、72℃延伸30Sec,共6个循环,每个循环温度降低2℃;94℃变性20Sec、58℃退火1 min、72℃延伸30Sec,共6个循环,每个循环温度降低1℃;94℃变性20Sec、50℃退火30Sec、72℃延伸30Sec,共20个循环,最后72℃延伸5min。
6.根据权利要求3所述的分子标记SNP-392的引物在鉴定甜瓜抗落蒂基因CmAL3中的应用,其特征在于:步骤(2)中,酶切体系为10 µL:PCR产物5.0 µL、无菌水3.4 µL、内切酶AluI0.6 µL 和 10× NEB Buffer 1.0 µL。
7.权利要求1所述的分子标记SNP-392的引物用于甜瓜抗蒂落分子标记辅助育种。
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