CN113046462B

CN113046462B - 与玉米穗长主效qtl紧密连锁的分子标记、引物及应用

Info

Publication number: CN113046462B
Application number: CN202110373589.XA
Authority: CN
Inventors: 汤继华; 陈晓阳; 丁冬; 孟淑君; 张雪海; 郭战勇
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2041-04-07
Also published as: CN113046462A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记、引物及应用。所述分子标记位于玉米第10染色体上，包括分子标记ID15或分子标记ID23；所述分子标记ID15的核苷酸序列如SEQ ID NO.39或者SEQ ID NO.40所示，所述分子标记ID23的核苷酸序列如SEQ ID NO.41或者SEQ ID NO.42所示。本发明提供的分子标记与玉米穗长主效QTL紧密连锁，可应用于穗长分子标记辅助育种，应用于穗长种质资源筛选，应用于玉米穗长的遗传改良。

Description

与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记、引物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记、引物及应用。

背景技术

玉米是一种重要的粮食作物、经济作物以及工业原料，其产量对保障国民经济生产与人们生活具有重要意义。玉米单产主要由亩穗数和单穗籽粒重共同决定，其中单穗籽粒重又可分解为穗长(行粒数)和穗粗(穗行数)和百粒重等三个要素。研究表明，穗长与单穗籽粒重表现为极显著正相关，是育种家首先考虑的育种目标之一。因此，筛选和鉴定穗长种质资源是培育高产玉米新品种的重要途径。

玉米穗长是一种典型的数量性状，且易受环境条件影响。通过传统育种方法选育穗长种质资源存在选育周期长、效率低等问题。分子标记辅助选择技术具有选育速度快、灵敏度高、特异性强、准确可靠等优点，且不受生物体生长发育阶段和外界环境条件等因素的影响，可以加快穗长种质资源筛选的进程。利用该技术的前提是获得与目标性状基因紧密连锁的分子标记。

QTL定位是分离目标基因及其紧密连锁分子标记的重要步骤，适宜的定位群体对QTL定位的速度与准确度至关重要。单片段代换系是指除目标区段外，染色体其余部分与受体均一致。该类材料遗传背景单一，在QTL分析中可以消除遗传背景的影响，提高了定位的准确性；同时避免了上位性互作的干扰，可以使微效QTL被检测出来，增强了QTL鉴别能力；通过比较不同的单片段代换系，可以直接鉴定到目标QTL区域，将数量性状的多个位点分解为多个的单个孟德尔因子，简化了数量性状研究过程。因此，单片段代换系已被广泛应用于QTL克隆和功能分析。

目前虽然有利用单片段代换系定位玉米穗长基因，但获得的定位区间较大，分子标记难以在生产上应用。因此需要开发一种与目标基因紧密连锁的分子标记，以应用于玉米穗长的遗传改良。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记、引物及应用，该分子标记与玉米穗长主效QTL紧密连锁，可应用于玉米穗长分子标记辅助育种。

本发明提供了一种与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记，所述分子标记位于玉米第10染色体上，包括分子标记ID15或分子标记ID23；所述分子标记ID15的核苷酸序列如SEQ ID NO.39或者SEQ ID NO.40所示，所述分子标记ID23的核苷酸序列如SEQ ID NO.41或者SEQ ID NO.42所示。

本发明提供了扩增上述与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的引物，扩增所述分子标记ID15的引物序列为：

ID15-L：5’-ACCTCATCTCAGCCAGTCAC-3’；

ID15-R：5’-GCAGAACCAATCCTCCCAAC-3’；

扩增所述分子标记ID23的引物序列为：

ID23-L：5’-ATCGACCAGAGCTCCCTGTA-3’；

ID23-R：5’-GTGCTTGTGCTTGTGCTTGT-3’。

本发明提供了上述的与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记在玉米穗长遗传改良中的应用。

本发明提供了上述的引物在玉米穗长遗传改良中的应用。

优选的，上述应用中，鉴定玉米穗长性状的方法包括以下步骤：

提取玉米叶片基因组DNA；

以玉米叶片基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物ID15-L/ID15-R、ID23-L/ID23-R分别进行PCR扩增；

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果：当采用的引物为ID15-L/ID15-R时，当检测出所述分子标记ID15大小为305bp，则表示待检样品的穗长较长，当检测出所述分子标记ID15大小为143bp，则表示待检样品的穗长较短；

当采用的引物为ID23-L和ID23-R时，当检测出所述分子标记ID23大小为168bp，则表示待检样品的穗长较长，当检测出所述分子标记ID23大小为155bp，则表示待检样品的穗长较短。

优选的，上述应用中，PCR扩增体系10μL，组分包含：2μL DNA，左右引物各0.5μL，5μL 2×Taq Master Mix和2μL ddH₂O。

优选的，上述应用中，利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s(每个循环降落1℃)，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记与玉米穗长主效QTL紧密连锁，可应用于穗长分子标记辅助育种，应用于穗长种质资源筛选，应用于玉米穗长的遗传改良。

附图说明

图1为实施例1的许178和SSSL1283成熟果穗照片，比例尺为1cm；

图2为实施例2的分子标记聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中A-C分别为umc1053、umc1697和umc1280的电泳图；A-C中1-4号泳道样品分别为SSSL1283、许178、显性池和隐性池；

图3为实施例2的qEL10基因初定位；

图4为实施例3的qEL10的精细定位。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。

实施例1穗长单片段代换系SSSL1283的鉴定

1.1玉米单片段代换系群体的构建

2008年开始以玉米自交系综3为供体亲本，许178为受体亲本，通过连续4个世代回交和3个世代自交，并结合分子标记辅助选择，构建了150份纯合的单片段代换系。

1.2单片段代换系群体穗部表型的田间测定

2013年和2014年，在河南浚县、新乡和许昌分别种植150份单片段代换系及其受体许178。每个材料设置2个重复，每个重复2行，行长4米，行距0.65米，株距0.25米。成熟期，利用考种仪(Jetion)测定果穗穗长和穗粗，人工测定穗行数和行粒数。

1.3成熟果穗的表型分析

通过两年六点田间测定，发现单片段代换系SSSL1283比受体许178在穗长和行粒数均有显著增加，结果参见图1和表1；穗粗和穗行数无显著差异，结果参见表1。

表1许178和SSSL1283成熟果穗表型分析

实施例2玉米穗长主效QTLqEL10初定位

2.1定位群体的构建：以单片段代换系SSSL1283为母本，与许178杂交，后代F₁植株再与许178回交，获得BC₁F₁群体。

2.2穗长表型鉴定：2016年夏于河南郑州种植BC₁F₁群体，取叶片低温保存，散粉期自交留种。2016冬，将BC₁F₁群体各单株自交后种子(BC₁F₂)种植于海南三亚，2个重复，每个重复2行，行长4米，行距0.65米，株距0.25米。利用考种仪(Jetion)对BC₁F₁和BC₁F₂群体测定成熟期果穗穗长。以BC₁F₂家系穗长代表BC₁F₁单株穗长。

2.3DNA提取和分子标记开发

利用SLS法提取玉米叶片基因组DNA，于-20℃冰箱保存备用。

从MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)数据库IBM 2008Neighbors Frame2分子标记参考图谱中，选取覆盖玉米全基因组的1000对SSR引物。

InDel标记开发：比对许178和综3基因组序列，挑选两个材料序列差异在5个碱基以上的位点，利用Primer3.0设计引物，引物长度在18-24bp之间，具体序列参见表2。

2.4 PCR程序和扩增产物基因型分析

PCR扩增体系(10μL)组分包含：2μL DNA,1μL引物(左右引物各0.5μL)，5μL 2×TaqMaster Mix(诺维赞)和2μL dd H₂O。利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s(每个循环降落1℃)，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖胶电泳进行基因型分析。

2.5玉米穗长主效QTL初定位

通过BSA混池法初步确定单片段代换系SSSL1283穗长主效基因qEL10的染色体位置。根据BC₁F₁单株及BC₁F₂群体果穗穗长，选择BC₁F₁群体中穗长有明显差异的显性单株和隐性单株各10株，提取叶片基因组DNA后等量混合，构成显隐性池。利用1000对覆盖玉米全基因组的SSR标记对亲本和显隐性池进行基因型分析，共筛选到3对多态性分子标记，分别为umc1053、umc1697和umc1280，这三对分子标记的电泳图参见图2，这三对标记均位于玉米第10染色体10.04bin，说明qEL10位于玉米第10染色体。在10.04-10.05bin区间内设计并筛选到多态性分子标记，分子标记引物信息参见表2。

表2分子标记引物信息

利用表2分子标记分析2016年BC₁F₁群体的基因型。结合单株后代表型，将80个交换单株归类为8种不同类型的重组单株。通过跨叠系作图，将目标基因定位于第10染色体分子标记chr10-17和S03136之间，物理距离为2.8Mb，结果参见图3。图3中白色框代表来自许178的基因组片段，黑色框代表SSSL1283基因组片段。右侧柱状图代表重组单株自交子代穗长平均数，显著性差异P为与许178进行t测验获得。

实施例3玉米穗长主效QTL qEL10精细定位

3.1定位群体的构建：在BC₁F₁群体中选择目标区段为杂合的单株自交构建BC₁F₂群体。

3.2穗长表型鉴定：2017年夏于河南郑州种植BC₁F₂群体。经基因型鉴定后，重组单株自交留种。2017冬和2018年夏，将BC₁F₂群体重组单株自交后种子(BC₁F₃)分别种植于海南三亚和河南郑州，2个重复，每个重复2行，行长4米，行距0.65米，株距0.25米。利用考种仪(Jetion)对BC₁F₂重组单株和BC₁F₃群体测定成熟期果穗穗长。以BC₁F₃家系穗长代表BC₁F₂单株穗长。

3.3DNA提取和分子标记开发

利用SLS法提取玉米叶片基因组DNA，于-20℃冰箱中保存备用。

InDel标记开发：比对许178和综3基因组测序结果，挑选两个材料序列差异在5个碱基以上的位点，利用Primer3.0设计引物，引物长度在18-24bp之间，具体序列参见表3。

3.4PCR程序和扩增产物基因型分析

PCR扩增体系(10μL)组分包含：2μL DNA,1μL引物(左右引物各0.5μL)，5μL 2×TaqMaster Mix(诺维赞)和2μL ddH₂O。利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s(每个循环降落1℃)，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖胶电泳进行基因型分析。

3.5玉米穗长主效QTL精细定位

根据许178和综3在初定位区间内重测序结果，筛选到多态性分子标记引物信息参见表3。

表3分子标记引物信息

对2017年夏郑州种植的2500株BC₁F₂群体取样提DNA，利用分子标记chr10-17和S03136筛选到该区段内的160个重组单株。经单株后代穗长分析，将目标基因定位于分子标记ID15(SEQ ID NO.39或者SEQ ID NO.40)和分子标记ID23(SEQ ID NO.41或者SEQ IDNO.42)之间，物理距离为586kb，结果参见图4。白色框代表来自许178基因组片段，黑框代表SSSL1283基因组片段。右侧柱状图指示重组单株自交子代穗长平均数，显著性差异P为与许178进行t测验获得。分子标记ID15位于玉米第10染色体，具体位置chr10：130718440-130718592，分子标记ID23位于玉米第10染色体，具体位置chr10：131304654-131304821。

许178中ID15扩增序列大小为143bp，扩增序列为SEQ ID NO.39：

ACCTCATCTCAGCCAGTCACCCCCCTTTTCCTACCCTATACCCAGATCTGTCTACCCGCGCCTCGCACATCTATGTTTGTTTGATTGGATTTGATGCGATTTGTTGCGCTTCGTCATCTGGTCGTTGGGAGGATTGGTTCTGC；

SSSL1283 ID15扩增序列大小为305bp，扩增序列为SEQ ID NO.40：

ACCTCATCTCAGCCAGTCACCCCCCTTTTCCTACCCTATACCCAGATCTGTCTACCCGCGCCTCGCACATCTATGTTTGTTTGGAGAAATTTGCTATTTTGCCACTCTCAATTTTGGCTACCTGTTATTATGTCATCCCGTGTTTATGACTGGTGGGACCGTCTGTGTCTATGATTTGTGGGTCCGATGGCATAGGCGAAGCCCACAAATGATAATGGCAAAATTGCCAATGGCTCGTTTGTTTGATTGGATTTGATGCGATTTGTTGCGCTTCGTCATCTGGTCGTTGGGAGGATTGGTTCTGC；

许178中ID23扩增序列大小为155bp，扩增序列为SEQ ID NO.41：

ATCGACCAGAGCTCCCTGTAGGTGAGCCTGTCCGGGGAAGTGCGCGCGTACTTGCTGAACAGGTTCTCGAAGTTCACTGGCATGAACCTGGACCAGACGCGTTAGCATTTGGGACTGCAGACTGCAAACTGCACAAGCACAAGCACAAGCACAAG；

SSSL1283中ID23扩增序列大小为168bp，扩增序列为SEQ ID NO.42：

ATCGACCAGAGCTCCCTGTAGGTGAGCCTGTCCGGGGAAGTGCGCGCGTACTTGCTGAACAGGTTCTCGAAGTTCACTGGCATGAACCTGGACCAGACGAGCGAGGACGCGTTAGCATTTGGGACTGCAGACTGCAAACTGCACTAGGACAAGCACAAGCACAAGCAC。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记、引物及应用

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttgtatcat cagctagggc atgt 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaacttatg tcaactgcat gctt 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caacacgtac gaagcgcagt c 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcagctacc aagttagcag gaac 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccatcagtc tttgttcgct tc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccacggagc attgtcgatc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agagtgggag gcattcagtg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgaccggat ttaattagac g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcacattgt acacatagct ga 22

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccggagtgtc gatctgcc 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttctcctaca aagtcccagt gc 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgaagcaggc atacctcttg ag 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aacagccagt tttgggctgt ataa 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaaatccatg gcttctttct ttcc 24

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aggcaacagg acaggctcat c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caggaggctg ggtggttgtg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcgctgcggg gttaactcat g 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gccttcctcg ggttcaagtg ag 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctgctggact tcatcgtcat 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agctgcactc cggtaccaa 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgcttaataa cggatcctgc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gatcaaaatc gctcccaaaa 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcattggtgc aactgtgcga tc 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aacccgtgca atcaagacat gg 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcggtcttcg ttctagcatc gg 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acgtgcgtag gactcccatt ac 22

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggagggagcc ggtgtttcg 19

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaccgctctt tgttgccgta ac 22

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgcacacgtc tctgagcctt g 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tgtcacggca ggtcacattc c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

acctcatctc agccagtcac 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gcagaaccaa tcctcccaac 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atggcattgt acggtggttc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gagtccccag agcacactaa 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gccagtccag tcggtgttgt ag 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cctgaccagt gccctccaat ac 22

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atcgaccaga gctccctgta 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gtgcttgtgc ttgtgcttgt 20

<210> 39

<211> 143

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 39

acctcatctc agccagtcac cccccttttc ctaccctata cccagatctg tctacccgcg 60

cctcgcacat ctatgtttgt ttgattggat ttgatgcgat ttgttgcgct tcgtcatctg 120

gtcgttggga ggattggttc tgc 143

<210> 40

<211> 305

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 40

acctcatctc agccagtcac cccccttttc ctaccctata cccagatctg tctacccgcg 60

cctcgcacat ctatgtttgt ttggagaaat ttgctatttt gccactctca attttggcta 120

cctgttatta tgtcatcccg tgtttatgac tggtgggacc gtctgtgtct atgatttgtg 180

ggtccgatgg cataggcgaa gcccacaaat gataatggca aaattgccaa tggctcgttt 240

gtttgattgg atttgatgcg atttgttgcg cttcgtcatc tggtcgttgg gaggattggt 300

tctgc 305

<210> 41

<211> 155

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 41

atcgaccaga gctccctgta ggtgagcctg tccggggaag tgcgcgcgta cttgctgaac 60

aggttctcga agttcactgg catgaacctg gaccagacgc gttagcattt gggactgcag 120

actgcaaact gcacaagcac aagcacaagc acaag 155

<210> 42

<211> 168

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 42

atcgaccaga gctccctgta ggtgagcctg tccggggaag tgcgcgcgta cttgctgaac 60

aggttctcga agttcactgg catgaacctg gaccagacga gcgaggacgc gttagcattt 120

gggactgcag actgcaaact gcactaggac aagcacaagc acaagcac 168

Claims

1.一种与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于玉米第10染色体上，包括分子标记ID15或分子标记ID23；所述分子标记ID15的核苷酸序列如SEQID NO.39或者SEQ ID NO.40所示，所述分子标记ID23的核苷酸序列如SEQ ID NO.41或者SEQ ID NO.42所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述的与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的引物，其特征在于，扩增所述分子标记ID15的引物序列为：

ID15-L：5’-ACCTCATCTCAGCCAGTCAC-3’；

ID15-R：5’-GCAGAACCAATCCTCCCAAC-3’；

扩增所述分子标记ID23的引物序列为：

ID23-L：5’-ATCGACCAGAGCTCCCTGTA-3’；

ID23-R：5’-GTGCTTGTGCTTGTGCTTGT-3’。

3.根据权利要求1所述的与玉米穗长主效QTL紧密连锁的分子标记在玉米穗长遗传改良中的应用。

4.根据权利要求2所述的引物在玉米穗长遗传改良中的应用。

5.根据权利要求4所述的引物在玉米穗长遗传改良中的应用，其特征在于，鉴定玉米穗长性状的方法包括以下步骤：

提取玉米叶片基因组DNA；

6.根据权利要求4所述的引物在玉米穗长遗传改良中的应用，其特征在于，PCR扩增体系10μL，组分包含：2μL DNA，左右引物各0.5μL，5μL 2×Taq Master Mix和2μL dd H₂O。

7.根据权利要求6所述的引物在玉米穗长遗传改良中的应用，其特征在于，利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s，每个循环降落1℃，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。