CN115976263B - 小麦千粒重主效qtl的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记及其应用，主效QTL定位于小麦3D染色体长臂，命名为QTgw.cau‑3D；所述QTgw.cau‑3D包括两个连锁的KASP分子标记为KASP.cau‑3D.1和KASP.cau‑3D.2，对应物理位置为3D：553,396,779‑558,737,727，遗传距离为2.8cM。该千粒重QTL位点LOD值5.32～6.58，表型变异贡献率为9.03～11.86％，加性效应为1.26～1.82g。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学技术领域，特别涉及小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记及其应用。
背景技术
小麦是世界上主要的粮食作物之一，小麦生产和消费分别占全球小麦总量的17％和16％。在人口不断增长、自然灾害频发、耕地和其他农业可利用资源短缺的现实国情下，提高单产是保障国家粮食安全的根本出路。
小麦产量是一个复杂的性状，由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重三要素组成。研究表明，穗粒数的增加与单位面积穗数呈一定的负相关关系，而千粒重的增加则相对独立。在稳定单位面积穗数和穗粒数的前提下，增加粒重对小麦单产的提高具有重要的作用。在小麦产量三要素中，千粒重遗传力最高，受环境影响较小，主要由基因的加性效应控制。小麦粒重是一个复合性状，可分解为粒长、粒宽和粒厚等基本要素，各要素均为多基因控制的数量性状(QTL，Quantitative trait loci)。
QTL定位是目前应用于小麦粒重遗传研究的主要方法。迄今为止，关于小麦粒重的QTL定位已进行了大量的研究，所定位的与粒重相关的QTL遍布于小麦21条染色体。然而，但大多已定位的QTL遗传效应较小、效应未经验证且其侧翼标记与目标QTL遗传距离较远，尚不能满足小麦高产分子育种的需要。此外，由于目前所鉴定的与小麦籽粒大小相关的标记大多为SSR、STS、CAPS等标记类型，由于其基因分型技术繁琐、通量低且成本高等原因，也使得大多研究结果尚未有效应用于小麦产量育种。近年来，随着新一代代测序技术和基于芯片分型技术发展，单核苷多态性(SNP，Single nucleotide polymorphism)芯片的应用极大的加速了小麦基因分型的效率，为为小麦分子遗传及基因定位提供了新的途径。
综上，利用高密度SNP基因分析技术发掘和定位小麦千粒重主效QTL并开发与之紧密连锁的分子标记是开展目标基因克隆和高产分子育种的前提，对解析小麦产量形成的遗传机制及高产小麦品种的培育具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明在发掘与小麦千粒重主效QTL紧密连锁的分子标记的基础上，开发并提供了与小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记及其应用。利用该分子标记可以进行辅助选择育种，快速筛选出千粒重高的小麦品系，从而加速小麦高产育种分子进程。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记，所述主效QTL定位于小麦3D染色体长臂上，命名为QTgw.cau-3D；所述QTgw.cau-3D包括两个连锁的KASP分子标记KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2，对应物理位置为3D：553,396,779-558,737,727，遗传距离为2.8cM；该千粒重QTL位点LOD值5.32～6.58，表型变异贡献率为9.03～11.86％，加性效应为1.26～1.82g；千粒重QTL位点的增效等位变异来自于亲本冀麦120。
优选的，其正向引物1和正向引物2的5’末端分别连上FAM和HEX荧光基团接头；所述KASP分子标记KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2，具体引物序列分别如下：
①KASP.cau-3D.1的引物序列
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACAAGTGGGATGGGCTT-3’，如SEQ IDNO.1所示；
正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGACAAGTGGGATGGGCTC-3’，如SEQ IDNO.2所示；
共用反向引物：5’-TTCTTGCACCCGATCAACCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
②KASP.cau-3D.2的引物序列
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGATGGATGTTTCCCAAATTTA-3’，如SEQ IDNO.4所示；
正向引物2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGATGGATGTTTCCCAAATTTG-3’，如SEQ IDNO.5所示；
共用反向引物：5’-AGCGTTCAACGACTTTGGAA-3’，如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述小麦千粒重主效QTL的基因分型方法，具体步骤如下：提取小麦基因组DNA，用序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的KASP.cau-3D.1标记的KASP引物或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的KASP.cau-3D.2的KASP标记引物序列对提取的基因组DNA进行PCR扩增。
进一步优选的，所述PCR扩增方法为：
PCR反应体系：PCR反应体系共8μl，每孔DNA使用量为50-100ng，KASP引物混合物0.1μl，HiGeno 2×Probe Mix 4.0μl；无菌水补至8μl；
PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s，61-55℃退火/延伸40s，其中，61-55℃梯度PCR，每循环降低-0.6℃，共10个循环；95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共28～34个循环；12℃保存；
KASP引物混合物包括：FAM正向引物、HEX正向引物、反向引物和无菌水；所述FMA正向引物浓度为12μmol/ml，所述HEX正向引物浓度为12μmol/ml，所述反向引物浓度为30μmol/ml。
前述的小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记在小麦高产育种中的应用。
前述的小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记在高千粒重小麦育种中的应用。
一种小麦千粒重高低检测试剂盒，包括前述的小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记。
本发明的有益效果在于：
本发明所使用遗传群体是由冀麦120和冀麦325为亲本构建的193个高代(F6)RIL群体。冀麦120(JM120)和冀麦325(JM325)是河北省农林科学院粮油作物研究所选育冬小麦品种，于2015年和2016年通过河北省和国家黄淮北片麦区审定，两亲本品种千粒重差异显著，冀麦120千粒重较高(50.0g左右)，冀325千粒重较低(42.0g左右)。
本发明提供一个影响小麦千粒重的主效QTL，该主效QTL位点位于小麦3D染色体长臂上，命名为QTgw.cau-3D；所述QTgw.cau-3D包括两个连锁的KASP分子标记为KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2,对应物理位置为3D：553,396,779-558,737,727，遗传距离为2.8cM。LOD值5.32～6.58，表型变异贡献率为9.03～11.86％，加性效应为1.26～1.82g。千粒重QTL位点的增效等位变异来自于亲本冀麦120。
本发明利用千粒重差异较大的两亲本品种冀麦120和冀麦325构建RIL群体为材料，采用小麦55K芯片技术对两亲本(JM120/JM325)及193个家系进行全基因组测序，且结合多个环境条件下千粒重表型数据，在3D染色体上检测到一个新的千粒重主效QTLQTgw.cau-3D，并获得与其紧密连锁的两个KASP分子标记KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2，为小麦高产分子育种提供新的可利用的分子标记。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在无需付出创造性劳动的前提下，根据文中所述技术流程可准确获得附图所示研究结果。
图1QTgw.cau-3D遗传连锁图谱；其中，注：▲，◆，分别表示邯郸(2020)、邯郸(2021)、石家庄(2021)和北京(2021)千粒重表型QTL定位区间；/>表示4个不同环境千粒重表型平均值QTL定位区间。
图2QTgw.cau-3D近等基因系(NIL)2021年千粒重、粒长、粒宽表型；其中，A为TKW，B为GL，C为GW；
图3QTgw.cau-3D近等基因系(NIL)2022年千粒重、粒长、粒宽表型；其中，A为TKW，B为GL，C为GW；
图4KASP.cau-3D.1RIL群体部分家系基因型分型示意图；
图5KASP.cau-3D.2RIL群体部分家系基因型分型示意图；其中，纵坐标及横坐标数字分别表示HEX和FAM荧光性信号的强度；圆点表示携带JM325等位基因型(小粒型)；正方形表示携带JM120等位基因型(大粒型)；三角形表示杂合基因型，左下角原点为NTC阴性对照。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
材料与方法
1.实验材料及田间种植
以冀麦325(JM325)和冀麦120(JM120)为亲本杂交构建的193个高代重组自交系群体(RIL)为研究材料.
JM120和JM325以及RIL群体分别于2020年10月和2021年10月种植于河北邯郸(2020HD、2021HD)、河北石家庄(2021SJZ)、北京上庄(2021SZ)四个不同环境条件种植。每个环境均采用随机区组设计，设置2个重复，亲本和RIL群体双行种植，行长2m，行距30cm，每行点播籽粒40粒。田间管理按照普通大田生产标准进行。
2.表型测量
小麦成熟后，两亲本材料及RIL群体每家系进行收获脱粒并自然晾干，使用万深公司SC-G型籽粒考种仪对亲本及RIL群体千粒重、粒长和粒宽等籽粒相关性状进行测量，每系两个重复，取其平均值用于数据统计分析。
3.表型统计分析
对四个环境下JM120/JM325构建的RIL群体的千粒重表型数据利用SPSS version20.0(SPSS，Chicago，IL，USA)和Microsoft Excel等软件进行统计分析。
4.SNP基因分型及遗传连锁图谱的构建
提取亲本冀麦120和冀麦325及其衍生的193个RIL群体的基因组DNA，使用小麦55KSNP(Affymetrix 55K SNP Array，CapitalBio Technology Company,Beijing,China)芯片对两亲本和RILs群体进行基因分型，该芯片在该群体中共检测到11975个多态性SNP标记，其中3D染色体上共220个标记。
利用JoinMap 4.0软件构建遗传连锁图谱，参数设置选用Independence LOD参数和Kosambi作图函数及回归映射算法(regression mapping algorithm)。遗传图谱构建流程如下：首先挑选出具有亲本多态性的SNPs，对其中基因型缺失率大于10％的SNPs进行过滤，然后基于过滤后的高质量SNPs，利用Regression mapping的作图方法，选择Kosambi函数进行遗传连锁图谱构建，设置不同的LOD阈值，最终获得遗传连锁图谱。
5.千粒重QTL初级定位
利用基于逐步回归的复合区间作图法的IciMapping4.2软件进行千粒重QTL定位，设置步长为1.0cM，P值以0.001为临界值，统计检测阈值为LOD＝2.5，即当LOD值大于2.5时认为该处存在一个真实有效的QTL。冀麦325基因型赋值为0，冀麦120基因型赋值为2。因此，当加性效应为正值时，表明增效等位变异来自于冀麦120。反之，则表明增效等位变异来自于冀麦325。
6.QTgw.cau-3D QTL区间标记的加密
根据QTgw.cau-3D侧翼55K SNP芯片序列所在的染色体位置，利用冀麦120和冀麦325重测序及外显子捕获(Exon capture)序列信息，获得QTgw.cau-3D区间内的基因组序列，根据亲本间序列的SNP信息并将其转化成KASP(Kompetitive allele specific PCR)标记。经亲本间PCR扩增及RIL群体验证，共获得3个目标QTL区间内三对多态性KASP标记并通过RIL群体将其加密于目标QTL区段。利用加密的遗传连锁图进行千粒重QTL的遗传定位。
具体过程及引物序列信息如下：
①KASP.cau-3D.1的正向引物(Forward primer，5’-3’)SEQ ID NO.1
(CGACAAGTGGGATGGGCTT)和SEQ ID NO.2
(CGACAAGTGGGATGGGCTC)分别在5’末端连上FAM和HEX荧光基团接头(adaptor)序列，作为KASP标记正向引物来分别检测主效QTgw.cau-3D紧密连锁标记，KASP.cau-3D.1的单核苷酸标记(SNP)的多态性，其中，等位基因为JM325类型接FAM荧光基团，等位基因为JM120类型接HEX荧光基团。共用反向引物(Reverseprimer，5’-3’)序列为SEQ IDNO.3(TTCTTGCACCCGATCAACCA)
②KASP.cau-3D.2的正向引物(Forward primer，5’-3’)SEQ ID NO.4
(TCGATGGATGTTTCCCAAATTTA)和SEQ ID NO.5
(TCGATGGATGTTTCCCAAATTTG)分别在5’末端连上FAM和HEX荧光基团接头(adaptor)序列，作为KASP标记正向引物来分别检测主效QTgw.cau-3D紧密连锁标记，KASP.cau-3D.2的单核苷酸标记(SNP)的多态性，其中，等位基因为JM325类型接FAM荧光基团，等位基因为JM120类型接HEX荧光基团。共用反向引物(Reverseprimer，5’-3’)序列为SEQ ID NO.6(AGCGTTCAACGACTTTGGAA)。
③KASP.cau-3D.3的正向引物(Forward primer，5’-3’)(TCTCTGCCAGCACAATCGAC)和(TCTCTGCCAGCACAATCGAT)分别在5’末端连上FAM和HEX荧光基团接头(adaptor)序列，作为KASP标记正向引物来分别检测主效QTgw.cau-3D紧密连锁标记，KASP.cau-3D.3的单核苷酸标记(SNP)的多态性，其中，等位基因为JM325类型接FAM荧光基团，等位基因为JM120类型接HEX荧光基团。共用反向引物(Reverseprimer，5’-3’)序列为(GGTTTGTCCAACTGCAATTTTCA)。
7.KASP标记的实施
1)引物配置：新合成的引物稀释成100μM/mL的浓度，按表1比例配置引物工作液。
表1.KASP引物工作液成分、体积及浓度
| 成分 | 体积(μl) | 工作液浓度(μM/L) |
| Forward primer-FAM(100μM/L) | 12 | 12 |
| Forward primer-HEX(100μM/L) | 12 | 12 |
| Common reverse primer(100μM/L) | 30 | 30 |
| Pure water | 46 | - |
| Total | 100 | - |
2)KASP标记PCR反应体系(8μl)及程序：
参照公司提供的步骤，设计PCR反应的体系和程序。反应体系的总体积为8μL，DNA模板浓度控制在50-100ng/μL左右(中国北京嘉程生物科技有限公司产品)。
PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s，61-55℃退火/延伸40s，其中，61-55℃梯度PCR，每循环降低-0.6℃，共10个循环；95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共28～34个循环；12℃保存；PCR扩增循环结束后，在终点荧光模式下，利用Bio-rad CFX-96instrument real-time PCR仪器进行荧光信号值读取，37℃读取1min(图4，图5)。
研究结果
1.千粒重主效QTL的初级定位
利用冀麦120/325RILs群体，于2020年河北邯郸(E1)、2021河北邯郸(E2)、2021河北石家庄(E3)、2021北京上庄(E4)及四个不同环境平均值对亲本及其RIL群体进行千粒重表型考察。利用小麦55K芯片对两亲本及“冀麦120/325”自交系群体(RIL)进行基因型分析，利用JoinMap 4.0软件构建RIL群体遗传连锁图谱，使用IciMapping 4.2软件的完备复合区间作图法(ICIM)进行千粒重QTL检测。结果表明，在小麦3D染色体长臂上定位到一个主效且稳定的千粒重主效QTL位点，即QTgw.cau-3D,该位点位于
AX-110915164-AX-109918023之间，LOD值4.43～6.47，表型变异率为9.63～10.57％，加性效应为1.24～1.75g，遗传距离为6.4cM，增效等位基因来自亲本冀麦120。
2.千粒重主效QTL QTgw.cau-3D紧密连锁标记的开发
利用193个RIL系群体，结合QTgw.cau-3D区间内新开发的三个多态性KASP标记进行目标区段遗传连锁图谱的加密(图1)。利用加密后的图谱信息，通过“冀麦120/325”RIL群体不同环境下千粒重表型数据，利用基于逐步回归的复合区间作图法的IciMapping4.2软件对控制千粒重的QTL定位发现，千粒重主效QTL QTgw.cau-3D定位在KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2之间，其LOD值为5.32～6.58，可解释千粒重表型变异的9.03～11.86％，加性效应为1.26～1.82g，遗传距离为2.8cM。KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2可作为目标QTL紧密连锁的分子标记。(表2)
表2QTgw.cau-3D遗传效应及其侧翼标记
3.千粒重主效QTL位点QTgw.cau-3D遗传效应验证
利用QTgw.cau-3D侧翼标记(KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2)扫描由冀麦120及冀麦325构建的F6 RIL群体中，鉴定到该群体的Line-19在该侧翼标记位点为杂合类型。因此申请人选择利用剩余杂合系Line-19自交衍生的近等基因系(NIL)对目标QTL QTgw.cau-3D的遗传效应进行验证。于2021(图2)和2022(图3)河北邯郸对近等基因系进行千粒重、粒长及粒宽等性状进行考察，结果表明，QTgw.cau-3D近等基因系NIL-JM120千粒重、粒长显著高于NIL-JM325，粒宽则无明显差异；利用该近等基因系进一步验证了千粒重主效QTL位点QTgw.cau-3D的遗传效应的稳定性，且该QTgw.cau-3D主要是通过增加小麦籽粒的长度来提高小麦千粒重。
综上，KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2与千粒重主效QTL—QTgw.cau-3D紧密连锁，为共显性标记(图4，图5)，其千粒重增效等位变异来自于冀麦120。KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2在小麦小麦高产标记辅助选择育种中具有重要的应用价值。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记，其特征在于，所述主效QTL定位于小麦3D染色体长臂上，命名为QTgw.cau-3D；所述QTgw.cau-3D包括两个连锁的KASP分子标记KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2，KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2的对应物理位置为3D：553,396,779-558,737,727，遗传距离为2.8cm；该千粒重QTL位点LOD值5.32～6.58，表型变异贡献率为9.03～11.86％，加性效应为1.26～1.82g；千粒重QTL位点的增效等位变异来自于亲本冀麦120；
所述KASP分子标记KASP.cau-3D.1和KASP.cau-3D.2，具体引物序列分别如下：
①KASP.cau-3D.1的引物序列
正向引物1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACAAGTGGGATGGGCTT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
正向引物2：5’-
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGACAAGTGGGATGGGCTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
共用反向引物：5’-TTCTTGCACCCGATCAACCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
②KASP.cau-3D.2的引物序列
正向引物1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGATGGATGTTTCCCAAATTTA-3’，如SEQ ID NO.4所示；
正向引物2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGATGGATGTTTCCCAAATTTG-3’，如SEQ ID NO.5所示；
共用反向引物：5’-AGCGTTCAACGACTTTGGAA-3’，如SEQ ID NO.6所示；
其正向引物1和正向引物2的5’末端分别连上FAM和HEX荧光基团接头。
2.根据权利要求1所述的所述的小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记，其特征在于，所述小麦千粒重主效QTL的基因分型方法，具体步骤如下：提取小麦基因组DNA，用序列SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的KASP.cau-3D.1标记的KASP引物和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的KASP.cau-3D.2的KASP标记引物序列对提取的基因组DNA进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述的所述的小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记，其特征在于，所述PCR扩增方法为：
PCR反应体系：每孔DNA使用量为50-100ng，KASP引物混合物0.1μl，HiGeno 2×ProbeMix 4.0μl；无菌水补至8μl；
PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s，61-55℃退火/延伸40s，其中，61-55℃梯度PCR，每循环降低-0.6℃，共10个循环；95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共28～34个循环；12℃保存；
KASP引物混合物包括：FAM正向引物、HEX正向引物、反向引物和无菌水；所述FAM正向引物浓度为12μmol/ml，所述HEX正向引物浓度为12μmol/ml，所述反向引物浓度为30μmol/ml。
4.权利要求1～3中任一项所述小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记在小麦高产育种中的应用。
5.权利要求1～3中任一项所述小麦千粒重主效QTL的KASP分子标记在高千粒重小麦育种中的应用。
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