CN108998562B

CN108998562B - 基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用

Info

Publication number: CN108998562B
Application number: CN201811050346.7A
Authority: CN
Inventors: 肖永贵; 付路平; 徐小婷; 杨梦娇; 扎西次仁; 夏先春; 何中虎
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2018-09-10
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2038-09-10
Also published as: CN108998562A

Abstract

本发明公开了基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用。本发明提供了用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质在如下任一中的应用：鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状；比较待测小麦籽粒的长短；选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种。本发明利用扬麦16/中麦895DH群体660K SNP高密度遗传图谱对籽粒长进行QTL定位，在2D染色体长臂上定位到一个主效QTL，在此研究基础上，开发了区间标记AX‑111538812的KASP标记专用引物组，为育种利用粒长QTL位点QKl.caas‑2DL提供了良好工具。

Description

基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用。

背景技术

小麦是重要的粮食作物，对我国乃至世界农业产业和粮食安全具有举足轻重的作用，持续提高单产是小麦育种永恒的主题，是满足于日益增长的人类需求的根本，而提高粒重是实现高产的关键。粒长、粒宽等性状是组成籽粒特征的关键指标，同时也影响小麦的加工品质，并是决定市场分级和贸易价值的关键。

过去几十年，我国小麦产量得到了极大提升，其根本原因在于优异种质的引进和传统育种方法的利用。近年来，随着优异种质作用减弱及气候变化导致的病虫害加剧，小麦产量潜力提高缓慢，传统育种方法已难以实现人们对高产育种目标的追求。分子标记辅助选择是利用与功能基因连锁或共分离的分子标记对特定性状进行定向选择的一种辅助育种方法，其可对目标性状关键基因位点进行快速检测和跟踪，加快育种进程，缩短育种年限，该方法的应用潜力取决于可用基因连锁标记的多少。

小麦粒型是受多基因控制的数量性状，前人研究定位了多个控制粒长、粒宽等籽粒性状的QTL位点。截至目前，已报道的与小麦粒型相关的QTL几乎分布在所有21条染色体上。Dholakia等(2003)利用包含106个家系的RIL群体对小麦粒长进行QTL定位，结果表明控制粒长的QTL主要位于2DL、2BL、6BS、5BL和7BL等染色体上。Ramya等(2010)将控制粒长的QTL定位在1A、2B、2D、5A、5B和5D等染色体上。由于研究所用遗传材料和分子标记的差异，一些QTL区间较大，其连锁标记距目标功能基因较远，不能有效用于分子辅助育种。另外，前人研究使用的SSR、RFLP等分子标记在用于基因型鉴定时，操作费时，通量低，难以满足当前及未来分子设计育种的需求。

单核苷酸多态性(SNP)是植物个体间最常见的遗传变异形式，常出现的单核苷酸多态性包括碱基的替换以及插入和缺失，是植物复杂性状遗传研究的理想分子标记。随着生物技术水平的发展，竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)技术作为一种高通量、低成本、低失误率的检测SNP分型的方法之一，在作物分子标记辅助育种应用中具有重要作用。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所和中国农业科学院棉花研究所合作选育的半冬性小麦品种，2012年通过黄淮南片国家审定。中麦895主要特点之一是籽粒大，产量高。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用。

第一方面，本发明要求保护一种用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状；

(B)比较待测小麦籽粒的长短；

(C)选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种；

(E)制备用于比较待测小麦籽粒的长短的产品；

(F)制备用于选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(G)制备用于选育粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

进一步地，所述用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质可为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒。

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物。

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体2D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

更进一步地，所述成套引物为由SEQ ID No.1的第22-52位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-52位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物。

更加具体的，所述SEQ ID No.1的第22-52位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQID No.1的第22-52位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A。所述SEQ IDNo.2的第22-52位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-52位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

在所述试剂或试剂盒中，还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。

所述荧光探针B为与所述特异荧光标签序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光标签序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。

本发明中所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和淬灭探针B是存在于KASP 2×Master Mix中，其中所述KASP 2×Master Mix是英国LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002(适用于96孔或384孔PCR板)。

在本发明的具体实施例方式中，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX；所述荧光报告基团A为FAM，所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。所述荧光标签序列FAM具体为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列HEX具体为SEQ ID No.2的第1-21位(即所述成套引物具体为由SEQ IDNo.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物)。

第二方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)直接测序；

(A2)用前文第一方面中所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为蓝色(聚集在位于分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴附近)，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为红色(聚集在位于分型结果荧光信号坐标系中靠近Y轴附近)，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为绿色(聚集在位于分型结果荧光信号坐标系中靠近对角线中间的位置)，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A和G的杂合体。

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为粉色，则可能由于所述待测小麦的基因组DNA质量差等原因导致无法明确其在2D上SEQ IDNo.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的类型。

方法B：一种比较待测小麦籽粒的长短的方法，包括如下步骤：

(B1)检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(B2)按照如下确定所述待测小麦籽粒的长短：基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的所述待测小麦的籽粒长度长于基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体或者是A和G的杂合体的所述待测小麦的籽粒长度。

方法C：一种选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(C1)检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(C2)选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的小麦，最终获得粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种。

进一步地，在实际应用中，选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体(GG基因型)的小麦作为亲本，与基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体(GG基因型)或A和G的杂合体(AG基因型)或A的纯合体(AA基因型)的小麦进行杂交，在育种各世代中选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体(GG基因型)或A和G的杂合体(AG基因型)的小麦，直至选育出基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体(GG基因型)的小麦的稳定单株或株系或品系或品种。

方法D：一种选育粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(D1)检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(D2)选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的小麦，最终获得粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种。

进一步地，在实际应用中，选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体(AA基因型)的小麦作为亲本，与基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体(AA基因型)或A和G的杂合体(AG基因型)或G的纯合体(GG基因型)的小麦进行杂交，在育种各世代中选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体(AA基因型)或A和G的杂合体(AG基因型)的小麦，直至选育出基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体(AA基因型)的小麦的稳定单株或株系或品系或品种。

进一步地，在所述方法B、所述方法C和所述方法D中，所述检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法均可为所述方法A。

第三方面，本发明要求保护具有如下(A)-(D)中至少一种功能的物质：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状；

(B)比较待测小麦籽粒的长短；

(C)选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种。

所述物质为前文第一方面中所述的用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ IDNo.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质。

第四方面，本发明要求保护前文所述的方法或所述的物质在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

(a)粒长相对较长；

(b)粒长相对较短。

第四方面，本发明要求保护前文所述的方法或所述的物质在小麦分子标记辅助育种中的应用。

在本发明中，所述粒长相对较长是指当所比较的小麦中基因组上其他影响籽粒长短的位点的效应相等时，基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦的籽粒长度相对于基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的籽粒长度更长。所述粒长相对较短是指当所比较的小麦中基因组上其他影响籽粒长短的位点的效应相等时，基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的籽粒长度相对于基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦的籽粒长度更短。

在前文各方面中，所述小麦可为但不限于如下品种中的任一种或任几种：扬麦16、中麦895、扬麦16/中麦895DH群体，以及实施例部分表1中所示的196份小麦品种。

本发明利用扬麦16/中麦895双单倍体(Doubled Haploid，DH)群体660K SNP高密度遗传图谱对籽粒粒长性状进行QTL定位，在2D染色体长臂上定位到一个主效QTL，记为QKl.caas-2DL，其增效等位基因来自中麦895，解释表型变异达5.8％～11.5％。在此研究基础上，本发明将其区间SNP标记AX-111538812转化为可用于高通量、低成本和低失误率地检测或辅助检测籽粒长短的KASP标记，命名为AX-111538812-KASP，并进一步开发了QKl.caas-2DL的区间标记AX-111538812的KASP标记专用引物组。通过实验证明：本发明所述KASP分子标记AX-111538812-KASP可用于小麦粒长主效QTL QKl.caas-2DL的分子标记辅助选择育种。本发明为育种利用粒长QTL位点QKl.caas-2DL提供了良好工具，对于加快利用该QTL位点优异等位基因进行遗传改良，提高育种效率具有重要实践意义。

附图说明

图1为利用小麦660K SNP芯片标记构建的DH群体粒长QTL QKl.caas-2DL附近的遗传连锁图。图中数值表示标记的遗传位置，单位为cM；红色区块表示QKl.caas-2DL的左右标记所在区间。

图2为采用KASP标记AX-111538812-KASP对中麦895、扬麦16和部分DH群体家系的检测结果。

图3为采用KASP标记AX-111538812-KASP对196份小麦品种的检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用小麦品种均由国家小麦改良中心提供。

下述实施例中的定量试验，籽粒长度采用杭州万深检测科技有限公司开发的万深SC-G型自动种子考种分析及千粒重仪进行测定。

下述实施例中的定量试验，均设置三次生物学重复实验，结果取平均值。

实施例1、小麦粒长主效QTLQKl.caas-2DL的区间SNP标记AX-111538812及其KASP标记引物组的获得

供试材料：中麦895和扬麦16分别是我国黄淮麦区和长江中下游冬麦区主推品种之一，综合农艺性状优良。中麦895主要特点之一是籽粒大，产量高。本发明以扬麦16为母本，中麦895为父本，构建DH群体，含174个家系。

田间试验：DH群体于2017–2018年度种植于河南新乡和漯河试验站，采用随机区组设计，设置三次重复，采取小区播种方式种植，每个小区六行，行长3m，行距25cm。田间管理参考当地试验站管理，另外重点进行白粉病、条锈病、蚜虫等病虫害防治。

粒长测定：采用万深SC-G型自动种子考种分析及千粒重仪(杭州万深检测科技有限公司，https://www.instrument.com.cn/netshow/SH102434/)对籽粒长度进行测定，操作方法按照仪器操作规程进行。

遗传图谱构建：构建遗传图谱前，先将无多态性、标记缺失率大于10％以及偏分离大于30％的标记去除。然后采用IciMapping V4.0软件的BIN-Mapping功能对剩余的多态性标记进行优化处理，以用于遗传图谱构建。利用JoinMap V4.0和MSTmap Online软件和程序进行遗传图谱构建。

QTL定位和连锁标记AX-111538812的发现：利用QTL IciMapping V4.0软件，采用完备复合区间作图法(ICIM)对DH群体174个家系不同环境下粒长进行QTL定位。LOD值选取3.0作为阈值。定位结果显示，在2D染色体长臂上存在一个控制粒长的主效QTL(图1)，其左右标记分别为AX-111601893和AX-111538812，该位点解释表型变异达5.8％～11.5％，其增效等位基因来自中麦895。进行大量序列分析、比对以及预实验，发现SNP标记AX-111538812的侧翼序列在2D染色体上具有特异性，因此将其转化为KASP标记，用于分子标记辅助选择育种。

KASP标记AX-111538812-KASP的引物组的获得：SEQ ID No.4为SNP标记AX-111538812的侧翼序列，其中SEQ ID No.4的第36位为该SNP标记的两种多态性单核苷酸A或G，即在实际小麦材料中该位置碱基为A或G。用SEQ ID No.4在国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)IWGSC(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)进行检索，获得3条与SEQ IDNo.4一致性在90％以上的同源序列，分别为序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7，其分别定位于小麦2A、2B和2D染色体。其中SEQ ID No.7包含SNP标记AX-111538812在SNP位点为G碱基的SEQ ID No.4。对SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7进行多序列比对，根据染色体特异性和KASP引物设计的一般原则，设计成套KASP引物组，由引物A、引物B和引物C组成。两条上游引物(引物A和引物B)3’末端为标记AX-111538812的等位变异碱基A/G，下游引物(引物C)保证了PCR扩增的2D染色体特异性。上游引物5’端连接有荧光标签序列，其中引物A的5’端连接为FAM荧光标签序列：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，引物B的5’端连接为HEX荧光标签序列：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

引物A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACGTAAGGATCTTTTTACTCCTTATACCTT

-3’(SEQID No.1，下划线部分为特异荧光标签序列FAM)；

引物B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACGTAAGGATCTTTTTACTCCTTATACCTT

-3’(SEQID No.2，下划线部分为特异荧光标签序列HEX)；

引物C：5’-ACCCCGTAGGAAAGATTGGATGACAG-3’(SEQ ID No.3)。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增AX-111538812SNP位点基因型为G:G的片段。

上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增AX-111538812SNP位点基因型为A:A的片段。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增AX-111538812SNP位点基因型为A:G的片段。

实施例2、用KASP标记检测SNP标记AX-111538812基因型方法的建立

用KASP标记AX-111538812-KASP的引物组检测扬麦16/中麦895DH群体亲本及部分家系

1、采用CTAB法提取扬麦16/中麦895DH群体各家系的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用实施例1所述用于检测小麦中SNP标记AX-111538812的KASP标记引物组进行PCR扩增，得到扩增产物。

KASP标记引物工作液的制备：

分别取上游引物(引物A和引物B)12μL(100μM)，取下游引物(引物C)30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液备用。

PCR扩增反应体系：含有DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASP 2×Master Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL。其中，KASP 2×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成。荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个HEX荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；

PCR反应程序如下：

第一步：95℃预变性15min；

第二步：95℃20s、65℃60s，95℃20s、64℃60s，95℃20s、63℃60s，95℃20s、62℃60s，95℃20s、61℃60s，95℃20s、60℃60s，95℃20s、59℃60s，95℃20s、58℃60s，95℃20s、57℃60s；

第三步：95℃变性20s、57℃复性60s，32个循环；10℃保存。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

3、PCR扩增产物荧光信号扫描：

采用多功能酶标仪对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；HEX激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。

4、等位基因分型：

采用Kluster Caller软件对酶标仪扫描数据进行分析(具体方法参照KlusterCaller软件说明书，公众可从LGC公司获得)，根据分析结果按照如下确定待测小麦SNP标记AX-111538812的基因型：待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在位于分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴附近显示为蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型(即GG基因型)；聚集在靠近Y轴附近显示为红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型(即AA基因型)；聚集在坐标系中靠近对角线中间位置显示为绿色的样本的基因型为杂合基因型(即AG基因型)；显示为粉色的样本，可能由于其基因组DNA质量差等原因导致无法明确其基因型。左下角显示为黑色的样本为空白对照。

采用上述KASP标记引物组检测扬麦16/中麦895DH群体亲本及部分家系基因型，分型结果如图2所示，具体而言：待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在靠近X轴附近显示为蓝色的样本(图2中样本集合1)，基因型为GG，其中包括亲本中麦895；扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在接近Y轴附近显示为红色的样本(图2中样本集合2)，基因型为AA，其中包括亲本扬麦16；左下角显示为黑色的样本为空白对照(图2中样本3)。

实施例3、使用KASP标记AX-111538812-KASP辅助鉴定小麦粒长在育种中的应用

1、供试材料

供试材料包括：测试组包括196份小麦品种(表1)，另外设置无菌超纯水作为空白对照组。

测试组材料粒长测定：196份小麦品种于2017–2018年度种植于河南漯河试验站，采用完全随机区组设计，设置三次重复，双行区，行长1.0m，行宽20cm，田间管理按照当地试验站管理进行。种子成熟收获后，采用实施例1所述方法分析测试组各重复的籽粒长度，取三个重复的均值用于统计分析。

2、用KASP标记AX-111538812-KASP引物组检测测试组和对照组：

按照实施例2所述方法，提取各实验材料基因组DNA，并采用上述高通量分子标记检测体系分析测试组和对照组的基因型。测试结果如图3所示：无菌超纯水作为空白对照，其分型结果聚集在荧光信号坐标系的左下角，显示为黑色；中麦895以及另外134份小麦品种分型结果聚集在靠近X轴附近，显示为蓝色，基因型为GG；扬麦16以及另外62份品种分型结果聚集在靠近Y轴附近，显示为红色，基因型为AA。具体的，采用所述KASP标记检测196份测试组小麦品种的基因型结果列于表1，196份测试组小麦品种的粒长测定结果也列于表1。采用国际通用SAS 9.2统计软件中的PROC TTEST模型对196份测试组小麦品种不同基因型材料的粒长进行t检验，结果如表2所示，表明：基因型为GG的品种比基因型为AA的品种粒长平均值高1.9％，在p<0.01水平上有显著差异，说明上述KASP标记AX-111538812-KASP的引物组及基因型检测体系可以用于以改良小麦粒长为目标的分子辅助选择育种。

表1 196份小麦品种粒长及用KASP标记AX-111538812-KASP检测的基因型

表2 196份小麦品种粒长t检验

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用

<130> GNCLN181761

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tacgtaagga tctttttact ccttatacct tg 52

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tacgtaagga tctttttact ccttatacct ta 52

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

accccgtagg aaagattgga tgacag 26

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> r为g或a

<400> 4

agggaacgta aggatctttt tactccttat accttrtgtc cttctaatct ctgtcatcca 60

atctttccta c 71

<210> 5

<211> 415

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 5

atgggaatac cgtgcatgag gccgcaaagt gatatgatgt gttacatgct agatcaatgt 60

gacttaggat tgggttcttg aaagctttgg tatcagagcc tgactgcctg taggattacc 120

aagccaaact ggtcgaagtt gagtctagaa attctttagt tatatagggg aattgattgt 180

ggaagggaac gtaaggctct ttttactcct tatacctcat gtccttctga tctgagtcat 240

cctatctttc ctacggggtt aaggaactag gctttctctt ctgtctatca ggatcacgtg 300

ttactactcc atagtctctt aggattggtt gatcagagtc atattccaga ttttgagtac 360

ttccggtgta gttgtttagt agtatcacag aaccttgagt gatgatgttg agtat 415

<210> 6

<211> 410

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 6

gcgtgaggtc acaaagtgat atgatgtgtt acatgctaga tcggtgtgac ttaggatcgg 60

ggtcctgaca gctttggtat cagggcttga ctgcctatag gattaccaag ccaaactggt 120

caaagttgag tctagaaatg ctttagttat atgtagggga attgattatg gatgggaacg 180

taaggctctt tttactcctt ataccttatg gccttctgat ctgagtcatc ctatctttcc 240

tacggggtta agaaactagg ttttctgttc tttctatcag gatcatgtgt tactcatccg 300

tagacttata agattgttgg atttaagcct cagttcagtt tctactgctt ccatgtgttc 360

atagctggcc tcagaacctt gatattgtga tgatcgagtg gtttccacca 410

<210> 7

<211> 419

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 7

taccgtgcgt gaggccgcaa agtgatatga tgtgttacat gctagatcgg tgtgacttag 60

gatcggggtc ctgacaattt tggtatcaga gcctgactgc ctgtaggatt accaagccaa 120

actggtcaaa gtttagtcta gaaatgcttt agttatatca gggaattgat tgtggaaggg 180

aacgtaagga tctttttact ccttatacct tgtgtccttc taatctctgt catccaatct 240

ttcctacggg gttaagaact aggcttctca tctttctatc aggttcacgt gttactaatc 300

cgtagactca taggattgat ggattcaagt cttagttcag tttctactac ctccgtgtga 360

tgacagttga tctcagaacc ttgatattgt gatgttgagt ggtcatgcca ctattttgc 419

Claims

1.用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状；

(B)比较待测小麦籽粒的长短；

(C)选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种；

(E)制备用于比较待测小麦籽粒的长短的产品；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体2D上SEQ IDNo.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述成套引物为由SEQ ID No.1的第22-52位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-52位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物；

所述SEQ ID No.1的第22-52位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.1的第22-52位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；

所述SEQ ID No.2的第22-52位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-52位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；

所述荧光探针A为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX；所述荧光报告基团A为FAM，所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。

6.如下任一方法：

(A1)直接测序；

(A2)用权利要求5所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A和G的杂合体；

(B2)按照如下确定所述待测小麦籽粒的长短：基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的所述待测小麦的籽粒长度长于基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体或者是A和G的杂合体的所述待测小麦的籽粒长度；

(C2)选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体2D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的小麦，最终获得粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种；

(D2)选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体2D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的小麦，最终获得粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法B、所述方法C和所述方法D，所述检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法为所述方法A。

8.具有如下(A)-(D)中至少一种功能的物质，为权利要求2-5任一中所述的用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质；

(A)鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状；

(B)比较待测小麦籽粒的长短；

(C)选育粒长相对较长的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育粒长相对较短的小麦单株或株系或品系或品种。

9.权利要求6或7所述的方法或权利要求8所述的物质在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

(a)粒长相对较长；

(b)粒长相对较短。

10.权利要求6或7所述的方法或权利要求8所述的物质在小麦分子标记辅助育种中的应用。