CN117230230A - 一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法。本发明提供了小麦基因组上特定SNP位点(位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37，为T或C)的单核苷酸多态性作为标记物在鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性中的应用。本发明根据所述特定SNP位点开发了KASP引物，可以对黑胚病基因进行分子标记辅助筛选。本发明对于培育黑胚病抗体增强的小麦品种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法。
背景技术
黑胚病是一种世界性病害，主要症状表现为籽粒胚部呈现明显的黑褐色斑点，严重影响籽粒外观、加工及营养品质，降低小麦商品等级。近年来，随着土壤条件的改善以及全球气候的变化，黑胚病愈发严重，威胁小麦生产安全。在我国小麦黑胚病主要发生在黄淮麦区和长江中下游地区。我国要求三等以上不完善粒小于6％(国标GB-1351-2008)。使用种子包衣剂并在灌浆期喷施药剂是防治黑胚病的主要方式，但会带来严重的环境污染，因此，选育抗病品种是防治黑胚病经济有效的方法。
黑胚病抗性是由多基因控制的复杂数量性状，不同品种间抗性差异显著，发掘抗性基因并开发紧密连锁标记是黑胚病抗性育种亟需解决的问题。与抗黑胚病QTL紧密连锁的分子标记可通过分子标记辅助选择(Marker assisted selection，MAS)有目的地进行基因累加，提高品种抗性。MAS已广泛应用于连锁分析、关联分析、标记辅助选择和作物设计育种等领域。随着基因组学和分子生物学的进展，SNP标记发展成为目前小麦遗传研究中应用最为广泛的一类分子标记。近年来，小麦90K、660K、50K、55K和35K等基因芯片发展迅速，在小麦复杂性状遗传解析研究中广泛应用。SNP标记已逐渐应用于高密度遗传图谱构建、数量性状基因定位和种质基因型检测中，有效加速分子育种进程。KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术可在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。LGC Genomics公司研发的基于KASP技术的SNP基因分型检测方案，有效节约成本，高效应用于大批量材料的特异标记检测工作。
发明内容
本发明的目的是提供一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法。
第一方面，本发明要求保护小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。所述特定SNP位点对应于小麦参考基因组Chinese Spring RefSeq v1.0的物理位置109.9Mb(https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/)(下同)。
第二方面，本发明要求保护用于检测小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。
其中，用于检测小麦基因组上所述特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质为后文第三方面中所述的KASP引物或后文第四方面中所述的试剂或试剂盒。
第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物。
本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-39位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。
其中，所述荧光标签序列A的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B的核苷酸序列可为SEQ ID No.2的第1-21位。
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
第四方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的试剂或试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有前文第三方面中所述的KASP引物。
第五方面，本发明要求保护一种特异性DNA分子。
本发明所要求保护的特异性DNA分子如SEQ ID No.4所示。其中，SEQ ID No.4的第37位的Y为T或C。
第六方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的KASP引物或前文第四方面中所述的试剂或试剂盒或前文第五方面中所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
在(A9)中，所述育种的目的是获得黑胚病抗性增强的小麦品种。
第七方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的黑胚病抗性强弱：T:T基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性强于或候选强于C:C基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型。
方法II：一种选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择T:T基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择T:T基因型的小麦，最终获得黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型。
方法III：一种筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，将C:C基因型的所述待测小麦筛选出来剔除出去；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型。
在上述方法中，检测所述待测小麦的基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸可通过直接测序完成，也可按照包括如下步骤的方法进行：利用前文第四方面中所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述特定SNP位点的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为C:C基因型。
在本发明的具体实施方式中，所述黑胚病抗性强弱是通过籽粒的黑胚率高低体现的。籽粒的黑胚率高说明黑胚病抗性弱，籽粒的黑胚率低说了明黑胚病的抗性强。
在本发明中，所述小麦可选自临麦2号和中892的杂交后代或者表2中166份小麦材料。
本发明基于特定SNP位点(小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，为T或C)开发了KASP引物，进而分别统计临麦2号/中892的F6 RIL群体和166份自然品种中两种基因型的小麦的平均黑胚率，结果表明，RIL群体中TT纯合型的小麦品种(黑胚率18.6％)比CC纯合型(黑胚率21.8％)的小麦品种的黑胚率的平均值降低了14.7％；自然品种中TT纯合型的小麦品种(黑胚率22.2％)比CC纯合型的小麦品种(黑胚率28.3％)的黑胚率的平均值降低了21.6％。两个群体结果数据菌在0.05水平上有显著差异。本发明所开发的KASP引物，可以对黑胚病基因进行分子标记辅助筛选。本发明对于培育黑胚病抗体增强的小麦品种具有重要意义。
附图说明
图1为K-6A-109.9对临麦2号/中892RIL群体基因分型结果。红色为临麦2号基因型(CC)，蓝色为中892基因型(TT)，粉色为检测失败，绿色杂合(TC)。
图2为K-6A-109.9对166份小麦品种基因分型结果。红色为临麦2号基因型(CC)，蓝色为临麦2号中892基因型(TT)，粉色为检测失败，绿色杂合(TC)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
临麦2号：记载于“刘正学,刘飞,李宝强,王靖,朱新亮,王桂香.(2005).高产小麦新品种临麦2号的选育及栽培技术研究.中国农学通报(06),188-192”一文中，该品种是临沂市农业科学院以自育品系临90-15与鲁麦23进行杂交，通过系谱法选育而成的小麦品种。临麦2号具有综合农艺性状好、产量潜力高、稳产性好、适应性广的特点。
中892：记载于“刘金栋.普通小麦黑胚病抗性的遗传解析.中国农业大学,2018”一文中，该品种是中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所以(786-11(欧柔/北京8号)的F6代品系为母本，LK338/730-04的F3代品系为父本选育而成，具有高产稳产、抗倒广适、千粒重高且稳定的优点。
黑胚率是小麦籽粒成熟后黑胚籽粒所占比例，是黑胚病抗性评价的指标。
实施例1、抗黑胚病分子标记的K-6A-109.9的开发和多态性检测
一、分子标记K-6A-109.9的开发
本发明的发明人经过大量实验，通过精细定位的方式，在小麦6A染色体上109.9Mb处设计并合成适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定小麦黑胚病抗性的引物组。KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R 3条引物序列组成，用于扩增包括K-6A-109.9位点(SNP位点)的靶序列。
上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCAGCAGTGTAGGCGA-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为特异荧光标签序列FAM)；
上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGCAGCAGTGTAGGCGG-3’(SEQ ID No.2，下划线部分为特异荧光标签序列HEX)；
下游引物R：5’-GTCCTTGGATGCAGCCAAT-3’(SEQ ID No.3)。
K-6A-109.9位点为小麦基因组中SEQ ID No.4自5’末端起第37位的核苷酸(对应两条上游引物的3’末端最后一个碱基)，为T或C(在SEQ ID No.4中用Y表示)，该位点的基因型可为TT纯合型、CC纯合型和TC杂合型。
SEQ ID No.4：TCAGCAGCAGCTTTTCAGAACACGACGAAGCAAGTA[Y]CGCCTACACTGCTGCAGTTCCAGCAGCCTCAGAACA(Y为T/C)。
由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。K-6A-109.9位点的基因型均为正义DNA的基因型。
上游引物F1用于扩增小麦6A染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为A(对应正义链，该SNP位点处核苷酸为T)的情况，上游引物F2用于扩增小麦6A染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为G(对应正义链，该SNP位点处核苷酸为C)的情况；下游引物R为通用引物。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦6A染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为A纯合(对应正义链，该SNP位点的基因型为T:T纯合型)的片段。
上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦3B染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为G纯合(对应正义链，该SNP位点的基因型为C:C纯合型)的片段。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增小麦6A染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为A和G杂合(对应正义链，该SNP位点的基因型为T:C杂合型)的片段。
二多态性检测
(一)临麦2号/中892田间黑胚病抗性的表型鉴定
1、以临麦2号为母本，中892为父本，采用单粒传法构建一个含有271个F6株系的RIL群体。临麦2号/中892RIL群体271个F6株系及其亲本种植于河南安阳(2012-2013和2013-2014年度)、安徽濉溪(2013-2014年度)和甘肃清水(2013-2014年度)。田间种植采用完全随机区组设计，单行区，3次重复，行距0.2m，行长1.5m，50粒/行。在整个小麦生育过程中，田间管理按照当地常规栽培技术进行。在小麦正常收获脱粒后，每次重复的单个株系随机选取200粒籽粒，采用统一标准(籽粒胚部有肉眼可见黑褐色斑点)统计黑胚籽粒个数，并计算黑胚率，三次技术重复。最终，以三个生物重复的均值作为该株系最终黑胚率。
2、完成步骤1后，选用国际通用SAS统计软件PROC CORR模型计算黑胚率(即黑胚病抗性)的Pearson相关系数、PROC MIXED命令进行方差分析。方差分析结果表明，黑胚率在不同基因间存在极显著差异，五个环境的相关系数在0.52-075之间，相关性较好，进而明确表型数据的有效性。
(二)271份小麦RIL群体的分子鉴定
1、采用CTAB法提取271份小麦种质资源幼嫩叶片的基因组DNA。基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2100(Thermo)检测A260/A280比值介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)，A260/A230比值介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)，270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；待测小麦的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。
2、竞争性等位基因特异性PCR。以待测小麦的基因组DNA为模板，采用步骤一合成的KASP引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系：2.0μl KASP 2×Master Mix(LGC,货号：13448166)、0.048μl KASP引物(3条引物混合，总浓度为50μM，其中两条上游引物和一条下游引物的摩尔比为2:2:5)、1.952μl模板DNA(50ng/μl)。扩增使用384孔PCR仪(BIO-RAD，S1000TMThermal Cycler)。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃1min，继续扩增26个循环。
3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测小麦基于K-6A-109.9位点的基因型。具体的判断原则如下：如果待测小麦基于K-6A-109.9位点显示蓝色荧光信号，则该待测小麦基于K-6A-109.9位点的基因型TT纯合型，与中892一致；如果待测小麦基于K-6A-109.9位点显示红色荧光信号，则该待测小麦基于K-6A-109.9位点的基因型为CC纯合型，与临麦2号一致；如果待测小麦基于K-6A-109.9位点显示绿色荧光信号，则该待测小麦基于K-6A-109.9位点的基因型为TC杂合型。检测结果见图1。
需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
三、显著性分析
分别统计临麦2号/中892的F6 RIL群体中两种基因型的小麦的平均黑胚率，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型进行t检验。统计结果见表1。结果表明，TT纯合型的小麦品种(黑胚率18.6％)比CC纯合型(黑胚率21.8％的小麦品种的黑胚率的平均值降低了14.7％，在0.05水平上有显著差异(表2)。
由此可见，利用K-6A-109.9位点的基因型可以鉴定小麦的黑胚病抗性，K-6A-109.9位点的基因型为TT纯合型的待测小麦的黑胚病抗性显著高于CC纯合型的待测小麦。
表1、临麦2号/中892RIL群体中K-6A-109.9检测结果及黑胚率
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注：-表示表型数据缺失。亲本临麦2号为基因型CC，亲本中892为基因型TT，杂合为TC，NN代表基因型缺失。
表2、K-6A-109.9检测临麦2号/中892RIL群体结果
实施例2、抗性引物组与小麦自然品种黑胚病抗性的关联分析及验证
1、检测166个小麦品种基于K-6A-109.9位点的基因型
按照实施例1中的方法，将待测小麦分别替换为166个品种，其它步骤均不变，得到166个小麦品种基于K-6A-109.9位点的基因型。检测结果见图2。
2、检测黑胚率
166份黄淮麦区品种种植于河南安阳(2012-2013、2013-2014和2014-2015年度)和安徽濉溪(2012-2013和2013-2014年度)。所有试验均采用随机区组设计，3次重复，3行区，行长2m，行距25cm，50粒/行。田间管理按当地常规管理规程进行，进行黑胚病抗性鉴定。在小麦正常收获脱粒后，每次重复的单个株系随机选取200粒籽粒，采用统一标准(籽粒胚部有肉眼可见黑褐色斑点)统计黑胚籽粒个数，并计算黑胚率，三次技术重复。最终，以三个生物重复的均值作为该株系最终黑胚率。
3、关联分析
分别统计两种基因型的小麦的平均黑胚率，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROCTTEST模型进行t检验。统计结果见表2。结果表明，TT纯合型的小麦品种(黑胚率22.2％)比CC纯合型(黑胚率28.3％)的小麦品种的黑胚率的平均值降低了21.6％，在0.05水平上有显著差异(表3、表4)。
表3、166份小麦品种的基因型检测结果
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注：TT：中892基因型；CC：临麦2号因型；TC：杂合基因型；NN：未识别基因型,-代表表型缺失。
表4、K-6A-109.9检测临麦2号/中892RIL群体结果
由此可见，利用K-6A-109.9位点的基因型可以鉴定小麦的黑胚病抗性，K-6A-109.9位点的基因型为TT纯合型的待测小麦的黑胚病抗性显著高于CC纯合型的待测小麦。
上述结果表明，通过检测待测小麦基于K-6A-109.9位点的基因型可以鉴定小麦黑胚病抗性，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。
2.用于检测小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：用于检测小麦基因组上所述特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质为权利要求4或5中所述的KASP引物或权利要求6或7所述的试剂或试剂盒。
4.用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-39位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。
5.根据权利要求4所述的KASP引物，其特征在于：所述荧光标签序列A的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位；
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
6.用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有权利要求4或5中所述的KASP引物。
7.特异性DNA分子，如SEQ ID No.4所示。
8.权利要求4或5所述的KASP引物或权利要求6所述的试剂或试剂盒或权利要求7所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
9.如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的黑胚病抗性强弱：T:T基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性强于或候选强于C:C基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型；
方法II：一种选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择T:T基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择T:T基因型的小麦，最终获得黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
方法III：一种筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，将C:C基因型的所述待测小麦筛选出来剔除出去；
所述特定SNP位点位于小麦6A染色体上SEQ ID No.4的第37位，该SNP位点处的核苷酸为T或C；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为C的纯合型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：检测所述待测小麦的基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸按照包括如下步骤的方法进行：利用权利要求6所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述特定SNP位点的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为C:C基因型。
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