CN116855631A - 一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 - Google Patents
一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116855631A CN116855631A CN202311023934.2A CN202311023934A CN116855631A CN 116855631 A CN116855631 A CN 116855631A CN 202311023934 A CN202311023934 A CN 202311023934A CN 116855631 A CN116855631 A CN 116855631A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wheat
- resistance
- black
- genotype
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 203
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 203
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 43
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 41
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 30
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 29
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 24
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 24
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 11
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- -1 salt ion Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
- A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记。本发明提供了小麦基因组上特定SNP位点(位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，为T或G)的单核苷酸多态性作为标记物在鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性中的应用。本发明根据所述特定SNP位点开发了KASP引物，可以对黑胚病基因进行分子标记辅助筛选。本发明对于培育黑胚病抗体增强的小麦品种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记。
背景技术
小麦高产、稳产直接影响着人民群众生活质量和国家粮食安全。黑胚病是一种典型的籽粒病害，在我国的长江流域、黄淮流域等小麦主产区发病严重。黑胚病感病籽粒胚部呈黑褐色，加工和营养品质显著降低。我国要求三等以上不完善粒(包括黑胚籽粒)小于6％(国标GB-1351-2008)。近年来，随着肥水条件的改善，黑胚病已成为制约小麦可持续生产的重要因素。施用农药和种植抗病品种是防治小麦病害的主要方式，但黑胚病为籽粒病害，化学防治最佳窗口期短，农药施用无法起到良好的防治效果。因此，选育与推广抗病品种是降低小麦黑胚病危害最为经济、有效和安全的途径。
明确黑胚病抗性基因的位置及其遗传机制是选育抗病新品种的基础。连锁分析可基于双亲遗传群体，鉴定抗黑胚病QTL位点。与抗黑胚病QTL紧密连锁的分子标记可通过分子标记辅助选择(Marker assisted selection，MAS)有目的地进行基因累加，提高品种抗性。应用紧密连锁分子标记可在基因型水平上对作物种质资源和育种世代材料进行深入评价和鉴定，有效缩短抗病育种年限。分子标记辅助品质和抗病育种实践中，常采用表型分析、生化标记和基因标记鉴定相结合的方法。目前，用于基因型鉴定的分子标记有STS、SSR、SNP和InDel等。随着基因组学和分子生物学的进展，基于芯片或重测序可快速获取大量的SNP变异数据。近年来，小麦90K、660K、50K、55K和35K等基因芯片发展迅速，已广泛应用于小麦复杂性状遗传解析研究中。SNP标记已逐渐应用于高密度遗传图谱构建、数量性状基因定位和种质基因型检测中，有效加速分子育种进程。LGC Genomics公司研发的基于KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术的SNP基因分型检测方案，可通过通用荧光探针来代替针对位点荧光探针，有效节约成本，可高效应用于大批量材料的特异标记检测工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记。
第一方面，本发明要求保护小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G。所述特定SNP位点对应于小麦参考基因组Chinese Spring RefSeq v1.0的物理位置640.1Mb(https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/)(下同)。
第二方面，本发明要求保护用于检测小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G。
其中，用于检测小麦基因组上所述特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质为后文第三方面中所述的KASP引物或后文第四方面中所述的试剂或试剂盒。
第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物。
本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-42位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-42位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。
其中，所述荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，其核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B为荧光标签序列HEX，其核苷酸序列可为SEQ ID No.2的第1-21位。
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
第四方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的试剂或试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有前文第三方面中所述的KASP引物。
第五方面，本发明要求保护一种特异性DNA分子。
本发明所要求保护的特异性DNA分子如SEQ ID No.4所示。其中，SEQ ID No.4的第38位的K为T或G。
第六方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的KASP引物或前文第四方面中所述的试剂或试剂盒或前文第五方面中所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
在(A9)中，所述育种的目的是获得黑胚病抗性增强的小麦品种。
第七方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的黑胚病抗性强弱：G:G基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性强于或候选强于T:T基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
所述G:G基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为G的纯合型。
方法II：一种选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择G:G基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择G:G基因型的小麦，最终获得黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G；
所述G:G基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为G的纯合型。
方法III：一种筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，将T:T基因型的所述待测小麦筛选出来剔除出去；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型。
在上述方法中，检测所述待测小麦的基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸可通过直接测序完成，也可按照包括如下步骤的方法进行：利用前文第四方面中所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述特定SNP位点的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为G:G基因型。
在本发明的具体实施方式中，所述黑胚病抗性强弱是通过籽粒的黑胚率高低体现的。籽粒的黑胚率高说明黑胚病抗性弱，籽粒的黑胚率低说了明黑胚病的抗性强。
在本发明中，所述小麦可选自临麦2号和中892的杂交后代或者表2中166份小麦材料。
本发明基于特定SNP位点(小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，为T或G)开发了KASP引物，进而分别统计临麦2号/中892的F6 RIL群体和166份自然品种中两种基因型的小麦的平均黑胚率，结果表明，RIL群体中GG纯合型的小麦品种(黑胚率16.0％)比TT纯合型(黑胚率20.2％)的小麦品种的黑胚率的平均值降低了20.8％；自然品种中GG纯合型的小麦品种(黑胚率20.8％)比TT纯合型(黑胚率22.6％)的小麦品种的黑胚率的平均值降低了8.0％。两个群体结果数据菌在0.05水平上有显著差异。本发明所开发的KASP引物，可以对黑胚病基因进行分子标记辅助筛选。本发明对于培育黑胚病抗体增强的小麦品种具有重要意义。
附图说明
图1为K-3B-640.1对临麦2号/中892RIL群体基因分型结果。蓝色为临麦2号基因型(TT)，红色为中892基因型(GG)，绿色杂合(TG)。
图2为K-3B-640.1对166份小麦品种基因分型结果。蓝色为临麦2号基因型(TT)，红色为中892基因型(GG)，粉色为检测失败，绿色为杂合(TG)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
临麦2号：记载于“刘正学,刘飞,李宝强,王靖,朱新亮,王桂香.(2005).高产小麦新品种临麦2号的选育及栽培技术研究.中国农学通报(06),188-192”一文中，该品种是临沂市农业科学院以自育品系临90-15与鲁麦23进行杂交，通过系谱法选育而成的小麦品种。临麦2号具有综合农艺性状好、产量潜力高、稳产性好、适应性广的特点。
中892：记载于“刘金栋.普通小麦黑胚病抗性的遗传解析.中国农业大学,2018”一文中，该品种是中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所以(786-11(欧柔/北京8号)的F6代品系为母本，LK338/730-04的F3代品系为父本选育而成，具有高产稳产、抗倒广适、千粒重高且稳定的优点。
黑胚率是小麦籽粒成熟后黑胚籽粒所占比例，是黑胚病抗性评价的指标。
实施例1、抗黑胚病分子标记的K-3B-640.1的开发和多态性检测
一、分子标记K-3B-640.1的开发
本发明的发明人经过大量实验，通过精细定位的方式，在小麦3B染色体上(640.1Mb)设计并合成适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定小麦黑胚病抗性的引物组。KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R 3条引物序列组成，用于扩增包括K-3B-640.1位点(SNP位点)的靶序列。
上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCACTTCCTTTTGAGGGAGA-3’(SEQ IDNo.1，下划线部分为特异荧光标签序列FAM)；
上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCACTTCCTTTTGAGGGAGC-3’(SEQ IDNo.2，下划线部分为特异荧光标签序列HEX)；
下游引物R：5’-CAAAAGCTTAGAGGAATGGTCG-3’(SEQ ID No.3)。
K-3B-640.1位点为小麦基因组中SEQ ID No.4自5’末端起第38位的核苷酸(对应两条上游引物的3’末端最后一个碱基)，为T或G(在SEQ ID No.4中用K表示)，该位点的基因型可为TT纯合型、GG纯合型和TG杂合型。
SEQ ID No.4：
TCGCAAAAGCTTAGAGGAATGGTCGAAACACTTGCTT[K]CTCCCTCAAAAGGAAGTGGGGAATCCGATGTGAGTTCTGTGATTCTTTCG(K为T/G)。
由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。K-3B-640.1位点的基因型均为正义DNA的基因型。
上游引物F1用于扩增小麦3B染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为A(对应正义链，该SNP位点处核苷酸为T)的情况，上游引物F2用于扩增小麦3B染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为C(对应正义链，该SNP位点处核苷酸为G)的情况；下游引物R为通用引物。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦3B染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为A纯合(对应正义链，该SNP位点的基因型为T:T纯合型)的片段。
上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦3B染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为C纯合(对应正义链，该SNP位点的基因型为G:G纯合型)的片段。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增小麦3B染色体上该SNP位点(反义链)处核苷酸为A和C杂合(对应正义链，该SNP位点的基因型为G:T杂合型)的片段。
二多态性检测
(一)临麦2号/中892田间黑胚病抗性的表型鉴定
1、以临麦2号为母本，中892为父本，采用单粒传法构建一个含有271个F6株系的RIL群体。临麦2号/中892RIL群体271个F6株系及其亲本种植于河南安阳(2012-2013和2013-2014年度)、安徽濉溪(2013-2014年度)和甘肃清水(2013-2014年度)。田间种植采用完全随机区组设计，单行区，3次重复，行距0.2m，行长1.5m，50粒/行。在整个小麦生育过程中，田间管理按照当地常规栽培技术进行。在小麦正常收获脱粒后，每次重复的单个株系随机选取200粒籽粒，采用统一标准(籽粒胚部有肉眼可见黑褐色斑点)统计黑胚籽粒个数，并计算黑胚率，三次技术重复。最终，以三个生物重复的均值作为该株系最终黑胚率。
2、完成步骤1后，选用国际通用SAS统计软件PROC CORR模型计算黑胚率(即黑胚病抗性)的Pearson相关系数、PROC MIXED命令进行方差分析。方差分析结果表明，黑胚率在不同基因间存在极显著差异，五个环境的相关系数在0.52-075之间，相关性较好，进而明确表型数据的有效性。
(二)271份小麦RIL群体的分子鉴定
1、采用CTAB法提取271份小麦种质资源幼嫩叶片的基因组DNA。基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2100(Thermo)检测A260/A280比值介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)，A260/A230比值介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)，270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；待测小麦的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。
2、竞争性等位基因特异性PCR。以待测小麦的基因组DNA为模板，采用步骤一合成的KASP引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系：2.0μl KASP 2×Master Mix(LGC,货号：13448166)、0.048μl KASP引物(3条引物混合，总浓度为50μM，其中两条上游引物和一条下游引物的摩尔比为2:2:5)、1.952μl模板DNA(50ng/μl)。扩增使用384孔PCR仪(BIO-RAD，S1000TMThermal Cycler)。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃1min，继续扩增26个循环。
3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测小麦基于K-3B-640.1位点的基因型。具体的判断原则如下：如果待测小麦基于K-3B-640.1位点显示红色荧光信号，则该待测小麦基于K-3B-640.1位点的基因型GG纯合型，与中892一致；如果待测小麦基于K-3B-640.1位点显示蓝色荧光信号，则该待测小麦基于K-3B-640.1位点的基因型为TT纯合型，与临麦2号一致；如果待测小麦基于K-3B-640.1位点显示绿色荧光信号，则该待测小麦基于K-3B-640.1位点的基因型为TG杂合型。检测结果见图1。
三、显著性分析
分别统计临麦2号/中892的F6 RIL群体中两种基因型的小麦的平均黑胚率，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型进行t检验。统计结果见表1。结果表明，GG纯合型的小麦品种(黑胚率16.0％)比TT纯合型(黑胚率20.2％)的小麦品种的黑胚率的平均值降低了20.8％，在0.05水平上有显著差异(表2)。
由此可见，利用K-3B-640.1位点的基因型可以鉴定小麦的黑胚病抗性，K-3B-640.1位点的基因型为GG纯合型的待测小麦的黑胚病抗性显著高于TT纯合型的待测小麦。
表1、临麦2号/中892RIL群体中K-3B-640.1检测结果及黑胚率
/>
/>
/>
/>
/>
/>
注：亲本临麦2号为基因型TT，亲本中892为基因型GG，-：表型数据缺失。
表2、K-3B-640.1检测临麦2号/中892RIL群体结果
实施例2、抗性引物组与小麦自然品种黑胚病抗性的关联分析及验证
1、检测166份小麦品种基于K-3B-640.1位点的基因型
按照实施例1中的方法，将待测小麦分别替换为166份品种，其它步骤均不变，得到166份小麦品种基于K-3B-640.1位点的基因型。检测结果见图2。
2、检测黑胚率
166份黄淮麦区品种种植于河南安阳(2012-2013、2013-2014和2014-2015年度)和安徽濉溪(2012-2013和2013-2014年度)。所有试验均采用随机区组设计，3次重复，3行区，行长2m，行距25cm，50粒/行。田间管理按当地常规管理规程进行，进行黑胚病抗性鉴定。在小麦正常收获脱粒后，每次重复的单个株系随机选取200粒籽粒，采用统一标准(籽粒胚部有肉眼可见黑褐色斑点)统计黑胚籽粒个数，并计算黑胚率，三次技术重复。最终，以三个生物重复的均值作为该株系最终黑胚率。
3、关联分析
分别统计两种基因型的小麦的平均黑胚率，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROCTTEST模型进行t检验。统计结果见表2。结果表明，GG纯合型的小麦品种(黑胚率20.8％)比TT纯合型(黑胚率22.6％)的小麦品种的黑胚率的平均值降低了8.0％，在0.05水平上有显著差异(表3、表4)。
表3、166份小麦品种的基因型检测结果
/>
/>
/>
/>
/>
/>
注：GG：中892基因型；TT：临麦2号因型；TG：杂合基因型；NN：基因型数据缺失；-：表型数据缺失。
表4、K-3B-640.1检测166份自然群体黑胚率效应结果
由此可见，利用K-3B-640.1位点的基因型可以鉴定小麦的黑胚病抗性，K-3B-640.1位点的基因型为GG纯合型的待测小麦的黑胚病抗性显著高于TT纯合型的待测小麦。
上述结果表明，通过检测待测小麦基于K-3B-640.1位点的基因型可以鉴定小麦黑胚病抗性，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G。
2.用于检测小麦基因组上特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：用于检测小麦基因组上所述特定SNP位点的单核苷酸多态性的物质为权利要求4或5中所述的KASP引物或权利要求6或7所述的试剂或试剂盒。
4.用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-42位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-42位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。
5.根据权利要求4所述的KASP引物，其特征在于：所述荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，其核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B为荧光标签序列HEX，其核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位；
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
6.用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有权利要求4或5中所述的KASP引物。
7.特异性DNA分子，如SEQ ID No.4所示。
8.权利要求4或5所述的KASP引物或权利要求6所述的试剂或试剂盒或权利要求7所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
9.如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的黑胚病抗性强弱：G:G基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性强于或候选强于T:T基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型；
所述G:G基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为G的纯合型；
方法II：一种选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择G:G基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择G:G基因型的小麦，最终获得黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G；
所述G:G基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为G的纯合型；
方法III：一种筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上特定SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，将T:T基因型的所述待测小麦筛选出来剔除出去；
所述特定SNP位点位于小麦3B染色体上SEQ ID No.4的第38位，该SNP位点处的核苷酸为T或G；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸为T的纯合型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：检测所述待测小麦的基因组上所述特定SNP位点处的核苷酸按照包括如下步骤的方法进行：利用权利要求6所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述特定SNP位点的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为G:G基因型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311023934.2A CN116855631A (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311023934.2A CN116855631A (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116855631A true CN116855631A (zh) | 2023-10-10 |
Family
ID=88227098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311023934.2A Pending CN116855631A (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116855631A (zh) |
-
2023
- 2023-08-15 CN CN202311023934.2A patent/CN116855631A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109735652B (zh) | 小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用 | |
| US10494644B2 (en) | Methods and compositions for selecting soybean plants resistant to phytophthora root rot | |
| CN108998562B (zh) | 基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用 | |
| CN111218524B (zh) | 棉花纤维品质相关的GhJMJ12基因SNP标记及其应用 | |
| CN105256031B (zh) | 利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物 | |
| CN111961749B (zh) | 检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3和Ty-3a的KASP引物及其应用 | |
| CN110724758B (zh) | 一种基于snp标记鉴定京农科728玉米杂交种纯度的方法 | |
| CN109609687B (zh) | 用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用 | |
| JP2007054020A (ja) | Ｐｂ１遺伝子と連鎖する分子マーカーを指標にイネの穂いもち抵抗性を識別する方法 | |
| CN113046462B (zh) | 与玉米穗长主效qtl紧密连锁的分子标记、引物及应用 | |
| CN117683927A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用 | |
| CN110777216B (zh) | 一种基于snp标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法 | |
| CN109439788B (zh) | 与小麦株高主效基因位点紧密连锁的kasp分子标记及其应用 | |
| CN116769955A (zh) | 一种快速转育转基因玉米自交系的方法及应用 | |
| CN111996280B (zh) | 与甘蓝型油菜矮杆紧凑性状共分离的snp标记及应用 | |
| CN116855631A (zh) | 一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 | |
| CN117230230A (zh) | 一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法 | |
| CN116790794A (zh) | 抗黑胚病QTL QBp.caas-2AL与QBp.caas-5BL的KASP标记 | |
| CN113897352B (zh) | 玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用 | |
| CN115976263B (zh) | 小麦千粒重主效qtl的kasp分子标记及其应用 | |
| CN115820909A (zh) | 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其使用的引物组 | |
| KR101892461B1 (ko) | 핵내유전자적 웅성불임성 유전인자인 ｍｓ3 판별용 분자마커 및 이를 이용한 검정방법 | |
| CN115786571A (zh) | 一种筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法 | |
| CN115820910A (zh) | 一种筛选不同灌浆速率小麦的方法 | |
| CN116656866A (zh) | 黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |