CN115786571A - 一种筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法。该方法包括如下步骤：检测待测小麦基于AX‑111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型，基于AX‑111258240位点的基因型为TT纯合型的小麦的穗发芽抗性>基于AX‑111258240位点的基因型为CC纯合型的小麦的穗发芽抗性；AX‑111258240位点为小麦基因组中SEQ IDNO:1自5’末端起第36位的核苷酸。实验证明，检测小麦基于AX‑111258240位点的基因型可以筛选小麦穗发芽抗性性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

Description

一种筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法。

背景技术

小麦是全球范围内的重要粮食作物，小麦的可持续生产直接影响着人民群众生活质量和国家粮食安全。近年来，随着全球气候变暖以及极端天气频发，小麦成熟至收获期间穗发芽现象愈发频繁，严重降低小麦产量，劣化籽粒品质，已成为全球性危害。穗发芽促使籽粒内部水解酶活性增加，储藏物质被分解消耗，从而造成籽粒容重和千粒重下降，导致小麦减产。同时，由于蛋白质被降解，制粉后的SDS沉降值和面筋含量逐渐降低，用发芽小麦粉加工的面制品如馒头、面包等，外形和口感较差，严重影响营养品质和加工品质。全球小麦每年因穗发芽造成的直接经济损失约10亿美元，培育抗穗发芽小麦新品种是解决这一问题最经济有效的途径。

小麦穗发芽为多基因控制的数量遗传性状。明确抗穗发芽基因的位置及其遗传机制是选育抗穗发芽小麦新品种的基础。连锁分析可基于双亲遗传群体，鉴定抗穗发芽QTL位点,与抗穗发芽QTL位点紧密连锁的分子标记可用于育种。通过分子标记辅助选择(Markerassisted selection，MAS)可有目的地进行基因累加，从而实现抗源积累，提高品种抗性。应用紧密连锁分子标记可在基因型水平上对作物种质资源和育种世代材料进行深入评价和鉴定，有效缩短抗病育种年限。分子标记辅助品质和抗病育种实践中，常采用表型分析、生化标记和基因标记鉴定相结合的方法。目前，用于基因型鉴定的分子标记有STS、SSR、SNP和InDel等。随着基因组学和分子生物学的进展，基于芯片或重测序可快速获取大量的SNP变异数据。近年来，小麦90K、660K、50K、55K和35K等基因芯片发展迅速，已广泛应用于小麦复杂性状遗传解析研究中。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)标记在基因组中广泛存在，具有数量极多、密度极高、覆盖范围广且可高通量检测的优点。随着分子生物学技术的快速发展，SNP标记已逐渐应用于高密度遗传图谱构建、数量性状基因定位和种质基因型检测，有效加速分子育种进程。LGC Genomics公司研发的基于KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术的SNP基因分型检测方案，相比于传统Taqman方法，可通过通用荧光探针来代替针对位点荧光探针，有效节约成本，可高效应用于大批量材料的特异标记检测工作；利用基因芯片检测SNP基因型，发掘目标位点，开发KASP标记，将有助于高效、低成本和精准开展小麦复杂农艺性状MAS育种工作。

中麦578是中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所联合育成的优质强筋、抗病抗逆小麦新品种，已通过黄淮南片和黄淮北片审定，在全国新一批优质麦中名列前茅，产业化前景广阔，并已成为黄淮麦区主栽品种和重要的骨干亲本。中麦578是当前我国白粒小麦穗发芽抗性表现最好的品种之一，但目前有关其穗发芽抗性方面的遗传研究尚未见报道。发掘穗发芽抗性QTL，并开发与其紧密连锁的SNP标记，对小麦育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的为鉴定小麦穗发芽抗性。

本发明首先保护引物组，可由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R组成；

所述上游引物F1可由荧光标签序列甲和SEQ ID NO:2自5’末端起第22至42位所示的DNA片段组成；

所述上游引物F2可由荧光标签序列乙和SEQ ID NO:3自5’末端起第22至42位所示的DNA片段组成；

所述下游引物R的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示。

上述引物组中，所述荧光标签序列甲的核苷酸序列可如SEQ ID NO:2自5’末端起第1至21位所示。所述荧光标签序列乙的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3自5’末端起第1至21位所示。

上文中，SEQ ID NO:2自5’末端起第1至21位所示的核苷酸序列为FAM荧光标签序列，荧光信号具体为蓝色。SEQ ID NO:3自5’末端起第1至21位所示的核苷酸序列为HEX荧光标签序列，荧光信号具体为红色。

本发明还保护上述任一所述引物组的应用，可为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的穗发芽抗性；

b2)筛选具有高穗发芽抗性的小麦品种；

b3)小麦育种。

本发明还保护SEQ ID NO:1所示的DNA片段的应用，可为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的穗发芽抗性；

b2)筛选具有高穗发芽抗性的小麦品种；

b3)小麦育种；

b4)作为鉴定待测小麦的穗发芽抗性的分子标记。

b4)即本发明还保护SEQ ID NO:1所示的分子标记。

本发明还保护筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法，可包括如下步骤：检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型，基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型的小麦的穗发芽抗性>基于AX-111258240位点的基因型为CC纯合型的小麦的穗发芽抗性；

AX-111258240位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

上述方法中，所述检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型的步骤如下：

(a1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(a2)完成步骤(a1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测小麦基于AX-111258240位点的基因型。

上述方法中，所述检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型的步骤如下：

(b1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(b2)取步骤(b1)得到的PCR扩增产物，测序；

(b3)根据步骤(b2)得到的测序结果，获得待测小麦基于AX-111258240位点的基因型。

本发明还保护一种用于鉴定小麦穗发芽抗性的试剂盒，可包括检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型的物质；

AX-111258240位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

所述试剂盒具体可由检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型的物质组成。

上述试剂盒中，所述检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型的物质可为上述任一所述引物组。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

本发明还保护上述任一所述试剂盒的应用，可为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的穗发芽抗性；

b2)筛选具有高穗发芽抗性的小麦品种；

b3)小麦育种。

上文中，所述>具体可为统计学上的>。所述高穗发芽抗性具体可为统计学上的高穗发芽抗性。

实验证明，采用本发明所提供的方法检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型，基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型的小麦的穗发芽抗性>基于AX-111258240位点的基因型为CC纯合型的小麦的穗发芽抗性；AX-111258240位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。由此可见，通过检测小麦基于AX-111258240位点的基因型可以筛选小麦穗发芽抗性性状。本发明在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为由50K芯片中的SNP标记构建的遗传连锁图。

图2为实施例1中步骤五262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体的部分检测结果。

图3为实施例2中89个小麦品种的部分检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

济麦22(记载于如下文献中：高产稳产抗病广适型小麦新品种-济麦22.李豪圣，刘建军，宋建民，刘爱峰，程敦公，赵振东.麦类作物学报，2007(04)：744)是山东省农业科学院作物研究所1994年以自育品系935024为母本、35106为父本进行杂交，通过系谱法选育而成的小麦品种。济麦22具有综合农艺性状好、产量潜力高、稳产性好、适应性广的特点，是优质中筋小麦品种。

中麦578(记载于如下文献中：中麦578在驻马店地区的种植表现及栽培技术.王海峰，赵卫琴，冉午玲，吴长城，王家润，王子君，王芳，中国种业.2020(10)：99-101.)是中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所联合培育的优质强筋高产小麦新品种，具有早熟落黄好、优质强筋、高产稳产、抗倒广适、千粒重高且稳定、籽粒商品性好等优点，是河南省驻马店地区优质强筋小麦生产更新换代品种。

发芽指数(Germination index，GI)为种子的活力指标，通过在发芽试验期间，每天记载发芽粒数，然后计算获得发芽指数。GI越高，种子活力越高，即穗发芽抗性越低。

实施例1、抗穗发芽基因的AX-111258240位点的发现以及用于鉴定小麦穗发芽抗性的引物组的获得

一、田间表型数据分析及新穗发芽抗性QTL的发现

1、2019-2020年度，将中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体种植于河南新乡(34°53′N，113°23′E；E1)；2020-2021年度，将中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体，分别种植于河南新乡(E2)、商丘(33°43'N，114°49'E；E3)、洛阳(34°32'N，112°16E；E4)和河北高邑(37°33′N，114°26′E；E5)；共五个环境。所有环境均采用完全随机区组设计，三次重复，1m行长，30粒/行，行距20cm，其它田间管理措施按照当地小麦田间管理规范进行。在室内进行表型鉴定。在小麦生长到蜡熟后期时，剪取每份材料的10个主茎穗(带穗下节)，每5穗结扎为一个重复，室内风干1d，立即存放于-20℃的冰箱内以维持其休眠性，待收获全部材料后统一进行穗发芽实验。

穗发芽实验如下：先将整穗在蒸馏水中浸泡10-12h，再用0.1％次氯酸钠溶液浸泡消毒15min后，用无菌水冲洗干净，用发芽纸卷裹，保鲜袋保湿，置于人工气候培养箱(温度20℃，光周期为16h昼/8h夜，相对湿度为80％)培养7d后取出，在电热恒温烘箱(150℃)内快速烘干，阻止其继续发芽，手工脱粒，以种胚破裂为鉴定标准，记录每份材料的GI，两次重复的平均值为此材料的GI(GI＝种胚破裂的粒数/总粒数×100％)。

2、完成步骤1后，选用国际通用SAS统计软件PROC CORR模型计算GI(即穗发芽抗性)的Pearson相关系数、PROC MIXED命令进行方差分析。

方差分析结果表明，GI在不同基因间存在极显著差异，五个环境的相关系数在0.52-075之间，相关性较好，进而明确表型数据的有效性。

3、遗传连锁图谱的构建

利用小麦50K芯片(博奥)对将中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体进行基因型分型。小麦50K芯片含有55224个SNP标记，均匀分布于21条染色体上。在构建遗传连锁图谱之前，首先去除双亲间无多态性的标记，删除缺失率大于20％、最小等位基因频率小于0.3的标记。接下来利用剩余的9354个高质量的多态性标记进行分析。采用Icimapping 4.2的BIN功能去除冗余标记后剩余1501个标记，利用JoinMap 4.0软件进行连锁分析，使用MapChart 2.32进行遗传连锁图谱的绘制。

由50K芯片中的SNP标记构建的遗传连锁图见图1。

4、QTL定位

利用IciMapping 4.2软件的完备区间作图法(ICIM)进行QTL分析。作图参数设置为扫描步长为0.1cM，逐步回归标记进入的概率(PIN)为0.001，采用1000次的排列检验(P<0.05)计算LOD(Logarithm of the odds)临界值。解释表型变异率大于10％的为主效QTL，在3个及以上环境下重复定位的为稳定QTL。依据国际遗传学命名法对QTL命名。

该群体共定位到两个较稳定的QTL，其中，QGI.caas-5A稳定存在于4个环境及期望均值，QGI.caas-5A为新的穗发芽抗性QTL。

二、AX-111258240位点的发现

本发明的发明人进行了大量序列分析、比对以及预实验，发现QGI.caas-5A上游的AX-111258240SNP位点不仅物理位置相距较近，并且在3条同源染色体间有较多的差异位点。将AX-111258240SNP位点简称为AX-111258240位点。

AX-111258240位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸，基因型为CC纯合型、TT纯合型和TC杂合型。SEQ ID NO：1：TCATTTTGGCCTGTATCGTTGTCCCCATGTGGGCAYATACGTGATGTGTGCACTGCTTGCGCTGGCTTTGC(Y为C/T)。

由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。AX-111258240位点的基因型均为正义DNA的基因型。

三、用于鉴定小麦穗发芽抗性的引物组的获得

根据AX-111258240位点及其前后的核苷酸序列，设计并合成适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定小麦穗发芽抗性的引物组。引物组由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R 3条引物序列组成，用于扩增包括AX-111258240位点的靶序列。各个引物的核苷酸序列如表1所示。

表1

注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。

四、小麦基于AX-111258240位点的基因型分型方法的建立

1、待测小麦的基因组DNA的获得

采用CTAB法提取待测小麦的基因组DNA。

待测小麦的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2100(Thermo)检测A260/A280比值介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)，A260/A230比值介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)，270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；待测小麦的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。

2、竞争性等位基因特异性PCR

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用步骤三合成的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃1min，继续扩增26个循环。

3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测小麦基于AX-111258240位点的基因型。具体的判断原则如下：如果待测小麦基于AX-111258240位点显示蓝色荧光信号，则该待测小麦基于AX-111258240位点的基因型CC纯合型；如果待测小麦基于AX-111258240位点显示红色荧光信号，则该待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型；如果待测小麦基于AX-111258240位点显示绿色荧光信号，则该待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TC杂合型。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

五、采用步骤四的方法检测中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体基于AX-111258240位点的基因型

按照步骤四的方法，将待测小麦分别替换为中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体，其它步骤均不变，得到中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅RIL群体基于AX-111258240位点的基因型。部分检测结果见图2(NTC为空白对照，即无模板)。

将上述基因型分型结果与小麦50K芯片中中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体的基因型分型结果进行比较。结果表明，采用步骤四提供的方法检测小麦基于AX-111258240位点的基因型与小麦50K芯片中的基因型分型结果完全一致。由此可见，采用步骤四提供的方法检测小麦基于AX-111258240位点的基因型具有较高的准确性。

实施例2、实施例1合成的用于鉴定小麦穗发芽抗性的引物组与小麦穗发芽抗性的关联分析及验证

待测小麦为89个黄淮麦区的小麦品种，89个小麦品种的名称如表2中第2列所示。

表2.89个小麦品种基于AX-111258240位点的基因型和发芽指数(GI)

注：NA为无法分型。

1、检测89个小麦品种基于AX-111258240位点的基因型

按照实施例1中步骤四的方法，将待测小麦分别替换为89个小麦品种，其它步骤均不变，得到89个小麦品种基于AX-111258240位点的基因型。部分检测结果见图3(NTC为空白对照，即无模板)。

检测结果见表2中第3列。

2、检测发芽指数

在2014-2015年度，将89个小麦品种种植于河南安阳，进行穗发芽抗性鉴定。采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长1.5m，行宽0.25m，50粒/行，其它田间管理措施按照当地小麦田间管理规范进行。在室内进行表型鉴定。在小麦生长到蜡熟后期时，剪取每份材料的10个主茎穗(带穗下节)，每5穗结扎为一个重复，室内风干1d，立即存放于-20℃的冰箱内以维持其休眠性，待收获全部材料后统一进行穗发芽实验。穗发芽实验如下：先将整穗在蒸馏水中浸泡10-12h，再用0.1％次氯酸钠溶液浸泡消毒15min后，用无菌水冲洗干净，用发芽纸卷裹，保鲜袋保湿，置于人工气候培养箱(温度20℃，光周期为16h昼/8h夜，相对湿度为80％)培养7d后取出，在电热恒温烘箱(150℃)内快速烘干，阻止其继续发芽，手工脱粒，以种胚破裂为鉴定标准，记录每份材料的GI(GI＝种胚破裂的粒数/总粒数×100％)，两次重复的平均值为此材料的GI。

89个小麦品种的GI结果见表2中第4列。

3、关联分析

分别统计两种基因型的小麦的平均GI，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROCTTEST模型进行t检验。统计结果见表3。

结果表明，89个黄淮麦区的小麦品种组成的群体中，CC纯合型的小麦品种的GI>TT纯合型的小麦品种的GI；所述“>”为在统计学上的>(即在0.05水平显著高于)。由此可见，TT纯合型是提高小麦穗发芽抗性的优异基因型。

表3.89个小麦品种的GI值t检验

注：*表示P<0.05；TT为TT纯合型，CC为CC纯合型。

上述结果表明，通过检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型可以筛选小麦穗发芽抗性性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.引物组，由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R组成；

所述上游引物F1由荧光标签序列甲和SEQ ID NO:2自5’末端起第22至42位所示的DNA片段组成；

所述上游引物F2由荧光标签序列乙和SEQ ID NO:3自5’末端起第22至42位所示的DNA片段组成；

所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于：

所述荧光标签序列甲的核苷酸序列如SEQ ID NO:2自5’末端起第1至21位所示；

所述荧光标签序列乙的核苷酸序列如SEQ ID NO:3自5’末端起第1至21位所示。

3.权利要求1或2所述引物组的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的穗发芽抗性；

b2)筛选具有高穗发芽抗性的小麦品种；

b3)小麦育种。

4.SEQ ID NO:1所示的DNA片段的应用，为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的穗发芽抗性；

b2)筛选具有高穗发芽抗性的小麦品种；

b3)小麦育种；

b4)作为鉴定待测小麦的穗发芽抗性的分子标记。

5.一种筛选具有不同穗发芽抗性小麦的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型，基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型的小麦的穗发芽抗性>基于AX-111258240位点的基因型为CC纯合型的小麦的穗发芽抗性；

AX-111258240位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型的步骤如下：

(a1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(a2)完成步骤(a1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测小麦基于AX-111258240位点的基因型。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型为TT纯合型还是CC纯合型的步骤如下：

(b1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(b2)取步骤(b1)得到的PCR扩增产物，测序；

(b3)根据步骤(b2)得到的测序结果，获得待测小麦基于AX-111258240位点的基因型。

8.一种试剂盒，包括检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型的物质；

AX-111258240位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述检测待测小麦基于AX-111258240位点的基因型的物质为权利要求1或2所述引物组。

10.权利要求8或9所述的试剂盒的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的穗发芽抗性；

b2)筛选具有高穗发芽抗性的小麦品种；

b3)小麦育种。

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