CN115820909A - 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其使用的引物组 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选不同千粒重小麦的方法及其使用的引物组。该方法包括如下步骤：检测待测小麦基于AX‑110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型，基于AX‑110125073位点的基因型为GG纯合型的小麦的千粒重>基于AX‑110125073位点的基因型为AA纯合型的小麦的千粒重；AX‑110125073位点为小麦基因组中SEQ IDNO:1自5’末端起第36位的核苷酸。实验证明，通过检测待测小麦基于AX‑110125073位点的基因型可以筛选小麦千粒重性状。本发明在小麦育种中具有重要应用价值。

Description

一种筛选不同千粒重小麦的方法及其使用的引物组

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种筛选不同千粒重小麦的方法及其使用的引物组。

背景技术

小麦是全球范围内的重要粮食作物，小麦的可持续生产直接影响着人民群众生活质量和国家粮食安全。提高单产是我国小麦育种工作的永恒目标，也是国家粮食安全和国民经济发展的重要保障。

产量为多基因控制的数量性状，遗传力较低且受环境影响显著，在早代选择难度较大，通过常规育种的手段很难实现其重大突破。随着分子标记技术的不断发展，连锁分析作为基因发掘的重要手段，越来越多地被应用于产量性状的遗传研究，并为揭示产量性状遗传机制及分子标记辅助选择提供了重要依据。产量由单位面积穗数、穗粒数和千粒重3个因子构成，其中千粒重的遗传力较高，对产量贡献较大，建国后我国黄淮麦区的小麦产量遗传进展主要得益于千粒重的提高。因此，继续挖掘小麦产量，特别是千粒重等相关性状基因位点，通过分子标记辅助选择(Marker assisted selection，MAS)有目的地实现优异等位基因累加，可以进一步提高产量。

在MAS育种实践中，常采用表型分析、生化标记和基因标记鉴定相结合的方法。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)标记在基因组中广泛存在，具有数量极多、密度极高、覆盖范围广且可高通量检测的优点。随着分子生物学技术的快速发展，SNP标记已逐渐应用于高密度遗传图谱构建、数量性状基因定位和种质基因型检测中，有效加速分子育种进程。近年来，LGC Genomics公司开发的基于KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术的SNP基因分型检测方案成熟应用于作物MAS育种研究。相较于传统的Taqman方法，可通过通用荧光探针来代替针对位点荧光探针，有效节约成本。KASP标记可高效、低成本的应用于大批量种质的特异标记检测工作。基于双亲或自然群体，利用基因芯片检测SNP基因型并发掘目标性状遗传位点，开发KASP标记并检测育种材料，可高效、精确、低成本的开展小麦复杂农艺性状MAS育种工作。

济麦22是由山东省农业科学院作物研究所育成的高产品种，于2006年通过黄淮北片国家审定，并分别于2010和2011年完成黄淮南片的安徽和河南两省引种备案工作，累计推广超过2100万公顷，连续12年排名全国第一，当前年种植面积约100万公顷。中麦578是由中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所联合选育的强筋高产小麦新品种，分别于2020和2021年通过黄淮南片和黄淮北片两大麦区国家审定，当前年推广面积约37万公顷，已成为黄淮麦区主要推广品种和重要的骨干亲本。

发明内容

本发明的目的为鉴定小麦千粒重。

本发明首先保护引物组，由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R组成；

所述上游引物F1由荧光标签序列甲和SEQ ID NO:2自5’末端起第22至39位所示的DNA片段组成；

所述上游引物F2由荧光标签序列乙和SEQ ID NO:3自5’末端起第22至39位所示的DNA片段组成；

所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

上述引物组中，所述荧光标签序列甲的核苷酸序列如SEQ ID NO:2自5’末端起第1至21位所示。所述荧光标签序列乙的核苷酸序列如SEQ ID NO:3自5’末端起第1至21位所示。

上文中，SEQ ID NO:2自5’末端起第1至21位所示的核苷酸序列为FAM荧光标签序列，荧光信号具体为蓝色。SEQ ID NO:3自5’末端起第1至21位所示的核苷酸序列为HEX荧光标签序列，荧光信号具体为红色。

本发明还保护上述任一所述引物组的应用，可为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的千粒重；

b2)筛选具有高千粒重的小麦品种；

b3)小麦育种。

本发明还保护SEQ ID NO:1所示的DNA片段的应用，可为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的千粒重；

b2)筛选具有高千粒重的小麦品种；

b3)小麦育种；

b4)作为鉴定待测小麦的千粒重的分子标记。

b4)即本发明还保护SEQ ID NO:1所示的分子标记。

本发明还保护筛选不同千粒重小麦的方法，可包括如下步骤：检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型，基于AX-110125073位点的基因型为GG纯合型的小麦的千粒重>基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型的小麦的千粒重；

AX-110125073位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

上述方法中，所述检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型的步骤如下：

(a1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(a2)完成步骤(a1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测小麦基于AX-110125073位点的基因型。

上述方法中，所述检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型的步骤如下：

(b1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(b2)取步骤(b1)得到的PCR扩增产物，测序；

(b3)根据步骤(b2)得到的测序结果，获得待测小麦基于AX-110125073位点的基因型。

本发明还保护一种用于鉴定小麦千粒重的试剂盒，包括检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型的物质；

AX-110125073位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

所述试剂盒具体可由检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型的物质组成。

上述试剂盒中，所述检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型的物质可为上述任一所述引物组。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

本发明还保护上述任一所述试剂盒的应用，可为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的千粒重；

b2)筛选具有高千粒重的小麦品种；

b3)小麦育种。

上文中，所述>具体可为统计学上的>。所述高千粒重具体可为统计学上的高千粒重。

实验证明，采用本发明所提供的方法检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型，基于AX-110125073位点的基因型为GG纯合型的小麦的千粒重>基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型的小麦的千粒重；AX-110125073位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。由此可见，通过检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型可以筛选小麦千粒重性状。本发明在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为由50K芯片中的SNP标记构建的遗传连锁图。

图2为实施例1中步骤五262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体的部分检测结果。

图3为实施例2中40个济麦22的衍生品种的部分检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

济麦22(记载于如下文献中：高产稳产抗病广适型小麦新品种-济麦22.李豪圣，刘建军，宋建民，刘爱峰，程敦公，赵振东.麦类作物学报，2007(04)：744)是山东省农业科学院作物研究所1994年以自育品系935024为母本、35106为父本进行杂交，通过系谱法选育而成的小麦品种。济麦22具有综合农艺性状好、产量潜力高、稳产性好、适应性广的特点，是优质中筋小麦品种。

中麦578(记载于如下文献中：中麦578在驻马店地区的种植表现及栽培技术.王海峰，赵卫琴，冉午玲，吴长城，王家润，王子君，王芳，中国种业.2020(10)：99-101.)是中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所联合培育的优质强筋高产小麦新品种，具有早熟落黄好、优质强筋、高产稳产、抗倒广适、千粒重高且稳定、籽粒商品性好等优点，是河南省驻马店地区优质强筋小麦生产更新换代品种。

千粒重即小麦1000粒种子的重量，它是体现种子大小与饱满程度的一项指标，是检验种子质量和作物考种的重要内容，也是田间预测产量时的重要依据。

实施例1、千粒重控制基因的AX-110125073位点的发现以及用于鉴定小麦千粒重的引物组的获得

一、田间表型数据分析及新千粒重QTL的发现

1、2019-2020年度，将中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体种植于河南新乡(34°53′N，113°23′E；E1)；2020-2021年度，将中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体，分别种植于河南新乡(E2)、商丘(33°43'N，114°49'E；E3)、洛阳(34°32'N，112°16E；E4)和河北高邑(37°33′N，114°26′E；E5)，共五个环境。所有环境均采用完全随机区组设计，三次重复，1m行长，30粒/行，行距20cm，其它田间管理措施按照当地小麦田间管理规范进行。小麦成熟后，随机剪取30个穗并人工脱粒；随机取1000粒种子称重，三次重复，求其平均值，即为千粒重。

2、完成步骤1后，选用国际通用SAS统计软件PROC CORR模型计算千粒重的Pearson相关系数、PROC MIXED命令进行方差分析。

方差分析结果表明，千粒重在不同基因间存在0.01水平显著差异，五个环境的相关系数在0.71-0.87之间，相关性较好，数据较为精确，一致性较高。

3、遗传连锁图谱的构建

利用小麦50K芯片(博奥)对将中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体进行基因型分型。小麦50K芯片含有55224个SNP标记，均匀分布于21条染色体上。在构建遗传连锁图谱之前，首先去除双亲间无多态性的标记，删除缺失率大于20％、最小等位基因频率小于0.3的标记。接下来利用剩余的9354个高质量的多态性标记进行分析。采用Icimapping 4.2的BIN功能去除冗余标记后剩余1501个标记，利用JoinMap 4.0软件进行连锁分析，使用MapChart 2.32进行遗传连锁图谱的绘制。

由50K芯片中的SNP标记构建的遗传连锁图见图1。

4、QTL定位

利用IciMapping 4.2软件的完备区间作图法(ICIM)进行QTL分析。作图参数设置为扫描步长为0.1cM，逐步回归标记进入的概率(PIN)为0.001，采用1000次的排列检验(P<0.05)计算LOD(Logarithm of the odds)临界值。解释表型变异率大于10％的为主效QTL，在3个及以上环境下重复定位的为稳定QTL。依据国际遗传学命名法对QTL命名。

最终，定位到一个在5个环境及期望均值下稳定存在的千粒重QTL QTkw.caas-7D；QTkw.caas-7D为新的千粒重QTL。

二、AX-110125073位点的发现

本发明的发明人进行了大量序列分析、比对以及预实验，发现QTkw.caas-7D上游的AX-110125073SNP位点不仅物理位置相距较近，并且在3条同源染色体间有较多的差异位点。将AX-110125073SNP位点简称为AX-110125073位点。

AX-110125073位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸，基因型为AA纯合型、GG纯合型和AG杂合型。SEQ ID NO：1：

TCTCTTCCTGTCATCTCCCCTTAATCAAATCGTGCRCACACCTTCTTCGCCCCCACACGCAGCGCAGGCAC(R为A/G)。

由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。AX-110125073位点的基因型均为正义DNA的基因型。

三、用于鉴定小麦千粒重的引物组的获得

根据AX-110125073位点及其前后的核苷酸序列，设计并合成适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定小麦千粒重的引物组。引物组由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R 3条引物序列组成，用于扩增包括AX-110125073位点的靶序列。各个引物的核苷酸序列如表1所示。

表1

引物名称	核苷酸序列(5’-3’)
		上游引物F1	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGGCGAAGAAGGTGTGT(SEQ ID NO:2)
上游引物F2	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGGCGAAGAAGGTGTGC(SEQ ID NO:3)
		下游引物R	GCGTCTCTTCCTGTCATCTCC(SEQ ID NO:4)

注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。

四、小麦基于AX-110125073位点的基因型分型方法的建立

1、待测小麦的基因组DNA的获得

采用CTAB法提取待测小麦的基因组DNA。

待测小麦的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2100(Thermo)检测A260/A280比值介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)，A260/A230比值介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)，270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；待测小麦的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。

2、竞争性等位基因特异性PCR

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用步骤三合成的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃1min，继续扩增26个循环。

3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测小麦基于AX-110125073位点的基因型。具体的判断原则如下：如果待测小麦基于AX-110125073位点显示蓝色荧光信号，则该待测小麦基于AX-110125073位点的基因型AA纯合型；如果待测小麦基于AX-110125073位点显示红色荧光信号，则该待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为GG纯合型；如果待测小麦基于AX-110125073位点显示绿色荧光信号，则该待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AG杂合型。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

五、采用步骤四的方法检测中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体基于AX-110125073位点的基因型

按照步骤四的方法，将待测小麦分别替换为中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体，其它步骤均不变，得到中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅RIL群体基于AX-110125073位点的基因型。部分检测结果见图2(NTC表示空白对照,即无模板)。

将上述基因型分型结果与小麦50K芯片中中麦578、济麦22和262个中麦578/济麦22的F₅ RIL群体的基因型分型结果进行比较。结果表明，采用步骤四提供的方法检测小麦基于AX-110125073位点的基因型与小麦50K芯片中的基因型分型结果完全一致。由此可见，采用步骤四提供的方法检测小麦基于AX-110125073位点的基因型具有较高的准确性。

实施例2、实施例1合成的用于鉴定小麦千粒重的引物组与小麦千粒重的关联分析及验证

待测小麦为40种济麦22的衍生品种(表2中第1列所示)。表2中第1列所示的40种济麦22的衍生品种均为常见品种。

表2.40种济麦22的衍生品种的基因型和千粒重(g)的统计结果

1、检测40种济麦22的衍生品种基于AX-110125073位点的基因型

按照实施例1中步骤四的方法，将待测小麦分别替换为40种济麦22的衍生品种，其它步骤均不变，得到40种济麦22的衍生品种基于AX-110125073位点的基因型。部分检测结果见图3。

检测结果见表2中第2列。

2、千粒重性状检测

分别于2012-2013年度、2013-2014年度和2014-2015年度，将40种济麦22的衍生品种种植于河南安阳。采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长1.5m，行宽0.2m，50粒/行。田间管理措施按照当地小麦田间管理规范进行。小麦成熟后，随机剪取30个穗并人工脱粒，随机取1000粒种子称重，三次重复，求其平均值，即为千粒重。

各个年度的各个小麦品种的千粒重统计结果见表2中第3—5列。

计算各个小麦品种三个年度的千粒重的平均值，即各个小麦品种的千粒重。各个小麦品种的千粒重统计结果见表2中第6列。

3、关联分析

分别统计两种基因型的小麦的平均千粒重，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROCTTEST模型进行t测验。统计结果见表3。

结果表明，40种济麦22的衍生品种组成的群体中，GG纯合型的小麦品种的千粒重>AA纯合型的小麦品种的千粒重；所述“>”为在统计学上的>(即在0.05水平显著高于)。由此可见，GG纯合型是提高小麦千粒重的优异基因型。

表3

注：*表示P<0.05。

上述结果表明，通过检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型可以筛选小麦千粒重性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.引物组，由上游引物F1、上游引物F2和下游引物R组成；

所述上游引物F1由荧光标签序列甲和SEQ ID NO:2自5’末端起第22至39位所示的DNA片段组成；

所述上游引物F2由荧光标签序列乙和SEQ ID NO:3自5’末端起第22至39位所示的DNA片段组成；

所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于：

所述荧光标签序列甲的核苷酸序列如SEQ ID NO:2自5’末端起第1至21位所示；

所述荧光标签序列乙的核苷酸序列如SEQ ID NO:3自5’末端起第1至21位所示。

3.权利要求1或2所述引物组的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的千粒重；

b2)筛选具有高千粒重的小麦品种；

b3)小麦育种。

4.SEQ ID NO:1所示的DNA片段的应用，为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的千粒重；

b2)筛选具有高千粒重的小麦品种；

b3)小麦育种；

b4)作为鉴定待测小麦的千粒重的分子标记。

5.一种筛选不同千粒重小麦的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型，基于AX-110125073位点的基因型为GG纯合型的小麦的千粒重>基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型的小麦的千粒重；

AX-110125073位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型的步骤如下：

(a1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(a2)完成步骤(a1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测小麦基于AX-110125073位点的基因型。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型为AA纯合型还是GG纯合型的步骤如下：

(b1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(b2)取步骤(b1)得到的PCR扩增产物，测序；

(b3)根据步骤(b2)得到的测序结果，获得待测小麦基于AX-110125073位点的基因型。

8.一种试剂盒，包括检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型的物质；

AX-110125073位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起第36位的核苷酸。

9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述检测待测小麦基于AX-110125073位点的基因型的物质为权利要求1或2所述引物组。

10.权利要求8或9所述的试剂盒的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)鉴定待测小麦的千粒重；

b2)筛选具有高千粒重的小麦品种；

b3)小麦育种。

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