CN113151565A - 水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发及其应用，属于基因组序列及植物生物技术领域。它包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性；基因型为水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型；记KASP_Pi40位点是水稻基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为CA或AG，为序列表中SEQ ID No.4的第101‑102位核苷酸。本发明利用KASP技术对与水稻稻瘟病抗性基因Pi40紧密连锁的SNP位点进行基因快速分型鉴定，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时分子标记KASP_Pi40的表型选择效率达到94.44%，可在水稻的不同种质资源中快速、精准的检测水稻稻瘟病抗性基因Pi40；可在育种早期进行分子标记辅助选择，降低育种成本，加快育种进程。

Description

水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发及其应用

技术领域

本发明涉及基因组序列及植物生物技术领域，具体涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是全球三大主要粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物。2020年，我国水稻种植面积达4.5亿亩，约占粮食总面积的四分之一，我国约六成以上人口以稻米为主食。除食用颖果外，稻米还可制淀粉、酿酒、制醋，米糠可制糖、榨油、提取糠醛，供工业及医药用；稻杆为良好饲料及造纸原料和编织材料，谷芽和稻根可供药用(郭孔雁,冯敏.稻米营养价值及其食味的研究[J].湖南农学院学报,1989,15(4):1-5.)。

稻瘟病是水稻最为严重的病害之一，每年因稻瘟病损失的水稻为其年产量的10％～30％(Skamnioti P,Gurr S J.Against the grain:safeguarding rice from riceblast disease[J].Trends in Biotechnology,2009,27(3):141-150.)。因此，培育抗稻瘟病品种是水稻育种的重要方向。分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，可以利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLP mapping in plantbreeding:New tools for an old science.1989,Biotechnology,7:257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，是提高水稻抗病育种效率的有效途径。迄今为止，科学家已克隆了30多个抗稻瘟病基因，包括Pi37、Pit、Pish、Pi21、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pid2、Pid3、Pi25、Pi36、Pi5、Pikh、Pikm、Pikp、Pi1、Pik、Pia、Pb1、Pita等基因(杨庆,YANG,Qing,等.水稻抗稻瘟病基因与育种研究进展[J].北方水稻,2017.)。大部分基因都开发了相应的Indel、SSR或CAPS分子标记(郑祥正.稻瘟病抗性位点Pik-InDel分子标记开发及其在育种上的应用[J].分子植物育种,2020,v.18(18):186-189.；杨德卫,唐定中,李生平.稻瘟病抗性基因Pib的功能特异性分子标记及其检测方法与应用:,2020.)。SSR标记、InDel标记或酶切标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台。

基于SNP位点设计的标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加产量育种准确度与提高育种效率的有效手段。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻抗病KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国抗病水稻的育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：

水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发，其主要步骤如下：

包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性；所述基因型为水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型；所述记KASP_Pi40位点是水稻基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为CA或AG，为序列表中SEQ ID No.4的第101-102位核苷酸。

作为优选实例，当所述KASP_Pi40位点的基因型为AG/AG基因型时，水稻为感稻瘟病或者候选为感稻瘟病，其中，所述AG/AG基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pi40位点的核苷酸种类为AG的纯合型。

作为优选实例，当所述KASP_Pi40位点的基因型为CA/CA基因型时，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病；其中，所述CA/CA基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pi40位点的核苷酸种类为CA的纯合型。

作为优选实例，当所述KASP_Pi40位点的基因型为AG/CA基因型时，所述AG/CA基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pi40位点的核苷酸种类为AG和CA的杂合型。

一种水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的产品，包括以下几种：

a、检测与水稻稻瘟病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

b、鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻的产品；

c、用于水稻辅助育种的产品；

d、用于选育抗稻瘟病水稻资源的产品。

作为优选实例，所述产品包含以下物质，

I、所述检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_Pi40位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；

II、所述检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

III、含有D1所述PCR引物或D2所述PCR试剂的试剂盒。

作为优选实例，PCR引物主要包括以下几个方面：

i、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-44位的单链DNA，核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-43位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQID No.3的单链DNA组成的引物组；

ii、所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ IDNo.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的产品而提出的应用，主要包括以下几项：

A、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中；

B、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中；

C、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中；

D、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病的水稻资源中。

本发明的有益效果是：本发明利用KASP技术对与水稻稻瘟病抗性基因Pi40紧密连锁的SNP位点进行基因快速分型鉴定，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时分子标记KASP_Pi40的表型选择效率达到94.44％，可在水稻的不同种质资源中快速、精准的检测水稻稻瘟病抗性基因Pi40；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭EB(Ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行分子标记辅助选择，减小育种群体的田间种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

附图说明

图1为水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发流程图；

图2为水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记检测品种材料的分型图；

图3为水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发检测F2群体的分型图。

具体实施方式

为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一

与水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发

与水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的流程如图1所示，据文献报道，获得一个与Pi40基因紧密连锁的SNP位点。

1.引物的确定：将Pi40基因的紧密连锁SNP位点锚定在水稻6号染色体10389855-10389856bp位置上(寇姝燕,邓剑川,邹茜,等.基于抗稻瘟病基因Pi40特异性SCAR标记的MAS育种应用[J].分子植物育种印刷版,2019,17(17).)，从NCBI数据库下载Pi40基因的紧密连锁SNP位点的侧翼序列，并利用Primer5.0软件，共设计3组KASP引物，利用DouglasScientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证，所述用于检测与水稻稻瘟病抗性基因Pi40紧密连锁KASP标记的引物具体如下：

Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattTAAGTCGAACTTCTTCAGGTGAG-3’(SEQ IDNo.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；

Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctAAGTAGATCTTCTTCAGGTGCA-3’(SEQ IDNo.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

Primer R：5’-GAGATGCCTAACTGGATTGAGC-3’(SEQ ID No.3)。

所述引物对应的SNP位点为水稻基因组第6号染色体的第10389855-10389856位碱基(对应序列表中序列4中第101-102位核苷酸)；

2.DNA提取：采用常规CTAB法从水稻叶片中提取基因组DNA；

3.KASP反应测试

SNP标记扩增及反应体系：

(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：

5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L^-1各12μL，反向引物Primer R100pmol·L^-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL；按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。

以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测

1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L^-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL，根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。

以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。

其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成，荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。

扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型(即检测水稻基因组第6号染色体的第10389855-10389856位碱基是A还是G)，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型为AG/AG纯合型(即水稻基因组第6号染色体的第10389855-10389856位碱基为AG纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型为CA/CA纯合型(即水稻基因组第6号染色体的第10389855-10389856位碱基为CA纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型为CA/AG杂合型(即水稻基因组第6号染色体的第10389855-10389856位碱基为CA/AG杂合型)，左下角显示为空白对照。

5.标记分型数据分析

为了验证KASP_Pi40位点的可靠性，首先，利用KASP_Pi40对16份水稻品种材料进行分子标记检测(图2)；然后，对16份水稻品种材料进行稻瘟病接种鉴定，获得材料的抗性数据，稻瘟病接种鉴定方法及评价标准见文献(寇姝燕,邓剑川,邹茜,等.基于抗稻瘟病基因Pi40特异性SCAR标记的MAS育种应用[J].分子植物育种印刷版,2019,17(17).)，材料基因型采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复，扩增结果表明，KASP_Pi40位点在16份材料中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到AG-VIC和CA-FAM两个等位位点(图2)，因此，本发明所述的KASP_Pi40位点可用于水稻稻瘟病抗性基因Pi40的分子标记辅助育种。

表1.16份测试水稻品种的表型与基因型信息表

注：表中‘T’表示材料的表型为抗病；‘S’表示材料的表型为感病；‘CA/CA’表示纯合抗病基因型；‘AG/AG’表示纯合感病基因型；‘CA/AG’表示杂合抗病基因型；‘*’表示无检测信号。

实施例2

与水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记在分子标记辅助选择水稻抗稻瘟病植株中的应用

为检测本发明KASP_Pi40位点的实用性，利用抗稻瘟病材料Xiangai B与感稻瘟病材料云粳4号杂交获得F1群体，通过F1天然自交产生F2自然分离群体90株，对分离群体进行KASP标记检测和抗病表型验证(表2)，标记检测和抗病表型验证实施方法参考实施例1，通过对分离群体进行表型与基因型检测和分析，在90份分离群体单株中，仅5株基因型与表型结果不一致，标记KASP-Mi与田间抗性的一致性结果为P＝94.44％，表明标记KASP-Mi在水稻抗根结线虫病植株筛选中具有较高的实用性。

表2.水稻分离群体的表型与基因型信息表

注：表中‘T’表示材料的表型为抗病；‘S’表示材料的表型为感病；‘CA/CA’表示纯合抗病基因型；‘AG/AG’表示纯合感病基因型；‘CA/AG’表示杂合抗病基因型；‘*’表示无检测信号。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 常熟市农业科学研究所

<120> 水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

gataaagata aaggaccatg aggttgggca atgccccaag tatcagcatg gttttacctt 60

ccttagttta ctcctccgta agtcgaactt cttcaggtga gtgagctgct caatccagtt 120

aggcatctct tcaagacttc cattcaacct gagtgtcctt agtaggggag gaggagatga 180

aatagaatct aggcactcaa g 201

<210> 2

<211> 202

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

gataaagata aaggaccatg aggttgggca atgccccaag tatcagcatg gttttacctt 60

cctttagttt gctgctcaat aagtagatct tcttcaggtg catgagctgc tcaatccagt 120

taggcatctc ctcaagaatt ccatccaaca cgagtgtcct cagtagggga ggaggagatg 180

aaatagaatc taggcactca ag 202

Claims (8)

1.水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发，其特征在于，其主要步骤如下：

包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性；所述基因型为水稻基因组中KASP_Pi40位点的基因型；所述记KASP_Pi40位点是水稻基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为CA或AG，为序列表中SEQ ID No.4的第101-102位核苷酸。

2.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发，其特征在于，当所述KASP_Pi40位点的基因型为AG/AG基因型时，水稻为感稻瘟病或者候选为感稻瘟病，其中，所述AG/AG基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pi40位点的核苷酸种类为AG的纯合型。

3.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发，其特征在于，当所述KASP_Pi40位点的基因型为CA/CA基因型时，水稻为抗稻瘟病或者候选为抗稻瘟病；其中，所述CA/CA基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pi40位点的核苷酸种类为CA的纯合型。

4.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发，其特征在于，当所述KASP_Pi40位点的基因型为AG/CA基因型时，所述AG/CA基因型表示水稻基因组中所述KASP_Pi40位点的核苷酸种类为AG和CA的杂合型。

5.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的产品，其特征在于，包括以下几种：

a、检测与水稻稻瘟病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

b、鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻的产品；

c、用于水稻辅助育种的产品；

d、用于选育抗稻瘟病水稻资源的产品。

6.根据权利要求5所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的产品，其特征在于，所述产品包含以下物质，

I、所述检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_Pi40位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；

II、所述检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

III、含有I所述PCR引物或II所述PCR试剂的试剂盒。

7.根据权利要求5或6任意一项所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的产品所提出的物质，其特征在于，包括以下几个方面：

i、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-44位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-43位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.3的单链DNA组成的引物组；

ii、所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

8.根据权利要求7所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi40的KASP标记开发的产品而提出的应用，其特征在于，主要包括以下几项：

A、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻稻瘟病抗性中；

B、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗稻瘟病水稻产品中；

C、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中；

D、应用在检测水稻基因组中KASP_Pi40位点的多态性或基因型的物质在选育抗稻瘟病的水稻资源中。

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