CN116024372B - 一种快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记及其应用，其中，扩增所述dCAPS分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1(AGTTAACTCGGAACCATGTCAAAC)所示，下游引物序列如SEQ ID No.2(TAAACTATCTTTGTGAGTGAGTGTAG)所示。本发明通过采用引入一个错配碱基引物对待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，实现了同步筛选无位点突变大豆基因组DNA和鉴定抗干旱品种的目的，提高了筛选效率和筛选准确率。

Description

一种快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记及其应用。

背景技术

大豆作为中国的传统粮食作物，也是中国重要的饲料原产品之一。为了提高中国的大豆产量和质量，必须要重视由不良生态环境造成的影响。而干旱导致的缺水一直是制约我国大豆产量的重要因素，具体的说，植物的生长发育依赖外部的环境作用和内部的代谢活动同时发挥作用，水分的吸收对于细胞的分裂分化起着极为重要的作用；据研究，细胞壁是植物的生长发育中的重要因素，通过对活体材料，包括大豆、水稻、玉米、小麦进行干旱处理发现，当水分亏缺时，植物细胞壁的伸展受到明显的抑制；此外干旱还会对植物光合作用、呼吸作用以及植物的渗透调节等一系列生理代谢活动造成紊乱。因此，长期缺水会造成大豆产量大幅度缩减，大豆质量大幅度下降。目前，干旱胁迫是制约大豆事业发展的最大问题之一。

而大豆的抗旱性不同于其他简单性状，抗干旱性状是由多基因控制的数量性状，其表型并不会一成不变，会随着环境的改变而变化。目前为止对于大豆抗旱性的评价标准更多的集中于表型观测以及生理生化指标，但是不同的干旱胁迫会对大豆的表型造成不同的影响，且表型的观测具有主观性，标准也并不统一。好多生理生化指标的使用要结合实验室数据分析或通用性不好,现如今对于大豆抗干旱性的评价标准混乱复杂。因此迫切需要一个简单、直观且能够快速形成鉴定大豆抗干旱材料的新方法。

目前通过遗传改良提高大豆品种的抗旱性已经成为重要途径之一，其中，核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)标记具有高效、准确和经济的优点，能够大幅缩短育种周期，可作为传统育种技术的有力补充。

基于酶切扩增多态性序列标记技术(cleaved amplified polymorphicsequence，CAPS)是一种基于PCR的传统分子标记技术，主要原理是根据位于酶切位点上的SNP设计引物并进行PCR扩增，通过对扩增产物酶切电泳后条带的多态性即可判断酶切位点的有无，从而对SNP实现多态性检测。但当SNP不涉及酶切位点时，就需要利用衍生的酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)来进行检测，由于dCAPS是通过在引物中引入错配碱基并结合SNP创造了序列中原本不存在的限制性酶切位点，因此，dCAPS理论上可以实现对所有SNPs的多态性检测。并且dCAPS由于其操作简单、成本低等特点现已被广泛应用于植物分子遗传学研究以及优质作物品种的选育与鉴定等多个领域。

目前尚未有用于快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记，通过采用引入一个错配碱基引物对待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，实现了同步筛选无位点突变大豆基因组DNA和鉴定抗干旱品种的目的，提高了筛选效率和筛选准确率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种快速鉴别大豆抗旱性的dCAPS分子标记，扩增所述dCAPS分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

本发明进一步提供了如前所述的dCAPS分子标记在快速鉴别大豆抗旱性中的应用。

本发明进一步提供了如前所述的dCAPS分子标记在辅助选择大豆育种方面的应用。

本发明进一步提供了用于检测如权利要求1所述的dCAPS分子标记的试剂在快速鉴别大豆抗旱性中的应用，所述试剂包含扩增所述dCAPS分子标记的引物对；所述引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

本发明进一步提供了一种用于快速鉴别大豆抗旱性的试剂盒，所述试剂盒包含扩增如前所述的dCAPS分子标记的引物对。

本发明进一步提供了一种快速鉴别大豆抗旱性的方法，包括以下步骤：

提取待测大豆基因组DNA；

采用扩增上述的dCAPS分子标记的引物对对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

对扩增产物酶切后，获得酶切产物；

对所述酶切产物进行电泳检测，根据酶切产物的条带类型鉴别大豆抗旱性。

进一步方案，所述PCR扩增的体系包括：12.5μL 2×Rapid Taq Master Mix，1μL上游引物，1μL下游引物，2μL大豆基因组DNA和8.5μL ddH₂O。

进一步方案，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸15s，循环36次；72℃延伸5min；4℃保存。

进一步方案，所述酶切采用限制性内切酶Mun I进行。

进一步方案，所述的根据酶切产物的条带类型鉴别大豆抗旱性具体为：

若酶切产物显示为134bp的高条带，则判断大豆品种为抗旱类型；若酶切产物显示为110bp的低条带，则判断大豆品种为常规品种。

本发明的有益效果如下：

本发明采用引入一个错配碱基引物对对待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，实现了同步筛选无位点突变大豆基因组DNA和鉴定抗干旱品种的目的，降低了筛选时间，提高了筛选效率和筛选准确率；

本发明的分子标记可针对整个大豆生长时期的抗旱性进行判断，可以快速筛选出具有高抗旱属性的大豆材料，为优化的大豆抗干旱品种提供了方法基础，提高了大豆产量和质量，在辅助大豆育种以及大豆遗传改良中具有重要的作用。

附图说明

图1为不同基因型DNA序列上的差异以及引物中的错配碱基；

图2为经过限制性内切酶Mun I酶切后，电泳检测呈现的不同条带；图中，从左至右的品种依次为A基因型(820-3(T)、820-4(S)、绥农26、吉林菜里香、绥农25、中科毛豆4号、通县黄豆、北石佛黄豆)，C基因型(冀16YG162、中作09-560、辽豆36、晋豆21、16YJ051-2、中黄19、红豆、ZDD26249)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1获得SNP突变位点

通过2214份大豆基因组重测序数据(数据来源https://sfgb.rmbreeding.cn/index)，通过对基因型和表型分析后发现SNP突变位点在大豆基因组第12号染色体4920921处，此处碱基为A或C，该位点与大豆抗旱性状显著相关。

实施例2引物设计

1、根据实施例1中获得的与大豆抗旱性状显著相关的第12号染色体4920921位点，提取位点相关序列：

AGTTAACTCGGAACCATGTCAAAT(A/C)ATTGATCTTGGTGAGTGACTCATGCTTTATATACATATTATTAAT(SEQ ID No.3)。利用在线酶识别软件dCAPS Finder2.0选择出限制性内切酶Mun I，该限制性内切酶的酶切识别序列为CAATTG。

2、经过分析，上述位点具有A和C两种基因型，其中，A基因型代表SNP位点为A，由于酶切位点的存在，其能够被酶切，电泳检测酶切后的条带长度为110bp；C基因型代表SNP位点为C，不能被酶切，电泳检测条带长度为134bp。

3、引物设计：使用dCAPs Finder 2.0网站和Primer5.0软件设计得到的引物对为：

dCAPS-F：5’-AGTTAACTCGGAACCATGTCAAAC-3’(SEQ ID No.1)；

dCAPS-R：5’-TAAACTATCTTTGTGAGTGAGTGTAG-3’(SEQ ID No.2)。

实施例3快速鉴别大豆抗旱性

1、大豆材料：具体可参见表1。

2、对大豆品种抗旱性的鉴别，步骤如下：

步骤1、提供引物对：采用实施例2中设计的能够鉴定大豆基因组DNA是否有位点突变的引物对。

步骤2、提取待测大豆基因组DNA，采用CTAB法进行提取，其具体步骤为：

(1)在2mL离心管中加入适量磨碎后的样品，加入800μL CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴锅10min，每3min上下翻转一次；

(2)加入800μL核酸提取液(24：1)，振荡1min后，12000rpm离心5min，吸取上清液600μL(不能吸取到其他层)转入新的1.5mL离心管；

(3)加入等体积异丙醇(预冷)，上下翻转10次左右，静置2min，12000rpm离心5分钟，弃上清；

(4)加入500μL 70％乙醇(预冷)，用枪头轻轻吹打清洗DNA絮状沉淀(注意不能将沉淀吹散)，12000rpm离心2分钟，弃乙醇；

(5)通风橱中风干30min，加入100μL ddH₂O溶解；

(6)使用紫外可见分光光度计检测DNA纯度和浓度，置于-20℃冰箱保存。

步骤3、PCR扩增

采用步骤1中设计的引物对对提取的大豆基因组DNA进行扩增，获得扩增产物。

其中，扩增体系如下：

具体的扩增程序如下：

通过对扩增的目的片段进行测序，测序序列有两种基因型：

A基因型：

AGTTAACTCGGAACCATGTCAAACAATTGATCTTGGTGAGTGACTCATGCTTTATATACATATTATTAAT(SEQ ID No.4)。

C基因型：

AGTTAACTCGGAACCATGTCAAACCATTGATCTTGGTGAGTGACTCATGCTTTATATACATATTATTAAT(SEQ ID No.5)。

步骤4、取5μL步骤3中的PCR扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过凝胶成像分析系统验证条带后对PCR产物进行酶切，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物仅含一条主带，片段大小为168bp，说明成功扩增出目的片段。

步骤5、加入限制性内切酶进行酶切3个小时后取10μL酶切产物，使用4％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过凝胶成像分体系统观察酶切产物的条带类型。

其中，酶切体系如下：

酶切程序如下：

如图1中所示的，C基因型由于没有酶切位点的存在，其目的片段不会被切开；而A基因型由于酶切位点的存在，酶切识别序列为CAATTG，会导致目的片段被切开；最终电泳结果显示，条带会呈现一高一低的现象，如图2中所示的。其中，条带长度为134bp的高条带说明该大豆品种为抗旱类型，而条带长度为110bp的低条带则说明该品种为常规品种。其中，表1中示出了实施例3中快速鉴别大豆抗旱性的方法对不同大豆品种抗旱性的鉴别结果。

表1大豆品种抗旱性鉴别结果

根据表1的测试结果，通过测量相关抗旱指标，如测量测量过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等。结果显示，在相同条件的干旱胁迫下，C基因型大豆材料具有更高的抗氧化酶活性，暗示其具有更高的抗干旱能力。说明通过本发明中的dCAPS分子标记能够准确且快速的鉴别出大豆材料的抗旱性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1. dCAPS分子标记在快速鉴别大豆抗旱性中的应用，其特征在于，扩增所述dCAPS分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

2. dCAPS分子标记在辅助选择大豆育种方面的应用，其特征在于，扩增所述dCAPS分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

3. 用于检测dCAPS分子标记的试剂在快速鉴别大豆抗旱性中的应用，其特征在于，所述试剂包含扩增所述dCAPS分子标记的引物对；所述引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

4. 用于检测dCAPS分子标记的试剂盒在快速鉴别大豆抗旱性中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含扩增所述的dCAPS分子标记的引物对；所述引物对的上游引物序列如SEQID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

5.一种快速鉴别大豆抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测大豆基因组DNA；

采用扩增dCAPS分子标记的引物对对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；所述引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

对扩增产物酶切后，获得酶切产物；

对所述酶切产物进行电泳检测，根据酶切产物的条带类型鉴别大豆抗旱性。

6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系包括：12.5 µL 2×Rapid Taq Master Mix，1µL上游引物，1µL下游引物，2µL大豆基因组DNA和8.5µL ddH₂O。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸15s，循环36次；72℃延伸5min；4℃保存。

8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶切采用限制性内切酶Mun I进行。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的根据酶切产物的条带类型鉴别大豆抗旱性具体为：

若酶切产物显示为134bp的高条带，则判断大豆品种为抗旱类型；若酶切产物显示为110bp的低条带，则判断大豆品种为常规品种。