CN111593058A - Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用 - Google Patents

Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因Bna‑miR169n的分离克隆和应用，本发明分离和应用一种包含基于Bna‑miR169n序列改造得到的核苷酸片段Bna‑MIM169n，该片段赋予甘蓝型油菜抗旱性增强的能力。本发明从甘蓝型油菜中分离Bna‑miR169n基因，通过基因工程技术控制Bna‑miR169n基因的表达量能够控制甘蓝型油菜对干旱胁迫的抗性，对于培育高抗旱性甘蓝型油菜新品种具有十分重要的意义。

Description

Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用
技术领域
本发明涉及甘蓝型油菜基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高抗旱性的甘蓝型油菜Bna-MIM169n片段在甘蓝型油菜抗旱性遗传改良中的应用。本发明利用PCR的方法，分离到控制甘蓝型油菜干旱应答相关基因Bna-miR169n，并利用基因工程技术对其进行改造得到片段Bna-MIM169，该片段能够提高甘蓝型油菜的抗旱性，证实了Bna-miR169n的功能及其应用途径。
背景技术
油菜是我国重要的食用油来源。2017年全国油菜种植面积为6653千公顷，油菜籽产量达到1327.41万吨，约占油料作物总播种面积和产量的40％(中华人民共和国农业和农村部http://www.moa.gov.cn/sjpre/)。中国人民共和国农业农村部提出力争将2020年油料作物种植的总面积稳定在1.9亿亩，其中油菜是可以满足自给的重要潜力作物(http://www.moa.gov.cn/govpublic/ZZYGLS/202002/t20200210_6336809.htm？keywords＝％E6％B2％B9％E8％8F％9C)，具有重要的经济地位。油菜是十字花科芸薹属成员，主要分为白菜型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜。甘蓝型油菜起源于欧洲，其产量和品质与其他两个栽培种相比具明显的优势，而且其具有高抗病、抗逆、适应性广等特征，因此被认为是具有最大利用潜质的油料作物之一，也是目前中国栽培面积最广的油菜类型。油菜不仅能够用于生产优质的食用油，而且也是高蛋白饲用饼粕的重要来源，且甘蓝型油菜的主要生命周期在冬季和春季完成，不与水稻等粮食作物争地，具有较大利用潜质。然而，甘蓝型油菜在生长过程中会受到各种生物和非生物胁迫的影响，这些不利的环境因素严重制约了甘蓝型油菜的产量。到目前为止，甘蓝型油菜逆境应答的研究尚不深入，如何从根本上解决由于油菜逆境胁迫而导致的产量降低也还未找到有效的方法。解析甘蓝型油菜逆境应答的调控机制、改良油菜抗逆性是甘蓝型油菜理论研究和育种实践中重要的工作内容。
发明内容
本发明提供一种基于Bna-miR169n、基因改造片段Bna-MIM169及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用。利用qPCR手段分析了甘蓝型油菜中Bna-miR169n成熟序列在干旱胁迫条件下的表达变化情况，结果显示在干旱条件下，Bna-miR169n的表达显著下降。本发明分离和应用一种包含Bna-MIM169n的DNA片段，该片段赋予甘蓝型油菜提高叶片抗旱性的能力。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因，所述基因为Bna-miR169n，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
或基于Bna-miR169n改造的Bna-MIM169n，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
所述的Bna-miR169n的成熟序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列长度为21bp，基于Bna-miR169n成熟序列改造的Bna-MIM169n序列如序列表SEQ ID NO:2所示，序列长度为24bp。
一种甘蓝型油菜抗旱调控基因。所述基因是如下(a1)-(a3)中任何一种的核苷酸序列：
(a1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的核苷酸序列杂交且编码甘蓝型油菜抗旱性调控相关蛋白的DNA分子；
(a3)与(a1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性的甘蓝型油菜抗旱性调控相关DNA分子。
本发明的另一个目的是提供含有前述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
本发明还提供所述的控制甘蓝型油菜抗旱性基因在转基因甘蓝型油菜中的应用。
本发明的又一个目的是提供(b1)或(b2)或(b3)的应用：
(b1)所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控甘蓝型油菜抗旱性中的应用；
(b2)所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育甘蓝型油菜新品种中的应用；
(b3)所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗旱性中的应用。
本发明还提供一种培育提高植物抗旱性的转基因植物的方法，为提高目的植物中所述核苷酸片段的含量或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性增加。
一种培育提高植物抗旱性的转基因植物的方法，采用前述方法培育得到转基因植物；所述的转基因植物含有甘蓝型油菜干旱调控基因。
本发明还提供了一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因重组载体的构建方法，所述基因为前述控制甘蓝型油菜抗旱性基因，所述方法包括以下步骤：将包含Bna-MIM169n基因片段的克隆载体质粒经SpeI+AscI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段，将此片段与相应酶切的pMDC83骨架载体相连构建成Bna-miR169n基因的target mimicry载体。
本发明还提供一种抗旱转基因植物的培育方法，对上述构建方法构建的载体进行农杆菌转化，利用农杆菌介导法实现外源片段在甘蓝型油菜中的遗传转化，得到转基因植物。
进一步的，所述遗传转化方法包括：
种子灭菌；
将种子接种于M0培养基上，温室避光培养；
将-70℃保种的农杆菌菌株活化，提前一天挑取单菌落接种于含有Kan和Gen抗性的LB液体培养基摇菌，28℃摇床250rpm培养过夜至菌液浓度OD600＝0.3；25℃6000rpm离心5min，弃上清，用DM液重悬两次并再次离心，弃上清；
将幼苗下胚轴切割为长度为1.0-1.5cm的小段，转移到配制好的DM侵染液中暂存，将重悬好的农杆菌菌液加入DM侵染液中侵染10min；然后将外植体转移到M1培养基上，24℃黑暗条件下共培养36h至48h；
将外植体从M1培养基上转入含250mg/L Hyg的M2培养基中，25℃光照培养15～20d后，将存在明显愈伤组织的外植体转移到含250mg/L Hyg的M3培养基中，每隔15～20d继代一次，直至出现绿色幼苗；
将具有明显生长点的幼苗移至M4培养基上，25℃光照培养2～4周直至生根；
炼苗和移栽。
本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜抗旱品种的方法，提取甘蓝型油菜基因组DNA，检测前述控制甘蓝型油菜抗旱性基因的表达量。
进一步的，引物序列如SEQ ID NO:12所示。
携带有本发明Bna-MIM169n的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电击转化等常规生物技术方法导入植物细胞。
可使用包括本发明的Bna-MIM169n的表达载体转化宿主(包括甘蓝型油菜在内的多种植物)，培育产量相对提高的植物品种。植物宿主还可以为水稻、烟草、大豆、番茄、小麦等。
利用DNA回收试剂盒回收包含Bna-miR169n基因成熟序列的DNA片段，将IPSI上与miR399结合的区域通过设计特定引物改造，利用酶切连接的方法，将此片段连入pMDC83骨架载体，构建该基因的过量表达载体，命名为pMDC83-Bna-MIM169n。
利用电击转化法将pMDC83-Bna-MIM169n载体导入GV3101农杆菌。借助农杆菌侵染介导的遗传转化方法将pMDC83-Bna-MIM169n转化甘蓝型油菜受体材料J9712，成功获得了Bna-miR169n基因表达量相对于对照显著降低的转基因植株，观察发现，与对照植株相比，过表达Bna-MIM169n的转基因甘蓝型油菜在自然干旱条件下，植株长势较好，说明Bna-MIM169n能够调控植物抗旱性。
有益效果
本发明以甘蓝型油菜为研究材料，通过分析甘蓝型油菜在正常条件下和干旱胁迫条件下miRNA的表达水平，发现Bna-miR169n在正常条件下和干旱胁迫条件下显著差异表达，可能在提高植物抗旱性中起重要作用。
甘蓝型油菜是我国食用油的主要来源之一，提高甘蓝型油菜的产量和抗逆性是目前油菜育种工作的重要目标之一。本发明中，基于Bna-miR169n基因片段改造的Bna-MIM169n能够提高甘蓝型油菜的抗旱能力，说明Bna-miR169n基因参与了甘蓝型油菜的干旱应答。因此，从甘蓝型油菜中分离Bna-miR169n基因，并鉴定其在增强甘蓝型油菜抗旱性方面的生物学功能，对于培育抗逆性增强的甘蓝型油菜新品种具有十分重要的实践意义。
附图说明
图1 Bna-miR169n在甘蓝型油菜干旱条件下的表达情况；
图2 Bna-miR169n target mimicry载体(pMDC83-Bna-MIM169n)构建示意图；
图3 Bna-miR169n在pMDC83-Bna-MIM169n转基因阳性植株中的表达情况，CK为转基因阴性植株；其余编号的植株为pMDC83-Bna-MIM169n转基因阳性甘蓝型油菜；
图4 Bna-MIM169n转基因甘蓝型油菜的抗旱性表型，其中CK为对照植株；Bna-MIM169n为Bna-miR169n的转基因甘蓝型油菜。
图5 Bna-MIM169n转基因甘蓝型油菜干旱应答相关基因的表达水平。
具体实施方式
实施例1
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有Bna-MIM169n片段，以及验证Bna-miR169n基因功能的方法。根据以下描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用于不同的用途和条件。
实施例1：qPCR分析甘蓝型油菜内源miR169n在甘蓝型油菜干旱条件下的表达情况
取甘蓝型油菜四叶一心时期胁迫0d、3d(轻度萎蔫)、5d(中度萎蔫)和7d(重度萎蔫)对应的同一时刻的叶片样品，迅速置于液氮中，并采用大连TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取总RNA，并用天根生化科技(北京)有限公司的miRNA反转录试剂盒进行反转录，
反转录体系：
Figure BDA0002507169680000061
42℃反应60min，95℃3min处理后，产物保存于－20℃冰箱，并用miRNA荧光定量试剂盒(miRcute Plus miRNA qPCR Kit)中的Reverse Primer与甘蓝型油菜的内参引物5.8S(5'-GTCTGCCTGGGTGTCACG-3')(SEQ ID NO:3)八连管跑一个样品,检测模板cDNA的质量和浓度。
采用qPCR技术分析Bna-miR169n在干旱胁迫不同时期的相对表达量(Bna-miR169n-F引物：5'-TCATATACCCATCACAAACACTCTTTG-3'(SEQ ID NO:4)，Bna-miR169n-R引物：5'-TCATATACCCATCACAAACACTCTTTG-3')(SEQ ID NO:5)，如图1所示，可见Bna-miR169n在干旱处理后的甘蓝型油菜叶片中的表达出现了显著下调。
实施例2：甘蓝型油菜Bna-MIM169n片段的分子改造
取甘蓝型油菜“Darmor-bzh”三叶一心期幼苗置于冰盒中带回实验室，将样品放置于-20℃冰箱中保存以备提取DNA。利用快提法提取DNA。
首先设计引物Bna-IPS1F(5'-ACTAGTGAAACCTTCTCTTAATCTGGC-3')(SEQ ID NO:6)和Bna-IPS1R(5'-GGCGCGCCTCACTCCAATGAGATATGG-3')(SEQ ID NO:7)克隆甘蓝型油菜中的IPS1基因，在引物两端分别引入SpeI和AscI酶切位点，设计2对目的基因特定引物Bna-MIMn-F(5'-CCGGCAAGTCTCTATCCTTGGCTGGCTTCGGTTCCCCT-3')(SEQ ID NO:8)，Bna-MIMn-R(5'-CAGCCAAGGATAGAGACTTGCCGGCAATTTATAGAGGG-3')(SEQ ID NO:9)将IPS1上与miR399结合序列替换Bna-miR169n与靶基因结合的序列，分别用IPS1的上游引物与MIM169n的下游引物和MIM169n的上游引物与IPS1的下游引物分段扩增，得到第一轮PCR的2个初级产物，再以第一轮初级PCR产物为模板，以Bna-IPS1F/R为引物进行重叠延伸PCR，切胶回收获得Bna-MIM169n目的片段，命名为Bna-MIM169n-T。
实施例3：Bna-miR169n基因target mimicry载体(pMDC83-Bna-MIM169n)的构建
为了更好地分析Bna-miR169n基因的功能，申请人将其在甘蓝型油菜中抑制表达，通过观察转基因植株在干旱胁迫条件下的表型来研究该基因的功能。
Target mimicry表达载体构建方法如下：将上述Bna-MIM169n-T扩增片段连接到北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt T载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，委托南京擎科生物科技有限公司对阳性克隆进行测序。
包含Bna-MIM169n片段的克隆载体质粒经SpeI+AscI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段，将此片段与相应酶切的pMDC83骨架载体相连构建成Bna-miR169n基因的target mimicry载体，命名为pMDC83-Bna-MIM169n(图2)。
实施例4：pMDC83-Bna-MIM169n的甘蓝型油菜遗传转化
利用电击转化法对构建好的载体进行农杆菌转化，步骤如下：
(1)准备电转化所需的电转仪、电转杯和500μL液体LB培养基；
(2)取农杆菌感受态细胞放置冰上融化至液态时，加入2μL目的质粒混匀；
(3)吸取农杆菌感受态细胞和质粒的混合物转移到电转杯底部，以2000V电压进行电击，促使质粒转入农杆菌感受态细胞；
(4)电击后迅速将500μL LB液体培养基加入电转杯中，吸打混匀后将农杆菌液转入新的1.5mL离心管中，28℃摇床200rpm培养30min；
(5)取出菌液，6000rpm室温离心5min，吸弃450μL上清后重悬菌液；
(6)取适量菌液涂布于含有卡拉霉素(Kanamycin，Kan)和庆大霉素(Gentamycin，Gen)抗性的LA培养基平板上，28℃培养2d。
转化甘蓝型油菜的遗传转化方法为借鉴华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的转化方法改进之后的方法，以甘蓝型油菜无菌幼苗的下胚轴作为外植体，利用农杆菌介导法实现外源片段在甘蓝型油菜中的遗传转化。
所用培养基配方如下：
接种培养基(M0)：MURASHIGE&SKOOG MEDIUM(Duchefa Biochemie公司)+30.0g/L蔗糖Sucrose+8g/L琼脂Agar(pH 5.8-pH 6.0)。
共培养培养基(M1)：M0+18.0g/L甘露醇Mannitol+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D+0.3mg/L激动素Kinetin+100μM乙酰丁香酮AS(pH 5.8)。
愈伤分化培养基(M2)：M1+300.0mg/L特美汀Timentin+25mg/L潮霉素(HygromycinB，Hyg)。
生苗培养基(M3)：MURASHIGE&SKOOG MEDIUM(Duchefa Biochemie公司)+10.0g/L葡萄糖Glucose+0.25g/L木糖Xylose+0.6g/L吗啉乙磺酸MES+2.0mg/L玉米素Zeatin+0.1mg/L吲哚乙酸IAA+300.0mg/L特美汀Timentin+25mg/L Hyg。
壮苗生根培养基(M4)：M0+300.0mg/L特美汀Timentin。
MURASHIGE&SKOOG MEDIUM简称为MS培养基。
甘蓝型油菜遗传转化具体操作步骤如下：
(1)油菜种子灭菌：先挑选籽粒较为饱满的甘蓝型油菜种子，在无菌操作台上将镊子用酒精灯烧1分钟左右灭菌彻底，然后用75％的酒精灭菌1min，再用40％的次氯酸钠(NaClO)灭菌18～20min，最后用无菌水洗约3～5次。
(2)接种：镊子灭菌烧红2次，再用镊子将种子接种于M0培养基上，每罐30～40粒，24℃温室避光培养6d左右。
(3)摇菌：将-70℃保种的农杆菌菌株活化，提前一天挑取单菌落接种于含有Kan和Gen抗性的LB液体培养基摇菌，28℃摇床250rpm培养过夜至菌液浓度OD600＝0.3。25℃6000rpm离心5min，弃上清，用DM液重悬两次并再次离心，弃上清。
(4)农杆菌侵染及共培养(M1阶段)：小心用镊子将幼苗从组培罐中取出，切除根和子叶(包括生长点)，只保留下胚轴并用锋利的刀片迅速切割成长度为1.0-1.5cm的小段，将切好的外植体转移到配制好的DM侵染液中暂存，待切取2罐幼苗对应的外植体后，将重悬好的农杆菌菌液加入DM侵染液中侵染10min(菌液与DM侵染液体积比为1：10)。然后将外植体转移到M1培养基上，24℃黑暗条件下共培养36h至48h。
(5)筛选(M2及M3阶段)：将外植体从M1培养基上转入含250mg/L Hyg的M2培养基中，25℃光照培养15～20d后，将存在明显愈伤组织的外植体转移到含250mg/L Hyg的M3培养基中，每隔15～20d继代一次，直至出现绿色幼苗(若出现菌污染情况或或玻璃化现象，可提前批次换苗)。
(6)壮苗生根培养(M4阶段)：将具有明显生长点的幼苗移至M4培养基上，25℃光照培养2～4周直至生根，其间每隔15～20d视具体情况更换一次培养基。
(7)炼苗和移栽：将培养瓶打开盖子，将苗进行修剪，剪去一些较大的叶片，加入少许无菌水在光照培养箱中培养1d使其适应正常条件，移栽至土壤中，注意温度与保湿，待苗在土中适应2～3周长出新的叶片后移植室外适应2d左右，然后移栽至大田中，注意移栽之后土壤的保湿，温度过低可以搭棚保证幼苗健康生长。
实施例5：转基因甘蓝型油菜阳性植株的鉴定
采用快速法提取甘蓝型油菜基因组DNA，其步骤如下：
(1)取两片幼嫩叶片(约0.2g)，剪碎装入2mL的离心管中，加入500μL DNA buffer和两个钢珠(直径6.7mm)，打样机50Hz，3min打碎叶片样品；
(2)将打碎的样品置于95℃孵育10min；
(3)将样品取出冷却至室温，12000rpm离心10min；
(4)吸取150μL上清转移至新的2.0mL离心管中，稀释10倍后备用。
DNA buffer配方如下：
Tris-HCl(pH＝7.5) 500mM
NaCl 300mM
蔗糖Sucrose 300mM
取1μL DNA作为模板，分别以引物35S(5'-TCAGGGTAACGGGAGAAGC-3')(SEQ ID NO:10)和Bna-MIMn-R(5'-CAGCCAAGGATAGAGACTTGCCGGCAATTTATAGAGGG-3')(SEQ ID NO:9)、Bna-MIMn-F(5'-CCGGCAAGTCTCTATCCTTGGCTGGCTTCGGTTCCCCT-3')(SEQ ID NO:8)和GFP(5'-TCAGGGTAACGGGAGAAGC-3')(SEQ ID NO:11)搭配进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min。以转基因甘蓝型油菜DNA样品作为PCR模板，能扩增出特异性目的片段，证明目的载体pMDC83-Bna-MIM169n已经整合到甘蓝型油菜基因组中。
实施例6：Bna-MIM169n转基因甘蓝型油菜抗旱性增强
本发明采用荧光检测实时定量的方法对部分转基因甘蓝型油菜植株中Bna-miR169n基因的表达进行检测，RNA的提取和反转录见实施例1。在ABI公司的7500定量PCR仪上进行荧光定量PCR，以设计的qMIM169n-F：5'-CAGCCAAGGATGACTTGCCGG-3'(SEQ ID NO:12)和miRNA荧光定量试剂盒(miRcute Plus miRNA qPCR Kit)中的Reverse Primer为引物进行荧光定量PCR，反应条件为：
Figure BDA0002507169680000101
反应结束后，用ABI7500自带的软件(7500Software v2.0.1)进行分析及绘图。结果显示，成功获得了Bna-miR169n基因的表达量相对于对照植株中Bna-miR169n基因表达量显著降低的Bna-MIM169n转基因植株(MIM169n-1、MIM169n-2、MIM169n-3、MIM169n-4、MIM169n-5)(图3)。与对照植株相比，大部分转基因阳性植株中Bna-miR169n的表达量均有不同程度降低，其中Bna-MIM169n-1、Bna-MIM169n-2、MIM169n-3中Bna-miR169n的表达量降低为对照(CK)植株中Bna-miR169n表达量的20％-40％。
对MIM169n转基因植株和CK植株进行干旱胁迫表型分析，发现与CK植株相比，在干旱胁迫前，MIM169n转基因植株和CK植株的生长状态没有明显差异；在自然断水干旱处理10d后，CK植株所有的大叶片都出现萎蔫甚至发黄干枯的情况，且有些盆中CK植株的幼嫩叶心也出现脱水萎蔫甚至发黄的情况，而MIM169n转基因植株(MIM169n-1、MIM169n-2、MIM169n-3)状态较好，大叶片萎蔫程度较轻，叶心基本无脱水萎蔫情况或脱水萎蔫情况较轻，说明与CK相比，MIM169n材料的抗旱性有一定程度的增强(图4)。
取正常条件和干旱胁迫处理10d条件下MIM169n和CK植株叶片提取RNA并反转录成cDNA，利用qPCR对干旱应答相关基因的表达水平进行分析。在正常生长条件下，这些基因在MIM169n材料和CK中的表达量没有明显差异，而在干旱胁迫处理之后，BnRD22、BnRAB18、BnNCER3在MIM169n材料中的表达量显著高于它们在CK中的表达量，说明MIM169n转基因植株可能通过调节Pro生物合成、ABA信号通路并激活一些干旱应答基因的表达从而增强植株的抗旱性(图5)。
本发明分离得到与干旱应答相关的甘蓝型油菜基因Bna-miR169n，对于研究植物干旱应答相关基因具有一定的理论指导意义。本发明分离得到的干旱应答相关基因来自于植物本身，对环境影响较小。利用分离的基因进行油菜抗旱性遗传改良分子育种，对于培育抗旱性相对提高的甘蓝型油菜新品种具有非常重要的意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagccaagga tgacttgccg g 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcggttcct atctctgaac ggcc 24
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctgcctgg gtgtcacg 18
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatataccc atcacaaaca ctctttg 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcatccttg gctgcattat actct 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actagtgaaa ccttctctta atctggc 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcgcgcctc actccaatga gatatgg 27
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggcaagtc tctatccttg gctggcttcg gttcccct 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagccaagga tagagacttg ccggcaattt atagaggg 38
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcccactatc cttcgcaag 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcagggtaac gggagaagc 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagccaagga tgacttgccg g 21

Claims (10)

1.一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因，其特征在于，所述基因为Bna-miR169n，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
或基于Bna-miR169n改造的Bna-MIM169n，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的控制甘蓝型油菜抗旱性基因，其特征在于，所述基因是如下(a1)-(a3)中任何一种的核苷酸序列；
(a1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的核苷酸序列杂交且编码甘蓝型油菜抗旱性调控相关蛋白的DNA分子；
(a3)与(a1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性的甘蓝型油菜抗旱性调控相关DNA分子。
3.含有权利要求1或2所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
4.权利要求1或2所述的控制甘蓝型油菜抗旱性基因在转基因甘蓝型油菜中的应用。
5.(b1)或(b2)或(b3)的应用：
(b1)权利要求1或2所述基因，或，含有权利要求1或2所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控甘蓝型油菜抗旱性中的应用；
(b2)权利要求1或2所述基因，或，含有权利要求1或2所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育甘蓝型油菜新品种中的应用；
(b3)权利要求1或2所述基因，或，含有权利要求1或2所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗旱性中的应用；所述的植物为甘蓝型油菜、水稻、烟草、大豆、番茄或小麦。
6.一种控制甘蓝型油菜抗旱性基因重组载体的构建方法，其特征在于，所述基因为权利要求1或2所述的控制甘蓝型油菜抗旱性基因，所述方法包括以下步骤：将包含Bna-MIM169n基因片段的克隆载体质粒经SpeI+AscI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段，将此片段与相应酶切的pMDC83骨架载体相连构建成Bna-miR169n基因的targetmimicry载体。
7.一种抗旱转基因植物的培育方法，其特征在于，对权利要求6所述的构建方法构建的载体进行农杆菌转化，利用农杆菌介导法实现外源片段在甘蓝型油菜中的遗传转化，得到转基因植物。
8.根据权利要求7所述的抗旱转基因植物的培育方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括：
种子灭菌；
将种子接种于M0培养基上，温室避光培养；
将-70℃保种的农杆菌菌株活化，提前一天挑取单菌落接种于含有Kan和Gen抗性的LB液体培养基摇菌，28℃摇床250rpm培养过夜至菌液浓度OD600＝0.3；25℃6000rpm离心5min，弃上清，用DM液重悬两次并再次离心，弃上清；
将幼苗下胚轴切割为长度为1.0-1.5cm的小段，转移到配制好的DM侵染液中暂存，将重悬好的农杆菌菌液加入DM侵染液中侵染10min；然后将外植体转移到M1培养基上，24℃黑暗条件下共培养36h至48h；
将外植体从M1培养基上转入含250mg/L Hyg的M2培养基中，25℃光照培养15～20d后，将存在明显愈伤组织的外植体转移到含250mg/L Hyg的M3培养基中，每隔15～20d继代一次，直至出现绿色幼苗；
将具有明显生长点的幼苗移至M4培养基上，25℃光照培养2～4周直至生根；
炼苗和移栽。
9.一种鉴定甘蓝型油菜抗旱品种的方法，其特征在于，提取甘蓝型油菜基因组DNA，检测权利要求1或2所述控制甘蓝型油菜抗旱性基因的表达量。
10.根据鉴定甘蓝型油菜抗旱品种的方法，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO:12所示。
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