CN102124110A - 抗旱的转录因子的转录调节和转录后调节 - Google Patents

Abstract

本公开提供用于产生抗旱植物的多核苷酸，包括改变这样的多核苷酸的表达的转基因植物及其后代。也提供了用于提供植物抗旱性的分子。

Description

抗旱的转录因子的转录调节和转录后调节

相关申请的交叉引用

本发明要求2008年4月30日提交的美国临时申请号61/048,996的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究的声明

本发明得到来自国家卫生研究所的资金的资助，资金号R01GM059138。政府对本发明享有一些权利。

背景技术

干旱胁迫是全世界限制作物生产力的主要环境因素。为了减少干旱胁迫的不利影响，植物已经进化出了多种策略，包括形态的、生理的和生化的适应(Bohnert等人，2006；Shinozaki等人，2003；Xiong等人，2002；Zhu，2002；Ingram and Bartels，1996)。这些策略中的一些旨在通过增加水吸收或减少水的损失避免脱水胁迫，而其他的策略在当水被耗竭并且组织脱水变得不可避免时寻求保护植物细胞免受伤害(Verslues等人，2006)。基因表达的变化在植物干旱胁迫应答中发挥重要的作用并且许多胁迫诱导的基因是已知的或被认为在抗旱中具有作用。对于许多的这些基因，激素脱落酸(ABA)是控制它们表达的关键信号中间体。这已经主要通过分析ABA缺失和ABA增强的拟南芥突变体得到了证实(Koornneef等人，1998)。

许多环境因素影响植物生长和结果，其中土壤盐度和干旱有害影响最大。非生物应激导致主要作物大约70％的遗传产量潜力丧失，并且绝大多数主要农作物对干旱胁迫敏感。通过植物育种增加应激条件下的产量的努力在很大程度上是不成功的，这主要是由于适应性反应的多基因来源(Barkla等人，1999，Adv Exp Med Biol 464：77-89).

发明内容

本公开证实了NFYA5的过表达增加干旱抗性。本公开提供了NFYA5在干旱抗性中的作用部分涉及其在保卫细胞中的表达和气孔孔径的控制。另外，NFYA5在许多组织中广泛表达。在非保卫细胞中，NFYA5可能对于通过其在激活靶应激反应基因(诸如涉及氧化应激反应中的基因)中的作用的脱水耐受是重要的。AtNFYB1的候选靶基因与应激耐受没有明显的关联，并且它们中的一些似乎与多糖代谢机制相关。NFYA5与AtNFYB1的靶基因缺少实质性重叠表明这两个转录因子可能参与不同的基因调节子。

转录诱导解释了在干旱胁迫下的部分的NFYA5转录物积累。ABA参与了转录调节，因为ABA导致NFYA5转录物积累和其激活NFYA5启动子活性。

干旱胁迫下的NFYA5调节的特征是miRNA的参与。本文提供的数据证实了miR169抑制NFYA5转录物的积累。干旱胁迫下调miR169表达，由此减缓miR169对NFYA5的抑制。miR169由许多基因座表达。这些基因座中只有两个，MIR169a和MIR169c基本上被干旱胁迫下调。本公开显示，尽管miR169a和miR169c与NFYA mRNA都有三个错配，但是miR169a而不是miR169c在抑制NFYA5转录物积累中起主要作用。在干旱胁迫对MIR169a和MIR169c的下调中，需要ABA。因此，ABA参与了NFYA5的转录调节和转录后调节。ABA和干旱胁迫对MIR169a和MIR169c的下调可能涉及在两个基因座的转录抑制。

干旱胁迫经miRNA不仅在转录水平上而且在转录后水平上调节NFYA5。这种双水平的调节与NFYA5对干旱抗性的重要性一致。NFYA5和miR169两者在水稻上高度保守(Jones-Rhoades和Bartel，2004)，因此NFYA5的调节的双模也适用于其它植物。

本公开提供了包括：NFY5A多核苷酸、其同系物或直向同源物的分离的多核苷酸，它们可操作地连接到异源启动子。在一个实施方案中，NFY5A包括与由SEQ ID NO：1、3、5或7构成的多核苷酸具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％的同一性。在另一个实施方案中，NFY5A多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2的多肽。在另一个实施方案中，异源启动子包括组成型启动子或诱导型启动子。在一个方面，组成型启动子是花椰菜花叶病毒35S或19S启动子或植物ACT2启动子或植物泛素启动子。在另一个方面，组成型启动子是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的肌动蛋白2启动子。在另外的方面，诱导型启动子包括光诱导启动子。

本公开也提供用上述的多核苷酸转化的植物细胞。

本公开也提供了转基因植物，该转基因植物以比野生型植物高的水平表达NFY5A多核苷酸并且具有增加的干旱抗性。

本公开还提供了缺乏NFY5A基因、其同系物或直向同源物的3′UTR的转基因植物。

本公开提供了基因组缺乏功能miR169多核苷酸的转基因植物。例如，该转基因植物基因组中可以缺乏功能miR169a或miR169c多核苷酸。

本公开也提供了使用上述的多核苷酸来产生抗旱的植物的方法，包括步骤：将多核苷酸或构建物导入植物细胞或植物组织，筛选多核苷酸分子的存在以产生转基因植物细胞或转基因植物组织和从转基因植物细胞或转基因植物组织再生植物，由此产生抗旱植物。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括可操作连接到异源启动子的编码NFY5A多肽的序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包括在植物细胞中减少mir169a或mir169c的表达或提供mir169a或mir169c的补体或敲除mir169a或mir169c的构建物。

本公开也提供了鉴定用于改变植物抗旱的制剂的方法，包括：接触含有NFY5A基因的植物与制剂；测量细胞中该基因表达的变化或存在的mRNA的量的变化；其中与对照相比表达或转录物水平的变化指示了改变抗旱的制剂。

本公开也提供了鉴定用于改变植物抗旱的制剂的方法，包括：接触植物与制剂，所述植物包含可操作连接到报告基因的TN(C/A)TTNGN(C/A)CANT(SEQ ID NO：60)序列；测量报告基因表达的变化；其中与对照相比报告基因表达的变化指示了改变抗旱的制剂。

本公开提供了增加植物耐旱的方法，包括接触植物与增加(1)NFY5A基因、其同系物或直向同源物和/或(2)表1所列基因的表达的制剂。

本公开的一个或多个实施方案的细节与附图和以下描述被描述。从该说明书、附图以及权利要求中可清楚地知晓其它特征、目标和优点。

附图说明

图1A-B显示了脱水和ABA对NFYA5表达的调节。(a)通过实时RT-PCR分析拟南芥幼苗响应脱水和ABA的NFYA5基因转录物的积累。表达水平对Tub8的表达水平进行归一化。误差线是三次重复的SD。(b)检测ABA缺乏突变株或信号突变株中的NFYA5 mRNA。野生型(WT)和突变株用足量的水培养3周，接着控水10天。接着负载来自各样品的20μg总RNA并与³²P-标记的全长NFYA5 cDNA探针杂交。Tub8用作负载对照，并且每个泳道下的数字指示相对于Tub8的表达水平。

图2A-D显示NFYA5表达图谱和转录调节。(a)将MS琼脂培养基上的两周转基因苗子接受3h的脱水处理或8小时的ABA处理，接着染色进行GUS活性分析。(b)在不同组织中的NFYA5p::GUS表达图谱。在叶片维管组织(I)和保卫细胞(II)中染色是显著的。在花序的花组织(III)和根维管组织(IV)中染色也是可见的。(c)NFYA5转录物积累的组织图。总RNA分离自4周大小的生长在长日照生长条件下野生型植物的多个组织中。将实时RT-PCR定量结果对18SrRNA的表达进行归一化。结果代表三次重复的SD。(d)NFYA5的亚细胞定位。NFYA5-YFP融合构建物在CaMV 35S启动子的控制下在转基因拟南芥中表达，在共聚焦显微镜下观察植物的根。在暗视野中对黄荧光照相(I)，在亮视野中对细胞的形态照相(II)和二者的结合(III)。

图3A-D显示干旱胁迫下调与NFYA5 mRNA互补的21nt小RNA。(a)NFYA5和At1g54150的顺反义基因对的图。框中为外显子，框之间的线表示内含子。箭头指示小RNA的靶位置。(b)干旱胁迫和ABA处理对小RNA的调节。U6RNA用于探针检测负载对照。每个泳道下的数字指示相对表达率。(c)在各个RNA沉默突变体中小RNA的积累。每个泳道上载40微克来自各样品的小RNA并用对应于ASRP1815序列的³²P-标记的寡核苷酸探针杂交。miR172、siR255和U6作为负载对照显示。(d)在dcl1-7、hen1和hyl1以及它们相应的野生型中的NFYA5 mRNA水平。将表达水平对Tub8的表达水平归一化。结果代表三次重复的SD。

图4A-E显示NFYA5主要被miR169a调节。(a)通过实时RT-PCR检测响应干旱胁迫的MIR169家族的前体转录物。将定量数据对Tub8表达归一化。结果代表三次重复的SD。(b)NFYA5表达构建物图。以小写字母显示在NFYA5靶位置导入的突变(SEQ ID NOs：80和81)。3’UTR中黑框显示miRNA的靶位。(c)在烟草本塞姆氏(N.Benthamiana)中miR169和NFYA5表达构建物的各组合的共表达。作为对照，NFYA5也与不相关的YFP构建物共表达。实时RT-PCR定量数据对烟草18S rRNA的表达归一化。结果代表三次重复的SD。(d)在转基因拟南芥中miR169a和miR169c的过表达。Northern印迹分析野生型和两个代表转基因系中的miR169a和miR169c水平。miR171作为负载对照显示。每个泳道下方的数字指示相对表达率。(e)实时RT-PCR检测35S:MIR169转基因植物中相应的NFYA5基因转录物。将定量数据对Tub 8的表达归一化。结果代表三次重复的SD。

图5A-D显示35S::MIR169a植物对干旱胁迫更加敏感。(a)35S::MIR169a过表达拟南芥对干旱胁迫更加敏感。野生型(Col)和5S::MIR169a植物在含有充足水分的土壤中生长3周，接着控水8天。显示了代表性的图片。对照，没有控水。(b)测量在野生型和35S::MIR169a植物中气孔孔径。数据是三个独立实验的宽∶长之比±SE(n＝40-50)。(c)来自野生型和35S::MIR169a植物的分离的叶子的水损失。水损失表达为初始鲜重的百分比。值是四次独立实验各10个叶子的平均值。(d)经或没经干旱处理8天的拟南芥叶片中花青苷含量。结果代表四次重复的SD值。

图6A-E显示nfya5突变株植株对干旱胁迫更加敏感。(a)是NFYA5基因座中T-DNA插入位点和通过Northern印迹分析检测NFYA5 mRNA的示意图。外显子为框，框之间的线代表内含子。负载20微克来自各样品的总RNA并用³²P-标记的全长NFYA5探针杂交。相应的溴化乙锭染色的rRNA显示为负载对照。(b)nfya5突变植株对干旱胁迫更加敏感。野生型(Col)和nfya5植株生长在含有充足水分的土壤中3周，接着控水8周。显示了代表性的图片。(c)测定在野生型和nfya5突变植株中的气孔孔径。数据是三次独立实验的宽比长的平均比±SE(n＝40-50)。(d)野生型和nfya5突变株植株的分离的叶子的水损失。水损失表示为初始鲜重的百分比。值是四次独立实验各10片叶子的平均值。(e)经或没经干旱处理8天的拟南芥叶片中花青苷含量。结果代表四次重复的SD值。

图7A-E显示在35S::NFYA5植株中增加的抗旱性。(a)检测35S::NFYA5转基因拟南芥中的NFYA5 mRNA。将实时RT-PCR定量值对Tub8的表达归一化。结果代表三次重复的SD。(b)35S::NFYA5植株的抗寒性(品系2、3和5)。野生型和35S::NFYA5拟南芥植株在含有充足水分的土壤中生长3周，接着控水14天。显示了代表性的图片。(c)测定在野生型和35S::NFYA5-3转基因植株中的气孔孔径。数据是三次独立实验的宽比长的平均比±SE(n＝40-50)。(d)野生型和35S::NFYA5-3植株的分离的叶子的水损失。水损失表示为初始鲜重的百分比。值是四次独立实验各10片叶子的平均值。(e)经或没经干旱处理14天的拟南芥叶片中花青苷含量。结果代表四次重复的SD值。

图8显示拟南芥NFYA家族成员的保守区域的序列比对(从上而下分别为SEQ ID NO：63-71)。

图9显示对35S:MIR169b和35S:MIR169h转基因株系中miR169和NFYA5mRNA水平的分析。将NFYA5转录物水平的实时RT-PCR定量值对Tub 8的表达归一化。结果代表三次重复的SD。

图10显示对野生型和35S::NFYA5转基因植株中转录物水平的分析。实时RT-PCR用于分析指定的基因座的表达水平。误差棒指示SD(n＝3)。

图11A-B显示对来自拟南芥、小麦和两个水稻品系(Os_J(SEQ ID NO：72)、Os_I(SEQ ID NO：74)、小麦(SEQ ID NO：76)、拟南芥(SEQ ID NO：78))的NFYA5的DNA比对。

图12显示本公开的序列(SEQ ID NO：1、2、61和62)。

具体实施方式

如此处和所付权利要求所用，单数形式“一”、“和”和“所述”包括复数形式，除非上下文明确表示其它。因此，例如，“多核苷酸”包括多个所述多核苷酸，“肽”包括一个或多个肽等。

另外，“或”的使用表示“和/或”除非另外说明。类似的，“包括”、“包含”可以互换使用，并且不旨在限制。

可以进一步理解，当各实施方案使用术语“包括”时，本领域技术人员会理解在一些具体的情况下，实施方案可以替代性地使用语言“基本上由…组成”或“由…组成”描述。

除非另外说明，此处所用的所有科技术语具有本公开所属技术领域的技术人员通常所理解的含义。尽管与本文所述相似的方法和材料可以用于实施所公开的方法和组合物，但是本文仍然描述了示例性的方法、装置和材料。

上文和全文所述的任何出版物仅由于它们的公开内容先于本申请的申请日被提供。在本文中没有任何内容被理解为承认发明人没有权利利用现有技术公开而先于这些公开。

干旱胁迫下的基因调节通过多个转录级联被介导(Zhu，2002；Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，2006)。在这些级联中的每一个中，转录因子基因被诱导，其依次来激活或抑制对抗旱重要的下游靶基因。一些应激调节的基因编码在调节对另外的其它下游基因重要的调节蛋白，诸如转录因子(Singh等人，2002)。在拟南芥中，干旱胁迫诱导AP2/ERF、bZIP、NAC、HD-ZIP和MYB/MYC家族中的成员以及几类锌指结构域蛋白(Shinozaki等人，2003；Zhang等人，2004)。在多种情况下，已经证实改变转录因子的表达能够通过激活下游靶基因改变应激抗性。这方面的例子有CBFs/DREBs、NACs和RING-H2锌指蛋白(Jaglo-Ottosen等人，1998；Kasuga等人，1999；Hu等人，2006；Ko等人，2006)。

研究已聚焦在鉴定导致应激抗性的遗传因素和基因构建应激抗性增加的作物。已经通过不同的机制鉴定了一些表达或改变表达与干旱胁迫相关的基因。例如表达玉米NADP-苹果酸酶的转化烟草显示比野生型植株保水性增加和获得更大的干物质/水消耗(Laporte等人，2002，J Exp Bot 53：699-705)。大量的研究努力集中在植物激素脱落酸(ABA)，其涉及适应不同的环境应激。过表达酶9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)(其对ABA生物合成是关键的)的转基因烟草和转基因拟南芥显示抗旱性增加(Qin等人，2002，Plant Physiol 128：544-51；Iuchi等人，2001，Plant J 27：325-33)。干耐旱性常与耐盐性相连，因为这两者都与渗透势和膨压的调节有关。因此，过表达液泡H+泵(H⁺-焦磷酸酶)-其产生跨液泡膜的质子梯度的转基因植株显示增加的干旱应激和盐应激，这是由于增加的溶质积累和水分保持(Gaxiola等人，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98：11444-9)。海藻糖也助于渗透保护免受环境应激。错表达海藻糖-6-磷酸合成酶(海藻糖生物合成的关键酶)的马铃薯植株显示增加的抗旱性(Yeo等人，2000，Mol Cells 10：263-8)。

转录水平的基因表达的调节在植物的发展和生理状态中发挥重要的作用。随着小RNA的发现，对通过小RNA的转录后基因的调节的重要性的关注已经增加(Carrington和Ambros，2003；Bartel，2004；Tang，2005)。这些小RNA包括20-24个核苷酸(nt)微RNA、21nt反式激活siRNA、～24nt重复连接的siRNA和21或24nt nat-siRNA。miRNA从发夹前体通过核糖核酸酶III样的酶切酶加工而来。siRNA不同于miRNAs，因为它们产生自长的双链RNA。植物miRNA参与各种发育过程，包括开花、叶片和根发育，胚胎发育和生长素信号转导(Allen等人，2005；Carrington和Ambros，2003；Bartel，2004；Jones-Rhoades等人，2006)。最近，研究发现在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)，miR169调节共生根瘤发育(Combier等人，2006)。微RNA在植物对生物应激和非生物应激(诸如硫酸盐和磷酸盐营养缺乏)以及氧化应激的反应中也发挥重要的作用(Jones-Rhoades和Bartel，2004；Fujii等人，2005；Sunkar等人，2006；Sunkar and Zhu，2007)。nat-siRNA被证实调节拟南芥的耐盐性和抗病性(Borsani等人，2005；Katiyar-Agarwal等人，2006)。然而，尽管小RNA的抗旱重要性，但是迄今为止，没有关于小RNA调节干旱胁迫响应的报道。

拟南芥已经充当模型系统用于鉴定助于耐旱的基因。例如，研究者已经鉴定了响应于水缺乏而被诱导的许多基因(例如，Taji等人，1999，Plant Cell Physiol 40：119-23；Ascenzi等人，1997，Plant Mol Biol 34：629-41；Gosti等人，1995，Mol Gen Genet 246：10-18；Koizumi等人，1993 Gene 129：175-82)和控制ABA或应激反应基因表达的称为ABA反应元件(ABREs)顺反DNA序列(Giraudat等人，1994，Plant Mol.Biol 26：1557)。

已经鉴定了几个拟南芥耐旱突变株。这些突变株包括隐形突变株abh1(Hugouvieux等人，2001，Cell 106：477)、era1-2(Pei等人，1998，Science 282：286)和abi1-1Ri(Gosti等人，1999，Plant Cell 11：1897-1909)。这些突变株era1-2和abh1通过筛选对ABA超敏的苗子鉴定，而突变株abi1-1Ri作为ABA不敏感的突变株abi1-1的基因内抑制物分离。显性耐旱突变株通过过表达ABF3、ABF4(Kang等人，2002，Plant Cell 14：343-357)或DREB1A(Kasuga，1999 Nature Biotech 17：287)鉴定。ABF3和ABF4编码碱性区亮氨酸拉链(bZIP)DNA结合蛋白，其特异性结合ABRE。DREB1A编码具有结合对失水响应表达重要的失水响应元件(DRE)的EREBP/AP2 DNA结合结构域的蛋白(Liu等人，1998，Plant Cell 10：1391)。通过过表达大豆BiP基因获得烟草显性耐旱表型(Alvim等人，2001，Plant Physiol 126，1042)。

本公开证实NFYA5是这些干旱胁迫转录级联的部分。该转录级联对抗旱是重要的，因为35S::MIR169a和nfya5突变植株对干旱胁迫是超敏的。本公开证实了NFYA5被至少两个miRNA分子(mir169a和c)转录后下调。此外，本公开证实了NFY5A多肽的过表达促进耐旱。表达或过表达可以通过用以下途径获得：(a)野生型NFY5A的转录调节(例如，通过使用nfy5a多核苷酸连接到组成型或诱导型启动子)，(b)表达缺乏与mir169a或mir169c相互作用的结构域的突变nfy5a；或(c)通过抑制或敲除mir169a和mir169c之一或两者的表达。因此，本公开提供了产生具有增加的耐旱的转基因植物的方法和组合物以及改变植物耐旱的方法。

和因子Y(NF-Y)是通用的转录因子，其对存在于～25％的真核基因启动子中的CCAAT盒具有高的亲和力和序列特异性。NF-Y是一个异源三聚体复合物，其由NF-YA(也称为CBF-B或HAP2)、NF-YB(CBF-A或HAP3)和NF-YC(CBF-C或HAP5)组成。在哺乳动物中，NF-YB和NF-YC通过组蛋白折叠基序紧密地二聚，接着在DNA结合前NF-YA相连，并且伴随NF-YA介导的三聚体序列特应性的相互作用(Mantovani，1999)。NF-YA和NF-YC亚单位含有对激活转录重要的富含谷氨酰胺和疏水残基的大结构域(Mantovani，1999)。在动物和酵母中，NF-Y的各亚单位由单个基因编码，然而，拟南芥基因组编码10个NF-YA、13个NF-YB和13个NF-YC(Gusmaroli等人，2002)。已经证实AtNFYB9(LEC1)在胚的发育中具有关键的作用(Lee等人，2003)。最近，在拟南芥和玉米中AtNFYB1的过表达被证实显著地增加了干旱胁迫条件下的抗旱和产量(Nelson等人，2007)。然而，植物中大多数NF-Y家族成员的生物学作用是未知的。

本公开提供的数据证实干旱胁迫和ABA处理强烈地诱导了拟南芥NF-YA家族中的成员AtNFYA5的表达。启动子::GUS分析表明该诱导的部分发生在转录水平；然而，只有转录调节不能解释干旱胁迫或ABA处理后发现的高水平的NFYA5转录物。

本公开进一步证实NFYA5含有miR169的靶位点，和干旱下调miR169表达。当分析miR169前体的表达时，两个前体miR169a和miR169c被干旱胁迫下调。miR169和NFYA5mRNA的共表达表明miR169a比miR169c更加有效地下调NFYA5mRNA。由此，结果表明干旱胁迫对miR169a的下调促成了干旱和ABA高水平诱导NFYA5。NFYA5在液泡组织和保卫细胞中高表达，而且对nfya5敲除的植物和miR169a或NFYA5过表达品系的分析显示NFYA5在控制气孔孔径和抗旱性上是重要的。综上，结果表明NFYA5对抗旱是重要的，其受到干旱胁迫的转录水平和转录后水平的调节。因此，本公开提供分离的多核苷酸，其包括：可操作连接至异源启动子的NFY5A多核苷酸、其同系物或直向同源物。在一个实施方案中，NFY5A包含与SEQ ID NO：1、3、5或7构成的多核苷酸至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％的同一性。在另一个实施方案中，NFY5A多核苷酸编码包括SEQ ID NO：2的多肽。在另一个实施方案中，异源启动子包括组成型启动子或诱导型启动子。在一个方面，组成型启动子是花椰菜花叶病毒35S或19S启动子或植物ACT2启动子或植物泛素启动子。在另一个方面，组成型启动子是来自拟南芥的肌动蛋白2启动子。在另一个方面，诱导型启动子包括光诱导型启动子。

本公开也提供了转化有上述多核苷酸的植物细胞。

本公开也提供以比野生型植株高的水平表达NFY5A多核苷酸的转基因植物，并且转基因植物具有增加的抗旱性。

本公开进一步提供缺失NFY5A基因、其同系物或直向同源物的3′UTR的转基因植物。

本公开提供基因组缺失功能性miR169多核苷酸的转基因植物。例如，转基因植物能够缺失基因组中的功能性miR169a或miR169c多核苷酸。

本公开也提供使用上述多核苷酸产生抗旱植物的方法，其包括步骤：将多核苷酸或构建物导入植物组织，筛选多核苷酸分子的存在以产生转基因植物细胞或转基因植物组织和从转基因植物细胞或转基因植物组织再生植物，由此产生抗旱植物。在一个实施方案中，多核苷酸包括可操作地连接至异源启动子的编码NFY5A多肽的序列。在另一个实施方案中，多核苷酸包括减少mir169a或mir169c的表达的构建物或提供mir169a或mir169c的补体的构建物敲除植物细胞中mir169a或mir169c的构建物。

本公开也提供鉴定用于改变植物抗旱性的制剂的方法，其包括：将含有NFY5A基因的植物与试剂接触，测量存在植物细胞中该基因的表达或mRNA转录物的量改变；其中与对照相比表达或转录物水平的改变指示改变抗旱性的制剂。

一般地，本公开的方法涉及将期望形式的NFYA5多核苷酸整合到植物表达载体用于转化植物细胞，并且NFYA5多肽在宿主植物中组成性或诱导性地表达或过表达。在另一个实施方案中，本公开提供由不结合siRNA或miRNA分子(例如miR169分子)多核苷酸编码的NFYA5多肽。因为野生型NFYA5被mrR169抑制，所以与野生型相比，抗抑制的NFYA5多核苷酸也提供调节耐旱性的方法(即，增加耐旱性)。另外，缺乏编码或提供miRNA(例如miR169)的序列的敲除转基因植物也提供耐旱植物。

NFYA5核酸和多核苷酸也被用于产生具有改变的(如增加的)耐旱表型的基因改造的植物。这样的植物还显示对其他非生物应激尤其是盐胁迫和冷冻的增加的耐性，因为对这些应激和干旱胁迫的响应由ABA介导(Thomashow，1999 Annu.Revl Plant Physiol.Plant Mol.Biol 50：571；Cushman and Bohnert，2000，Curr.Opin.Plant Biol.3：117；Kang等人，2002，Plant Cell 14：343-357；Quesada等人，2000，Genetics 154：421；Kasuga等人，1999，Nature Biotech.17：287-291)。

本文所述的方法一般适用于所有的植物。耐旱性是几乎任何农作物的重要性状；大多数大田农作物，包括谷物、大豆、棉花、苜蓿、甜菜、洋葱、番茄和菜豆对干旱胁迫敏感。尽管以下提供的具体实例是在选择物种中进行的，但是NFYA5基因(或直向同源物、其变体或片段)可以在任何类型植物中表达。本公开能够用于赋予以下植物耐旱性：结果和营养生长植物(fruit-and vegetable-bearing plants)，用于切花叶的植物、产谷粒的植物、产油植物、产坚果植物、作物包括玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium)、番茄(Lycopersicum esculentum)、苜蓿(Medicago sativa)、亚麻(Linum usitatissimum)、烟草(Nicotiana)和草坪植物(禾本科)和其它草类作物等。

本领域技术人员会看出本领域存在大量的转化技术，并且新的技术一直是可以获知的。适于靶宿主植物的任何技术能够用于本公开的范围内。例如，构建物可以大量的形式导入，包括但不限于DNA链、质粒或人工染色体。构建物导入靶植物细胞可以通过多种技术实现，包括但不限于农杆菌介导的转化、电穿孔、微注射、微粒轰击、磷酸钙DNA共沉淀或脂质体介导的异源核酸转化。优选地植物转化时永久性的，即通过将导入的表达构建物整合到宿主植物基因组中，由此导入的构建物传递给连续的植物世代。根据目的用途，包含NFYA5多核苷酸的异源多核苷酸构建物可以其整个蛋白或其生物活性部分。

在一个实施方案中，基于Ti的双元载体系统可以用于转移多核苷酸。标准的农杆菌双元载体为本领域技术人员所知的，并且许多是商业可得的例如，pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，Calif.)。

如此处所用，术语“载体”指设计用于在不同宿主细胞转移的核酸构建物。“表达载体”指能够将异源DNA片段整合到外源细胞并在其中表达的载体。许多原核和真核表达载体是商业可得的。筛选合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。

“异源”核酸构建物或序列具有不是在其中表达的植物细胞自身的序列的部分。异源的，针对对照序列而言指本性没有功能来调节目前正在调节的基因表达的调控序列(即启动子或增强子)。一般地，异源核酸序列对它们存在的细胞或基因组的部分而言不是内源性的，并且已经通过注射、转染、微注射、电穿孔等加到细胞中。“异源的”核酸构建物可以含有调控序列/DNA编码序列组合，其与在天然植物中发现的调控序列/DNA编码序列组合相同或不同。

本文所用术语“基因”指参与产生多肽链的DNA片段，其可以包含或不包含编码区前和编码区后的区域，例如在5′未翻译(5′UTR)或″前导区″序列和/或3′UTR或″尾部非编码区″序列，以及在单个编码区段(外显子)和非转录调节序列之间的插入序列(内含子)。

如此处所用，″重组子″包括已经通过导入异源核酸序列被改造的细胞或载体或来自这样改造的细胞的细胞或载体。由此，例如，重组的细胞表达不存在于天然(非重组)形式的细胞中的基因或表达在其他情况下由于人类有意的干预而异常表达、欠表达或根本不表达的天然基因。

如此处所用，术语″基因表达″指这样的过程：通过该过程基于基因的核酸序列产生多肽。该过程包括转录和翻译两者；因此，“表达”可以指多核苷酸或多肽序列，或指两者。有时，多核苷酸序列的表达不引起蛋白质的翻译。“过表达”指相对于野生型或其他植物的多核苷酸和/或多肽序列的增加的表达，并且可以涉及天然存在的或非天然存在的序列。″异位表达″通常时间、地点和/或增加的水平上的表达，在非改变的或野生型的植物中不天然发生。″欠表达″指多核苷酸和/或多肽序列通常是内源基因相对于它在野生型植物中的表达减少。术语“错误表达”和“改变的表达”包括过表达、欠表达和异位表达。

术语“导入”在将多核苷酸插到细胞的情况下，指“转染”或“转化”或“转导”，并包括将多核苷酸整合到真核细胞或原核细胞，其中多核苷酸可以整合到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子或暂时表达(例如，转染的mRNA)。

如此处所用，“植物细胞”指来自植物的任何细胞，包括来自未分化组织(例如，愈伤)以及植物种子、花粉、繁殖体(progagules)和胚的细胞。

本公开包括改良的植物和植物组成，包括整株植物、营养器官/结构(例如叶、干和和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及其后代。能够用于本公开方法中的植物类别通常为广泛的适于转化技术的高等和低等植物类，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、楔叶类、裸蕨植物、石松类脂物、苔藓类植物和多细胞藻类。″植物组织″包括分化的和未分化的植物组织，包括但不限于根、茎、枝、叶、种子、肿瘤组织和各种形式的细胞和培养物如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可以在植株中或在器官、组织或细胞培养物中。

本公开不限于任何植物种类。可以考虑的植物种类包括但不限于苜蓿、紫苑、大麦、秋海棠、甜菜、低芥酸菜籽、香瓜、胡萝卜、菊花、]三叶草、玉米、棉花、黄瓜、飞燕草、葡萄、草坪和草坪草、莴苣、豌豆、薄荷、水稻、芜菁甘蓝、高粱、糖用甜菜、向日葵、烟草、粘果酸浆、番茄、芜菁、小麦和百日菊。

如此处所用，相对于给定植物性状或表型的术语″天然的″和″野生型的″指其中在自然界的同种植物中存在的该性状或表型的形式。

如此处所用，关于植物性状的术语“改良的(改变的)”指转基因植物相对于类似的非转基因植物在表型上的改变。关于转基因植物的″目的表型(性状)″指T1和/或后代植株显现的可观察到的或可测量的表型，该表型在对应的非转基因植物(即，在相似的条件下培育的或分析的相似基因型的植物)中不显示(即，在相似的条件下培育的或分析的相似基因型的植物)。目的表型可以表现植物的改进或可以提供产生其他植物改善的手段。″提高(改善)″是通过提供具有独特和/或新的品质可以增强植物种或品种实用的特征。

“改变的耐旱表型”指与类似的但未改良的植物相比，基因改良的植物耐受低水条件的能力的可检测改变。一般地，改良的(增加的)耐旱表型(即，植物在通常对植物有害的低水条件下存活的能力)是目的表型。

如此处所用，″突变的″多核苷酸或基因在序列或表达上不同于对应的野生型多核苷酸或基因，其中这种不同导致了改良的植物表型或形状。相对于植物或植物品系，术语“突变体”指具有改良的植物表型或性状的植物或植物品系，其中改良的表型或性状与改良的野生型多核苷酸或基因的改良的表达相关。

如此处所用，术语″T1″指从种子到T0植物的代。T1代是第一组转化的植物，其能够通过使用选择制剂例如抗生素或除草剂来选择，所述转基因植物含有相应的对这些抗生素或除草剂的抗性基因。术语″T2″指通过先前筛选为转基因的T1植物的花的自体受精产生的代。

如此处所用，术语“植物部分”包括任何的植物器官或组织，包括但不限于种子、胚、分生组织区、愈伤组织、叶片、根、茎、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物细胞可以从任何植物器官或组织和从他们制备的培养物获得。能够用于本发明的方法中的植物类一般和适于转化技术的高等植物类一样广泛，包括单子叶和双子叶植物。

如此处所用，″转基因植物″包括在基因组内包括异源的多核苷酸的植物。所述异源的多核苷酸或能够稳定地整合到基因组中，或为染色体外的。优选地，本公开的多核苷酸被稳定地整合到基因组中，使得多核苷酸被传递到后续多代。其中导入异源多核苷酸的植物细胞、组织、器官或植株被认为是“转化的”、“转染的”或“转基因的”。也含有所述异源多核苷酸的转化植物或植物细胞的直接和间接后代也被认为是转基因的。

“蛋白”或″多肽″，这两个术语在本文中可以互换使用，包括一条或多条称为氨基酸的构件的链，氨基酸通过称为肽键的化学键连在一起。“天然的”或″野生型″的蛋白、酶、多核苷酸、基因或细胞，指自然界中存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。

“氨基酸序列”是氨基酸氨基酸的聚合物(蛋白、多肽等)或代表氨基酸聚合物的字符串，这取决于上下文。在本说明书中提到的各种氨基酸序列中存在的氨基酸具有它们在本领域常规使用的通常的三字母缩写或一个字母缩写：A、Ala，丙氨酸；C、Cys，半胱氨酸；D、Asp，天门冬氨酸；E、Glu，谷氨酸；F、Phe，苯丙氨酸；G、Gly，甘氨酸；H、His，组氨酸；I、Ile，异亮氨酸；K、Lys，赖氨酸；L、Leu，亮氨酸；M、Met，甲硫氨酸；N、Asn，天门冬酰胺；P、Pro，脯氨酸；Q、Gln，谷氨酰胺；R、Arg，精氨酸；S、Ser，丝氨酸；T、Thr，苏氨酸、V、Val，缬氨酸；W、Try，色氨酸，Y、Tyr，酪氨酸。

具体序列的″保守的氨基酸序列取代″或简单地说，″保守的变异″指用基本相同的氨基酸序列代替一个氨基酸或氨基酸串。本领域技术人员会知道改变、插入或缺失编码序列中单个氨基酸或氨基酸百分比的单次取代、缺失或插入导致“保守的变异”，其中所述改变造成氨基酸的缺失、氨基酸的插入或氨基酸被化学相似的氨基酸取代。

提供功能相似的氨基酸的保守取代表为本领域公知。例如，保守的取代基包括丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。另一个保守的取代基包括天门冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。另一个保守的取代基包括天门冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。然而，另一个保守的取代基包括精氨酸(R)和赖氨酸(K)。另一个保守的取代基包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)。另一个保守的取代基包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

由此，本公开所列的多肽的″保守的氨基酸取代″包括所述多肽的通常小于10％百分比的氨基酸被相同保守取代基的保守选择的氨基酸取代。因此，本公开的多肽的保守取代的变异能够含有具有相同保守取代基保守取代的变异的100、75、50、25或10次取代。

″保守的变异体″是其中给定的氨基酸残基已经改变但没有改变其整体构象和功能的蛋白质或酶，包括但不限于被具有相似性质的氨基酸的取代，所述性质包括极性或非极性特性、尺寸、形状和电荷。那些指明为保守的那些之外的氨基酸在蛋白质或酶中会不同，使得在具有相似功能的任何两个蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可以不同，并且可以为例如，至少30％、至少50％、至少70％、至少80％或至少90％，这根据比对方案确定。如本文所述，″序列相似性″指核苷酸或蛋白质序列相关的程度。两个序列之间的相似程度能够建立在序列同一百分率和/或保守百分率基础上。″序列同一性″在本文中指两个核苷酸或氨基酸序列不变的程度。″序列比对″指排列两个或更多个序列以得到最大同一水平的过程(并且，在氨基酸序列的情况下，指保守性)，以用于评价相似性的程度的目的。用于比对序列和评价相似性/同一性的许多方法是本领域已知的，诸如，例如Cluster Method，其中相似性是建立在MEGALIGN算法基础上，以及BLASTN、BLASTP和FASTA(Lipman和Pearson，1985；Pearson和Lipman，1988)。当使用所有这些程序时，优选的设置时那些导致最高序列相似性的那些。

如此处所用，关于指定的主题序列或其指定部分的″同一性百分率″被定义为在在比对序列和导入空位后，候选衍生物中的核苷酸或氨基酸与主题序列(或其规定部分)中的核苷酸或氨基酸相似的百分率，如果需要，获得最大的序列同一性百分率，这通过用设为缺省值的检索参数的程序WU-BLAST-2.0a19(Altschul  等人，J.Mol.Biol.(1990)215：403-410；网址blast.wust1.edu/blast/README.html)产生。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且通过程序本身依赖于具体序列的组成和具体数据库的组成建立，目的序列通过该具体数据库检索。″％同一性值″通过匹配的相同核苷酸或氨基酸的数除以所要报道序列同一性百分率的序列的长度。″氨基酸相似性百分率″通过进行与确定氨基酸序列同一性相同的计算确定，但是在计算中除了相同的氨基酸外还包括保守的氨基酸取代。

特定的多肽的非保守修饰是取代任何氨基酸的修饰，非表征为保守的取代。这些修饰包括用碱性或酸性氨基酸取代中性氨基酸(例如，Asp、Glu、Asn或Gln代替Val、Ile、Leu或Met)，芳族氨基酸代替碱性或酸性氨基酸(例如，Phe、Tyr或Trp代替Asp、Asn、Glu或Gln)或不用类似的氨基酸置换氨基酸的任何其它的取代。碱性侧链包括赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；酸性侧链包括天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；不带电荷的极性侧链包括甘氨酸(G)、天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)；非极性侧链包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)；β分支侧链包括苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)；芳族侧链包括酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)。

应理解，不改变多核苷酸编码的多肽的活性的序列插入，诸如非功能或非编码序列的插入是碱性多核苷酸的保守改变。

本领域技术人员会意识到公开的核酸构建物的许多保守变化产生功能相同的构建物。例如，如上述，遗传密码的简并，“沉默取代”(即，不产生编码多肽中的改变的核酸序列中的取代)是编码氨基酸的每个核酸序列的隐含特征。类似的，在被具有高度相似性质的不同氨基酸取代的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸中的″保守的氨基酸取代″也容易鉴定为与公开的构建物高度相似。各公开序列的这样的保守变异是本文提供的多肽的特征。

当与通常相连的组分(其它蛋白质、核酸、合成试剂等)完全或部分分开时，多核苷酸、多肽或其它的组分是“分离的”或“纯化的”。当多核苷酸或多肽是人工的或工程设计的或来自人工或工程构造的蛋白质或核酸时，它们是″重组的″。例如，插入载体或任何其它异源位置例如重组有机体的基因组中的多核苷酸，使得其与在自然界发现的通常位于所述多核苷酸侧翼的核苷酸序列不连接，这样的多核苷酸是重组的多核苷酸。从重组的多核苷酸体外或体内表达的蛋白质是重组的多肽的实例。同样，不在自然界出现的多核苷酸，例如天然出现的基因的变体是重组的。

任何载体，包括质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌双元载体，双链或单链的线形或环形的形式，可以是或可以不是自我传递或迁移的，并且能够通过整合到细胞基因组或染色体外存在的方式转化原核或真核宿主(例如，具有复制原点的自我复制质粒)能够用于本公开的方法和组合物中。

具体地说，包括穿梭载体，其指自然地或通过设计能够在两种不同的宿主生物体复制的DNA运载体，宿主生物体选自放线菌和相关种，细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。

载体中的多核苷酸是在合适的启动子或其他在宿主细胞转录的调控元件的控制下并可操作地连接到所述启动子或调控元件，宿主细胞如微生物、例如细菌或植物细胞。载体可以是在多宿主中具有功能的双功能表达载体。在基因组DNA的情形下，这可以含有其自身启动子或其它调控元件，在cDNA的情况下，这可以在合适的启动子或其他宿主细胞中的表达调控元件的控制下。

如此处所用，″组成型启动子″指有助于可操作地连接的编码多核苷酸或目的多核苷酸以基本连续的或基础水平表达的启动子。诱导型启动子是能够瞬时被诱导或通过接触使得在特定的时间表达水平改变的启动子。适于用于NFY5A多核苷酸或本公开的片段的启动子的实例包括来自脂肪酸去饱和酶基因的调控序列、来自玉米的醇脱氢酶启动子、光诱导型启动子诸如核酮糖二磷酸脱羧酶小亚基基因、主要叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、花椰菜花叶病毒的花椰菜花叶病毒19S启动子(CaMV，-46bp花椰菜花叶病毒(CaMV)35S最小启动子，其在多数植物组织中以低(基础)水平表达。组织特异性启动子，诸如根特异性启动子或根皮层特异的启动子，也考虑在内。种子特异性的启动子的非限定性实例包括油菜籽蛋白、菜豆蛋白、油质蛋白和十字花科蛋白启动子。其它合适的植物启动子包括本领域技术人员知晓的那些。

本公开包括术语″调节序列″、″调控元件″和″表达调控序列″指包括影响转录起始和转录速率的多核苷酸结构域。调节序列包括但不限于启动子、启动子调控元件、蛋白质结合结构域、5′和3′非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、内含子和位于编码区内的其它调节序列。

术语“可操作地连接”和“可操作地相连”在本文中可以互换使用，广泛地指在分子中两个其它方面不同的结构域的化学或物理连接(直接或间接)，其中各结构域具有独立的生物学功能。例如，可操作地连接指在调节序列和被该调节序列调节的多核苷酸之间的功能连接。例如本公开的可操作地连接的5NFYA5多核苷酸或片段能包括可操作地连接到启动子的5NFYA5多核苷酸或片段，其依次可操作地连接到编码多肽的多核苷酸或要表达的抑制性核酸分子。

启动子是由通常转录起始位点上游100个核苷酸内的DNA分子区域(通常在RNA聚合酶II的起始点附近)组成的。启动子参与识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白质以起始和调节转录。为了使编码序列在启动子的控制下，通常需要将多肽的翻译阅读框的翻译起始位点置于启动子下游的1到约50个核苷酸之间。

最小启动子仅包括必需量用于转录起始的转录复合物的组装的序列。最小启动子通常包括位于转录起始位点上游约15至约35个核苷酸之间的″TATA盒″元件。最小启动子也可以包括″CCAAT盒″元件，其可以位于转录起始点上游约40至约200个核苷酸之间，通常约60到约120个核苷酸之间。

拟南芥NFYA5核酸(cDNA)序列以SEQ ID NO：1、3、5或7提供。相应的蛋白质序列分别以SEQ ID NO：2、4、6和8提供。

如此处所用，术语″NFYA5多肽″指全长的NFYA5蛋白，或其“功能活性”片段、衍生物(变体)或直向同源物(表示所述蛋白质片段、衍生物或直向同源物显示与SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽相关的功能活性)。在一个实施方案中，功能活性的NFYA5多肽当在植物中过表达或错表达时，导致改变的耐旱表型。在进一步的实施方案中，功能活性的NFYA5多肽的错表达或过表达导致增加的抗旱性。在另一个实施方案中，功能活性的NFYA5多肽当在植物或植物细胞中表达时，能够挽救缺陷(包括缺乏的)内源的NFYA5活性；挽救的多肽可以来自与具有缺陷活性的种相同或不同的种。在另一个实施方案中，全长NFYA5多肽(即，具有SEQ ID NO：2、4、6或8序列的天然的多肽或其天然存在的直向同源物)的功能活性的片段保留与全长NFYA5多肽相关的一个或多个生物学性质，诸如信号活性、结合活性、催化活性或细胞定位胞外定位活性。NFYA5片段优选包含NFYA5结构域，诸如C-或N-端结构域或催化结构域等，并优选包含至少10个，优选至少20个、更优选至少25个和最优选至少50个连续的NFYA5的氨基酸。功能结构域能够用PFAM程序鉴定(Bateman A等人，Nucleic Acids Res(1999)27：260-262；网址pfam.wust1.edu)。全长NFYA5多肽或其片段的功能活性变体包括含有氨基酸插入、缺失或取代的多肽，具有与全长NFYA5相关的一个或多个生物学性质。在一些情况中，产生改变NFYA5多肽的翻译后加工的变体。例如，与天然的多肽相比，变体可以具有改变的蛋白质运输或蛋白定位特性或改变的半衰期。

如此处所用，术语″NFYA5多核苷酸″包括含有以下序列的多核苷酸：以SEQ ID NO：1提供的序列所述的序列或与该序列互补的序列以及其功能活性片段、衍生物或直向同源物的序列。本公开的NFYA5多核苷酸可以是DNA，其衍生自基因组DNA或cDNA或RNA或其组合。

在一个实施方案中，NFYA5多核苷酸编码功能活性的NFYA5多肽或互补于编码功能活性的NFYA5多肽(例如，包括SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽或其功能片段)的核酸。充当初级RNA转录物(mRNA前体)的模板的基因组DNA包括在该定义内，该初级RNA转录物在编码功能活性的NFYA5多肽前需要加工，如剪接。NFYA5多核苷酸能够包括其他的非编码序列，其可以或不可以被转录；这样的序列包括本领域公知的5′和3′UTR、多聚腺苷酸化信号和调控基因表达的调节序列等。一些多肽需要加工事件，诸如蛋白水解裂解、共价修饰等，以完全变得具有活性。因此，功能活性的核酸可以编码成熟的预加工的NFYA5多肽或中间体形式。NFYA5多核苷酸也可以包括异源编码序列，例如编码包括在内以利于融合多肽的纯化的标志物的序列或转化标志物的序列。

在另一个实施方案中，功能活性的NFYA5多核苷酸能够用于产生功能丧失的NFYA5表型，例如经反义抑制、共抑制等。

在一个实施方案中，本公开的方法使用的NFYA5多核苷酸包括编码与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多序列同一性的NFYA5多肽的核酸序列，或与编码与SEQ ID NO：2、4、6或8中所示的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多序列同一性的NFYA5多肽的核酸序列互补。

在另一个实施方案中，本公开的NFYA5多肽包括与SEQ ID NO：2、4、6或8的NFYA5多肽序列具有至少50％或60％同一性的多肽序列，和可以与SEQ ID NO：2、4、6或8的NFYA5多肽序列具有至少70％、80％、85％、90％或95％或更多的序列同一性。在另一个实施方案中，NFYA5多肽包括与在SEQ ID NO：2、4、6或8中存在的多肽的功能活性片段具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％或更多的序列同一性的多肽序列。

在另一个方面，NFYA5多核苷酸包括在其全部长度上与SEQ ID NO：1、3、5或7所示的NFYA5多核苷酸至少相同50％到60％的序列，或与与这样的NFYA5序列互补的核酸序列，NFYA5多核苷酸可以包括与SEQ ID NO：1所示的NFYA5序列具有至少70％、80％、85％、90％或95％或更多的序列同一性，或其功能活性片段或互补序列。

本公开也包括能够与由SEQ ID NO：1、3、5或7组成的多核苷酸杂交并编码赋予植物耐旱的多肽的核酸分子。杂交的严谨性可以通过在杂交和洗脱期间的温度、离子强度、pH和存在变性剂如甲酰胺控制。常规使用的条件是公知的(见，例如Current Protocol in Molecular Biology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等人，如上)。在一些实施方案中，本公开的核酸分子能够在包括以下的严谨杂交条件下杂交到含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子：在含有6x一倍浓度的柠檬酸(SSC)(1xSSC是0.15M NaCl、0.015M Na柠檬酸；pH 7.0)、5x Denhardt溶液、0.05％焦磷酸钠和100μg/ml鲱鱼精DNA溶液中在65℃预杂交含有核酸滤膜的8小时至过夜；在含有6xSSC、1x Denhardt溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠的溶液中在65℃杂交18-20小时；在65℃在含有0.2xSSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中洗涤滤膜1小时。在其他生物实施方案中，使用中度严谨杂交条件，其包括：在含有35％甲酰胺、5xSSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中预处理含有核酸的滤膜6h；在40℃在含有35％甲酰胺、5xSSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑鱼精和10％(wt/vol)硫酸葡聚糖的溶液杂交18-20h；接着在55℃在含有2xSSC和0.1％SDS的溶液中1小时洗涤2次。可选地，可以使用低严谨条件，其包括：在37℃在含有20％甲酰胺、5xSSC、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5xDenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育8小时到过夜；在同样的缓冲液中杂交18到20个小时，并在1xSSC中洗涤滤膜约1小时。

本公开的方法可以使用可以使用拟南芥NFYA5的直向同源物。鉴定其他植物中的直向同源物的方法是本领域公知的。通常，不同种中的直向同源物保留相同的功能，因为存在一个或多个蛋白基序和/或3维结构。在进化过程中，当物种形成后发生基因复制事件时，在一个物种诸如拟南芥中的单个基因，可以对应于另一个物种中多个基因(共生同系物)。如此处所用，术语“直向同源物”包括共生同系物。当特定植物种的序列数据是可知时，通常通过序列同源分析技术如BLAST分析通常用蛋白饵序列鉴定直向同源物。如果从正向的BLAST结果获得的最好的靶序列在反向BLAST检索到原始的查询序列，序列被指定为潜在的直向同源物(Huynen M A和Bork P，Proc Natl Acad Sci(1998)95：5849-5856；Huynen M A等人，Genome Research(2000)10：1204-1210)。用于多序列比对程序，诸如CLUSTAL(Thompson J D等人Nucleic Acids Res(1994)22：4673-4680)可以用于突出直向同源蛋白的保守区域和/或残基，并产生系统树。在表示来自不同种的多个同源序列(例如，从BLAST分析中检索)的系统树中，两个种的直向同源序列相对于这两个种的所有其他序列一般在树上显示最近。蛋白质结构预测线索法或蛋白折叠的其它分析技术(例如，使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的软件)也可以鉴定可能的直向同源物。并且当序列数据未知时也可以使用核酸杂交方法来寻找直向同源基因。cDNA或基因组DNA文库的简并PCR和筛选是常用的寻找相关基因序列的方法，并且是本领域公知的(见，例如上述的Sambrook；Dieffenbach C and Dveksler G(Eds.)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1989)。例如，用于产生目的植物种的cDNA文库和用部分同源的基因探针检测文库的方法在Sambrook等人中有描述。拟南芥NFYA5编码序列的高度保守部分可以用作探针。NFYA5直向同源核酸序列可以在高度、中度或低度严谨条件下杂交到SEQ ID NO：1的核酸序列。在扩增或分离假定的直向同源物后，通过标准的技术克隆并测序所述片段并用作探针来分离完全的cDNA或基因组克隆。可选地，有可能启动EST探针来产生目的植物种的序列信息数据库。在另一个方法中，特异性结合已知的NFYA5多肽的抗体用于直向同源物分离。Western印迹分析能够测定NFYA5直向同源物(即直向同源蛋白)存在于特定植物种的粗提取物中。当观察到反应性时，编码候选直向同源物的序列可以通过筛选代表特定植物种的表达文库来分离。表达文库能够构建在各种商业购买的载体中，包括λgt11，如在Sambrook，等人中描述，如上。一旦候选的直向同源物通过这些方法中的任何一种鉴定，候选的直向同源序列用作针对拟南芥的序列或其中NFYA5核酸和/或多肽序列已经鉴定的其它种的序列的反向BLAST的饵(″询问″)。

NFYA5多核苷酸和多肽可以使用任何已知的方法获得。例如，用于通过筛选DNA文库或使用聚合酶链反应(PCR)分离目的cDNA或基因组DNA序列的技术，如前所述，是本领域公知的。可选地，多核苷酸寡核苷酸可以被合成。任何已知的方法，诸如定点突变(Kunkel T A等人，Methods Enzymol.(1991)204：125-39)可以用于将期望的改变导入到克隆的核酸中。

如本领域技术人员所知，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达是有利的。遗传密码具有64个可能的密码子是冗余的，但是大多数生物体优选使用这些密码子的子集。物种最常使用的密码子称为最优密码子，不经常使用的密码子称为稀有或不常用密码子(见，例如Zhang等人，(1991)Gene 105：61-72)。密码子可以被取代以反应宿主的优选密码子使用，这个过程有时也称为″密码子优化″或″控制物种密码子偏爱″。

含有特定原核或真核宿主优选的密码子的最优编码序列(也可以见Murray等人，(1989)Nucl.Acids Res.17：477-508)可以被制备，例如以增加翻译速率或产生与从非优化序列产生的转录物相比具有期望性质如更长的半衰期。翻译终止密码子也可以被修饰以反应宿主的偏爱。例如，酿酒酵母和哺乳动物的偏爱终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的优选终止密码子是UGA，其中昆虫和大肠杆菌偏爱使用UAA作为终止密码子(Dalphin等人，(1996)Nucl.Acids Res.24：216-218)。用于优化在植物中表达的核苷酸序列的方法学在例如U.S.Pat.No.6,015,891中以及其中引用的参考文献中提供。

用农杆菌载体转化植物的最优程序会根据被转化的植物变化。用于农杆菌介导的转化的示例性方法包括转化来自无菌的幼苗和/或植株的下胚轴、牙尖、茎或叶片组织的外植体。这种转化的植物可以有性再生或通过细胞或组织培养再生。农杆菌转化先前已经描述用于大量的不同类型的植物，用于这样的转化的方法可以在科技文献中见到。

NFYA5的表达(包括转录和翻译)可以在表达水平、发生表达的组织类型(一种或多种)和/或表达发育阶段上进行调节。大量的异源调节序列(例如，启动子和增强子)可以用于控制NFYA5核酸的表达。这些包括组成型的、诱导型的和调节型的启动子以及调控以组织特异性或时间特异性的方式调控表达的启动子和增强子。示例性的组成型启动子包括树莓E4启动子(U.S.Pat.Nos.5,783,393和5,783,394)、35S CaMV(Jones J D等人(1992)Transgenic Res 1：285-297)、CsVMV启动子(Verdaguer B等人，Plant Mol Biol(1998)37：1055-1067)和甜瓜肌动蛋白启动子(出版的PCT申请WO0056863)。示例性的组织特异性的启动子包括番茄E4和E8启动子(U.S.Pat.No.5,859,330)与番茄2AII基因启动子(Van Haaren MJJ等人，Plant Mol Bio(1993)21：625-640)。

在一个实施方案中，NFYA5表达在来自表达与干旱胁迫相关的基因的调节序列的控制下。来自其他物种的干旱胁迫诱导的基因的启动子也可以使用。实例是来自玉米的rab17、ZmFer1和ZmFer2基因(Bush等人1997 Plant J 11：1285；Fobis-Loisy，1995Eur J Biochem 231：609)，来自番茄的tdi-65基因(Harrak，2001 Genome 44：368)，烟草的His1基因(Wei and O′Connell，1996Plant Mol Biol 30：255)，来自豇豆的Vupat1基因(Matos，2001 FEBS Lett 491：188)和来自马铃薯的CDSP34(Gillet等人1998 Plant J 16：257)。

在另一个方面，在一些情况中，期望抑制宿主细胞中内源NFYA5的表达。实施本公开的这方面的示例性方法包括但不限于反义抑制(Smith，等人，Nature(1988)334：724-726；van der Krol等人，Biotechniques(1988)6：958-976)；共抑制(Napoli，等人Plant Cell(1990)2：279-289)；核酶(PCT出版WO 97/1032S)和有义和反义的组合(Waterhouse，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95：13959-13964)。用于抑制宿主细胞中内源序列表达的方法通常利用所要抑制的序列的至少部分的转录或转录与反义。这样的序列可以与内源序列的编码以及非编码区同源。反义抑制可以使用完整的cDNA序列(Sheehy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：8805-8809)、包括5′编码序列的片段的部分cDNA序列(Cannon等人，Plant Molec.Biol.(1990)15：39-47)或或3′非编码序列3′的片段的部分cDNA序列(Ch′ng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：10006-10010)。共抑制技术可以使用整个cDNA序列(Napoli等人，supra；van der Krol等人，The Plant Cell(1990)2：291-299)或部分cDNA序列(Smith等人，Mol.Gen.Genetics(1990)224：477-481)。

可以进行标准的分子和遗传试验来进一步分析基因和观察的表型之间的关联。示例性的技术描述如下。

在突变体和野生型的株系中阶段特异性的表达和组织特异性的基因表达模式可以通过例如原位杂交来测定。可以进行基因特别是侧翼的调节区的甲基化状态的分析。其它合适的技术包括过表达、异位表达和在其他植物种的表达和基因敲除(反向遗传学、靶向敲除、病毒诱导的基因沉默[VIGS，见Baulcombe D，Arch Virol Suppl(1999)15：189-201])。

通常通过微阵列分析技术进行的表达图谱可以用于同时测量许多不同基因的表达的差异或诱导的改变。用于微阵列分析的技术是本领域公知的(Schena M等人，Science(1995)270：467-470；Baldwin D等人，(1999)Cur Opin Plant Biol.2(2)：96-103；Dangond F，Physiol Genomics(2000)2：53-58；van Hal N L等人，J Biotechnol(2000)78：271-280；Richmond T and Somerville S，Curr Opin Plant Biol(2000)3：108-116)。可以进行对个体标记的株系的表达作图。这样的分析能够鉴定由于目的基因的过表达而被并行调节的其他基因，这可助于将未知的基因置于特定的途径中。例如，以下进行的分析证实在非应激条件下干扰RNA分子抑制NFY5A活性。减少该分子的抑制能够助于赋予耐旱性或优化NFY5A的表达或活化。

基因产物的分析可以包括重组蛋白表达、免疫定位、生化分析催化活性或其它活性，磷酸化状态的分析和经酵母双杂交分析与其它蛋白的相互作用。

路径分析可以包括基于期望的表型或通过与相关基因的序列同源性将基因或基因产物放在特定的生化、代谢或信号途径内分析。可选地分析可以包括与野生型株系和其它的突变株系的遗传杂交(产生双重突变)以将基因放在路径中，或确定突变对途径中下游“报告”基因的表达的影响。

本公开还提供了鉴定具有使耐旱性增加的内源NFYA5的突变的植物的方法，和产生非基因改良的这些植物的耐旱后代的方法。在一个方法中，称为″TILLING″(用于靶向诱导的基因组中的局部病变)的突变在目的植物的种子中被诱导，例如，使用EMS处理。获得的植物生长并自我受精，并且后代被用于制备DNA样品。NFYA5-特异性的PCR被用于鉴定突变的植物是否具有NFYA5突变。具有NFYA5突变的植物接着可以被检测耐旱性；或可选地，可以检测植物的耐旱性并且接着使用NFYA5特异性的PCR来确定具有增加的耐旱性的植物是否具有突变的NFYA5基因。TILLING能够鉴定可以改变特定基因的表达或由这些基因表达的蛋白的活性的突变(见Colbert等人(2001)Plant Physiol 126：480-484；McCallum等人(2000)Nature Biotechnology 18：455-457)。

在另一个方法中，候选基因/数量性状基因座(QTLs)方法能够用于标志物辅助选择育种程序以鉴定使耐旱性增加的NFYA5基因等位基因或NFYA5基因的突变或NFYA5基因的直向同源物(见Foolad等人，Theor Appl Genet.(2002)104(6-7)：945-958；Rothan等人，Theor Appl Genet(2002)105(1)：145-159)；Dekkers and Hospital，Nat Rev Genet.(2002)January；3(1)：22-32)。由此，在本公开的进一步的方面，NFYA5核酸被用于鉴定耐旱的植物是否具有内源NFYA5中的突变。

实施例

拟南芥的突变体rdr2-1、dcl2-1、dcl3-1和dcl4-1获自于Center for Gene Research and Biotechnology，俄勒冈州州立大学。dcl1-7和hen1-1由Xuemei Chen提供。rdr6和sde4/nrpd1a由英国的John Innes Center for Plant Science Research，Sainsbury Laboratory，友好提供。sgs3由法国的Laboratoire de Biologie Cellulaire，Institut National de la Recherche Agronomique，Versailles，France提供。hyl1由宾夕法尼亚州立大学的The Huck Institute of Life Science提供。这些突变体为Columbia(Col-0)、Landsberg erecta(Ler)、Nosssen-0(No)或C24的遗传背景，如在在说明书文本和附图中所示。NFYA5的T-DNA插入突变体(SALK_042760)获自于ABRC。拟南芥植株生长在23±1℃下的连续光照(70μmol m-2s-1)下。烟草本塞姆氏植物生长在23±1℃下的16h光/8h黑暗的光周期下。对于脱水处理，将2周大小的苗子从琼脂培养基中拔出并在试验台上的Whatman 3MM纸上干燥规定的时间。对于干燥处理，植物生长在具有充足水分的土壤中3周，接着控水一定的时间。

通过QuickChange II定点突变试剂盒(Stratagene)进行定点突变以产生在与小RNA互补的区中突变的NFYA5。测序该片段以确保只引入了期望的突变。具有和不具有3’-UTR的NFYA5用指定的引物扩增(具有/没有3’-UTR的正向5’-CAC CAT GCA AGT CTT TCA AAG GAA AG-3’(SEQ ID NO：9)、具有3’-UTR反向5’-GTA ATG CAA TTG TAC TCT CGA G-3’(SEQ ID NO：10)和没有3’-UTR反向5’-TCA AGT CCC TGA CAT GAG AGC TGA GG-3’(SEQ ID NO：11))。At1g54150的全长cDNA用以下引物扩增：正向5’-CAC CAT GTC CTC GCC GGA GCG TGC TCT C-3’(SEQ ID NO：12)，反向5’-TAG TTC GAT CTC ACC GAG CTC CA-3’(SEQ ID NO：13)。这些构建物克隆到植物表达GATEWAY目的载体pMDC32中。

为了产生pMDC32:miR169构建物，从基因组DNA用下列引物扩增包括折回结构的围绕miRNA序列的200bp片段：miR169a正向5’-CAC CTG GGT ATA GCT AGT GAA ACG CG-3’(SEQ ID NO：14)和反向5’-CCT TAG CTT GAG TTC TTG CGA-3’(SEQ ID NO：15)、miR169b正向5’-CAC CCC CAA CGG AGT AGA ATT G-3’(SEQ ID NO：16)和反向5’-CTC ATA CGG TCG ATG TAA TCC GT-3’(SEQ ID NO：17)、miR169c正向5’-CAC CTC GTC CAT TAT GAG TAT T-3’(SEQ ID NO：18)和反向5’-CTA ATA TGA TAT GAA TAT GGA TGA-3’(SEQ ID NO：19)、miR169h正向5’-CAC CTC ATA TAA GAG AAA ATG GTG-3’(SEQ ID NO：20)和反向5’-CCA AAA AAG AGA AAT GTG AAT GAG-3’(SEQ ID NO：21)。将扩增的片段导入到pENTRTM/D-TOPO载体(Invitrogen)并通过LR反应克隆到pMDC32中。

对于NFYA5启动子::GUS构建物，用正向引物5’-CAC CTG TAT GAC ATA TTC TGT GTG GAG-3’(SEQ ID NO：22)和反向引物5’-TGC AAA TTG GGT ATT GGC TAT G-3’(SEQ ID NO：23)扩增起始密码子上游的1.7kb片段并按照Gateway重组克隆到pMDC164载体中。

产生YFP与NFYA5的C端的融合体并通过Gateway重组导入到pEarleyGate 101载体中。在Leica SP2共聚焦显微镜上采集YFP像。

从野生型、突变体和转基因植物用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。为了富集小RNA，通过加入一体积的20％PEG-1M NaCl选择性沉淀高分子量的RNA(Llave等人，2002)。在1.2％甲醛-MOPS琼脂糖上分离高分子量的RNA并在17％的变形聚丙烯酰胺凝胶上分级分离低分子量的RNA。探针检测印迹并如文献所述洗涤(Borsani等人，2005)。

对于实时RT-PCR，使用SuperScript^TM III First-Strand Synthesis Supermix(Invitrogen)合成第一链cDNA。对miR169前体特异的引物被用于检测miR169的表达水平(见表1)。引物也被设计为检测NFYA5的转录水平。在iQ5实时PCR检测系统中用iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)进行实时RT-PCR。各实验重复三次。采用比较Ct方法。

表1

                                                       

引物名称(SEQ ID NO：)  序列(5’-3’)

                                                       

miR169a正向(24)        TGGGTATAGCTAGTGAAACGCG

miR169a反向(25)        CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGA

miR169b正向(26)        CTCCACTCCCTAAACCATCACAAC

miR169b反向(27)        CTCATACGGTCGATGTTAATCCGT

miR169c正向(28)        CTACATTCACAAACGAGAGAATT

miR169c反向(29)        GCTCTACTTTAGCATCTCAACCA

miR169h正向(30)        GTAGTCTTGTGGGATACTCATCA

miR169h反向(31)        ATCCCCAAATTTGGAGGCCAAACA

miR169i正向(32)        AAGGTGTCTCCTGGGTTGAAAAT

miR169i反向(33)        CCATGATCATTCATGTCGTGCCT

miR169j正向(34)        GAGAGCACATCCATGTGAGGAA

miR169j反向(35)        GTCAGGCAAGTCATCCTTGGCT

miR169k正向(36)        CTCTTTGGCTATCTTGACATGCT

miR169k反向(37)        CCAAGGAGACTGCCTGATGTCT

miR169l正向(38)        GAGAGCACATGAATGTAAGGCA

miR169l反向(39)        AATAATGTGTAGACTCAGCCACAT

miR169l反向(40)        CTTGCGGGTTAGGTTTCAGGCA

miR169m反向(41)        GCCTCGAAATCATGAACATTATCT

miR169n正向(42)        AGAGAGCACATGCATGTATGGA

miR169n反向(43)        GAAAAGTAGGTATAACATGGATGG

NFYA5正向(44)          GAAGATTCATCTTGGGGAAACTC

NFYA5反向(45)          GAGCAGGAAACACAGAGTCTTGA

At4g15120正向(46)      GGTTGGGTGTTTCCCGGCATCGGA

At4g15120反向(47)      GGCTTCTCCTAAGATCTGATCTCCA

At1g17170正向(48)      CCTTCCCTCCGATCCTTACAAGA

At1g17170反向(49)      CAACCCAAGTTTCTTCCTACGTTCG

At2g37870正向(50)      CGTTGAGGCGGCAGGTGAGTGT

At2g37870反向(51)      TGTAACGTCCACATCGCTTGCCA

At2g42530正向(52)      TCAGTGGCATGGGTTCTTCTTCCA

At2g42530反向(53)      GAGGTCATCGAGGATGTTGCCGT

At2g42540正向(54)      GTTCTCACTGGTATGGCTTCTT

At2g42540反向(55)      GTCTTTCGCTTTCTCACCATCTGCT

18S正向(tobaco)(56)    AGGAATTGACGGAAGGGCA

18S反向(tobaco)(57)    GTGCGGCCCAGAACATCTAAG

Tub8正向(58)           ATAACCGTTTCAAATTCTCTCTCTC

Tub8反向(59)           TGCAAATCGTTCTCTCCTTG

                                                       

具有和不具有3’-UTR构建物的定点突变构建物被转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens strain)3301中。收集过夜培养物并与各种组合以1∶1的比例混合。在室温下在10mM MgCl2、10mM MES(pH 5.6)和150μM乙酰丁香酮温育1h后，农杆菌悬浮液被共渗到3周龄的烟草本塞姆氏叶子中。在共渗2天后采集叶片并如上所述提取小RNA并印迹。

从3周大小的在土壤栽植的相似发育阶段的植物收集莲座叶。立即在液氮中冷冻叶片并通过环境扫描电子显微镜观察(HITACHI，TM 1000)保卫细胞。测定气孔孔径的宽和长用于统计分析。

对于水损失测定，剪下生长在正常环境下3周的每单个突变株和野生型植物的6个叶片并在规定的时间间隔测定鲜重。每个株系进行4次重复。水损失表示为在各时间点的初始鲜重的百分率。

根据Rabino和Mancinelli(1986)与Sukar等人，(2006)测定花青苷含量。用99∶1 甲醇∶HCl(v/v)在4℃提取色素并且测定每个样品的OD₅₃₀和OD₆₅₇，OD₅₃₀-0.25×OD₆₅₇用于补偿Chl和其产物对在530处贡献的吸收。

通过在37℃在1mg mL 1 5-溴-4-氯-3吲哚β-D-葡糖醛酸、0.1M Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.0)、0.5mM K₃(Fe[CN]₆)和10mM EDTA中培养转基因植物过夜，然后用70％乙醇清洗进行GUS染色的组织化学定位。

根据Jefferson(1987)的程序分析GUS活性。在100μl提取缓冲液(50mM NaPO₄、pH 7.0、1mM Na₂EDTA、0.1％(v/v)Triton X-100、0.1％[w/v]月桂酰肌氨酸钠和10mM二硫苏糖醇)中在4℃以13,000rpm离心10min均化100mg冷冻组织。在0.5-mL添加有1mM 4-乙酸4-甲基伞形酯-β-D-葡糖苷酸(Sigma)体积的提取缓冲液温育2h，接着用0.2M Na₂CO₃终止反应进行荧光分析。根据随蛋白质分析试剂盒提供的Bio-Rad手册确定蛋白质浓度。GUS活性计算为皮摩尔MU每分钟每毫克蛋白。

对于Affymetrix GeneChip阵列分析，野生型和35S::NFYA5苗子在22℃在16h光和8h黑暗的循环中在MS平板中生长。使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)提取总RNA并用于制备生物素基互补RNA靶。如Breitling等人(2004)等人所述进行微阵列分析。产生了使用Bioconductor package，RankProd(Gentleman等人，2004，Hong等人，2006)上调和下调的基因列表。为了预测共有的新顺式调节元件，使用了AlignACE程序(Hughes等人，2000)。该程序应用于上调或下调基因的启动子序列上游1kb。在几个候选共有元件中，选择出一个含有弱CCAAT共有基序，其在上调基因的启动子内发现。

NFYA5首先被研究是因为其被注释为与另一个基因(At1g54150)在它们的3’UTR区域在反义链重叠形成天然的顺式-反义转录物(NAT)基因配对。NFYA5转录物在响应脱水处理时快速积累并在脱水处理开始3h后显示大约30倍的峰诱导(图1A)。当脱水处理进行更长的时间后，NFYA5的mRNA水平减少，但是仍然高于对照(图1A)。在遭受干旱胁迫的生长在土壤中的植物的NFYA5转录也被大大地诱导(图1B)。

一些干旱胁迫诱导的基因表达上调需要ABA积累(Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki，1996；Zhu，2002)。由此，检测NFYA5对ABA处理的反应。在施用100μM ABA后24h NFYA5表达增加大约13倍。为了证实ABA与干旱诱导的NFYA5表达相关，产生ABA缺失(aba2-1)的突变株和ABA敏感的(abi1-1)突变株。在Col-0和Ler野生型中，通过控水10天强烈地诱导了NFYA5的表达；然而，在aba2-1和abi1-1中，干旱诱导的NFYA5 mRNA的积累大大减少(图1B)。这个结果表明AtNFYA5表达至少部分依赖于ABA信号途径。

尽管实时PCR和RNA印迹分析都显示响应脱水和干旱胁迫或ABA而明显的NFYA5RNA积累的诱导，这些分析不能说明所述增加是否由增加的启动子活性或改变的RNA稳定导致。为了说明这个问题，使用来自NFYA5起始密码子上游的1.7kb片段构建启动子::GUS融合。在几个转基因株系中的GUS染色的分析显示对脱水应激或ABA处理的响应增加了GUS染色(图2A)。因此，这些处理的确增加了NFYA5启动子的转录活性。然而，定量分析表明对脱水处理的响应增加了大约5倍的GUS活性。这比通过定量PCR分析观察到的NFYA5 mRNA的30倍上调小的多(图1A)。因此，除了转录诱导外，NFYA5的转录后调节也发挥作用。

所述启动子::GUS转基因株系也用于检测NFYA5的表达谱。在叶片中NFYA5高表达，其中在叶片微管组织显著表达，重要地是在保卫细胞中具有高水平的表达(图2B，图I和II)。在花组织和根维管束中也观察到GUS染色(图2B，图III和IV)。在不同组织中的NFYA5 mRNA水平的定量PCR分析与GUA染色的组织模式一致，并显示在叶片和根组织中表达最高，在花组织和茎组织中也存在显著的表达(图2C)。

在拟南芥中，NF-Y复合物的A亚基由10成员的基因家族编码。尽管蛋白的其他区变化，但是NF-YA含有高度保守的核心区，该核心区由两个功能亚区组成：NF-YB/NF-YC结合亚区和DNA亚区，它们通过小的连接子连接(Romier等人，2003；Wenkel等人，2006)。Psort II程序预测NFYA5蛋白的定位，准确率为70％。为了证实NFYA5蛋白的亚细胞定位，黄色荧光蛋白(YFP)和NFYA5的C端之间翻译融合物被转化到拟南芥中。表达NFYA5-YFP融合蛋白的细胞显示YFP信号只在核中出现(图2D)。

在脱水下高水平的NFYA5 mRNA积累，其不能只通过AtNFYA5的启动子活性解释，这强烈地表明在转录后转录水平上存在另一个调节机制。一种可能是通过小RNA(s)调节。为了开始研究这种可能性，检索Arabidopsis MPSS Plus Database(万维网址mpss.udel.edu/at/)，鉴定了两个小RNA特征(17nt)，其与At1g54150的3’端配对并与AtNFYA5的3’UTR互补。在Arabidopsis MPSS Plus Database中的小RNA特征与ASRP小RNA数据库(万维网：asrp.cgrb.oregonstate.edu)中的ASRP1815(19nt)部分相同。因此，设计了与ASRP1815互补的寡核苷酸探针(图3A)。

使用该寡核苷酸探针，检测到在正常生长条件下的植物中的21-nt小RNA。在进行控水10天的植物中，ASRP1815小RNA的水平降低到在未胁迫的植物中水平的～28％(图3B)。在该同样的处理中，对干旱胁迫的响应使NFYA5的表达增加14倍。这与在干旱下ASRP1815表达的减少可以降低小RNA指导的NFYA5 mRNA降解的可能性一致。也与ABA诱导的NFYA5 mRNA积累一致，ABA处理抑制ASRP1815的水平约为对照水平的16％(图3B)。在Col-0和Ler野生型中，干旱胁迫强烈地诱导ASRP 1815的表达；然而，在aba2-1 and abi1-1突变体中ASRP 1815表达基本不受干旱的影响(图3B)。因此，干旱胁迫对ASRP 1815的抑制依赖于ABA信号转导。

NFYA5和At1g54150形成NAT基因对的事实产生了可能性：它们可以产生调节NFYA5的nat-siRNA。nat-siRNA的生物合成需要DCL2或DCL1、RDR6、SGS3和NRPD1a(Borsani等人，2005；Katiyar-Agarwal等人，2006)。为了检测ASRP1815是否为nat-siRNA，检测在缺乏已知对生物合成特定类型的小RNA所需的各种蛋白的突变体中的其生物合成。ASRP1815仍然在dcl3、rdr2、dcl4、dcl2、rdr6、sgs3或nrpd1a中产生(图3C)。这表明其不是前述类型的异染色质siRNA、tasiRNA或nat-siRNA。相反，ASRP1815在hen1、dcl1-7和hyl1(Figure 3C)中不存在。对这些组分的需要表明ASRP1815可能是微RNA。NFYA5表达的破坏对ASRP1815的影响很小，这与ASRP1815不是nat-siRNA的观点一致。

检测了ASRP1815小RNA不存在的突变体中NFYA5 mRNA的水平。NFYA5 mRNA的水平在hen1、dcl1-7和hyl1中高于野生型(图3D)。这个结果表明ASRP1815的确下调了NFYA5表达。

HEN1、DCL1和HYL1的需要表明miRNA用ASRP1815探针检测。因此，在小RNA数据库中进行检索与ASRP1815同源的序列，发现ASRP1815与miR169(21nt)家族的序列同源。拟南芥中miR169家族含有14个成员，并且该miRNA家族在水稻和毛果杨(Populus trichocarpa)是保守的(Bonnet等人，2004；Jones-Rhoades和Bartel，2004；Sunkar合Zhu，2004；Sunkar等人，2005)。基于产生的miRNA序列，可以将MIR169a/b/c//h/i/j/k/l/m/n家族分为三个亚组。MIR169a代表第一个亚组，MIR169b和MIR169c形成了第二个组，第三个组由MIR169h/i/j/k/l/m/n组成。这些亚组的主要不同是3’端的序列：MIR169a的最后两个核苷酸是G和A，然而MIR169b/c和MIR169h/i/j/k/l/m/n的最后两个核苷酸分别是GG UG。而且，MIR169h/i/j/k/l/m/n的5’端是UA，这与其他两个亚组的CA不同。

因为它们的序列相似性，MIR169家族成员由于交叉杂交而不能在小RNA印迹中得到区分。为了确定MIR169哪一个基因座可以调节NFYA5，用miR169基因座特异的引物进行实时RT-PCR，以确定miR169基因座的任一个是否被干旱胁迫调节。从经过控水10天的生长在土中的拟南芥植物提取RNA。只有MIR169a和MIR169c显示对干旱胁迫响应的转录物丰度的基本改变(图4A)。MIR169a和MIR169c两者都被干旱胁迫下调，这与干旱下调成熟miRNA的结果一致。进行进一步的实验以确定MIR169a和MIR169c是否下调AtNFYA5 mRNA。

在许多情形下，已经假定miRNA家族的成员具有最丰富的功能；然而，Sieber等人，(2007)最近提出了证据表明被预测靶向相同基因的密切相关的miRNAs事实上在发育期间具有不同的功能。为了证实MIR169a或MIR169c是否可以在调节NFYA5表达中具有特定的作用，在烟草本塞姆氏中进行了瞬时共表达。因为miR169的靶位点位于NFYA5的3’UTR，所以检测了三个NFYA5构建物：包括3’UTR的全长NFYA5、没有3’UTR的构建物和在3’UTR突变以引入在3’UTR和miR169之间的四个错配的另一个构建物(图4B)。NFYA5和miR169a或miR169c构建物都在35S启动子的控制下表达。在烟草本塞姆氏中共表达2天后，提取RT-PCR RNA并通过定量定量RT-PCR分析。来自缺少功能性miR169靶位点的构建物、NFYA5cds和NFYA5突变体的mRNA水平没有受到与miR169共表达的影响(图4C)。然而，当与MIR169a共表达时，NFYA5 mRNA的水平显著减少(对照水平的37％)(图4C)。有趣的是，与miR169c的共表达只导致NFYA5转录物水平减少13％。这些结果表明NFYA5 mRNA的降解主要受到MIR169a指导。从相同样品制备并用与互补MIR169的寡核苷酸探测的小RNA印迹清楚地显示21-nt小RNA在所有的共表达样品中高度表达。由此，miR169c不能指导强的AtNFYA5裂解不是由于缺乏miR169c表达。

为了证实这些结果，在拟南芥中过表达MIR169a和MIR169c前体并选择具有相似miR169表达水平的株系，以定量miR169a和miR169c过表达对NFYA5表达的影响(图4D)。与瞬时共表达分析结果一致，miR169a的过表达导致比miR169c过表达更大的NFYA5 mRNA水平减少(图4E)。也选择miR169家族的两个其它成员，miR169b和miR169h，而且他们也在拟南芥中过表达。NFYA5的相对mRNA水平没有显著改变，尽管miRNA过表达(图9)。这些结果再次表明MIR169a作为主要的miRNA基因座对调节AtNFYA5的表达是重要的。

干旱反应基因调节和ABA信号转导对抗旱是至关重要的(Pei等人，1998；Zhu，2002)。干旱和ABA诱导的NFYA5表达和其在保卫细胞中的强表达促使我们分析其在抗旱中的潜在作用。首先，其中NFYA5 mRNA的水平为野生型的～33％的过表达miR169a的植物(35S::MIR169a，株系#15)被检测(图4D)。野生型和35S::MIR169a-15植物生长在土壤中3周，接着进行控水8天。35S::MIR169a-15植物显示叶片卷曲并且叶片变紫，然而野生型植物仍然饱满，叶片仍然为绿色(图5A)。这个结果表明35S::MIR169a-15植物可能已经比野生型植物更快地耗竭土壤水并由此更快地枯萎。为了研究这种可能性，分析来自生长在土壤中的35S::MIR169a-15和WT植物以确定他们的气孔孔径。35S::MIR169a-15叶片的气孔孔径指数为0.25，其比WT的大约20％(图5B)。与这些结果一致，35S::MIR169a-15脱落的叶片一直比野生型的脱落叶片更快地失水(图5C)，这表明在控水后35S::MIR169a-15更快地出现枯萎，这可能至少部分是由于这些植物不能有效地关闭他们的气孔和减少蒸腾。一位ABA是气孔孔径和蒸腾的调节者，所以这种表型与ABA诱导的NFYA5表达一致，表明了NFYA5对于保卫细胞中的ABA信号转导可能是重要的。应激敏感性的另一个指示物是叶片中紫色的类黄酮色素、花青苷的积累。在35S::MIR169a-15植物中控水8天后花青苷水平为19.41μg g-1FW，这大约是野生型的3倍，这再一次支持了35S::MIR169a-15对干旱胁迫更敏感。这些结果表明NFYA5的充分表达为抗旱所需。

搜索公众可获得的T-DNA保藏并从Arabidopsis Biological Resource Center获得了T-DNA插入突变体(SALK_042760，Columbia背景)，以进一步研究NFYA5的功能。通过对T-DNA侧翼区PCR和测序T-DNA插入纯合的植物证实在NFYA5的启动子区的插入位点(图6A)。RNA印迹分析表明NFYA转录物不存在于命名为nfya5的T-DNA株系中(图6A)。与35S::MIR169a-15植物的表型一直，nfya5敲除的突变植物也对干旱胁迫高度敏感(图6B)。nfya5叶片的气孔孔径指数为0.27，这比野生型叶片大42％(图6C)。与这些结果一致，nfya5脱落的叶子比野生型的脱落的叶子更快地失水(图6D)。在nfya5叶子中的花青苷水平在控水8天后为野生型的4倍，这再一次支持了nfya5植物对干旱胁迫更加敏感。这些结果证实NFYA5是抗旱因子。

为了进一步表征NFYA-5在抗旱中的功能，产生过表达在组成型的CaMV35S启动子控制下的基因的转基因拟南芥植物。基于他们高水平的NFYA5表达选择三个转基因株系(#2，3和5)用于进一步的分析(图7A)。为了评价NFYA5过表达的影响，3周大小的生长在土壤中的野生型和35S::NFYA5植物经控水14天。在控水的第14天，大多数的野生型植物显示失水，但是35S::NFYA5植物显示比野生型失水少(图7B)。与nfya5相反，35S::NFYA5-3的气孔孔径比野生型小(图7C)。35S::NFYA5-3的脱落的叶片比野生型更慢地失水(图7D)并且35S::NFYA5-3中叶片中的花青苷水平在控水14天后要低得多(图6E)。这些结果表明NFYA5过表达增加抗旱。

NFYA5的核定位和DNA结合结构域表明蛋白可以在调节对抗旱重要的其它基因的表达中发挥作用。为了检测这种可能性，通过使用Affymemetrix Arabidopsis ATH1基因芯片进行微阵列试验。与在非应激条件下的野生型苗子相比，在35S::NFYA5中总共28个基因显示了35S::NFYA5表达改变2倍或更多，其中在所述转基因植物中分别有17个基因和11个基因增加或减少(表2)。这些基因的大多数具有已知的或假定的与非生物应激反应相关的功能，并且他们中的一些似乎参与氧化应激(例如，细胞色素b6-f复合体的亚基、GST、过氧化物酶和氧化还原酶家族蛋白)。在NFYA5异位表达影响的这些基因中，如预期的一样，他们中多数在启动子区域中含有的CCAAT基序(表2)，因为这种短序列基序一般能够大量的基因启动子片段中发现。使用AlignACE程序(Hughes等人，2000)，鉴定了一个顺式调节元件TX(C/A)TTXGX(C/A)CAXT(SEQ ID NO：60)，其在一亚组基因的启动子中含有“CCAAT基序”，所述亚组基因在NFYA5过表达的植物中显示表达增加(表2)。这些基因是NFYA5的直接靶是可能的。

表2.在微阵列分析中在35S::NFYA5转基因植物中表达改变至少2倍(P＜0.05)的基因列表

^*上述鉴定的基因的序列能够通过参照基因号和/或Affy ID识别。与这些识别号相关的序列通过参考并入本文。

实时RT-PCR证实了微阵列结果。与微阵列数据一致，实时RT-PCR分析显示在正常条件下35S:NFYA5植物中At4g15210(胞质β-淀粉酶)、At2g37870(蛋白酶抑制剂)，At1g17170(谷胱甘肽转移酶)、At2g42530(冷响应蛋白)和At2g42540(COR15A)高水平表达(图10)，这表明在35S:NFYA5中应激基因的组成型表达。在失水条件下在野生型和在35S:NFYA5中这些基因被强烈地诱导；然而，大多数这些基因的失水诱导的积累在nfya5中大大降低，表明这些基因中的许多基因的最佳失水应激诱导需要NFYA5。

上述的实施例只是说明性的，不是旨在限制本公开。

Claims (23)

1.分离的多核苷酸，包括

可操作地接至异源启动子的NFY5A多核苷酸、其同系物或直向同源物。

2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述NFY5A包括与选自SEQ ID NO：1、3、5或7的多核苷酸具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。

3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述NFY5A包括SEQ ID NO：1、3、5或7。

4.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述NFY5A多核苷酸编码包括SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽。

5.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述NFY5A多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、4、6或8具有至少80％同一性的多肽，其中所述多肽改变植物细胞中的气孔开口。

6.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述异源启动子包括组成型启动子。

7.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述异源启动子包括诱导型启动子。

8.权利要求1的多核苷酸，其被包含在表达载体中。

9.权利要求6的多核苷酸，其中所述组成型启动子选自下组：花椰菜花叶病毒35S启动子或19S启动子、植物ACT2启动子和植物泛素启动子。

10.权利要求6的多核苷酸，其中所述组成型启动子是衍生自拟南芥的肌动蛋白2启动子。

11.权利要求7的多核苷酸，其中所述诱导型启动子包括光诱导型启动子。

12.权利要求11的多核苷酸，其中所述光诱导型启动子是大豆的SRS1启动子。

13.用权利要求1-12任一项的多核苷酸的转化的植物细胞。

14.转基因植物，其以比野生型植物更高的水平表达权利要求1的多核苷酸，并且所述转基因植物具有增加的耐旱性。

15.转基因植物，其缺乏NFY5A基因、其同系物或直向同源物的3′UTR，并且与野生型植物相比具有增加的耐旱性。

16.转基因植物，其包括miR169a或miR169c多核苷酸的减少表达，并且与野生型植物相比包括增加的耐旱性。

17.权利要求16的转基因植物，其中所述miR169与SEQ ID NO：61至少98％或99％相同。

18.转基因植物，其包括miR169a或miR169c多核苷酸的敲除，并且与野生型植物相比具有增加的耐旱性。

19.从权利要求14-18任一项的转基因植物获得的植物部分或细胞。

20.利用权利要求1-12任一项的多核苷酸产生抗旱植物的方法，包括将所述多核苷酸导入植物细胞或植物组织中，筛选所述多核苷酸分子的存在以产生转基因植物细胞或转基因植物组织，和从所述转基因植物细胞或转基因植物组织再生植株，由此产生抗旱植物。

21.用于鉴定可用于改变植物抗旱性的制剂的方法，包括：

将含有NFY5A基因的植物与制剂接触；

测定细胞中所述基因表达的变化或存在的mRNA转录物的量的变化；

其中与对照相比表达的增加或转录物水平的增加指示了增加耐旱性的制剂。

22.用于鉴定可用于改变植物耐旱性的制剂的方法，包括：

将植物与制剂接触，所述植物包含可操作连接到报告基因的序列TX(C/A)TTXGX(C/A)CAXT(SEQ ID NO：60)；

测量所述报告基因表达的变化；

其中与对照相比报告基因表达的变化指示了改变耐旱性的制剂。

23.增加植物耐旱性的方法，包括将植物与增加(1)NFY5A基因、其同系物或直向同源物和/或(2)表2所列基因的表达的制剂接触。

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