CN110819633A - 一种胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3的序列及其应用 - Google Patents

Abstract

ABA应答元件结合蛋白属于bZIP转录因子家族ABF亚族，是植物中特有的一类转录因子。本发明利用聚合酶扩增方法从胡萝卜品种‘黑田五寸’中克隆得到一个ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3，其序列包含1329个核苷酸，编码442个氨基酸。序列分析表明，DcABF3蛋白含有典型的bZIP结构域。表达分析结果表明，胡萝卜DcABF3蛋白参与了多种逆境胁迫的响应，低温、高温、干旱或高盐胁迫下DcABF3基因的表达水平均显著上调。本发明从胡萝卜中克隆获得胡萝卜DcABF3基因，该基因可调控胡萝卜逆境胁迫响应过程。

Description

一种胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3的序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及1个胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因及其应用。本发明公开了一种利用聚合酶扩增方法从胡萝卜中克隆出胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3的方法，该基因可用于胡萝卜逆境胁迫响应机制研究。

背景技术

胡萝卜(Daucus carota L.)是一种重要的根菜类作物，属于伞形科胡萝卜属。胡萝卜营养价值丰富，具有增强免疫力、降低胆固醇、预防心脏病等多种保健功能(严怡红，食品研究与开发，2003，24(6)：120-122)。‘黑田五寸’是我国广泛种植的胡萝卜品种，具有产量高、稳定性好等特点，是基因及育种研究的优良材料(Xu et al.，Database，2014，bau096)。

植物在生长发育过程中需要不断适应外界环境的变化，在这一过程中，转录因子起重要作用。ABA应答元件蛋白(ABA responsive element binding protein)即ABF转录因子，属于bZIP转录因子家族ABF亚族，是一类植物中特有的转录因子家族。它们能响应胁迫信号，调控下游基因表达，提高植物对胁迫的适应能力(洪岚等，植物生理学报，2011，47(3)：211-217)。ABF转录因子的两端共有4个保守区域，其中包含一个高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，可以结合DNA或其他蛋白(Kim，Physiol Plant，2006，126：519-527)。拟南芥中共存在9个ABF转录因子，它们分别参与了干旱、低温、高盐、热和氧化胁迫等应答反应(杨颖等，麦类作物学报，2009，29：730-737)。在其他植物中，如小麦(Guiltinan et al.，Science，1990，250：267-271)、烟草(Oeda et al.，EMBO J，1991，10：1973-1802)、水稻(Hobo et al.，Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：15348-15353)、玉米等，也分离出了许多ABF类转录因子(王磊等，科学通报，2002，47：1167-1171)。

发明内容

本发明提供了一种胡萝卜ABA应答元件响应蛋白DcABF3基因的制备方法和用途。所获得的胡萝卜DcABF3基因能够应用于作物抗逆品种的研究与培育。

附图说明

图1.胡萝卜DcABF3蛋白的保守域预测结果

图2.胡萝卜DcABF3蛋白与拟南芥ABF蛋白氨基酸序列的多重比对结果

图3.胡萝卜与其他植物ABF蛋白的系统进化树分析

图4.胡萝卜DcABF3基因在不同胁迫下的表达分析

具体实施方式

1.植物材料及处理：本发明所用植物材料为胡萝卜品种‘黑田五寸’，由南京农业大学伞形科蔬菜作物遗传与种质创新实验室保存，植株种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。对生长至2个月大小状态良好的胡萝卜植株分别进行低温(4℃)、高温(38℃)、干旱(200g·L^-1PEG)和高盐(0.2mol·L^-1NaCl)处理，每个处理进行三个重复，于处理后1、2、4、8、12h取样。200g·L^-1PEG和0.2mol·L^-1NaCl溶液均以灌根方式施入，灌入等量蒸馏水为对照。

2.总RNA提取及cDNA合成：按照植物总RNA提取试剂盒RNA simple Total RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取胡萝卜‘黑田五寸’叶片的总RNA。测定样品RNA浓度后利用反转录试剂盒Prime Script with gDNA Eraser(大连TaKaRa生物科技有限公司)合成cDNA。

3.胡萝卜DcABF3基因的克隆：基于本实验室胡萝卜转录组数据库(Xu et al.，Database，2014，bau096)，检索胡萝卜ABA应答元件结合蛋白DcABF3基因序列，并设计一对扩增引物。正向引物序列为5’-ATGGGGTCTTACATAAATTTCAAGA-3’，反向引物序列为5’-TCACCAAGGTCCGGTCAGGGTCCTT-3’。以‘黑田五寸’cDNA为模板，利用聚合酶链式反应扩增目的片段，扩增程序为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃75s，共35个循环；最后72℃延伸10min。经琼脂糖凝胶电泳检测并回收扩增产物后，将其连接至pMD19-T载体(大连Takara公司产品)再转化到大肠杆菌DH5α中，菌液检测后由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。

4.序列分析：相关核苷酸和氨基酸序列下载及DcABF3蛋白保守域预测在NCBI网站(http：//ncbi.nlm.nih.gov)中完成；氨基酸多序列比对由ClustalW(https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw)完成；采用MEGA 5.0软件(Tumara et al.，Mol BiolEvol，2011，28(10)：2731-2739)进行不同物种ABF转录因子的进化分析。

5.胡萝卜DcABF3基因转录水平分析：根据克隆所得胡萝卜DcABF3基因序列，设计荧光定量引物，正向引物序列为5’-CTCAGTTGACAAGCCTCGGAACAA-3’，反向引物序列为5’-CGCCTTCTCTCCACCACTTTCTC-3’。选用胡萝卜DcActin基因为内参基因(Wang et al.J HorticSci Biotechnol，2016，91(3)：264-270)，利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行荧光定量PCR操作。反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃20s，共40个循环；之后通过由65℃逐步升温至95℃获得熔解曲线。根据相对定量法计算胡萝卜DcABF3基因的相对表达量(Pfaffl，Nucleic Acid Res，2001，29(9)：e45)，数据分析在Excel 2013和SPSS软件中完成。

6.试验结果：1).测序结果表明DcABF3基因包含一个长度为1329bp的开放阅读框(ORF)，编码442个氨基酸。利用DcABF3基因编码的氨基酸序列进行保守域预测，结果显示胡萝卜DcABF3转录因子含有一个bZIP结构域，属于bZIP超级家族(图1)。2).将本发明获得的DcABF3基因编码的氨基酸序列与4个拟南芥ABF转录因子序列进行比对，发现胡萝卜DcABF3转录因子蛋白N-端具有3个保守基序C1、C2和C3，C-末端具有高度保守的bZIP结构域，且含有多个亮氨酸位点(图2)。3).进化分析结果表明，胡萝卜DcABF3蛋白与2个拟南芥ABF蛋白AtABF1和AtABF4进化关系最近，与禾本科作物亲缘关系较远；属于同一科的植物其ABF蛋白具有较近的亲缘关系。4).实时荧光定量PCR结果显示，胡萝卜DcABF3基因在不同逆境胁迫条件下均有响应。在低温条件下，DcABF3基因的表达先被上调，4h时下降，随后表达水平显著增加；高温胁迫下，DcABF3基因的表达量在处理后4h达到峰值，为处理前的56倍；在干旱处理下，DcABF3基因的表达同样表现出先升后降的趋势；经过高盐处理后2h和4h时，DcABF3基因的表达水平上调最为明显(图4)。

Claims (5)

1.一种从胡萝卜中获得的ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3。

2.权利要求1所述的ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3的核苷酸序列。

3.一种权利要求1所述源于胡萝卜的DcABF3基因的制备方法，具体包括以下步骤：

1)基于本实验室胡萝卜转录组测序结果，检索胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3核苷酸序列；

2)设计克隆引物，正向：5’-ATGGGGTCTTACATAAATTTCAAGA-3’，反向：5’-TCACCAAGGTCCGGTCAGGGTCCTT-3’，通过聚合酶扩增技术从胡萝卜品种‘黑田五寸’中克隆获得DcABF3基因。

4.权利要求1所述的胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3的功能研究：通过实时荧光定量PCR技术，测定胡萝卜DcABF3基因在不同逆境胁迫下的基因转录水平。

5.权利要求1所述的胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3在胡萝卜逆境调控中的应用。

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