CN104080915A

CN104080915A - 在遗传修饰的植物中使用酰基辅酶a结合蛋白增强干旱耐受性的方法

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Publication number: CN104080915A
Application number: CN201280053262.3A
Authority: CN
Inventors: 蔡美莲; 杜志严; 陈沫先
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: Versitech Ltd
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2032-11-05
Also published as: EP2773765B1; WO2013064119A1; CN104080915B; US20140182011A1; CA2854069A1; EP2773765A4; CA2854069C; EP2773765A1

Abstract

ACBP2可用于在遗传修饰的植物中增强干旱耐受性。观察到ACBP2在保卫细胞中表达，并且ACBP2过表达的转基因拟南芥被赋予增强的干旱耐受性。提供了用于赋予植物/植物材料干旱耐受性的载体/表达盒。提供了使用ACBP2增强植物的耐受性的方法。还提供了具有改善的干旱耐受性的植物和植物材料。也提供了用于筛选具有ACBP2样活性的基因的方法。

Description

在遗传修饰的植物中使用酰基辅酶A结合蛋白增强干旱耐受性的方法

相关申请的交叉引用

该申请要求享有2011年11月3日提交的U.S.S.N. 61/555,287的权益和优先权，其通过引用并入本文。

序列表的引用

序列表作为命名为“UHK_00404_ST25.txt”的文本文件提交于2012年11月2日，创建于2012年11月2日，并具有17,888字节大小，其由此通过引用并入。

发明领域

本公开一般涉及遗传修饰的植物和赋予植物干旱耐受性的载体。

发明背景

干旱胁迫是农业和人类最大的环境威胁之一。干旱是植物的主要胁迫并且当植物细胞中的总蒸腾速率超过水分摄取时它就会发生(Ingram和Bartels, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 47:377-403, (1996))。作物在开花期间对干旱尤为敏感，并且没有花则没有形成大多数作物的收获物的果实和种子（谷粒）。全球变暖进一步加剧了干旱相关的问题。因此，需要鉴定赋予干旱耐受性的基因，以产生具有改善的能力以在水分缺乏胁迫中存活的转基因植物（尤其是作物）。

本发明的目标是提供赋予转基因植物和植物材料干旱耐受性的载体。

本发明的目标还有提供具有增强的干旱耐受性的转基因植物和植物材料，及制备它们的方法。

本发明的仍另一目标是提供筛选赋予植物干旱耐受性的基因的方法。

发明概述

提供了具有改善的干旱耐受性的转基因植物和植物材料以及用于产生它们的载体。已经发现，相对于未修饰的植物，在植物中表达拟南芥（Arabidopsis thaliana）酰基辅酶A结合蛋白2(ACBP2)改善了干旱耐受性。还提供了其中表达ACBP2多肽的修饰植物的植物部分包括例如果实、叶、块茎、种子、花、茎、根以及所有其他解剖学部分。在具体的实施方案中，转化的植物是转基因的或转质体的（transplastomic）拟南芥、番茄、烟草、棉花、玉米和稻植物。在具体的非限制性实例中，可以通过在缺水的情况下存活至少15天的能力测定植物中的干旱耐受性。

用于在植物中改善干旱耐受性的植物转化载体包括编码ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述载体包含启动子（其可操作地连接编码ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或变体的序列），和终止子，和/或其他调节元件。启动子可以是组成型的、诱导型的或组织特异性的。在其他实施方案中，可以设计载体，以便其将在植物自身的内源启动子的控制下进行表达。所述载体可以编码作为操纵子的多于一个ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或变体。本文所述的载体包括植物质体转化载体或核转化载体。

还提供的是产生具有干旱耐受性的修饰的植物或植物细胞的方法。所述方法包括用本文所述的载体转化植物或植物细胞，所述载体包含编码ACBP2的多核苷酸。在一些实施方案中，核转化载体用于引起一个或多个ACBP2或其变体的表达，输送与拟南芥ACBP2多肽相似的干旱耐受性。在其他实施方案中，质体转化载体用于引起一个或多个ACBP2或其变体的表达，输送与拟南芥ACBP2多肽相似的干旱耐受性。此类核转化载体和质体转化载体可单独使用或彼此结合使用或与可以增强以其转化的植物的干旱耐受性的其他重组载体结合使用。

还提供的是用于筛选赋予植物干旱耐受性的ACBP2样序列或变体的方法。所述方法包括向在干旱条件下显示生长抑制的宿主细胞引入外源核酸，以形成测试细胞，其中生长抑制的解除表明赋予生长耐受性的ACBP2样能力。在一些实施方案中，在引入到宿主细胞之前将外源核酸突变。在其他实施方案中，所述外源核酸是编码ACBP2变体的合成核酸。

附图简述

图1A和1B显示了12天龄的拟南芥幼苗中ACBP2响应ABA（图1A）和干旱处理（图1B）的表达。图1A值是均值± SD。** P < 0.01, * P < 0.05, n =4。图1B值是均值± SD。** P < 0.01, n = 4。图1C显示了在有或无ABA(2 μM)处理的情况下在种子萌发过程中指示时间（小时）的ACBP2的表达。a，表明在0小时与H2O对照相比的显著差异；b，表明在相似时间的显著差异(P < 0.05, n = 5)。

图2A-2D显示了与野生型植物相比ACBP2-OXs对干旱处理的耐受性。图2A是显示与ACBP2-OX3和ACBP2-OX6相比Col-0的存活，和与Col-0相比acbp2的存活的柱形图。** P < 0.01, * P < 0.05。值为均值± SD (n = 4)。图2B是显示干旱处理15天后野生型（Col-0和Col-6）、acbp2突变体、ACBP2-OX3和ACBP2-OX6植物的存活的柱形图。** P < 0.01。值为均值± SD（n = 4，在四次实验的每一次中测试每一种基因型的30株植物）。图2C显示了ABA对野生型(Col-0)和ACBP2-OXs叶中气孔闭合的影响。图2D显示了ABA对野生型(Col-6)和acbp2突变体叶中气孔闭合的影响。棒（Bar）= 20 μm。值为均值± SD。星号表明统计学上的显著差异。** P < 0.01, * P < 0.05, n = 3（检查每一株系的30个保卫细胞并重复三次）。图2E-2F显示了与对照Col-0相比，在ABA缺失（图2E）和存在（图2F）的情况下ACBP2-OX3 和ACBP2-OX6的萌发率。值为均值± SD, n = 3。** P < 0.01, * P < 0.05。图2G显示了ABA处理后与对照相比，ACBP2-OX3 和ACBP2-OX6中的相对根长。** P < 0.01。值为均值± SD, n = 3（测定每种基因型50株幼苗并将实验重复3次）。图2H显示了与对照相比，acbp2突变体中100 µm或150 µm处理后的相对根长。** P < 0.05。值为均值± SD, n = 3（测定每种基因型50株幼苗并将实验重复3次）。

图3A是显示相对荧光强度的柱形图，所述相对荧光强度表明响应ACBP2的过表达，保卫细胞中ABA诱导的ROS产生(%)。野生型（Col-0，对照组）中的ROS产生等于100%。*P<0.05。图3B显示了与10 μm ABA孵育3天或没有与其孵育的5周龄野生型(Col-0)和ACBP2-OX (OX-3和OX-6)植物的离脱叶的离子渗漏。图3C显示了与10 μm ABA孵育3天或没有与其孵育的5周龄野生型(Col-6)和acbp2突变体的离脱叶的离子渗漏。

图4A和4B显示了转化载体pAT351和pAT353的限制性图谱。图4A显示了质粒pAT351。图4B显示了质粒pAT353。

图5A和5B显示了如通过使用5溴-4-氯-3-吲哚-b-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)进行组织化学GUS测定所证明的转基因拟南芥的叶（图5A）和保卫细胞（图5B）中的ACBP2pro:GUS表达，比例尺= 1 mm (图5A)和20 µm (图5B)。

图6A-6C是显示ACBP2的过表达对HAB1 (图6A)、AtrbohD (图6B)、AtrbohF. (图6C)、AREB1 (图6D)、RD29A (图6E)、ABI1 (图6F)、NCED3 (图6G)、ABA2 (图6H)、PLD α 1 (图6I)和RPK1 (图6J)的影响的柱形图。a表明与未处理野生型相比的显著差异；b表明与ABA处理野生型相比的显著差异(P < 0.05, n = 5)。

发明详述

表达酰基辅酶A结合蛋白ACBP2（本文通过拟南芥ACBP2蛋白示例）的遗传修饰的植物及其后代与未修饰的植物相比显示改善的干旱耐受性。因此，作物植物中ACBP2多肽的过表达可以帮助它们抵抗干旱胁迫并扩大栽培区域。

I.定义

“ACBP2”在本文中用于表示拟南芥酰基辅酶A结合蛋白2及其功能变体（如上下文表明的多核苷酸或多肽），其可以向其中表达它们的宿主输送改善的干旱耐受性。在具体的非限制性实例中，可以通过在缺水的情况下存活至少15天的能力测定植物中的干旱耐受性。

“ACBP2-OXs”在本文中用于表示过表达ACBP2多肽的转基因拟南芥。

如本文所用的“ACBP2样多肽”包括与向宿主细胞输送改善的干旱耐受性的ACBP2具有至少77%序列同一性的多肽，包括下文所述的ACBP2变体。

如本文所用的ACBP2样多肽、ACBP2变体和ACBP2同系物指像ACBP2一样，多肽可以下调ABA介导的干旱调节蛋白的负调节物（例如，HAB1）并上调正调节物（像AtrbohD和AtrbohF）。

如与DNA序列相关的“化学合成的”表示组分核苷酸在体外进行装配。

如本文所用的“构建体”指重组核酸，一般是重组DNA，已产生其用于表达一种或多种特定核苷酸序列的目的，或待用于其他重组核苷酸序列的构建中。

“子叶”指幼苗的胚第一叶。

“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”在本文中互换使用，指转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等，其在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码多肽的产生。

如本文所用的“内源核酸”指在自然界中通常发现于给定的细菌、生物或细胞和/或通过其产生的核酸。“内源核酸”还指“天然核酸”或对给定的细菌、生物或细胞是“天然的”的核酸。

如本文所用的“外源核酸”指在自然界中不通常或天然发现于给定的细菌、生物或细胞和/或通过其产生的核酸。

如本文所用，“异源核酸”指这样的核酸，其中下列中的至少一项是正确的：(a)所述核酸在给定的宿主微生物或宿主细胞中是外来的（“外源的”，即非天然发现的）；(b)所述核酸包含天然发现于给定的宿主微生物或宿主细胞的例如对其是“内源的”核苷酸序列（例如，该核酸包含对宿主微生物或宿主细胞内源的核苷酸序列）；然而，在异源核酸的背景中，内源发现的相同的核苷酸序列以非天然（例如，高于预期或高于天然发现）的量产生于细胞中，或包含在序列上不同于内源核苷酸序列的核苷酸序列但编码内源发现的相同的蛋白质（具有相同的或基本上相同的氨基酸序列）的核酸以非天然（例如高于预期或高于天然发现的）量产生于细胞中；(c)所述核酸包含两条或多条核苷酸序列，所述核苷酸序列在自然界中未发现其彼此处于相同的关系中，例如该核酸是重组体。异源核酸的实例是可操作地连接转录控制元件（例如5启动子）的编码ACBP2的核苷酸序列，内源（天然发生的）ACBP2编码序列通常并不可操作地连接所述转录控制元件。异源核酸的另一实例是高拷贝数的质粒，其包含编码ACBP2的核苷酸序列。异源核酸的另一实例是编码ACBP2的核酸，其中利用编码ACBP2的核酸遗传修饰了通常不产生ACBP2的宿主细胞；因为编码ACBP2的核酸并不天然发现于宿主细胞中，所以该核酸对遗传修饰的宿主细胞而言是异源的。

如本文所用，“宿主细胞”表示体内或体外的真核细胞、原核细胞或来自作为单细胞实体培养的多细胞生物（例如，细胞系）的细胞，所述真核细胞或原核细胞可以是或已经用作核酸的受体（例如，包含编码一个或多个基因产物如ACBPs的核苷酸序列的表达载体），并且包括已经被核酸遗传修饰的原始细胞的后代。应理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，单个细胞的后代在形态学或基因组或总DNA互补物上可以不必与原始亲本完全相同。“重组宿主细胞”（也称为“遗传修饰的宿主细胞”）是已经向其中引入异源核酸，例如表达载体的宿主细胞。

“分离的”意在描述处于不同于多核苷酸、多肽或细胞天然发生的环境中的多核苷酸、多肽或细胞。分离的遗传修饰的宿主细胞可以存在于遗传修饰的宿主细胞的混合群体中。

如本文所用的应用于核酸、细胞或生物的“天然发生的”或“天然的”指自然界中发现的核酸、细胞或生物。例如，存在于可以从自然界来源中分离的生物（包括病毒）中并且并非在实验室中有意人为修饰的多肽或多核苷酸序列是天然发生的，并且“野生型”植物是天然发生的。

如本文所用的“修饰的植物或植物部分”指植物或植物部分，无论其附着到整株植物还是与整株植物分离。它还包括修饰的植物或植物部分的后代，其通过有性生殖或无性生殖而产生。

“可操作地连接”指这样的并置（juxtaposition），其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的联系中。例如，如果启动子影响其转录或表达，那么该启动子可操作地连接编码序列。

“操纵子”和“单一转录单位”在本文中互换使用，指两个或多个邻接的编码区（编码基因产物，如RNA或蛋白质的核苷酸序列），其受一个或多个控制元件（例如，启动子）的协同调节。如本文所用，术语“基因产物”指DNA编码的RNA(反之亦然)或RNA或DNA编码的蛋白质，其中基因通常将包含编码蛋白质的一条或多条核苷酸序列，并且还可以包括内含子和其他非编码核苷酸序列。

“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码的和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的肽骨架的多肽。

多肽或多核苷酸与另一多核苷酸或多肽的百分比“序列同一性”表示，当比较两条序列进行比对时，碱基或氨基酸是相同的并且在相同的相对位置上的百分比。

“植物细胞培养物”指以下植物单位的培养物，如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和处于发育多个阶段的胚。

“植物材料”指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物。

“植物组织”指组织成结构和功能单位的植物细胞组。包括植物的任何组织，无论是植物中的还是培养物中的。该术语包括，但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与如上文列出的或该定义另外包括的植物组织的任何具体类型结合使用或在缺少所述植物组织的任何具体类型的情况下使用并不旨在排除植物组织的任何其他类型。

“多核苷酸”和“核酸”在本文中互换使用，并且指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于，单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

“后代”包括起源于亲本的后代的直接世代和所有后续世代。

如本文所用，“重组体”表示特定核酸（DNA或RNA）是克隆、限制性酶切和/或连接步骤的多种组合产生具有区分于自然系统中发现的内源核酸的结构性编码或非编码序列的构建体的产物。一般地，编码所述结构性编码序列的DNA序列可以从cDNA片段和短寡核苷酸接头或从一系列合成的寡核苷酸进行装配，以提供合成的核酸，其能够从细胞或无细胞转录和翻译系统中含有的重组转录单位进行表达。可以以内在非翻译序列或内含子（其通常存在于真核基因中）不间断的可读框形式提供此类序列。包含相关序列的基因组DNA也可以用于形成重组基因或转录单位。非翻译DNA的序列可以存在于可读框的5'或3'，其中此类序列不干扰编码区的操作或表达，并且的确通过多种机制作用于调节产生期望的产物（参见“DNA调节序列”，下文）。因此，例如，术语“重组”多核苷酸或核酸指这样的多核苷酸或核酸，其是非天然发生的，例如通过人工干预人工组合序列的两个另外分离的区段来制备。该人工组合经常通过化学合成手段，或通过人工操作核酸的分离区段，例如通过遗传改造技术来完成。一般完成此类人工组合以利用编码相同或保守氨基酸的冗余密码子替换密码子，同时通常引入或去除序列识别位点。或者，进行它来将具有期望的功能的核酸区段连接起来，以产生期望的功能组合。

“转化”或“转化的”与“遗传修饰”或“遗传修饰的”在本文中互换使用并且指引入新的核酸（即，对细胞而言外源的DNA）后在细胞中诱导的持久的或瞬时的遗传改变。遗传改变（“修饰”）可以通过将新的DNA掺入到宿主细胞的基因组中，或通过瞬时或稳定维持新的DNA作为游离元件来完成。当细胞是真核细胞时，持久的遗传改变一般通过向细胞的基因组或细胞的原质体系中引入DNA来完成。在原核细胞中，持久的改变可以引入染色体中或通过染色体外元件，如质粒、质体和表达载体，其可以含有一种或多种可选标记物，以帮助它们在重组宿主细胞中进行维持。

“转化载体”和“表达盒”在本文中互换使用。

“合成的核酸”可以装配自寡核苷酸结构单元，其为使用本领域技术人员已知的程序化学合成的。将这些结构单元连接并退火，以形成基因区段，其然后经酶促装配来构建完整基因。

如本文所用的“变体”指ACBP2天然发生的遗传突变体或ACBP2重组制备的变异，其每一种在其DNA中均含有一个或多个突变。术语“变体”还可以指给定肽的天然发生的变异或给定肽或蛋白质的重组制备的变异，其中已经通过氨基酸取代、添加或缺失修饰了一个或多个氨基酸残基。

II. 赋予干旱抗性的载体

在拟南芥中，已经鉴定了酰基辅酶A结合蛋白(ACBPs)的共6种形式并且命名为ACBP1-ACBP6 (Xiao,等, Plant J., 54:141-151 (2008))，其在10-73.1 kD范围内(Leung,等, Plant Mol Biol., 55:297-309 (2004))。膜结合ACBP1和ACBP2亚细胞定位于ER和质膜上 (Chye,等, Plant J., 18:205-214 (1999); Li和Chye, Plant Mol Biol., 51:483-492 (2003))，ACBP3靶向细胞外(Leung,等, Planta, 223:871-881 (2006))，并且含有kelch-基序的ACBP4和ACBP5 (Leung,等, Plant Mol Biol., 55:297-309 (2004))，以及ACBP6 定位于细胞溶胶中(Chen等, Plant Physiol., 148: 304-315, 2008)。可能介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域锚蛋白重复序列(ACBP1和ACBP2) 以及kelch基序(ACBP4和ACBP5) (Leung等, Plant Mol Biol., 55: 297-309, 2004; Li和Chye, Plant Mol Biol., 54: 233-243, 2004)在较大的ACBPs中是明显的。拟南芥ACBPs已经涉及多种胁迫响应，如冰冻(Chen等, Plant Physiol., 148:304-315 (2008); Du等, Plant Physiol., 152:1585-1597 (2010))和病原体抗性(Xiao和Chye, Plant Physiol., 156:2069-2081 (2011))。本文所述的实施例显示，ACBP2的过表达在植物中赋予干旱耐受性。

本文提供的植物转化载体/表达盒包括编码ACBP2多肽或其ACBP2功能变体的核酸序列。所述载体还可以任选地包括启动子（其可操作地连接编码序列）和终止子，和/或其他调节元件。在其他实施方案中，可以设计载体以引入异源多肽，以便其将在植物自身内源启动子的控制下进行表达。植物转化载体优选包括一个或多个转录起始或转录控制区、目的蛋白质的编码区，和转录终止区。转录控制区包括在遗传修饰的宿主细胞中提供目的蛋白质过表达的那些；提供可诱导表达的那些，以便当向培养基中加入诱导剂时，目的蛋白质的编码区的转录被诱导或增加至比诱导前更高的水平。

在一个实施方案中，构建体含有以 5'-3'方向可操作地连接的启动子；编码ACBP2或ACBP2的功能变体或片段的一条或多条核酸序列；和3'多腺苷酸化信号。在其中构建体含有表达为操纵子的多于一个ACBP2或其ACBP2功能变体的实施方案中，核苷酸序列可以可操作地连接相同的启动子。或者，所述核苷酸序列可以处于不同启动子的控制之下。

可获得若干植物转化载体选项，包括在"Gene Transfer to Plants" (Potrykus,等,编辑) Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York (1995); "Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins" (Owen,等,编辑) John Wiley & Sons Ltd. England (1996);和"Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual" (Maliga,等编辑) Cold Spring Laboratory Press, New York (1995)中描述的那些。植物转化载体一般包括在5'和3'调节序列（包括启动子、转录终止和/或多腺苷酸化信号和可选择或可筛选标记基因）的转录控制之下的一条或多条目的编码序列。对于来自单个转录物的一个或多个多肽的表达，可以将额外的RNA加工信号和核酶序列改造到构建体中（美国专利号5,519,164）。该方法具有将多个转基因定位在单个基因座中的优势，这在随后的植物育种工作中是有利的。

对于转基因从质体基因组的直接表达，使用通过同源重组转化植物质体染色体的载体，在该情况下利用质体基因组的原核性质并插入许多转基因作为操纵子是可能的。实例描述-McBride等的于美国专利号5,545,818中。WO 2010/061186描述了使用用于将RNA从细胞质转移到质体（其中通过同源重组掺入所述RNA）中的适合的内源细胞过程将基因引入质体染色体的可选方法。该质体转化方法也适合于实践所公开的组合物和方法。

A. ACBP2

用于本文所述载体中的ACBP2基因包括天然发生的ACBP2。天然发生的ACBP2为本领域所知。ACBP2序列见于GenBank/EMBL数据库的检索号NM_118916 (ACBP2)下。

用于赋予植物干旱抗性的其他基因包括ACPB2的变体。在一些实施方案中，所述变体是合成的核酸。优选地，所述变体相对于拟南芥ACBP2包括少于25、少于20、少于15、少于10、少于5、少于4、少于3或少于2个氨基酸取代、重排、插入和/或缺失。在此方面，术语“变体”可以包括拟南芥ACBP2的片段、衍生物和同系物。所述ACBP2同系物优选是与ACBP2具有至少77%的DNA同源性的ACBP2样序列，其可以在野生型中从其自身的启动子在保卫细胞中表达并且当在转基因植物中过表达时，像ACBP2一样，其下调HAB1并上调AtrbohD和AtrbohF。更优选地，所述变体包括与拟南芥ACBP2具有至少90%氨基酸序列同一性的肽序列。

可以使用本领域已知的方法确定序列相似性。例如，确定序列同一性，可以使用在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的万维网（world wide web）上可获得的方法和计算机程序，包括BLAST比对序列。参见，例如Altschul，等J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。另一比对算法是可在来自Madison, Wis., USA的Oxford Molecular Group, Inc完全拥有的子公司的Genetics Computing Group (GCG)程序包中获得的FASTA。用于比对的其他技术描述于 Methods in Enzymology, 266 卷: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996),编辑Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., USA。特别感兴趣的是在序列中允许缺口的比对程序。Smith-Waterman是在序列比对中允许缺口的算法的一种类型。Meth. Mol. Biol., 70: 173-187 (1997)。同样，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)。

在其他实施方案中，ACBP2的变体是从如本文所述的宿主细胞中分离的突变体。在仍其他实施方案中，变体ACBP2由在严格条件下与编码拟南芥ACBP2或另一已知ACBP2的核酸杂交的核酸所编码。

B.启动子

用于表达载体中的启动子的选择决定了转基因在转基因植物中的时空表达模式。启动子在其强度上，即在促进转录的能力上可以变化。所选启动子在具体细胞类型（如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞）或具体组织或器官（例如根、叶或花）中表达转基因并且该选择反映了基因产物积累的期望定位。或者，所选启动子驱动基因在多种诱导条件下的表达。

1. 组成型启动子

用于核编码表达的合适的组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CAMV 35S启动子(Odell,等, Nature 313:810-812 (1985))；稻肌动蛋白(McElroy,等, Plant Cell 2:163-171 (1990),)；泛素(Christensen,等, Plant Mol. Biol., 12:619-632 (1989) 和Christensen,等, Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992))；pEMU (Last,等, Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991))；MAS (Velten,等, EMBO J., 3:2723-2730 (1984)); 和ALS启动子(美国专利号5,659,026)。其他组成型启动子包括例如，美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142。

2. 组织特异性启动子

“组织优选的”启动子可以用于将基因表达靶定在特定组织，如种子、叶或根组织内。组织优选的启动子描述于Yamamoto,等, Plant J. 12(2)255-265 (1997); Kawamata,等, Plant Cell Physiol. 38(7):792-803 (1997); Hansen,等, Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343 (1997); Russell,等, Transgenic Res. 6(2):157-168 (1997); Rinehart,等, Plant Physiol. 112(3):1331-1341 (1996); Van Camp,等, Plant Physiol. 112(2):525-535 (1996); Canevascini,等, Plant Physiol. 112(2):513-524 (1996); Yamamoto,等, Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 (1994); Lam, Results Probl. Cell Differ. 20:181-196 (1994); Orozco,等, Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 (1993); Matsuoka,等, Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 (1993);和Guevara-Garcia,等, Plant J. 4(3):495-505 (1993)中。合适的组织特异性表达模式包括绿色组织特异性的、根特异性的、茎特异性的和花特异性的。

适合于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基因的许多启动子和已经从单子叶植物和双子叶植物中克隆的许多启动子。叶特异性启动子为本领域所已知。参见例如Yamamoto,等, Plant J. 12(2):255-265 (1997); Kwon,等, Plant Physiol. 105:357-67 (1994); Yamamoto,等 Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 (1994); Gotor,等 Plant J. 3:509-18 (1993); Orozco,等, Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 (1993);和Matsuoka,等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 (1993)。另一实例是来自磷酸烯醇式（phosphoenol）羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth和Grula, Plant Molec.Biol. 12: 579-589 (1989))，并且启动子包括编码rbsC的那些启动子(Coruzzi等, EMBO J., 3:1671-1697 (1984))。

根优选的启动子是已知的并且可以选自可从文献中获得的或从多种相容(compatible)物种中从头分离的许多启动子。参见例如，Hire等Plant Mol. Biol. 20(2): 207-218 (1992)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner, Plant Cell, 3(10):1051-1061 (1991) (菜豆（French bean）的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等, Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (1990) (根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等, Plant Cell, 3(1):l 1'-22 (1991) (编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；5,023,179和7,285,656。用于根特异性表达的合适的启动子是de Framond FEBS 290: 103-106 (1991); de Framond的EP 0 452 269描述的那种启动子并且根特异性启动子是来自T-1基因的那种启动子。SAHH或SHMT (Sivanandan等, Biochimica et Biophysica Acta, 1731:202-208, 2005)对根特异性的表达是特异性的。同样，已经报道花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子在其启动子区具有根特异性的和叶特异性的组件(Benfey等, EMBO J., 8:2195-2202, 1989)。其他组织特异性的启动子是众所周知的并且对本领域的普通技术人员而言是广泛可得的。

合适的茎特异性启动子是描述于美国专利号5,625,136中并且驱动玉米trpA基因表达的那种启动子。

质体特异性的启动子包括PrbcL启动子[Allison,等, EMBO J. 15:2802-2809 (1996); Shiina,等, Plant Cell, 10: 1713-1722 (1998)]；PpsbA启动子[Agrawal,等, Nucleic Acids Research, 29: 1835-1843 (2001)]；Prrn 16 启动子[Svab和Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), Allison,等, EMBO 15: 2802-2809 (1996)]；PaccD启动子(WO97/06250; Hajdukiewicz,等, EMBO J. 16: 4041–4048 (1997))。

3. 诱导型启动子

诱导型启动子，例如化学品调节的启动子可以用于通过应用外源化学品调节剂调节在植物中基因的表达。根据目标，启动子可以是化学品诱导型启动子，其中化学品的应用诱导基因表达，或化学品抑制型启动子，其中化学品的应用抑制基因表达。此外，广泛的诱导型启动子也是众所周知的并且对本领域的普通技术人员而言是广泛可得的。已经充分地综述了成功用于植物中的诱导型启动子系统(Padidam, Curr. Opin. Plant Biol. 6:169 (2003); Wang,等 Trans. Res.:12, 529 (2003); Gatz和Lenk, Trends Plant Sci. 3:352 (1998))。这些诱导型系统可以被化学品，如四环素、原始霉素、病原体、光、糖皮质激素、雌激素、铜、除草剂安全剂、乙醇、IPTG（异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷）和病原体激活。

有用的化学品诱导型启动子包括但不限于，被苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米1n2-2启动子、被用作萌发前除草剂（pre-emergent herbicides）的疏水性亲电化合物激活的玉米GST启动子，和被水杨酸激活的烟草PR-1启动子。其他化学品调节的目的启动子包括类固醇响应的启动子（参见例如，Schena,等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10421-10425 (1991)和McNellis,等 Plant J., 14(2):247-257(1998)中的糖皮质激素诱导型启动子）和四环素诱导型以及四环素抑制型启动子（参见例如Gatz,等, Mol. Gen. Genet. 227:229-237 (1991),和美国专利号5,814,618和5,789,156），以其整体通过引用并入本文。

诱导型启动子的另一合适种类是创伤诱导的启动子。已经描述了在创伤部位上表达的许多启动子。该类型的优选启动子包括Stanford,等, Mol.Gen.Genet.215:200-208 (1989), Xu,等, Plant Molec.Biol., 22:573-588 (1993), Logemann,等, Plant Cell, 1:151-158 (1989), Rohrmeier和Lehle, Plant Molec.Biol., 22:783-792 (1993), Firek,等, Plant Molec.Biol., 22:129-142 (1993),和Warner,等, Plant J., 3:191-201 (1993)中描述的那些启动子。

C. 转录终止子

可获得多种转录终止子用于表达盒中。这些启动子负责转基因以外的转录终止及其正确的多腺苷酸化。因此，在转基因转录物的3’最末端，可以改造多腺苷酸化信号。多腺苷酸化信号指可以在将mRNA输出到细胞溶胶之前在核中导致mRNA多腺苷酸化的任何序列，如胭脂碱合酶的3’区(Bevan,等 Nucleic Acids Res., 11:369-385 (1983)。其他转录终止子是已知在植物中发挥功能的那些终止子并且包括CaMV 35S终止子、tm1终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。这些启动子用于单子叶植物和双子叶植物中。

D. 用于增强或调节表达的序列

已经发现许多序列增强转录单位内的基因表达并且这些序列可以用于与基因结合以增加其在转基因植物中的表达。例如，已经显示多种内含子序列，如玉米Adh1基因的内含子增强表达，特别是在单子叶植物细胞中。此外，也已知来源于病毒的许多非翻译前导序列增强表达，并且这些前导序列在双子叶植物细胞中特别有效。

E. 编码序列优化

可以通过改变编码序列来遗传改造所选基因的编码序列，用于在目的作物物种中增加表达或优化表达。用于修饰编码序列以实现在特定作物物种中的优化表达的方法是众所周知的（参见例如Perlak,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3324 (1991)；和Koziel ,等, Biotechnol. 11: 194 (1993)）。

F. 靶向序列

所公开的载体在编码待表达的蛋白质的区域内可以进一步包括编码靶向序列的一条或多条核苷酸序列。“靶向”序列是编码氨基酸序列或基序的核苷酸序列，所述氨基酸序列或基序指导所编码的蛋白质到达特定的细胞区室，导致蛋白质的定域化（localization）或区室化。蛋白质中靶向氨基酸序列的存在通常导致靶蛋白的全部或部分易位通过细胞器膜并进入细胞器内部。或者，靶向肽可以指导靶蛋白保持包埋在细胞器膜中。靶蛋白的“靶向”序列或区域可以含有邻接氨基酸串或非邻接氨基酸组。可以选择靶向序列以指导靶蛋白达到植物细胞器，如核、微体（例如过氧化物酶体或其专门化形式，如乙醛酸循环体）、内质网、内体、液泡、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体或质体中。

叶绿体靶向序列是可以将蛋白质靶向叶绿体或质体的任何肽序列，如苜蓿核酮糖-二磷酸羧化酶小亚基的转移肽(Khoudi,等, Gene, 197:343-351 (1997))。

过氧化物酶体靶向序列指N末端、内部或C末端的任何肽序列，其可以将蛋白质靶向过氧化物酶体，如植物C末端靶向三肽SKL (Banjoko和Trelease, ,Plant Physiol., 107:1201-1208 (1995); Wallace,等, “Plant Organellular Targeting Sequences,” Plant Molecular Biology, Ed. R. Croy, BIOS Scientific Publishers Limited (1993) 第287-288页, 并且植物中的过氧化物靶向显示于Volokita, The Plant J., 361-366 (1991))。

质体靶向序列为本领域所知并且包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等 Plant Mol. Biol. 30:769-780 (1996); Schnell等 J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342 (1991))；5-(烯醇式丙酮酸)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (Archer,等, J. Bioenerg. Biomemb., 22(6):789-810 (1990))；色氨酸合酶(Zhao等,, J. Biol. Chem., 270(11):6081-6087 (1995))；质体蓝素(Lawrence,等, J. Biol. Chem., 272(33):20357-20363 (1997))；分支酸合酶(Schmidt,等, J. Biol. Chem., 268(36):27447-27457 (1993))；和捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP) (Lamppa,等, J. Biol. Chem., 263:14996-14999 (1988))。还参见Von Heijne,等, Plant Mol. Biol. Rep., 9:104-126 (1991); Clark,等, J. Biol. Chem. 264:17544-17550 (1989); Della-Cioppa等 Plant Physiol. 84:965-968 (1987); Romer等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 (1993);和Shah等 Science, 233:478-481 (1986)。还已经在下文中描述了可选质体靶向信号：US 2008/0263728; Miras,等 J Biol Chem, 277(49) (2002): 47770-8 (2002); Miras,等, J Biol Chem, 282: 29482-29492 (2007)。

G. 可选标记

本文所述的表达盒可以编码可选标记，以能够选择转化事件。存在已经描述用于选择转化植物的许多方法[对于综述参见(Miki,等, Journal of Biotechnology, 107:193-232 (2004))及其中并入的参考文献]。已经广泛用于植物中的可选标记基因包括新霉素磷酸转移酶基因nptII (美国专利号5,034,322, U.S. 5,530,196)、潮霉素抗性基因(美国专利号5,668,298)、编码针对草胺膦的抗性的bar基因(美国专利号5,276,268)、氨基葡糖苷3”-腺苷转移酶(aadA)的表达赋予壮观霉素抗性(美国专利号5,073,675)、抑制抗性 5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶的使用(美国专利号4,535,060)和用于产生草甘膦耐受植物的方法(美国专利号5,463,175；美国专利号7,045,684)。先前已经描述了不使用抗生素或除草剂作为选择剂的植物选择方法，并且其包括表达葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，以在植物选择培养基(美国专利号6,444,878)和利用D-氨基酸的正向/反向系统(Erikson,等, Nat Biotechnol, 22:455-8 (2004))中失活葡糖胺。欧洲专利公开号EP 0 530 129描述了正向选择系统，其通过表达转基因（其编码激活向生长培养基中加入的失活化合物的酶）使得所转化的植物生长能够超过未转化的株系。美国专利号5,767,378描述了甘露糖或木糖用于正向选择转基因植物的用途。还已经描述了使用山梨醇脱氢酶将山梨醇转化成果糖用于植物生长的正向选择方法(WO 2010/102293)。可筛选标记基因包括β-葡糖苷酸酶基因(Jefferson,等, EMBO J., 6:3901-3907 (1987)；美国专利号5,268,463)和天然的或修饰的绿色荧光蛋白基因(Cubitt,等, Trends Biochem. Sci. 20: 448-455 (1995); Pan,等, Plant Physiol., 112: 893-900 (1996)。

也可以通过荧光蛋白，如来自非生物发光珊瑚（Anthozoa）物种的荧光蛋白（包括DsRed，其为来自珊瑚的香菇珊瑚（Discosoma）属的红色荧光蛋白(Matz,等, Nat Biotechnol, 17:969-73 (1999))）的可视化来选择转化事件。已经开发了DsRed蛋白的改进形式 (Bevis和Glick, Nat Biotech, 20:83-87 (2002))用于减少蛋白质的聚集。也可以利用黄色荧光蛋白(YFP)，包括具有加速的信号成熟的变体(Nagai,等, Nat Biotech., 20:87-90 (2002))、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白，和绿色荧光蛋白(Sheen,等, Plant J, 8:777-84 (1995); Davis和Vierstra, Plant Molecular Biology, 36:521-528 (1998))来进行可视筛选。荧光蛋白的概述可以见于Tzfira等 (Tzfira,等, Plant Molecular Biology, 57:503-516 (2005))以及Verkhusha和Lukyanov Nat Biotech, 22:289-296 (2004))，其参考文献以整体并入。已经产生许多荧光蛋白的改进形式用于多种应用。这些蛋白质的改进形式或这些蛋白质的组合用于选择转化体的用途对本领域技术人员而言是显而易见的。简单地分析转化事件的后代中PHB的存在由此避免使用任何可选标记物也是可行的。

对于质体转化构建体，优选的可选标记物是质体16S核糖体RNA基因的壮观霉素抗性等位基因 (Staub和Maliga, Plant Cell, 4:39-45 (1992); Svab,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8526-8530 (1990))。自此以后成功用于质体转化的可选标记物包括编码赋予壮观霉素和链霉素抗性的氨基糖苷3’-腺苷转移酶(AadA)的细菌aadA基因(Svab,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-917 (1993))、编码用于在卡那霉素上选择的氨基糖苷磷酸转移酶的nptII (Carrer,等, Mol. Gen. Genet., 241:49-56 (1993); Lutz,等, Plant J., 37: 906-913 (2004); Lutz,等, Plant Physiol., 145:1201-1210 (2007))、另一氨基糖苷磷酸转移酶aphA6(Huang,等, Mol. Genet. Genomics, 268: 19-27 (2002))和氯霉素乙酰转移酶(Li,等 Plant Mol Biol, 76(5-6):443-451 (2010))。已经报道了另一选择方案，其使用能够将有毒的甜菜醛转化成无毒的甜菜碱的嵌合甜菜醛脱氢酶基因(BADH)(Daniell,等, Curr. Genet., 39: 109-116 (2001))。

III. 植物/植物材料

可以改造广泛的植物和植物细胞系统，以表达ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或变体。因此可获得植物材料，如叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物，因此遗传修饰的植物材料显示改善的干旱耐受性。

遗传修饰的植物或植物材料包含编码ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或变体的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述遗传修饰的植物/植物材料包含编码两个或多个ACBP2s的两条核苷酸序列，其每一条可以包含在单独的表达载体上，或在共同启动子控制下的单个表达载体上。

在优选的实施方案中，用于改造的靶植物和植物细胞包括单子叶植物和双子叶植物，如作物，包括谷类作物（例如，小麦、玉米、稻、黍、大麦）、烟草、水果作物（例如，番茄、草莓、橙子、葡萄柚、香蕉）、饲料作物（例如，苜蓿）、根菜类蔬菜作物（例如，胡萝卜、马铃薯、甘蔗、甘薯）、叶菜类蔬菜作物（例如，莴苣、菠菜）；显花植物（例如，牵牛花、玫瑰、菊花）、针叶树和松树（例如，松杉、云杉）；油料作物（例如，向日葵、油菜籽）；和用于实验目的的植物（例如，拟南芥）。其他实例包括通常在多于约10株植物的组中种植的植物，以获得完整植物或植物的部分，例如果实、花，或作物，例如，烟草、植物生产的谷物等，树（即，果树、种植用于木材生产的树、种植用于装饰的树等）、任何类型的花（即，例如收获后为装饰目的种植的植物）、仙人掌。其中可以表达ACBP2s的植物的其他实例包括绿色植物（Viridiplantae）、链形植物（Streptophyta）、有胚植物（Embryophyta）、维管植物（Tracheophyta）、真叶植物（Euphyllophytes）、种子植物（Spermatophyta）、木兰植物（Magnoliophyta）、百合纲（Liliopsida）、鸭跖草亚纲（Commelinidae）、禾本目（Poales）、禾本科（Poaceae）、稻属（Oryza）、水稻（Oryza sativa）、玉米属（Zea）、玉米（Zea mays）、大麦属（Hordeum）、大麦（Hordeum vulgare）、小麦属（Triticum）、小麦（Triticum aestivum）、真双子叶植物（Eudicotyledons）、核心真双子叶植物（Core eudicots）、菊亚纲（Asteridae）、类真菊分支（Euasterids）、蔷薇亚纲（Rosidae）、类真蔷薇分支II（Eurosids II）、十字花目（Brassicales）、十字花科（Brassicaceae）、拟南芥、木兰纲（Magnoliopsida）、Solananae、茄目（Solanales）、茄科（Solanaceae）、茄属（Solanum）和烟草（Nicotiana）。可以使用本文所述的载体转化的另外的植物包括，但不限于来自以下属的物种：腰果属（Anacardium）、落花生属（Arachis）、天门冬属（Asparagus）、颠茄属（Atropa）、燕麦属（Avena）、芸苔属（Brassica）、柑橘属（Citrus）、西瓜属（Citrullus）、辣椒属（Capsicum）、红花属（Carthamus）、椰子属（Cocos）、咖啡属（Coffea）、黄瓜属（Cucumis）、南瓜属（Cucurbita）、胡萝卜属（Daucus）、油棕属（Elaeis）、草莓属（Fragaria）、大豆属（Glycine）、棉属（Gossypium）、向日葵属（Helianthus）、萱草属（Heterocallis）、大麦属（Hordeum）、天仙子属（Hyoscyamus）、莴苣属（Lactuca）、亚麻属（Linum）、黑麦草属（Lolium）、羽扇豆属（Lupinus）、番茄属（Lycopersicon）、苹果属（Malus）、木薯属（Manihot）、Majorana、苜蓿属（Medicago）、烟草属（Nicotiana）、木犀榄属（Olea）、稻属（Oryza）、Panieum、Panneserum、鳄梨属（Persea）、菜豆属（Phaseolus）、Pistachia、豌豆属（Pisum）、梨属（Pyrus）、李属（Prunus）、萝卜属（Raphanus）、蓖麻属（Ricinus）、黑麦属（Secale）、千里光属（Senecio）、白芥属（Sinapis）、茄属（Solanum）、高粱属（Sorghum）、可可树属（Theobromus）、胡芦巴属（Trigonella）、小麦属（Titicum）、野豌豆属（Vicia）、葡萄属（Vitis）、豇豆属（Vigna）、和玉米属（Zea）。

IV. 用于产生干旱抗性植物/植物细胞的方法

可以通过将表达如本文所述的ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或变体的一个或多个载体改造到多种植物细胞类型，包括但不限于原生质体、组织培养细胞、组织和器官外植体、花粉、胚以及整株植物中来获得本文所述的植物和植物细胞/材料。

转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据靶向转化的植物或植物细胞的类型而变化。将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway,等, Biotechniques, 4:320-334 (1986))、电穿孔(Riggs,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606 (1986))、农杆菌介导的转化(Townsend,等,美国专利号5,563,055; Horsch,等, Science, 227: 1227-1231 (1985))、直接基因转移(Paszkowski,等 EMBO J., 3:2717-2722 (1984))和弹道粒子加速（ballistic particle acceleration）(参见例如，Sanford等, 美国专利号4,945,050;Tomes,等, Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, 编辑Gamborg和Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995);和McCabe,等, Biotechnology 6:923-926 (1988))。还参见Weissinger,等 Ann. Rev. Genet., 22:421-477 (1988); Sanford,等, Particulate Science and Technology, 5:27-37 (1987) (洋葱); Christou,等, Plant Physiol., 87:671-674 (1988) (大豆); McCabe,等, BioTechnology, 6:923-926 (1988) (大豆); Finer和McMullen, In Vitro Cell Dev. Biol., 27P:175-182 (1991) (大豆); Singh,等, Theor. Appl. Genet., 96:319-324 (1998)(大豆); Dafta,等, Biotechnology, 8:736-740 (1990) (稻); Klein,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (玉米); Klein,等, Biotechnology, 6:559-563 (1988) (玉米); Tomes, 美国专利号5,240,855; Buising,等, 美国专利号5,322,783和5,324,646; Tomes,等 (1995) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, 编辑Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (玉米); Klein,等, Plant Physiol., 91:440-444 (1988) (玉米); Fromm,等, Biotechnology, 8:833-839 (1990) (玉米); Hooykaas-Van Slogteren,等, Nature, 311:763-764 (1984); Bowen,等, 美国专利号5,736,369 (谷类); Bytebier,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349 (1987) (百合科); De Wet,等 The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, 编辑 Chapman等 (Longman, N.Y.), 第197-209页 (1985) (花粉); Kaeppler等 Plant Cell Reports 9:415-418 (1990)和Kaeppler,等, Theor. Appl. Genet., 84:560-566 (1992) (颈须（whisker）介导的转化); D’Halluin,等, Plant Cell,, 4:1495-1505 (1992) (电穿孔); Li,等, Plant Cell Reports, 12:250-255 (1993); Christou和Ford, Annals of Botany, 75:407-413 (1995) (稻); Osjoda,等, Nature Biotechnology, 14:745-750 (1996) (通过根癌农杆菌转化玉米)；其全部以其整体通过引用并入本文。

Agrisoma技术的原生质体转化和/或基因枪方法描述于WO 2010/037209中。可获得用于转化植物原生质体的方法，包括使用聚乙二醇(PEG)的转化、电穿孔和磷酸钙沉淀（参见例如Potrykus,等, Mol. Gen. Genet., 199:183-188 (1985); Potrykus,等, Plant Molecular Biology Reporter, 3:117-128 (1985)）。也已经描述了用于从原生质体再生植物的方法 [Evans等, 在Handbook of Plant Cell Culture, 卷1中, (Macmillan Publishing Co., New York, 1983); Vasil, IK 在Cell Culture and Somatic Cell Genetics中 (Academic, Orlando, 1984)]。

用于转化质体如叶绿体的方法为本领域所知。参见例如，Svab,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8526-8530 (1990); Svab和Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-917 (1993); Svab和Maliga, EMBO J. 12:601-606 (1993)以及Staub和Maliga, Plant J. 6:547-553 (1994); Kuehnle, 美国公开号2009/7618819。所述方法依赖于基因枪递送含有可选标记物的DNA并通过同源重组将所述DNA靶向质体基因组中。此外，可以通过组织优选表达核编码的且质体指向的RNA聚合酶(McBride,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:7301-7305 (1994))或通过使用整合酶，如phiC31噬菌体位点特异性整合酶将基因插入靶向先前插入的噬菌体附着位点(Lutz,等, Plant J, 37:906-13 (2004))来转活沉默的质体携带的转基因而完成质体转化。可以设计质体转化载体，以便转基因从在质体转化过程中已经与转基因一起插入的启动子序列进行表达，或者从内源质体启动子进行表达，以便完成现有质体操纵子的扩展(Herz,等, Transgenic Research, 14:969-982 (2005))。还可以使用如WO 2010/061186中描述的用于质体转化的可选方法，其中在植物细胞的核中产生的RNA可以靶向质体基因组中。也已经报道了使用合成的核开关（riboswitch）从质体基因组诱导基因表达(Verhounig,等, Proc Natl Acad Sci U S A,107: 6204-6209 (2010))。Lutz,等, Plant Physiol, 145:1201-10 (2007)描述了用于设计质体转化载体的方法。

用于产生所公开的转基因植物的重组酶技术包括cre-lox、FLP/FRT和Gin系统。为本文所述目的，这些技术可以使用的方法描述于例如美国专利号5,527,695; Dale和Ow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10558-10562 (1991); Medberry,等, Nucleic Acids Res. 23:485-490 (1995)中。

根据下文所述的手段和方法或本领域已知的筛选方法选择或筛选改造的植物/植物材料的转化体（即，已经掺入或整合了引入的一个或多个基因构建体的那些植物）。通过上文所述方法的任一种转化后，可以用于获得表达转基因的转化植物的程序包括，但不限于：在选择性培养基上选择已经转化的植物细胞；再生已经转化的植物细胞以产生分化的植物；选择转化的植物，其表达在期望的组织和细胞位置中产生期望水平的一种或多种期望多肽的转基因。

可以通过选择或筛选改造的植物材料其在引入的表达盒上存在的选择标记基因编码的性状来鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂（转化基因构建体赋予针对其的抗性）的培养基上生长改造的植物材料进行选择。此外，还可以通过筛选本文所述的载体上可能存在的任何可见标记基因（例如，β-葡糖苷酸酶、荧光素酶、B或C1基因）的活性来鉴定转化的植物和植物材料。此类选择和筛选方法学为本领域技术人员所熟知。或者或此外，例如可以通过观察生长抑制的降低来筛选如本文教导的改善的干旱耐受性。

物理和生物化学方法也可以用于鉴定含有本文所述的基因构建体/载体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括，但不限于：1）Southern分析或PCR扩增，其用于检测和确定重组DNA插入片段的结构；2）Northern印迹、S1 RNase保护、引物延伸或逆转录酶PCR扩增，其用于检测和检查基因构建体的RNA转录物；3）用于检测酶活性的酶测定，其中此类基因产物由基因构建体编码；4）蛋白质凝胶电泳(PAGE)、western印迹技术、免疫沉淀，或酶联免疫测定，其中基因构建体产物是蛋白质。另外的技术，如原位杂交、酶染色和免疫染色也可以用于检测具体植物器官和组织中重组构建体的存在或表达。用于完成所有这些测定的方法为本领域技术人员所熟知。在具体的实施方案中，指定卡那霉素抗性的可选标记基因nptII用于核转化。

可以根据常规技术将已经转化的细胞生长成植物。参见例如，McCormick,等, Plant Cell Reports 5:81-84(1986)。可以生长这些植物，或者用相同转化品种或不同品种授粉，并且所得杂合体具有鉴定的期望表型特征的组成型表达。可以生长两代或更多代以保证期望表型特征的组成型表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子以保证已经实现期望表型特征的组成型表达。分离的转化体可以通过有性或无性生殖或生长再生成植物及其后代（包括直接世代和后续世代）。或者，改造的植物材料可以在选择或筛选来源植物的标记基因性状之前再生成植物。用于在选择或筛选一种或多种标记基因之前或之后从植物细胞、组织或器官再生植物的程序为本领域技术人员所熟知。

在质体转化程序中，可以从转化植物或组织的外植体进行进一步轮次的植物再生，以增加转基因质体的数目，以便转化植物达到同型异源性（homoplasmy）的状态（所有质体含有统一的原质体系，其含有转基因插入片段）。

V. 用于鉴定赋予干旱抗性的基因的方法

提供用于鉴定ACPB2的变体或同系物（其像ACPB2一样赋予干旱抗性）的方法。示例性筛选方法涉及将外源核酸引入宿主细胞，产生测试细胞，其中所述宿主细胞是当水受限或停止给予至生长抑制水平并持续生长抑制时期时，在干旱条件下显示生长抑制的细胞。当包含编码ACPB2或ACBP2样多肽的核苷酸序列的外源核酸被引入宿主细胞时，测试细胞的生长抑制得到缓解。因此，生长抑制的降低表明，外源核酸编码ACPB2或ACBP2样多肽，其中所编码的多肽以缓解干旱诱导的生长抑制的水平产生和/或具有缓解干旱诱导的生长抑制的活性。与未遗传修饰的宿主相比，生长抑制的降低包括至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或更高的生长抑制降低。

为了产生本发明的遗传修饰的宿主细胞，使用建立的技术，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子轰击、农杆菌介导的转化等将包括编码输送干旱耐受性的一个或多个ACBP2多肽的核苷酸序列的一个或多个核酸稳定或瞬时引入亲本宿主细胞中。对于稳定转化，核酸一般将还包括可选标记物，例如任何若干众所周知的可选标记物，如新霉素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氯霉素抗性和卡那霉素抗性。

将外源核酸插入到表达载体中。适合用于原核和真核宿主细胞中的表达载体为本领域所知，并且可以使用任何合适的表达载体。其中实例包括，染色体、游离型和病毒来源的系统，例如来源于细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒，如SV40、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，和来源于其组合的载体，如来源于质粒和噬菌体遗传元件，如粘粒和噬菌粒的那些载体。表达系统可以含有调节以及引起表达的控制区。一般地，可以使用适合于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸以产生多肽的任何系统或载体。可以通过多种众所周知的和常规技术中的任何一种将适当的核苷酸序列插入表达系统中，如，例如Sambrook等, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))中描述的那些。

其中亲本宿主细胞已经被遗传修饰以产生两个或多个ACBP2s时，编码两个或多个ACBP2s的核苷酸序列在一些实施方案中将各自包含在单独的表达载体上。其中宿主细胞被遗传修饰以表达一个或多个ACBP2s时，编码一个或多个ACBP2s的核苷酸序列在一些实施方案中将包含在单个表达载体中。其中编码一个或多个ACBP2s的核苷酸序列包含在单个表达载体中时，在一些实施方案中，所述核苷酸序列将可操作地连接常见的控制元件（例如，启动子），以便所述常见的控制元件控制所有ACBP2编码核苷酸序列在单个表达载体上的表达。

外源核酸在一些实施方案中将分离自处于其天然环境中的细胞或生物。从测试细胞中分离外源核酸的方法为本领域所熟知。合适的方法包括，但不限于本领域中标准的许多碱裂解方法中的任何一种。在其他实施方案中，在从细胞或生物中分离核酸之前所述细胞或生物的核酸将突变。在其他实施方案中，在体外无细胞系统中合成外源核酸。

在一些实施方案中，筛选方法包括进一步表征候选基因产物。在这些实施方案中，从如上所述的测试细胞中分离包含编码一个或多个ACBP2的一条或多条核苷酸序列的外源核酸。可以将所分离的核酸进行核苷酸序列分析，并且基因产物的氨基酸序列从核苷酸序列推导而来。在一些实施方案中，将基因产物的氨基酸序列与氨基酸序列公共数据库中的其他氨基酸序列进行比较，以确定是否与已知蛋白质的氨基酸序列存在任何显著的氨基酸序列同一性。

在已经将外源基因鉴定为具有赋予干旱抗性能力后，该新鉴定的ACBP2变体/同系物可以用于提供具有改善的干旱抗性的植物/植物细胞。

A. 外源核酸

适合于引入宿主细胞以产生测试细胞的外源核酸包括但不限于，从细胞中分离的天然发生的核酸。可以通过在严格条件下与编码ACBP2的核酸杂交鉴定待向宿主细胞中引入的外源核酸。也可以将与ACBP2显示77%或更高核苷酸序列同源性的外源序列引入宿主细胞中以形成测试细胞。将与ACBP2具有至少77%的DNA同源性的ACBP2样序列鉴定为ACBP2样多肽、变体或同系物，其在野生型的保卫细胞中从其自身启动子表达并且例如像ACBP2一样，当在转基因植物或植物细胞中过表达时，类似于ACBP2下调HAB1并上调AtrbohD和AtrbohF 。更优选地，序列同源性为80%或更高，最优选90%或更高。

从细胞中分离之前或之后已经修饰（例如通过突变）的天然发生的核酸；合成的核酸，例如使用化学合成核酸的标准方法在实验室中合成的或通过重组方法产生的核酸；已经在体外（在细胞内或在无细胞系统中）扩增的合成的或天然发生的核酸；等等。示例性的外源核酸包括但不限于，基因组DNA；RNA；从细胞中分离的mRNA的互补DNA (cDNA)拷贝；重组DNA；以及例如使用用于DNA合成的标准无细胞体外方法在体外合成的DNA。在一些实施方案中，外源核酸是从细胞（原核细胞或真核细胞）中产生的cDNA文库。在一些实施方案中，外源核酸是从细胞（原核细胞或真核细胞）中产生的基因组DNA文库。

在一些实施方案中，例如，其中外源核酸是多个外源核酸（如，例如，cDNA文库、基因组文库、或核酸的群体等，其各自编码具有不同氨基酸序列的ACBP2或ACBP2样多肽，等）时，将所述外源核酸引入多个宿主细胞中，形成多个测试细胞。在一些实施方案中，在干旱条件下在培养物中生长测试细胞，以便相同类型的天然细胞会显示生长抑制和/或死亡；包含外源核酸（其包含编码ACBP2/ACBP2样多肽的核苷酸序列）的那些测试细胞将比不包含外源核酸（其包含编码ACBP2/ACBP2样多肽的核苷酸序列）的测试细胞生长得快，或者包含外源核酸（其包含编码ACBP2/ACBP2样多肽的核苷酸序列）的那些测试细胞将存活下来，而不包含外源核酸（其包含编码ACBP2/ACBP2样多肽的核苷酸序列）的测试细胞将死亡或者受到不利影响。

在其他实施方案中，外源核酸是合成的核酸，其包含例如这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码变体ACBP2，例如在氨基酸序列上有一个或多个氨基酸不同于天然发生的拟南芥ACBP2或其他亲本ACBP2的ACBP2。在一些实施方案中，与天然发生的亲本ACBP的氨基酸序列相比，变体ACBP2在氨基酸序列上有一个氨基酸、两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸、五个氨基酸、六个氨基酸、七个氨基酸、八个氨基酸、九个氨基酸、或十个氨基酸，或更多个氨基酸不同。在一些实施方案中，与天然发生的亲本ACBP的氨基酸序列相比，变体ACBP在氨基酸序列上有约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约35个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约50个氨基酸、或约50个氨基酸至约60个氨基酸不同。

可以使用建立完善的程序完成DNA的手动化学合成，或可以使用许多市售机器中的一种进行自动化学合成。可以修饰核酸的核苷酸序列用于在优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性的基础上进行优化表达。技术人员理解在密码子选择偏向于宿主偏爱的那些密码子时成功表达的可能性。可以在来源于其中可获得序列信息的宿主细胞的基因调查的基础上确定优选密码子。可以通过本领域所熟知的技术，如通过产生编码期望部分的合成核酸；或通过使用Bal 31核酸外切酶产生更长核酸的片段来产生的全长蛋白质的片段。

在仍其他实施方案中，变体ACBP2由在严格条件下与编码拟南芥ACBP2或另一已知ACBP2的核酸杂交的核酸所编码。

在一些实施方案中，在引入宿主细胞形成测试细胞之前将核酸突变。在这些实施方案中，使用多种建立完善的方法中的任何一种将包含编码天然发生的ACBP的核苷酸序列的核酸突变，产生包含编码变体ACBP2的核苷酸序列的核酸。编码ACBPs的核苷酸序列为本领域所知，并且可以改变任何已知ACBP2编码核苷酸序列，以产生用于本发明方法的合成核酸。

突变核酸的方法为本领域所熟知并且包括建立完善的化学突变方法、辐射诱发的诱变以及在合成过程中突变核酸的方法。突变DNA的化学方法包括将DNA暴露于化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亚硝基脲(ENU)、N-甲基-N-硝基-N'-亚硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、硫酸二乙酯、苯并芘、环磷酰胺、博来霉素、三乙基三聚氰胺、丙烯酰胺单体、氮芥、长春新碱、二环氧烷烃（例如，二环氧丁烷）、ICR-170、甲醛、盐酸甲基苄肼、环氧乙烷、二甲基亚硝胺、7,12二甲基苯并(a)蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酸酰胺、白消安（bisulfan）等。辐射突变诱导剂包括紫外线辐射、γ辐射、X射线和快中子轰击。还可以使用例如三甲呋豆素，利用紫外线将突变引入核酸中。随机或靶向插入可移动的DNA元件，例如转座因子是用于产生突变的另一种合适的方法。例如可以使用聚合酶链反应（PCR）技术，如易错PCR在无细胞体外系统中的扩增过程中向核酸引入突变。可以使用DNA改组技术（例如，外显子改组、结构域切换等）在体外将突变引入核酸中。还可以因细胞中DNA修复酶的缺失而将突变引入核酸中，例如期望细胞中存在编码突变DNA修复酶的突变基因，以在细胞的基因组中产生高频率的突变（即，约1个突变/100个基因-1个突变/10,000个基因）。编码DNA修复酶的基因的实例包括但不限于Mut H、Mut S、Mut L和Mut U，及其在其他物种中的同系物（例如MSH 1 6、PMS 1 2、MLH 1、GTBP、ERCC-1等）。突变核酸的方法为本领域所熟知，并且任何已知方法适合于使用。参见例如，Stemple, Nature Reviews, 5:1-7 (2004); Chiang,等 PCR Methods Appl., 2(3):210-217 (2003); Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 (1994);和美国专利号6,033,861,和6,773,900。

因此，例如，包含编码天然发生的ACBP的核苷酸序列的核酸暴露于如上所述的化学诱变剂中，或进行辐射突变，或进行易错PCR，并且将诱变的核酸引入到如上所述的一种或多种遗传修饰宿主细胞中。使用细菌的“诱变物”菌株随机诱变的方法也为本领域所熟知并且可以用于产生变体ACBP。参见例如，Greener,等, Methods in Molecular Biology, 57:375-385 (1995)。使用聚合酶链反应（PCR）的饱和诱变技术也是众所周知的并且可以使用。参见例如美国专利号6,171,820。通过缓解铅引起的生长抑制的能力鉴定包含编码变体ACBP的核苷酸序列的核酸。

B. 宿主细胞

用于本文所述的筛选方法的宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞，或来自多细胞生物的细胞（例如，细胞系）。

实施例

提出以下实施例，以为本领域的普通技术人员提供怎样制备和使用本发明的完整公开和描述，并不旨在限制发明人视为其发明的范围或者并不旨在代表下文的实验是所有或仅进行的实验。已经努力保证所用数字（例如量、温度等）方面的精确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb, 千碱基；pl, 皮升；s或sec, 秒；min, 分钟；h或hr, 小时；aa, 氨基酸；kb，千碱基；bp, 碱基对；nt，核苷酸；等。

材料和方法

用于实施例中的材料和方法以及额外的数据描述于Du,等, Plant, Cell and Environment, 2012年7月, doi: 10.1111/j.1365-3040.2012.02574.x. [Epub印刷前]中，其内容以其整体通过引用并入本文中。

植物材料、生长条件和胁迫处理

拟南芥突变体acbp2和ACBP2-OXs (OX-3和OX-6)分别来源于Columbia生态型Col-0和Col-6 (Gao,等, New Phytol., 181:89-102 (2009)。将这些拟南芥株系的种子表面消毒，并播种在补充有0.8% (w/v)琼脂和2% (w/v)蔗糖的MS培养基上，在生长室中16-h-光照(23℃)/8-h-黑暗(21℃)周期下进行生长。土壤生长的植物也生长在类似的环境条件下。

土壤中盆栽的三周龄植物用于干旱处理。停止浇水15天，然后在拍照之前对植物重新浇水7天。

RNA 分析

还使用TRIzol^®试剂用于持续白光下100 µM ABA或干旱处理多个时间（0、1、3、6和24小时）的12天龄拟南芥幼苗的RNA提取。使用Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen)合成第一链。使用StepOne Plus (Applied Biosystems)和FastStart Universal SYBR Green Master (Roche)进行QRT-PCR。根据Schmittgen和Livak (Nat. Protoc. 3:1101-1108 (2008)分析三次独立实验的转录物变化。

用于RT-PCR分析的引物：

。

保卫细胞和叶中的 ROS 检测

使用2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯(H₂DCF-DA, Sigma- Aldrich; Lee等 1999; Pei等 2000)分析保卫细胞中的活性氧簇（ROS）产生。来自5周龄植物的表皮在含有30 mM KCl和10 mM Mes-KOH (pH 6.15)的孵育缓冲液中在冷白光，23℃下孵育2小时。随后，向溶液中加入50 µM H₂DCF-DA并孵育15分钟。用孵育缓冲液短暂洗涤后，向溶液中加入50 µM ABA或0.1%乙醇（对照）并处理15分钟。然后用蒸馏水洗涤上皮组织并使用Zeiss LSM 510 META显微镜，以488 nm激发和535 nm发射观察荧光。通过LSM Image Browser和Image J (National Institutes of Health)测定DCF荧光强度。

通过3, 3-二氨基联苯胺(DAB)染色(Thordal-Christensen等 1997)检查叶中的ROS产生。收获5周龄植物的叶并在室温下将其浸泡在1 mg mL-1 DAB溶液(pH 3.8)中大约8小时。在96%煮沸的乙醇中清洗10分钟后对样品拍照。

ACBP2 过表达转基因拟南芥株系的产生

通过农杆菌介导的转化产生过表达ACBP2的转基因拟南芥植物(Clough和Bent, Plant J., 16:735-743 (1998)，并将所得转化体随后用于测试ACBP2过表达是否增强了干旱耐受性。在下文提供了ACBP2全长cDNA。

从双元载体pSMB 的CaMV 35S 启动子表达ACBP2全长cDNA (Mylne 和Botella, Plant Mol. Biol. Rep., 16: 257-262.)用于拟南芥(Col-0)的转化。CaMV 35S 启动子特异性正向引物35SB的序列是。

在Northern印迹分析(Gao,等, New Phytol., 181: 89-102 (2009)中，将两个独立的T2 ACBP2过表达株系(ACBP2-OX3和ACBP2-OX6)鉴定为过表达1.6-kb ACBP2 mRNA。

在下文中提供了ACBP2的氨基酸序列。

ACBP2pro:GUS转基因拟南芥株系的产生

为了产生ACBP2pro:GUS融合构建体，通过引物对ACBP2 5’-侧翼序列中的ML805: -1704至-1677

和

ACBP2 gDNA中的ML806: 121-96

扩增ACBP2 5’-侧翼区的1.8-kb的片段，并将其克隆至pGEM-T Easy载体中(Promega, Madison, WI, USA)，以产生质粒pAT351 (图4A)。

在下文中提供了ACBP2pro:GUS融合物的核苷酸序列。

在下文中提供了ACBP2pro:GUS融合物的氨基酸序列。

随后，将来自pAT351的1.8-kb BamHI-SmaI片段克隆至双元载体pBI101.3的BamHI-SmaI位点上，以产生pAT353 (图4B)。通过DNA序列分析验证该构建体并通过根癌农杆菌介导的转化(浸花（floral dip）法；Clough和Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998)将其引入拟南芥（Columbia生态型）中。

根据Liu等, Plant Cell, 16: 5-20 (2004)，使用5溴-4-氯-3-吲哚-b-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)进行组织化学GUS测定。将植物样品浸没在GUS染色溶液 (100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.0，0.1% Triton X-100，2 mM铁氰化钾，2 mM亚铁氰化钾, 1 mg/mL 5溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸) 中并真空过滤30分钟，在37℃孵育并观察3-16小时的时期。随后，在70%的乙醇中清洗样品并拍照。

对于共聚焦显微镜观察，将12天龄幼苗在补充有50 mM Imagene Green (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的0.1% Silwet L-77溶液中孵育1小时。然后在0.1% Silwet L-77中短暂洗涤样品并在共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM 510 META; Zeiss, Hamburg, Germany)下拍照。

萌发时 ABA 的敏感性

为了测试萌发时ABA的敏感性，每次实验在存在或不存在0.75 mM ABA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)的MS培养基上播种超过200粒种子。在4℃下2天后，萌发种子并在16-小时光照(23℃)/8-小时黑暗(21℃)周期下进行生长。利用显微镜(Leica MZ6; Leica, Solms, Germany)每天检查萌发并在7天后对幼苗拍照。对于萌发后生长测定，种子在MS培养基上萌发4天，随后在进行拍照和根测量前转移到MS培养基或补充有100或150 mm ABA的MS培养基上7天。

离子渗漏测定

根据Welti等 (2002)测定离子渗漏。简言之，将ABA处理的离脱叶在去离子水中23℃下搅拌1小时。利用测量仪表(YSI 55型)测定溶液的电导率。随后，通过在水浴中煮沸溶液10分钟，然后冷却至23℃来确定总离子强度。

序列

本文包括的序列数据可见于GenBank/EMBL数据库检索号NM_118916 (ACBP2)、NM_105936 (HAB1)、NM_124165 (AtrbohD)和NM_105079 (AtrbohF)下。

实施例1 ACBP2受ABA和干旱诱导

脱落酸(ABA)是调节许多生理学过程，包括种子休眠和萌发、幼苗建成、营养发育和响应多种非生物胁迫（包括干旱和盐度）的植物激素(Schroeder, Kwak和Allen 2001; Finkelstein, Gampala和Rock 2002; Hirayama和Shinozaki 2007; Fujii和Zhu 2009; Lee和Luan 2012)。轻度和严重的水分缺乏均影响植物发育(Davies和Zhang 1991; Zhu 2002; Skirycz和Inzé 2010; Skirycz等 2011)。在水分缺乏胁迫过程中，ABA水平上升调节多个基因的表达，以促进适应性响应(Christmann等 2007; Raghavendra等 2010)。

为了确定ABA处理对ACBP2表达的影响，在持续白光下ABA处理之前和之后的12天龄幼苗中通过实时定量PCR (qRT-PCR)使用引物ML1122和ML1123 (SEQ ID NOs: 1和2)检查ACBP2的表达。使用StepOne Plus (Applied Biosystems)和FastStart Universal SYBR Green Master (Roche)进行qRT-PCR。根据Schmittgen和Livak (Nat. Protoc. 3: 1101-1108 (2008)分析三次独立实验的转录物变化。

qRT-PCR结果显示在持续白光下ACBP2受ABA (100 mM)处理的显著诱导。因此，研究了在持续白光下干旱处理后12天龄幼苗中ACBP2的表达。qRT-PCR结果显示在持续白光下ACBP2受干旱处理的诱导。在qRT-PCR分析中，ACBP2在干旱处理3、6小时和24小时后上调（图1B）。ACBP2受ABA和干旱处理的诱导表明其在干旱响应中的可能作用。

为了进一步检查种子萌发和早期幼苗发育中的ACBP2表达，进行了组织化学和qRT-PCR分析。

数据显示，ACBP2pro:GUS在萌发后第一天的整个胚中表达，并且随后局限于子叶和胚根的伸长区和分化区。从萌发的第４天开始，ACBP2pro:GUS在根维管束中表达，但不在根尖中表达（数据未显示）。随着萌发的进行，GUS表达快速降低，然而ABA处理抑制萌发并维持GUS表达（数据未显示）。qRT-PCR分析的类似结果暗示，ACBP2表达可由ABA处理部分恢复（图1C）。综上所述，ACBP2的表达模式暗示其在种子萌发和早期幼苗发育中的可能作用。

实施例2 干旱处理和气孔开度测定

如Osakabe,等, Journal of Biological Chemistry, 285:9190-9201 (2010)所述进行干旱处理。简言之，将在MS平板上生长的4周龄植物转移到滤纸上并在室中40±3% RH下孵育6或8小时。然后对这些植物重新浇水，并在3天恢复后计算存活率。对于在土壤中盆栽的3周龄植物，停止浇水15天，然后在拍照前对植物重新浇水7天。在图2B中显示了存活率。

acbp2突变体对干旱胁迫更敏感，而ACBP2-OXs对干旱胁迫更耐受。

对在MS培养基上生长的4周龄ACBP2-OXs植物和在土壤中生长的3周龄ACBP2-OXs进行失水胁迫。干旱处理并恢复后，与野生型（Col-0）相比，在MS培养基（图2A）和土壤（图2B）中生长的ACBP2-OXs均对干旱胁迫更耐受，而acbp2突变体植物比野生型（Col-6；图2A和B）对干旱更敏感。

为了进一步研究ACBP2在干旱胁迫下的功能，在野生型(Col-0和Col-6)、acbp2突变体和ACBP2-OXs中分析响应ABA的叶气孔闭合。

根据Pei,等 Plant Cell, 9:409-423 (1997)进行气孔闭合实验。来自4周龄拟南芥植物的莲座叶在含有10 mM KCl、0.2 mM CaCl₂和10 mM Mes-KOH (pH 6.15)的气孔开放溶液中，在23℃冷白光下孵育2小时。随后，将这些叶转移到补充有ABA的同一新鲜溶液中并孵育2小时。在Leica DMRXA显微镜下对保卫细胞拍照并利用Image J (National Institutes of Health)测定气孔开度。

来自ACBP2-OXs的保卫细胞与野生型（Col-0；图2C）相比显示对5 µM和10 µM ABA的增加的气孔敏感性。相反，来自acbp2突变体的保卫细胞比野生型（Col-6；图2D）更少受到影响。这些结果暗示在干旱胁迫过程中通过减少水分损失ACBP2与ABA信号传递之间的联系。

通过在ABA胁迫下的萌发测试ACBP2-OX种子。ACBP2-OXs (OX-3和OX-6)的萌发测定揭示了ABA敏感性。

对于在MS培养基上萌发的种子，在转基因株系和野生型之间没有注意到显著差异（图2E）。然而，存在外源ABA时，ACBP2-OXs对ABA更敏感并且萌发比野生型（Col-0；图2F）更慢，而在acbp2突变体与野生型之间没有检测到显著差异（数据未显示）。

除了种子萌发，已知ABA调节根发育(Finkelstein等 2002; Fujii和Zhu 2009)。对于根生长测定，将在MS培养基上萌发的4天龄幼苗转移到含有ABA的MS培养基上。生长7天后，ACBP2-OXs的根比野生型的根（Col-0；图2G）显著更短。acbp2突变体的种子在MS培养基上萌发并生长4天，随后将其转移到补充有100或150 µm ABA的新鲜MS培养基上用于进一步的7天孵育。存在100 µm ABA的情况下，acbp2突变体的根生长在根长度上与野生型（Col-6）没有显示出显著差异。然而，存在150 µm ABA的情况下，acbp2突变体幼苗的根长比野生型（Col-6）显著更长（图2H）。

实施例3 ACBP2-OXs显示增加的ROS产生

两种拟南芥保卫细胞表达的NAD(P)H氧化酶AtrbohD和AtrbohF对保卫细胞中ABA介导的ROS产生和气孔闭合是必需的(Kwak,等, EMBO J., 22:2623–2633 (2003)。从ACBP2-OXs的基因表达结果观察到AtrbohD和AtrbohF受ABA的上调。

通过2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯(H₂DCF-DA)和3, 3-二氨基联苯胺(DAB)染色研究5周龄野生型和ACBP2-OXs拟南芥植物中的ROS产生。H₂DCF-DA是可渗透到质膜中的非荧光化合物并转化成不可渗透的二氯荧光素(H₂DCF)。细胞过氧化物酶和H₂O₂将H₂DCF氧化，以产生表明ROS产生的DCF荧光。

与H₂DCF-DA孵育后，记录到了保卫细胞中以类似于无ABA处理情况下野生型和ACBP2-OXs拟南芥植物水平的ROS产生。然而，利用50 µM ABA处理15分钟后，如更高的荧光强度所示，来自ACBP2-OXs的保卫细胞比野生型积累更多的ROS产生（图3A）。

使用来自野生型(Col-0和Col-6)、acbp2突变体和ACBP2-OXs的离脱叶测试ABA相关衰老中ACBP2的功能。用10 mm ABA处理3天后，来自ACBP2-OXs的叶比野生型(Col-0)显示更明显的衰老，而acbp2突变体与野生型表现类似（数据未显示）。通过离子渗漏测定进一步分析来自acbp2突变体和ACBP2-OXs (OX3和OX6)的叶的膜完整性。结果显示，渗漏在ACBP2-OXs中比在野生型 (Col-0；图3B) 中更高，这与ACBP2过表达促进ABA介导的叶衰老的观察结果一致。相反地，野生型(Col-6)与acbp2突变体之间的差异并不显著，但是来自acbp2突变体植物的叶在ABA处理后显示降低（5.8%）的离子渗漏（图3c）。

实施例4 ACBP2的空间表达

数据显示，ACBP2在叶（5A）和保卫细胞（图5B）中高表达。比例尺= 1 mm (图5A)和20 µm (图5B)。

GUS染色也揭示，ACBP2在早期鱼雷形胚（early-torpedo）阶段、弯曲子叶（bent cotyledonary）阶段和成熟阶段强表达。在成熟阶段，除根顶端分生组织外，ACBP2在胚的大部分中表达。除了在胚中表达，转基因拟南芥上的GUS组织化学染色进一步揭示了拟南芥多个器官中的ACBP2pro:GUS表达模式。ACBP2pro:GUS在3周龄拟南芥幼苗、子叶和真叶的保卫细胞、以及主根和侧根维管束中表达。在开放的花中，ACBP2pro:GUS在花药的花粉中表达，但不在花瓣、萼片和雌蕊中表达。荧光GUS底物测试验证了幼苗保卫细胞中的GUS表达（数据未显示，但发表于Du,等, Plant, Cell and Environment, 2012年7月, doi: 10.1111/j.1365-3040.2012.02574.x. [Epub印刷前]，其通过引用并入）。

实施例7 ACBP2的过表达调节AtrbohD 、 AtrbohF和HAB1的表达

使用qRT-PCR研究ACBP2在ABA信号传递中的作用，以确定ACBP2是否调节与ABA信号传递相关的基因。

AtrbohD和AtrbohF编码在ABA响应中生产ROS产生的两个NAD(P)H氧化酶。研究已经显示，AtrbohD和AtrbohF的双突变削弱了ABA诱导的ROS产生和气孔闭合，表明其蛋白质在ABA信号传递中的主要作用(Kwak,等, EMBO J. 22: 2623–2633 (2003))。此外，已经观察到，HAB1是ABA信号传递和干旱耐受性的显性负调节物(Saez,等, Plant J., 37:354-369 (2004)。

因此，在野生型(Col-0)与ACBP2-OXs之间比较AtrbohD 、 AtrbohF和HAB1的表达。此外，在野生型(Col-0)与ACBP2-OXs之间比较ABA应答元件结合蛋白1 (AREB1)、ABA缺损2 (ABA2)、9-顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶3 (NCED3)、响应脱水29A (RD29A)、脱落酸不敏感1 (ABI1)、磷脂酶D α1 (PLD α1)和受体样蛋白激酶1 (RPK1)的表达。

在Murashige和Skoog (MS)平板上生长的20天龄ACBP2-OXs (OX-3和OX-6)幼苗保持未处理或用100 µM ABA处理3小时。通过qRT-PCR检查基因表达。

qRT-PCR分析显示，HAB1的表达在ACBP2-OXs中下调，由此促进ACBP2-OXs中的ABA信号传递并增强干旱耐受性。相反地，在ABA处理的ACBP2-OXs中，AtrbohD和AtrbohF的表达被显著上调，这与ABA处理后ACBP2-Oxs的保卫细胞中的ROS产物累积一致。在ABA处理之前和之后观察到AREB1的显著上调。当用ABA处理植物时，ACBP2-OXs中的NCED3表达下调。响应脱水29A (RD29A)、ABI1、PLDa1和受体样蛋白激酶1 (RPK1)的表达在野生型(Col-0)与ACBP2-OXs之间没有显著差异（图6A-6I）。

总结

实施例使用定量实时聚合酶链反应证明，ACBP2 mRNA表达受脱落酸（ABA；调节干旱耐受性的主要植物激素）和干旱的诱导（图1）。数据还显示，过表达ACBP2 (ACBP2-OXs)的转基因拟南芥被赋予改善的干旱耐受性。这些细胞中ABA介导的活性氧簇（ROS）产生的累积促进气孔闭合，其继而减少水分损失并改善干旱耐受性（图2A-D和3）。β-葡糖苷酸酶(GUS)测定证实，ACBP2pro:GUS在保卫细胞中表达（图4和5），支持在保卫细胞中ROS产生的与ACBP2相关的上调。进一步的研究揭示，ACBP2的过表达诱导呼吸爆发氧化酶同系物D (AtrbohD)和AtrbohF的表达（图6），其为编码在ABA响应中生成ROS产生的两个NAD(P)H氧化酶的两个基因(Kwak,等, EMBO J., 22:2623–2633 (2003)。此外，ACBP2过表达还抑制编码对ABA1高度敏感的蛋白质(HAB1)的mRNA的表达，所述HAB1是ABA信号传递和干旱耐受性的显性负调节物(Saez,等, Plant J., 37:354-369 (2004)，暗示了ACBP2在这些过程中的正作用。ACBP2过表达显著增加了（平均～2倍）暴露于干旱中的转基因拟南芥植物的存活率。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本公开发明隶属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文引用的出版物及其引用的材料通过引用明确并入。

本领域的技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同。此类等同旨在包括在以下权利要求书中。

Claims

1. 转基因植物，其进行遗传改造以相对于未修饰的植物表达有效增强干旱耐受性的量的ACBP2。

2. 种子，其来自权利要求1的转基因植物。

3. 转基因植物细胞，其来自权利要求1的转基因植物。

4. 权利要求1的转基因植物，其中所述植物细胞是茄科植物物种。

5. 权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物选自番茄、谷类作物和棉花。

6. 权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物细胞是棉花。

7. 在植物或植物细胞中获得增强的干旱耐受性的方法，其包括：遗传改造所述植物或植物细胞，以相对于未遗传改造的植物表达有效提供干旱耐受性的量的ACBP2。

8. 权利要求8的方法，其中所述植物细胞是茄科植物物种。

9. 权利要求8的方法，其中所述植物细胞是谷类作物。

10. 权利要求8的方法，其中所述植物细胞来自选自番茄、棉花和稻的植物。

11. 权利要求8的方法，其中所述ACBP2是拟南芥ACBP2。

12. 获得具有干旱耐受性的植物部分的方法，其包括：获得遗传修饰以表达ACBP2的植物部分；和在其中其暴露于足以抑制相同类型的天然植物生长的干旱胁迫的条件下生长所述植物部分。

13. 权利要求12的方法，其中获得所述植物部分包括从种子生长所述植物部分。

14. 权利要求12的方法，其中获得所述植物部分包括获得植物插条。

15. 权利要求12的方法，其中所述植物部分在植物中。

16. 权利要求14的方法，其中所述干旱胁迫是至少15天缺水。

17. 筛选功能性ACBP2变体的方法，其包括：获得遗传修饰以表达候选ACBP2变体的细胞；将所述细胞在干旱胁迫条件下生长足以抑制相同类型的天然细胞生长的持续时间；观察所述细胞是否展示出生长抑制的降低；并且，如果是这样，则将该候选ACBP2变体鉴定为功能性的。

18. 权利要求17的方法，其进一步包括将含有所述功能性ACBP2变体的遗传修饰细胞再生为植物。

19. 权利要求18的方法，其进一步包括获得包含表达所述功能性ACBP2变体的细胞的所述植物的后代。

20. 权利要求17的方法，其进一步包括获得遗传修饰以表达所述功能性ACBP2变体的其他植物细胞。