UA48104C2 - Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника - Google Patents

Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника Download PDF

Info

Publication number
UA48104C2
UA48104C2 UA94005307A UA94005307A UA48104C2 UA 48104 C2 UA48104 C2 UA 48104C2 UA 94005307 A UA94005307 A UA 94005307A UA 94005307 A UA94005307 A UA 94005307A UA 48104 C2 UA48104 C2 UA 48104C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
gene
protein
sequence
corn
promoter
Prior art date
Application number
UA94005307A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Майкл Г. Козіел
Наліні М. Дасай
Келлі С. Льюїс
Ванс К. Крамер
Грегорі У. Уоррен
Стівен В. Евола
Лайл Д. Кроссланд
Марта С. РАЙТ
Елліс Дж. Мерлін
Карен Л. Лоніс
Стівен Дж. Ротстайн
Original Assignee
Новартіс Аг
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27118547&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA48104(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартіс Аг, Новартис Аг filed Critical Новартіс Аг
Publication of UA48104C2 publication Critical patent/UA48104C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal protein (delta-endotoxin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

Розглянуто послідовності ДНК, оптимізовані для експресії в рослинах. Послідовності ДНК переважно кодують інсектицидні поліпептиди, зокрема, інсектицидні білки з Bacillus thuringiensis. Описано також рослинні промотори, зокрема, специфічно-тканинні і переважно-тканинні промотори. Крім того, розглянуто вектори, що трансформують, які містять зазначені послідовності ДНК. Вектори, що трансформують, показують високі рівні інсектицидної активності при їхньому введенні в кукурудзу.

Description

Опис винаходу
Фрагмент ДНК, содержащий кодирующую инсектицидньій протеин последовательность, оптимизированную 2 для кукурузьї, фрагмент ДНК, обеспечивающий направленную предпочтительную для сердцевинь! стебля зкспрессию связанного с ней структурного гена в растений, фрагмент ДНК, обеспечивающий специфическую для пьІільЦцьї! зкспрессию связанного с ней структурного гена в растений, рекомбинантная молекула ДНК, способ получения оптимизированной для кукурузьї кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защить! растений кукурузьі, по меньшей мере, от одного насекомого-вредителя. 70 Данная заявка является частичньім продолжением заявки США, регистрационньй номер 772,027, поданной 4 октября 1991 г., которая полностью раскрьіваєтся в нижеприведенном описаний.
Настоящее изобретение относится к последовательностям ДІК, кодирующим инсектициднье белки, и к зкспрессии зтих последовательностей в растения.
Зкспрессия генов инсектицидного белка /Р/, вьіделенного из ВасіПйи5 (пигіпдіепзіз (ВО в растения 72 оказалась чрезвьчайно трудной задачей. Делались попьітки зкспрессировать в растения комбинации химерньй промотор/ген ВІ ІР. Обьічно в трансгенньїх растениях получали только низкий уровень белка. См., например,
Маеск еї аїЇ., Майте 328:33-37, 1987; Вапоп еї аї.,, Ріапі РІузіоЇї. 85:1103-1109, 1987; РіІвспой еї аї.,
ВіІо/ТесппоЇоду 5:807-813, 1987.
Одним из обоснованньх обьяснений причини низкой зкспрессии является то, что случайнье участки обработки транскрипции создают аберрантнье формь! транскрипта мРНК ВІ ІР. Зти аберрантно обработаннье транскриптьі в растений не являются функциональньми, в смьсле образования инсектицидного белка.
Возможнье участки обработки включают участки полиазденилирования, области сплайсинга интрона, сигналь! прекращения транскрипции и транспортнье сигнальі. Большинство генов не содержат участков, которье вредно влияют на зкспрессию гена в обьічньій организм-хозяин. Однако, случайная встречаемость таких участков с 29 обработки в области кодирования могла бь осложнить зкспрессию указанного гена в трансгеннье Го) организмьі-хозянева. Например, кодирующая область для гена инсектицидного кристаллического белка, вьіделенного из штамма ВасПШиз (пигіпудіепзіз вида КигеіакІ Ленбанк ВТНКОКНО, каталожньій Номер М15271, В.
Іпигіпдіепвіз вида Кигеіакі,НО-1; Сеїівег еї аі. Сепе 48:109-118 /1986//, вьіделенного непосредственно из
ВасШив (пПигіпдіепзіз, могла бьі содержать участки, которне препятствуют правильной обработке указанного З генав растениях. Га»)
Кроме того, трудности возникают при попьітке зкспрессировать белок ВасіПйив (Пигіпдіепвівз в организм, например в растениє. Бьіло обнаружено, что использованиє кодона гена нативного ВІ ГР-значительно (37 отличается от использования кодона типичного для гена растения. В частности, использование кодона гена Ге) нативного ВІ ІР резко отличаєется от использования кодона гена кукурузьі. В результате, мРНК из зтого гена не может зффективно использоваться. Использование кодона может влиять на зкспрессию генов на уровне М трансляции, или транскрипции или обработки мРНК. С целью оптимизации иниектицидногсг генадля его зкспрессии в растения делались попьітки изменить ген, чтобьі придать ему по возможности большее сходство с генами-, которне естественньім образом содержатся в растении-хозяине, подлежащем трансформации. «
Адапуд и др. в патенте ЕРВ Мо 0359472 /1990/ ссьілаются на синтетический ген Васіїйив5 (Пигіпхіепвів - іепебпопів /ВЩ/, которьій на 85 процентов гомологичен нативному гену Ві, и которьій конструируется так, с чтобьї иметь содержание А ї- Т приблизительно равное содержанию А ї- Т, обьічно обнаруживаемому в з» растениях. В таблице 1 вьішеуказанного патента показана последовательность кодона синтетического гена ВЕ, которьій бьіл сконструирован для придания большего сходства с нормальньмм распределением кодона генов двудольньїх. Адапуд и др. утверждают, что синтетический ген, кодирующий ІР, может бьіть оптимизирован с целью повьішения зкспрессий в однодольнье растения аналогичньми способами, ссьілаясь на частоту е использования кодона вьісокозкспрессированньїх белков однодольньїх растений, как зто видно из Таблицьї! 1.
Ге | На странице 9 Адапуд и др. утверждают, что синтетический ген ВИ сконструирован с тем, чтобьї иметь содержание А ж- Т, равное 5595 (и при зтом содержание С ж- С, равно 45965). На странице 20 Адапа и др., - отмечают, что синтетический ген конструируется путем изменения отдельньїх аминокислотньїх кодонов в о 20 нативном геНеВі для того, чтобь отразить общее распределение кодонов, предпочтительньїх для генов двудольньїх для каждой аминокислоть! внутри кодирующей области гена. Адапа и др., кроме того, утверждают,
Т» что только некоторье кодоньі нативньїх геНозВИ будут замешаться найболее предпочтительньм кодоном растения для каждой аминокислотьі, так, что общее распределение кодонов, используемьх в белках двудольньх растений сохраняется. 29 Ріасппой и др. в патенте ЕРВ Мо 0 385 962 /1990/ ссьлаются на геньі растений, кодирующих токсин
ГФ) кристаллического белка Васіиз5 (пигіпдіепзіз. В таблице М РІзспгоїї еї аі, приводит процентное использование кодонов для каждой аминокислоть. На сто.8 РІзсппоїї еї ар вьісказьівают предположение о модификации гена о нативного Ві за счет удаления условньій: сигналов полиаденилирования и последовательностей АТТТА.
РІзспоїї еї а! кроме того, предлагают осуществить сканирование последовательности гена нативного Ві для 60 областей, имеющих больше, чем четьре последовательньх нуклеотида аденина или тимина, с целью идентификации условньїхх сигналов полиаденилирования растения. БіІзсппой ей а), утверждают, что нуклеотидная последовательность должна изменяться, если более чем один условньїй сигнал адннилирования иденткфицируется среди десяти нуклеотидов. На стр.9 РіІзсппоїї еї аі. утверждают, что необходимо приложить усилия для отбора кодонов с целью доведения содержания (з ї С до приблизительно 50905. бо Вапоп ей а в Трудах Национальной академии наук США 88:3324-3328 /1991/ ссьілаются на модифицированнье кодирующие последовательности гена Васійиз (пигікадіепеїв сгуїА(б), айа-логичнье последовательностям, на которне ссьілаются Різапної др.. Как видро из Таблиць 1 на странице 3325, частично модифицированньй ген, описанньй регіайи др., имеет приблизительно 9б-процентную гомологию с нативньм
Теном сгу!А(Б) /1681 из 1743 нуклеотидов/, при осодержаний б - С, равном 4195, количестве последонательностей сигналов полиаденилиоования растений /РРЗ5/ уменьшенном с 18 до 7, и количестне последовательностей АТТТА, уменьшенном с 13 до 7, Полностью модифицированньй ген сгуїА(в), описанньй
Репак и др., представляет собой полностью синтетический ген /страница 3325, КОЛОНКА //. Зтот ген имеет приблизительно 79-процентную гомологию с нативньм геном сгуіА(бБ) /1455 из 1845 нуклзотидов/ при 7/0 содержаний б ж С, равном 49965, количестве последовательностей сигналов полиаденилированйя растений /РРБЗБ/, уменьшенном до І и полном отсутствии последовательностей АТТТА.
Вапоп и др. в патенте ЕРВ Мо 0 431 829 /Л991/ описьівают зкспрессию инсектицидного токсина в растения. В колонке 10 описання вьішеуказанного патента приведена конструкция синтетического гена АаІїТ токсина насекомого, кодирующего токсин скорпиона с использованием найболее предпочтительного кодона для каждой /5 аминокислоть! в соответствий с графиком, показанньм на фиг.1 указанного патента.
Настоящее изобретение относится к способам повьішения зкспрессии гетерологичньїх генов в клетки растений. З общем случае ген или кодирующий участок, представляющий интерес, конструируется так, чтобь образовать специфическую последовательность преиймущественного кодона растения. В зтом случаєе использование кодона для определенного белка изменяется с целью повьішения зкспрессии в определенное го растение. Такие кодирующие последовательности, оптимизированнье относительно растения, могут бьть опарам больно связаньі с промоторами, способньіми направлять зкспрессию кодирующей последовательности в клетку растения.
В частности, одной из целей настоящего изобретения является создание синтетических генов инсектицидного белка, которне оптимизировань для зкспрессии в растения. с
Другой целью настоящего изобретения является создание синтетических генов инсектицидного белка Ві с целью максимизации зкспрессии белка Ві я растение, предпочтительно в кукурузу. Одной из особенностей і) настоящего изобретения является Ти что Синтетический генві ІР конструируется с использованием найболее предпочтительньхх кодонов кукурузьї, за исключением изменений, необходимьїх для образования участков легирования при конструирований полностью синтетического гена. «Е зо В соответствии с вьішеуказанньми целями бьіли синтезировань! геньї инсектицидного кристаллического белка, в котором использование кодона изменено для повьішения зкспрессии в растения, в частности, в о кукурузу. Однако, вместо того, чтобьі изменять использование кодона с целью придания сходства гену кукурузь, -« п исходя из полного распределения кодона, использование кодона бьіло оптимизировано за счет использования найболее предпочтительньх для кукурузьь кодонов /прейимущественно кукурузнье кодонь/ при синтезе со з5 синтетического гена. Оптимизированноеє использование прейимущественно кукурузного кодона является «г зффективньм средством для зкспрессии инсектицидного белка Ві на вьсоких уровнях. Зто может бьть достигнуто за счет максимизации количества инсектицидного белка Ві, транслированного из данной популяции матричньїх РНК. Синтез гена ВІ ІР с использованием преимущественно кукурузньїх кодонов также направлен на исключение случайньх участков обработки, которье могут вьявляться в нативной кодирующей « последовательности. Зкспрессия такого синтетического гена в клетке кукурузьі значительно вьіше, чем в с зкспрессия нативного гена ВІ ІР.
Предпочтительнье синтетические последовательности ДНК, оптимизированнье относительно кукурузь, ;» согласно настоящему изобретению вьіделяют из белка, кодированного геном сгуіїА(а) в Басів (пПигіпдіепвів вида Кигвіакі, НО-1; Сеїзег еї аіЇ., Сеае, 4Р:ІС9-И8 /1986/ или геном сгуів/"АКА Стгуа4 ген/, опизаййьм -- Вгпідлагап УУпеїву, Мис. Асіав.Кез.,16:2723 /1988/. Последовательность ДПК нативного гена НО-1 сгуїА(Б) їх КигвіакІ показана в виде Последовательности І. Указаннье белки являющая активньми по отношению к различньїм чешуекрьільім насекомьїм, включая Озігіпіа пибіІаів Европейский зерновой точильщик. со В то время как настоящее изобретение поясняется примером синтеза генов белка Ві, оптимизированного - относительно кукурузьї, ясно, что заявляемь!й способ может бьіть использован для оптимизации зкспрессий любого белка в растения. о Оптимизированнье для определенной стадии гень! могут бьіть слить! с различньми проматорами, включая ї» конститутивнье, индуцированнье, временно упорядоченнье, зволюционно упорядоченнье, прейимущественно тканевьне и специфически тканевне промоторьі, предназначеннье для получения молекул рекомбинантной ДНК, то есть химерньїх генов. Оптимизированньй Относительно кукурузьї ген /кодирующая последовательность/ Ообеспечивает значительно более вьісокие уровни зкспрессии в трансформированное растение по сравнению с неоптимизированньмм относительно кукурузьі геном. Соответственно зтому может бьть вьработана (Ф, сопротивляемость растений к жесткокрьільм или чешуекрьльм вредителям, например, к Европейскому ка зерновому точильщику и точильщику сахарного тростника.
Другой целью настоящего изобретения является создание преимущественно тканевьхх и специфически бо тканевьх промоторов, которье направляют зкспрессию операбельно ассоциированного структурного гена, представляющего интерес, в специфическую часть или части растения при почти полном исключений зкспрессии в другие части.
Еще одной целью настоящего изобретения является созданий преимущественно сердцевинньїх промоторов.
Под "сердцевинньім прзматором" понимается промотор, которьій способен направлять зкспрессию операбельно 65 ассоциированного структурного гена в большей, степени п сердцевину растения, чем в корни, внешнюю оболочку и опорньсе корни при почти полном отсутствий зкспрессии в семя.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание специфически пьільцевьїх промоторов. Под "специфически пьільцевьім" понимаєется опромотор, способньй направлять зкспрессию операбельно ассоциированного структурного гена, представляющего интерес, практически полностью в пьільцу растения при Ннезначительна малой зкспрессивна любую другую часть растения. Виіражение "незначительно малая" означает
Функциональную незначительность.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение молекул рекомбинантной ДНК, содержащих преимущественно тканевьій промотор или специфически тканевьій промотор, операбельно ассоциированньй или связанньй со структурньм геном, представляющим интерес, в частности, со структурньм геном, 7/0 Кодирующим инсектицидньй белок, и обеспечение зкспрессии рекомбинантной молекули в растение.
Следующей целью настоящего изобретения является получение трансгенньїх растений, которне действенно зкспрессируют по меньшей мере один структурньй ген, представляющий интерес, в преимущественна тканевьй или специфически тканевьїй обьект зкспрессии.
В одном из специфических вариантов вьіполнения изобретения, приведенном в данном описаний и 7/5 Защищаемом формулой изобретения, преимущественно тканевьій или специфически, тканевьій промотор операбельно связан со структурньм геном, кодирующим инсектицдньій белок, а растение устойчиво трансформировано с по меньшей мере одной такой рекомбинантной молекулой. Полученное в результате зтого растение обладает сопротивляемостью по отношению к некоторьім насекомь!м, которне питаются теми частями растения, в которне зкспрессирован геньі. Преимущественно структурнье геньї кодируют инсектициднье белки
ВІ. Более предпочтительньіми являются оптимизированньсе относительно кукурузь геньі ВИР.
Фиг.1 - сравнение полноразмерного нативного гена Ві сгуіА(вБ) /ВТНКИОКНО/, полноразмерного синтетического оптимизированного относительно кукурузьі Гена сгуїА(Б) ЛІзупрі. Шп/ и укороченного синтетического оптимизированного относительно кукурузь! гена Ві сгуІіА(в) /Юззуп/. Из зтого рисунка видно, что последовательность полноразмерного синтетического оптимизированного относительно кукурузь! гена сгуїА(бБ) с об соответствует последовательности нативного гена сгуіА(Б): приблизительно 2354 внуклеотида из 3468 /гомология составляет приблизительно б890б/ Фиг.2 - сравнение укороченного нативного гепавВі сгуїіА(Бв) і)
ІВТНКИОКНО)/ и укороченного синтетического оптимизированного относительно кукурузь! гена Ві /ровзуп/. Из зтого рисунка видно, что последовательность укороченного синтетического оптимизированного относительно кукурузьі гена сгуїА(Б) соответствует последовательности нативного гена сгуїА(Б): приблизительно 1278 «г
Зо Нуклеотидоя из 1947 /гомология составляеєт приблизительно 669б/.
Фиг.3 - сравнение последовательности чистого оптимизированного относительно кукурузьі гена Ві о /вупіТ.т2е/ с укороченньм синтетическим кукурузьь геном Ві /юб55уп/ и полноразмерньм синтетическим -«р оптимизированньім относительно кукурузь! геном Ві, модифицированньм с целью включения рестрикционньх участков, Способствующих конструированию гена ./5упіці.тса/. со
Из зтого рисунка видно, что последовательность укороченного синтетического оптимизированного («р относительно кукурузьі гена сгуїА(Б), совпадает с последовательностью чистого оптимизированного относительно кукурузьі гена сгуїА(Б): приблизительно 1913 нуклеотидов из 1947 /гомология составляет приблизительно 989б6/.
Фиг.4 - сравнение нативного укороченного гена ВІ сгуїА(в) "«ВТНКиКНО)/ с укороченньім синтетическим геном « 9УЇА(Ь), описанньм Рез їак и др. в РМАЗ ОЗА, 88:3324-3328 /1991/РМОМВТ/ и укороченньім синтетическим Ше) с оптимизированньім относительно кукурузьї геном ВІ /оззуп/. Из зтого рисунка видно, что последовательность гена /'РМОМВТ/ совпадает с последовательностью нативного гепавурззуп/ приблизительно 1453 нуклеотидов из ;» 1845 /гомология составляет приблизительно 7995/, в то время, как укороченньй синтетический оптимизированньй относительно кукурузь! геНВІі сгуІА(Б) совпадаєт с нативньм геном сгуіА(б): приблизительно 1209 нуклеотидов из 1845 /гомология составляєт приблизительно 669б/. їх Фиг.5 - сравнение укоооченного синтетического гена сгуїА(Б), описанного Регіак и др. в РМА5З
ОИБА,88:3324-3328 /1991/ /Рюизт / и укороченного синтетическое оптимизированного относительно кукурузь! гена со ВІ сгуіА(вБуУрезуп/Не зтого рисунка видно, что последовательность гена РМОМВТ совпадаєт с - последовательностью укороченного синтетического оптимизированного относительно кукурузь! гена Ві сгуіА(б): приблизительно 1410 нуклеотидов из 1845 /гомология составляет приблизительно 7 79б0/. о Фиг.6 - полноразмерньій оптимизированньй относительно кукурузь! ген СтгуІВ. ї» Фиг.7 - полноосазмерная гибридная частично оптимизированная относительно кукурузь! последовательность
ДНК гена СтуІА(Б), которьій содержится в рС184434. Синтетический участок состоит из нуклеотидоз 1-1938 /аминокислотьі 647-1155/. Точка слияния между синтетической, и нативной кодирующими б последовательностями показана в последовательности знаком разрьва /-/.
Фиг.8 - карта рС184434. (Ф, Фиг.9 - полноразмерная гибридная оптимизированная относительно кукурузь! последовательность ДНК, ка кодирующая теплоустойчивьїй белок СтІА(б), содержащийся врС1В5511.
Фиг.10 - карта рС185511. 60 Фиг.11 - полноразмерная гибридная оптимизированная относительно кукурузьі последовательность ДНК, кодирующая теплоустойчивьїй белок СіуІА(В), содержащийся в рС185512.
Фиг.12 - карта рС185512.
Фиг.13 - полноразмерная оптимизированная относительно кукурузьї последовательность ДНК, кодирующая теплоустойчив: белок СіуІА(в), содержащийся в рС135513. 65 Фиг.14 - карта рРС1В551Р
Фиг.15 - полноразмерная оптимизированная относительно кукурузьї последовательность ДНК, кодирующая теплоустойчивьій ген СтуІА(Б), содержащийся в рС185514.
Фиг.16 - карта рС185514.
Фиг.17 - карта рС184418.
Фиг.18 - карта рС184420.
Фиг.19 - карта рС134429.
Фиг.20 - карта рС184431.
Фиг.21 - карта рС184428.
Фиг.22 - карта рС184430. 70 Фиг.23А - таблица, содержащая даннье об уровнях белка сіуІА(Б) я трансгенной кукурузе.
Фиг.23В - таблица, в которой обобщень результать! биологического испьітания Озігіпіа НаїІаггаєа на поМассе листа от потомства кукурузьі, содержащей оптимизированньй относительно кукурузь! ген СтуІА(б).
Фиг. 23С - таблица, содержащая даннье об уровнях белка СгуІА(Б)в трансгенной кукурузе.
Фиг. 23Д.,- таблица, в которой обощень результать! биологическоо испьітания Озігіпіа и ОІаїгаєа на биомассе /5 листа от па кукурузьї, содержащей синтетический ген кукурузьі, операбельно связанньй с промотором сердцевинь.
Фиг. 23Е - таблица, содержащая даннье об зкспрессии гена сгуїА(Б) я трансгенной кукурузе при использовании преимущественно сердцевинного промотора.
Фиг.24 - полная геномная последовательность ДНК гена кукурузьі, коюодирующая триптофан синтетаза-альфа 2о бубьединицу. Показань! интоонь, зксоньі, начала транскрипции и трансляции, начало и конец кКДНК. Начало й конец кКДНК обозначено знаком 5, начало транскрипции обозначено как 41, поаймер расширяющий праймер обозначен как 73Х000х начало трансляции обозначено как 4-1, терминирующий ко-дОн обозначен как жк, комплементарньсе парь /Бр/ 1495-99 соответствуют рамке ССААТ, рр 1593-1598 соответствуют рамке ТАТАА, рр
Р7г0-3725 соответствуют поли-А дополнительному сайту, Мо над подчеркнутьми последовательностями Га означаєет праймерь! цепной поли-меразной реакции /ЕСт/к.
Фиг25А, 258, 25С, 25Д - аналиаіїнозерн блотов, показьивающие дифференциальную зкспрессию гена і9) кукурузьї, кодирующего ТгтрА субьединицу в ткани кукурузьї через 2-часовье, 4-часовье, 18-часовье и 48-часовне интерналь! соответственно при температуре, равной -802С с использованием усиливающих зкранов
ВБиРопі сгопех. Буквами обозначень!і: Р - сердцевина, С - початок-кукурузьі, ВК - опорнье корни, Е5 - стебель чЕ початка, І Р- нижняя сердцевина, МР - средняя сердцевина, ОР- верхняя сердцевина, 5- семя,! - лист,К - корень, Р /слева вверху/ - совокупная сердцевина. о
Фиг.26 - анализ нозерн блота, где два левьїх столбца показьвают зкспрессию гена кукурузьі ТТрАв лист Л//и че сердцевину /Р/ инбредньх линий Фанка 2ІІД и 5М984. Пять правьїх столбцов указьвают на отсутствие зкспрессии в полную РНК линии Фанка 21ІД семени. Знаком 5/1, 2, З, 4 и 5/ обозначень! семена чеезз 1, 2, 3, 4 со и 5 недель после опьіления. Буквами обозначено: І- лист, Р - сердцевина"М- семена через Мо недель после чІ опьіления.
Фиг.27 - анализ саузерн блота линии Фанка 2ІІД геномной ДНК с кукурузной кКДНК 8-2ТтрА /рСІЗ5600/, где З означаєт Вамні, Е обозначаєт ЕсоКІ, ЕМ означает ЕсокМ, К означаєт НІМО І, а зозначаєт засі. Знаками ІХ.. «
БХ, 10Х обозначень!ї зквиваленть! реплики реконструированного гена.
Фиг.28А- анализ расширения праймера, которьй показьвшаєт начало транскрипции гена кукурузь, - с кодирующего ТгтрА субьединицу, и секвенирующего лзддера. Столбцьі 41 и «2 характеризуют образць ІХ ж 0,5Хх ц реакции расширения праймера. ,» Фиг.288 - анализ защить от РНКазьі от 42 рр до 4387 Ьр при температурах гибридизации, равньїх 422С, 482С, 542С, через 16 часов зкспонирования на пленку при температуре, равной -80 С с использованием усиливающих зкранов ЮиРопі сгопех. ї- Фиг.29 - -карта исходного специфически пьільцевого клона ДНК второго типа. Показано субклонирование о трех Фрагментов ЕсокіІ в блюскрипт-векторь!ї для образования рС183168, рС183169 и ІІ - .6.
Рйс.30 - ДНК последовательность кукурузного гена к ДНК кодирующего специфически пьільцевую - кальций-зависимую протеинкиназу, содержащаяся в фрагментах исходного клона кДНК второго типа с о 50 размером ІКб и 0,5КЬ. Показан сайт ЕсокКіІІЇ, которьій делит фрагменть! с длиной ІКо и 0,5КЬ. Указанная кКДНК не является полноразмерной, при зтом инициирующий сайт мРНК на карте располагается на 490 рр вьіше конца ї» клона кКДНК.
Фиг.31 - специфически тканевая зкспрессия мРНК пьільцевой СДРХ. РНК из указанной кукурузной ткани 211Д денатурирована, подвергнута злектрофорезу на геле агарозьі, трансформирована на нитроцеллу-лозу и пробирована с фрагментом длиной 0,5 Ко кКДНК пьільцевой СДРК. мРНК обнаруживаеєется только в пьІльце, в о которой наблюдается сильньй сигнал.
Фиг.32 - сравнение аминокислотной последовательности пьільцевой СДРК овьіделенной белковой їмо) последовательности и белковой последовательности протеинкиназь! 2 КРЬЇСЬ, описанной Тобітаїзи егаї., - 9.
ВІоІ. Спет. 263:16082-16086 /1988/. Для оценки последовательностей бьіла использована отлаженная програма 60 АІпд содержащая пакет программ ЮОМАвзвіаг. Гомология к протеинкиназам обнаруживаеєется на 2/3 5-конца гена, т.е на фрагменте длиной 1,0ОКб.
Фиг.33 - сравнение аминокислотной последовательности пьільцевой СДРК овьіделенной белковой последовательности и белковой последовательности кальмодулина человека, описанной різпег еї аї., |. Віої.
Спет. 263:17055-17062 /1988/. Гомология с кальмодулином находится на 1/3 3-конца гена, т.'е-на фрагменте б5 длиной 0,5КЬ.
Фиг.34 - сравнение аминокислотной последовательности пьільцевой СРДК овьіделенной белковой последовательности и СРДК сои. Гомология наблюдается на протяжений всего гена.
Фиг.35 - последовательность кукурузного гена специфически пьільцевой СРДК. Перед инициирующим сайтом мРНК показана последовательность длиной 1,4КЮ. Позиции семи зкзонов и шести интронов показань
ПОД соответствующей последовательностью ДНК. Показан сайт полиаденилирования в клоне кКДНК.
Фиг.36 - карта рС184433.
Фиг.37 - полноразмерная гибридная оптимизированная относительно, кукурузьі последовательность, кодирующая теплоустойчивьй белок сгуІА(Б).
Фиг.38 - карта рС185515. 70 Описание последовательностей.
Последовательность 1 - последовательность ДНК полноразмерного нативного гена сгуІА(б).
Последовательность 2 - последовательность ДНК полноразмерного чистой оптимизированного относительно кукурузь! синтетического генаві сгуіА(б)
Последовательность З - последовательность ДНК укороченного оптимизированного относительно кукурузь! /5 бинтетического генаві сгуій(б) с длиной, равной приблизительно 2 кр.
Последовательность 4 - последовательность ДНК полноразмерного оптимизированного относительно кукурузь! синтетического генаві сгуІА(б).
Последовательность 5 - последовательность ДНК синтетического гена Ві с длиной, равной 2 кр согласно
Регіак и др.
Детальное описание изобретения.
Для однозначности понимания терминологии в смьісле, используемом в описаний и формуле настоящего изобретения, принятьї следующие определения:
Преимущественно кукурузньій кодон: преймущественньій кодон - зто кодон, которьій преймущественно зксгибинируется клеткой-хозяином при использований нуклеотидньїх кодонов для точного определения с г Заданной аминокислотьі. Преимущественньій кодон для аминокислоть! определенного хозяина представляет собой единичньй кодон, которьій найболее часто кодирует указанную аминокислоту указанного хозяина. і)
Преимущественно кукурузньій кодон для данной аминокислотьі может бьть получен из известньїх генньх последовательностей кукурузь. Например, использование кукурузного кодона для 28 генов кукурузньх саженцев приведено В Таблице 4 /Миїгтгау (е аї., МисівІс Асідз Кезеаср,17:477-498 /1989/, на которую делаются «г зо Ссьілки в данном описаний. Например, прейимущественно кукурузньій кодон для аланина представляет собой
ОСС, так как согласно обьединенньмм последовательноетям 26 гонов кукурузьі п «Мигтау и др., зтот кодон о кодирует аланин в 3695 случаен, в та время, как СО - в 2496,, ОСА - в 1395, а ОСТ - 2795 случаев. -
Последовательность, оптимизирования относительно чистой кукурузь: оптимизированньй ген или последовательность ДНК соответствуют гену, в котором нуклеотидная последовательность нативного гена со з5 Модифицирована с целью использования преимущественньїх кодонов для кукурузьі. Например, синтетический «г оптимизированньй относительно кукурузьі ген Ві сгуїА(Б) является геном, в котором нуклеотидная последовательность нативного генаві сгуїА(в) модифицирована так, что используемье кодоньі! представляют собой преиймущественно кукурузнье кодоньі, как зто описано вьше. Ген, оптимизированньй относительно чистой кукурузьі, является геном, в котором нуклеотидная последовательность содержит 100 процентов « последовательностей преимущественно кукурузного кодона для данного полипептида. Например, в с оптимизированньій относительно чистой кукурузьі генВі сгуїА(Б) является геном, в котором нуклеотидная последовательность содержит 100 процентов последовательностей прейимущественно кукурузного кодона и ;» кодирует полипептид с той же самой аминокислотной последовательностью, что и последовательность, виіработанная нативньїм геном Ві сгуїА(Б). Чистая нуклеотидная последовательность оптимизированного гена
Может бьть таюке изменена с тем, чтобьї позволить манипулировать геном, например, путем замень ї5» нуклеотида для образования или исключения рзстрикционньїх сайтов. Чистая нуклеотидная последовательность оптимизированного гена может бьть также изменена для исключения потенциально со вредньїх процессирующих сайтов или сайтов распознавания интрона. - Признано, что могут бьть также использованьй "частично оптиуи-зисораннье относительно кукурузь" последовательности. Понятие "частично оптимизированная относительно кукурузь!" означает, что кодирующий о участок гена является химерньм участком /гибридом/, содержащим последовательности, вьіделенньюе из ї» нативного инсектицидного гена, и последовательности, оптимизированнье для зкспрессии в кукурузу. Частично оптимизированньій ген зкспрессирует инсектицидньій белок на уровне, достаточном для борьбь с насекомьіми-вредителями, причем такая зкспрессия осуществляется на более вьісоком уровне, чем ов Ддостигаемая при использований только нативньх последовательностей. Частично оптимизированньєе относительно кукурузьі последовательности включают те из них, которье содержат по меньшей мере около 590 (Ф, оптимизированньїх последовательностей. ка Полноразмернье геньіВі зтот термин относится к последовательностям ДНК, содержащим полную нуклеотидную последовательность, необходимую для кодирования полипептида, образованного нативньм бо Геном ВІ. Например, нативньй ген ВІ сгуїА(Б) имеет длину, равную приблизительно 3,5 кь и кодирует полипептид с длиной, составляющей приблизительно 1150 аминокислот. Полноразмерньй синтетический ген Ві сгуїА(в) предположительно имеет длину, равную приблизительно 3,5кКр.
Укороченньюе геньі Ві: зтот термин относится к последовательностям ДНК, содержащим нуклеотидную последовательность с меньшей, чем полная, длиной, необходимую для кодирования полипептида, 65 образованного нативньмм геномВі, но которая кодируем участок активного токсина полипептида. Например, укороченньій синтетический ген с длиной, равной приблизительно 1,9к0, кодирует участок активного токсина полипептида таким образом, что белковьій продукт проявляет инсектицидную активность.
Премущественно - тканевьій промотор: термин "преимущественно тканевьій промотор" используется для указания на то, что данная регуляторная последовательность стимулирует более вьісокий уровень транскрипции связанного структурного гена или кодирующей последовательности ДИК, или зкспрессийи продукта связанного гена, как на зто указьівает любая обьічная проба РНК или белка, или для указания на то, что данная последовательность ДНК показьівает некий характерньій зффект, т.е., что транскрипция связанньх последовательностей ДНК или зкспрессия продукта гена больше в какой-то ткани, чем во всех других тканях растения. 70 Термин "Специфически - тканевьій промотор" используется для указания на то, что данная регуляторная последовательность ДНК стимулирует транскрипцию связанной кодирующей последовательности ДНК в основном полностью в одной или более тканях растения, или в одном виде ткани, например зеленой ткани, тогда как во всех других тканях или видах тканей растения транскрипция указанной связанной кодирующей последовательности ДНК в основном не осуществляется.
Настоящее изобретение направлено на создание последовательностей ДНК, оптимизированньїх для зкспрессии в растения, особенно в кукурузу. В предпочтительном варианте вьшполнения настоящего изобретения последовательности ДНК кодируют продукт - инсектициднрго токсина, преймущественно полипептид, разделяющий в основном аминокислотную последовательность инсектицидного кристаллического белкового токсина, обьчно производимого ВасіПй5 (пигіпдіепзіз. Синтетический ген может кодировать го Укороченньій или полноразмерньй инсектицидннй белок. Особенно предпочтительньми являются синтетические последовательности ДНК, которне кодируют полипептид, зффективнье против насекомьїх вида
Іерідоріега и СоІеоріега и синтетические последовательности ДНК, кодирующие полиптид, имеющий аминокислотную последовательность, в основном ту же, что и аминокислотная последовательность кристаллических белковьїх токсинов ВасіПиз (пигіпдіепзіз разновидности Кигаїак!І "НО-Ї. сч
Настоящее изобретение направлено на создание синтетических последовательностей ДНК, зффективньх для обеспечения вьісокойин-тенсипной зкспрессии активньхх инсектицидньіїхгбелков в растения, і) преимущественно в протоплазму кукурузьї, клетки растений и растения. Синтетические последовательности
ДНК согласно настоящему изобретению модифицировань! таким образом, чтобьі иметь сход-ствос геном кукурузь! в смьісле использования кодона и содержания С к С. В результате зтих модификаций синтетические «Е зо последовательности ДНК согласно настоящему изобретению не содержат потенциально процессирующих сайтов, которне присутствуют в нативном гене. Полученнье в результате синтетические последовательности о
ДНК /синтетические кодирующие последовательности ВІ ІР/ и векторьї трансформации растения, содержащие -жр указанную синтетическую последовательность ДНК/ синтетические геньі Ві ІР/ приводят к неожиданно увеличенной зкспрессии синтетического гена Ві ІР по сравнению с нативньим геном Ві ІР, исходя из со з5 продуцирования инсектицидного белка в растениях, особенно в кукурузе. Вьісокий уровень зкспрессии приводит «г к тому, что клетки кукурузьі и растения проявляют устойчивость к чешуйчатокрьільм насекомьм, особенно К
Европейскому зерновому точильщику и Оіаїгеа зассптаг ІІз, сахарному точильщику.
Синтетические последовательности ДНК согласно настоящему изобретению предназначень! для кодирования инсектицидньїх белков из ВасПиз (Пигіпдіепвзів, однако оптимизирована для зкспрессии я кукурузу, « 470 Мсходя из содержания С т С и использования ко-донов. Напримео, для осуществления обратной трансляций в с аминокислотной последовательности токсина, Продуцированного геном сгуїА(Б) ВасіПив (Пигіпдіепвів разновидность Кигвіакі! НО-1, применяя только найболее предпочтительнье кодонь! кукурузьі, используется ;» таблица использования кодонов кукурузьї, приведенная Мигтау еї аіІ, см. виіше. Обратно транслированной последовательностью ДНК считается оптимизированная относительно чистой кукурузь! последовательность,
Которая показана как Последовательность 4. Указанная последовательность затем модифицируется для ї5» исключения сайтов зндонуклеазь! рестрикции, которье являются нежелательньми, и для создания требуемьсмх сайтов рестрикции зндонуклеазьі. Указаннье модификации предназначеньї для облегчения клопирования гена со без ощутимого изменения использования кодонов или ооптимизированной относительно кукурузь - последовательности. Во время процесса клонирования с целью облегчения клонирования гена проводятся другие модификации на участке, которьій по-видимому проявляет особую восприимчивость к ошибкам, о индуцированньм при клонирований за счет цепной о полимеразной реакций /РСК /. Конечная ї» последовательность синтетического оптимизированного относительно кукурузьь гена Ві ІР показана как
Последовательность 2. Сравнение синтетического оптимизированного относительно кукурузьі гена ВЕ ІР с нативньм геном сгуїА(бв) ВІ Кигаїакі показана на фиг.1. 5Б В предпочтительном варианте настоящего изобретения белок, продуцированньй" синтетической последовательностью ДНК, является зффективньм средством борьбьі с насекомьми вида І ерідоріега или (Ф, СоІеоріега В наиболее предпочтительном варианте полипептид, закодированньй синтетической ка последовательностью ЛІК, содержит р оосновном полноразмерную или укороченную аминокислотную последовательность инсектицидного белка, обьчно продуцируемого ВасіПйиз5 (Пигіпдіепзіз разновидности бо Кигвсакі НО-1. В конкретном варианте исполнения синтетическая последовательность ДНК кодирует полипептид, содержащий существенно укороченную аминокислотную последовательность белка СтуІА(б) ВІ.
Инсектициднье белки согласно изобретению зкспрессируются в растение в количестве, достаточном для борьбь! с насекомьіми-вредителями, т.е. в насекоморегулирующих дозах. Признано, что степень зкспрессийи инсектицидного белка в растение, необходимая для борьбь! с насекомьіми, может значительно изменяться в 65 зависимости от особенностей растения, вида насекомьїх, факторов окружающей средь и т.п. В общем случає популяция насекомьїх будет поддерживаться ниже зкономически обоснованного порога, которьій изменяется от растения к растению. Например, для борьбьі с Европейским зерновьім точильщиком, воздействующим на кукурузу, зкономический порог составляет 0,5 яйцемасс на растение, что приводит к появлению приблизительно 10 личинок на растение.
Способьі, предлагаемье настоящим изобретением, могут бьіть использовань!ї для борьбьі с широким крутом насекомьїх, включая, но не ограничиваясь нижеперечисленньм: личинки, повреждающие корни, гусеница озимой совки, личинки бабочки-ночниць!, жук-щелкун, тля растительная, зерновье точильщики, в частности,
Европейский зерновой точильпик, сахарньій точильщик, Юго-западньїйй зерновой точильщик и т.д.
В предпочтительном варианте вьшолнения настоящего изобретения синтетическая кодирующая /о последовательность ДНК, оптимизиоованная для зкспрессии в кукурузу, содержит б ж С в процентном отношений больше, чем последовательность нативного гена сгуіА(Б). Предпочтительно, чтобь! процентное содержание С жї- С по меньшей мере составляло приблизительно 50 процентов, более предпочтительно - по меньшей мере около 60 процентов. Особенно предпочтительно, чтобьі содержание С ж- С составляло приблизительно 64 процента.
В другом предпочтительном варианте вьіполнения настоящего изобретения синтетическая кодирующая последовательность ДНК, оптимизированная для зкспрессии ов кукурузу, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 9О-процентную гомологию (с оптимизированной относительно "чистой" кукурузьь нуклеотидной последовательностью нативного белка сгуіА(вБ) Васійиз (игіпдіепзіз, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95-процентную гомологию, найболее предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 98-процентную гомологию.
Другие предпочтительнье вариантьії вьшполнения настоящего изобретения включают синтетические последовательности ДНК, имеющие в основном последовательность ДНК Последовательности ІЮ Мо 4, также как и ее мутанть! или вариантьї; трансформирующие векторьі, содержащие в основном последовательность ДНК
Последовательности ІЮ Мо 4; и вьіделеннье последовательности ДНК, полученнье из плазмид рсСІВ440Є, с рС184407, рС184413, рС184414, рС184416, рС184417, рС184418, рС184419, рС184420, рС184421, рС184423, рС134434, рсС114429, рсС184431, рС184433. Наиболее предпочтительньми являются вьіделеннье (8) последовательности ЛІК, полученнье из плазмид рС184418 и рС184420, рС184434, рС184429, рС184431 и ро184433.
Для конструирования одной из оптимизированньїх относительно кукурузьї последовательностей. ДНК «Е зо согласно настоящему изобретению олигонуклеотидь! синтетической ДНК создаются со средней длиной, равной приблизительно 80 нуклеотидов. Указаннье олигонуклеотидьі предназначеньї для гибридизации с целью о получения, фрагментов, содержащих различнье четверти укороченного гена токсина. Олигонуклеотидь! для «- данной четверти гибридизируются и усиливаются с помощью РСК. Затем четверти клонируются и клонированньюе четверти секвенируются с тем, чтобь! вьіявить те из них, которне содержат необходимьсе со з5 последовательности. В случає, касающемся четвертой четверти, гибридизированнье олигонуклеотидь! «г клонируются непосредственно без усиления РСК. После вьіявления всех клонов четьірех четвертей, которне содержат открьтье считьвающие рамки, собираєтся неповрежденньй ген, кодирующий активньй инсектицидньй белок. Затем собранньіїй ген может испьітьіваться на инсектицидную активность против любого представляющего интерес насекомого, включая Европейского зернового точильщика /ЕСВ/ и сахарного « Точильщика / примерьі 5А и 5В соответственно/. При получений полностью функционального гена он вновь Ше) с секвенирует-ся для подтверждения его первичной структурьі. Находит, что полностью функциональньй ген обеспечиваєт 10095 уничтожение при биопробе против ЕСВ. Полностью функциональньй ген также ;» модифицируется для зкспрессиий в кукурузу.
Оптимизированньй относительно кукурузь! ген испьІітьіївается с помощью анализа транзиентной зкспрессии. Кодирующая последовательность нативного сгуїй(Б) Ві для активного инсектицидного токсина не ї5» зкспрессируется на подающемся обнаружению уровне в системе транзиентной зкспрессии кукурузьі. Таким образом, уровень зкспрессии синтетического гена может бьть определен. За счет использования со существующих способов зкспрессия белка в трансформированнье растения может бьіть увеличена по меньшей - мере приблизительно от 100 до приблизительно 50000 раз, более характерно- по меньшей мере от приблизительно 1000 до по меньшей мере приблизительно 22000 раз. о Увеличение зкспрессии инсектицидного гена до зффективного уровня не требует обработки нативного гена ї» по всей последовательности. Зффективность зкспрессии может бьть достигнута за счет обработки только участков последовательностей, необходимьіїх для получения увеличенной зкспрессии. Может бьіть получек полноразмерньій оптимизированньій относительно кукурузь! ген СтуіА(Б), содержащий белок нативной сгуїА(Бв) в последовательности. Например, на фиг.7 показан полноразмерньй оптимизированньй относительно кукурузь! ген сгуІА(б), которьій представляет собой синтетически-нативньй гибрид. Другими словами, приблизительно 2Кр
Ф) гена /нуклеотидь! 1-1938/ в кукурузе оптимизированьі, т.е. являются синтетическими. Оставшиеся, ка С-терминальнье нуклеотидь 647-1155, идентичньії соответствующей нативной последовательности гена сгу!А(в). Конструкция показанного на рисунке гена описана ниже в примере 6. 60 Общепризнанно, что путем использования приведенньх в настоящем описаний способов могут бьть сконструированьі и испьітаньі на зкспрессию различнье синтетические/нативнье гибридьі. Важньм аспектом гибридной конструкции является то, что с целью борьбь! с насекомьіми-вредителями белок продуцируется в значительньїх количествах. Указанньім способом могут бьіть идентифицировань! критические участки гена, которье синтезируются, используя преимущественнье кодоньі. Синтетические последовательности могут бьіть 65 связань! с нативньіми последовательностями, как зто показано в нижеприведенньйх примерах. В общем случає,
М -концевье участки или процессирующие сайть, с целью увеличения зкспрессии в растения, могут бьть синтезированьї и замещень в нативной кодирующей последовательности.
В другом варианта вьіполнения настоящего изобретения оптимизированнье относительно кукурузь! гень, кодирующие белок сгІА(бБ), могут бьїть подвержень! манипуляциям для придания кодируемому белку большей Теплоустойчивости или температуроустойчивости по сравнению с нативньм белком сгуІА(Б). Показано, что ген сгуіА(Б) обнаруженньй в ВасПШиз (пПигіпоаіепвзіз КигеїакІі НО-1 содержит делецию из 26 аминокислот, по сравнению с белками сгуіА(а) и сгуїА(с), в -СООН половине белка. Указанная делеция приводит к получению температурочувствительного белка сгуїА(Б). См. (зеізег, патент ЕПВ 0 440 581, озаглавленньй "Температуроустойчивьй ВасіПйиз (пигіпдіепвів -Гоксин". Репарация указанной делеции соответствующим /о участком из белка сіуїАс(а) или сіуІАсс) повьішаєт температуроустойчивость репарационного белка. Конструкции полноразмерного модифицированного синтетического гена сгуїА(Б) предназначеньй для введения последовательностей, кодирующих недостающие аминокислоть! в соответствующем месте последовательности без изменения считьвающей рамки и без изменения остатка белковой последовательности. Полноразмерньй синтетический вариант гена собирается путем синтезирования ряда кассет двухцепочечной ДНК, каждая из 7/5 Которьїх имеет длину, равную приблизительно ЗООБр, используя стандартную методику синтеза ДНК и ферментативньїх реакций. Считают, что репарационньй ген кодирует "теплоустойчивьій" или "температуроустойчивьй" белок сгуїА(Б), т.к. он сохраняет большую биологическую активность, чем его нативньій двойник при воздействии вьісоких температур. Специфические последовательности оптимизированньх относительно кукурузь теплоустойчивьсх генов сгУІА(В), кодирующие температуроустойчивье белки, показань! на фиг.9, 11, 13, 15, а также описаньії в нижеприведенном примере 7.
Настоящее изобретение включаєет оптимизированнье относительно кукурузь кодирующие последовательности, которье кодируют другие полипептидь, включая инсектициднье полипептидь, полученнье НЄ ОТ ВасіШиз (пигіпдіепзіз, или инсектициднье белки из других источников. Например, гень! сгу!В могут бьіть оптимизировань относительно кукурузьі, а затем целенаправленно введень в растения, в частности, с 2г5 Кукурузу. Последовательность оптимизированного относительно кукурузьі гена сгуїВ, сконструированного в соответствии с настоящим изобретением, показана на фиг.б. і)
Оптимизация генаві ІР для зкспрессии в кукурузу, используя преимущественно кукурузньій кодон согласно настоящему изобретению, приводит к значительному возрастанию зкспрессии инсектицидного гена. Следует ожидать, что могут бьїть синтезированьі другие геньї, используя преимущества растительньїх кодонов для «Е зо улучшения их зкспрессии в кукурузу или другие растения. Использование преймущества кукурузного кодона является возможньм способом оптимизации и максимизации зкспрессии чужеродньїх генов в кукурузу. Такие о геньі включают те из них, которве используются в качестве селектирующих или метящих маркеров при «- трансформации кукурузьї, а также геньї, обеспечивающие гербецидоустойчивость, и геньії, обеспечивающие устойчивость к болезням и к воздействию насекомьх. со
Синтетический ген сгуїА(Б) также вводится в Адгорасіегішт векторь, которье применяются для «Е трансформации большого разнообразия видов двудольньх растений. /пример 44/. Растения, целенаправленно трансформированнье синтетическими Адгобрасіегічт векторами, показьівают инсектицидную активность.
Нативньїй ген сгуіА(Б) ВІ имеет довольно большое количество А ї- Т. Содержание (з ї- С в полноразмерном нативном гене сгуіА(Б) ВІ составляет приблизительно 3995. Содержание С ж- С в укороченном нативном гене « 9УА(В) ВЕ, имеющем длину,равную приблизительно 2кКр, составляет примерно 3795. Обьчно участки, шщ с кодирующие кукурузу, имеют тенденцию к превалирующему содержанию 5 б ї- С. Модификации гена сгуїІА(в) ВІ позволяют получить участок, кодирующий синтетический ІР, содержание С ж С в котором превьішаєт 5095, а ;» гомология на уровне ДНК с нативньїм геном сгуіА(Ь) составляет приблизительно 6595. Белок, закодированньй указанньмм синтетическим геном СтгуіА(Б), имеет 100-процентную гомологию с нативньм белком и, таким образом, полностью сохраняет свой функции в смьісле инсектицидной активности. Укороченньй синтетический їх ген сгуїА(Б) ІР имеет длину, равную приблизительно 2кр, и кодирует участок активного токсина нативного инсекти-цдидного белка сгуїА(Б) ВІ Кигвіакі. Длина белка, закодированного укороченньім синтетическим геном со сгуЇА(В), составляет 648 аминокислот. - Синтетические геньії согласно настоящему изобретению применяются для усиления зкспрессиий в трансгеннье растения, найболее предпочтительно в трансформированную кукурузу. Трансгеннье растения в о соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для зкспрессии инсектицидного белка сгуіА(бБ) ї» на вьісоком уровне, обеспечивая их устойчивость к насекомьім-вредителям, особенно к жесткокрьільм или чешуйчатокрьільм насекомьм, преймущественно к Европейскому зерновому точильщику /ЕСВ/ и сахарному точильщику. 5Б Согласно настоящему изобретению кодирующая последовательность ДНК синтетического оптимизированного относительно кукурузьї гена может находиться под контролем регуляторньїх злементов, (Ф, например, промоторов, которне направляют зкспрессию кодирующей последовательности. Такие регуляторнье ка злементьї включают, например, функциональнье промоторьї однодольньх растений /кукурузьь и других однодольньх растений/, обеспечивающих зкспрессию гена в различнье части кукурузного саженца. бо Регуляторнье злементь - могут бьть конститутивньми, т.е. они могут стимулировать непрерьівную и устойчивую зкспрессию гена. Такие промоторьі включают, не ограничиваясь нижеперечисленньім, промотор
Самм 195, промотор СдММ 353, А. Штегстасіеєпе промоторь, например, промоторь! синтетазь! октопина, промоторьії синтетазьь маннопина, промоторь синтетазьь нопалина или промоторь! синтазь! другого спина, убиквитинойье промоторь, актиновье промоторь, гистоновье промоторьі и тубулиновье промоторь. 65 Регуляторньій злемент может представлять собой прейимущественно тканевьій промотор, т.е. промотор, способньй стимулировать более вьісокую зкспрессию в определенньюе ткани растения, чем в другие ткани.
Преимущественно тканевьій промотор предпочтительно направляет более вьісокую зкспрессию синтетического гена в листья, стебли, корни и/или пьільцу, чем в семя растения. Регуляторньій злемент может бьіть также индуцируемьм, например, за счет термостресса, водного стресса, питания насекомогоили химической Мндукции, или же может бьть звалюционно регулированньм. Специалистам в данной области известнь множество промоторов, зкспрессия которьїх изменяется в ткани специфическим образом. Примером одного из таких промотор является фосфозноллируват карбоксилаза /РЕРС/ кукурузьі, которая является Специфическим для зеленой ткани промотором. См., например, Ниадзрефй, К.І. НоОгуїа, 9У.МУ., Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду 12: 579-589, 1989/. Другими специфическими для зеленой ткани промоторами являются хлорофилл а/ь 7/0 бвязьвающие белок промоторьї и промоторьї небольших субьединиц КибрізСО.
Настоящее изобретение направлено также на создание вьіделенньїх и / очищенньх преимущественно-сердцевинньїх промоторов. В предпочтительньїх случаях прейимущественно-сердцевиннье промоторь! вьіделяются из травянистьїх однодольньх растений, таких как сахарньй тростник, рис, ячмень рута, сорго, пшеница и кукуруза; более предпочтительньіми являются промоторь!ї, вьіделеннье из кукурузньх /5 Ссаженцев.
В предпочтительном варианте преимущественно сердцевинньій промотор наделяется из растительного гена
ТгрА; К наийболее предпочтительном варианте промотор вьіделяется из кукурузного гена ТгрА. Т.е. промотор в своем нативном состоянии является оперативно связанньм с геном кукурузьї, кодирующим триптофан синтаза-альфа субьединицу /в последующем "ТгрА"/. Закодированньійй белок имеет молекулярную массу, го равную приблизительно З8кД. Вместе с другой альфа-субьединицей и двумя бета-субьединицами ТгрА образует многомерньій фермент, триптофан синтезу. Каждая субьединица может действовать самостоятельно, но более зффективно они функционируют совместно. ТгрА катализирует трансформацию индоло-глицеролфосфата в индол. До настоящего изобретения ни кукурузньій ген ТгтрА, ни закодированньй белок, не бьіли вьіделеньі из какого-либо растения. Агарідорзіз (паПйапа ген, кодирующий триптофан синтаза сч бета субьединицу бьіл клонирован, как зто описано у МУгідні еї аІ., Те Ріапі Сей , 4:711-719 /1992/, Чисто кукурузньй ген ТгрА не имеет гомологии с геном, кодирующим бета субьединицу. і)
Настоящее изобретение обеспечиваєт также получение очищенньїх специфически-пьільцевьїх промоторов из растительного гена, кодирующего кальций-зависимую фосфат киназу /СРОК/. Другими словами, в своем нативном состоянии промотор оперативно связан с растительньм геном СРОК. В предпочтительном варианте «Е зо промотор вьіделяют из кукурузного генасрвк. Термин "специфически-пьільцевой" означает, что зкспрессия оперативно связанного структурного гена, представляющего интерес, в основном осуществляется только /т.е о поактически полностью/ в пьільцу растения и в незначительной степени по все другие части растения. Под «- термином " СРОК " подразумевают протеин кинару растения, которая имзет вьісокую степень сродства для кальция, но не для кальмодулина, и для своей каталитической активности требует кальций, а не кальмодулнн. со
Для получения прейимущественно-тканевьхх или специфически-тканевьхх промоторов геньії, кодирующие РНК («р специфически-тканевого переносчика /мРНК/, могут бьїть полученьї за счет дифференциального скрининга библиотеки кДНК. Например, преимущественно-сердцевинная кКДНК может бьть о получена при дифференциальном скринингег библиотеки сердцдевинной кКДНК, используя пробьі КДНК, полученнье из меНК сердцевиньії и семени. См. МоїЇесцшіаг Сіопіпу, А І арогаїогу Мапиеї, ЗатрбгооК еї аї., едз.Соїй Зргіпд Нагрог «
Ртезв: Мем Хогк (1989). з с С другой стороньії, специфически-тканевне промоторь! могут бьіть получень! путем получения специфически тканевьїх белков, секвенирования М-концов, синтеза олигонуклеотидньїх проб и использования проб для ;» скрининга библиотеки кКДНК. Такие операции поясняются примерами, описанньїми в разделе, которьйй касается зкспериментов по вбіделению специфически-пьільцевого промотора.
Обьем притязаний настоящего иизобретения, касающихся прейимущественно-сердцдевинньх и ї5» специфически-пьільцевьїх промоторов, включает в себя функционально активнье фрагменть! полноразмерного промотора, которье также способнь направлять преимущественно-серддевинную или со специфически-пьільцевую транскрипцию, соответственно, связанньїх структурньх генов. Функционально - активньіе фрагменть! последовательности ДНК промотора могут бьіть вьіделеньі из последовательности ДНК 5о промотора с помощью нескольких известньїх специалистам способов, например, расщеплением о последовательности ДНК промотора, используя рестриктазь, о синтезируя в соответствий с ї» последовательностью последовательности ДНК промотора, или могут бьіть полученьі с помощью технологии -РСК. Киї» еї аї!., КечІ. Кпгутої. 155:335-350 (1987); ЕпІсй (ед.), РОК Тесппоіоду, ЗіосКіеп Ргезз (Мем Хогк 1989).
Кроме того, в обьем притязаний настоящего изобретения включеньї преимущественно-сердцевиднье-и вв специфически-пьільцевьіе промоторь, зквивалентнье полноразмерньм промоторам. Другими словами, различнье нуклеотидь! или группь! нуклеотидов могут бьіть модифицировань, введеньї или удалень! способом, (Ф, которьїй не прекращает активность промотора в соответствии с известньіми способами. ка Преимущественно-сердцевинньій промотор, полученньй из кукурузного гена, ТгтрА показан на фиг.24.
Специалистьі в данной области, обладая информацией.о такой последовательности, должнь! признать, что бо преимущественно-сердцевиннье промоторьі, включеннье в обьем притязаний настоящего изобретения, могут бьіть получень из других растений путем пробирования библиотек сердцевин из указанньїх растений зондами , вьіделенньми из кукурузного структурного гена ТгрА. Зондьі, сконструированнье из последовательностей, которье имеют вьісокую степень консервации среди, генов, кодирующих ТгтрА субьединицу, как зто описано в примере 17, являются предпочтительньми. Другие специфически-пьільцевье промоторь!, которье в своем б5 Нативном состояний связаньь с генами СОРК растений, отличньїх от кукурузь», могут бьть вьіделень аналогичньм образом, используя, вьіделеннье из сохранениях участков кукурузного гена СРОК с целью пробирования пьільцевьїх библиотек.
В другом варианте настоящего изобретения преимущестйенно - сердцевинньй или специфически-пьільцевой промотор оперативно связан с последовательностью ДНК, т.е. со структурньім геном, / Кодирующим белок, представляющий интерес, с целью образования молекульї рексмбинантной ДНК или химерного гена. Вьіражение "оперативно связанньй с " известно специалистам в данной области и может бьїть использовано наряду с виіражениями "оперативно ассоциированннй с",, "связанньй с" или "слитьй с".
Структурньйй ген может бьіть гомологичен или гетерологичен к первоначальному промотору и/или целевому растению, в которьій он трансформируеєется. Независимо от опроисхождения последовательность 70 ассоциированной ДНК зкспрессируется в трансформированное растение в соответствии с зкспрессирующими свойствами промотора, с которьім сна связана. Таким образом, вьібор последовательности ассоциированной
ДНК должен вьтекать из потребности иметь последовательность, зкспрессированную указанньім способом.
Примерами гетерологичньїх последовательностей ДІК являются последовательности, которье кодируют инсектициднье белки, например, балки или полипептидь токсиньІіх или, оказьвающих ингибирующее воздействие на насекомьїх или других паразитньїх артроподов растений или растительньїх патогенов, таких как низшие грибьї, бактерий и нематодьі. Указаннье гетерологичнье последовательности ДЖ кодируют белки, такие как магайниннь 7азіої, РМАБЗ БА, 84:5449 ДО87/, сикропинь), Ниїтак ей а). , Виг. 9.
Віоопет.127:207-217 /1982/, аттациньї, Нийтагк еї аї, ЕМВО 3. 2:571-576 /1983/; мелиттин, грамицидин 5, Каїви еї аІ.,, Віоспет. ВіІорпуз. Асіа, 939: 57у63 /1988/; белки натруєного канала и синтетические фрагменть, ОІКІ еї ам. РМАБ БА, 85:2395-2397 /1988/; альфа-токсин іа-рпуіососсив ашгеизт ТобкКез еї аї., Віоспет., 24:1915-1920 /1985/; аполипобелки и их фрагменть, Кпої еї аІ., Зсіепсе 230:37 /1985/; МаКадама еї а!., 9. Ат. Спет. 5ос., 107:7087 /1985/; аламетициц и разновидность синтетических амфипатичес-КИХ пептидоп, Каїзег еї аї.,, Апп.
Кем. Віорпуз. Віорпуа. Спет. 16:561-581 /1987/, лектиньі, Ів еї аіЇ., Апп. Кем. Віоспет. ,55г 35-68 /1986/; ингибиторь! протеазьі и амилазьі; инсектициднье белки из ВасШиз (пигіпдіепвів, особенно дельта-зндотоксинь! сч ге из В. ШПигіпдіепвів; и из других бактерий или грибов.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения преимущественно сердцевинньій промотор, о полученньій из кукурузного гена, кодирующего ТгрА субьединицьі, или специфически-пьіІльцевой промотор, полученньій из кукурузного гена СОРК, оперативно связаньі с гетерологической последовательностью ДНК, кодирующей ВасіПйиз (Пигіпдіепвів /"в.4"/ инсектицидньій белок. Такие белки и соответствующие структурнье «г
Зо Геньі хорошо известнь! специалистам в данной области. См. Нопйе апа МУпІейіеу, Місгоріо!Ї. Кеміємув , 53:242-255 пово. о
Поскольку признано, что любой промотор, способньій направлять зкспрессию, может бьіть использован, «- предпочтение в использованиий отдается скорее гетерологическим промоторам, чем нативизму промотору белка, представляющего интерес. Зтим способом могут бьть сконструированьі нуклеотиднье со з5 последовательности химер, которье могут бьть оопределеньй на основе растения, подлежащего «г трансформации, а также насекомого-вредителя. Например, для борьбьі с о кукурузньіми насекомьіми-вредителями промотор однодольного растения или кукурузьї может бьіть оперативно связан с белком ВІ. Промотор кукурузьї может вьібираться из преимущественно тканевьїх или специфически тканевьх промоторов, например, преймущественно сердцевинньїх и специфически пьільцевьїх промоторов, « соответственно, как указано в данном описаний. в с З некоторьх случаях предпочтительньм считаєется трансформация клетки растения конструкцией, включающей более, чем один химерньй ген. Таким образом, например, единичное растение могло бьть з трансформировано преймущественно сердцевинньім промотором, оперативно связанньім с белком Ві, а также специфически пьільцевьім промотором, оперативно связанньм с белком Ві Трансформированнье растения обьічно зкспрессируют белки Ві в сердцевину и пьільцу растения и в меньшей степени в корни, другие корревье ї5» чехлики и опорнье корни.
По различньмм другим причинам, в частности, для управления потенциальной насекомоустойчивостью, со образующейся в инсектицидньїх балках, зкспрессирозанньїх в растение, целесообразно в одно и то же растение - зкспрессировать более одного инсектицидного белка /Р/. Можно бьло бьї зкспрессировать в одни и те же ткани 5ор два различньх гена Інапример, два различньїх дельта-зндотоксина, вьіделенньїх из ВасіПйив5 (Пигіпдіепвів, о которье связьшвают различнье рецепторьії в желудке целевого насекомого/, или можно вьіборочно ї» зкспрессировать указаннье два токсина в различнье ткани одного и того же растения, используя специфически-тканевье промоторьі. Зкспрессирование двух генов Ві /или любьїх двух инектициднмх генов/ в одно и то же растение, используя три различньїх специфически - тканевьїх промотора, вьізьіваєт затруднения к Пполучений растения, представляющего собой требуемьій фенотип. Три различньїх промотора, управляющие двумя различньми генами, создают шесть различньїх инсектицидньїх генов, которье требуется ввести в
Ф) растение в одно и то же время. С целью идентификации трансформированньїх растений при трансформации ка необходим также селектируемьй маркер. Зто означаєет введение семи различньїх генов в растение в одно и то же время. Наиболее целесообразньіїм является интеграция всех генов, особенно инсектицидньх генов, в одном бр М том же локусе генома растения, так что они ведут себя как единьій ген, обладающий свойственньім ему признаком, а не как множество генов, что труднее проследить при вьіведений коммерческих гибридов. Общее количество генов может бьіть уменьшено за счет использования различной специфически тканевой зкспрессийи различньїх инсектицидньїх белков.
Например, путем слияния сгуїА(Б) с промоторами пьільцьь и Фосфоенолпируваткарбоксилазь! /РЕР 65 карбоксилазьи можно получить зкспрессию зтого гена в зеленье ткани и пьільцу. Слиянием преимущественно-сердцевинного промотора с сгуЇВ дельта зндотоксином из ВасШив (пПигіпдіепзіз возможно осуществить зкспрессию указанного инсектицидного белка в сердцевину трансформированного растения в значительной степени, но зто не распространяется на ткани семени. Трансформация растения тремя генами,
РЕР карбоксилаза/ сгуїА(Б), пьільца/ сгуїА(Б), и сердцевина/ сгуЇВ позволяет пррдуцировать растение, Зкспрессируищее два различньїх инсектицидньх зндотоксина Ві в различньсе ткани одного и то же растения. Ген сгуіА(Б) может бьіть зкспрессирован во "внешние" ткани растения /особенно кукурузь//, т.е. з те ткани, которье поедает Европейский зерно-рой точильщик сразу же после его пояйления из личинки. Если бьї указанньй зерновой точильщик оказался устойчивьм к гену сгуЇА(в) и смог бьі внедриться в стебель растения после поедания ткани листа и/или пьільцьІ, он встретился бь с дельта-зндотоксином сгуїВ и подвергся бь 7/0 Воздействию второго инсектицидного компонента. Таким образом, можно дифференциально зкспрессировать два различньїх инсектицидньїх компонента в одно и то же растение и уменьшить общее число генов, необходимьїх для введения в качестве генетической единицьї, одновременно обеспечивая защиту от создания устойчивости у насекомого к одному инсектицидному компоненту.
Аналогичньїм образом, растение может бьіть трансформировано конструкциями, кодирующими более одного /5 вида инсектицидного белка для борьбь! с различньіми насекомьми. Специалистам в данной, области понятно, что может бьіть создано множество вариантов таких конструкций.
Молекульй рекомбинантной ДНК согласно настоящему изобретению могут бьть получень за счет манипуляции различньїми злементами, размещая их с различной ориентацией. Таким образом, для соединения фрагментов ДНК могут бьіть использовань!ї адаптерь! и линкерьі. Могут бьіть проведеньі другие манипуляции с 2о целью получения подходящих рестрикционньїх сайтов, удаления рестрикционнчх сайтов или избьточньх ДНК.
Такие видьї манипуляций могут вьіполняться известньіми способами. См. Затргоок еї аї., МоїІесшіаг сіопіпд: А
І арогаюгу Мапиаї, Сода 5ргіпд Нагбог І арогаюгу
Ргезв, зесопа еашоп, 1989. Например, для связьівания и лигпрсвзнпя могут применяться такие способь,, как рестрикция, устранение или усиление избьточности при получении тупьїх концов, лигирование линкеров, с дб Комплементарньхх концов Фрагментов ДНК. "М. вьіше, Затрьгоок еї аї.
В зависимости от способа, с помощью которого молекула вводится в геном вьібранного растения, в і) молекулу рекомбинантной ДНК могут включаться другие функциональнье последовательности ДНК. Например, в случає Адгорасіегійт-опосредствованной трансформации, если для Трансформации клеток растения используется Ті- или Кі -плазмида, правая и ливая границь! Т-ДНК ТіІ- и Кі-плазмидн связьіваются в качестве «г зо Фланкирующих участков с зкспрессирующей кассетой. Адгорасіегіт (Шптегїасіепз-опосредствованная трансформация растений описана Ногесіп еї аї., зсіепсе, 225:1229 /1985/; Маг-юп, Се Сийиге бЗотаїйс Сеї| о
Сепейсе ої Ріапів , 1:514-521 /1984/; НоеКета, п: Те Віпагу Ріапі Месіог БЗувіет ОйПйвеї -- ОгиККегі) "пе
Капіеге В.М.АІБіаззегдат, 1985, СПпаріег М Ргаіеу еї аїЇ.,СтгпКем.Ріапі ЗеІ4:1-46; и Ап еї аїЇ,, Втро 3 ., 4:277-284 /1985/.Молекульї рекомбинантной ДНК согласно настоящему изобретению с целью облегчения со з5 селекции в рекомбинантньїх клетках растения могут включать также маркерньй ген. Например, такие маркерь! «г отмечают устойчивость к биоцидам, таким как канамицин, гидромицин, хлорамфеникол, парамомицин, метотрексат, блеомицин, или ок гербецидам, таким,жак )имидазалон, сульфонидмочевина, глифосат, фосфинотрицин или биалофос. Маркерньсе геньї хорошо известньі! специалистам в данной области.
В другом варианте настоящего изобретения предусматривается получение устойчиво трансформированньх « растений с помощью вьшеуказанньх молекул рзкомбинантной ДНК или химерного гена. Получрнпое в /7- с результате тоансгенное растение содержит трансфор-мировпннмг ген устойчиво включенньій в его геном, и
Й зкспрессирует структурньй ген, оперативно связанньїй с промотором, соответствующим образом. а Трансгеннье растения, рассматриваемье настоящим изобретением, включают как однодольнье, так и вудольнье растения. Представительньми примерами таких растений являются кукуруза, люцерна, рис,
Ккартофель, подсолнечник /другие?/. В предпочтительнье растения включена кукуруза, особенно инбреднье ї5» линии кукурузь!.
Все трансформированнье растения, рассматриваемье настоящим изобретением, могут бьіть получень! с со помощью нескольких известньїх способов. А. (Шптегасіепз-опосредствованная трансформация описана вьіше. - Другие способь! предусматривают прямой перенос гена в протопластьі, Раз2Кому8КІ еї аіІ., ЕМВО .., 12:2717 /1984/; Гготт еї аїЇ., Маїцге 319:719 /1986/; бомбардировку микрочастицами, Кіеїп еї ді., Віо/Гесппоіоду, о 6:559-563 ДО88/инжекцию в протопластьї, культивируемье клетки и ткани, КеїЇсп еї аї., Віо/Тесппоіоду, ї» 4:1001-1004 /1986/; или инжекцию в меристемати-ческие ткани или в проростки и саженць, как зто описано ЮОе
Га рс-па еї аї.,, Майте ,325:274-276 /1987/; ОСгамевз еї аї., Ріапі. Мої. Віоі.-, 7:43-50 /1986/; Ноосукааз-Мап
Зіодіегеп еї ді., Майшге, 311:763-764 /1984/;- СгітвіІєеу еї аїЇ., Віо/Гесппоіоду, 6: 185 /1988/; и Огітвівеу еї аІ., Майге,325:177 /1988/, а также злектрофорез, патент мо92/09696/.
Паттерн зкспрессии структурного гена, оперативно связанного с преимущественно-тканевьм или (Ф, специфически-тканевьім промотором в трансформированном растений, содержащем то же самое, является ка критичньім в случае, когда структурньій ген кодирует инсектицидньій белок, Например, паттерн зкспрессии, являющейся преимущественно-сердцевинной, которая раскрьта в данном изобретении, позволяет бо трансгенному растению вьідерживать и противостоять патогенам и травоядньім, которье в первую очередь разьедают сердцевину, а также опорнье корни, внешнюю оболочку и листья растения, поскольку белок Ві зкспрессируется в меньшей степени, но все же в количестве, достаточном для борьбь! с насекомьми в зтих частях растений, однако в случае наличия обоих типов промоторов семена растения остаются неповрежденньми. 65 Примерні.
Следующие примерьї описьмвают материаль! и способьі), используемье для реализации изобретения. Зти примерьї являются чисто иллюстративньми и не ограничивают обьем притязаний изобретения.
Пример 1: Общие способь..
Манипуляции, проводимьсе с ДНК, осуществлялись с использованием процедур, являющихся стандартньми
В данной области. Зти процедурь! зачастую могут бить модифицировань и/или изменень! без существенного отличия в полученном результате. Помимо случаєв, на которье делаются ссьлки из других источников, большинство указанньїх процедур описаньї в Затьгоок еї а!., Моіесшаг Сіопіпо: А І арогаїюгу Мапиаї, Соїд Зргіпа
Нагбог І арогаюгу Ргезв, зесопа еашШоп, 1989. Синтез олигомеров ДНК:
Олигомерь! ДНК, содержащие от приблизительно двадцати до приблизительно девяноста, преимущественно /0 от приблизительно шестидесяти до приблизительно восьмидесяти, нуклеотилов, синтезируют с использованием синтезатора ДНК АрріІїей Віозузіетв, модель РРОВ, и стандартньїх процедур. Олигомерь получают, используя современньй цикл 5ЗСАБЕЗ в малоразмерной /0,2мкМ/ крупнопористой колонке АВІ.
Конечной процедурой является удаление третила и расщепление олигомера на колонке, используя автоматический цикл расщепления, предусмотренньй на установке 3808. Затем олигомерь! деблокируют в избьітке гидроокиси аммония /МН./ОН/ при температуре 552С в течение 8 - 12 часов. После зтого олигомерь вьісушивают в вьіпарном аппарате с использованием азота. Затем олигомерн ресуспендируют в 0,25 - О,б5мл деионизированной водь. Очистка олигомеров ДНК:
Аликвотную пробу каждого олигомера смешивают сравньм обьемом смеси синего красителя и формамида с получением Конечного " раствора, содержащего 0,0595 бромфенольной сини, 0,05956 цианолкси-лола ЕР и 2590 формамида. Указанную смесь нагревают при температуре 9593 в течение 10 минут с целью денатурирования олигомеров. Затем пробьї наносят на полиакриламидмочевинньй гель, содержащий 7М мочевинь /Затрогоок еї а! /. После злектрофореза при напря-жений 300 - 4008 в течение З - 4 часов, используя гелевую установку для вертикального злектрофореза /Ноегег Зсіепійіс Іпвігитепів, Зап Егапсівсо, СА/, осуществляют ультрафиолетовое зкранирование для локализации в геле фрагмента требуемого размера, которьій затем Га удаляют с помощью бритвьі. Фрагмент очищенного геля измельчают и инкубируют в буферном растворе из 0,4
ГІС и 1їмМ комплексона /ЕДТА/ /рН8/ в течение всей ночи при температуре 3720. і)
Для отделения олигомеров от остатков полиакриломидного геля используют любой из двух способов: с применением полизтиленовьх фильтров с размером пор 25мкм Сепе/х или фильтров тонкой очистки с размером опор 045бмкм - мембранного фильтра МС. Очищеннье олигомерьі осаждают озтанолом, че восстанавливают с помощью центрифугирования на микрофуте в течение 20мин при температуре 49С и о окончательно ресуспендируют в растворе ТЕ /ЛОмММ 1мМ ЕДТА, рНаі,0/. Концентрацию доводили до величинь, равной 5Онг/мкл,. основьіваясь на просматриваний при длине волньї 260ум. -
Определение размера олигомеров путем меченжя их киназой: Для определения размера некоторьх со олигомеров на секвени-рующем геле осуществляют реакциий мечения киназой, используя очищеннье синтетические олигомерь! каждого представительного размера: 40 олигом., 60 олигом., 70 олигом., 80 олигом., «І 90 одкромеров. В каждой из указанньїх реакций в 20О0мкл использовали Тпмоль очищенного олигомера в буферном растворе, содержащем 7мм тів рН7,5, 10мМ КСІ, їмМ Масі», 0,5мМ ДТТ /дитиотреитол/, 5Омкг/мл бьічьего сьівороточного альбумина, З00Омксї /3з пмоля/ 32Р-гаммаАТР, и 8 единиц полинуклеотидной киназь! Т4. «
Пробу киназьіь инкубировали в течение | часа при температуре 372С с последующей зкстракцией фенол/хлороформа и трех зтаноловьїхпреципитаций с гликогеном в качестве носителя /Ігасу, Ргер. Віоспет. т с 11:251-268 (1981). ч Две гелевье загрузки / одну, содержащую 1000 ерт" (" срм - импульсов в мин /прим, перев.), а другую, ни содержащую 2000 срт/кажлой реакции готовили вместе с 2595 формамнда, 0,0С5956 бромфеноловой сини и 0,0595 цианолксилола ЕЕ.
Олигомепь, маркисонанньр киназами, кипятили в течение 5 минут перед загрузкой на секвенирующий гель, ї- содержащий 695 полиакриламида и 7М мочевинь /ВКІ Се! Міх ТМб, ВКІ, СаНегериго, МО/. Реакция о секвенирования плазмидь рисіе проводится на том же геле с целью получения маркеров размеров.
После злектрофореза гель вьісушивают и зкспонируют на диагностическую рентгеновскую пленку /Кодак, - Х-ОМАТ АВ/. Полученньй авторадиографический снимок показьіваєт, что все подлежащие проверке очищеннье о 20 рлигомерь имеют правильньй размер. Олигоме-рь, которье не бьли измереньй непосредственно на секвенирующем геле, исследовали на геле из 695 полиакриламида и 7М мочевинь /ВКІ. сеї міх тмб/, используя їз» измереннье олигомерьі в качестве маркеров размеров. Все олигомерьі после загрузки на гель вначале денатурируют 2596формамидом при температуре 10023 в течение 5минут. Окрашивание геля полиакриламида зтидиумбромидом позволяет визуально наблюдать все олигомерь! с целью определения их размеров. 99 Гибридизация олигомеров для прямого клонирования:
ГФ! Подлежащие гибридизации олигомерьї обьединяют /от.1мкг до 20мкг общей ДИК/И юровоцят. киназную реакцию .1час в їх лигирующем буфере Рготеда , содержащем ЗОмМ Тгівз-НСІ рН7,8, 10ММ Маосі», ЛоММ ДТ и о 1мМм аАТР. В реакции в зависимости от количества присутствующей общей ДНК используют от 1 до 20 единиц полинуклеотидной киназь! Т4. Реакции маркирования киназой останавливают путем помещения пробь в ванну с 60 кипящей водой на 5 минут. Олигомерь, образующие 5-концьі! гибридизированньїх молекул, не метят киназами, а добавляют к меченьм киназой олигомерям имеете с дополнительньім буфером для гибридизации после нагрева. Обьединеннье оолигомерь вместе с буфером для гибридизации, используемьм с целью регулирования условий вьісаливания при конечном содержаниий 100мМ Масі., 120мМ Ттгів рН7,5, и 10мМ Масі», составляют по обьему 50 - 100мкл. Меченье и немеченье киназами олигомерь!ї, нагревают в ванне с кипящей бо водой в течение 5минут и медленно охлаждают до комнатной температурь! в течение приблизительно 4 часов.
Затем гибридизированнье олигомерь зкстрагируют фенол/хлороформом, осаждают зтанолом и ресуспендиру-ют в 17мкл ТЕ /10мМ Тіз, їмМ ЕДТА, рНаВ,0/. Используя указаннье 17мкл ТЕ, образуют лигирующую пробу с конечньім обьемом, равньім 20мкл /конечнье условия: ЗОмММ Ттівнсі, рН7,8, 10 мМ Масід, 10мМм ДТТ, 1мМ АТР и З единицьї лигазьі ДНК ТА /Рго-теда, Мадізоп мі//. Лигирование "при инкубации проводят при комнатной температуре в течение приблизительно двух часов. Гибридизированнье и лигированнье
Фрагменть! обьічно очищают на 295 Мивіеме гелях перед и/или после разрезания рестрикционньіми ферментами /рестриктазами/ перед клонированном в векторьї, Лигирующую пробу в обьеме 20мкл получают, используя от 100 до 50Онг каждого Фрагмента с приблизительно зквимолярньім количеством ДНК в буфере, содержащем
ЗОММ Ттів-нсі, рН7,8, 10мММ Мосі», 10мММ ДТТ ї1мМ АТР и З единиц лигазьї ДНК Т4 /Рготеда, Мадівоп, УУТ/. 7/0 Лигирующую смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. После лидирования. ДНК трансформируют в замороженнье надлежащие клетки Е. соїЇ, используя стандартнье процедурь! /Зат-ргоок еї а!І./, а трансформанть! селектируют на І В-агаре /Затрьгоок еї а//, содержащем 1О0Омкг/мл ампицилина /см. ниже/.
Пробьї РСК для скрининга клонов в Е. Сої!:
Колониий Е.соїІЇ, содержащие соответствующую вставку ДНК, идентифицируют с помощью РОК /см. Запапи еї 7/5 8І., ВіоТесппідцез 7:689-690 /1989//. С помощью зубочистки колонии соскребьівают с пластиньі, задействованной в течение всей ночи, и добавляют к смеси пробь! гснлбьемом от 20 до 45мкл, содержащей приблизительно 50 пмолей каждого гибридизирующего праймера /см., например, использование праймеров МК2ЗА28 и МК25А28 для селекции ориентации фрагмента ЗасіЇ в рНУВ2 6/, от 200мцм до 400мМ каждого аМТР и 1х реакционньй буфер /РегкіІп ЕІтег Сейв, МогмаІкК,СТ/поМ6 кипячения реакционной смеси Е.сої! /рек в водяной бане в течение 2019 минут 5 МКЛ ПОЛимМеразь Тад /0,5 единиц/ /РегкіІп ЕІтег Сей5, МогмаїкК, Сопп./ добавляют в реакционньій буфер
ЇХ. Параметрь! пробьі РСК йобьічно вьібирают такими, что зтап денатурации при температуре 9492 длится в течение 30 с.гибридизации - при температуре 5593 в течение 45с. и удлинения-при температуре 7290 в течение 45с., используя от ЗО до Зб циклов. Продуктьь реакций РСК помещают на гели агарозь! или Га
МивіеуеагарозН /РМС/ для обнаружения амплифицированньїх фрагментов подходящего размера. Лигирование:
Фрагменть! полученньіе путем переваривания растриктазой, очищают в 195 ІТ - / низкрплазкая агароза, о
ЕМС/, 295 МивІєме /ЕМС/ или в 0,7595 згарозьї, используя методики, стандартнье для данной области исследований. Диски ДНК визуализируют зтидиумбромидом, а диски восстанавливают из геля путам зксцизии с помощью лезвия. Фрагментьі, вьіделеннье из ЗТ, лигируют непосредственно ВІ ОТ. Десять уикзолитров «І каждого извлеченного фрагмента ДЦК используют для сборки лигируюших проб, получая конечную лигирующую пробу и обтеме, равном приблизительно 23мкл. После зксцизий с помо-шью лрзвия посстановленнче диски о геля,, содержащие требуемье Фрагменть! ДНК, подвергают тепловой денатурации и вводят в буфер для лигазь оче
ЇХ, после чего добавляют З единиць лигазьі ДНК ТА /Ргатеда/, как зто описано вьіше. Фрагменть, вбіделеннье из обьічной агарозь! или Мивіеме агарозьі, очищают от агарозьі, используя фильтрь! тонкой очистки с размером со пор 0,45мкм /ультратонкий мембранньій фильтр/, а затем лигируют, как описано вьіше. Лигирующие пробь! «Ж инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов перед трансформацией их в замороженнье подходящие клетки Е.соїЇ, используя стандартнье процедурь /Затьгоок еї аї./.
Трансформации: «
Замороженнье подходящие клетки Е.соїЇ штамма ЛНВальфа или НВ101 приготавливают и трансформируют, используя стандартнье процедурьй /ЗатргооК еї аі/. Подходящие КЛЄТКИ Е.соїї "5ОКЕ"- получают из - с стратагема Ла доМйа, СА/. При лигированиях, вьіполненньїх в агарозе ЗТ, после завершения реакций ц лидирования 50мММ Сасі 2 добавляют к конечному обьему, равному приблизительно 15Омкл, и раствор "» нагревают при температуре, приблизительно равной 659 в течение приблизительно ТОминут до полного плавления агарозьі. Затем раствор перемешивают и охлаждают на льду в течение 1О0минут перед добавлением 200мкл подходящих клеток, которне оттаийвали на льду. Указанную смесь подвергают инкубированию на льду в
Її течение ЗОминут. Последующий нагрев смеси осуществляют при температуре 422С в течение босекунд перед со охлаждением на льду в течение двух минут. Далее добавляют 80Омкл средь вос /2095 триптона, 0,595 дрожжевого зкстракта, 1 мМ Масі, 2,5мМ КС, отрегулированного до рНВ8 с 5 М /молярньїх долей/паон, 20ММ - смеси МосСі»ІМа95О03, и 20мММ глюкозь; ЗатргооК ей ан! ./ и клетки инкубируют при температуре 3720 с о 20 взбалтьшванием к течение приблизительно одного часа перед зьізеванизм на чашки на злективнье средь.
Обьічно злективная среда представляет собой І -агар /"Затьгоок еї аіІ./, содержащий 100мкг/мл ампицилина. їз» Если лигирование вьшполняли в растворе, не содержащем агарозу, обьічно 200мкл замороженньмх подходящих.клеток в, соїЇ /штамм ВНЗальфа /ВКІ, Сайпегзригду МО или клетки Зиге,Зіга--адепе, Іа доїа, СА/ оттайвали на льду и добавляли 5мл лигирующей смеси. Пробу инкубировали на льду в течение 45...бОмин, затем клетки вновь нагревали при температуре 422С в течение приблизительно 90 секунд. После регенерации
ГФ! при комнатной температуре в течение приблизительно ТОминут добавляли 80Омкл средьії БОС, после чего клетки инкубировали в течение | часа при температуре 372С с взбалтьіванием и вьісевали на чашка, как зто о описано вьіше.
При скринирований дли вставок в ген бета-галактозидазь! в некоторьїх стандартньїх используемьїх векторах 60 200мкл восстановленной трансформирующей смеси вьісевали на чашках с І В-агаровой средой, содержащей 000895 Х-гала, ЗВОМмкМ изопропилтиогалактози-да /ЛРТО/ и 100мкг/мл ампипиллина /ЗатрьгоокК еї а)/. Для обеспечения селекции и роста трансформантов чашки инкубировали всю ночь при температуре 3720.
Минискрининг ДНК:
На чашках с злективньми средами вьращивали трансформантьій и исследовали и подтверждали их бо плазмидную структуру, используя стандартнье методики минискринирования плазмид /Затьгоок еї аї./.
Обьчно для получения небольших количеств плазмидной ДНК для анализа используют методику "кипячения" /Затьгоок еї аї./.
Ч некоторьїх других случаях используют методику с применением ацетат аммония. Указанная методика является модификацией методики, описанной ЗПІпао-уї! І ее еї а!., Віосїеоппіднез 9:676-679 /1990/, 1/ Мнокулируют единичную бактериальную колонию из селективньїх чашек, которье бьіли задействовань всю ночь, в 5мл /может бьіть уменьшено до 1мл/ средьі! ТВ (ЗатрбгоокК еї аІ.) и виращивают ее в присутствий соответствующего антибиотика. 2/ Всю ночь инкубируют на вращающемся цилиндре при температуре 37"С. 70 З/ Собирают 5мл бактериальньїх клеток в пластиковую пробирку СакгідденН вращают в роторе типа богмаї 585-348 течение 5минут при 5000 оборотов в минуту.и температуре 420. 4/ Удаляют надосадочную жидкость. 5/ Ресуспендируют пелетту в їмл лизисного буфера /50ММ глюкозьі, 25мММ Ттгів-нсі /"рН8,0/, 10ММ ЕДТА и 5мг/мл лизоцима/, взбалтьівают в течение 5 секунд и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут. 6/ Добавляют 2мл щелочного раствора /0,02М Маон, 195 додецилсульфат натрия/, плотно закрьувают крьішкой, перемешивают, переворачивая пробирку 5 раз, и /ломещают пробирку в ванну с лледяной водой на 5 минут. 7/ Добавляют 1,8ми охлажденного да температурь! льда ацетата аммония /7,5М, рН7,6б/, перемешивают путем пятикратного плавного переворачивания пробирки и помещения ее в ванну с ледяной водой на время, 2о равное 5 минутам. 8/ Центрифугируют смесь в течение 10 минут при комнатной температуре и скорости вращения, равной 9000боб/мин. 9/ Переливают чистую надосадочную жидкость в пробирку Согех и добавляют 0,6 обьемов изопрбканола /приблизительно 2,5мл/. Дают отстояться при комнатной температуре в течение 10 минут. с 10/ Центрифугируют смесь в течение 10 минут при комнатной температуре и скорости вращения, равной 9000 об/мин, и удаляют надосадочную жидкость. і) 11/ Ресуспендируют палетту в З0Омкл буфера ТЕ. Добавляют бмкл исходной РНКазь А и ТІ |приготовленной в виде раствора обьеемом 200мкл путем добавления 180 РНкКазь А (3254 единиц/ мг белка, 5,бмг белка/мл и 20Омкл РНКазь ТІ (481 единица/мг белка, 1,2мг белка/мл.). Указаннье компоненть! могут бьть закуплень У «ф зо 0О5В/ЛОЗ Віоспетіса/ . Помещают В микроцентрифужную пробирку и инкубируют при температуре.370с в течение 15 минут. - 12/ Добавляют 75мкл дистиллированной водьі и 100мкл ацетата аммония /7,5М/ и инкубируют в ванне с «-- ледяной водой в течение 10минут. 13/ В микрофуге Бекмана при Г4000 об/мин центрифугируют смесь в течение 10минут при температуре 426. со 14/ Осаждают путем добавления 2,5 обьемов 10096Е(Н /приблизительно їмл/ и инкубируют в ванне с чЕ ледяной водой в течение 10 минут. 15/ Центрифугируют в микрофуте при 14000об/мин в течение 1Оминут. 16/ Промьіївают пелетту 7095 зтанолом /используя 0,5 - тмл/. Вьісушивают пелетту и ресуспендируют ее в « 10О0мкл Іх оуфера 4 рестриктазьі Мем/ Епдіапа Віоіарз (2ОмММ Тгіз-НСІ/рн 7,9/, 10ММ ацетата магния, 50ММ 70 ацетата калия, 1мМ ДДТІ|. Измеряют концентрацию и проверяют чистоту с помощью спектрофотомет-рии при - с спектральной поглощательной способности на длинах волн 260 и 280нм. ц Для более бьістрого определения того, вместила ли данная бактериальная колония рекомбинантную "» плазмиду, применяют методику минискрининга РСК, используя модификацию методики, описанной /Запанпи,-
О.5. еї ей., 1989, ВіоїесппіІдцев, 7:689-690/. Другими словами, готовят следующую смесь: 10О0мкл вьішеупомянутой смеси праймера, по 20мкМ каждого прармера; ьч 100мкл смеси КМТР /2,5мМ каждого/; со 100мкл 10х буфера Атрінад /РегкІп-ЕІтег-Саїшв, Їх буфер - 10мМ ТТтів-НСІ рНа,З, 5О0мММ КСІ, 1,5мММ МасСіь и 0,0195 желатина)/; - 7О00мкл дейонизированной водь. 20мкл вьшеуказанной смеси помещают в полипропиленовую пробирку емкостью 0О,бБмл для РСК. о Трансформированную бактериальную колонию соскребьтвают зубочисткой и ресуспендйруют в смеси. Пробирку «з» кладут в водяную баню на 1Оминут, а затем охлаждают до комнатной температурь! перед добавлением 5мкл нижеуказанной смеси: 265мкл дейонизированной водьі ЗОмкл буфера Атрінад /РегкіІп-ЕІтег Сеіир,буферіх - 10мММ Ттгіз-НСЇІ рна,З3, 50мММ КСІ, 1,5мМ Мас» и 0,0196 желатина/ 7,5мкл полимеразь! Тад
Образцьі покрьівают 5Омкл минерального масла и вьіполняют 30 циклон РСК, соблюдая следующие і) параметрь!: ко денатурация: 942С в течение Тмин гибридизация: 552С в течение Тмин 6о0 удлинение: 729С в течение 45с.
После амплификации РСК добавляют 1мкл загрузочного красителя /3095 глицерина, 0,25956 бромфенольной сини, 0,2595 цианолксилола/, после чего 20мкл смеси загружают на 295 Мивзіеме, 195агарозньй гель для визуального определения того, имеет ли продукт РСК, ожидаемьй размер.
Указанная процедура используется в качестве первоначального скриннинга. Затем с целью подтверждения б5 структурь! плазмий ее вставки до секвенирования осуществляют ее перенос.
Пример 2: Амплификация и сборка каждой четверти.
Клонирование фрагментов синтетического гена.
Синтетический ген бьіл сконструирован таким образом, чтобьі! его можно бьіло клонировать в четьіре части, каждая из которьїх приблизительно составляет одну четвертую часть гена. Олигомерь! для каждой четверти Группировали с целью сборки в структуру с помощью ЕСК, гибридизации или комбинации гибридизации с последующей амплификацией РСК, как зто описано в другом месте. Синтетические четверти собирали вместе путем наложения рестрикционньїх сайтов Ааї ІІ, .Мсо!І, и Ара | между первой и второй, второй и третьей и третьей и четвертой четвертями соответственно.
Каждая четверть гена / размер которой приблизительно составляет 500Бр/ собирали путем гибридизации 7/0 Соответствующих олигомеров и амплификации желательного фрагмента, используя праймерь РСК, характернье для концов зтой четверти. Использовались два различньїх набора проб РСКс применением двух наборов незначительно отличающихся друг от друга праймеров. Продуктьі РСК указанньїх двух проб конструировали таким образом, чтобьі они бьіли идентичньії, за исключением того, что в первой пробе на 5-конце кодирующего участка имелась дополнительная последовательность ААТТ, а во второй пробе на 7/5 З-конце данной четверти имелась последовательность АЄСТ. Когда продуктьі указанньх двух проб определенной четверти смешивали /после удаления полимеразн, поримеров и незавершенньїх продуктов)/, денатурировали и затем ренатурировали, определенное количество /теоретически 5095/ отожженного продукта должно бьіло иметь негомологичнье избьіточньсе конць.
Зти концьі бьіли сконструированьї таким образом, чтобь! соответствовать "липким концам", образованньіми 2о во время рестрикционного переваривания ЕсокК! на 5-конце и Ніпа І на З-конце молекуль!. Полученнье в результате молекуль! ббіли фосфорилированьї, лигированьі в перепаренньій ЕсокіІ/НІпсаїЇ и фосфатирозанньй блюскрипт-вектор и трансформировань! в замороженньій подходящий Е.сої! штамм. ОНбаїрна. После селекции колоний Е. соїЇ, содержащие необходимьй фрагмент, идентифицируются с помощью г паттернов рестрикции
ДНК. Затем вставки, представляющие части синтетического гена, очищают и секвенируют, используя с ов стандартнье методики. Во всех случаях, клоньі из многих проб РСК генерируются и секвенируются. Затем четверти соединяют имеете, используя специфические рестрикционньюе сайтьі в местах соединения для і) получения полного гена.
Клонированнье четверти идентифицируются с помощью методик мини-скрининга и секвенирования фрагмента, гена. Находят, что в последовательность часто вводят ошибки, с наибольшей вероятностью на «Е зо зтапе амплификации РСК. Для коррекции таких ошибок в клонах, которне содержат только несколько таких ошибок, используютря гибридизированнье олигомерь. Гибридизированнье фрагменть! перевариваются в о местах узнавания рестриктазьь внутри фрагмента и клонируются для замещения мутированного участка «- синтетического гена; Длина гибридизированньіїхгфрагментов колеблется от ЗО0Бр /например, участок, которьй замещаеєт фрагмент между сайтами Зас І во 2-ой четверти/ до приблизительно З50бБр у Фрагмента 4-ой со з5 Четверти, которьій замещает две индуцированньсе мутации РСК в 4-ой четверти гена. «г из-за вьісокого козффициента ошибок РОК плазмида конструируется таким образом, чтобь! обеспечить селекцию фрагмента клонированного гена, содержащего откритую считьвающую рамку. Указанная плазмида конструируется так, что, если ооткрьтая считьвающая рамка вводится в клонирующие сайть, трансформированньюе бактерии могут расти в присутствий канамицина. Конструкция указанного вектора « 70 детально описана ниже. Такая система селектирования в значительной мере способствует прогрессу, позволяя в с бьістро идентифицировать клоньі открьїтьїіми считьвающими рамками без необходимости секвенирования большого числа независимьїх клонов. з Синтетические четверти собирают в различнье плазмидьі, включая ВЗ5К/Стратаген; Іа доПа, Са/, Рис18 /Затьгоок еї аі/, и Кмзкспрессируюжий вектор. В данной области изнестньі и могут бьіть использовань! другие подХходящие плазмидь, включая плазмидь на основе фиг. Полное секвениродание клонированньїх фрагментов, ї5» анализ метрдом вестерн-блотирования продуктов клонированного гена и биопробь! насекомьїх, используя в качестве подопьітного насекомого Европейский зерновой точильщик, свидетельствуют, что бьли получень со полностью функциональнье синтетические гень! сгуіА(бВ) ВІ. - Конструкция Км-зкспрессирующего вектора для селекции открьїітьїх считьівающих рамок:
Км-зкспрессирующий вектор конструируется с целью селектирования фрагментов синтетического гена, о содержащего открьїітье считьвающие рамки. Олигомерьі РОК конструируются с целью обеспечения слияния ї» гена МРТІЇ из Тп5, начиная от нуклеотида 13 /КеїЇзд еї аіІ., ЕМВО 4. 3:3317-3322 1984 /, с русСІВ и введения полезньїх рестрикционньїх сайтов между сегментами ДНК. Полилинкерньій участок содержит рестрикционнье сайтьі, обеспечивающие клонирование различньїх синтетических фрагментов ВІ ІР в рамке генетического кода дв Геном Км /канамицина/. 5 олигомер длиной 88рр, содержащий полилинкерньй участок, очищают на 695 полиакриламидном геле, как зто описано вьіше относительно очистки олигомера РАСЕ. "Пробу РСК собирают с
Ф) фрагментом кодирующей нити ДНК Ва! 11/5та І, которьій содержит ген МРТ ІЇ, вьіделенньій из Тп5. Смесь ка пробьї РСК содержит 10О0нг кодирующей нити ДНК вместе со 100 пмолей олиго-меров КЕ72А28. и КЕ74А28 /см. нижеприведеннье последовательноети/, 200НМ амтР, и 2,5 единицьї полимеразь!і Тад с общим обьемом 5Омкл бо при равном обьеме покриівающего смесь минерального масла. КЕ74А28 5- ОСАСАТСТОС АТССАТОСАС ОССОТОААОо ССССТІСТАб ААСОССТАТС бАТААДАСАСС
ТССССОСОбБА ТОСАТТОСАС ССАССТТО-3
КЗ72А28 5- ОСОТТААСАТ-СТСОАСТСАС АДАСААСТСОТ СААСААОсОСО-3! 65 Используемьми в методике параметрами РСК являются: 94"7С в течение 45 секунд, 55 С в течение45 си 729 в течение 55с, удлинение третьего зтапа на Зс в течение 20 циклов. Все пробьії РСК вьіполняют в датчике термоциклов РегкіІп-ЕІтег Сей5. Продукт, амплифицированннй РСК, имнет размер, равньй 800Бр, и содержит полилинкерньій участок с трансляционньм инициирующим сайтом, за которьім следуют специфические рестрикционньсе сайть!, слитье в рамке генетического кода с Км геном из основания Мо13, входящего в состав трансляционной последовательности нуклеотидов, терминирующей транскрипцию, рис "КМ74 представляет собой Км-зксп-рессирующую кассету, которую собирают из Ва! П/За! І полилинкер/Км фрагмента с размером 800рр,, клонированного в вектор руОсСт18. Іас7 промотор позволяет зкспрессировать Км ген в Е.соїЇ. Производнье рисС:КМ74 сначала необходимо вьісевать на чашки с І В-агарОМ, содержащие 10О0мкг/мл ампицилина для селекции трансформантов, которье затем могут бьть скринированьії на чашках с ІВ-агаром, содержащих 7/0 2омкг/мл канамицина/Р То. Фрагменть! синтетического гена ВІ ІР собирают из каждой четверти в Км-кассету с целью контроля клонирования открьїтой считьвающей рамки, содержащей части фрагметов. Первьій фрагмент синтетического гена ВІ ІР, зффективного относительно ЕСВ, рВі:КтМоб, представляет собой ген, показьівающий устойчивость к канамицину. Затем указанньй фрагмент исследуют на содержание мутаций в третьей и четвертой четвертях, которне позже репарируют.
Пример 2А: Синтез и клонирование первой четверти синтетического гена/ 1 - 550пар, комплементарньх оснований/
С целью клонирования 1-ой четверти последовательности, синтетической ДНК, кодирующей синтетический ген ВІ сгуіїА(Б) , проводят следующие операции. Те же операции проводят; по существу, для синтеза и клонирования других четвертей, за исключением указанньїх для праймеров и рестрикционньх сайтов.
Матрица для четверти 1: смесь равньїх количеств очищенньїх олигомеров ШІ-О7 и ГІ - 17
Праймерь РОК:
Прямье:
РІ /а/: 5- СТСОАСАДОС АТССААСААТ 0-3!
РІ /Б/: 5- ААТТОТСОАС ААССАТССАА СААТСО-3: с
Обратньєе:
Р2 /а/: 5- АСАСОСТОАС СТСОСОСАСС АСО-3! і)
Р2 /б/: 5- АВСТАСАСОС ТОАСОТССОС САС-3
Пара праймеров А!: Р1/Б / - Р2 /а/
Пара праймеров А2: Р1/а/ -- Р2 /р/ «г зо Пробу РСК, содержащую олигомерь, имеющие первую четверть синтетического оптимизированного относительно кукурузь гена ВІ ІР, формируют следующим образом: о 200-нг олигосмеси /все олиго для данной четверти, смешанньє в равньїх по весу количествах/ «- 10мкл праймерной смеси /смесь 1 : 1 каждого праймера по 20мкМ;, праймерь! описань! вьіше/
Бмкл буфера 10Х РСВ со
Используемьйй буфер РСК может представлять собой либо «г /а/ концентрацию ІХ, содержащую 10мМ КСІ, 10мМ /МНу//250,3, 20мМ Тгів-НСІ, рН8В,О, 2мММ Мово, и 0,190
ТейопХх-100/, или /вБ/ концентрация ЇХ, содержащая 10мММ Ттіз-нсі рН8,З3, 5О0мММ КСІ, 1,5мМ МасІі 5, 0,0190 в отношений веса к обьему желатина. «
Компонентьї смешивают, нагревают в ванне с кипящей водой в течение бминут и инкубируют при в с температуре 657С в течение 10 минут.
Й Затем добавляют следующие реагенть!: и?» мкл смеси аМТР /конечная концентрация в смеси составляет 0,2мММ каждой составляющей/ 5 единиц полимеразь.
Конечньїй обьем реакционной смеси; составляет 5Омкл. їх Затем олигомерь! инкубируют в течение З минут -при температуре 729С и после зтого проводят цикл РОК.
Реакцию РСК проводят в датчике термоциклов со следущими циклами: бо цикл денатурации: 942С в течение Тминуть! - цикл гибридизации: 602С в течение одной минуть! о 50 цикл удлинения: 722С в течение 45 секунд /плюс З секундьі на каждьійй последующий цикл/ количество циклов: 15
Я» После завершения реакции 7Омкл пробьі РСК загружают на 295 Мивіеме-ОТО /ЕМС/, 195 агарозньй аналитический гель с целью управления реакцией. Оставшиеся 40мкл используют для клонирования
Фрагментов гена, как зто описано ниже.
Продукть! РСК о Концьї двуцепочечного продукта РСК, соответствующие различньм праймерньм парам, показань! ниже
Мдолько верхняя нить// А! ААТТОТСОАС ОСОТОТ /554рр/ первая четверть. А?2 їмо) СТСОАС ОСОТОтТАССТ /554рр / первая четверть.
Гибридизация 60 40мкл каждой пробьі РСК описанной вьіше, очищают, используя колонку спготазріп 400 /СіІопедесіп, Раїо
АМо,СА/ в соответствии с заводскими инструкциями. Перед загрузкой в колонку к пробам добавляют Б5мкг
ДНК-носителя. / Зто делают для большинства случаев клонирования. Однако в некоторьїх случаях для удаления полимеразь! Тад осуществляют фенол: хлороформовую вьітяжку проб ЕСК, используя стандартнье методики /Затьгоок еї аіІ./и ДНК, созданную при РОК, восстанавливают из водной фазь, используя стандартную 65 методику осаждения зтанолом. ДНК-носитель не вьімьшаєется с сформированньми Фрагментами РОК.
Дубликать проб АїЇ и А? каждой четверти смешивают и нагревают в ванне с кипящей водой в течение 10 минут,
а затем всю ночь инкубируют пру температуре 6592. После зтого пробьї удаляют из ванньі с температурой водь, 659С0 и осаждают озтанолом с мкл /2Омкг/ гликогена, свободного от нуклеазьі /Ігасу, Ргер.
Віоспет.1І:251-268 /1981/ в качестве носителя. Пеллету ресуспендируют в 40мкл дейонизированной водні.
Реакция фосфорилирования
Реакцию фосфорилирования осуществляют следующим образом: 4Омкл ДНК 2,5мкл, 20мММ АТР
О,5Бмкл Т0Х ВБА/ОТТ /ЛХ - 5мМ ОТ, 0,5мг/мл ВБА/ 70 1,0мкл 10Х полинужлеотидньй киназньй буфер /1х - 7ОмММ Ттгів.НСІ, рН7,б, 0,1М КСІ, 10тМ Масі»/ 2,О0мкл полинуклеотид киназьї /Мем Еподіапа Віоіабв, 20 единиц/.
Инкубацию осуществляют в течение 2 часов при температуре 3770.
Затем пробу зкстрагируют один раз смесью фенол : хлороформ в соотношении 1 : 1, после чего зкстрагируют хлороформом и осаждают водную фазу зтанолом, используя стандартнье методики. Пеллету 75 ресуспендируют в 1Омкл ТЕ.
Обработка рестриктазами 20мкг блюскрипт-вектора /«В55К, вігаіадепе, І а доа, СА/ 1Омкл 10 х рестрикционного буфера /ЛХ - 20 мРл
Тиів-НСЇІ, рН8,О, 10мМ Масі», 100мМ Масі/ бмкг Есо КІ /Мем Еподіапа Віоїіарв/, 100 единиц бмкг Ніпа І /Межм Еподіапа Віоіавзв/, 100 единиц
Конечньй обьем пробь! составляет 100мкл.
Инкубирование осуществляют в течение З часов при температуре 3770.
После завершения реакции пробу зкстрагируют равньм обьемом фенола, сатурированньм ТЕ /ЛОмММ
Ттів-НСЇІ, рН8,О и 10ММ ЕДТА/. После центрифугирования водную фазу зкстрагировали равньм обьемом смеси с /сатурированного ТЕ/ фенолгхлороформа в соотношениий 1 : 1 /"Ххлороформ" представляет собой смесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24 : 1/, после чего водную фазу зтой зкстракции і) зкстрагировали равньім обьеемом хлороформа. Конечную водную фазу осаждали зтанолом / за счет добавления 10мкл ЗМ уксуснокислого натрия и 250мкл абсолютного зтанола/, вьідерживали в течение 10 минут при температуре 42С и центрифугировали в микрофуге при максимальной скорости вращения в течение 10 минут. «Ж Пеллету прополаскивали в 70956 зтаноле и вьісушивали при комнатной температуре в течение 5 - 10 минут и ресуспендировали в 100мкл 10мММ Тгів.НСЇІ /рна,3/. о
Фосфатазная реакция --
Для уменьшения количества колоний, полученньїх без вставки, вектор ДНК обьічно обрабатьвают фосфотазой. Обьічно используют щелочную фосфотазу из кишечника теленка /затьгоок еї а//, но для данного со зтапа могут бьіть также использованьі! другие фосфотазнье ферменть. «І
Типозми фосфатазнье реакции приведень ниже: 9Омкл вьішеописанной гидролизированной ДНК 10мкл 10х буфера щелочной фосфотазьиз кишечника теленка /Іх - 50мММ ТТтівз-НСІ /рна,3/, 10ММ Масід, ІММ « 7псі2, 10ММ спермидина/ 1мкл Л единица/ щелочной фосфотазь из кишечника теленка/ СІР, Воейпгіпдег Мапппеїт, ІпаІапароїІв, ІМ/. - с Инкубирование проводили в течение 1 часа при температуре 37"С. а Затем ДНК очищают на геле /1956 с низкой температурой зас-тудневания //СТ/ гель агарозь/у/, и пеллету "» ресуспендируют в 5Омкл ТЕ. После злектрофореза соответствующий диск зксцизируют из геля с помощью лезвия, плавят в течение 5 минут при температуре 657"С и разбавляют ТЕ в соотношениий 1 : 1. Указанньй раствор дваждьі зкстрагируют фенолом, один раз вьішеупомянутой смесью фенола и хлороформа и один раз
Її хлороформом. Конечную водную фазу осаждают зтанолом и ресуспендируют в буфере ТЕ. со Лигирование:
Для лигирования фрагментов синтетического гена в векторь! обьічно используют следующие условия: - БбБмкл фосфорилированной вставки ДНК о 50 2мкл фоофатазного блюскрипт-вектора, обработанного Есо КІ/НіІпа ІІ, нагреваемого при температуре 6590 в течение 5 минут, а затем охлажденного
Я» 1мкл 10Х лигазньій буфер /ЛХ буфер- ЗОмМ Ттгів. НСІ /рН7,8/, 10мМ, Масі», 10мМ ОТ, 1мМ АТР/ 1мкл ВЗА /Імг/мл/ 1мкл лигазь /З единиць, Рготеда, Мадівоп, УМІве./
Обьічно пробь! лигазьь инкубируют всю ночь при температуре 1620 или при комнатной температуре в о течение двух часов.
Трансформация де Трансформацию Фрагментов лигировачной ДНК в Е. соїЇ вьіполняют, используя стандартнье методики /еатьгоок еї аї./, как зто описано вьіше. 60 Идентификация рекомбинантов
Белье или светлоголубне колонии, полученнье в результате ночной инкубации трансформирующих чашек, селектируют. Плазмидь в трансформантах характеризуют, используя стандартнье методм минискрининга /Ззатьгоок еї аі/ или так, как зто описано вьіше. Обьічно используют одну из трех методик, перечисленньїх ниже: /1/ Метод приготовления минипрепарата ДНК нагреванием 65 /2/ РСК минискрин /3/ микроколичества аммоний ацетата
Перевар рестриктазами рекомбинантньїх плазмид, как полагают, содержит первую четверть и составляется следующим образом /а/переваривание Ват НІ/Ааїйії; тОмкл ДНК «- 1Омкл 1х рестриктазного буфера 4 Мем Еподіапа Віоіарз
О,5мкл Ват НІ /10 единиц/
О,5мкл Дак /5 единиц/
Инкубирование осуществляют в течение приблизительно 2 часов при температуре 3726.
Клоньії, идентифицируемье как имеющие необходимую рестрикци-онную структуру, затем подвергают перевариванию-спомощью Рмуи Ії и Ва! ІІ в отдельньїх пробах. В дальнейшем для секвенирования бнрут только 70 клонь с требуемьми паттернами рестрикции, переваренньсе всеми тремя знзимами.
Секвенирование фрагментов клонированного гена:
Секвенирование осуществляется, используя модификацию дидезоксиметода Сзнгера обрьва цепи /ЗатрьгооК еї аІ/, применяя двуцепочечную ДНК из набора Секвеназьі 2 /Опіей Зіайфез Віоспетіса! Согр.,
СіІемеіапа, СН/. Всего секвенируется шесть клонов первой четверти. Считают, что из всех секвенированньх 7/5 КлОнНОовВ только два клона, обозначенньхх рОАб и рОАїТ содержат только одну делецию /каждьй/. Указаннье делеции состоят из одной комплементарной парьї, каждая из которьїх расположена на позиции 452 в роАЇ и на позиции 207 в роОАбБ.
Для получения первой четверти с ожидаемой последовательностью используют плазмиду роАЇ с рР1-8 /как описано ниже/.
Пример 2В: Синтез и клонирование второй четверти. /комплментарньсе парьї оснрваний 531-1050/
Матрица: олигомерьі 08-14 и І 8-І 14
Праймерь РОК:
Прямье: с
РЗ /а/: 5-ССТОСОСОАС СТСАОСОТОоТ Тооо-3"
РЗ /в/: 5-ААТТОСТСОО СОАССТОдОС Сто о
Обратньєе:
РА /а/ : 5-СОССОСТТОССС АТОСТОССОТ АСАСО-3!
РА /в/ -- 5-АССТООСОТ ТОСССАТОСТ ОССО-3 «І
Праймерная пара ВІ: РЗ/в/ я Ра/а/
Праймерная пара В2: РЗ/а/ - Р4/в/ -
Продуктьі РСК «--
ВІ ААТТОСТОСС ААСЄСС /524 рр/вторая четверть В2 СОСТОоСО ААСОССАССТ /524 рр/
Гибридизацию, амплификацию РСК, фракционирование по размерам на центрифугирующей колонке и со Кклонирование фрагмента зтого гена в блюскрипте, переваренном Есо КІ/Ніпа ЇЇ готовят, как описано вьіше для «І первой четверти /пример 2А/. Продукт РСК для первой четверти имеет размер, приблизительно равньй 529 Ьр, представляя вторую четверть гена / нуклеотидь! 531-1050/. Трансформацию осуществляют в замороженнье подходящие клетки Е. Со /ДН5обальфа/, используя стандартнье методики, описанньсе вьіше /Затрьгоок еї аї./.
Минискрининг клонов РОЗ: «
Минипрепарат ДНК готовят, как описано вьіше, и переваривают /а/ Ааї 11/Мсо І, /в/Рми ЇЇ и /с/ Ва! 1 для шщ с подтверждения структурной вставки в вектор перед секвенированием. й Секвенирование вьіполняют, как описано вьіше, используя дидезоксиметод Сзнгера /Затьгоок еї аї./. "» Секвенируют всего тринадцать клонов зтой четверти. Вторая четверть постоянно содержит одну или более делеций между позициями 884 и 887. В большинстве случаев С на позиции 884 делетирован. Плазуида рРОВ5 имела только одну делециюла позиции: 884. тот участок находится между двумя сайтами зас ІІ /позиции 859 и «їз» 949/. Коррекция зтой делеций описана в примере 3.
Клоньї первой половинь /1 - 1050Бр /. бо Фрагмент для клонирования первой половинь! /четверти 1 и 2/ синтетического кукурузного гена Ві в качестве - одного фрагмента ДНК получают рестрикционньім перевариванием продукта пробьї РСК, содержащей'первую 5р Ччетверть и вторую четверть. Для разрьіва двойной спирали ДНК в 20мкл пробе /после зкстракции фенолом и о преципитации зтанолом/ используют рестриктазу Ааї І. 1ї5мкл каждой из переваренньїх четвертей Ааї ІІ
Та» смешивают и лигируют /в ХОмкл обьеме путем добавления 5мкл 10х лигазного буфера /1Х - ЗОмММ Ттів-НСЇІ рН7,8, 10мММ Масі», т0мМ ДТТ, їмММ АТР/ 14мкл дейонизированной водьій и їмкл ДНК-лигазьй фага Т4, З единицьі, Рготеда, Мадізоп, ММІ/ при комнатной температуре в течение 2 часов. В результате получают фрагмент длиной, приблизительно равной 1КЬ, судя по данньм злектрофореза на геле 195 агарозь! при использований стандартньх условий /Затьгоок еї аї./. іФ) Десять микролитров продукта лигирования амплифицировали с помощью РОС используя условия, ко описанньсе ранее, за исключением того, что вьіполняли только 5 циклов.
Праймерная пара: НА - РІ /а/ я РА /в/ во Праймерная пара: НВ - Р1 /а/ я РА /а/
Продукт зтих реакций клонировали в блюскрипт /Зігаїадепе, а доПйПа СА/. как зто описано для индивидуальньїх четвертей. Указанную процедуру вьіполняли только один раз, т.е. все вставеч-нье ДНК получали в данной области из единичной пробьі РОК.
Тридцать шесть колоний минискринируют переварами За І и переварами Рми І. Все колонии, за 65 Мсключением четьрех, содержат вставку с длиной, равной приблизительно ІКкЬ, при зтом по меньшей мере 20 колоний содержат правильную картину рестрикции. Рми ІІ. Восемь из зтих клонов вьібрали для анализа последовательности. Один из клонов, РІ-8, имел желательную последовательность между сайтом ЕсоМі/З9ГЬр/ и сайтом Огаїп /640Бр/. Зтот клон использовали для получения плазмидьі! с желательной последовательностью, расположенной до сайта Огаї|ї! /640Бр/ во второй четверти с роАї /первая четверть с делециеР на позиции 452 описана ранев/.
Пример 2С: Клонирование и синтез третьей четверти /комплементарнье парьї 1021-1500/
Матрица: Олиго ШІ5-020 и 1 1І5-І 21
Праймерь РОК: прямьге: 70 РБ /а/: 5-ТТСССССТОТ АСОСОСАССАТ СОООССААСОоСС оС-3
РБ /в/: 5-ААТТОТАССО САССАТОСОС ААС-3" обратньєе:
Рб/а/: 5-СААСССОоСОоо СССТТСАССА СОСТОО-3!
Рб /в/: 5'-"АОСТОАДАоСС соОсССсстТТо АСО-3
Праймерная пара СІ: РбБ/в/ - Рб/а/
Праймерная пара С2: РбБ/а/ - Рб/в/
Продукт РОК:
СІ ААТТОТАСОО СССТТС /475рр /, З четверть
С2 ТТОСССТОтТАСОоо СОСТТСАССТ /484Бр З четв.
Реакции РСК, центробежное вьіделение фрагментов ДНК правильного размера и лигирование в векторь вьіполняются так, как зто описано вьіше /Пример 2А/, используя разрезание блюскзипт-вектора Есокі и Ніпа ПІ.
Третий четверть синтетического гена /МТ 1021-1500/ представляют приблизительно 479 комплементарньїх пар продукта РОК.
Трансформация в замороженнье подходящие клетки ДНбальфа штамма Е. соїЇ, селекция и идентификация сч ов трансформантов, определение характеристик трансформантов с помощью минискрининга и секвенирование фрагмента синтетического гена в вектор описань вьіше. - Минискрининг клонов РОС: і)
Третью четверть минискринируют, используя стандартнье методики /ЗатргооК еї аіІ/. Минипробу ДНК разрезают /а/Мсо І/Ара І и /в/ Рми ІІ. Клоньії, содержащие правильньсе структурь! рестрикци-онньїх гидролизатов, секвенируют, используя стандартнье,методики. Всего секвенировали 22 клона. В третьей четверти «Е зо Мдентифицируют три основнье "горячие пятна" делеций /а/ на позиции 1083, /в/ между позициями 1290-1397 и /с/ между позициями 1356-1362. Во всех клонах, за исключением одного, рОоС8, также постоянно имеется о вставка С на позицию 1365. Кроме зтих мутаций клони третьей четверти содержат большое число других, "п по-видимому, случайньїх делеций. Общим фактором, определяющим наличие трех мутационньїх "горячих пятен" в третьей четверти и одного "пятна" во второй четверти является то, что зти участки фланкировали на со любой стороне последовательностями, содержащими приблизительно 8095 С и к б. Олигомерь! на участках ЦІ5, «г
ШІб6, Ів, 0ІЮд, ГІ5, Гб, ГІ8,ЛІ9 реконструировали с целью уменьшения содержания СО Ж о на зтих участках. Пять клонов из пробьї РОК секвенировали, используя модифицированньсе олигомерньі.
Плазмида рОСМІОЗ имеет правильную последовательность для тоетьей четверти, за исключением изменения на позиции 1326. Зто изменение, касающееся замещения С на С, приводит к замещению одной « аминокислоть /лейцин/ на исходную /фенилаланин/. з с Пример 2Д: Синтез и клонирование четвертой четверти /комплементарньсе парьї 1480-1960/
Й Четвертую четверть клона получали из клона, которьій первоначально бьл сконструирован с целью а включения в себя третьей и четвертой четвертей гена. "Вторую половину" синтетического гена получали из проб
РСК с целью слияния третьей и четвертой четвертей. Указаннье пробьі использовали с праймерами РСК Рб/а/
М Рбв/г/, описанньіми вьіше для третьей четверти, и с праймерами Р7/а/ и Рв/а/, описанньіми ниже. Обратньй ї5» праймер модифицировали с целью включения сайта бас | и терминирующего кодона. Отдельнье пробь! для каждой четверти исследовали в 30 циклах при условиях, описанньїх вьіше. Дне четверти соединяли вместе со путям перекрьиівания РСКп последующего переваривания рестриктазами Мсої! и Заеї, Полученньій фрагмент с - размером 953рр клонировали непосредственно в рС183С54, которьій разрезали Мсо |/Зас | и обрабатьіївали щелочной фосфатазой. о рС183054 конструировали путем вставки интрона Мо 9 РЕРКкарбоксилазь /РЕРС интрон Мо9/ в ї» специфический сайт Нра | рС18246 /детально описанньій в примере 4/. рС18246 разрезали Нраї и фосйатировали СІР, используя стандартнье методики, описаннье в примере 2А. РЕРС интрон Ме9 получали с помощью РСК, используя рРЕР-10 в качестве матриць. рРРЕР-10 является геномньім субклоном, содержащим полньій кукурузньій ген РЕР карбоксилазь, кодирующий фотосинтетический фермент Сд, плюс 5'-рланкирующая часть ЛІК с размером приблизительно 2,2 кр и 3З'-«фланкирующая часть ДНК с размером
Ф) 1,8К5. ДНК с размером 1Окр лигировалр в НіпаїйЇ сайте руОсСІЗ ж (Ниазреїй еї аї., Ріапі Моїесшіаг Віоіоду, ка 12:576-589 /1989/. Прямой праймер для РСК, используемьйй для получения РЕРСинтрона Мо9, представляет собой СТАСАААААССАССААСТС, а обратньій праймер представляет собой СТОСАСАААСТОСАСТАСТ. бо Продукт РЦЦ является фрагментом с размером 108рр, содержащим только последовательности интрона Мо9
РЕРкарбоксилазьі. Пробу РСК, зкстрагировали фенолом и хлороформом,зтанольньій осадок фосфорилировали полинуклеотидной киназой и обрабатьвали полимеразой Т4 с целью заполнения бретпи, обнаруженной в продуктах реакции РОСК/Сіагк, 9.М., Мисіеіс Асій Кезеагсп, 16: 9677-9686 /1988/, используя стандартнье методики. Меченьій киназой фрагмент клонируют на тупом конце в Нраї! сайт рС13246, используя стандартнье б5 Методики, описаннье ранее.
Амплификация и сборка четвертой четверти
Матрица: 021-026 и 122-128
Прагмерь РСК
Прямье
Р7 /а/: 5- ТОСТОААОоСОо ССССООсСТТо АССОО-3
Обратнье
РВ /а/: 5- АТСАТСОАТО АССТОСТАСА ССТОАТСОАТ СТОСТА-3!
Праймерная пара 4: Р7/а/ - Рв/а/
Праймерная пара 3: Рб/а/ - Рб/а/ 70 Граймерная пара для перекрьівания РОК: Р7/а/ - Рв/а/
Продукт РСК, четвертая четверть: ОСТОАА АТСАСОСАОССТСАТСОСАТОАТ /484рр/, третья четверть ТІСССССТОТА-- Я - --- І ТСАССоо /484рр/, вторая половина: ОСТСАА- Я Я - Я -- Я САТОАТОАТ /953рр/
Четьіре положительньїх клона идентифицировали путем минискрининга плазмидь, а затем секвенировали, используя стандартнье методики.
Плазмида ВІР2 Мої содержит приблизительно правильную последовательность четвертой четверти, за исключением двух мутаций. Указаннье мутации расположеньй на позиции 1523 / замещение А на С, в результате чего происходит изменение аминокислоть! из-за замещения Нізв на Агад/ и на позиции 1634 /замещая
ТТ на С, в результате чего в аминокислоте происходит замещение зЗег на Тпг /.
Плазмиду ВЕР2 Мо1 использовали в конструкциий рС184414, описанной ниже. /В итоге, ошибки исправляли путем гибридизации всех олиго четвертой четверти, обработки Ара 1/В5іЕ ІІ и замень зтой области в рС184414.
Позтому в конечной конструкции оставались только последовательности от поззций 1842-1960 ВІ.Р2МОо1/,
Пример 3: Сборка и репарация конечного синтетического гена. с
Синтетический оптимизированньій относительно кукурузьі ген сгуіА(Б) Ві бьл сконструирован с целью клонирования в четверти. Использование методики РОК приводит, однако, к мутациям, которьіе в большинстве і) случаев представляют собой делеции, обусловливающие мутации со сдвигом рамки генетического кода.
Позтому плазмидьі, содержащие индивидуальнье четверти, секвенировали и правильнье части лигировали вместе, используя стандартнье методики. «Е зо После получения клонов паузой и овторой четвертей с почти требуемой последовательностью конструировали плазмидьй рЕВІОМо4 и рЕВІОМоО5 с целью получения требуемой последовательности о синтетического гена Ві до сайта Ога на позиции комплементарной парьі 634 /зта мутация разрушает сайт «-
ОгаїІп/. Конструкции рЕВІО изготавливали путем лигирования фрагмента Есо Му/ВатнНі с размером З3,9КЬ из рР1-8 с фрагментом размером 400рБр из роОАї!. Плазмида рРЕВІОМо5 имела требуемую последовательность до со сайта ОганІ, а плазмида РЕВІОМОо4 имела мутацию на позиции комплементарной парь 378. «Е
Плазмидь рінІМ4 и ріНІМ5 конструировали с целью репарации сайта ЮОгаїйЇ в плазмидах рЕВІОМо4 и
РЕВІОМо5. Плазмидьї рІНІММо4 и Мо5 изготавливали путем лигирования фрагмента Мсо 1/Ааї ІЇ с размером
З,5КЬ из плазмид РЕВІОМ и Мо5 соответственно с фрагментом Мсо 1/Аанй І с размером 500рр из рОовВ5. Плазмида рІНІМ5 содержала мутацию между сайтами Зас ІІ на позиции 884 во второй четверти синтетического гена Ві. «
Плазмида ріНнІМА4 содержала добавочную мутацию, как зто описано для конструкциий ее предшественниць! з с РЕВІОЮМОо4, . Сайт бас ІІ на участке блюскрипт-вектора ріІНІМА4 делетировали путем разрезания рінімаА Мої | и бас и а конвертирования зтих сайтов к тупьім концам, используя полимеразу ДИК Т4 при стандартньїх условиях перед лигированием зтого Фрагмента с размером 3,9КБ для получения рінІМА4 5. Удаление сайта Зас ІІ на участке вектора позн'оляет удалить фрагмент зас ІІ с размерен 90Бр с мутацией на позиции 884 во второй четверти їх рІНІМА перед замещением фрагмента Зас І с размером 9ОБр. Олигомерьі О/Л 12 и 13 метили киназой и гибридизировали /как зто описано вьіше/ перед разрезанием зас ІІ и вьіделеним Фрагмента с размером 90 ьЬр на со 295 Мивіеме гель. Фрагмент ас ІІ лигировали с фрагментом, внрезанньїм из вектора ріІНІМ475 и. обработаннье - Зас ІІ с размером З,8КБ, после чего указанньій вектор фосфатизировали СІР. Конструкцию репарированного Зас | назьівают рРНУВ2Моб. Ориентацию фрагмента зас ІЇ в РНУВ2Моб определяли путем скрининга РСК, как зто о описано ранее, используя следующие праймерь!: ї» МК2ЗА28 - 5-СсОСбОСТОСОБАТОСТОСССТ-3
МК25БА28 - 5-СВАОСТ5АСССТОАССОоТОСТ-3
МК2бА28 - 5-САССТОАТОСАСАТССТОАДА-3!
При проведений реакций РСК с 50 пмолями праймеров МК2ЗА28 и МК25А28 получили фрагмент с размером,приблизительно равньїм 180Ббр , показьівающий, что вставочньій Фрагмент, связанньій сайтами Зас ЇЇ
Ф) в РНУВ2Моб имеет правильную ориентацию. Использование праймеров МК25А28 и МК2бА28 при скрининге РСК ка вьіполняет роль негативного контроля, продуцируя фрагмент с размером, приблизительно рапньм 180Бр, только в конструкциях, содержащих Зас || связанньй Фрагмент с неправильной ориентацией. бр Последовательность плазмидьії РНУВ2Моб определяли, используя стандартнье методики.
Плазмида рНУВ2Моб имела одну мутацию на позиции 378, которая нуждалась в репарации с целью получения первой четверти, содержащей требуемую последовательность.
Плазмида рІНОМоб содержала требуемую последовательность для всей первой половинь! синтетического гена Ві. Плазмида рІіІНОМоб бьіла создана из Фрагмента Ааї П/Мсо | размером 3,4КкЬ плазмидьії рІНІМ5Ме2, 65 лигированного с фрагментом Ааї ПКсо І размером 500Бр йз плазмидь! РНУВ2МОб.
Для идентификации клонов или частичньх клонов синтетического гена, которьій содержит открьітье считьвающие рамки, использовали вектор отбора по канамицину,/описанньй вьше/. В кассету канамицина первьім помещали четвертую четверть синтетического гена Ві. Плазмида рКМ74-4 содержала фрагмент Ара 1/Сіа размером 500рр из плазмидьі ВІР2 /которую предварительно трансформировали в штамм дат- Е. сої /РО-100/, чтобьі можно бьіло резать с помощью Сіа І/, лигированньій с рОсС:КМ74, разрезанньім с помощью Ара 1/Сіа 1. Плазмида рКМ74-4 проявляла устойчивость к канамицину, но позже бьіло обнаружено, что она содержит две мутации-заменьі на позициях 1523 и 1634 /мутации описань! вьіше в разделе, касающемся клонирования четвертой четверти; они являются заменами, а не делециями или инсерциями)/.
В плазмиду рКМ74-4 бьіла вставлена правильная первая половина синтетического гена Ві из плазмидь! 7/0 ВІНОМОоб. Полученная в результате зтого плазмида, названная рКм124, бьіла создана из фрагмента Ара І/Вам НІ размером 3,9КрЬ, вьіделенного из планмидьі рРКМ74-4, лигированиой с ФрагментовАра!/Вам НІ размером 1КЬ из плазмидьі рІНОМоб. Плазмида рКм124 проявляла устойчивость к канамицуіну. Указанная плазмида содержала первую, вторую и четвертую четверти синтетического гена, формирующего одну откритую считьівающую рамку.
Затем третью четверть синтетического гена клонировали в плазмиду рРКМ124. Первьій функциональньй клон /5 В плазмиде рВі : КмМеб представлял собой функциональную копию указанного синтетического гена сгуІА(бВ) в
Км-кассете, которая проявляла устойчивость к канамицину, но которая содержала делецирующие мутации между третьей и четвертой четвертями. Плазмида рвВі:КмМоб бьіла создана из фрагмента лектора Ара 1/Мсо ркКМ124 размером 5КЬ, лигированного с фрагментом Ара 1/ Мсо! размером, приблизительно равньм 500Бр, из плазмидьї РОСМІОЗ /плазмида РОСМІОЗ содержала мисмоатч -мутацию на позиции 1326, которая позже бьла 2о репарирована. Контаминирулщая нуклеазная активность, по-видимому, делетировала Ара | сайт между третьей и четвертой четвертями в плазмиде рВі : КмМоб. Ген Ві, кодированньій синтетическим геном в плазмиде рВт :
КмМеб,имел приблизительно 50 - 6095 активность нативньїх белков против Европейского зернового точильщика.
С целью получения плазмидь), назьіваемой 355 : Віб, в 355: зкспрес-сизную кассету біл вставлен фрагмент
Зтаї!/Вам НІ размером 2КБ из плазмидь рВі: КміМоб. с
Первоначально бьіли полученьі два Функциональньїх -синтетических клона -Ві, каждьій из которьїх имел мутации: плазмпдьі рВі : КММоб и рС184414. Плазмида рС184414 , которая проявляла 10095 активность в і) испьтаниях против Европейского зернового точильщика по сравнению с нативньм геном, содержала замещающие мутации в третьей и четвертой четвертях на позициях 1323, 1523 и 1634.
Плазмиду рС134414 конструировали из двух плазмид, МО3.054 Мо18 и ІНОС, описанньїх вьіше. Плазмиду « зо МСЗ3.54Мо18 получали путем клонирования Фрагмента Ара 1/Крп І плазмидь! ВСР2Мо1 в РОСМІОЗ /используя те же самье рестрикционньюе сайтьу. При зтом получали плазмиду, содержащую третью и четвертую четверти о гена. Первую половину синтетического гена из плазмидьі 1НО разрезали Ват НІ и Мсо | и вставляли в плазмиду -жд
МСО3.С4Мо18 / содержащую третью и четвертую четверти гена/. Полученная в результате плазмида рС184414 содержит Функциональньй вариант синтетического гена. Будучи Функциональньм, синтетический ген в зтой со зв плазмиде содержит три ошибки: на позиции 1326 / С замещено на С/, на позиции 1523 /А замещено на б/ и на «Е позиции 1634 // замещено на С/.
Четвертую четверть плазмидьі рС184414 замещали фрагментом Ара/Ваї Е ІІ четвертой четверти с размером
З54Бр, полученньмм из гибридизирующих, легирующих и расщепляющих рестрикцией олигомеров четвертой четверти, как зто описано ранее, и вьіделяли фрагмент из 290 Мивіеме геля агарозьі. Плазмида рС184408 « представляла собой клон синтетического гена Ві, полученньійй путем замещения фрагмента четвертой четверти 7 с в плазмиде рС184414 гибридизированньмм фрагментом четвертой четверти. Для вставки промотора Самм 355 перед синтетическим геном Ві плазмиду рСІВ4406 получали из фрагмента Еса МуКрпі плазмидьі р355ВІ с ;» размером 4КЬ и фрагмента ЕсоМі/Крп І с размером 1,8КЬ плазмидм рС1844С8.
Плазмида рС184406 имела 10095 активность /по сравнению с белком нативного гена/ относительно ЕСВ, но содержала замещающую мутацию третьей четверти синтетического гена на позиции 1323, в результате чего в їх аминокислоте произошло замещение лейцина на фенилаланин. Плазмиду рВ3123М913 использовали для репарации указанной мутации. со Фрагмент третьей четверти плазмидьь рВвеЗ123М913 получали из генерированного фрагмента - гибридизированного олигомера с размером, приблизительно равньм 479Бр. Третьи четверти олигомеров 115-020 и 115-421 метили киназой, гибридизировали и лигировали, как зто описано вьіше. Реакциий ЕСК о вьіполняли, как зто описано вьіше, с праймерами Рб/а/ и Рб/в/ в течение 15 циклов. Продукт РОК обрабатьівали ї» протеиназой К с конечной концентрацией, равной приблизительно 50 мкг/мл в обьеме, равном приблизительно 95мкл, в течение ЗОмин при температуре 372С, а затем В течение 1їОмин при температуре 6592 /МисівЇс Асій
Кезеагсі, Стоме еї аї., 19:194, 1991/, Затем продукт зкстрагировали фенол/хлороформом и осаждали зтанолом,
Мспользуя стандартньсе методики, перед разрезанием рестриктазами Ара І и Моо).
Фрагмент РСК Ара 1/Мсо І с размером, равньім приблизительно 450Бр, лигировали с фрагменту вектора Ара іФ) 1/Мсо | с размером 3,8КБ из плазмидьй рІНСМоб с целью получения плазмидьї рВ5123М0о13. Плазмида ко рВаз123М913 содержала требуемую последовательность третьей четверти, оптимизированного относительно кукурузьі гена сгуїА(Б), размещенную в промежутке от позиции 1319 сайта Мер І до позиции 1493 сайта Ара І. бо Указанньй фрагмент Мер І/Ара | с размером 170Бр из плазмидь! рВ3123Я83 использовали в полностью активном синтетическом гене сгуїА(В) плазмидьі рС184418.
Вестерн-блот анализ
Анализьї вестерн-блотирования различньїх трансформантов вьіполняли, используя неочищенньсе зкстракть, полученньсе из Е.соїІ, вниращенного на селективньїх чашках. С помощью зубочистки культурь! соскребьівали с б5 чашек; содержащих трансформанть, представляющие интерес, которье вьращивали всю ночь при температуре 3720. Позитивньій контроль зкспрессии гена Ві в Е. соїЇ осуществляла конструкция, назьіваемая плазмидой рС183069, которая содержала нативньй' ген ВЕК, слитьій с зкспрессивньім промотором СатмМ 355 растения. Плазмида рСІВЗОЄЯЗ также содержала промотор 355, оперативно связанньй с геном, устойчивьм к гидромицину, промотор 355 с нитроном И дан, оперативно связанньй с геном айз,и промотор 355, оперативно связанньій с геном, кодирующим продукт нативного белка сгуїА(БІР Вт. Анализ предусматривал также негативньій контроль штамма Е.соїІ, не содержащего ген Ві. Культурьї ресуспендировали в 100мкл загрузочного буфера, содержащего 62мМ Тгів-нсі, рНб,8, 195 5О5, 0,0025956 бромфеноловой сини, 1095 глицерина и 7,590 меркаптозтанола. После нагревания смеси при температуре 959 в течение 1О0мин препарать! озвучивали ультразвуком в течение 1 - З секунд. Остатки центрифугировали в микрофуге при комнатной температуре в 7/0 течение приблизительно 5мин и 10...15мкл каждого образца загружали на акриламицньій 1095 основной гель ниже 695 концентрирующего геля (І аегптії, Майте 227:680-685 (1970)).
После злектрофореза, осуществляемого всю ночь при токе ТОМА, белки переносили из геля в ІттобБіІІеп мембрану /миллипира/. Перенос осуществляли, используя установку для злектрофоретического блотирования /Атегісап ВіоМисіеаг, ЕтегумІПе, СА/, В буфер для переноса /20мММ Ттів, 150ММ глицина и 2095 метанола/ в 7/5 течение 1,5 часов при токе равном 450мМА.
Буферь! для вестерн-блотизования включали:
Блокирующий буфер: 295 твин-20
ЗОММ Ттів-НСЇ, рніб,2 1Б0мМ масі
Промьівочньй буфер: 0,0595 твин-20
ЗОММ Ттів-НС,, рніб,2 150тМм Масі
Основной буфер: 100мМ Ттгів-НСІ, рне,б с 100мМ масі 10мМ Мас» і9)
После окончания переноса мембрану инкубировали в течение приблизительно ТОминут в блокирующем буфере. Перед обработкой первого антитела осуществляли три 15-минутньїх промьівания промьівочньм « зо буфером. Первое антитело представляло собой очищенноє иммуноаффиьінной хроматографией антитело кролика. или козла, приготовленное с использование белка СтуїІА(Б) в качестве антигена /СІра-СеїІду, КТР, М.С.; о
КосКіапа Іпс., сПрегізміПе, РА.; Вегкееу Апіроду СО., Кісптопа, СА. /. Специфическое антитело сгуіА(Б) "ее обрабатьівали сразу же перед использованием лизатом штамма Е.соїЇ из фирмь! Віо-Кайд в обьеме, равном мл, с 5мкг антитела, 5Омкл лизата штамма Е. сої в растворе промьівочного буфера. Указанную смесь инкубировали со з5 я течение одного часа при комнатной температуре перед разбавлением ев в соотношений 1: 30 до конечного /-«ф разведения 1 : 6000 промьівочньїім буфером. Инкубацию мембраньі! с первьім антителом осуществляли при комнатной температуре в течение 1,5 часов.
Между первой и второй обработкой антитела осуществляли три десятиминутньїх промьівания. Второе антитело представляет собой либо кроличий антикозлиньій, либо козлиньій антикроличий коньюгат шелочной « фосфатазь: /Зідта, ві. Гоців, мо./. МИнкубацию со щелочной фосфатазой осуществляли при комнатной шщ с температуре в течение одного часа, используя разведение в промьівочном буфере при соотношений 1 : 6000. . Между обработкой второго антитела и созданием вестернблота проводили шесть 10-минутньїх промьвок. «» Вестерн-блот создавали в 100мл проявительного буфера вместе с - 440мкл нитроголубога тетразолия в 7090 диметилформамиде /75мг/мл/ и З3Омкл 5-бром-4-хлор-индолил-фосфата в 10095 диметилформамиде /5Омг/мл/.
После проведения указанной операции в течение 10...15мин мембрану промьівали водой и сушили воздухом. ї» Пример 4: Крнструирование трансформирующих векторов.
Конструирование плазмидьі рС18710 и производньх.
Со Кассетнье плазмидьії рС18709 и рС18710 с промотором СаммМ 355 конструировали так, как зто описано у - Коїйвіевї!п еї аІ., Сепе 53:153-161 /1987/. Плазмида рСІВ710 содержала промотор Сапм и последовательности 5р терминации транскрипции для транскрипта РНК 355 /Сомеу еї аї., Мисі. Асіадв. Кез., 9:6735-6747/1981//. ші Рестрикционньій фрагмент Ва/11 с размером 1149рр дик Самм /комплементарнье парьі 6494-7643 по Нопп
Та» еї аї,, Ситепі Торісв Іп Місгоріоїоду апа Іттипоіоду, 96:194-220 и Приложения А-О /1982// вьіделяли из ДНК
СаікМ путем приготовительного злектрофореза, агарознога геля как описано ранее. Фрагмент смешивали с ДНК
ВаиНі-расщепленной плазмидьі руС19, обработанной лигазой ДНК Т4, и трансформировали в штамм Е. сої. /Следует отметить, что рестрикционньй сайт ВамНі в полученной плазмиде разрушали путем лигирования связьівающих концов Ва111 с "липкими" концами Вамні/.
Ф) Затем полученную плазмиду, названную рОС19/355, использовали в олигонуклеотидо-направленном Іп-мйго ко мутагенезе с целью вставки "Вамні распознающей последовательности ОБАТСС, следующей сразу же за Саму нуклеотидом 7483, в Хохг-мотиве. Полученная плазмида рС18710 содержала участок промотора Самм 355 и бо участок терминации транскрипции, разделеннье рестрикционньм сайтом Вамні. Последовательности ДНК, вставленнье в указанньій сайт Вамні зкспрессируют в растения с помощью зтих регулирующих транскрипцию последовательностей СамМ. /Следует также отметить, что плазмида рС18710 не содержит никаких инициирующих трансляцию кодонов АТО между началом транскрипции и сайтом Вамні/.
Плазмиду рС18710 модифицировали для продуцирования плазмидьї рС18709 путем вставки фрагмента 65 Замні, содержащего кодирующую последовательность для гигромицин фоофотрансферазь! из плазмидь рі-590 /Коїйнзіе!п еї а!., Сепе, 53:153-161 /1987//, в. сайт Вамні.
Плазмиду рСІВ709 модифицировали для продуцирования плазмидьі рСІВ99б6 за счет удаления АТО из инициирующего кодона гена гигромицин фосфотрансферазь), используя стандартнье приемь! мутагенезе, вставляя при зтом на указанное место пестрикцнонньій сайт Ва! І. Полученную плазмиду рС18996 затем модифицировали с целью удаления спіитов Ват НІ, Зіта ІІ и Воді І на 5'-нетранслированной лидерной области, где локализован 5 инициирующий кодон, З результате изменяеєется последовательность оснований ДНК с --АТААСОСАТС ССОбОООСА АСАТСТОАСА ТАТО-Нуд на ТАТААОСАТС ТОАСАТАТО-Нуд. Полученная плазмида известна как рС183073.
С другой стороньї, плазмиду рС18710 модифицировали для продуцирования плазмидьї рС18900 путем /о вставки Фрагмента Ват НІ -Всі І плазмидь! рСІВІО/355ВІ, содержащей кодирующую последовательность из 645 аминокислот, описанную ниже в Части С4, в сайт Ват НІ плазмидьї рС18710 с целью создания плазмидь! рСІВ710/3558Ї. Для вставки устойчивого к антибиотикам маркера плазмиду рС18709 разрезали взаї І, лигировали адаптер Крп 1/ За! І, а полученньій продукт лигирования разрезали Крп І. Фрагмент Крп плазмидь! рС18709, содержащий устойчивьй к З53/гигромизцину ген, вставляли в сайт Крп І плазмидьі рС18710/3558ВІЇ ддя 7/5 получения плазмидь! рСІВ900.
К генам, используемьм в качестве селективньїх маркеров, относится ген, устойчивьй к гигромицину, описанньій Коїйп -віеІп.-е( аіІ.епе 53: 153-161 /1987/. Ген гидромицина, описанньій в зтой работе, вводится
ВрисС -плазмиду, например, рС18710 или рС18709, и "зкстра" АТО слева от избранного участка цепи ДНК из последовательности, кодирующей гигромицин трансферазу, удаляли с целью образования плазмидь! рС18996.
Зтот модифицированньй ген плазмидьі рС1И966 затем модифицировали для удалрипя сайтов Ва ІІ, Ват НІ и
Зтаї! из 5'-учястка гена, используя стандартнье способьї молекулярной биологии для получения плазмидь! ро183073.
Плазмида рС18932 представляет собой плазмиду на основе рисСт19, содержащую химерньй ген
Рер-С:промотор/Вву/Рер-С:терминатор. Она составлена из фрагментов, вьіделенньїх из рРРЕР-10, субклона Ніпагі сч об Геномного клона, Н1т-лямбда-14, РМАБ И5А, 83:2884-2888 /1986/, гена кукурузьї, кодирующего фермент РЕР карбоксилазьі, активньій при фотосинтезе, и из плазмидьї рС18930, которая представляет собой фрагмент і)
Вамні, содержащий укороченную форму из 645 аминокислот гена зндотоксина сгуЇАБ в сайте Вамні плазмидь! рист18.
Фрагмент ЕсоКІ-ХпоЇ с размером 2,6КБ из рРЕР-10, содержаний полиА дополнительньй сайт, из гена «г зо РЕР-карбоксилазьі, вьіделяли и переваривали Рзї-і и Ніпс ІІ. Рестрикционньій перевар лигировали с рист8, переваненной РзйШНІКсЛІ, трансформировали в Е.соїЇ, а трансформанть! скринировали для обнаружения тех, о которніе содержат вставку рзйй-Ніпсі! с размером 412рр в рОсСт18, при зтом вставку контролировали с помощью -с де секвенирования. Полученную плазмиду назвали рС18931.
Ядерньй ген, кодирующий изозимьї фосфознолпируват карбоксилазь /"Рер-С"/, описан у Нидреїйй еї аї., Ріапі со
Моїіесшіаг Віоїо -ду, 12:579-589 /1989/. Плазмиду рС18932 конструировали путем лигирования трех фрагментов. «Е
Первьій фрагмент, содержащий терминатор РЕР-С транскрипции, продуцировали путем переваривания плазмидьї рС18931 по полного переваривания с Ніпайїї, частично с ЗрпЇ и вьіделяли фоагмент разм.3з098Бр.
Второй фрагмент, содержащий кодирующую последовательность зндотоксина Ві, продуцировали путем переваривания плазмидьі рС18930 с помощью Месої! и 5рпїЇ и изолировали фрагмент с размером 1950Бр. Третий « фрагмент, содержащий промотор РЕР-С, продуцировали путем переваривания рРЕР-10 до полного з с переваривания с Ніпаїїї, частично с Мсо! и вьіделяли фрагмент с размером 2,3К5. Лигирующую смесь . трансформировали в штамм Е.соїЇ , идентифицировали трансформантьі с правильной вставкой, а вставку а контролировали с помощью секвенирования.
Для получения фрагмента с размером 4,Укь, содержащего кукурузньій Рер-С : промотор/ВуРер-С :
Терминатор, плазмиду рС18932 разрезали с помощью Руці! и очищали на 1795І-СТ агарозном геле в однократном їх ТАЕ. Линеаризированньй вектор плазмидьї рС183079 и вставку с размером 4,9крБ из плазмидь! рС18932 лигировали, используя лигазу ДНК Т4, в ЗТ для получения плазмидьї рС184401. Плазмида рС184401 со представляет собой кукурузньй трансформирующий вектор, содержащий химернье гень:358 : - промотор/РАТ/355 : терминатор, Рер-С : промотор/Ви/Рер-С : терминатор и 355 : промотор/ даті Мо1 5ор Мнтрон/5И5/355 : терминатор. о Конструкция плазмидьі рС18246 /355 -Зив-3585 / ї» Кассетньій промотор СаМу 355, рС18246, конструировали следующим образом.
Рестрикционньй сайт раеї! на нуклеотидной позиции 7482 генома СаМму /Ргапск еї а/ї., СеїІ, 21:285-294 /1980/ модифицировали путем вставки олигонуклеотида с размером 48Бр, содержащего несколько сайтов рестриктаз, ов Включая сайт Мсо! /ССМОО-/, сайт ЗаіІ ЛЗТООАС/ и сайт ЗвйЦ/ЗАССсТте/, Указанньі: измененнье промотор СаОММ 355 вставляли в вектор рРИС19, которьій модифицировали с целью разрушения сайтов 551! и Заї! вектора. Таким
Ф) образом, промотор СаммМм 355 плазмидьй рС181500 содержал специфические сайтьй Зв и ба) , ка предназначенньсе для клонирования.
Плазмиду рС181500 переваривали с З8й/Мсої! и лигировали с геном БИ5, полученньім из плазмидь! рВ1221 во /Сіопіесі! І арогайгіез, Іпс., Раю А, СА/. Сайт Мсо! сливали с геном 55 таким образом, чтобьії АТС сайта
Мсо! функционировал в качестве инициирующего кодона для трансляции гена 55. Для 3'-конца химерного гена использовали сигналь! терминации и полиаденилирования Самуз55.
Конструкция плазмидьі рС183069 /355 -Аапе-С-Ор-355 /
Плазмиду рС18246 модифицировали путем добавления Даті интрона номер 1 кукурузного гена 65 алкогольдегидразь /дані/ /Оеєппів еї аї., МисіеІс Асідз Кезеагсі, 12:3983-4000 /1984// в сайт За! | плазмидь рС18246 для продуцирования плазмидьі рС183007. дані интрон внрезали из кукурузного дані гена в качестве фрагмента Ваї І/Рві І и субклонировали в рОС18, которьій вьірезали с помощью Зта 1/Рві І, для получения плазмидь), названной Аа 1026. Плазмиду Адпй 1026 разрезали с помощью Рмуи 11/Зае ІІ, у фрагментов формировали тупье концьі с помощью полимеразь! ДНК Т4, добавляли линкерь заї І, используя стандартнье методики, а фрагмент с размером, приблизительно равньім 560Бр, восстанавливали из 3956 Ми БеїЇме геля и лигировали а риС18, разрезанной ЗаІ І и обработанной фосфатазой. Аді интрон Мої, сшитьй с зап, в полученной плазмиде вьірезали с помощью За! 1, очищали на геле и лигировали с разрезанной за!1 и обработанной фосфотазой плазмидой рС18246 для получения плазмидьі! рС183007.
Плазмиду рСІВ3007 разрезали с помощью РОЇ и концьі затупляли, используя полимеразу ДНК Т4 /МЕМ/ 7/0 Епдіапа Віоіарв/ в соответствии с инструкциями изготовителя. Полученнье молекульй с тупьіми концами разрезали с помощью 5рі І и фрагмент размером 5,8КЬ с одним тупьім концом и одним Зрі-І-концом очищали на геле из низкоплавкой агарозьі //СТ/, используя стандартнье методики. Плазмиду рС18900 разрезали с помощью та // 5рі І и Фрагмент, содержащий ген З355/ВІ, очищали на І СТ геле агарозьі. Два очищенньх гелем фрагмента лигировали с Її агарозой, используя лигазу ДИК Т4 при стандартньїх условиях. Полученнье 7/5 лигированнье фрагменть! трансформировали в Е.соїІ, используя стандартнье методики. Полученную плазмиду назвали рС133062. Существует два варианта зтой плазмидь. Плазмида рСІВ3О62Мо1 имеет сайт Зта |, регенерированньй там, где лигировань! затупленнье конць!ї сайта Зта | и полимеразь! Т4. Наиболее вероятно, что зто явилось следствием удаления с помощью полимеразь! Т4 нескольких комплементарньїх пар из сайта
Зта І в течение реакции затупления.
Плазмиду рСІВ3062Мо3 разрезали Крп І и с помощью полимеразь! ДНК Т4 делали ее тупоконечной, затем разрезали с помощью Рми ІЇ для получения Фрагмента длиной 6,4КЬ с тупьіми концами, содержащего гень! 355/5И5 и 355/ВІ. Указанньій тупоконечньій фрагмент лигировали с- плазмидой рС183073, разрезанной Зта І, для получения плазмид рС183063 или рС183069. Плазмида рС183063 содержит такой же фрагмент, что бьл использован для получения плазмидь! рСІВ3063, но химернье геньі в плазмиде рС183069 имеют одинаковую сч ов относительную ориентацию, отличную от ориентации геном в плазмиде рСІВ3З063. Зти плазмидь! содержат а/ промотор 355, оператично связанньй с устойчивьм к гигроуицину геном; 6/ промотор 355 с Аанп нитроном Мо, і) оперативно связанньій с геном БИ; и в/ промотор 355, оперативно связанньій с геном, коюодирующим продукт синтетического инсектицидного белка СтутА/р/ из ВасіПизв (пигіпдіепвів, как зто описано вьіше. Пробь (35.
Пробьі БИ вьіполняют по существу так, как зто описано в ТеПегзоп, Ріапі Мої. Віо. Керогіег, 5:387-405 «г зо /1987/. Как показано вьіше, плазмида рС13246 содержит промотор Самм355, слитьій с геном 5И5. 5'-нсетранслированньій лидер указанного химерного гена содержит копию кукурузного АапІ интрона Мо1. Он о используется в данном случае в качестве средства трансформационного контроля. Хотя при каждой «- трансформации добавляли одинаковое количество плазмидь! рС18246, рассчитанная активность изменялась среди испьітанньїх конструкций ВІ. Величинь, показаннье ниже, являются усредненньіми для трех репликаций. со
Плазмиду рС184407 испьітьївали дваждь. «Е рос1в3069 28нМ му/мкг/мин рс184407 0,7нМ М/мкг/мин, 2,3нН. МЦ/мкг/мин «
Пример 5А: Анализ синтетического гена сгуЇА/б/ на инсектицидную активность к европейскому зернрвому 7 70 точильнику. с Синтетический ген сгулА/Ь/ плазмидьї рС184414 в штамме Е. соїЇ исследовали на инсектицидную активность "з к Европейскому зерновому точильщику в соответствии со следующими правилами.
Жидкую искусственную пищу для насекомого очищали в чашке Петри размером бомм, снабженной крьіІшкой
Геллхана. После загустевания клетки Е. соїІ, суспендированнье в 0,195 тритона Х-100, распластьівали по всей ї» що поверхности с концентрацией З Х 107 клеток/ см". Чашки вьісушивали воздухом. Затем десять Европейских зерновьїх точильщиков первой возрастной стадии, Озігіпа пибіаі|5, с возрастом менее 12 часов размещали на (ее) поверхности пищи. Пробу инкубировали при температуре 302С в полной темноте в течение 2...5 дней. В конце - опьїта записьівали процент смертности. Положительнь!м считали клон, которьій давал 50 или более процентов 5р смертности, тогда как контрольнье клетки Е.соїЇ давали 0...1095 смертности. о Для сравнения испьїтьївали нативньй ген сгуїА/б/ плазмидьії рС183069 при той же концентрации. Клонь
Т» испьітьвали с пищей при концентрации З х 107 клеток/сме; 20 насекомьх на один клон. Бьли получень следующие результать!:
Клон Процент смертности
Контрольньй 0) (Ф. рос1в3069 100
ГІ рс1в4414 100
Зти результать! показьівают, что инсектицидньій кристаллический белок, полученньїй от синтетического гена бо сгуїА/Б/, демонстрирует большую активность к Европейскому зерновому точильщику по сравнению с такой активностью белка ІР, полученного от нативного гена сгуІА/р/. Другие плазмидьї, содержащие синтетический ген сгу!їА/б/, исследовали аналогичньіїм образом.
Пример 5АВ: Анализ белка СгуЇа/р/ на инсектицидную активность к точильщику сахарного тросника. в Ген сіуІА/р/ зкспрессировали в Е. сої! и исследовали на инсектицидную активность к точильщику сахарного тростника /ОІшгеа взасспаів/ в соответствии с той же методикой, которую использовали для Европейского зернового точильщика, описанную вьіше/ Результать! исследования обобщень в Таблице. ; нн нн 60000000 о 00000000 юю їв
Приведенньій результатьь показьвают, что инсектицидньй белок, продуцированньй геном ВІ, оптимизированнькм относительно кукурузьї, зффективен против точильщика сахарного тростника. Более вьісокие концентрации белка СтуіА/Б/, 25Онг/г - 100Онг/г, достигаются в трансгенной кукурузе, полученной в го сСоответствий с настоящим изобретением.
Пример 6: вьіделение и трансформация синтетическим геном Ві протопласть кукурузьі.
Исследовали зкспрессию синтетического гена Ві лранзиентно трансформированнье протопласть! кукурузьі.
Медодика вьіделения протопласт: 1. Содержимое 10 суспензионньїх культур двухдневной кукурузьі 2717 линии б пипетируйте в стерильнье с пробирки обьемом 5Омл и отстаивали. Затем нее культуральнье средь! удаляли и набрасьівали. 2. Клетки /в обьеме 3...5мл/ ресуспзндируйте в ЗОмл раствора фермента протопластьї со следующим (8) составом:
Зо целлюлаза К5 195 мацерозим КІО в КМС буфере «г зо КМС буфер /состав на 1-литр/ «в)
КСІ 8,65г -
МаСсІ - вН2О 16,А7г сасі» - 2Н2О 12,50г со
МЕ5Б 5,0г « рнН5,б, стерилизация фильтрованием через микропористую мембрану
З. Хорошо смешайте клетки и поместите аликвотную смесь в чашках Петри размером 100 х 25мм, приблизительно 15 мл в чашку. Для переваривания с помощью ротационного шейкера перемешивайте в « 0 течение 4 часов. з 4. Пипетируйте 1їОмл КИС через микрофильтр с размером ячеек 100мкм. Отфильтруйте содержимое чашек с через микрофильтр. Промойте микрофильтр равньім обьеемом КМС. :з» 5. Пипетируйте осторожно отфильтрованнье протопласть! в 50о-милдилитровье пробирки и центрифугируйте в течение 10 минут в центрийуте Вескмап 1Т.)-6 при 1000об/мин /500л/. 6. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспенди-руйте пеллету в 1їОмл КМСО. Соедините їз содержимое трех пробирок в одной пообирке и доведите обьем до 50мл, доливая КМС. 7. Повторяя вьішеуказанньсе зтапьі, вновь центрифугируйте и промойте. бо 8. Ресуспендируйте все промьтье протопластьь в 5Омл КМОС. Определите количество в гемоцитометре. - Центрифугируйте протопластьі и ресуспендируйте при 8 х 10б/мл в ресуспендирующем буфере /25-буфері/. 5о КЗ-буфер /состав на 500мл/ («в) ї» маннит 27,33г
Сасіо /0,1 М концентрированной/ 7Бмл
НЕК ОБГ рН5,8Ї, стерилизация фильтрованием через микропористую мембрану. Методика трансформации (Ф) протопласт: г 1. Поместите 5О0мкг плазмидной ДНК /конструкции ІР Ві, как синтетического/урС184407/, так и нативного /рРСІВ3063// в пробирки с 15мл полистироловой культурьі. Поместите также 25мкг зИ5-содержащей плазмиднри во ДНК /которая не содержит ІРВІ /рСІВ246/ во все пробирки. Используются З репликации на одну конструкцию, подлежащую исследованию, при одной репликации, не содержащей ДНК, в качестве контрольной.
Ві конструкции: БИ конструкция: рос1в3069 рос18246 рос184407 б5
2. Слегка перемешайте протопласть! и поместите 0,5ми в пробирку.
З. Добавьте 0,5 мл РЕЄ-40 в каждую пробирку.
Состав РЕО-40: 0,4М маннита 0О1М Са(Мо»з)» - 4850 рнНае,О, стерилизация фильтрованием через микропористую мембрану. 4. Слегка перемешайте с целью обьединения протопласт с РЕ. Подождите 30 минут. 5. Последовательно добавляйте імл, 2мл, и бмл раствора МУ5 через 5-минутнье интервальі. Состав /о раствора М/5 154мММ 125 мМ Сасі» - НО
БММ КС
5ММ глюкозь рН, 0, стерилизация фильтрованием через микропористую мембрану. 6. Центрифугируйте в течение 10 минут в центрифуге Т9У-6 Весомая, приблизительно при 1000об/мин /500л /.
Удалите надоса-дочную жидкость, 7. Осторожно ресуспендируйте пеллету в 1,5мл средьі ЕМУ и осторожно поместите в чашки Петри размером 35 х 10мм. Среда ЕМУ /состав на Тлитр/: соли М 4,3Гг 200х В5 витай. 5мл сахароза Зог пролин 1,5г с маннит 54г о 2,АД Змг рН5,7, стерилизация фильтрованием через микропористую мембрану. 8. Инкубируете в течение всей ночи в темноте при комнатной температуре. « 9. Вьішполните исследование вид, биопробьй насекомьх и ферментньй иммуносорбентньй анализ на протопластовьїх зкстрактах, как зто описано ниже. (ав)
Пример 7: Конструирование полноразмерного синтетического оптимизированного относительно кукурузь - гена СтуІА/р/.
Последовательность 4 представляет собой синтетическую оптимизированную относительно кукурузь (ее) последовательность, кодирующую полноразмерньй инсектицидньй белок сгуіА/б/ из В .Пигіпдіепвів. «
Укороченньй вариант вьшеуказанного гена представляет собой первую часть с размером, равньм приблизительно 2КБ, зтого гена. Остаток полноразмерного гена клонировали, используя методики, описаннье вьіше. Указанная методика включаєт синтезирование олигомеров ДНК длиной от 40 до 90 МТ, используя обьічно 80 олигомеров в качестве среднего размера. Олигомерьі! очищали, используя стандартнье методики ЖХВР или « 20 восстановления из полиакриламидного геля. Очищеннье олигомерьі метили киназой и гибридизировали с з целью образования фрагментов с размером, приблизительно равньм 500Бр. Гибридизированнье олигомерь! с могут бить амплифицировань, используя РСК-при стандартньїх условиях. Затем фрагменть! с размером 500Бр, :з» полученнье либо непосредственно из гибридизаций, из амплификации РОК, либо восстановленнье из агарозньїх гелей после либо гибридизации, либо амплификации РСК, клонировали в плазмиду и" трансформировали в Е. соїЇ используя стандартнье методики. їх що Рекомбинантнье плазмидьі, содержащие желательнье вставки, идентифицировали как зто описано вьіше, используя РСК и/или стандартнье методики минискрининга, Затем вставки, которне представляются (ог) правильньми на основе их РСК и/или профиля рестриктазьї, секвенируются с целью идентификации тех - клонов, которне содержат требуемую открьтую считьшающую рамку. После зтого фрагменть! лигировали вместе с синтетической последовательностью с размером, приблизительно равньім 2КЬ, описанной в примере (ав) 50 2, с целью получения полноразмерного оптимизированного относительно кукурузь! синтетического гена сгуїА/р/,
І» используемого для зкспрессии вьісокого уровня белка сгуїА/б/ в кукурузе. Содержание З ї- С в нативном и синтетическом генах ВЕ
Полноразмерньїй нативньїй 38,85 29 Укороченньй нативньй 37,290
ГФ) Полноразмерньй синтетический 64895
Укороченньй синтетический 64,695 іме)
Процент гомологии конечного укороченного варианта гена Ві. к гену использования кодона "чистой" кукурузь 60 составляєт 98,2596.
Пример 8: конструирование растительного зкспрессируемого полноразмерного гибридного частично оптимизированного относительно кукурузь! гена СтуІА/Б/.
Плазмида рС184434 содержит полноразмерньй ген СтуїА/б/, включающий синтетический оптимизированньй относительно кукурузь! ген сіуЇА/рб/ с размером, равньім приблизительно 2КБЬ, с остатком /СООН терминальньй 62 кодирующий участок/ гена, вбіделенного из нативного гена. Таким образом, кодирующий участок представляет собой химеру между синтетическим геном и нативньім геном, но полученньій в результате белок идентичен белку нативного белка сгуїА/б/. Синтетический участок состоит из нуклеотидов 1-1938 /"аминокислоть! 1-646/, а нативная кодирующая последовательность - из нуклеотидов 1939-3468 /аминокислоть! 647-1155/.
Последовательность указанного гена показана на фиг.7. Карта плазмидьі! ро184434 показана на фиг.8.
Для получения плазмидьі! рС184434 бьіли сконструированьі следуюшие олиго:
КЕІЗ4А28 - У-СОСТСАСССАС ТАССАСАТСО АТСААЄТАТС СААТТТАЄТТ САСТ -3
КЕІЗБА28 - 5 -АСТСААСТАА АТТОСАТАСТ ТОАТСОАТбТ ССТАбТСОСТС АСО-3!
КЕ1ТЗ36А28 - У-ССАЗАТСТОА ОССТСТТАОСТ АСССААТАЄС СТААСОТ-3 70 КЕ137А28 - У-СОСТОАТТАТО САТСАСССТАТ-3'
КЕТЗ8А28 - 5У-ССАСАТСТОА ОССТСТТАТТСО СТОСАТААЄА АСТААТТО-3"
МКОБА28 - 5-СААДАООСТАСС СААТАССОТА АСО-3
МКЗ5А28 - У-ААСОАСОСТОТ АСАТСОАССО-3
Плазмиду рС184434 изготавливали, используя четьіреххедови лигирование с фрагментом размера 5,7КЬ из 7/5 плазмидьі рС184418, с химерньім фрагментом, полученньм с помощью реакции РСК и обработанньім Вві Е
П/Крп І с размером 346брр, с фрагментом нативного сгуіА/б/ обработанного Крпі/М5і! размером 108рр из плазмидьі! рСІВ1315 полученньм, при РСК фрагментом Ме! І/Вао! І с размером 224Бр. Для лигирования и трансформации вьібирали стандартнье условия, описанньсе ранее.
Фрагмент слияния синтетического нативного гена изготавливали в два зтапа, используя реакцию РОК
Первьій фрагмент слияния с помощью РСК с оазмером 253рр изготавливали с использованием 100 пмолей, олигомеоон КЕ134А28 и МКО4А28 с приблизительно 200нг нативной матриць! скудА/и/ в 100-микролитзсвом обьеме с 200нм каждого дезоксинуклеозидтрифосфата /аМТР/, ЇХ буфера РСК/Регкіп ЕІтег Сефв/, 2090 глицерина и 5 единиц полимеразь! Тад/ Регкіп ЕІтег Сефшв/. Реакцию РСК, вьіполняли при следующих условиях: 1 минуту при температуре 942С, 1 минуту при температуре 552С, 45 секунд при температуре 722 с удлинением сч
З в течение З секунд при 25 циклах. Фракцию /195/ указанной первой реакции РСК, использовали в качестве матриць наряду с 20Онг синтетической ДНК для получения полного фрагмента слияния синтетического о нативного гена с размером 351Бр. Олигомерами, используемьми в качестве поаймеров РОК во второй реакции
РСК, являлись 50 пмолей МКЗ5А28, 50 пмолей МКО4А28 и 25 пмолей КЕ135А28. Состав смеси и параметрь! реакции РСК те же, что и перечисленнье вьіше. Полученньій фрагмент слияния синтетического нативного гена «І зо с размером З51Бр обрабатьвали протеиназой К при общей концентрации 5Омкг/мл и зкстрагировали фенол/хлороформом с последующим осаждением зтанслом перед разрезанием с помощью Вв5ві Е П/КкКрп І, - используя стандартнье условия. «--
Фрагмент подученньій с помощью РОК и обработанньй, Мзі І/Ва! ІІ с размером 224рр, использованньй для получения рС184434, создавали, используя 100 пмолей олигомеров КЕ137А28 и КЕ138А28 и 200нг нативного со з5 гена сгуЇА/Б/ в качестве матриць! в 100мкл обьеме с тем же составом смеси и параметрами реакций РСК, что МИ «р перечисленнье вьіше. Нативньій фрагмент сгуіїА/б/ полученньій с помощью реакции РСР, с размером 230Бр, обрабатьшвали протеиназой К, зкстрагировали фенол/хлороформом и осаждали зтанолом, как зто описано вьіше, перед разрезанием его с помощью Мві 1/Ваї ПЇ.
Плазмиду рС134434 трансформировали в кукурузнье протопласть! так, как зто бьіло описано вьіше. Для « 70 сравнения в качестве контрольньїх использовали протопластьї 2717 линии 6 с плазмидами рС184434 и шщ с рОС184419. Результать! приведень! ниже: ;» нг Вумг белка 4419 /358/ 14 400 4 2100 4434 /полноразмерная/ 2200 - 900
ЧК»
Результат - 1Знг Вумг белка для нетрансформированньїх протопластов Результать! показьшвают, что со плазмида рС184434 зкспрессирует на уровне, равном приблизительно 15905 от зкспрессии плазмидьі рС184419. - Вестерн блот-анализ показьшваєт, что по меньшей мере одна треть белка сгуїА/б/, продуцированного плазмидой рС184434, имеет размер 130КО. Таким образом, значительное количество полноразмерного белка о сгу!іА/в/ продуцируется в клетках кукурузь! при зкспрессии плазмидьі рС134434.
Т» ПРИМЕР 7: Й КОНСТРУЙРСВАНИЄЕ ПОЛНСРАЗМЕРНЬМХ.ГЕНОВ СКУТА/Б/, КОДИРУЩИХ
ТЕМПЕРАТУРОУСТОИЧИВЬИ БЕЛОК
Конструкции плазмид рС185511-5515, каждая из которьїх содержит полноразмерньй ген сгутА/а/, описань
НИЖе. В зтих последовательностях делегация из 26 аминокислот между аминокислотами 793 и 794,
КСОЕРМКСАРНІ ЕМУМРДІ ДСЗСЕДОЕ, присутствующая в сгуїТА/а/ и сгуїтА/с/, но не в сгулА/Б/, восстановлена.
Ф) Ген в плазмиде рС185513 является синтетическим; другие четьіре гена являются гибридньми и, таким образом, ко являются частично оптимизированньїми относительно кукурузь!.
Конструирование плазмидьі рС185511. во Указанная плазмида является производной плазмидьі рС184434. Карта плазмидьі рС185511 показана на фиг.10. Сегмент ДНК размером 435 Бр между комплементарньми парами 2165 и 2590 сконструировали путем гибридизации синтетических олигомеров, предназначенньїх для вьіполнения роли верхней и нижней цепи, как зто бьіло описано вьіше для конструкции укороченного гена сгутА/в/. Указанньій сегмент синтетической ДНК синтезировали, используя стандартнье методики, известнье специалистам в данной области, пои зтом 65 указанньій сегмент включает делецию из 26 аминокислот, которая, как вьіявлено, встречается в естественном состояний в белке сгутА/в/ в Васійи5 (пигіпдіепвзіз Кигеїак!і НО-І. Полньіїй инсерционньїй сегмент ДНК использует преимущества оптимизированного относительно кукурузьь кодона для кодирования аминокислот. 26 аминокислот, используемье для восстановления естественно встречающейся делеции, вводили внутрь указанного фрагмента. Их вводили, начиная от позиции 2387 между сайтом Крпі на позиции 2170 и сайтом Хваї на позиции 2508/2586 в плазмиде рС185511/ плазмидьі рС184434. Плазмиду рС135511 конструировали путем трехходового лигирования, используя фрагмент с оразмером 3,2КОБ, полученньй рестрикционньм перевариванием плазмидьї рС184434 с помощью 5Зрп! и Крпі фрагмент с размером 3,8КЬ, полученньй перевариванием плазмидьї рС184434 с помощью ЗрпЇ и Хваі и фрагмент с размером 416рр, полученньй перевариванием синтетической ДНК, описанной вьше, с помощью Крпі и Хваї. Ферментативнье реакции 7/0 Ввіполняли при стандартньхх условиях. После лигирования смесь ДНК трансформировали в подходящие клетки
Е.соїї, используя стандартнье методики. Трансформанть! селектировали из І-агаре, содержащем 10Омкг/мл ампицилина. Характеристики плазмид в трансформантах определяли, используя стандартнье методики минискрининга. Последовательность восстановленного гена сгуіА/в/, копирующая теупературоустойчивьй белок сгуїА/в/, приведена на фиг.9.
Конструирование плазмидьі рС135512.
Конструкция указанной плазмидьі является производной плазмидьі рС184434. Карта плазмидьі рС185512 показана на фиг.12. Для репарации делеции 26 аминокислот приготавливали ДНК, используя стандартнье методики синтеза ДНК и ферментативной реакции. Три кассетьї двухцепочечной ДНК, рогЕсавзі, рогсавз2 и роРсавзЗ3, каждая из которьіїх имеет размер ЗО0рр, приготавливали и использовали для замещения участка, расположенного между рестрикционньім сайтом Вз5ІїЕЇ! на позиции 1824 и сайтом Хваї на позиции 2508, при зтом кассетьі включали вставку дополнительньх 78Ббр, которье кодировали недостающие 26 аминокислот /описаннье вьіше для плазмидьі рРС18551Т в плазмиде рС184434/. Указаннье кассеть! конструировали такими, чтобьї они содержали кодоньі, оптимизированнье относительно кукурузьї, одновременно обеспечивая 10095 аминокислотную идентичность с инсектицидньмм белком. Каждую из зтих кассет клонировали в сайт ЕсокКМ с блюскрипт-вектора /стратаген/ с помощью стандартньїх методик. Три кассеть! конструировали так, чтобь! они содержали перекриівающие рестрикционньсе сайть!. Кассета 1 имела рестрикционньсе сайть! Вз5іЕїЇ! на 5'-конце и і)
ЕсокМ на 3-конце: кассета 2 имела сайт ЕсокМ на 5'-конце и сайт СіаЇ на 3-конце; кассета З имела сайт Сіа! на 5- конце и сайт Хва | на 3-конце. Кассетьь по отдельности клонировали в блюскрипт а затем полньй фрагмент с размером 762бр собиоали лигированием, используя стандартнье методики. Плазмиду рС115512 «г зо собирали, используя указанньй фрагмент с разменом 762Бр и лигиропянгя его с фрагментом с размером 6,б5Кр, полученньм путем полного переваривания плазмидьй рС134434 с помощью ВвіЕїЇЇ и частичного о переваривания с помощью Хваї. С другой стороньі, может бьіть использовано четььірехходовоє лигированиє, в о/р котором применяется тот же вектор и указанньюе три кассетьї, перевареннье специфическими ферментами.
Ферментативнье реакции вьіполняли при стандартньїх условиях. После лигирования смесь ДНК со трансформировали в подходящие клетки Е.соїЇ, используя стандартнье методики. Трансформанть «Е селектировали на І-агаре, содержащем 100мкг/мл ампицилина. Характеристики плазмид в трансформантах определяли, используя стандартнье методики минискрининга. Полученная плазмида является плазмидой рС115512. Последовательность репарированного гена сгуІА/в/ показана на фиг.11. Указанньій репарированньй ген сгуїА/в/ отличаєтся от гена, содержащегося в плазмиде рС185511, тем, что больший участок области « Кодирования сгуій/в/ оптимизирован для зкспрессии кукурузьі за счет использования преимущественно в с кукурузньїх кодонов.
Конструирование плазмидьі рС185513. ;» Указанная плазмида содержит репарированньій ген сгуЇА/в/, вьіделенньій из плазмидьі рС185512. Карта плазмидьі! рС135513 показана на фиг.14. Участок 3 из сайта Хваї на позиции 2586 до конца гена /сайт В ІІ на позиции 3572/ полностью заменяли оптимизированньіми относительно кукурузь! кодонами. Указанньй участок ї5» синтезировали, используя стандартнье приемь! синтеза, ДНК и ферментативной реакции, хорошо известной специалистам в зтой области, в качестве четьірех кассет двухцепочечнмх ДНК /кассеть Мо 4, 5, 6, 7/. Соседние со кассетьї имеют перекриівающие рестрикционнье сайть! для облегчения связи между кассетами. Указанньіми - сайтами являются сайтьї ХваІ и ХпоЇ на 5- и 3-концах кассеть! 4; сайть! ХпоЇ и Засі на 5- и 3-концах 5р боответственно кассеть 5; сайтьі Засі и В8їХІ на 5- и 3- концах соответственно кассеть! б; сайть! ВвіХІ и Ваї о ІЇ на 5- и 3- концах соответственно кассеть 7. Как зто описано для плазмидь! рС135512, кассеть! клонировали н ї» тупоконечньій сайт ЕсокМ блюскрипт-вектора /стратаген/ и полноразмерньй "репарированньій" ген сгуІА/в/ клонировали либо путем последовательной сборки вьшеуказанньх кассет в блюскрипт с последующим лигированием полного синтетического участка с размером 967рр с фрагментом размером 6448Бр, полученньім дв путем полного переваривания плазмидь! рС185512 с помощью Во) їЇ и частичного переваривания с помощью
Хваї. С другой стороньі, плазмиду, содержащую полноразмерньсе геньі, получали пятиходовьім лигированием (Ф, каждой из четьірех кассет /лосле расщепления соответствующими ферментами/ и того же вектора, как зто ка указано вьіше. Последовательность полноразмерного "репарированного" гена сгуЇїА/в/ показана на фиг.13.
Белок, закодированньій различньми синтетическими и синтетически/нативньми химерами кодирующего бор участка, кодирует тот же белок. Указанньй белок является теплоустойчивьм вариантом сгуїА/в/, продуцированного путем репарирования естественно встречающейся делеции 26 аминокислот, ввіявленной в гене сгуїА/в/ из ВасШив (Пигіпдіепвзіз Кигеїакі НО-Ї. 71 когда область гомологиий сравнивали либо с дельта-зндокснами сгуїІА/в/, либо с сіміА/с/ из ВасіПизв (пигіпдіепвів.
Конструирование пламида рСІВ5514 65 Зта плазмида является производной плазмидь! рСІВ4434. Карта плазмидьі! рСІВ5514 показана на фиг.16.
Она изготовлена с использованием кассеть! МОЗ синтетической ДНК /см. вьше/, содержащий оптимизированную относительно кукурузьі последовательность участка между сайтом СіаІ! /позиция 2396/, вьіявленном на термоустойчивом участке из 26 аминокислот, и сайтов ХваІ на позиции 2508 в плазмиде рСІВ4434 /2586 в плазмиде рС185511/. Участок методу позицией 2113 плазмидьй рС184434 и местом соединения термоустойчивого участка амплифицировали РСК, используя в качестве матриць! плазмиду рС184434. При зтом имеют место следующие параметрь! праймеров: прямой: 5-ССАССОАТАТСАССАТССААООСАСОСОАТОАСОІАТТСААдАО-3! обратньй; 5-АССОСАІСВАТТСООСТОСССОСАСТТОССОАТТОСАСТТООСООССТОАДААО-3.
Затем продукт РОК переваривали с помощью рестриктаз Крпі и Сіаїа и лигировали в четьірехходовой /о реакции с Фрагментом с размером 189рр, полученньім путем переваривания кассеть! З с помощью Сіа! и Хваї, фрагментом плазмидьії рС184434 с размером 3,2КБ переваренньм Зрпі и Крпі, и фрагментом плазмидь! рОШВА4434 с размером 3,8КЬ, полученньм путем переваривания с помошью Зрпі и Хва. Ферментативнье реакции вьіполняли в стандартньїх условиях. Продукт лигирования трансформировали в подходящие клетхи Е. со!ї, селектированнье ампнцилином и скринированнье с использованием стандартньїх методик, описанньх 7/5 Ввіше. Последовательность сепарированного гена сгуіА/в/, содержащегося в плазмиде рСІВ35514, показана на фиг.15.
Конструкция плазмидьі рСІВ5515.
Плазмида рС184434 бьла модифицирована путем добавления термоустойчивого злемента Сег|зег/(«зеівег
Т5Е / с размером 78рБр, описанного вьіше, между сайтом Крпі /2170рр/ и сайтом Хва І /2508рБр/ на участке 2о нативного ВІК. Точньїйй инсерционнни сайт начинается на нуклеотиде Мо2379. Участок, содержащий Сеїзег Т5Е, амплифицировали двумя циклами реакций РСК, т.е. фрагментом Крп1 - СеІзег ТЗЕ и фрагментом Сеїзег ТЗЕ -
Хва!т.
Праймер РСК Мо: /сайт Крп 1/ 5 - АТТАСОТТАС ОСТАТТОООСТ АССТТТОАТО -3 с
Праймер РСК Мо2: /низ Сеїзег ТЗЕ/ 5 - ТоСССОТССС ТОСАОСТОСА ОСТСТАООСТоС СОбТТССАСТ ССАООТОСОоб АбСОСАТОСА і)
ТТевОсСТоСС СОСАСТТОСС САТТОСАСТТ СОСБОСТОА - 3
Праймер РСК Моз: /верх Сеїзег ТЗЕ/ 5- СААСТОСООо ОАСССОААТС ОАТОСОСТОС ОСАССТОСАС ТОСААСССОб АССТАСАСТО «і зо САССТОСАВО БАСОСОБАДА ААТОТОСССА ТСАТТОСС - 3
Праймер РСК Мо4: /сайт Хва 1/ о 5- ТОСТТТСТСТ ТСОАСАААТТ СТАЄАТТТСС - З" «-
После амплификации фрагменть! РСК бьіли обработаньі /Крп 1 ж Сіа 1/ и /Сіа 1 ї- Хва 1/ соответственно.
Указаннье два фрагмента бьіли лигированьї с плазмидой рС184434, обработанной Крп 1 и Хва 1. Полученная в со зв результате конструкция рС185515 представляет собой плазмиду рС184434 с злементом Сеїізег ТЗЕ и зкстра «Е сайтом Сіа 1, фланкированньм с помощью Крп 1 и Хва 1. Ген плазмидьі рСІВ55І5 показана на фиг. 38. Ген сту А/в/, содержащіийся р указанной плаамида, которьій кодисует тямпяратуроусто?-чивпіиї белок сгуТА/н/, показан на фиг. 37.
Способьії вьіделения и определения характеристик преимущественно - сердцевинного корового промотора « приведень в нижеописанньх примерах 9 - 20. з с Пример 9. Вьіделение РНК и нозерн-блоть. . Всю РНК вьіделяли из растений, вніросших в условиях теплицьі. Всю РНК вьіделяли способом, описанньм и?» Кгатег еї аї., Ріапі РНузіої., 90:1214-1220 /1990/ из следующих тканей кукурузьь линии Фанка 5М 984: 8, 11, 15, 25, 35, 40 и 6бО-дневньїх зеленьїх листьев; 8, 11, 25, 35, 39, 46, 60 и 70-дневной сердцевинь!; 60- и 7Т0-дневньїх опорньсх корней кукурузьї линии Фанка 577984; 60- и 70-дневньїх оболочки и колоса линии 5М 984. їх РНК также вьіделяли из 14-дневньїх корней 211Д и из развивающегося семени с недельньми интервалами в течение одной-пяти недель после опьіления. Поли А ї- РНК вьіделяли, используя олиго-аТ, как описано бо Запібгоок еї аіІ., МоіІесшаг Сіопіпуд: А І арогаїогу Мапиа! /2-ое изд./, 1989, и нозерн-блотирование проводили - также по ЗатбгооК еї ам, используя либо полную РНК /ЗОмкг/, либо поли А ж- РНК /2 - 10Омкг/. После 5о злектрофореза РНК блотировали на мембрань! МІИгоріиз 2000 /Місгоп Зерагайопе Іпс/. РНК связьвали с о фильтром, используя страталинкер /стратаген/ при 0,2мДж. Нозерн-блотьі бьіли зондировань! коровьм ї» фрагментом ЕсокКіІ, вьіделенньм из 8 - 2 КДНК ТКрА/,.с размером 1200рр, используя 0,895 агарозу с низкой температурой плавления в буферной системе ТВЕ. Нозерньі гибридизировали и промьвали, а фильтрь зкспонировали на пленку, как зто описано в примере 10 "Изоляция клонен кКДНК".
Пример 10. Изоляция клонов кКДНК.
Синтез первой цепи кДНК осуществляли, используя систему 1 обратной транскриптазн вируса
Ф) миелобластоза птиц /"АММ/ВКІ. при условиях, определенньїх поставщиком / Ме Тесппоіодіев, Іпс., Зайегерига, ка МО/. З данном случае 25мкл проб, содержащих 50Мм Ттгів-НСІ, рНв,3, 20мММ КСІ, 1мММ ДДТ, бмМ Масі», 1мМ каждого аМТР, 0,1 олигомера /тимидин,ат/ 12 - 18, 2мкг сердцевинной поли /Ат/ РНК, 100мкг/мл альбумина во бьічьей сьіворотки /ВЗА/, 5Омкг/мл актиномицина Д, 8 единиц ингибитора плацентарной РНКазьї, їмкл /ЛОмММ
Ки/мл/ 32Р астР » З00О0мКи/мл в качестве изотопного индикатора и 30 единиц обратной транскриптазьї АММ нкубировали при температуре 42"С в течение 30 минут. Дополнительно добавили КСІ до получения концентрации, равной 5ОММ и продолжили инкубирование еще в течение 30 минут при температуре 4220. Для получения конечной концентрации, равной 100мММ, вновь добавили КСІ. Для поддержания начальной 65 Концентрации других компонентов с прибавлением десяти дополнительньїх единиц добавили дополнительньй реакционньій буфер АММ обратной транскриптазьії и продолжили инкубирование при температуре 422С еще 30 минут. Синтез второй цепи вьіполнили, используя систему синтеза кКДНК Кіросіопе с линкерами Есо КІ /Ргомеда,
Мадіївоп, У//. Двухцепочечную кДНК сортировали по размерам на 195 геле агарозьі, используя Тгіз-борат-ЗДТК буфер, как зто описано Затьгоок еї а!., и вбіделяли образць! с размером, равньім приблизительно 1,2К. кДдДНК фракционировали по размеру, используя дизтиламинозтиловую /ДЕАЕ/ мембрану МА45, чтобьі оставить те молекульі, размер которьїх равен приблизительно 1000Бр или более. Фракционирование проводили при условиях, определенньїх поставщиком /ЗспіеІснег и 5спцеї/. Факционированнье по размеру кДНК лигировали с лямбда 7ар ІЇ вектором/Зігаїадепе, а доМПа, СА/ и заключали в лямбда-частицьі, используя СіІдіарпскК ІІ
РіІиз/зігаїадепе, Га доМа, СА/. Неамплифицированная библиотека имела титр 315 000 бляшкообразующих 7/0 единиц /ріш/, тогда как амплифицированная библиотека имела титр 3,5 миллиарда/мл, используя клетки РІ К-Р".
Рекомбинантньїй фаг вьісевали при плотности 500Оріи на чашках І -агара размером 150 х 15мм. Всего бьіло скринировано 50000 фагов, используя отпечатки из каждой чашки и пробьї первой цепи кКДНК, образованной либо из мРНК, вьіделенной из сердцевинь, либо из мРНК, вьіделенной из семян. Отпечатки вьіполняли так, как зто описано ЗатрбгооК еї аі)., используя нитроцеллулознье фильтрь. ДНК фиксировали на фильтре путем ультрафиолетовой сшивки с помощью страталинкера /Зігагадепе, а доМПа, СА/ при мощности 0,2мМДж.
Предгибридизацию и гибридизацию фильтра проводили в 10-кратном растворе Денхардта, 15Омкг/мл гидродинамически фрагментированного ДНК спермь! лосося, 196 додецилсульфат натрия /505/, 50ММ фосфата натрия, рН7,0, 5Мм, ЗДТК, б-кратньій раствор хлорида и цитрата натрия /55С/, 0,0595 пирофосфата натрия.
Предгибридизацию проводили при температуре 622С в течение 4 часов, а гибридизацию - при температуре 627С в течение 18 часов /на ночь/ при 1 миллионе срм/мл в обьеме 40мм. Фильтрь! промьівали в 500мл двукратного
ЗЗС, 0,596 505 при комнатной температуре в течение 15 минут, затем при температуре 632С в 0,1-кратном зС, 0,595 505 течение 30 минут для каждого промьівания. Пробьї ДНК, меченье радисактивньми изотопами, изготавливали, используя систему ник-трансляций и удаляли пробьї, не имеющие радисактивньїх меток, используя "ник"-колонки /Рпагтасіа/. Фильтрь! зкспонировали ночью на рентгеновскую пленку Кодак Х-Отас Ак су с помощью Стопех ГІдпіпіпуд Ріиз усиливающих зкранов при температуре -80"С. Гибридизируемье и не гибридизируемьсе пятна бьіли очищень!ї для дальнейшее характеристики. о
Пример 11. Изоляция геномньх клонов.
Геномную ДНК из инбредной линии 211Д Фанка кукурузь! вьіделяли так, как зто описано -ЗПиге еї аї., СеїЇ 35:225-233 /1988/. ДНК подвергали частичному перевариванию с помощью За ЗА, а затем рфракционировали по «ф зо размеру на 10...4095 сахарознье градиентьь с помощью центрифугирования в роторе Весктап 5МУУ40 при температуре 207"С в течение 20 часов при 22000об/мин. Фракции с размером в диапазоне от 9 до 2З3КБ о группировали и осаждали зтанолом. Лямбда Дазви, ІІ /стратаген/, разрезанньій с помощью Вам Ні использовали, че как зто предписьівается поставщиком. Библиотека бьіла скринирована неамплифициропанной, при зтом бьло скринировано всего ЗО000Оріи в условиях, описанньїх вьіше. Библиотеку зондировали с использованием со специфически-сердцевинного /ТтрА/ клона кКДНК 8 - 2, плазмиду рС185600 которого идентифицировали в «т дифференциальном сите библиотеки кДНК. Вьіделеннье клонь бьли очищень и бьіли приготовлень препаративнье количества фага, используя Іатраазогр/Рготеда/ как предписьшвалось поставщиком.
Изолированнье геномнье клоньі переваривали с помощью Есо Кі и Фрагмент ЕсоК!І с размером 4,8К5 « субклонировали в блюскрипт-вектор /стратаген/.
Пример 12. Последовательность ДНК и компьютерньй анализ. - с Спкпенирование нуклеотидов осуществляли, используя способ, описанньїй Запоег еї аіІ., РМА5, 74:5463-5467 ц /1977/. Секвенируущие праймерь! синтезировали на синтезаторе ДНК модели 3808 фирмь! Арріїей Віозузіетв, "» используя стандартнье условия. Реакции секвенирования осуществляли с использованием системь
БЗедцепазе/05 Віоспетіса! Согр/. Гелевьій анализ вьіполняли на 40см геля 695 полиакриамида с 7М мочевинь! в Тпів-борат- ЗДТК буфере /ВКІ. Се! -МІхб/. Анализ последовательностей и сравнение с последовательностями в г» генобанке проводили с использованием программь! анализа последовательностей, разработанной группой генетического компьютерного анализа Висконсинскога университета ЛЮШШМУСО/,
Ме Пример 13. Картирование сайта инициации транскрипции. - Удлинение праймера вьіполняли в соответствии с методикой, описанной Меїгаих еї аі., РМА5, 86:896-900 11988/. Другими словами, ЗОмкг общей РНК кукурузной сердцевинь! гибридизировали праймером в 50мМтТ"ів, о рН?7,5, 40мМ КСІ, ЗмМ МС» /буфер КТ/ путем нагревания до температурь! 802С в течение 10 минут и медленного
ЧТ» охлаждения до температурь 4220. РНК/праймерную смесь оставляли на всю ночь для осуществления гибридизации. Кроме буфера КТ добавляли ДТТ до бмМ, В5А до 0,1мг/мл, араназин в количестве 4ед/мл и амТР до 1мМ каждого. Затем добавляли 8 единиц обратной транскриптазьі! АММ и пробу вьідергивали в течение 1 часа при температуре 3720. Использованньій праймер представлял собой 5-ССОТТоОТто стосттоотТо
Ге! САСО-35 и начинался в месте, сдвинутом относительно начала транскрипции на 90. См. фиг.29А,
Секвентирующий лзддер, использующий тот же праймпр, что и в реакции удлинения праймера, образовали, ко используя геномньій клон с размером 4,8КЬ с целью определения сайта инициации транскрипции. Реакцию секвенирования вьіполняли, как зто описано в примере 12. бо Предохранение, от РНКазьї использовали для определения того, является ли последовательность с размером 371рр на интервале от ї2бр до «37ЗБр /начало кКДНК/ соприкасающейся или содержит один или более интронов. Фрагмент 5рпІ-Мсо! с размером 385Бр, расположенньй на интервале «2брБр...-387рр относительно инициации транскрипции, показанньій на фиг. 298, клонировали в рЕєЕН-52/7 /Рготеда/ и транскрибировали, используя систему Кіроргоре Сетіп! /Рготедаа/ из промотора 5РЬ для образования радисактивньїх зондов 65 антисмьсловой РНК по методике, определенной поставщиком. Защиту од РНКазьі обеспечивали так, как зто описано ЗатргоокК еї аі. рВК322 /разрезанньй с помощью Нраї!Ї и меченьій на конце с помощью 32Р-йСТР/ и фрагмент Кленова использовали как маркерь! молекулярного веса. Гели представляли собой 695 акриламид/7/М мочевинь /ВКІ. се!-Міх 6/ и потребляли бОВт постоянной мощности. Пример 14. Геномнье саузерн-блоть.
Геномную ДНК вьіделяли из кукурузной линии 211Д, используя методику, описанную Зпиєге еї аї., см. вьіше.
Для каждого переваривания рестриктазьь использовали мкг геномной ДНК. В буфере, предлагаемом поставщиком, использованьії следующие ферменть!: Вамі!ї, ЕсокМ, ЕсокМ Ніпа-111, 5асі. Клон номер 8 - 2 сердцевинной кДНК использовали Ідля оценки числа копий гена. Переваренную ДНК исследовали на 0,795 геле агарозьі, используя буфер Ттгів -борат- ЗДТК. Для облегчения переноса ДНК с вьісоким молекулярньім весом гель проднлрительно обрабатьшали 250ММ НОСІЇ в течение 15 минут. ДПК переносили на мембрану МИгоріиз 70 2000, а затем зондировали сердцевинной ДНК 8 - 2. Блот проминали способом, описанном в призере 10.
Пример 15. Материал и способь! РОК.
Пробьі РСК предварительно готовили, используя набор реактивов для амплификации ДНК СепеАтр и рекомбинантную Тад ДНК-полимеоазу Амрійад /РегкІп ЕІтег Сеййв/. Условия проведения реакции бьли следующие: от 0,1 до О0,5мкМ каждого из двух праймеров, используемьїх на одну пробу, 25нг сердцдевинного 7/5 Фрагмента Есокі с размером 4,8КБЬ в блюскрипт-векторе и реакционная смесь РОЗІ, оговоренная поставщиком, при общем обьеме, равном 5Омкл, в реакционной пробирке Сепеатр /Регкіп ЕІтег Сей5в/ обьемом 0,Тмл. Для денатурации при температуре 9492С в течение бос, гибридизации при температуре 559С в течение бос и расширения при температуре 722С в течение 45с с последующим удлинением на Зс в каждом цикле при общем числе циклов, равном 30, применяли датчик термоциклоя ДНК /Регкіп ЕІтег Сейв/ работающий по программе зтап-цикл. Использовали следующий набор праймеров: 1.83 х 84, от -429рр до -2рБр; 2.49 х 73, от -69рр до к
О1рр; 3.38 х 41, от ї136рр до ж 258рр; 4.40 х 75, от 239рр до ї 372рр. Указаннье праймерь! отмечень! на фиг.24.
Пример 16. Вьіделение преимущественно-сердцевинного гена.
Библиотеку кДНК, вьіделенную из сердцдевинной мРНК, клонировали в лямбда -7ар и скринкровали, Га б используя первую цепочку кКДНК, вьіделенной из мРІПК сердцевиньій или семени. Клоньі, которье бьли гибоидизпрованьї только с сердцевинньім зондом, біли очищень от пятен и вновь скринировань!. Клонь, о подвергнутье второму скринированию, использовали в качестве зондов в нозерн-блотах, содержащих РНК из различньїх тканей кукурузь!.
Пример 17. Структура гена и анализ его последовательности. «І
Вставку с размером 1,2КЬ кКДНК клона 8 - 2 секвенировали, используя дидеокси метод, описанньій Сангером и др. /см. вьіше/. Аналогично бьіл секвенирозан геномньій зквивалент, содержащийся во фрагменте Есокі с о размером 4,8КЬ блюскрипта, обозначенного как рС185601. Указанная информация свидетельствует о том, что -- геномная копия кодирующего участка перекрьваєт 1,/КБ и содержит пять нитронов. Транскрипт мРНК представляет собой шесть зкзонов. Зто показано на фиг.24. Размер зкзонов находится в диапазоне от 43рр до со
З13рр, а размер интронов изменяеєется от 7бБр до 130Бр. Полная последовательность гена и ее «І соответствующая образованная аминокислотная последовательность показань! на фиг.24.
Указанньій ген кодирует белок из 346 аминокислот с молекулярной массой, равной приблизительно З8кД.
Как видно из таблиць 1, предсказанньїй белок показьіваєт 6295 подобие и 4195 идентичность с субтединичньм « белком Рзецдотопаз аегидіпоза имеет вьісокую гомологию с белками ІгрА других организмов. - с ї» 4 г со -
Группирование подобия, І-І - М -М,Д-Е, БЕ - М, КА К, М - 0, 5 - Т. Подобие и идентичность бьіли о вьявлень, используя программу САР, разработанную Висконсинским университетом. ї» Стамлога еї аії,, Апп. Кем. Місгобріої!., 43:567-600 /1989/, на которьїх делается ссьілка в данном описаний, обнаружили участки сохраненньїх аминокислот в бактериальньх генах їІгрА. Такими аминокислотами являются аминокислоть! 49 - 58, аминокислоть! 181 -184 и аминокислотьі! 213 - 216, причем остаток гена показьваєт большую изменчивость, чем в последовательности ТгтрВ. Рассмотрение известньїх ігрА белков с белком ТгтрА кукурузь! /не показан/ показьтвает, что гомология между геном кукурузьі и другими белками ігрА значительна. (Ф, Кроме того, она сравнима с уровнем гомологии, наблюдаемой, пря сравнениий других белков ТгрА друг с другом, ка как зто описано у Стаулога еї аї., /см. вьіше/.
Для определения локализации сайта начала транскрипции, а также того, присутствовали или нет интронь! в бор Зтой области, бьіл проведен нозерн-анализ с использованием четьірех фрагментов, генерированньїх с помощью цепной полимеразной реакции /РСК/, с размером от поиблизительно 122Бр до 427рр из области в интервале от -429рр до «372рр. Результать! нозерн-анрлиза показали, что зондьі РОК ІЇ,. І, ІМ гибрпдизированьї до полной сердцевинной РНК, а зонд | не гибридизирован. Зто свидетельствует о том, что транскрипция начиналась на участке -69Бр...-90Бр. Для болеє точного определения места сайта инициации транскрипции использовали 65 праймер удлинения. Из фиг.29А видно, что если для поаймера удлинения использовали праймер /Мо73/, расположенньй в позиции 9ОБр относительно начала транскрипции, сайт инициации транскрипции располагался в позиции 41, 1726 геномной последовательности.
Первьій антитимоцитарньій глобулин /АТО/ из сайта инициации транскрипции располагался в позиции я114рр. Указанньій АТО предназначен, как ожидают, для того, чтобьі служить в качестве сайта инициации трансляции. Зтот АТО начинаєт открьтую считьвающую рамку, вьіявленную в клоне кКДНК, Первье 60 аминокислот зтой предсказанной открьтой считьвающей рамки имеют значительное осходство с хлоропластовьу транзитньм пептидом. См. Вепуп еї аі., РМАБ 86:4604-4608 /1989/ и Меиптапп-Кагіп еї аї).,,
ЕМВО))., 5:9-13 /1986/. Зтот результат позволяет предположить, что указанньій белок направлен к пластиде и, вероятно, процессируется до получения активного белка. Исследование переходной зкспрессии в системе 7/0 протопласта ткани кукурузьі, использующей ген В.ї., оптимизированньйй относительно кукурузь! и управляемьй промотором -їгрА, показало, что, когда АТО- в положении ї114Бр используеєется в качестве точки слияния, получают самье вьісокие уровни зкспрессии. Мспользование любого из следующих двух АТОС- в последовательности значительно снижаєет уровень зкспрессии гена. АТО в положении «ЗО00Бр давал некоторую активность, но на намного более низком уровне, чем 4114 АТС, а АТО- в положений ж 201р6р не давал никакой /5 активности.
Хотя ряд рамок, подобньїх рамкам Хогнесса, расположен слева от сайта инициации транскрипции на «бр,
ТАТААТ в положений -132рр является найболее похожим на растительньй консенсус ТАТААА. См. дов, Мис.
Асіайз Кез., 15:6643-6653 /1987/. Блок, подобньй блоку-ССААТ бьл обнаружен в положений -231рр.
Нуклеотидная последовательность, окружающая стартовьій АТО /ЗСОАСАТОСС/, гомологична другим точкам 2о Мнициации трансляции у кукурузьї, как зто описано у Меззвіпуо еї аї., Сепейс Епоіпеегіпу ої Ріапів: Ап
Адгісийига! Регересіїме, Ріепит Ргевзв сс. 21-227 /1983/, но отличаєтся от последовательности, которую считают согласованной последовательностью в растениях /Л"'АММАТОСОС/, См. 9до5пІ, ссьлка указана вьіше.
Возможньй сигнал добавления поли/А/ расположен у 3719рр /ААТААА/ на геномной последовательности, 52Бр от конца кДНК. Указанная последовательность согласуется с известньмми последовательностями для кукурузь, с об Как зто описано у Оевап еї аї., Мис. Асідв Кев., 14:2229-2240 /1986/ и расположена на 346рр ниже от конца трансляции белка. у Юеап еї аїЇ., Мис. Асійз Кев., 14:2229-2240 /1986/, 3- нетранслированная і) последовательность КкДНК заканчиваєтся у 3775рр на геномной последовательности.
Фиг.8 показьівает саузерн-блот геномной ДНК кукурузьї линии ДНК с приблизительньм количеством копий гена, реконструированньїх с использованием кДНК 8 - 2 сердцевинного гена. По-видимому, из переваров «г зо рестрикции и реконструкции получаются 1 - 2 копий гена, присутствующего я гаплоидном геноме. По-видимому, нет других генов с более низкими уровнями гомологии с указанньм геном. Позтому, он является о представителем семейства с одним или мальм числом генов в кукурузе. «-
Пример 18. Защита от ЗНКазь.
Структуру 5 - конца мРНХ определяли, используя защиту от РНКазьї. Защиту от РНКазьі осуществляли, со
Зв Мспользуя зонд, представляющий собой промежуток из З85бБр от 2бр до «387рр. Зтот участок из геномного «Е клона помещали в вектор транскрипциий РНК рСЕМ-521/47/ и формировали зонд РНК, меченьїй 32Р, используя полимеразу 5Рб. Зонд и добавочнье основания из множественного сайта клонирования продуцируют транскрипт из 461 нуклеотида (п). Зонд гибридизировали с общей РНК сердцевиньі, а затем переваривали смесью РНкКазь; А и ТІ и анализировали защищеннье фрагменть! на денатурирующих полиакриламиднмх гелях. « 70 Анализ гелей показьваєт защищенньй фрагмент из приблизительно З55пі и другой фрагмент из (- с приблизительно 16бОпі. См. фиг.298. . Тот факт, что расширение праймера, использующего праймер /М9о73/ в позиции «80бр, продуцирует продукт и?» с длиной 9ОМТ, свидетельствует о том, что 5' -конец расположен в позиции 4«1бр. Расширение праймеса из поаймеоса, находящегося на зтом участке, продуцирует продукт, так что можно бьло бьї ожидать, что зто также обнаруживается с помощью анализа защить! от РНКазьі. Указанньій праймер расположен в 5 области зонда їх предохранения от РНКазн. Клон кКДНК содержит последовательности, присутствующие на 3 -конце зонда предохранения от РНкКазь, и, следовательно, как ожидалось, они бьіли защищень! в зтой пробе. Поскольку на со геле имеется только одна полоса, которую можно било бь отнести за счет обеих зтих последовательностей, мь! - увереньі, что защищенньй фрагмент фактически является большей полосой и что меньшая одна полоса является артефактом. Если бь! в зтой области не бьло интрона, в зонде присутствовали бьї фрагменть! из о обоих концов и, следовательно, бьіли бьі определеньі на геле. Из двух видимьїх полос одна, по-видимому, ї» представляет собой всю 5 область, позтому мьї не верим, что в зтой области расположен интрон.
Пример 19. Комплементация мутанта ТгрА Е.соїЇ сердцевинной кДНК 8 - 2.
СОС штамм 5531 штамма Е. соїЇ, полученньй из Центра генетических штаммов Е.соїЇ Валийского дв университета /по классификации О.Н.-5т й Гар МоМ5004/ с хромосомньмми маркерами діпАЗ, ТгрА9825,1-, ІМ (ппО-гппЕ), І-ї, описанньй Мауег ей а), Мої Сеп. Сепівеї, 137:131-142 /1975/, трансформировали
Ф) сердцевинной /трА/ кКДНК 8 - 2 либо блюскрипт-плазмидой /стратаген/, как зто описано у Затргоок еї аї., см. ка вьіше. Трансформанть, содержащие ТгрА кДНК 8 - 2 обладали способностью расти без наличия триптофана на минимальной среде, тогда как трансформанть! блюскрипт-плазмидь! /стратаген/ или с нетрансформированной бо регуляцией не бьіли способньі расти без триптофана. Клетки, трансформированньюе кукурузньім ТгрА геном росли очень медленно и колоний становились видимьми после семи дней роста при комнатной температуре.
Все штаммь! вниращивали на минимальной среде МО с добавлением 200мкг/мл глутамина, О,01мкг/мл тиамина и с добавлением или без добавления 20мкг/мл триптофана. Все трансформанть! бьіли проверень! на наличие соответствующей плазмидь! путем анализа рестриктазь. 65 Колонии, вьіращеннье в отсутствий тркптофана, содержали клон 8 - 2, содержащий кДНК условного кукурузного ТгрА гена, как зто подтверждено саузерн-гибридизацисй /даннье не показань/. Указаннье результать! подтверждают вьівод о том, что зто кукурузньій белок субьединиць А триптофан синтезь.
Пример 20. Зкспрессия гена.
Мсследовали опаттерн зкспрессии преимущественно-сердцевинного гена во всем растений. Также Моследовали различньсе кукурузнье генотипь! на паттернь зкспрессиий зтого гена. В качестве источника РНК для зтих исследований использовали следующие ткани: верхнюю, срединную и нижнюю сердцевинь, опорнье корни, плюсну колоса, кочерьіжку кукурузного початка в генотипе 5М984; верхнюю, срединную, нижнюю сердцевиньі, 10-дневнье листья, 14-дневнье опорнье корни и сердцевину всего растения в генотипе 211Д и семена из генотипа 211Д, которье собирали еженедельно в течение одной-пяти недель после опьіления. 7/0. Нижнюю сердцевину вьіделяли из стебля в пределах двух междуузлий, расположенньйх над опорньіми корнями; срединную сердцевину вьіделяли из .последующих трех междуузлий; верхнюю сердцевину вьіделяли из последних двух междуузлий перед метелкой 60- и 70-дневньїх растений. У 39-дневньїх растений имелось только два междуузлия, а у 46-дневньїх растений - три междуузлия. Нозерн-блот анализ показал, что транскрипть, гибридизированнье фондом, вьіделенньм из сердцевинной кДНК, бьстро аккумулируются в молодой /5 Сердцевине и в молодьх листьях. По мере увеличения возраста растения и роста стебля наблюдается значительное уменьшение количества вьіявленного транскрипта. См. фиг.25А-Д. В РНК, вьіделенной из семени, общей РНК, либо поли Ак РНК, ни разу не получали информацию от зтого гена. См. фиг.26. Транскрипт также бил вьіявлен в корне, плюсне колоса и обвертке, но не на таких вьісоких уровнях, которье бьіли вьіявлень в тканях сердцевиньі и молодьїх листьев. См. фиг.258, 25С. Определенная информация бьіла вьіявлена к 2о опорньх корнях, но только на очень низком уровне. См. фиг.25Д. С помощью нозерн-блот анализа бьіли исследованьі шесть недифференцированньх линий каллюса кукурузь, при зтом ни в одном образце каллюса не бьіла обнаружена зкспрессия зтого гена /даннье не показань/. Уровень зкспрессии указанного гена является зкстремально вьісоким, поскольку очень сильньій сигнал из ТгрА гена 8 - 2 в зонд мог бить обнаружен я сердцевине и листе менее, чем через два часа после зкспозиции блота на пленку /фиг.25А/. Количество сч ов полученного РНК сравнимо с количеством РНК, вьіделенньм из гена фосфознолпируват карбоксилазь кукурузьії, описанного Ниазреїй, еї аї., Ріапі Мої. Віоіоду, 12:579-589 /1989/, которьій является другим о вьісокозкспрессивньім геном кукурузь. Вьшеуказанная работа приводится в данном описаний в качестве
СсЬІЛКИ.
Характер зкспрессии данного гена не является постоянньім во времени. Зкспрессия очень вьісока в нижней «Е зо М срединной сердцевинах растения в возрасте, меньше 60 дней, и бьістро уменьшаеєтся у вершинь! растения. По мере того, как растение достигает зрелости, например после 70 дней роста, зкспрессия падаєт до о необнаруживаємьх уровней, за исключениєм нижней сердцевиньй и плюснь колоса. Аккумулирование -«жр транскрипта в молодом листе почти также вьісоко, как и в нижней сердцевине, но зкспрессия бьстро уменьшается и не обнаруживается в листьях через 40 дней после их появления. Бьіло обнаружено, что со з5 Зкспрессия в листе различна в зависимости от времени года, когда он растет. «г
Нижеприведеннье примерь 21 - 39 касаєтся анализа вьіделения, характеризации и зкспрессий специфически-пьільцевого промотора согласно настоящему изобретению.
Пример 21. Вьіращивание кукурузь!.
Кукурузу /инбредная линия Фанка 211Д7еа тауз/ виіращивали из семени в смеси вермикулита и песка в « теплице в режиме 16-часового светлого и 8-часового темного времени. з с Пример 22. Вьіделение общепьільцевого белка.
Спелую пьільцу вьіделяли из кукурузьі в период максимального пьільцеобразования. С целью удаления ;» инородньїх примесей ее просеийвали, затем замораживали в жидком азоте, З - 4мл замороженной пьІльць измельчали в ступке и расталкивали с равньм обьемом 75 - 15Омкг стеклянньх шариков. 4Омл диспергирующего буфера /2мМ ЗДТК, 5мМ ДТТ, 0,190 505, 100мМ Нерез рнНвВ/ добавляли к указанной смеси, ї5» которую вновь измельчали. Стекляннье шарики и неповрежденнье пьільцевье зерна осаждали путем низкоскоростного центрифугирования, после чего смесь очищали центрифугированием при ускорении 10000л, в бо течение 15 минут. Белок осаждали из надоса-дочной жидкости путем добавления ацетона до 9095. - Пример 23. Вьіделение белка пьільцевой зкзинь.
Белок зкзинь! вьіделяли из спелой пьІільцьї кукурузь! линий 211Д, как зто описано у Майизек и Тиру, ., Ріапі о РАузіоїоду 119:169-178-/1985/. ї» Пример 24. Вьіделение белка листа.
Молодье листья /вьніросшие приблизительно на бО9Ув/ отрьівали от кукурузьі и удаляли средние жилки.
Полньі? белок вьіделяли также, как и у пьільцьі, за исключением того, что материал не замораживали, а измельчение осуществляли в размельчителе Уоринга без стеклянньїх шариков.
Пример 25. Вьіделение белка зерна. (Ф, Колосья с полностью разлитьми, но еще влажньіми зернами отрьівали от растения и с помощью скальпеля ка удаляли из них зерна. Полньїй белок вьіделяли также как и у листьев.
Пример 26. Гель-злектрофорез белков кукурузь!. во Белки пьІільць, листьев и зерен сепарировали на 505 полиакриламидньх гелях, как зто описано у зЗатбргоок еї аї,, МоїІесшаг Сіопіпд, А Іарогаїогу Мапиа!ї, Соїа Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв; Нью-Йорк /1989/. После окрашивания с помощью кумасси голубого красителя проводили сравнение белковьх полосок из пьІлЬцЬь, листьев и зерен и определяли широко распространеннье белки с размерами 1ОкД, 13кД, 20кД, 45кД, 55кД и 57КД, наийболее характерньїми для пьІльцьї. 65 Идентификация клонов специфически пьільцевой кДНК.
Пример 27. Определение частичной последовательности специфически-пьільцевьїх белков.
Белковье полоски, определеннье как специфически-пьІльцевье очищали злектроблситированием из геля полиакриламида на РМОЕЄ мембрану /Маїзиадаїга, Р., У, Віої. Спет. 261:10035-10038 /1987// или ЖХВР с обращенной фазой М-терминальную последовательность очищенньх белков определяли с помощью автоматизированной деградаций по Здману на газо-фазном секвенаторе 470А фирмь Аррдіеа Віозузіетв.
Фенилтиогидантоиновье /РТН/ аминокислотьї идентифицировали, используя анализатор РТН 120А Аррдієйд
Віозувіетв. Для получения внутренней последовательности белки перепаривали зндопротеиназой І!уз-С /Военпгіпдег МаппПпеіт/ в 0,1М ТтіІз-НСЇ, рН8З,5 в течение 24 часов пой комнатной температуре, используя фермент/субстрат в соотношении 1 : 10. Полученнье я результате белки вьіделяли с помощью ЖХВР, 7/0 Мспользуя колонку Лацароге С-8, злюированную линейньм ацетонитрил/изопропаноловьї/м /в соотношениий 1 : 1/ градиентом /от 0 до 6бО9в/ в 0,190 ТЕАж Последовательность вьіделенньх І ув-С пептидов определяли, как зто бьло описано вьше. Для специфически пьільцевого белка 13кД бьли определеньй следующие последовательности: 75 М-концевая: ТТРІ ТЕОМСКОЗКРОНИІ ТРМУМАТІ
Гуво 61: КРОНІТРМУАТІВОУМІК
Гуво 54: ЗОСТВІАООМІРАОЕК
Гувс 49: ЕНССООБВЕТІК
Гувс 43: ЕСРТОТМУТІГОТК
Пример 28. Синтез олигонуклеотидньїх зондов для специфически пьільцевьх кКДНК.
Бьіли отселектированьі области пептидной последовательности в белке 13кД с низкой избьточностью кодона и с помощью синтезатора Аррдіеєй Віозузіетв З80А синтезированьії подходящие олигонуклеотиднье зондь! для генов, кодирующих указаннье области. Бьіли синтезированьї следующие олигонуклеотидь!: сч 29 Олиго Мо 51 5- АА АТС АТС АСС АСС АТО ТТ -3 Ге) вв вс т с
Олиго Мо 58 5- СС ТТТ АСС САС ОТТО АДА0С-3 З сс со (ав) т с «- с где колонки нуклеотидов представляют основания, которне случайна образом вводили в равньїх пропорциях на указанную позицию в олиго. Олиго Мо 51 кодирует аминокислотную последовательность ЕНОСОБОБК, З вьявленную в пептиде ГузС 49, а олиго Мо 58 кодирует аминокислотную последовательность ЕОМОКО, вьявленную на М-конце пептида. Использование указанньїх смешанньїх олигонуклеотидов для скринирования библиотеки кКДНК специфически-пьільцевого гена описано ниже. «
Пример 29. Конструирование библиотеки кукурузной пьіІльцевой кДНХ. З 70 Полную кукурузную РНК вьіделяли из спелой пьІльць!ї кукурузь! линии 211Д так, как зто описано у СіЇзеп еї с аІ.,, Вісспетівігу 13:2633-2637 /1974/. Мз полной РНК очисткой вьіделяли поли АмМРНК, как зто описано у з» Затьгоок еї а. Используя указанную мРНК, приготавливали кДНК с помощью набора для синтеза кДНК, которьй закупали у фирмь! Рготеда, в соответствии с инструкциями, прилагаемьми к набору. К кКДНК добавляли линкерьі ЕсоКіІ, после чего осуществляли ее лигирование в ветви лямбда 7ар клонирующего вектора, закупленного у фирмь! Зігаїадеп, используя инструкции, предоставляемье поставщиком. Продукт лигирования е упаковьвали в лямбда пакующий зкстракт, также закупленньй у фирмь! бігаїадеп, и использовали для (ее) заражения клеток Е. соої В34. з Пример 30. Вьіделение клонов специфически-пьільцевьїх кДНК.
Библиотеку кКДНК пьільцьі кукурузьь зондировали, используя синтетические полинуклеоткднье зондь, ав | 20 характернье для гена белка 13кД, как зто описано Затрбгоок еї аі. Другими словами, приблизительно 100000 стерильньїх пятен библиотеки пьільцевой кКДНК вьісевали и помещали на нитроцеллюлознье фильтрьі. Фильтрь!
Т» зондировали с помощью олигонуклеотидов Мо 51 и Мо 58, которне метили на конце З2Р, используя полинуклеотидную киназу. Зондь! гибридизировали на фильтрах при низкой жесткости /502С в ІМ Масі, 1095 декстран сульфата, 0,596 ЗЮО5/, промьшали 30 минут при комнатной температуре, а затем 30 мпнут при 59 температуре 459С в бх ЗЗС, 0,190 ЗОЗ и зкспонировали на рентгеновскую пленку для идентификации
ГФ) позитивньїх клонов. Условнье клоньї очищали посредством 4-кратной гибридизации пятен. Вьіделяли три типа
ГФ клонов КДНК. Тип І содержал фрагменть! ЕсоКіІ с размерами 0,2КЬ и 1,8КЬ. Тип ІЇ содержал фрагменть! Есокі с размерами 0,6КЬ, 0,5КЬ и 1,0ОКБЬ, а тип І содержал фрагмент ЕсокіІ с размером 2,3КБ.
Пример 31. Характеризация клонов специфически-пьільцевьїх кКДНК. бо Фрагменть! ЕсокКіІІ клона кДНК типа ІІ субклонировали в плазмидньій рблюскрипт-вектор ЗК, закупленньй у фирмь!ї Зігаїедеп См. фиг.30. Фрагмент с размером 0,6КЬ рблюскрипта получил название 1І-.6б, фрагмент с размером 0,5Ко получил название 1І-.5 /лозже перейменованньй в рС183169/ и фрагмент в рблюскрипте с размером 1,0К5 получил название 1І-4,0 /позже переийменованньй рС183168/. Как будет описано ниже, в фрагментьі с размером О0,5КБ и 1,0К6Б кодируют кукурузньій специфически-пьільцевой ген СДРК. РНК из пвІЛЬНИКа, ПпЬІЛЬЦЬІ, листьев, корня и шелка денатурировали с глиоксалем, подвергали злектрофорезу на 190 геле агарозьї, трансформировали в нитроцеллюлозу и зондировали по отдельности с тремя/фрагментами
ЕсокіІ, которніе бьіли меченьі 32Р. с помощью случайного расширения прайморов, как зто описано Затбгоок еї аі, МоїІесшіаг Сіопіпд, А Іарогаїогу Мапиа), Соїй Зргіпд Нагвог І арогаїогу Ргезв:Мемж МЖогк /1989/,. Блоть Зкспонировали на рентгеновскую пленку и мРНК-полоску с размером, приблизительно равньм 1,5КБ, идентифицировали с помощью фрагментного зонда с размером 0,6Кб, в то время, как фрагменть! с размерами 0,5 и 1,.0К6 гибридизировали с мРНК с размером, приблизительно равньм 2,0КБ. Во всех случаях гибридизацию наблюдали только на линии пьільцевой РНК, за исключением того, что фрагмент с размером 0,6КЬ показал слабьй сигнал в другой мРНК. Из зтих данньїх можно сделать вьівод о том, что начальньйй клон кКДНК 7/0 представлял собой слияние молекул кДНК, вьіделенньїх из двух различньїх МРНК. Фрагмент с размером 0,6КЬ являлся частью кКДИК специфически-пьільцевой мРНК с размером 1,5КЬ5 при зтом указанная мРНК кодирует пептидьі ЇузС 49 и М-конец. Фрагментьь с оразмером 1,0 и 0,5К0Б осодержат частичную кДНК специфически-пьільцевой мРНК с размером 2,0Кб, не относящейся к пептидам и олигомерньім зондам, используемьім для зондов. Зтот вьівод бьіл подтвержден секвенированием фрагментов, используя способ /5 терминации дидеокси цепи, описанньй у Затрьгоок еї ам. Последовательность кКДНК показана на фиг.31.
Пример 32. Определение специфичности зкспрессии мРНК.
Для определения того, присутствовала ли РНК с размером 2,0КЬ, представленная клонами кКДНК рС183169 и рСІВЗ3168, только в пьільце, вьіделяли полную РНК из корней, листьев, пьІЛЬЦЬІ, пбІЛЬНИКОВ и Шшелка кукурузь! линии 211Д. РНК денатурировали с сглиоксолью, подвергали злектрофорезу на 195 геле агарозь, 2о трансформировали в нитроцеллюлозу и зондировали вставкой ЕсоКіІІ, меченой 32Р из плазмидьі рСІВ3168 или рС183169, используя стандартнье методики, описаннье у бЗатргоок еї а), МоїІесшаг Сіопіпоу, А І арогафгу
Мапиа!Ї, Соїй Зргіпу Нагвог І арогаїогу Ргезв:Мем/ Могк /1989/. Зкспонирование зтого блота на фотопленку показало, что ген, представленньій зтими двумя клонами, является транскрипционно активнь!м только в пьільце /фиг.32/. сч
Идентификация специфически-пьільцевого промотора.
Пример 33. Конструирование библиотеки геномной ДНК кукурузь!. і)
Геномная ДНК из молодьх побегов кукурузь! линии 211Д бьіла вьіделена способом, описанньм Зпиге еї аї.
СеїІ! 35:225-233 /1983/. ДНК поставлялась фирмой Зігаїадепе, где библиотеку геномной ДНК конструировали путем клонирования частично переваренной с помощью ЗаиЗА! ДНК в клонирующий вектор І атраа Равзи, «г зо фирмь! зЗігаіедепе.
Пример 34. Гибридизация блота геномной ДНК для определения количества копий гена. о
Геномную ДНК из кукурузьь линий 211Д переваривали рядом рестриктаз, каждьій перевар подвергали «- злектрофорезу на геле арагозьії, трансформировали в нитроцеллулозу и зондировали вставкой ЕсокКі, меченой
З2Р из плазмидьі рС183168 /фрагмент с размером 1,0КБ/, плазмидьі рС183169 /фрагмент с размером 0,5КБ/ или со
Зв Кклона І-.6, используя стандартнье методики, описаннье Затьгоок еї аІ. С помощью зонда 1І-.6 в большинстве «Е переваров бьло обнаружено более 10 полосок, указьівающих на то, что зта ДНК вьіделена из большого многогенного семейства. Зондирование с помощью фрагмента размером 1,0Ко вьіявило от З до 6 полосок, а зондирование с фрагментом размером 0,5КЬ вніявило только от 1 до З полосок, которне представляли собой субпопуляцию полосок, обнаруженную фрагментом размером 1,0К5. Благодаря меньшему размеру семейства «
Генов, обнаруженного фрагментами размером 1,0 и 0,5КБЬ, бьіло решено попьітаться вбіделить соответствующий пт») с геномньй клон.
Пример 35. Вьіделение специфически-пьільцевого геномного клона. ;» Геномную библиотеку кукурузьь линии 211Д от фирмьіЗігаїедепе скринировали путем зондирования отпечатков с вставками, мечеувімь З32Р, из плазмид рСІВ3168 /фрагмент размеоом 1,0КБ/ и рС183169 /фрагмент 5 размером 0,5КБ/, используя стандартнье методики, описаннье в инструкции фирмь! зіга(едепе, прилагаемьсе к ї5» библиоке. Используя указанную методику, вбіделяли лямбда-клон МО14 и гибридизировали его с обойми зондами. Фрагмент Вамні с размером 9,0КЬ клона МО14, которьій также гибридизировали с обоими зондами, со субклонировали в сайт Вамні рблюскрипта 5К- для создания плазмидьі рС18379. 18006р плазмидьі оС18379 - на участке, соответствующем последовательности кДНК, бьіло секвенировано, как описано вьіше. Сравнение последовательностей кКДНК и геномной показало идентичность, равную только 9195. Вставка рС18379 о представляет собой родственньій специфически-пьільцевой ген. ї» Вторую геномную библиотеку кукурузь! линии 211Д конструировали в лямбда-векторе (ЗЕМ-11, закупленном у фирмь Рготеда, используя методики, указаннье в инструкции фирмь. Скринирование зтой неамплифицированной библиотеки, как бьіло указано вьіше, дало клон СЗЕМІ!І-І, которьій гибридизировали с обоими зондами с размерами 0,5 и 1,0К5. Фрагмент Ніпацй с размером 20КБ клона ЗЕМІЇІ-І, которьій также гибридизировали с обоими зондами, субклонировали в сайт НіпаїїЇ рблюскрипта ЗК для получения плазмидь!
Ф) рСІВ3166. Определяли последовательность ДНК с размером 4,1К5 плазмидь! рСІВ316б /фиг.36/ и после ка вьявления шести интронов в геномном клоне бьіло установлено, что она имеет 10095 идентичность с последовательностью КДНК рСІВЗ3168 и рС183169. Сравнение последовательности плазмидьі рСІВ3166 с базой бо данньх Генбанка/ЕМВІ показало, что 5 участок через 3-ий зкзон бьл на 34,695 идентичен киназе ІЇ калмодулин-занисимого белка крьісьї на аминокислотном уровне /фиг.33/, тогда как четвертьїй - седьмой зкзонь бьіли идентичньї кальмодулину крьсь на 39,495, см. фиг.34. Ни одна другая киназа не бьіла описана при зтом не бьіл известен белок, обьеединяющий доменьі кальмодулина и киназьі. Впоследствий, Нагрег еї аї., Зсіепсе 252:951-954 /1991/ описали последовательность КДНК аналогичного белка из сои, хотя зтот ген не является 65 специфически-пьільцевь!м при зкспрессии. Сравнение киназьі! кальций-зависимого белка сои /СДРК/ и СДРК пвІЛЬЦЬ кукурузь!ї показьіваєет 3895 идентичность на аминокислотном уровне. См. фиг.35.
Пример 36. Идентификация транскрипционного инициирующего сайта промотора с помощью расширения праймера.
В качестве праймера бьіл синтезирован олигонуклеотид РЕ5БІ со следующей последовательностью: 5 --ООСССАТООСТОСООССООСААСОАСТОоСОооС -3
Анализ расширения праймера проводили на поли Аж пьіІльцевой мРНК, как зто описано у Меїгаих еї аї.,
РМАБ БА 86:896-890 /1989/. Сайт инициации транскрипции находился, как зто бьіло определено, между основаниями 1415 и 1425 на частичной последовательности плазмидь! рсСІВ3166, показанной на фиг.36.
Исследование функции промотора в трансгенньїх растениях. 70 Пример 37. Конструирование векторов промотора для трасформации растений.
Для демонстрации того, что промотор пьіІльцевой СДРК может вьізьшшать зкспрессию связанного гена в трансгеннье растения, слияние гена промотора пьільцевой СДТК с бета-глюкуронидазнькм геном Е.сої обеспечивали следующим образом. Фрагмент Вамні с размером 10КЬ из лямбда СЕМІ-І, содержащий первни зкзон и часть первого интрона гона пьільцевой СДРК, а таюже фрагмент размером 9КЬ вьше гена, субклонировали в сайт Вамні рблюскрипта ЗК для образования плазмидьі рСІВ3167. Фрагмент ВамнНіІ-НіпанІ с размером 2,3КБ из плазмидьії рСІВ3167 субклонировали в сайтьь ВамнНі и Ніпанй рблюскрипта ЗК для образования плазмидь! раеК105. Плазмиду реК105 переваривали с помощью Амаї и Ніпай и на геле агарозь вьіделяли фрагмент НіпайІ-Ама! с размером 1,75К0. Реакцию РСК проводили в стандартньїх условиях, как зто описано у Затрбгоок еї аі, используя неповрежденную плазмиду рОК1О05 в качестве матрицьі, и следующие 2о праймерньі!:
Мо 42: 5 - АОСОСТСОАССТОСАСОСАТОСОАТСТОСАССТОССОССО-3
Мо 43: 5 -АТОСОСААДОСАССТоОосО-3!
Продуктьі реакций РСК переваривали с помощью Ама! и ЗІЇ и полученньій фрагмент вьіделяли на геле агарозьі. Рблюскрипт ЗК- переваривали с помощью Ніпай и Ама). Для образования плазмидь рокК110 сч ов осуществляли трехходовоє лигирование фрагмента Ніпапі-Ама! с размером 1,75КБ «фрагмента Амаї-заї|, вьіделенного при реакции РСК, и рблюскрипт-вектора с концами Ніпай! п заї!. і)
Слияние фрагмента промотора в рОК110 с геном бета-глюкоронидазьї /3М5/ осуществляли путем переваривания плазмидь! раК110 с помощью Ніпайі и заї|І, вниіделяя фрагмент с размером 1,9КЬ на геле агарозь и лигируя его в сайть! Ніпа и заїІЇ плазмидьі рС183054 для образования плазмидь рК12, при зтом плазмида, «г зо Вьіделенная из рОС19 содержала ген 505, за которьім следовал растительньй интрон из гена РЕРС кукурузь и полиА сигнал из вируса мозаийки циртнон капустьі. Указанное промоторное слияние в растениях бьло о пассивньм, возможно, из-за присутствия внерамочньх АТО кодонов в лидерной последовательности, «- предшествующей БИ гену АТО.
Функциональное слияние промотора осуществляли путем переваривания плавмидь! рКі2 с Хваї и заї| с со
Зз5 целью удаления соединения предьідущего слияния. Новое место слияния продуцировали с помощью реакции «Е
РСК, используя в качестве матрицьї плазмидьі раКтТО5 и следующие праймерь!:
Мо К5О: 5 -СССТТСААААТСТАСААДАССТ-3!
Мо К49: 5 --(' ААТОТСОАСОСААСОССОАСАСАТОСА-3!
Продукт РСК переваривали с помощью Хваі и За и очищали на геле агарозьї Очищенньй Фрагмент « Ллигировали в сайть! Хваї и ЗаіїЇ плазмидьі! рК/2 для образования плазмидь! рСІВ3171. Указанная плазмида з с содержит функциональное слияние промотора СДРК и 505, которое направляеєет зкспрессию гена 505 исключительно в пьІЛЬЦУ. ;» Для образования вектора, содержащего слияние промотора пьільцевой СДРК-БИЗ, подходящее для использования в растениях, трансформированньїх с помощью Адгобрасіегіцт (штегасіепв, ген слияния вьіделяли з плазмидьї рС183171 с помощью переваривания Ніпаї и заїї. Полученньій фрагмент лигировали с сайтами їх Ніпаї и ЗаїЇ плазмидь! рВ1101 /закупленной у фирмь! Сіопіесп/ для образования плазмидь! рС183175.
Пример 38. Продуцирование трансгенньїх растений. со Плазмиду рС183175 трансформировали в Аадгобрасіегійт іштеїасіеп5, содержащий плазмиду помощник - рС18542 и полученную культуру использовали для трансформации дисков листьев из культур, вьіделенньх из 5о верхушки побега табака, как зто описано у /Ногзсп еї а!., Зсіепсе 227:1229-1231 /1985/, за исключением того, о что покровнье культурь! не включались, а селекцию проводили на 100мг/л канамийина. Трансгеннье растения ї» бьіли регенерировань и проверень! на присутствие трансгена с помощью реакции РОК.
Пример 39. Анализ зкспрессии гена.
Пьільцу из первичньїх трансформантов и их потомства гистохи-мически анализировали на зкспрессию гена
СИ, как зто описано у Спцеїтего еї а)., МоЇ. Сеп. (зепеї. 224:161-168 /1990/. В нижеприведенной таблице показан процент пьільцевьїх зерен, зкспрессирующих ген 55, определенньій с помощью голубого окрашивания
Ф) в буфере Х-адіис: іме)
Номер растения 55 пьільцьї, окрашенной в голубой цвет г РРІ-Б1 287
РРІ-5А за
РРІ1-5Б5 нет
РР1-61 очень мальй
РР1-63 5196 в5 РРІ-67 1556
РРІ-8ВО 1056
РР1-83 1296
Первичнье трансформантьі), в которье бьл введен единичньій промотор пьільцевой СДРК - ген (5, продуцируют максимум 5095 позитивной пьІЛЬЦЬ 505 вследствие сегрегации единичного гена.
С целью демонстрации зкспрессии промотора пьільцевой СДРК бьіли проведень! флуометрические анализь!
СИ пьільцьІ, стебля, корня, листьев и пестика отобранньїх растений. Анализь! вьіполнялись по методике, описанной у УдеПегвоп, Ріапі Мої. ВіоІ. 14:995-1006 /1990/Л и величиньі активности зИ5 вьрражали в нмолей
МИ/мкг белка/мин.
Номер растения Ткань Активность 605 Активность нетоансформированного растения Активность чистого СОЗ
РРІ1-61 стебель 0,01 0,02 о) лист |в) |в) |в) корень 0,15 010 0,05 пестик 0,02 0,01 0,01 пьільца 0,24 0,02 0,22
РР1-54 стебель 0,01 0,02 о) лист |в) |в) |в) корень 0,13 0,1 0,03 пестик 0,01 0,01 о) пьільца 0,6о0 0,02 0,58
РР1-63 стебель 0,01 0,02 о) лист |в) |в) |в) корень 0,07 0,1 о) с пестик 0,01 0,01 о) з пьільца 0,57 0,02 0,55 о)
Примерь 40 - 50 рассматривают приготовлениг прейимущественно химерньїх конструкций, т.е. молекул рекомбинантной ДНК, содержащих постояннье, преймущественно-тканевье или специфически-тканевье « зр Промоторь, оперативно связанньюе с геном ВА, вставку указанньїхх промоторов в векторьії, продуцирование трансгенньїх растений, содержащих векторьї, и анализ уровней зкспрессиий белков В.І. трансгенньїх растений. (ав)
Пример 40. Конструирование трансформирующих векторов ВТ, оптимизированньх относительно кукурузь!. «-
Для доказательства зффективности синтетического гена Ві сгуїА/в/ в кукурузе РерС и специфические сердцевиннье промоторь! слиняли с синтетическим геном сгуїА/в/ Ві, используя реакцию РСК. Олигомерами, с зв предназначенньми для слияний при РСК, являлись: - /РЕРС/
КЕ99А28 - 5 -- ВСОСТТАСС СССОАТСАСАТО-3;
КЕ97А28 - 5 -ВСОСТАССОС СТССАСОСОО АТСССОССООС СОбААОСТААдО-3;
ІСЕРДЦЕВИНА/ « 20 КЕТООА28 - 5- СТСОТСОАСС ССААСА-3 -о
КЕ98А28 - У-ССОСТАССОС СТТААСОСОО АТССТОТССО АСАССОСАС-3' с КЕ104А28 - У-СОСАТОТСОТСО АССОСААСАС-3" :з» КЕТОЗА28 - 5У-ССОСТАССОС ОБАТССТОТС СОАСАССОСА СОССТ-3
Праймерьї РСЕ конструировали для замещения сайтов Мсо 1 в 5 область нетранслированного лидера Каждого из вьішеуказанньх специфически-тканевьїх генов /содержащих сайтьї инициирования трансляции АТО-/ їз сайтами ВамнНі для облегчения клонирования синтетического гена сгуїА/в/ в указанньй сайт Вамні.
Последующая конструкция векторов, содержащих специфически-тканевье промоторь!, слитье с синтетическим (о) геном сгуїА/в/, и также содержащих маркерньй ген З355:РАТ:З355, включают несколько промежуточньх - конструкций. 1. рС184406 /355:синтетический-сгуІА/в/ грерС встроенная последовательность Мо 9:355/ («в») рС184406 содержит ВамнНі/Сіа | синтетический ген сгуіїА/в/ с размером 2КЬ, слитьій с промотором Сам
Т» 355/Коїпвіеїп, еї ам. Сепе 53:153-161 /1987//. Ген также содержит интрон Моб, вьіделенньй, из кукурузного гена
РЕР карбоксилазь /встроенная последовательность Мо9 -ІмеМо9/ в 3' нетранслированной области гена, которьй использует САММ 3-конец. /'РМА5 ОА 83:2884-2888 /1986/, Ниазрейй еї а/ї., Ріапі МоіІесшіаг Віоіоду, 12:579-589 /1989//. рСІВ4406 лигировали и трансформировали в штамм "ЗОКЕ" клеток Е.сої! /Зігаїедепе, їа доМа, СА/, как (Ф) описано вьіше. Бьіла обнаружена одна мутация в гене сіуїА/в/ плазмидьі! рСІВ4406 в аминокислоте Мо436, что г приводило к требуемому изменению Ре на Геиш. Плазмида рСІВ4406 является полностью активной против
Европейского зернового точильщика, что бьло обнаружено при исследованиях биопроб насекомьх, и во Ппродуцирует белок СтуІА/в/ ожидаемого размера, как зто определено вестерн-блот анализом. 2. рРСІВ4407 /355:синтетический- сгуіїА/в/:рерсС Ім Мо9;355 «355:РАТ:З355/ рС184407 изготавливали из НіпайШ/Есо КК! фрагмента с размером, приблизительно равньм 4КБ, содержащего ген 3З55:РАТ:З355, и гена НіпапйиЕсо КІ 355:синтетический-сгуіА/в/:355 с размером З3,1КБ5 из плазмидьі рС184406. рС184407 лигировали и трансформировали в штаммь! "ЗОКЕ", ДНбЗальфа и НВ101 Е.сої, ве используя стандартнье методики /Затьгоок еї аіІ./. Синтетический ген сгуїА/в/ имел те же свойства, что и его предшественник рС134406. -До-
3. рС184416 /355:хсинтетический-сгуІА/в/ грерС ІмеМо9:355 - 355:РАТ:355 ї- 355:Аап интрон:И5:355./ рС184407 резали Есо КІ и обрабатьвшали щелочной фосфатазой из кишечника теленка /СІР/ при стандартньїх условиях /ЗатргооК еї аі/ для продуцирования фрагмента размером приблизительно 7,2КБ), которьій лигировали с фрагментом Есо КІ 355:х:Ааплзизв:355 с размером 3,4Ко для продуцирования рС184416.
Лигирование и трансформации в клетки "ЗВОКЕ" осущезтвлялись, как описано вьіше. Синтетический ген сгуІА/в/ в рС184416 имел те же свойства, что и ген в рС184406. 4. рСІВ4418 /355:спнтетический-сгуІА/в/:рерсС Імз Мо9:355/ рСІВ4406 перепаривали с помощью Ара І и Вамні и обрабатьівали СІР. РСІВ4406 переваривали с помощью 7/0 Вамні и Мер І. РВ5123 Ме13 переваривали с помощью Мер І и Ара І. Для образования рС184418 осуществляли трехходовое лигирование, содержащее фрагмент Ара І/ ВамнНі с размером 4,3КБ из рС184406, фрагмент
Вамні/Ммер І с размером 1,3КБ из рС184406 и фрагмент Мер МАра | с размером 170К5 из рВ5123 Мо13.
Штаммом-хозяйином Е. соїЇ для рС184418 является НВ101. 5. рС184419 /355:синтетический-сгуІА/в/:рерС ІмеМо9:355 ї- 355:РАТ:355 ї- 355:Аапинтрон:И5:355./ рС184416 и рС184418 переваривали с помощью Вві Е ІІ и ЕсоМі и Фрагментьї рС184406 обрабатьівали СІР.
Фрагмент с размером 9,1КБ лигировали для образования рС184419 с фрагментом с размером 1,4К6 из рС184418. рС184419, трансформированная в соответствующие НВІ101 клетки Е.соїЇ, показала полную активность в биопробах насекомьїх против Европейского зернового точильщика. 6. рС184420 /сердцевина:синтетический-сгуіА/в/ "РЕРС Імз Мо9:355 - 355:РАТ:355/
Промежуточньми конструкциями при получениий рС184420 являлись рВтТІп1, рВІп2, рі4420А и рВіп3. рВІп1 /сердцевинньій промотор: вторая половина синтетического гена Ві ї- З55:РАТ:355/ изготавливали путем лигирования фрагмента сердцевинного промотора Хва /1/ //со | с размером 2,1лБиз плазмидной сердцевиньї /3-1/ с фрагментом Хва 1/Мза 1 с размером 5,2К5 из рС184407. рВИп2 является промежуточной конструкцией, содержащей сердцевинньй промотор, модифицированньй фрагментом реакций РСК с размером 210Бр, сч изготовленньїй с использованием праймеров КЕТ1О0А28 и КЕ98А28, приведенньх вьіше.
Реакционная смесь РСК содержит приблизительно 100нг фрагмента сердцевинного промотора Вамні/Мсо | і) с размером 2,1К6 со 100 пмолями каждого олигомера, 200нНМ, каждого аМТР, однократньій буфер /Сейшв/ и 2,5 единицьі термоустойчивой полимеразьі. Поскольку температура плавления ДНК /Тм/ является относительно низкой /между 402 и 502С/, реакции РСК вьіполняли при следующих параметрах: «г цикл денатурации: 942С в течение 1 минуть; цикл гибридизации: 372С в течение 1 минуть о цикл расширения: 722 в течение 45 секунд /с прибавлением З секунд в каждом цикле/; -- количество циклов: 25 со
Пробьї РСК, обрабатьівали протейиназой К, как зто описано вьіше, перед разрезанием с помощью зЗаї 1/Крп с последующей зкстракцией фенол/ хлороформа и осаждением зтанолом, как зто описано вьіше. фрагмент с Ж размером 210рБр очищали на 295 Мизіеме геле и зкстрагировали из гели, используя фильтровальнье установки ультратонкой очистки. Фрагмент Заї! 1/Крп 1 с размером 210рбр лигировали с фрагментом заї 1/Крп 1 с размером 4,9К5 из сердцевиньі /3З - 1/ для получения рВіїп 2. р4420А /сердцевина:синтетический-М:Рер интрон:355 Ж «
З55:РАТ;355/ изготавливали трехходовьім лигиропанием, содержащим фрагмент Мз5ІП/Вамні с размером 7О00рр из рВЧп2, фрагмент Вам НІ/Взі Е ІІ с размером 1,8КЬ из рС184418 и фрагмент Вві Е П/МвіЇ с размером 5,9КЬ из - с рРВІпІ. После изготовления р4420А в рВіп2 бьли обнаружень три мутации. Второй фрагмент РСК и изготавливали с целью модификации сайта Мсо 1 в лидере сердцевиньі, используя праймерь! КЕ104А28 и "» КЕТОЗА28 при значений Тм, равном приблизительно 65922. Смесь реакциий РСК идентична смеси, подведенной вьіше, с добавлением глицерина до 2095 для уменьшения мутаций в областях с избьітком СС /Непгу еї аї., Ріапі
Моіесшціаг ВіІоіоду Керогпег 9/2/:139-144, 1991/, Параметрь! реакции РСК следующие: - Файл 1: 947: З минуть, 1 цикл о Файл 2: 60": 1 минута, 942С: 1 минута. 25 циклов
Файл 3: 727: 5 минут, 1 цикл - Пробьї РСК обрабатьвали, как описано вьіше, и разрезали с помощью зндонуклеаз рестрикции заїЇ и Крп 1. о 20 Фрагмент РСК /глицерин в пробе /Заї І/Крп І с размером 210Бр лигировали с фрагментом Заї 1/Крп 1 с размером 4,9КЬ из сердцевинь! плазмидьї /З - 1/ с целью получения рВіІп3. Даннье о последовательности на рВіїпЗ3-оМо1
Т» показьівают, что фрагмент, виіработанньй РСК, является правильньм. рВЧи3-9Мо1 использовали для получения рС184420 /гтакже назьшваемой р442088 "Моб", рС184420 конструировали с помощью трехходового лигирования, используя фрагмент Ме! 1/Вамні с размером 700рр из го рВЦп-оМо1, фрагмент Вамні/Взі Е ІІ с размером 1,8КЬ из рС184418 и фрагмент Вві Е П/Мві І с размером 5,9КЬ из
ГФ! рВІп 1. рСІВ4420 использовали в опьїітах с протопластом мезофила, при зтом бьіла доказана полная активность синтетического гена сгуїА/в/ против Европейского зернового точильщика. о 7. рС184413 /РЕРС: синтетически-ВІЕ /Рпе мутация/"РЕРС интрон: 355./
Фрагмент слияния вьірабатьвшали с помощью РСК, используя прайморьї КНОЗА28 и КЕ97А28 с матрицей 60 Ніпа ПзЗаї І с размером 2,3 из рШи54.5. Смесь РСВК имеет ту же концентрацию праймеров, матриць, амМтТР, солей и термоустойчивой полимеразьї, как бьіло описано вьіше. Реакция РСК имела следующие параметрь!: цикл денатурации: 947С в течение 1 минуть цикл гибридизации: 552С я течение 1 минуть! цикл расширения: 72"С в течение 45 секунд /с прибавлением трех секунд в каждом цикле/ б5 количество циклов: 30
Затем пообьї РОК обрабатьвали протеийназой К с последующим зкстрагированием фенол/хлоройормом и осаждением зтанолом, как зто описано ниже, перед разрезанием с помощью зндонуклеаз рестрикции Вамні и
ВЕ. рС18441Р получали путем трехходового лигирования, используя фрагмент Вамні/Взі Е ІІ с размером 210бБр, фрагмент Вамні/Ніпа Іс размером 4,7КЬ из рС184406 и фрагмент Ніпа П/Вві Е ІІ с размером 2,2К5 из реИза.5. 8. рС184421 /РЕРС:синтетический- сгуід/в/РЕРС интрон:355./ рОС184421 изготавливали для замещения синтетического гена сгуіА/в/, содержащего мутацию Рпе в рОС184413, синтетическим геном сгуіА/в/ из рС184419. рС184421 получали путем лигирования фрагмента 7/0 Вамні/Зас І с размером 5,2КЬ из фрагмента рС184413 с фрагментом Вамні/зас І с размером 1,9КЬ из рС184419. 9. рС184423 /РЕРС:синтетический-суІА/в/Рерс интрон:355 и З55:РАТ:355/
Фрагмент РЕРС промотора ВамнНі/Ніпа І с размером 2,4К5Б изрС184421 лигировали с фрагментом
Вамні/Ніпа ІІ с размером 6,2К5 из рС184420 для получения рС184423. Сайт Ніпа ІІ удаляли зкзонуклеазами при клонирований рСІВ4423. рСІВ4423 содержит синтетический ген сгуіА/в/, управляемьій РЕРС промотором, и /5 РАТ ген, управляемьй промотором 358. 10. Синтетический ген сгуІА/в/ в штаммах Адгобасіегійт:
Штаммь Аадгобасіегішт, полученнье с помощью синтетического гена сгуІА/в/, обеспечивают перенос зтого гена в ряде двудольньїх растений. Адгорасіегійт вектор рС184417 содержит фрагмент Ніпа ІШ/ Есо КІ
З55:синтетический-СтуІА/в/"РерС:Ім8:355 с размером 3,3КБ из рС184406 /Рпе мутация/, лигированного с фрагментом Ніпа Ш/Есо КІ из рВ1101 /Сіопіесп/. Используя злектронорацию, рСІВ4417 перенесли в штамм
А Лптегасієпз І ВА4404 /Діе -Іпага еї аї., МисіеІс Асіаз Кезеагсі, МоїІ17:Мо16:6747 1989./, 20О0нг рС184417 и 4Омкл размороженньх подходящих клеток | ВА4404 подвергали злектротторациив предварительно охлажденньх кюветах для злектропорации размером 0,2см. /Віо-Кай Іарогаюгіев Ца./.
МИспользуя датчик импульсов Сепе Риізег-ТМ совместно с блоком регулирования импульсов /Віо-Кад)/, сч г прикладьвали злектрический импульс с напряжением 2,5кВ при емкости, равной 25мкФ. После прикладьівания импульса клетки сразу же переноси.л в мл средь! УЕВ и встряхивали в течение трех часов при температуре і) 272 перед их вьісеиванием на чашки, содержащие АВмін:Км50. После инкубирования при температуре 2890 в течение приблизительно 60 часов колонии селектировали для минискрина с целью проведения растрикционного анализа. Конечньій штамм Аадгобрасіегішт назвали рС134417:1вА4404. «І
Пример 41: ферментньій иммуносорбентньй анализ /ЕІ ІЗА/ трансформированньх кукурузньїх протопластов.
Наличие токсического белка сгуЇА/В/ обнаруживали с помощью ферментного иммуносорбентного анализа - /!ЕОБА/, Указанньй анализ является очень чувствительньм специфическим анализом для антигенного «-- материала. Зтот анализ используется для определения зкспрессии продуктов полипептидного гена.
Антисьіворотка для таких анализов изготавливается в результате иммунизирования кроликов очищенньіми с со 3з5 помощью градиента кристаллами Ві /Апд оеї аї., Арріїей Епмігоп Місгоріої. 36:625-626 /1978//, «Ж солюбилизированньми сульфатом додецил натрия. Анализ ЕЇпІЗА озкстрактов из неустойчиво трансформированньмх клеток кукурузь! вьіполняли, используя стандартнье методики /см., например, Нагіом/, Е., и Гапе, Д. в "Апіродіег: А І авогаїгу Мапиаї!", Соїд Зргіпду Нагбог І азогайогу Ргезз, 1988/.
Кроме того, методика проведения вьішеуказанного анализа описана у СіагК еї аі., Меїйодз Іп Епгутоіоду, « 420. 118: 742-766 /1986/; и Вгадіога, Апа!. Віоспет, 72:248 1976/. Таким образом, такие методики хорошо известнь! -пее) с специалистам в данной области. Даннье методики раскрьіваются в настоящем описаний в качестве ссьлок. й Анализьі ЕГІЗБА вьіполняли для обнаружения продуктов белка СгуІА/в/ в кукурузньїх протопластах. «» Продуцированньій белок характеризуетбя ниже в размерности нг Ві на мг общего белка /нг Вумг/. Каждую конструкцию испьітьіївали дваждь. рС183069 Ві не обнаружено /в обоих опиьїтах/. ї» рС184407 21900нг Вумг. общего белка, 2100Онг Вумг обшего белка/
Трансформированньюе клетки кукурузьі продуцировали вьісокие уровни, порядка приблизительно 2000Онг бо белка сгуіА/в/ Ві на мг полного растворимого белка, ВІ ІР при трансформации геном Ві, оптимизированньм - относительно кукурузьі. Уровень обнаружения с помощью анализа ЕГІЗА составляет приблизительно от 1 до 5ор онг белка сгуїй/в/ на мг белка. Позтому оптимизированньй относительно кукурузь ген В обеспечиваєт о увеличение зкспрессии зтого белка в клетки кукурузьї приблизительно в 20000 раз.
Та» Пример 42. Анализ зкстракта из трансформированньїх протопластов на инсектицидную активность к
Европейскому зерновому точильщику.
Вестерн-блот анализ также проводили, используя зкстрактьі, полученнье из клеток кукурузь!, которье бьіли
Неустойчиво трансформированьї с помощью ДНК для зкспрессии оптимизированного относительно кукурузь гена. При исследований, проводимом с помощью вестерн-блотов, указанньй белок показьввал идентичность с іФ) белком, поодуцированньм в Е. соїЇ. В противоположность зтому, как показано в вьішеприведенном примере 6, ко необнаруживаємьй инсектицидньй белок сгуїй/в/ Ві продуцировался кукурузньми клетками, трансформированньми сравниваемьми векторами при попьтке зкспрессировать нативную кодирующую бо область, вьіделенную из ВІ. Адгобасіегіцт:
Качественнье испьтания на токсичность насекомьх могут бьть проведеньі, используя полученнье протопласть Во всех биопробах готовили суспензий для каждой анализируемой репликации. Репликация считается позитивной, если она вьізьівает значительно более вьісокую смертность, чем контрольная. Например, репликации испьітьвшали на их активность против насекомьїх отряда чешуекрьільїх, в частности, против 65 Европейского зернового точильщика, Овігіпіа пиріайв. 100мкл суспензии протопласть в 0,195 Тгйоп Х-100 пипетировали на поверхность искусственной питательной средь! совки ипсилон /Віозегм, Іпс., РЕгепспіом/п, М;
Е9240/ в чашках Петри с размером крьішки 5Омм х 1О0мм. После сушки воздухом в каждую чашку добавляли 10 новорожденньїх личинок. Смертность фиксировали приблизительно через 4 дня. Когда указанньй белок скармливали Европейскому зерновому точильщику, смертность достигала 10090.
Пример 43: Зкспрессия синтетического ВІ в протопласть! растительной ткани кукурузньі.
Общую методику вьіделения протопластов растительной ткани кукурузьї применяли согласно Зпееп еї аї.,
Тпе Ріапі СеїЇ, 2: 1027-1038 /1990/. Систему трансформации протопласта, используемую ЗПееп еї аї., модифицировали за счет трансформации, опосредствованной полизтиленгликолем /РЕС/,а не злектропорации.
Зта методика, а также изменения, сделанньсе в методике вьіделения, описаньї ниже. 70 Вьіделение/трансформация протопласта растительной ткани кукурузь!. 1. Простерилизуйте и прорастите семена кукурузь! для получения листьев. Саженць! виіращивайте на свету при температуре 2576. 2. Стерилизуйте поверхность кусочков листьев 10 - 12-дневньїх саженцев 590-ньім Сіогох в течение 5 минут с последующими несколькими промьіваниями стерильной дистиллированной водой.
З. Аликвотируйте раствор фермента /см. рецептуру ниже/; 25мл/чашка /чашка Петри размером 100 х 25мМм/. 4. Удалите из листьев лишнюю воду и поместите 6-8 двухдюймовьх" кусочков /5,08см/ в каждую чашку с ферментом. Обьічно готовят 14 чашек с кусочками листьев от приблизительно 100 саженцев. 5. Разрежьте листья на как можно более тонкие продолговатье полоски /2 - 5мм/. 6. Медленно встряхивайте чашки в течение 6,5 - 7 часов при температусе 252С. Накройте чашки так, чтобь
Мнкубирование происходило в темноте. 7. Перед фильтрованием протопластов промойте микрофильтрьі с размером ячеек 100мкм 1Омл 0,6М маннита. Медленно пикетируйте протопластьі Через микрофильтрь. Промойте чашки 0,6М маннита с целью сбора всех протопластов, оставшихся в чашках. 8. Тщательно пикетируйте отфильтрованную жидкость в 5О0мл стерильнье пробирки. Добавьте равнье с обьемь 0,6М маннита для разбавления. 9. Центрифугируйте в течение 10 минут при 1000об/мин и ускорений 500л на центрифуге /Весили, модель о
ТО-6 /. 10. Удалите ферментньій раствор и вьібросьте его. Тщательно ресуспендируйте пеллеть! в 5мл маннита.
Обьедините несколько пеллет. Доведите обьем до 50мл, добавляя 0,6М маннита и центрифугируйте. «І 11. Ресуспендируйте до известного обьема /5Омл/ и проведите подсчет. 12. После подсчета и осаждения центрифугированием ресуспендируйте протопластьі в количестве о 2миллиона/мл в ресуспендирующем буфере /рецептура приведена ниже/. Проведите инкубирование осадков в. 0//с пе ресуспендирующем буфере в течение по меньшей мере 30 минут перед трансформированием.
Трансформация: со 1. Поместите аликвотнне пробь! плазмид в пробирки /РІзпегагапа полистироловье пробирки с культурой, «ф имеющие защелкивающуюся крьшку, с размером 17 х 100мм/; по меньшей мере, три копии при одной обработке; используйте зквимоляонье количества плазмид с тем, чтобь! сравнивать равнье количества копий генов. 2. Добавьте 0,5мл протопластов и 0,5 мл 4095 полизтиленгликоля, приготовленного с 0,6М маннита. « 3. Мягко встряхивайте для перемешивания и инкубируйте при температуре 252С в течение 30 минут. шщ с 4. Добавьте культуральную среду, содержащую протопласть, с интервалом в 5мин; 1, 2, 5мл. ц 5. Центрифугируйте в течение 10мин при 1000об/мин и ускорений 500905. "» 6. Удалите жидкость из пеллеть! и ресуспендируйте в Тмл культуральной средь /ВММ среда)/. 7. Мнкубируйте всю ночь в темноте при температуре 2570.
Рецепт: г» Ферментньй раствор 0О,6М маннита со 10мММ МЕБ, рНн5,7 - 1мМ Сасі 1мМ Масі» о 0,195 ВЗА «з» стерилизующий фильтр
К зтому раствору добавьте следующие ферменть!: 196 цитаза КБ, 0,196 мацерозим КІО
Промьівочньїй буфер: 0,6М мачнита, стерилизующий фильтр
Ресуспендируюший буфер: 0,6М маннита, 20мМ КСІ, стерилизующий фильтр о Культуаальная среда: рецепт средьі! ВМУ, описанньїй ОКипо еї аї., ко Рпуюраїйїйоіоду 67:610-615 /1977/ 0О,6М маннита во 4ММ МЕЗ, рН5,7 0,2ММ КНо»РО,Х 1ММ КМО»з 1мММ Ма5О, 10мМ Сасі, 65 Микронутриенть ІХ КЗ
Стерилизующий Фильтр
Анализ ЕГІЗА трансформированньїх протопластов исполняли через один день после тоансформации.
Анализ проводили так, как зто описано ранее. Следующие три зксперимента бьіли проведень! с имбредной линией 211Д кукурузьі. Конечно, могут использоваться и другие линии кукурузьі. Использовали 5О0мкг плазмидь! рС184419 и зквимолярное количество других плазмид. Общий растворимьій белок определяли с использованием Віо-гаа набора /Вгадіога, Апа! Віоспет, 72:248 /1976//. Зксперимент по трансформации:
Исследованнье конструкции: 1. рС184419 /Конструкция содержит синтетический ВІ под контролем промотора САММУЗ55, и маркерньх генов З55/РАТ и 355/505/ 70 2. рС184420 /конструкция содержит синтетический Ві под контролем сердцевинного промотора, и маркерного на РАТ/ 3. рС184421 /Конструкция содержит синтетический Ві под контролем РЕРС промотора/ 4. рС184423 /Конструкция содержит синтетический Ві под контролем РЯРС поомотора и маркерного гена
РАТ/РЕРсС:синтетический-суІА/в/РерС интрон:355 ж 355:РАТ:355/
В следующих зкспериментах 10...11-дневньіе саженць! подвергли анализу на продуцирование белка СтуІА/в/
ВЕ с помощью Віогад, набора.
Зксперимент 1 /11-дневнье саженць/: рос184419 15000 х З0бОнг Вумг белка рос184420 280 5 б5нг Вумг белка
РС184421 9000 ж 800Онг Вумг белка
Зксперимент 2 /10-дневнье саженць/: ростВ4419 5000 х 27Онг Вумг белка рос184420 80 з 14нг Вумг белка с рос184421 1600 ж 220нг Вумг белка о
Зксперимент З /11-дневнье саженць/ рос184419 21500 х 1800нг Вумг белка рос184420 260 я Бонг Вумг белка рос184421 11900 х 400Онг Вумг белка «І рсС184423 7200 х 340Онг Вумг белка «в)
Вьішеприведеннье зкспериментьі подтверждают, что оба промотора Самм355 и РЕРС зкспрессируют синтетический белок сіуїА/в/ ВІ на очень вьісоких уровнях. Сердцевинньій промотор, хотя и менее злективньй, также зффективен для зкспрессии синтетического белка сгуїІА/в/. со
Пример 44: Стабильная зкспрессия синтетического Ві в латук. «г
Синтетический ген Ві в Адгобрасіегішт векторе рС184417 трансформировали в І асіиса займа су. Кедргіге /латук/. Методика трансформации описана в Епомоїйо еї а/!., Ріапі СеїЇ Керогів, 9:6-9 /1990/.
Методика трансформации:
Поверхность семян латука стерилизуют в 5956 Сіогох в течение 5 минут, после чего следуют несколько « промьваний стерильной дистиллированной водой. Семена со стерилизованной поверхностью вьсевают на пт») с средьі М5 с половинной концентрацией /Мигазпієде и ЗКоод, РПузіоІ. Ріапі. 15:473-497 /1962//, В качестве зксплантатов для Адгобасіегішт. инфекции используются семядоли б-дневньїх саженцев Кеадргіге, вииращенньмх :з» при освещений ЗО0бОлк в течение 16ч при температуре 2520. Основпние и верхушку каждой семядоли удаляют с помощью скальпеля. Зксплантатьь погружают на 10 минут в бактериальньй раствор, которьй бьл
Культурирован в течение 48ч в минимальньх средах АВ с соответствующими антибиотиками при температуре ї» 289С. После блотирования избьточного бактериального раствора на стерильную фильтрованную бумагу зксплантать! внісевают на среду М5 /0,1мг/л ВА и 0, Тмг/л МАА/ в течение 2 дней. Затем зксплантать! переносят в со злективную среду, содержащую 5О0Омг/л карбенициллина и БбОмг/л канамицина. Зксплантатьї еженедельно - пересевают на свежую среду. В камере для вніращивания поддерживаются следующие условия: освещение 2000лк в течение 16бч при температуре 25"С. Приблизительно через 4 недели на крепких на вид каллюсах из о каждой чашки, в которой осуществляли пересев, проводят анализ ЕІ ІБА. Методика проведения указанного
Чл» анализа такая же, как и описанная вьіше для протопластов; снова определяют растворимьій белок с помощью вьішеописанного. Віо -гад набора.
Результатиь!: рС183021 /канамициновьй контроль/ 0)
Ф) рос184417 /чашка 1/ (в)
Кк. рос184417 /чашка 2/ 5О5нг Вумг белка рс184417 /чашка 3/ 45нг Вумг белка во рос184417 /чашка 4/ 120Онг Вумг белка
Зтот пример показьшаеєт, что двудольнье растения также могут проявлять повьішенную зкспрессию оптимизированного инсектицидного гена.
Пример 45. Конструирование рС184429. 65 рОС184429 содержит предпочтительньій кукурузньій специфически-пьільцевой промотор, слитьій с оптимизированньм относительно кукурузьії геном сгуіА/в/. Специфически-пьільцевой кукурузньй промотор, -дА-
используемьійй в зтой конструкции, бьіл получен из плазмидь рКІ 2, описанной в примере 37. Оптимизированньй относительно кукурузь ген сгуіА/в/ біл получен из плазмидьі рС184418, также описанной в примере 37. рРКІ2 опредставляет собой оплазмиду, которая содержит опредпочтительно кукурузньй специфически-пьільцевой промотор, слитьій с геном Е. соїї, кодирующим бета-глюкуронидазу. Указанная плазмида бьла сконструирована из плазмид рОК110 и рС183054. Плазмида рОаК110 содержит кукурузньй специфически-пьільцевой промотор. Плазмида рС183054, производная от рисСт19, содержит ген БЕ. сої бета-глюкуронидазьї /3И5/, слитьій с промотором 355 вируса мозаики цветной капусть! /Самм/. Ее конструкция описана в другом месте данной заявки. Зтот промотор может бьїть удален из указанной плазмидь! путем 7/0 Ввірезания с помощью заї 1/НІпа І с целью получения Фрагмента, содержащего ген БИ, ген, устойчивьй к бактериальному ампициляину, и начало СОЇЕЇ! копии. Второй Фрагмент содержит промотор САММ 355. рС1БЗ3054 разрезали рестриктазами заї! и Ніпа ІІІ, используя стандартнье условия, в течение двух часов при комнатной температуре, Затем пробу зкстрагировали фенол/хлороформом при стандартньїх условиях и ДНК восстанавливали путем осаждения зтанолом, используя стандартнье условия. Восстановленную. ДНК /5 ресуспендировали в буфере, подходящем для реакции с телочной фосфотазой из кишечника теленка /СІР/ и зводили в реакцию с СІР, продолжающуюся, всю ночь при температуре 372С. После реакции с СІР ДНК очищали на геле агарозьі, используя стандартнье условия, описаннье в другом месте данной заявки. рек разрезали с помощью зЗаїйНіпа ПШ в стандартньхх условиях в течение двух часов при комнатной температуре, а затем очищали ДНК на геле агарозьії, используя стандартнье условия. Фрагменть! восстановленной ДНК лигировали при стандартньїх условиях в течение двух часов при комнатной температуре, после чего трансформировали в подходящие клетки НВ101 штамма Е. соїЇ. Трансформанть! селектировали на І-агаре, содержащем 1ООмкг ампициллина/мл. Трансформантьї идентифицировали для получения требуемой конструкции плазмидь, используя стандартнье операции минискрининга. Правильная конструкция получила название рКі-2. -. Для получения рС184429 вьіполняли трехходовое лигирование, используя стандартнье условия, известнье с специалистам в данной области. Тремя лигированньми фрагментами являлись: 1/ Фрагмент Ніпа Ш/Вам НІ из рС184418 с размером приблизительно 4,7К0, содержащий ген СгуІА/в/, ген, о устойчивьїй к бактериальному ампициллину, и начало СОЇЕЇ копни. 2/ Фрагмент Ніпа ПХба І из рКІ?2 с размером 1,3КБ , содержащий специфически-пьільцевой промотор из кукурузь!. «І 3З/ Образованньйй РСК, фрагмент, вьіделенньй из пьільцевого промотора по сайту Вамні, введен на участке, расположенном ниже начала транскрипции. Указанньій фрагмент имел размер, равньій приблизительно 120Бр, о а его концьї виірезаньї с помощью рестриктаз Хваї!/ Вамні. «--
Фрагмент РСК получали, используя 100мкл реакционного обьема при стандартньїх условиях, описанньх вьше. Праймерами являлись: со
ЗКБО: 5-ССС ТС ААА АТС ТАС ААА ССТ-3 «
КЕ127: 5-5СО БАТ ССО ОТ оСо Со Со ДАС ОА-3
Вьішеуказаннье праймерь смешивали в реакциий РСК с плазмидой рОК105, той плазмидой, которая содержит специфически-пьільцевой промотор из кукурузь!.
После окончания реакции РСК, 1Омкл пробьі помещали на гель агарозьії, используя стандартнье условия, « для того, чтобьї убедиться в том, что продукт реакциий имел ожидаємьй размер. Оставшиеся 9Омкл 8 с обрабатьввали протеиназой К при конечной концентрации, рапной 5О0мкг/мл в течение ЗОминут при температуре й 372С. Затем пробу нагревали при температуре 659С в течение 10 минут, после чего ее зкстрагировали "» фенол/хлороформом, используя стандартнье операции. ДНК восстанавливали из надосадочной жидкости путем осаждения с помощью двух обьемов зтанола, используя стандартнье условия. После осаждения ДНК восстанавливали центрифугированием в микрофуте. Пеллету промьівали один раз 7095 зтанолом /что является г» стандартом в данной области/, бьістро сушили для полного удаления зтанола и ресуспендкзовзли в 17мкл ТЕ буфера. 2мкл, 10х буфера рестриктазьь добавляли к имевшимся О,бБмкл Вам НІ и О,бмкл Хва 1. ДНК
Ме переваривали в течение 1 часа при температуре 372С для продуцирования фрагмента ДНК, внірезанного с Хва - І/Вам НІ. После переваривания рестриктазами указанньй фрагмент очищали на геле агарозьі, содержащем 290 о 50 Мивієме (ЕМС)/1956 гель агарозь. Для вьмьшвания ДНК из агарозьь применяли ультратонкие фильтрь, руководствуясь инструкциями изготовителя. После злюйирования ДНК использовали в трехходовом с» лигировании, описанном вьіше.
После лигирования ДНК трансформировали в подходящие НВІТО1 клетки штамма Е. соїЇ, используя стандартнье методики. Трансформантьі селектировали на чашках с І-агаром, содержащим ампициллин в Количестве 100мкг/мл. Колонии, вьіросшие в избирательньїх условиях, идентифицировали для плазмидньх вставок с использованием стандартньїх для данной области методик. о Пример 46. Конструирование рС184431, вектора для специфически-тканевой зкспрессии синтетического іме) гена сітуЇА/в/ в растения. рС184431 является вектором, предназначенньім для трансформации кукурузьі. Он содержит два химерньх бо гена, кодирующих зндотоксин Ві, которье могут бьть зкспрессированьй в кукурузу. Указаннье гень представляют собой опромотор РЕР карбоксилазь/синтетический сгуїА/в/ и пьільцевой промотор/ синтетический-сгуІА/в/. Ген РЕР карбоксилаза/сгу|А/в/ в указанном векторе вьіделяли из рС184421, описанного вьіше. Пьільцевой промотор также описан вьіше. На фиг.20 показана карта плазмидьії рС184431. Плазмида рС184431 бьіла сконструирована с помощью трехходового лигирования, используя Фрагмент Крп І/Ніпа Ш с 65 размеоом приблизительно 3,5КО, содержащий пьільцевой/синтетический-сгуІїА/в/ из рС114429, фрагмент Ніпа
Ш/Есо КІ РЕРС/синтетический-сгу!А/в/ с размером приблизительно 4,5К5Б, и фрагмент Крп МЕсо КІ из блюскрипт-вектора с размером 2,6кКБ.
Другие векторьії, включающие пьільцевой промотор/синтетический химерньй ген сгуЇА/в/, содержат рС184428 и рС184430 См. фиг.21 и 22. рС184430 также содержит ген РЕРС/синтетический-ВІ, описанньй вьіше.
Пример 47. Продуцирование трансгенной кукурузь, содержащей синтетический оптимизированньй относительно кукурузь! ген сгуІА/в/.
В нижеприведенном примере для введения в кукурузньсе клетки, из которьїх получают трансформированнье растения, частиц ДНК использовали Віо|І5(Їсв.
Зксперимент КО-65 70 Продуцирование кукурузьї, зкспрессирующей синтетический ген о сгуіїй/в/, с о использованием специфически-тканевого промотора.
Ткань.
Незрельсе кукурузнье змбрионь! с длиной приблизительно 1,5...2,5мм, вьіделяли из колоса генотипа 6М615 через 14 - 15 дней после опьіления. Материнское растение вьращивали в теплице. Перед вьіделением змбрионов колос поверхностно стерилизовали 2095 Сіогох в течение 2Омин. и триждь: промьвали стерилизованной водой. Каждьй змбрион вьісевали щитковой стороной на площади 2см, 36 змбрионов на чашку, на среду, итсициирующую каллюс, 2ДО4 -и 5 хлорамбеновую среду /основнье соли 6, вспомогательнье соли В5, М5 железо, 295 сахароза с 5мг/л хлорамбена, 20мг/л глюкозьі/ и 1Омл добавок С4 /Таблица 1/ которье вводили после автоклавирования. сч 8; « зо о - со «
Бомбардировка.
Ткань бомбардировали, используя установку ВіоїІзйсв РОБ-1000Не. Ткань помещали на полке, расположенной на 8см ниже полки задерживающего зкрана. Ткань однократно бьла обстреляна расткором « Микроносителя ДНК/золото, 1Омкл вьісушивали на макроносителе. Использованньій задерживающий зкран шщ с вручную перфорировали на установке АВК, используя трафарет из нержавеющей стали размером 10 х 10. . Бьіли примененьі диски с усилием на разрьів, равньім 155Орзі /103,5кПа/. После бомбардировки змбрионь! а культивировали в темноте при температуре 2576.
Приготовление ДНК для доставки.
Микроноситель готовили в основном согласно инструкции, прилагаемой к прибору ВіоіІзійсв5. В процессе їз встряхивания 5Омкл, 1,0мкМ золотого микроносителя добавляли 5мкл рС184431 /1,23мкг/ мкл/ /Мо898/ ї- 2мкл рос183064 /0,895мкг/мкл/ /М56/, затем 5Омкл 2,5М Сас», а затем 20мкл, 0,1М спермидина /свободное основание
Со тимилин-цитазин/. Полученную смесь встряхивали в течение З минут и микройугировали 10 секунд. Удаляли - надосадочную жидкость и микроносители дваждь промьшвали 250 микролитрами 10095 ЕН /чистьїй для б5р Колонки НРІС/ с последующим непродолжительньм встряхиванием, центрифугированием и удалением о надосадочной жидкости. Микроносители ресуспендировали я ббмкл 10095 ЕН. ї» Формация каллюса.
Змбрионьі переносили в среду, стимулирующую каллюс, с Змг/л РРТ через один день после бомбардирования. Змбрионьі! оценивали на инициацию каллюса через 2 и З недели после бомбардирования. в Любье разрастания переносили на среду обеспечения каллюса, 20054 ж 0,5 2,2-Д среду с Змг/л РРТ. Среда обеспечения каллюса представляет собой основнье соли Мб, вспомогательнье соли В5, М5 железо, 295
Ф) сахарозу с 0,5мг/л 2,4-Д, 20мг/л глюкозьї и 1О0мл добавок 4, вводимьїх после рвтоклавирования. Змбриогенньй ка каллюс субкультивировали каждье 2 недели с целью обновления средьі! обеспечения каллюса, содержащей
Змг/л РРТ. Весь каллюс бьіл инкубирован в темноте при 2596. во Реакция формации каллюса типа 1 составляла 1595. Каждьй змбрион, которьій продуцировал каллюс, бьл культивирован как индивидуальное разростание, что приводило к появлению индивидуальной линии.
Регенерация.
Через 12 недель после селекции ткань удаляли из средьі обеспечения каллюса с РРТ и помещали на среду регенерации. Среда регенерации представляет собой 0,25М5355ВА /0,25мг/л 2,4-Д, 5мг/л КАЕ /щелочная 65 фосфатаза бактерий/, соли М5, 395 сахароза/в течение 2 недель, после чего следует субкультивирование до средьі М5З5 для регенерации растений. Через 4 - 10 недель растения удаляли и помещали в гиббереллин А 7
/БА;/. Линия КС65 0 - 6, которая стала разрастанием ВІ Мо176, продуцировала всего 38 растений.
Анализь
Все растения по мере того, как их помещали в СА 7, испьітьшали с помощью реакции, использующей хлорфенольний краситель /индикатоо СК/ на устойчивость к РРТ, как зто описано в заявке США 07/759 243, поданной 13.09.31, релевантнье раздель! которой подведеньі в данном описаний в качестве ссьілки. В данном анализе используется чувствительньій к рН индикаторньй краситель для того, чтобь! показать, какие клетки растут в присутствий РРТ. Растущие клетки вьізьшвают изменение рН в среде, при зтом цвет индикатора меняется с красного на желтьїй. В зтом тесте легко различимь! растения, зкспрессирующие ген, устойчивьй к 7/0 РРТ. /Мо176 - 8 положитольньх /30 отрицательньх/. Растения, которье согласно тесту СК являются положительньми, исследовали с помощью РСК на присутствие синтетического гена ВТ. /Мо176 - 5 положительньх /2 отрицательньмх/ 1 отмершее/.
Растения, показавшие положительньій результат при реакции РСК, на синтетический ген ВТ, помещали в фитотрон. Сразу же после помещения их в фитотроне, определяли их характеристики, используя биопробь /5 насекомьх и анализ ЕГІЗА. В качестве биопробь! насекомьх использовали стандартньй анализ на
Европейского жука точильщика /описанньій в примере 5А/, при котором небольшие кусочки листа отщипьівали от растения и помещали в небольшую чашку Петри с несколькими новорожденньми личинками ЕСВ. Обьічно исследуют растения вьісотой Є дюймов / приблизительно 16 см/. Далее приводятся характеристики растений, приводящих к 100956 уничтожению ЕСВ. Результать! анализа ЕЕГ ІЗА приведеньі ниже. Растения, показавшие 20 положительньй результат, помещали в теплицу.
Теплица/Фертильность
Растение Мо176-11 опьіляли пьільцой дикого 6М615. Бьіли продуцированьї один побег колоса и один колоса метелки. Лили сохранень!і все змбрионьї из колоса метзлки /11/ и 56 зерен из колоса 1. 204 зерна, оставшиеся на колосе, бьіли вьісушеньі! естественньім путем. Пьільцу от растения Мо176-11 подвергали ауткроссингу с сч ов различньми генотипами кукурузьі 5ІМ984, 5МА8О и З3МУб1. При всех трех ауткроссингах бьіли сохранень змбрионьі /5М984 - 45; 5МАВ8О - 30; 3МО6б1 - 8/. Большинство зерен оставили на колосьях растений, (8) размещенньїх в теплице, и вьісушивали естественньм путем. Из растения Мо176-11 с помощью стандартной методики вьіделили ДНК и проанализировали, используя саузерн-блот анализ. Бьіло обнаружено, что она содержит последовательности, которье гибридизируются зондами, вьіделенньіми из синтетического гена «Е
Зо 9ГУЇА/в/, и зондом, вьіделенньм из гена РАТ. Указанньсе результать! свидетельствуют об интеграции зтих генов в геном кукурузь. о
Зксперимент КО-64. «-
Продуцирование трансгенной кукурузьї, зкспрессирующей синтетический ген сгуіА/в/, используя конститутивньїй промотор. со 35 Ткань. «Е
Незрельсе кукурузнье змбрионь с длиной, приблизительно равной 1,5...2,5мм, вьіделяли из колоса генотипа 6М615 через 14... 15 дней после опьіления. Материнское растение вьіращивали в теплице. Перед вьіделением змбрионов колос поверхностно стерилизовали 2095 Сіогох в течение 20 минут и триждь! промьівали стерилизованной водой. Каждьй змбрион вьсевали щитковой стороной на участок с площадью 2см?, 36 « 70 змбрионов на чашку, на среду, инициирующую каллюс, 2Д0О4 ї- 5 хлорамбеновая среда /основнье соли Мб, - с второстепенное соли В5, М5 железо, 295 сахароза с 5мг/л хлорамбена, 20мг/л глюкозьи/ и 1Омл добавок 04, й которье вводятся после автоклавирования. и? г со - зо о ї» ов щі о во Бомбардировка.
Ткань бомбардировали, используя установку ВіоїІзйсв РОБ-1000Не. Ткань помещали на полке, расположенной на 8см ниже полки задерживающего зкрана. Ткань бьіла однократно обстреляна раствором микроносителя ДНК/золото, 1Омкл вьісушивали на микроносителе. Использованньійй задерживающий зкран вручную перфорировали на установке АВР, используя трафарет из нержавеющей стали размером 10 х 10. 65 Бвіли примененьі диски с усилием на разрьв, равньм 155Орві /103,5кПа/. После бомбардировки змбрионь культивировали в темноте при температуре 2596.
Приготовление ДНК для доставки.
Микроноситель готовили, в основном, согласно инструкции, прилагаемой к прибору ВіоіІзіИс5, В процессе встряхивания 5Омкл 1,0мк золотого микроносителя добавляли 3,2мкл рС184418 /0,85мкг/мкл/ /Мо905/ ї- 2 мкл рРСІВЗ3064 /0,895мкг/мл/ /Мо456/ ї- 1,6мкл рСІВ3007А /1,7мкг/мкл/ /Мо152/, затем 5Омкл 2,5М Сас», а затем 20мкл 0,1М спермидина /свободное основание, тимидин-цитазин/. Полученную смесь встряхивали в течение З минут и микрофугиролали 1Осек. Надосадочную жидкость удаляли и микроносители дваждь!. промьівали 250 мкл 10090
ЕЮН /чистьй для колонки НРІ С /с последующим непродолжительньім встряхиванием, центрифугированием и удалением надосадочной жидкости. Микроносители ресуспендировали в бб5мкл. 10095 ЕН. 70 Формация каллюса.
Змбрионьі переносили в среду инициации каллюса с Змг/л РРТ через 1 день после бомбардировки.
Змбрионьї оценивали на инициацию каллюса через 2 и З недели после бомбардировки. Любье реакции переносили на среду обеспечения каллюса, 2Д(з4 ж 0,5 2,4-Д среду с Змг/л РРТ. Среда обеспечения каллюса представляет собой основнье солите, вспомогательнье соли В5, М5 железо, 295 сахарозу с О,5мг/л 2,4-Д, 20Омг/л глюкозьі и 1Омл добавок С4, вводимьїх после автоклавирования. Змбриогенньій каллюс субкультивировали каждье две недели с целью обновления средь! обеспечения каллюса, содержащей Змг/л
РРТ. Весь каллюс бьіл инкубирован в темноте при 2590.
Реакция формации каллюса типа 1 составляла 1895. Каждьй змбрион, которьій продуцировал каллюс, бьл культивирован как индивидуальное разрастание, что приводило к появлению индивидуальной линии.
Регенерация.
Через 12 недель после селекции ткань удаляли из средьі обеспечения каллюса/ помещали на среду регенерации и инкубировали при температуре 252С при 16 часах светлого /5ОМКЕ .м-2. 5 -1/ и 8 часах темного времени. Среда регенерации представляет собой 0,25М5355ВА /0,25мг/л 2,4Д, бмг/л ВАР, М5 соли, 395 сахароза/ в течение 2 недель, после чего следует субкультивирование до средьї М535 для регенерации Га растений. Через 4 - 10 недель растения удаляли и помещали в СА»7. Линия КСбА4 0 - 1, которая стала собитием
Мо170 ВТ, продуцировала 55 растений. Линия КСбА 0 - 7, которая стала собцргием Мо171, продуцировала всего о 33 растения.
Анализь.
Одиннадцать растений по мере того, как их помещали в (СА;, испьтьшвали с помощью реакции, «Ж использующей хлорфенольний краситель (95, на устойчивость к РРТ, как зто описано ЗНО еї а! см. вьіше, В данном анализе используется чувствительньй к рН индикаторньій краситель для того, чтобь! показать, какие о клетки растут в присутствии РРТ. Растущие клетки вьізьівают изменение рН в среде, при зтом цвет индикатора че изменяется с красного на желтьй. В зтом тесте легко различимь! растения, зкспрессирующие ген, устойчивьй к
РРТ, Растения, которье согласно тесту СК являются положительньми, исследовали с помощью РСК на со присутствие гена ВТ/Разрастание 170 - 37 положительньх/-18 отрицательньїх;. Мо171 їх 25 положительньх/ 8 «КЕ отрицательньх)/.
Растения, показавшие положительньій результат при реакции РСК на синтетический ген ВТ, помещали в фитатрон. Сразу же после размещения их в фитатроне, определяли характеристики растений, используя « биопробь! насекомьїх и анализ ЕГІБА. В качестве биопробьі! насекомьїх использовали стандартньій анализ на Европейского зернового точильщика /см. ниже/, при котором небольшие кусочки листа отщипьмвали от растения /-- с и помещали в небольшую чашку Петри с несколькими новорожденньми личинками ЕСВ, Обьічно исследуют ц растения вьістой 6 дюймов. Далее приводятся характеристики растений, приводящих к 10095 уничтожению ЕСВ. "» Результатьї анализа ЕГІЗА приведеньі ниже. Растения, показавшие положительньій результат, помещали в теплицу.
Скоининг Вавіа. ьч Для оценки устойчивости к Вазіа /хехст/ отобрали восемь зрельїх растений из серии Мо170. На одном среднем листе растения окрашивали участок с длиной, приблизительно равной 10 - 14см, и шириной, равной со ширине листа, с использованием 0, 0,4, 1,0 или 2,095 водного раствора Вазіа ЛОмл исходного раствора 200г/л, - разведенного дейонизированной водой до 100мл /содержащего 2 капли Тмееп 20 на 100мл. Растения бьіли Мспьштань на уровень. Восемь дикорастущих растений типа 6Мб15 приблизительно того же возраста о обрабатьвали в качестве контрольньїх. Все растения обследовались на 4-ьій и 7-ой день. Все контрольнье
СТ» растения в итоге погибли. На протяжений всего исследования ни одно из растений, взятьїх из серии Мо170, не имело повреждений, вьізванньїх гербицидами.
Опьіление.
Все колосья метелки, первьій колос и, при наличии, второй колос растений из серии Мо170 и Мо171 опьіляли пьІЛЬЦОЙ Ддикорастущих растений 6М615. По меньшей мере 9095 растений бьіли женскими особями. о Пьільцу от растений серии Мо171 ауткроссировали с генотипами 6Мб615, 5М984, 5МА89, 6010, 5МАБб, ко 2М217А,2МДО1 и ЗМО61. По меньшей мере 9095 растений оказались мужскими особями.
Обнаружение зкспрессии гена сгуїА/в/ в трансгенной кукурузе осуществлялось с помощью биопробь 6о Европейского зернового точильщика /ЕСВ/ й анализа ЕГІбА для количественного определения уровня полученного белка сгуїІА/в/.
Количественное определение ІР сгуїА/в/ в листьях трансгенньїх растений осуществляли, используя ферментнье иммуносорбентньсе тесть! /ЕІ! НА/, как зто описано у СіагК М РЕ, ІІвіег КМ, Ваг-дозерпи М:- ЕГІЗА
Тесппідцев. Іп: МУеІззрасі А, УУеІззраси Н /епаз/ Меїйодз Іп Епгутоіоду 1181:742-766, Асадеміс Ргезв, Ріогіда 65 11986/. Для определения отношения нг ІР на мг растворимого белка из общих зкстрактов образцов листьев бьіли использованьї иммуноаффинно очищеннье поликлональнье антитела кролика и козла, специфические для ІР штамма В.Т.. разновидность Кигзіакі. Чувствительность анализа двойной ЕГІЗА составляла 1 - 5нг ІР на мг растворимого белка, используя 50мкг общего белка на лунку в микротитровальном планшете.Е | А.
Кукурузнье зкстракть! изготавливали путем измельчения ткани листа в пластиковьїх сетчатьїх мешочках,
Мспользуя ручной гомогенизатор /АОДІА, Еїкап ІМ./ в присутствий зкстрагирующего буфера /50ММ Ма СО», рНУ,5, 100мМ Масі, 0,0595 Тгйоп, 0,0595 ТПлиееп, їмММ Фенилметилсульфонилфторида /РМ5Б/ и мкм лейпептина/. Определение белка вьіполняли, используя Віо-Кай набор /Кісптопа, СА/.
МИспользуя вьішеуказанную методику, первичнье кукурузнье трансформанть, описаннье вьіше, анализировали на наличие белка сіуІА/в/, применяя анализ ЕГ ІЗА. Во время анализа использовали растения с 7/0 Внісотой от 6 дюймов /16бсм/ до приблизительно-3 футов /180см/.
Растение нг Вумг растворимого елка 5/27/01 778-8 (в) (в) 1786-10 700 1585 1768-11 760 2195 171-АА 59 171-6 БО 171-8 во 171-9 280 1714-13 77 171-14А 43 171-148 во 1714-15 55 171-16А 13 с 171-168 19 171-18 19 о 176-30 1160 171-32 980 171-31 166 чІ 171-30 370 71-14 о лист Мо10 26 ьо лист 1 17 со растение 171-16 лист Мо9 40 « лист 1 120
Анализ на европейского зернового точильщика. « 1. Из распрямленного листа кукурузь! виірежьте участки с размером от 1 до 4см. 2. Каждьй кусочек листа поместите на диск увлажненного фильтра чашки Петри с размером 50 х Умм. - с 3. Пять новорожденньїх личинок Европейского зернового точильщика поместите на каждьій кусочек листа и /Всего 5 - 20 личинок на растения/. ,» 4. Чашки Петри инкубируйте при температуре 29,576. 5. Через 24, 48 и 72 часа просчитайте даннье о поврежденньх от поедания и погибших листьях.
Пример 49. Зкспрессия зндотоксина Ві в потомство трансформированной кукурузь!. т» Трансформированную кукурузу, полностью способную к оплодотворению, скрещивали с несколькими со генотипами кукурузь. Потомство от зтих скрещиваний анализировали на их способность к уничтожению
Европейского зернового точильщика /"ЕСВ/ при проведений стандартного бисанализа на ЕСВ /описанного - непосредственно вьіше/, а также на присутствие белка сгуІА/в/, используя анализ ЕТ ІЗА, как зто описано вьіше. о 50 Способность к уничтожению ЕСВ и продуцированию белка сгуїА/в/ коррежрована. Зти признаки передань потомству в отношений 1 : 1, указьвая на наличие единственного сайта вставки для активной копий чз» синтетического гена. Указанное соотношение 1 :1 бьіло справедливьм как для конститутивньїх растений, содержащих промотор /синтетический-сгуїА/В/, так и для растений, содержащих специфически-тканевьй промотор/ синтетический-сгуТА/в/ /даннье не показань. На фиг.23А представлена таблица, содержащая даннье о небольшой субпопуляции общего количества проанализированного потомства. Указанная таблица отражает о ряд различньїх скрещиваний.
Анализ на насекомьїх провели с Оіаїгеа засспага|з и Озігіпіа пибіІаі5, используя листовой материал /как їмо) зто описано вьше/ трансгенного потомства, содержащего оптимизированньій относительно кукурузь! ген
СтуІА/в/. Результатьь зтих анализов показань на фиг.23В. Они свидетельствуют о том, что пункции бо оптимизированного относительно кукурузьі гена сгуіА/в/ в трансформированной кукурузе заключаются в обеспечений устойчивости к сахарному точильщику и Озігіпіа пиріІаї Ів.
Пример 50. Зкспрессия гена сгуІА/в/ в пьільцу кукурузьі.
Потомство трансформированной кукурузьї, содержащее химерньій пьільцевой промотор/ синтетический ген сгуІА/в/, вьіделенньій из рС114431, вниращивали в поле до спелости. ПьіІльцу собирали и анализировали на 65 наличие белка сгуіА/в/, используя стандартную методику анализа ЕЇІЗА, как зто описано в другом месте. В пьІЛьце бьіл обнаружен вьісоких уровень белка сгуїА/в/. Потомство от трансформированного 355 промотором/
синтетическим геном сгуїА/в/ растения вьіращивали в теплице. Пьільцу от зтих растений исследовали используя анализ ЕГІЗА, при зтом бьіл обнаружен белок сгуІА/в/.
Результать! показаньі ниже на фиг.23С.
Признано, что такие факторь, как вьібор линий растений, генотипов растений, синтетических последовательностей и т.п., могут также влиять на зкспрессию.
Пример 51. Зкспрессия гена сгуІА/в/, слитого с преимущественно сердцевинньім промотором. рС184433 /фиг.36/ представляет собой плазмиду, содержащую оптимизированньій относительно кукурузь ген сгуіА/в/, слитьій с преимущественно сердцевинньім промотором, вьіделенньім из кукурузьі. - Зту плазмиду 7/0 Конструировали путем трехходового лигирования, содержащего: 1/ рС134418, вьірезанньій с помощью В5ІіЕЇ! и Вамні; Фрагмент с размером 1,8кКб; 2/ рВипі, вьірезанньій с помощью Меі! и В5(ЕїЇІ; Фрагмент с размером 5,9КБ;. рВІпі описан в другом месте данной заявки;
З/ Фрагмент РОК М1-151 внірабатьівали при реакции РСК в стандартньх условиях, описанньїх в другом месте данной заявки. Бьіли использованьї! следующие праймерь! РОК:
КЕ150А28: 5У-АТТ СОС АТО САТОТТ ТСА ТТА ТО-3
КЕ151-А28: У-ОСТ ОТ АСС АСО САТ ССО То СТ Сто ТОС ААС АС С-3!
После реакций РСК-ДНК проверяли на геле агарозьі с тем, чтобьії убедиться, что реакция протекала правильно. ДНК восстанавливали из пробьі РОК, используя стандартнье условия, описание в другом месте, а 2о затем внірезали рестриктазами Мзві! и Вамні при стандартньїх условиях. После виірезания фрагмент помещали на 2965 МизЗіІеме гель и восстанавливали требуемую полосу, как зто описано в другом месте. ДНК использовали при лигировснли, описанном вьіше.
После лигирования /при стандартньїх условиях/ ДНК трансформировали в подходящую клетку Е.соїЇ.
Трансформацию проводили путем бомбардировки микрочастицами по существу так, как зто описано в сч ов другом месте данной заявки. Змбрионь! переносили в среду, содержащую 10бмкг/мл РРТ, через 24 часа после бомбардировки микрочастицами. Полученньій в результате каллюс переносили в среду, содержащую 4Омкг/мл і)
РРТ, через четьіре недели. Растения регенерировали без селекции.
Для каждой серии опьітов с помощью РСК проводили анализ не-. большой вьіборки растений /З - 5/. Для указания различньх положений и расстояний змбрионов относительно устройства для бомбардировки «г зо Микрочастицами растениям бьіли присвоень кодьі. Растения со следующими кодами поместили в теплицу: о 521А ТОР ВІ. РОК позитивнье растения «- 521А МІД ВІ. РОК позитивнье растения 5216 вот ВІ. РОК позитивнье растения (ее) 3522Д МІД ВІ. РОК позитивнье растения «г 45238 МІД ВІЇ. РОК негативнье растения /для контроля/
Образць! листьев из регенерированньїх растений подвергали бисанализу на инсектицидную активность к
Европейскому зерновому точильщику, как зто описано в пзимере 48; результать! -представленьї на фиг.23Д. « дю Анализьі ЕГІЗА - образцов листьев на величину уровня белка сгміА/в/ зкспрессированного в листья, - проводили, как зто описано в примере 48; результать! представлень! нз фиг.24Е. с Представление для регистрации. :з» Для регистрации Базовой коллекцией сельскохозяйственньїх культур /МККІ/ /1818М. Опімегену 5І.,Реогіа, І. 61604/ по условиям Будапештского Договора бьіли представлень! следующие плазмидь!: рС184418, рС184420, рОС184429, рС134431, рС184433, рСВ5601, рС183166 и рС183171. ї» 35 ХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХ
Настоящее изобретение описано со ссьілкой на его специфические варианть! вьіполнения; однако следует (ее) понимать, что возможньї его многочисленньіе разновидности, модификации и вариантьі. Соответственно, такие - разновидности, модификации и варианть! необходимо рассматривать как находящиеся в границах сущности и обьема настоящего изобретения. («в) 50 Распечатка последовательностей.
ГТ» Л/ Общая информация (І) Заявитель: Емоїа, З(ерпеп М.
Стозвіапа, І уУе Д.
МУпоН, Мага .).
Ї ацпів, Кагеї |...
ГФ) КоїВпзіе!п, Зіемеп 3.
ГФ (І) Название изобретения: Последовательность синтетической ДНК с улучшенной инсектицидной активностью в кукурузе во (ПП) Количество последовательностей: 5 (Ім) Адрес для переписки: /А/ Адресат: Циба-Гейги корпорейшн 1/5/ Улица: 7 ЗКУПпе Огіме /С/ Город: Наулйпогпе /Д/ Штат: Нем/ Хогк 69. /Б/ Страна: ОЗА -Б50-
/Р/ Почтовьїй индекс: 10532 (м) Формуляр компьютера: /А/ Тип носителя: гибкий диск /В/ Коглльютер: -совместимьій с ІВМ РС /С/ Операционная система: РО-ДП5З/М5-ДО5 /Д/ Программа: Раїепі!п КеїІеазе Мо1,0, рерсия Мо1.25 (м) Данньсе по заявке: /А/ номер заявки: США 70 /В/ дата подачи: /С/ классификация: (МІ) Информация о патентном поверенном/агенте:
А! ФИО: /5/ Регистрационньй номер: /С/ Номер дела/досье: СОС 1577/С1Р (У) Информация для связи: /А/ Телефон: /919/541-8615 /В/ Телефакс: /919/541-8689 /2/ Информация а последонптельности 1Д Мо1 (І) Харпктеристики последовательности: /А/ Длина: 4360 комплементарньх пар /В/ Тип: нуклеийновая кислота /С/ Депочечность: одноцепочечная /Д/ Топология: линейная сч (ІЇ) Тип молекуль!: ДНК (І) Гипотетическая: нет і) (Ім) Антисмьісловая: нет (м) Источник: /А/ Организм: «г зо /В/ Штамм: /С/ Индивидуальная культура микроорганизма: ген инсектицидного кристаллического белка сгуІА/в/ о (хі) Описание последовательности: последовательность 1Д Мо 1: -
СТТААСАСОСС ТООСТСАААА АТТОАТАТТІ АСТААААТТА СТТОСАСТТТ СТОСАТТТТТ 60 со
ТСАТААСАТО АСТСАТАТОТ ТІТАДАТТОТЇ АОТААТСААА ДАСАСТАТТА ТАТСАТААТСо 120 «
ААТТОСТАТС ТТААТАЛААС АСАТОСАбСОТ ААСТТАТОСА ТААСААТОСО ААСАТСААТОо 180
ААТССАТІСС ТІАТААТТОЇ ТТААСТААСС СТОААСТАСА АСТАТТАССТ СбАбБАААСАА. 248 «
ТАСАААСТОС ТТАСАССССА АТССАТАТІТ ССТТОТСОСТ ААСССААТТТ СТІТІСАСТо 300 З с "з ААТІТСТІТОС СООТОСТССА ТТТСТСІТАС бАСТАСТТОА ТАТААТАТОС ССААТІТТТО 360
СТСССТСТСА АТОССАСОСА ТТТСТТІСТАС ААЛАТТСААСА СТТААТТААС САААСААТАС 420 ч 45 ААСААТТССС ТАССААССАА СССАТТІСТА САТТАСААСС АСТААССААТ СТТТАТСАЛА 480 о ТТТАСССАСА АТСТІТТАСА САСТСОСААС САСАТОСТАС ТААТССАССА ТТААСАСААо 540 -й АСАТОССТАТ ТСААТТСААТ САСАТСААСА СТОСОСТТАС ААССОСТАТТ ССТСТТТТТо 600 ' о САСТТІСАААА ТТАТСААСТІ ОСТІСТТТТАТ САСТАТАТСТ ТСААССТОСА ЛАТТТАСАТТ 560
Т» ТАТСАСТТТТ САСАСАТСТІ ТСАСТСТТТО САСАЛАССТО СССАТТТСАТ СССОССАСТА 120
ТСААТАСТСО ТТАТААТОСАТ ТТААСТАСОС ТТАТТОССАА СТАТАСАСАТ САТОСТОТАС 180 тт о ССТОСТАСАА ТАССОСАТТА САСССТСТАТ СбССАСОССА ТТСТАСАСАТ ТОСАТААСАТ За. 7 АТААТСААТТ ТАСААСАСАА ТТААСАСТАА СТОТАТТАСА ТАТОСТТТСТ СТАТТТСССА 900
АСТАТСАТАС ТАСААССТАТ ССААТТССАА САСТТІТСССА АТТААСААСА САДАТТТАТА 960. 60
САААСССАСТ АТТАСААААТ ТТІСАТОСТА СТТТТОСАСС СТОСОСТСАб СОСАТАСАдо 1020
СААСТАТТАС САСТССАСАТ ТТОАТОСАТА ТАСТТААСАС ТАТААССАТС ТАТАСОСАТС 1080
СТСАТАСАСС АСААТАТТАТ ТОСТСАССбС АТСАААТААТ СОСТТСТОСТ СТАСОСТТТТ 1140 б5
ССОБОССАСА АТТСАСТТТТ ССОСТАТАТО СААСТАТССС АААТССАССТ ССАСЛАСААС 1200
СТАТТСТТОС ТСААСТАССТ САСССССТСТ АТАСААСАТТ АТОСТССАСТ ТТАТАТАСАА 1260
БАССТТТТАА ТАТАСССАТА ААТААТСААС ААСТАТСТСТ ТСТТСАСССС АСАСААТТТС 1320
СТТАТССААС СТОСТСАЛАТ ТТОССАТССС СТСТАТАСАС АААААССССА АСССТАСАТТ 1380
СОСТССАТСА ААТАСССССА САСААТААСА АССТОССАСС ТАСССААССА ТТТАСТСАТС 1440
ТО САТТААСССА ТСТТТСААТС ТТТССТТСАС ОСТТТАСТАА ТАСТАСТСТА АСТАТААТАА 1500
САССТОСТАТ СТТСТСТТСС АТАСАТССТА СТОСТСААТТ ТААТААТАТА АТТССТТСАТ 1560
САСААЛАТТАС АСАААТАССТ ТТААСАААЛАТ СТАСТААТСТ ТООСТСТОСА АСТТСТоТосС 1620 9 ТТАНАССАСС АССАТТТАСА ССАССАСАТА ТТСТТССААС ААСТТСАССТ ССССАСАТТТ 1680
СААССТТААС АСТАААТАТТ АСТОСАССАТ ТАТСАСАААС АТАТСОССТА АСААТТСССТ 1740
АСССТТСТАС САСАААТТТА СААТТССАТА САТСААТТСА СССААСАССТ АТТААТСАСС 1800 77 всААТтТтТтТтТС АССААСТАТС АСТАСТСССА СТААТТТАСА СТССССААСС ТТТАССАСТЄ 1860
ТАССТТТТАС ТАСТОССТТТ ААСТТТІСАА АТОСАТСААС ТСТАТТТАСС ТТААСТОСТСО 1920 р» ВТСТСТТСАА ТТСАСОСААТ СААСТТТАТА ТАСАТССААТ ТСААТТТСТТ СССССАСААЄ 1980 о
ТААССТТТСА СССАСААТАТ САТТТАСАДА САССАСАААА СССОСТСААТ САОСТОТТТА 2040
СТІСТТССАА ТСАААТСОСС ТТАААААСАС АТСТСАСОСА ТТАТСАТАТТ САТСААСТАТ 2100 зо ССААТТТАСТ ТСАСТСТТТА ТСТСАТСААТ ТТТСТСТОСА ТСАЛАЛАЛАА СААТТСТССС 2160 5
АСАЛАСТСАА АСАТОССААС ССАСТТАСТО АТСАССССАА ТТТАСТТСАА САТОСААЛАСТ 2220
ТТАСАСССАТ СААТАСАСАА СТАСАСССТО ОСТОССАСАСС ААСТАСССАТ АТТАССАТСОС 2280 ю з5 ВАССАССССА ТСАССТАТТС АЛАСАСААТТ АССТТАСССТ АТТСССТАСС ТТТСАТСАСТ 2340 «
ССТАТССААС СТАТТТАТАТ СААААААТАС АТСАСТССАА АТТАЛААССС ТАТАССССТТ 2400
АССААТТААС АСССТАТАТС СААСАТАСТС ААСАСТТАСА ААТСТАТТТА АТТСССТАСА 2460 « 70 АТОССАААСА ССАААСАСТА ААТСТОССАС СТАССССТТС СТТАТОСССС СТТТСАбССС 02520 шо - СААСТССААТ СССААААТСТ ССССАТСАТТ СССАТСАТТТ СТОСТТОСАС АТТСАТСТТС 2580 2 САТСТАСАСА СТТАААТСАС САСТТАССТО ТАТСОСТСАТ АТТСААСАТТ ЛАСАСССЛАС 2640 АТОБССАТОС ААСАСТАССА ААТСТАСААТ ТТСТССААСА САААССАТТА СТАССАСААС 2700 й САСТАССТСС ТСТСААААСА ССОСАСАААА ААТССАСАСА САЛАССТСАА АЛАТТОСААТ 2760 шк о 50
Ї» (Ф. то бо б5
СБСАААСААА ТАТТСТІТАТ АААСАСОСАА ААСААТСТОТ АСАТОСТТТА ТІТОТАААСТ 2820
СТСААТАТСА ТАбАТТАСАА ССОбАТАССА АСАТСССОСАТ САТТСАТОСО ССАСАТАААС 2880 2 СССТТСАТАС САТТОСАСАА ССТТАТСТОС СТСАССТСТО ТСТСАТТССС ССТСТСААТо 2940
СООСТАТТТТ ТОААбААТТА СААОСОССТА ТІТТСАСТОС АТТСТСССТА ТАТОАТОССА -3000
САААТСТСАТ ТАААААТОСТІ ОАТТІТААТА АТООСТТАТС СТОСТОбААС ОТОАААСоСС 3060 0 АТСТАСАТСТ АСААСААСАА ААСААССАСС СТТОССТОСТ ТСТТСТТССС СААТСССААС 3120
САБбААСТСТС АСААСААСТТ ССсТОТСТоТо СобОТССТОоС СТАТАТОСТТ СОТОТСАСАС 3180
СОТАСААССА СОСАТАТОСА СААбОТТОСОо ТААССАТТСА ТОАСАТССАб ААСААТАСАО 3240 то АССААСТОСАА СТТТАБСААС ТОТОТАбААС АССААСТАТА ТОСАЛАСААС АСОСТААССТ 3300
СТААТОАТТА ТАСТОССАСТ СААСААСААТ АТОАСОСТАС СТАСАСТІСТ СОТААТССАСб 3360
САТАТСАССо АСССТАТСАА АССААТТСТТ СТОТАССАСС ТОАТТАТОСА ТСАСССТАТо 3420
ААСАААААСС АТАТАСАСАТ ОСАССААСАС АСААТССТТО ТСААТСТААС АСАССАТАТО 3-0
СССАТТАСАС АССАСТАССА ОСТООСТАТО ТОСАСАДААСА АТТАСАСТАС ТТОССАСААА 3540
СССАТААСОТ АТОСАТТОАС АТСОСАСААА СОбААССААС АТТСАТССТО САСАСсССсТос 3600 с
ААТТАСТТСТ ТАТОСАСОСАА ТААТАТАТОС ТТТАТААТСТ ААбСТОТОСА ААТАААСААТ 3660 о
САТТАСТОАС ТІСТАТТОАС АСАТАААТАА СОАААТТТТТ АТАТСААТАА ААЛАССООСА 3120 зо ТСАСТСТТАА АДАСААТОАТС ТОСОТТТТТТ СТАТОАТТТА АССАСТСАТА ТТТАААТСТТ 3780 З «в)
ТІТТТТОССА АСОСТТТАСТ ТААСбСОСТА СОбССАСАТО СССАТСААСТ ТААСААТТТо 3840 з ч-
САСТАССССС ААСТОТСААА АААССТТАТТ СТТІТСТАААА АССТАССТАб АЛАССАТСАС 3900 со
АТТТТТТАТО ААТСТТТСАА ТТСААСАТСА АТТАСААСТА ТТТТСТСААС АССТОТАТОСС 3960 -
ТСАТТТААСС ССТТСТСТТТ ТОбААСААСТ СОСТАЛАСАА ТТАССТІТТО ТААЛААСАлЛА 4020 , -
АССАДАСТТТ ТСАССАААТО ААТТАССТАС САТАТСТАТО ТОССССАСТО ААССТАСАСС 4аш80 « 20 САСТОСАТТСТ СТОСТТСбАС ТАТОСАСТСА АТТАСАСССС СССАСАбСАС ТСТТАТОАСТ 4140 2 с ССАСААСОСАС ТСААТАААСО СТТТСАТААА АААССОСТТС ААТТТТТСАА АТАТАТТТТТ 4206 ня ТСТОСАТТАТ ССААААСТАА АСТТТСТААА АСАТСАСССА ТТТСААСТОС АССАСТСАСС 4260 ТАТТТТСААС СААТОССТАТ ТТТАСАТОСС АССАТТТТСС ААСТАССОАА АСАТТТАССА . 4320 ь САТОТАТАТС СТОСОТСАСС ТОСТТОТОСА САААСТОСАС - 4360 (ее) - /2/ Информация о последовательности 1Д Мо2: (І) Характеристика последовательности: о /А/ Длина: 3474 комплементарньх пар ї» /В/ Тип: нуклеиновая кислота /С/ Цепочечность: одноцепочечная /Д/ Топология: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: ДНК (П)Гипотетическая: да
Ф) (Ім) Антисмьісловая: нет ка (м) Источник: /А/ Организм: Оптимизированньй относительно чистой кукурузь! синтетический ген сгуІА/в/ ВІ 60 Описание последовательности: последовательность 1Д Мог2: б5
АТССАСААСА АССССААСАТ СААССАСТСС АТССОСТАСА АСТОССТСАС СААСССССАС бо
СТССАССТСС ТССССОСССА ССССАТССАС АСССОСТАСА СССССАТССА САТСАСССТО 120
АБОСТСАССС АСТТОСТОСТ САСССАСТТС стТососсссо сососттост сстососсто 180
СТССАСАТСА ТСТОСООСАТ СТТССОССОС АСССАСТОСС АССССТТОСТ ССТОСАСАТС 240
САССАССТСА ТСААССАССС САТССАССАС ТТСССССОСА АССАССССАТ САСССОССТО 300 70 сАБОСОСТСА ССААССТСТА ССАСАТСТАС ССССАСАССТ ТОСОССАСТО ССАСССССАС зво
СССАССААСС ССбСССТОСС ССАССАСАТО СОСАТССАСТ ТСААССАСАТ СААСАССССС 420
СТСАССАССС ССАТСССССТ СТТСОСССТО САСААСТАСС АССТСССССТ ССТСАСССТо 480 7 тАССТОСАСС СССССААССТ ССАССТСАСС СТОСТОСССС АССТСАСССТ СТТСССССАС 540
СССТСССОСТ ТССАСОССОС САССАТСААС АСССОСТАСА АССАССТСАС ССОССТОАТС 6оо
СССААСТАСА СССАССАСОС СОТОСОСТОС ТАСААСАССС СоСтТосАссс ССстостоссос 66о 77 есосАСАССС СССАСТОСАТ СОССТАСААС САСТТССССС СССАССТСАС ССТСАСССТЄ 729 "СТОСАСАТСС ТСАСССТСТІ ССССААСТАС САСАСССССА ССТАССССАТ ССССАСССТС 780 р АЯССАССТСА СССОССАСАТ СТАСАССААС ССССТОСТОС АСЛАСТТССА ССССАССТТС 840 с
СССОССАССС СССАССОСАТ ССАССССАСС АТССССАССС СССАССТСАТ ССАСАТССТо 900 о
МАСАССАТСА ССАТСТАСАС ССАСССССАС ССССОССАСТ АСТАСТОСАС СССССАССАС 960 « о - со « «
З с ;»
Сг» со шк о 50 «г» (Ф. тю бо б5 -БА-
АТСАТСОССА ССССССТОбо СТТСАССССС ССССАСТТСА ССТТССОССТ СТАССССАСС 1020
АТОСССААСО СССССССССА ССАСОССАТС СТОбСССАСС ТОССССАССС ССТСТАСССС 1080
АСССТСАССА ССАСССТСТА ССОССОСССС ТТСААСАТСС ССАТСААСАА ССАССАССТО 1140
АСССТОСТОС АССССАСССА СТТОСССТАС СССАССАССА ССААССТОСС САССОСССТО 1200
ТАССОСААСА ССОССАСССТ ССАСАСССТО САССАСАТОС ССССССАСАЛ СЛАСААССТО 1260 70 сссссссосс АСООСТТСАС ССАСССОСТЄ АСССАССТСА ССАТСТТССО САССбОСТТС 1320
АССААСАССА СССТСАССАТ САТОСССОСС СССАТСТТСА ССТССАТССА ССбСАССССС 01380
САСТТСААСА АСАТСАТССС САССАСССАС АТСАСССАСА ТСССССТСАС СААСАССАСС 1440 7 ААССТОбОСА СССССАССАС ССТОСТСААС ОбСССОСССТ ТСАССОбСОС ССАСАТОСТО 1500
ССССССАССА ССССССОССА САТСАССАСС СТОССССТСА АСАТСАССОС СССССТбАСС 01560
САССОСТАСС СССТОСССАТ ССОСТАСОСС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАЄС 1620 77 АТОбАСОССС СССССАТСАА ССАСОССАЛС ТТСАССОССА ССАТСАССАЄ СОССАЄСААС 1620
СТОСАСАССС ССАССТТССС САСССТООСС ТТСАССАССС ССТТСААСТТ САССААСССС 1740 ри МОСМОССТЄТ ТСАСССТСАЄ СОСССАССТО ТТСААСАССО ССАЛССАСОТ СТАСАТССАСЄ 1800 сч
СОСАТССАСТ ТССТОССССС СбАССТСАСС ТТССАССССС АСТАССАССТ ССАССоСССС 01860 о
САСААСОССС ТСЛАССАССТ СТТСАССАСС АССААССАСА ТОССССТСАА САСССАССТО 1920 зр МСССАСТАСС АСАТССАССА ССТСАССААС СТОСТОСАСТ СССТСАСССА ССАСТТСТОС 1980 5
СТОСАССАСА АСААССАССТ САСССАСААС СТСЛАССАСС ССААСССССТ САСССАССАЄ 2040
СССААССТСС ТССАССАССС СААСТТССОС СССАТСААСС СССАССТОСА ССССбсоСТосС 02100 ю з СбССССАССА СССАСАТСАС САТОСАССОС СОССАССАСС ТСТТСААССА СААСТАССТО 2160 «
АСССТССТСС ССАССТТОСА ССАСТОСТАС СССАССТАСС ТСТАССАСАА САТССАССАЄ 2220
АССАЛССТСА АССССТАСАС ССОСТАССАЄ СТОССССОСТ АСАТССАССА САСССАССАС 223 « у) СТОСАСАТСТ АССТСАТСОС СТАСААСССС ААССАССАСА СССТСААССТ.СССССоСАСС 02340 з с СбСАСССТСТ ССССССТСАЄ СОСССССАСС СССАТСОССА АСТОСССССА ССАСАСССАС 2400 і САСТТСАССС ТОСАСАТССА ССТОСОСТОС АСССАССТСА АССАССАССТ Собсстстоб 02460 75 СТСАТСТТСА АСАТСААСАС ССАССАССОС САСССССССС ТОСОСААССТ ССАСТТССТО 2520 й САССАСААСС СССТОСТОСо ССАСССССТО СССССССТСА АССОСССССА СААСААСТОС 2580 шк о 50
Я» (Ф. юю бо б5
СОССАСААСС ССбАСААОСТ ОБАСТОбСАС АССААСАТСО ТОТАСААССА СОССААССАС 2640
АбСоТоСАСо СССТОТТОССТ СААСАСССАС ТАССАССОСС ТОСАСОСССА САССААСАТС 2700 9 СССАТСАТСС АСОССОСССА СААССОССТО САСАССАТСС СССАСОоССТА ССТоССССАСс 2760
СТОАОСОТОА ТоСССбОССТ СААСбССоСС АТСТТСОАСОо АоСТобАСоС ССССАТСТТС 2820
АСССССТТСА ОССТОТАССА СОСССОСААС СТСАТСААСА АССОССАСТТ СААСААСсСоС 2880 1
СТСАССТОСТ ОбААССТОАА СООССАССТО бАССТОСАСО АССАСААСАА ССАССССАбС 2940 сТОоСтТостТос ТОСССбАСТО ССАбоСССАС СТСАбССАСо достососстТ стосссссос 3000
СОСООСТАСА ТССТОСОССТ САССОССТАС АЛАССАССОСТ АСобССсАСос СТОоССтТосдес 3060
АТССАССАСА ТССАСАЛАСАА САСССАССАб СТОААСТТСА бСААСТОССТ ССАССАССАС 3120
СТОТАССССА АСААСАСССТ САССТОСААС САСТАСАССС ССАСССАССА ССАСТАССАС 3180
СОСАССТАСА ССАБССОСАА ССССООСТАС САССОСОССТ АССАСАССАА САССАСССТо 3240
СССОСССАСТ АССССАбСОС СТАСОАССАС ААСОССТАСА СССАСОбССС ССОССАСААС 3300
СССТОССАСА ССААССССбОо СТАСБОССАС ТАСАСССССС ТоСССбСССб СТАССТСАСС 3360 в ААБСАССТОб АСТАСТТССС ССАСАСССАС ААССТОТОСА ТОСАСАТСОС СОАСАСССАС 3420 сч (8)
СОСАССТТСА ТОСТОСАСАС СОТОСАССТо СТОСТСАТОб АССАСТАСТА САТ 3474 /2/ Информация о последовательности 1Д Моз: (І) Характеристики последовательности: « /А/ Длина: 1961 комплементарная пара 3о /В/ Тип: нуклеийновая кислота (ав) /С/ Цепочечность: одноцепочечная - /Д/ Топология: линейная (І) Тип молекуль!: ДНК (ее) (І) Гипотетическая: нет (Ім) Антисмьісловая: нет З (м) Источник: /А/ Организм: укороченньій синтетический оптимизированньй относительно кукурузь ген сгуІА/в/ ВІ (ХхІ) Описание последовательности: последовательность 1Д Моз: « дю САТССААСАА ТОБАСААСАА ССССААСАТС ААССАСТОСА ТОСССТАСАА СТОоССТодоС 60 -о с ;» щ» (ее) - о 50 с»
Ф) іме) 60 б5 -58в-
ААСССССАСо ТОбАбСТоСТ ОббОСОССАС СОСАТОСАБА ССБОСТАСАС ССССАТОССАС 120
АТСАСССТОА СССТОАСССА СТТОСТоСТо АбСбАСТТоо тоСссобсСосС сбосттосто 180 стоббостТоС ТОСАСАТСАТ СТОСООСАТС ТТССОССССА СССАСТООСА соссттосто 240
СТОСАСАТСС АССАССТСАТ СААССАССОС АТССАССАСТ ТОССССССАА ССАССССАТС - 300
АбСсСССсСтТоб АОООССТСАС СААССТОТАС СААЛАТСТАСС ССбАСАССТТ ССОССАСТОоС 36 70 вАБОСССАСС ССАССААССС СССССТОСОС САССАСАТОС ССАТССАСТТ СААССАСАТо 420
ААСАССоССС ТОАССАССОС САТСССССТОо ТІСОСССТОС АСААСТАССА ссТОосССсСстТо 480
СТОАССсТоТ АСОТОСАбоС СОССААССТО САССТСАбСС ТОСТоСОСбА ССТСАСССТо 540 2 ттсооссАСС ССТОСООСТТ ССАССССОСС АССАТСААСА СССОСТАСАА ССАССТСАСС 600
СОССТОАТСО ОСААСТАСАС ССАССАСОоСС СТОСОСТОСТ АСААСАССбб ССТОбАбСОС 660 бтІСтТобОосТо ССОАСАбССб ССАСТОСАТС АССТАСААСС АСТТССОоССО ССАбСТОАСС 720 7 СТСАСССТОС ТОбАСАТССТ САбССТОТТС СССААСТАСС АСАБССОСАС СТАССССАТС 782809
СОСАСССОТОА ОССАССТОАС ССОССАСАТТ ТАСАССААСС СССТОСТОСА СААСТТОбАС 840 зв бОСАССТТОСС бСбОСАССбС ССАСОССАТОС САСОбСАССА ТОСОСАСССС ССАССТСАТО 900 с
САСАТССТОСА АСАССАТСАС САТСТАСАСС САСССССАСС ОСбОССАСТА СТАСТобАСС 960 о
СОССАССАСА ТСАТОСССАС СОСССТОСоС ТТСАСССОСС СССАСТТСАС СстТтсссссто 1020 зо ТАССССАССА ТОСОСААСОС ТОСАССТСАС САССОСАТСо ТОбСАСАбСТ СОСССАСОСА 1080 5
СТОТАССОСА СССТОАССАС САСССТОТАС ССТССАССТТ ТСААСАТСОб САТСААСААС 1140
САССАССТОА ССОТОСТОСА СООСАСССАС ТТСОССТАСО ССАССАССАС СААССТОоСеС 1200 ю з5 МОСбССоТСТ АССОСААСАС СОССАСССТО САСАСССТОС АССАСАТССС СССТСАСААС 1260 «
ААСААССТОС САССТОСАСА СбОСТТСАСС САСССТСТСА СССАССТСАС САТСТТоСОоС 1320
АСТООСТТСА ОСЛАСАОСАС СОТОАССАТС АТСССТОСАС СТАТСТТСАС СТОСАТТСАС 1-20 « СОСАСТОССб АСТТСААСАА САТСАТССОС АбСАСССАСА ТСАСССАСАТ СССССТСАСС 1440 -о - ААСАССАССА АССТОбССАС ССбСАССАСС СТОСТСААСо бСССсСоСстт САСсссссСС 1500 що САСАТОСТОС бССбСАССАС СССССБОССАб АТСАССАССС ТоССССТоАА САТСАСсосС 1560 ССССТОАбСС АССОСТАССо ССТССбСАТО СССТАССССА бСАССАССАА ССТОСАСТТС 001620 й САСАССАССА ТССАСбОССО ССССАТСААС САССОСААСТ ТСАСССССАС САТСАССАСС . 1680 - СОСЬОСААСС ТОСАСАСССОо САССТІССОС АСССТОСОСТ ТСАССАСССС СТТСААСТТС 1740
Ф 9 АбсСвАСОССА ССАСССТСТТ САСССТСАСС ССССАССТСТ ТСААСАСССС СААССАССТС 1800
Т» ТАСАТССАСС ОСАТОСАСТТ СоТбСССоСС бАОСТСАССТ ТССАбССССА СТАССАССТО 1860
САСАССОСТО АСААбОСОСТ СААССАССТОо ТІСАССАССА ССААССАСАТ СООССТоААС 1920 о щі "АСССАСОТСА СССАСТАССА САТОСАТСАб СТСТАбСАСС т 1961 /2І.Мнформация о последовательности 1Д Мо 4: іме) (І) Характеристики последовательности: /А/ Длина: 3508 комплементарньх пар 60 /В/ Тип: нуклеийновая кислота /С/ Цепочечность: одноцепочечная /Д/ Топология: линейная (ІЇ) Тип молекуль!: ДНК (Ім) Антисмьіслояая: нет 65 (м) Источник: /А/ Ооганизм: полноразмерньй синтетический оптимизированньй относительно кукурузь! ген СтуІА/в/ ВІ
(хі) Описание последовательности: последовательность 1Д Мо 4: й
САТССААСАА ТОСАСААСАА ССССААСАТС ААССАСТОСА ТССССТАСАА СТІбССТОАСС 60
ААСССССАОС ТОбАСсТОоСТ ОбОСбОСОАС СОСАТОСАбА ССбОСТАСАС ССССАТОСАС 120
АТСАСССТОА СССТСАСССА СТІССТОСТо АСССАСТТСб тТоССссбоСосС соосттоото 180
СТОобОССТбо ТОБАСАТСАТ СТОббОСАТС ТТІСббОСССА ОССАСТООСА СОССТТОСТо 240 70 СТОСАСАТОСС АССАССТОАТ СААССАбСОС АТССАСбСАСТ ТОбСССбСАА ССАСОССАТС 300
АСССбССТоо АССОССТОАС СААССТОТАС САААТСТАСС ССбАСАССТТ ССоСбАСТоб 360
САБССССАСС ССАССААССС СОСОСТОСОС САССАСАТОС ССАТССАСТІ СААССАСАТО 420 /у5 ААСАССОССС ТСАССАССОС САТОССОСТО ТТСОСССТОС АСААСТАССА сстососсто 480
СТСАСССТСТ АССТОСАССС СОССААССТО САССТСАССС ТОСТОСбССА ССТСАСССТо 540
ТТОССССАСС ССТСОСОСТТ ССАСОССОСС АССАТСАВСА СССОСТАСАА ССАССТоАСС 600 СОССтТОАТоСо ССААСТАСАС ССАССАСССС СТССОСТОСТ АСААСАСОСС ССТоСАСССС 660
СТоТоООбТС ССбАСАбССС ССАСТОСАТС АБСТАСААСС АСТТССоССо СОАОСТоАСС 120 с о - о «- г) - « - с ;» т» (ог) - о 50 «з» (Ф, ко 60 б5
СТОАСССТОоС ТОбАСАТСОСТ САбССТОТТС СССААСТАССо АСАСССбСАС СТАССССАТС 780
СОСАСССТСА СССАССТСАС ССОССАСАТТ ТАСАССААСС СССТОСТОСА СААСТТССАС 840
СбСАССТТОС бСОбСАСССС ССАССССАТС САССССАССА ТОСССАСССС ССАССТСАТС 900
САСАТССТСА АСАССАТСАС САТСТАСАСС САСССССАСС бСОбССАСТА СТАСТОСАЄС 960
СОССАССАСА ТСАТССССАС СССССТССбСС ТТСАСССОСС СССАСТТСАС сттсссссто 1020 0 ТАССОСАССА ТОСССААССС ТОСАССТСАЄ САССОСАТСС ТСССАСАССТ СбОССАСССА 1080
СТСТАССОСА СССТСАССАС САСССТОТАС ССТОСАССТТ ТСААСАТССО САТСААСААС 1140
САССАССТСА СССТОСТССА ССССАСССАС ТТССССТАСС ССАССАбСАС СААССТоССС 01200 з АССоСССТоТ АССОСААСАб ССОСАССОТО САСАСССТОб АСбАСАТССС СССТСАБААС 1260
ААСААССТОС САССТОСАСА ОСОСТТСАбС САСССТСТСА бССАССТОАС САТоТТсСос 1320
АСТОССТТСА ССААСАССАС ССТСАССАТС АТОССТОСАС СТАТСТТСАС СТОСАТТСАС 1380 77 сосстоссо АСТТСААСАА САТСАТОСОС АССАСССАСА ТСАСССАСАТ СССССТСАСС 1440
ААСАССАССА АССТОСССАС ССССАССАСС СТОСТСААбС СССССобСтТтТ САСССССсбсС 01500 р9в ЗАСАТССТОС СССОСАССАЄ СССССОССАС АТСАССАССС ТОСОССТСАА САТСАСССОС 1560 о,
ССССТСАССС АССОСТАСССО ССТССССАТС СОСТАСОССА ССАССАССАА ССТОСАСТТС 1620
САСАССАССА ТССАСССССС ССОСАТСААС САССССААСТ ТСАСССССАС САТСАССАбЄС 1680 зо БОСАССААСС ТОСАСАСССС САССТТОССС АСССТОСОСТ ТСАССАСССС СТТСААСТТС 1740 З
АССААССССА ССАСССТСТТ САСССТСАСС ССССАССТСТ ТСААСАСССС СААССАССТо 1800 о
ТАСАТССАСС ССАТССАСТТ ССТОСССОСС САССТСАССТ ТОСАСССССА СТАССАССТо 1860 ю з5 ЗАСАССОСТС АСААСССССТ СААССАССТО ТТСАССАССА ССААССАСАТ СОСССТСААС 1920 «
АСССАССТСА СССАСТАССА САТССАТСАЄ СТСАССААСС ТОСТОСАСТО ССТСАСССАС 1980
САСТТСТОСС ТССАССАСАА СААССАССТО АСССАСААСС ТСААССАСОС СЛАСССССТ 25 « АСССАССАСС ССААССТОСТ ССАССАСССС ААСТТССОСС ССАТСААССО ССАССТОСАС 2100 2 - ССССССТоСС ССОБСАССАС ССАСАТСАСС АТССАСОССС СССАССАССТ СТТСААССАЄ 2160
ААСТАССТСА СССТОСТОСС САССТТССАС САСТОСТАСС ССАССТАССТ СТАССАСААС 2220 в.о МТССАССАСА ОСАЛАССТСАА СОССТАСАСЯ СССТАССАЄС ТОССССССТА САТССАССАС 2280 со АСССАССАСС ТОСАСАТСТА ССТСАТСССС ТАСААССССА АССАССАСАС ССТСААСоТС 02340 шк о 50
Я» (Ф. юю бо б5
ССсСССсАССо бСАСССТоТОо ОССССТОАбС ССССССАбСС ССАТоСоСАА сТОоСбСССАС 2400
САСАСССАСС АСТТСАСССТ ОбАСАТССАС СТОбОСТОСА ССбАССТСАА СбБАббАССТО 2460
СОоСОоТоТооо ТОАТСТТСАА САТСААСАСС САбСАСОобСС АСоССССССТ СбОСААССТо 2520
САСТТССТОб АССАБААССС ССТОоСТобОоС бАбОоССсСТоо ССССССТоАА ССОСоССсАС 2580
ААСААСТОССС ССбАСАдДОСо ССАСААССТО САСТООСАСА ССААСАТССТ СТАСААССАС 2640
СССААССАСА ОССТОбАСОС ССТСТТССТо ААСАСССАСТ АССАССОССТ ССАбоСССАС 2700
АССААСАТСО ССАТСАТССА СоССОСССАС ААССОССТОоС АСАССАТТСО СБАСОССТАС 2760
СТОСССбАСС ТОАСбССТОАТ ССССбОССТо ААСОССОССА ТСТТССАбСА ССТобАСооС 2820 то СССАТСТТІСА ССбССТТСАС ССТОТАССАС ССССбСААСС ТСАТСАДСАА СООССАСТТС 2880
ААСААСОСОСС ТОАОСТОСТо СААССТСААС СОССАССТОоС АССТОСАССА ССАСААСААС 2940
САССоСАССо ТОоСТОСТОСТ ОССССАСТоо бАБОСССАСО ТОАбССАССА ссТоСоСссТо 3000 й тосСсссоосс ССООСТАСАТ ССТОСОСоТо АССОССТАСА АССАСОССТА СооСсоАсобс 3060
ТОСОТОАССА ТОСАСбАСАТ ССАСААСААС АСССАССАСС ТСААСТТСАС СААСТОоССТо 3120
САССАССАСсС ТОТАССССАА СААСАСССТО АССТОСААСО АСТАСАССбС САСССАССАС 3180 с
САСТАССАСо ССАССТАСАС САСССбСААС СОСООСТАСО АСОбСОССТА СБАБАССААС 3240 о
АбСАоСстТОоС ССОССбАСТА СОССАбСОСС ТАСбАСбАСА АСОССТАСАС ССАСобссос 3300 зо СБССАСААСС ССТОССАСАС СААССОСОСС ТАССОССАСТ АСАСССССсСтТ бсссооссоос 3360 т «в)
ТАССТСАССА АССАбСТОбА СТАСТІСССС САБАСССАСА АССТСТОСАТ ССАСАТобоС 3420 «-
САСАСССАСо ССАССТТСАТ ССТОСАСАСС СТОСАССТОС ТОСТСАТОСА СбАСТАСТАС 3480 со
АТОТОАТАСТ АССТАДОСТС САбСАТСТ й 3508 « /2/ Информация о последовательности 1Д Моб: (І) Характеристики последовательности: /А/ Длина: 1845 комплементарньх пар /В/ Тип: нуклеийновая кислота « /С/ Цепочечность: одноцепочечная з с /Д/ Топология: линейная . (ІЇ) Тип молекуль!: ДИК и?» (Ім) Антисмьісловая: нет (м) Источник: /А/ Организм: укороченньй синтетически ген ВІ /Регіак еї аї!./ їх (хі) Описание последовательности: последовательность 1Д Моб: (ее) - о 50 с»
Ф) іме) 60 б5
АТОСАСААСА АСССАЛАСАТ СААССААТОС АТТССАТАСА АСТОСТТОАС ТААСССАСАА 60
СТТСААСТАС ТТОСТОСАСА АСОСАТТСАА АССОСТТАСА СТСССАТОСА САТСТОоСТТо 120 9 ТССТТСАСАС АСТТТСТОСТ САОСОАСТТС СТОССАбСТо СТОобОТТОСТ ТСТСббАСТА 180
СТІСАСАТСА ТСТООООТАТ СТТТОСТССА ТСТСААТОСО АТОСАТТОССТ ОСТОСАААТТ 240
САССАСТТСА ТСААССАСАС САТССААСАС ТТСбССАСбА АССАСОССАТ СТСТАОСТТо 300 7 ААССАТТСА ССААТСТСТА ССАЛАТСТАТ ССАСАСАССТ ТСАСАСАСТО ССААССССАТ 360
ССТАСТААСС САОСТСТОСо СОАССАААТО ССТАТІСААТ ТСААССАСАТ СААСАССоСС 420
ТТБАССАСАС СТАТСССАТТ СТТОССАСТОС САбААСТАСС ААСТТССТСТ сттІСсТоССсТто 480
ТАССТТСААб САОСТААТСТ ТСАССТОАОС СТОСТІССАб АССТТАСССТ СТІТОСССАА 540
АССТОООСАТ ТОСАТОСТОС ААССАТСААТ АбСССТТАСА АССАССТТАС ТАСССТОАТТ 60.
ССАААСТАСА ССБАССАСОС ТОТТССТТОС ТАСААСАСТО ССТТобАСсСо тТотостТосесст 660
ССТСАТТСТА САСАТТОСАТ ТАСАТАСААС САСТТСАССА САСААТТСАС ССТСАСАСТТ 120
ТТОСАСАТТо ТОТСТСТСТТ ССССААСТАТ САСТССАСАА ССТАСССТАТ СССТАСАСТо 780 дв ТСССААСТТА ССАСАСАААТ СТАТАСТААС ССАСТІСТТО АСААСТТССА СССТАССТТС 840 сч
СоТОоСТТСТо СССАДОСТАТ СбААбОСТОС АТСАССАССС САСАСТТСАТ ССАСАТСТТо 300 о
ААСАССАТАА СТАТСТАСАС ССАТОСТСАС АСАССАСАСТ АТТАСТОСТС ТОСАСАССАС 960 зо АТСАТОбССТ СТОСАСТІОС АТТСАССОСС ССОСАСТТТА ССТТТОСТСТ СТАТОСААСТ 1020 М «в)
АТОССАААСо ССОСТССАСА АСААССТАТС СТТОСТСААС ТАССТСАбОС ТОТСТАСАСА 1080 «-
АССТТСТСТТ ССАССТТСТА САСААСАССС ТТСААТАТСб СТАТСААСАА ССАССААСТТ 11 со
ТСССТТСТТо АСОСААСАСА СТІСОССТАТ ССААССТСТТ СТААСТТОСС АТеСоСТеТТ 1200 «
ТАСАСАААСА ССССААСССТ ТСАТТССТТО САССАААТОС САССАСАСАА СААСААТОТо 1260
ССАСССАССС ААССАТТСТО ССАСАССТТО АбССАССТСТ ССАТОТТССо ТТССССАТТС 1320 « 70 ВОСВАСАСТТ СССТОАССАТ САТСАСАОСТ ССТАТСТТСТ САТССАТТСА ТОСТАСТОСТ 1380 - с САСТІСААСА АТАТСАТІСС ТТССТСТСАА АТСАСССААА ТСССАТТСАС СААСТСТАСТ 1440 2» '
ААССТТОСАТ СТОбААСТТС ТОТССТОААА бСАССАбОСТ ТСАСАССАСС ТОАТАТТСТТ 1500 АСААСААСТТ СТОСТОООСА САТТАССАСС СТСАСАСТТА АСАТСАСТОС АССАСТТТСТ 1560 е САААСАТАТС СТСТСАССАТ ТССТТАСССА ТСТАССАСТА АСТТОСААТТ ССАСАССТоС 1620 (ее)
АТССАСССАА СОССТАТСАА ТСАСОСТААС ТІСТССОСАА ССАТСТСААС СОССАССААС 1680 - о 50 ТТОСААТССо ССАССТТСАС ААСССТСОСТ ТТСАСТАСТС СТТТСААСТТ СТСТААСОбА 1740
І» ТЄААССоТТТ ТСАСОСТТАС СОСТСАТСТО ТТСААТТСТо ССААТСААСТ СТАСАТТСАС 1800
ССТАТІСАСТ ТТСТОССТОС СбААСТТАСС ТТССАбОСТо АСТАС 1845
Подписи к рисункам:
У
Фис.23Е - Зкспрессия гена сгуЇїА/в/ в тоансгенную кукурузу, используя преимущественно сердцевинньй
ГФ) промотор) 7 Образцьї листьев небольших проростков, трансформированньїх РС184433 при использованиий методик, описанньїх в другом месте, біли проанализированньї на присутствие белка сгуЇА/в/, используя анализ ЕП ІЗА.
Бьіло обнаружено, что все растения, зкспрессирующие сгуїА/в/, являются инсектицидньми в стандартной 60 биопробе на Европейского зернового точильщика.
Следует ответить, что преиймущественно сердцевинньй промотор имеет низкий, но обнаруживаемьй уровень зкспрессии в ткань листа кукурузь. Обнаружение белка сгуіА/в/ согласуется с таким характером зкспрессии.
Фиг.24. 65 Полная последовательность кукурузного гена ТгрА, с нитронами и зкзонами, начала транскрипции и трансляции, начало и остановка ДНК.
Ф - начало и конец кКДНК; 41 - начало транскрипции; 730000х - праймер расширения праймера; Ї - начало трансляции; -- - терминирующий кодон; т ССААТ бокс, ТАТАА бокс, поли А дополнительньй сайт.
Подчеркнутье последовательности с проставленньім над ними Мо являются праймерами РОК
Фиг.25А - нозерн-блот, показььівающий различную зкспрессию гена ТгтрА в ткани кукурузьі. Двухчасовая зкспозиция на пленку при температуре -802С с использованием усиливающих зкранов Диропі Стопех
Фиг.258 - нозерн-блот, показьівающий различную зкспрессию гена ТрА в ткани кукурузьі. Четьірехчасовая зкспозиция на пленку при температуре -807"С с использованием усиливающих зкранов фирмь! Диропі Стопех.
Фиг.25С - нозеон-блот, показьівающий различную зкспрессию гена ТгрА и ткани кукурузьі. 18-часовая зкспозиция на пленку при температуре -807"С с использованием усиливающих зкранов фирмь! Диропі Стопех.
Фиг.25Д - нозерен-блот, показьівающий различную зкспрессию гена ТгрА я ткани кукурузьі. 48-часовая зкспозиция на пленку при температуре -802С с использованием усиливающих зкранов фирмь! Диропі Стопехю
Фиг.26 - нозерн-блот, показьівающий зкспрессию кукурузного гена ТгрА в лист и сердцевину линии Фанка 15...211Д и 5М984 и отсутствие зкспрессии в общую РНК семени линии 211Д. 65-Часовая зкспозиция на пленку при температуре -802С с использованием усиливающих зкоанов Фирмь! Диропі Стопех.
Фиг.27 - геномньйй саузен линии Фанка 211Д, зондированной ТгрА кДНК 8 - 2. 120-ч-асовая зкспозиция на пленку при температуре -80 «С с использованием усиливающих зкранов фирмь!
Диропі Стопех.
Фиг.28А - расширение праймера, показьівающее начало транскрипции гена ТгрА и секвенирующий лзддер. 1-ч-асопая зкспозиция на пленку при температуре -80 «С с использованием усиливающих зкранов фирмь!
Диропі Стопех.
Фиг.288 - защита от РНкКазь на участке от ї 2бр до ї 387рр при трех температурах гибридизации. 16-часовая зкспозиция на пленку при температуре -80"С с использованием усиливающих зкранов фирмь! с
Диропі Стопех. Го)

Claims (1)

  1. Формула винаходу
    «
    1. Фрагмент ДНК, содержащий кодирующую инсектицидньй протейн последовательность, (7у оптимизированную для кукурузьї, где указанная последовательность содержит по меньшей мере 9090 последовательности, оптимизированной для кукурузь!, вьібранной из группьї, включающей -- ЗБОЮ МО:2 со « -
    с . и? щ» (ее) - г ШИ с» іме) 60 б5
    АТОСАСААСА АССОСЛАСАТ СЛАССАСТОС АТССССТАСА АСТСССТСАС СААССССОАС во СТОСАССТОС ТССОСССССА ССССАТОСАС АССОССТАСА СССССАТССА САТСАСССТС 120 АСССТСАССС АСТТССТОСТ САСССАСТТС Сстосссоссо ссобсттост сстобоссто 180 СТОСАСАТСА ТСТССОССАТ СТТССССССС АСССАСТОСС АСОССТТССТ ССТОСАСАТС 240 САССАССТСА ТСААССАССС САТССАССАЄ ТТСССССССА АССАССССАТ САСССоССТО» 300 САСОСССТСА ССААССТСТА ССАСАТСТАС ССССАСАССТ ТССОССАСТО ССАСССССАС 360 )0 ССсАССААСС ССбСССТЄСС СПАССАСАТО СОСАТОСАСТ ТСААССАСАТ СЛАСЛССОСС 420 СТСАССАССС ССАТСССССТ СТТССОССТО САСААСТАСС АССТСССССТ ССТСАСССТо 480 -ТАССТССАСО ССОССААССТ ССАССТОАСС СТоСТоСОСо АССТСАССсТ сттсссссМ 540 СоСТОСоССТ ТССАССССОС САССАТСААС АСССОСТАСА АССАССТСАС ССОССТСАТС 600 у5 ЗБСААСТАСА СССАССАСОС ССТСОССТоС ТАСААСАССЯ боСТобАССо Сстотоосос 66о ССССАСАССС СССАСТССАТ ССОСТАСААС САСТТССОСС СССАССТСАС ССТСАСССТо 720 СТОСАСАТСС ТСАСССТСТТ ССССААСТАС САСАСССОСА ССТАССССАТ ССОСАСССТО тво АСССАССТСА ССССОСАСАТ СТАСАССААС ССССТССТОС АСААСТІССА СОССАССТІС 840 СОСОБСАССС СССАССССАТ ССАССОСАСС АТССССАССС СССАССТСАТ ССАСАТОСТО 900 МАСАССАТСА ССАТСТАСАС ССАСССССАС СОСОСОСАСТ АСТАСТОСАЄ СОСССАССАС 60 АТСАТСОССА ССССССТОСС СТТСАСОСОС СОССАСТІТСА ССТТСССССТ СТАССССАСС 1020 АТССбСААСС ССбССССССА ССАбСОСАТС СТОбСССАСС ТоСбССАСОС СоТсТАССОС 1080 сч АСССТСАССА ССАСССТОТА ССОССОСССС ТТСААСАТСО ССАТСААСЛА ССАССАССТО 1140 о АСССТОСТОС АССССАСССА СТТССССТАС бОСАССАССА ССААССТОСС САССоСССТо 1200 ТАССбСААСА СССССАСССТ ССАСАСССТО САССАСАТСС ССОСССАСЛА СЛАСААССТО 1250 СссссссбСс АСОССТІСАС ССАСССССТО АСССАССТОА ССАТСТІССо САбССОСТТС 1320 «г ВбсААСАБСА СССТСАССАТ САТСОССССС СССАТСТТСА ССТОСАТССА ССОСАССОСС 1380 о САСТТСААСА АСАТСАТССС САССАСССАС АТСАСССАСА ТОССССТСАС СЛАСАССАСС 1440 ААССТОСССА бСбССАССАС ССТОСТСЛАС бОСССССОСТ ТСАССОСССо ССАСАТОСТо 1500 т СОССОСАССА бССССОСССА САТСАССАСС СТОСОССТСА АСАТСАСССС СССССТСАСС 1550 со 30 сАбСОСТАСС СССТОСОСАТ ССССТАСОСС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАСС 1620 « АТССАССОСС СССССАТСАА ССАСООСААС ТТСАССОССА ССАТСАССАС ССССАССААС 1680 СТОСАСАССС ССАССТТССО САССОТОСОС ТІСАССАССС ССТТСААСТІ САССААСОСС 1740 АбСАСССТСТ ТСАСССТСАС СССОСАССТО ТТСААСАССО ССААССАССТ СТАСАТССАЄ 1800 « 70 сосАТСсАСТ ТССТОСССОС ССАССТСАСС ТТССАССССС АСТАССАССТ ССАССССССС 01860 в - САСААСОССС ТСЛАССАССТ СТТСАССАСС АССЛАССАСА ТСССССТСАА САСССАССТ 1920 -» АСССАСТАСС АСАТССАССА ССТСАССААС СТССТОСАСТ СССТСАбССА ССАСТТСТОС 1980 СТССАССАСА АСААССАССТ САСССАСААС СТСААССАСС ССААССОССТ САСССАССАЄ 2040 їз 45 обслАсстос ТосАОСАССС СААСТТОССС СОСАТСЛАСС сссАОСТОСА ссоссостос 2100 со СбСбОСАССА СССАСАТСАС САТССАСОСС бСССАССАСС ТОТТСААССА СААСТАССТо 2160 АСССТОСТОС ССАССТТССА ССАСТОСТАС СССАССТАСС ТОТАССАСАА САТССАССАЄ 2220 - АССААССТОА АССССТАСАС ССОСТАССАЄ СТОСССООСТ АСАТССЛОСА САСССАССАЄ 2200 ге ШИ СТОСАСАТСТ АССТСАТССС СТАСААСОСС АЛОСАССАСА СССТСААССТ.ССССобСАСС 02340 їз» СОСАСССТСТ СОССССТСАС СОСССССАСС СССАТСОССА АСТОСОСССА СЕАСАСССАС 2400, САСТТСАССС ТОСАСАТССА ССТОбОСТОС АСССАССТОА АССАССАССТ Собсстстоб 02460
    (Ф. ко бо б5
    СІСАТСТТСА АСАТСААСАС ССАССАСССС САСССССССС ТОСССАЛОСТ ССАСТТССТО 2520 САССАСААСС СССТОСТОСОо ССАСОСССТО СССССССТСА АССССССССА СААСЛАСТСоС 02580 ! СОССАСААСС СССАСААССТ ОбАСТоОСАб АССААСАТСС ТСТАСААССА СОССААСсСАС 2540 АСССТОСАСС СССТСТТССТ СААСАСССАЄ ТАССАССССС ТОСАСССССА САССАЛСАТС 2700 СССАТСАТСС АСОССОСССА СВАСССССТО САСАССАТСС СССАСОССТА ССТОСССсАС 2760 СТСАСССТСА ТССССССССТ СЛАССССОСС АТСТТССАСС АОСТОСАЄСС ССССАТСТТС 2820 /0 МССбССТТСА СССТСТАССА СССССОСААС СТСАТСАЛСА АСССССАСТТ СЛАСААСССС 2880 СТОАССТОСТ ССАЛССТОАА СССССАССТО САССТОСАСС АССАСЛАСАА ССАССОСАСС 2940 сТоСТоСТоС ТОССССАСТО ССАССССбАС СТСАСССАСС АСсТоСоСсотТ стоссссосс 03000 СбСоССТАСА ТОСТОССССТ САСССССТАС ААССАбСССТ АСССССАССС СТоСстТоАСС 003060 /5 МТССАССАСА ТССАСЛАСАА САСССАССАЄ СТЄААСТТСА ССАЛСТОССТ ССАССАЄСАС 3120 СТОТАССССА АСААСАСССТ САССТОСААС САСТАСАССС ССАСОСАССА ССАСТАССАС 3180 СОСАССТАСА ССАбССССАА ССОССССТАС САССССОССТ АССАСАССАА САССАСССТО 3240 СССОСССАСТ АСОССАССОС СТАССАССАС ААССССТАСА СССАСССССО СССССАСААС 3300 СССТОССАСА ССААСССССС СТАСбОССАС ТАСАСССССС ТоССССССоС СТАССТсАСС 3360 ААССАССТОС АСТАСТТССС ССАСАСССАС ААССТСТОСА ТССАСАТСОС ССАСАСССАЄ 3420 СОСАССТТСА ТССТОСАСАС ССТОСАССТО СТОСТСАТСС АССАСТАСТА САТ 3474 ЗЕО Ю МОЗ САТССААСАА ТССАСААСАА ССССААСАТС ААССАСТОСА ТССССТАСАА СТоССТОАСС бо с ААСССССАСС ТОССАСОТОСТ ССОССОССАЄ СОСАТССАСА ССОССТАЄАС ССССАТССАС 120 (о) АТСАСССТСА СССТСАСССА СТІССТОСТо АбОСАСТТСС Тосссбссос соосттосто 180 СТоСОССТоб ТОСАСАТСАТ СТОбОССАТС ТТОбОССССА СССАСТОССА СосСТІССТто 240 СТОСАСАТОС АССАОСТСАТ СААССАССОС АТССАССАСТ ТСССССССАЛ ССАбСССАТС 300 З АбССОССТоб АСОСССТОАС СЛАССТСТАС САААТСТАСС ССбАСАбСТТ СОбССАСТОС зво («в») САСССССАСС ССАССЛАССС СОСССТОСОС САССАСАТОС ССАТССАСТТ СААССАСАТО 420 «- ААСАССООССС ТСАССАССОС САТСССССТЄ ТТСОСОСТОС АСААСТАССА СсТоССССТо 480 со СТОАСССТСТ АССТССАСОС СОССААССТО САССТСАбСС ТОСТОСбССА ССТСАСССТо 540 тТТССОССАСС ССТОСООСТТ ССАССССОСС АССАТСААСА СССССТАСАЛ ССАССТСАСС во ч у СбоССТСАТСО ССЛАСТАСАС ССАССАСССС СТОСССТОСТ АСАЛСАССОС ССТОСАССОС во СТСТОбССТС СССАСАСССС ССАСТОСАТС АССТАСААСС АСТТСССССС ССАССТСАСС 120 « СТСАСССТОС ТОСАСАТОСТ САСССТСТТС СССААСТАСС АСАСССССАС СТАССССАТС 780 СОСАСССТСА СССАССТСАС СССССАСАТТ ТАСАССААСС СССТОСТОСА СЛАСТТССАС 840 не) с СОСАССТТСС СССОСАСССС ССАСОССАТС САССОСАОСА ТОССОСАСССС ССАССТСАТО 900 ;» САСАТССТСА АСАССАТСАС САТСТАСАСС САСССССАСС СССОССАСТА СТАСТОСАСС 960 СБССАССАСА ТСАТОСССАС СоСССТСооС ТТСАбСОоССС СССАСТТСАС СсттТоССССсто 1020 ТАСОССАССА ТОСССААСОС ТОСАССТСАС САССССАТОС. ТОбСАСАССТ СобССАСССА 001080 е СТСТАССОСА СССТСАССАС САСССТСТАС ССТССАССТТ ТСААСАТССС САТСЛАСААС 1140 со САССАССТСА СССТОСТОСА ССССАСССАС ТТСОССТАСО ССАССАССАС СЛАССТСССС 1200 - АССССССТСТ АССССААСАС ССОСАСССТО САСАСССТОСОАССАСАТССС СОСТСАСААС 1260 о ААСААССТОС САССТОСАСА ССОСТТСАСС САСССТСТСА бССАССТСАС САТОТТССоС 1320 І» АСТСССТТСА ОСААСАССАЄ ССТОАССАТС АТСССТОСАС СТАТСТТСАС СТОСАТТСАС 1380 СОСАСТОСССО АСТТСААСАА САТСАТСССС АССАСССАСА ТСАСССАСАТ СССССТСАСС аг й ДАСАССАССА АССТОСОСАС СООСАССАСС СТОСТсААоС СССССсоСтт САССоССобС 1500 САСАТССТОС СССССАССАС ССССОСССАб АТСАССАССС ТОССССТСАА САТСАССССС 1560
    (Ф. ССССТСАССС АССОСТАССС ССТССОСАТС СОСТАССССА бСАССАССАА сстосАСТТС 1520 їмо) САСАССАССА ТОСАСОСССС ССССАТСААС САССССААСТ ТСАСССССАС САТСАССАСС 1686 6О ОбСАССАЛСС ТОСАСАСССС САССТТССОС АСССТОСОСТ ТСАССАСССС СТТСААСТТС 1740 АССААССССА ССАСССТСТТ САСССТСАСС ССССАССТСТ ТСААСАбССС СААССАССТе 1800 ТАСАТССАСС ССАТСОСАСТТ ССТОСССбОС бАССТСАССТ ТОСАСССОСА СТАССАССТО 1860 САСАССОСТС АСААСОСССТ СЛАССАССТС ТТСАССАССА ССЛАССАСАТ СобССТоААб 1920 65 АСССАССТСА СССАСТАССА САТССАТСАС СТСТАССАСС т 1961 ЗЕО ІЮ МО4
    САТССААСАА ТОСАСААСАА ССССААСАТС ААССАСТОСА ТССССТАСАА СТоССТоАСС 60 ААСССССАСОо ТОСАССТОоСТ бОоСбоССАС СОСАТССАСА ССООСТАСАС ССССАТОСАС 120 АТСАСССТОСА вСстсАСосА сттостосто АбСсАсттос тоссссосос сбосттосто 180 СТобоССТоб ТОСАСАТСАТ СТОбОССАТС ТТСбОССССА бССАСтТобСА СбОСТТОоСТо 240 ОТОСАСАТСО АССАССТСАТ СААССАбСОС АТССАССАСТ ТСССССОСАА ССАбоССАТС 300 ИССоСсСтТоо АСОСССТСАб СААССТОТАС САААТСТАСо ССбАСАССТТ СобссАстТоо 360 70 САСОСССАСС ССАССААССС СОСССТОСОС бАССАСАТСС ОСАТССАСТТ СААССАСАТО 420 ААСАБСОССС ТОАССАССОС САТСССССТО ТТСОССоТОоС АСААСТАССА ОСТОоССССТОо 480 СТОАбССТоТ АССТОСАСоС СбССААДССТо САССТСАбСо ТОСТССОСбА СОТСАСССсТОо 540 ТТСббССсАСС ССТОоСооСтТтТ ССАСбССОСС АССАТСААСА СССОСТАСАА ССАССТОАСС 6О0 ССССТОАТСС бСААСТАСАС ССАССАСССС СТбСОСТОСТ АСААСАССоС ССтТоСАССоС 66о0 СТоТОоСОоСТС СССАСАбССО ССАСТОСАТО АССТАСААСС АСТТССоССо ССАССТоАСС 720 СТОАСССТОС ТОбАСАТССТ САбССТОТТС СССААСТАСО АСАбБССбСАС СТАССССАТО 7во СБСАСССТСА СССАССТОАС ССОСОАСАТТ ТАСАССААСС СССТОСТОСА СААСТТовАС 840 СбСАССТТСС ОССБСАСССС ССАССССАТС САбОССАССА ТССОСАбССС ССАССТСАТо 900 САСАТССТСА АСАССАТСАС САТСТАСАСС САСОСССАСС ССООССАСТА СТАСТОобАбС 960 СбССАССАСА ТСАТоСССАС СССССТобоС ТІСАбСоССС СССАСТТСАС СсттССССсто 1020 ТАСбССАССА ТССОСААССС ТОСАССТСАб САбСОСАТСС ТОбСАСАССТ ССбОССАСССА 1080 сеІ 29 СТСТАССОСА СССТСАБСАС САСССТОТАС СБТССАССТТ ТСААСАТОВО САТСААСААС 1140 Ге) САбСАССТСА ОСОТОСТОоСА СООСАСССАС ТТСОССТАСО ССАССАССАб СААССТоССС 1200 ДОСОСССТОТ АССОСААСАС СООСАССОТО САСАбССТОО АСбАСАТССС СССТСАБААС 1260 ААСААССТОС САССТОСАСА СООСТТСАбС САСССТСТОА СССАССТСАб САТстТТССоС 1320 - 3 АСТОССТТСА ССААСАССАС ССТСАССАТС АТСССТОСАС СТАТСТТСАС СТОбАТТСАС 1380 («в СБСАСТОССО АСТТСААСАА САТСАТСССС АбСАбССАСА ТСАСССАСАТ СССССТолСС 1440 ч ААСАбБСАССА деСстТобоСАС СобСАССАбС бтТостТоААСо оссСсоостІ САССобосбос 1500 с САСАТССТОС СССОСАССАС ССССбОССАС АТСАССАССС ТоСОССТСоАЛА САТСАССоСС 1550 Зо ССССтТоАССС АССОСТАССо СОТССОСАТО СбСТАСОССА ОСАССАССАА ССТоСАСТТС 1620 т САСАССАССА ТССАСоСССо ССССАТСААС САСОбСЛАСТ ТСАОСоССАС САТСАССАСС 1680 СОСАССААСС ТоСАСАбСОоо САбСТТССоС десотТосостТ ТСАССАСССС СТІСЛАСТТС 1740 « АОСААССОСА ССАСССТОТТ САСССТОАСС ССССАСОТОТ ТСААСАбСОб СААСоЛоСТОо 1800 2 с ТАСАТССАСС бСАТСбАСТТ СоТОоСССоСС САбСТСАССТ ТССАСООССА СТАССАССТо 1860 :з»
    с» (ее) шк о 50 Я»
    (Ф) то бо б5
    !ЗіКсАССССТО АСААСССССТ СААССАССТО ТІСАССАССА ССААССАСАТ СбОССТСААб 1920, АСССАССТСА СССАСТАССА САТССАТСАб СТСАССАЛСС ТОСТОСАСТО ССТСАбССАС 1980 САСТТСТОСС ТОСАССАСАА СААССАССТо АСССАСЛАСС ТОЛАССАСоС СААссоссто | 2990 АСССАССАбС ССААССТОСТ ССАБСАСССС ААСТТоСосо ССАТСААССС ССАбСТОбАС 2100 СОСОосСТобС ССОбСАССАС ССАСАТСАСС АТССАСОССо СОСАССАССТ СТТСААССАС 2160 ААСТАССТСА СССТОСТоСС САССТТСбАС САСТОСТАСС ССАССТАССТ СТАССАСААб 2220 70 АТСБАССАбБА ОСАДбСТОАА СОССТАСАСС СОСТАССАбС тТоСоСоОСтТА САТССАССАС 2280 АбССАбСАСС ТОСАСАТСТА ССТСАТСССС ТАСААССССА АССАССАСАС ССТбААСоТо 2340 СсссбосАССо бСАбССТоТо СССССтсАСС ССССссАбСС ССАТССОСАА СсТоСбСССАС 2400 САСАСССАСС АСТТСАСССТ ССАСАТССАС стосостосА ССБАССТСАА ССАССАССТо 2450 бОСоТОоТооб ТОАТСТТСАА БАТСААбАСС САССАССОСС Асссссосст ОббСАДССТо 2520 САСТТССТОо АбСАСААССо сстТостТоооС САббСССТоо СССОССТоАА СобСбССсСАС 25850 ААСААСТОСС СССАСААССО СОАСААОСТО САСТОССАСА ССААСАТССТ СТАСААССАС 2540 СССААССАСА СССТОСАСОС ССТОТТОбТС ААСАСССАСТ АССАСССССТ ССАСССССАС 2700 АССААСАТСС ССАТСАТССА ССССОСССАС ААСССССТОС АСАССАТТОС ССАСОСССТАС | 2760 ! СТОССССАСС ТбАСССТОАТ ССССобСоТо ААСССССССА ТСТТССАСбА ССТОбАСОоСбС 2820 СОСАТСТТСА ССбССТІСАС ССТОТАСбБАС бСССОСААСС ТСАТСААСАА СобСбАСТТС 2850 АДСААСОСОСС ТОАССТОСТо СААССТСААС СОССАССТОС АССТОСАССА ОСАСААСАдС 2940 с САССОСАССо ТОСТОСТОСТ бССССАСТОС САСССССАСС ТСАбССАССА сстососсто 3000 о тоссссоосс бСоСсСтТАСАТ ССТОоСоСоТо АСССССТАСА АССАССОСТА СобССАсобС 3060 ТСССТСАССА ТОСАССАСАТ ССАСААСААС АСССАССАСС ТСААСТТСАС СААСТоССТо 3120 САБСАСбБАСС ТСТАССССАА СААСАСССТО АССТОСААСО АСТАСАССОС САСССАССАС 3180 чІ САСТАСОАбОС ССАССТАСАС САСОССССААС СоССоСтТАСС АССОССССТА ССАСАССААС 3240 о АБСАбСОТОС ССбССбАСТА СоССАбСоСС ТАССАССАСА АбСССТАСАС СбАСобССОоС 3300 СОССАСАЛСС ССТОСбАСАС СААССоСООС ТАСООСБАСТ АСАСССсСстТ сосссоссоос 3360 т ТАССТСАССА АОСАССТОбА СТАСТТСССС САСАСССАСА АССТСТОСАТ ССАСАТСоОС 3420 со 325 САбАССОАбС ССАССТІСАТ ССТОБАСАСС СТОСАССТОС ТОСТОАТОСА ССАСТАСТАС 3480 « АТСТСАТАСТ АССТААССТС САССАТСТ Ще й 3508, последовательность, представленную на фигуре 6 « 64 АТОСАССТОС ТоССССАСбС ССОСАТССАС САСАСССТСТ ССАТСбСССА СОССААСЛАС дю месАзріви ГеиРгОоА5р АіадкудІ1ебіз Азрб5егцео СубзІ1еАїа С10б1уА5пАп -о с 124 АТССАССССТ ТОСТСАССОС САССАСССТО САСАСССССА ТСААСАТСОС СоССсСссСАТС ІїеАзрРго Ріеуаї5ег АзїабесктісчУаї біптрхбіу І1еАбЗпПІ1Те АзасіуАкдІїє ;» 184 стТобосстТос тТооссстТоосс СТТСбССбОС САбСТООССА ССТТІСТАСАС СсТТоСстТостТо Теобіумаї Гезбіууаї РгорреАзвбіу біпіецАзла бесРБетТує 5егРпетецуаї 244 бОССАССТСТ ССССССоСбо СССССАССАС ТОССАСАТСТ ТОСТОСАССА ССТоСАССАС їз біубіціїею ТерргоАку СіуАкдАЗроїп Терсіші1іе Рбебечбіц нівуаїб1ібір о 304 СтТСАТСААСС АССАСАТСАС ССАСААСССС СССААСАССо СССТобСССС ССтТоСАбоСС ТечзІ1їеАзп СіпбіпІ1є ТигбісАзпА1а АкдАЗоТВг АзатеоАїта Агдієибіпос1їу - 364 СтТобоССАСА ССТТССОСОС СТАСТСАбСАС АСССТОСАСО АСТООСТОСА ссосоьс о 50 ГеобіуАзр бБекРпелко Аіатукбіпбіп бЗекіре»бі Азрткріги бішлеплкдАер 424 САСССССОСА СССССАбССТ ССТОТАСАСС САСТАСАТСС СССТССАССТ СбАСТТССТо «г» АзрАзалка ТпгАгобег МаіїїенптТуктих біптугі1е Аіїагейбіш ГецА5ррРБеїгеи 484 ААССССАТОС СССТоТТСбС САТССССААС САбСАССТОС СССТОСТСАТ ССТоТАСОоСС АзпАзамес РгогейРМпе Азаїт1іеАкдА5п біпбіоУуаї Ргоїешптец Месуа1ТугАїа
    (Ф, ко 60 65
    544 САСОСССССА АССТССАССТ ССТОСТоСТо СбСбАССССА ссСсТСст : Й ТСбб САСССАСТТС біпАзадіа АєпівецНів тептешецеи АгчАзрАїа 5егіерРре біубекбі|пРВе 604 бСССтТСАССА СССАССАСАТ ССАССССТАС ТАССАССбСС АССТОСАСС С САСССССбАС біутемитрІ бекбіпбСі» 11ебіпАгутуг,тукСісАкд Сіпугібій АсУтпгАгоА5р 664 ТАСАСССАСТ АСТСССТОСА СТОСТАСААС АССССОСТСА АСАСССсТОС С СБОСАССААС тукбЗегАзр ТугСсузчуаї СіотертукАзЗп Твкгбіусеч Азпбегієи Мео1утьса 724 СССосСсСАССТ бССТОСССТА СААССАСТТС СОССбССАСС ТСАСССТтТоСб - Го еуксе оче ст то ліаліазЗег Тгруаі1іАгд ТугАзпбіпРне АгдАкгудА5р БТецштвгівч СіуУуазїГемАзр 706 784 СтТОоСтТооСоС ТСТТССССАб СТАССАСАСС СССАССТАСС ССАТСААСАС САС осссСАб ГеоУаїАїа ГеоРБеРго ЗекТтукАвртйх Ахутісгтук Ргої1еАзп ТігбЗегАїасів 844 СТОАСССССС АССТСТАСАС ССАССССАТС СОССССАССС СССТСЛАСАТ СОССАбСАТо теотЬвгАк9 бішуаїтТух ТЬгАзрАзЗаїтіє СіуАтатьг біууаїА5п МесАтабекме:ї --904 ААСТОСТАСА АСААСААСОС ССССАБСТТС АБССОСАТСС АБОССОССОС САТССоСАСС АБпТЕртук АвзпАБпПАЗп А1аРгобекРЬе бекА1атї1е СічАлТаліа А1ат1елгубег 964 ССССАССТОС ТОСАСТТССТ ССАССАбСТО АССАТСТТСА СССССАбСАС ССОСТОССАСС РгоНізіеп ТецйАЗрРве Іеибіобіпіст ТЬсІзерре бегА1абег 5егАгутсгрбег 1024 дАСАСССбСС АСАТСАССТА СТООСОССОС САСАССАТОС АСАССССССС САТССССбОС АЗптТВхАху Нівместіх ТугтТгрАкУусіу нізтакІїе біпбегАкад Ресої1ебіубіу 1084 сссстТоААСА ССАССАСССА ССОССССАСС ААСАССАССА ТСЛАСССССТ САСССТоСоС біуїецА5зп Тпгбесгтпг НізбіуАзатьк АзпТВкі5ек І1еАзпРко УМаїТагієезАкд 1144 тТтТСОбСсСсАбСС СССАССТСТА ССССАСССАб АССТАСбССо бССТОоСТОоСТ бТобОбСАТС Рпедіабег АгоАзруа1! ТукАсгутпсОї1 БегтукА1їа СіууаїГекш Теотгрбо1уї1єе 1204 ТАССТССАбС ССАТОСАССС ССТССССАСС СТССОСТТСА АСТТСАССАА СССССАСЛАС с Тугіеобі Ргої1еніз СіууаїРкотТік МаїАгкурБе АзопРВетвкг АзпРгОбіпАЗп о 1264 АТСАСССАСС СССССАССОС СААСТАСАбС САбСССТАСС АСАбСССССо ССТоСАбСТо І1іебегА5р Агубіутпкг А1іаАзптугбекг біпРготТук бішбБексРкго Сбіугечбіпіви 1324 АДССАСАССС АСАСССАССТ бСССССССАС АССАСССАСС бССССААСТА ССАСАССТАС ПувА5рбет СІіоТЬгбіч ГейРгоРгобіц Тістпкбій АкдРкКоАвп Тугб1о5ектуг Й
    1384 АСССАССОСС ТОАбССАСАТ ССОСАТСАТС СТОСАСАСОСС СССТОААССоТ бССССТоТАС ав) бекнізАк9д Гейбехсніх І1ебіуї1еї1е Пеобіпбег Акдуа1їАєп Уа1іРгоУаїтТуг 1444 АБСТОСАССС АССССАССОС ССАССССАСС ААСАССАТСС СССССААССС САТСАСССАС - ЗесТгртТйг НізАхдбек АзаАзрАсутТЬк АзптпКІ1е біуРкоАвп АкдІі1етнгсі1в со 1504 АТССССАТОО ТСААбОССАС ССАбСТоССС САббоСАССА сСосСтТОоСстТосо СсбоСосссос І11еРгоМеє уаїцухА1іа бЗекбішціецйРго СіпСіутьс ТБгУаїУаї АкосіуРкобіу «І 15564 ТТСсАССОСССО СССАСАТОСТ бСбССбСАСС ААСАССбоСо бСТТСбоССС САТоСоССсТо Рретпгбіу біуА5рі)е ТезАкдАхутаг АЗзптВКкбіу біуРресбіу Ргої11еАгдуа1ї 1624 АСССТСААСС ССССССТСАС ССАСОССТАС СОСАТССОСТ ТССОСТАСОС САбСАСССТо « 20 тТвпгуаїА5п біургоїе ТигбіпАгутук АсдІ1ебіу РбеАхотухє А1абегтігуа! З с 1684 САСТТССАСТ ТСТТССТоАС ССССбоСОбС АССАСССТОА АСААСТтТоСо СтТтоСстТоСбС АврРіПеАзр РіеРПечаї б5екгАгубсіубіу Тактпсуаії АзпАзпРпе АгорБетгевАго9 . и"? 1744 АССАТСААСА СССОССАССА ССТСААСТАС СССААСТТоб ТОСоССбобС СТТСАССАСС ТігмесАєп бегбіуазр СіціеціувєТтТук б1уАЗпПРЬе Уа1АкудАку Азарретьстьг 1804 СССтТТСАССТ ТСАСССАСАТ ССАССАСАТС АТССОСАССА ССАТОСАСОС ССТСАбОСбоС ї5» Рговрпетіг Рпетіпгоіп І1ебіпАзрІ1е ІзїеАкутвк бЗекі)1ебіп Сіутеоб5екб1іу 18564 ААСССССАСС ТСТАСАТССА СААСАТССАС АТСАТССОСС ТСАССбССАС СТТОбАСОСС бо Азпбіубі УуаїТугі1є Азрі,узІ1ебіш т11еї1ерко ЧаїтпсА1а твсвребізАта 19324 САСТАССАСС ТОСАБССССС ССАбСАСОСС СТСААССССС ТСТТСАССАА САССАКСОСИ -й сіптугА5р ГеоСіслк Азабіпбішата уазїАзпАз1а ГеоРБетьх АзптвсАЗаРкКо С) 70 001984 о соссбостбА АСАСССАССТ САСССАСТАС САСАТССАСС АССТСАССАА ССТОСТОбОС АгадАкЧїез рузТВгАзр МаїтвпхАзртуг НізІ1еА5зр СіпУа15ех Азпігиуаїлі1а з» т 2044 ТОСсСтТСАССО АССАСТТСТО ССТОСАССАС ААССОССАСС ТОСТОСАСАА СОТОЛАСТАС Сузпечбег А5рб1іЧРлпе СузПрецАзрСій ПузАкдбі Тецшецисіи БузуаїЦузтуг іме) 60 65
    2104 СССААССбСС ТСАСССАССА ССССААССТО СТОСАССАСС ССААСТТСАС САССАТСААС А1з1ацузАгад Гео5егАзр біцАкКдАЗєпреч ГейбіпАзр РгоАвзпПРНе Тпг5егі1елвп 2164 ААбСАбССССС АСТТСАТСАС САССААССАС САбАССААСТ ТСАССАССАТ ССАССАССАС БПузбіпРгОо АЗрРпеї1е бБектЬБкКАзпбіц біпбесАзп Рпетпгбек І1енівзСсіос1іо 2224 АСССАССАСС бСТОСТОоСОб САСССАСЛАС АТСАССАТСС АССАбСССАА СбАССсТСсТтТС Зекбізніз біуТсрТср біубБекбіцА5зп І1етпсІ1їе б1іпбівбіу АзпАЗзруа1Рве 2284 ААССАСААСТ АССТСАСССТ ССССБОСАСС ТТСААССАСТ ССТАССОСАС СТАССТОоТАС Бузб1іцА5в ТугУуаїтТьи: ГПеоРкобіутьк РреА5пбіш СузТукРго ТігТугіеитуг 70 2344 САбААСАТСС СССАСАСССА ССТСАВОСОС ТАСАСССОСТ АССАССТОСо ССССТАСАТС біпрузІ1е біубішЗек бістезБузАїа ТугтпкКАкуд Тукбіпрес Агсубіутуєтіє 2404 САССАСАбСС АССАССТОСА САТСТАССТО АТССОСТАСА АССССААбСА ССАСАСССТо бішА5рзек біпАзріви б1011еТугіеч І1еАхутут АзпА1аБуз Нізб1іотЬкіеи 2464 САССТОСССС ССАСССАСАС ССТСТООССС СТОАСССТОС АСАбССССАТ СоССсСоСсТоС АзрУуаїРго біутісгбіш бБекреотТесррко Теибекуаї СіобекРго І1ебіуАгдсСуз
    2524 ССССАбСССА АССССТоССС СССССАСТТС САСТОСААСС СССАССТОСА СТОоСАССТОС біубійРко АзпАкуСув АзарконНізРпе бійТгрАвзп РгоАзрієи АзрСузбексСуз 2584 СбССАССОССС АСААСТОССС ССАССАСАСС САССАСТТСА СССТОСАСАТ ССАССТобОС Аг9АвзрС1у бішцузСуз АіанізНнізбек НізНібБРИпєЄ бекГецйА5Зр І11еАд5руаїбіу 2644 ТОСАСССАСС ТССАССАСАА ССТОСОССТо ТООСТОСТОТ ТСААСАТСАА САСССАССАС СузтпгАзр Теонізбій А5піенбіууаї Тгруаї1їУаі РрецузІ1є цузтТвго1пбіц 2104 сбссАСбССС СССТОООСАА ССТОбАСТТС АТОСАССАСА АбССССТоСТ СОБССАСССС СсіунізАзїа Акутечзбіу АєпіесобіпРре Ізїебіюбсіцй 0узРгоїео тезобіусіміа 2764 СстТСАСССССС ТСААбСОСОС ССАСЛАСААС ТОСССССАСА АбССССАСЛА бСТоСАССТо ІесбБекгАгоа чаїцузАку Атабісоцузрув ТгрАгуАзр БузАхубі Бузівеобіпіви се 29 2824 САСАССАЛОС ОССТСТАСАС ССАССОСААЄ САСССССТОС АСССССТСТТ ССТОСАСАСС Ге) біствгБуз АгууаїтТує тікбішАзаруз бішАлауаї АєрАазатен РБеуа1тАвріек 2884 САСТАССАСС СССТОСАБОС ССАСАССААС АТССОСАТСА ТССАСССЄБС ССАСААССТО біптукАвр Аксдіечбіп АзадлертьгкАзп І1ебіумеб І1їеНізАза Атахзріцузіви 2944 СТОСАССОСА ТОССССАСОС СТАССТСАСС САбСТОСОСо ТСАТОСССбС СбТоЛАСбСС « хаїнівАхУ І11ехлкгубіз Азатугіенбек СішеийРко УаїІ1еРко сіухмаїА5лпАТа о 3004 сСАСАТСТТОС АССАССТОСА бООССАСАТС АТСАССбССА ТСАСССТСТА СбАСбСССОС бічІ11ерБе сСіобіцшіеч Сіобіунізїтїе 11етбкАла І11е5есгіви ТтугАзЗрАа1тадко ч- 3064 ААССТОСТОСА АСААССОССА СТТСААСААС СОССТОАССТ ОСТОСААССТ СлАСоССсСАС Авпуаїуаї ПузАзпбіу АзрРпеАзпАЗзп біугецствІ СузТгрАзп Мазїцузсіунів со З5 3124 СтТОоСсАССТОС АССАСАСССА ССАССОСАСС САССТОСТСА ТСССССАСТО бСАСОСССАС «І Уаїлєруаї Сіпсіпбес НібзНізАкудзек Азріенмаїії І11еРгобій ТгрбіпАЗасіо 3184 СтТоАбСсСАСо СССсТоСбССстТ СТОоССССбоС ТоССОСТАСА ТОСТоСОССТ САССбССтТАС Уаїбекбіп АзаМаїАгуд МаїСузРкобіу Су5біутук І1етепйАхо МаїтЬгА1атуг 3244 ААССАССОСТ АСССССАССС СТОССТСАСС АТССАССАСА ТССАСЛАСАА САСССАССАС « цузбіобіу ТукСіубсіч СіуСузуаїтвс Хіенівзсіц І1ебішА5пП АЗПТВсАЗрСТи ш-в с 3304 СТОоААСТТСА АСААССОССА ССАССАССАС СТСТАССССА СССАСАССОС САССТОСААС течцузРпе ЦузАБпАкЯ біобівбі0біш Маз1ТукРго ТвКАЗзртйг с1утьссСузАЗо . и"? 3364 САСТАСАССС СССАССАСОС САСССССбОС ТоССССОАСо ССТОСААСАС ССССААСоСС АзртТуєтТіх Азїанізсіп сС1утакКАлабіу СузАзаазр А1ТаСузАзп б5егкАкуазпА1їа 3424 бОСтТАССАСС АСОССТАССА ССТССАСАСС АСССССАССС ТОААСТАСАА ССССАССТАС їз бсіутукбіч АєрАтТатує бісуа1їАвзртіс ТВгАлабек Уа1А5зпТук БувзРкотіхкстуг 3484 САССАССАСА ССТАСАСССА ССТОССССбС САСААССАСТ ССбАСТАССА ССБССОСТАС (ее) біоСіобі тЬестугтйг АзруазАєЯАку АзрАБпнівз Сузбіштуг АзрАгусіутуг - 3544 СТСААСТАСС ССССССТоСС СОСССОСТАС СТОАССнАСо АССТООАСТА СТТСССССАб УаїАзпТухт РгоРгоуз1і РгоА1абіутуг МаїТБПгруз бішебіш ТусРреРкобіц о 3604 АСССАСАССС ТСТОСАТССА САТСССССАС АСССАСООСА АСТТСАТОССТ ССАСАСССТо Т» ТВгАЗрТВг Уа1ітТгрі1є січІ1ебіубіш ТЬвсб1іобіу бузРпеї1е УаіА5зрсегуаї 3664 САССТОСТОСС ТСАТОСАССА СТАб Сіптемтеи ТезМесбіц б1іц--- последовательность, представленную на фигуре 7 ко 60 б5
    1 АТОСАСААСА АССССААСАТ СААССАСТОС АТССССТАСА АСТОССТСАб САЛСССССАС МмесАзрАєп АзпРгоА5п І1І1еАзпбійСуз І1еРготук АзпСувіею 5екгА5зпПРгобіцй 61 СТбСАССТОоС ТОСССОбССА бСССАТССАС АСССОСТАСА СССССАТССА САтТесАСССТо Уаїб1іоУаї їейбіусіу біцАсуїт1ебіш тТЬгбіутує ТрпсРгоїЇ1є Азрі1ебзегкіево
    121 АСССТСАССС АСТТОСТОСТ САСССАСТТС Стососсссс сссостТтТсст сстососсто БекресТьх СіпрРЬеїеи ГечбекбійРПе УаїРкобіу А1абіуРве Ууаібеобіутеу т 1 181 СТОССАСАТСА ТСТОСОССАТ СТТСббСССС АСОСАСТООС АСоССТтТоСТ СОТОСАСАТС УаїАзрі1їе ч11еТгрбіу І1еРребіуРксо бекбіпТтутр АзрА1аРБе ТецшуаїСсіпі1е 70 241 САбБСАССТСА ТСААССАбСО САТССАССАС ТТСССССССА АССАССССАТ САбССоССТо сіобСіпцеч Т1ед5пбіп Агат1ебіобіш РБеА1айгд АзпсіпАїа І1ебегАгатеи 301 бАССОССТОА ССААССТСТА ССАААТСТАС ССССАСАССТ ТСССССАСТО бСАССССсАС біобіуте 5егА5півго тугбіпІ1етуг Азасійбек Рпелхудсіс ТкрбівА1адзр 361 СССАССЛАСС ССССССТоСС ССАССАСАТО СбСАТОСАСТ ТСАЛАССАСАТ СЛАСАСОССС 75 РКгоТВгАБп РгоАХАіатгео Агуабіобішмес Агухті1іебіп РпеАзпАвзр МегАзпбекА1а 421 СтТбСАССАССС ССАТСССССТ СТТСОСССТО САбААСТАСС АССстТоСССсСтТ бСТСАСССТо пеотпстТвг Азат1іеРго гезРпеАлтауаї біпАбзаТух біпуа1Рко Гецїеибегмаї 481 ТАССТОСАбо ССОССААССТ бСАССТСАСС СТоСТоСбСб АССТСАбССТ СТТоСССсА ТукУаїбіп Азахзалзп ГечНізієчбек УМаїїецйпаку Азруаії5Зегк Уа1Рпебіубів 541 сСоСстТообосСтТ ТССАСССССС САССАТСЛАС АСССОСТАСА АССАССТСАС СОбССТоАТС Агутгрб1у РреАзрАзїа АзатігІ1еАзп БекАкутук АзпА5рієм ТпгАхдіемІїє 1 й 601 СОСААСТАСА СССАССАССС ССТоСОСТОС ТАСААСАССО СССТоСАССо ССТоТОобоСт біуАзптТут ТЬсА5ЗрНніз Азауаї1їАкутТгр ТугАзлтіс біуге»бі АгодУуа1ітТгрбо1у 661 СССбАСАбСС СССАСТОСАТ САССТАСААС САСТТоСОСС СССАбСТОАС ССТоАСССтТо см РкгоАзрбех АхдАзртгр І1еАкутукАЗзп біпрРпедху Акдбівгей твкгіечтисУуаї 721 СтТОбАСАТСС ТСАбССТсТтІ ССССААСТАС бАСАбССССА ССТАССССАТ ССБСАСССТо о тІечАЗзріІ1їе Уа1бегіеч РбБеРгоАзптухк АзрбекАх9Ч ТпстТукРКко І1еАкутисуаї 781 АСССАССТСА ССССССАбАТ ТТАСАССААС ССССТОСТОО АСААСТТОСА СОССАССТТО ЗекбСіплец ТагАгубі 11етуєтЬкАб5п Ркоуаїїечуч біоА5пРЬе А5ро1убекРве «г 84) СОСбОСАССС СССАСОССАТ ССАССОСАСС АТССБСАССС СССАССТСАТ ССАСАТоСТо Акгубіубег А1їабіпбіу 11есіобіубек Іїіелсубег РкоНізІіеи МесАзрі1еГеу о 9301 ААСАбСАТСА ССАТСТАСАС ССАСССССАС СОСССССАСТ АСТАСТоСАСб СССССАССАб ч- АзпбекІ1е ТпсгІі1еТуг ТпгАЗрАЗанівз Агубіубі ТукТукскТтгр бЗекбіунізбів у с 961 АТСАТОСССА ССССССТССС СТТСАССССС ССССАСТТСА ССТТСССССТ СТАССССАСС ІїенекАзїа 5есРгомаї біуРпебекбіу РкгобійРпе ТВкРБеРко Геотуксіутьс « 1021 АТОССССААСС СТОСАССТСА бСАССССАТС СТСОСАСАСС ТООСССАбОС АСТСТАССоС Меєсіул5п А1аліаРко біпбіпАкЧІїе МаїАласіп Геоб1іубіл біучуаїтТукАга 1081 АСССтТСАбСА ССАСССТОСТА СССТССАССТ ТТСААСАТОС ССАТСААСАА ССАССАССТо « тТвгівецбег бектпсгіеи ТукАсудАгувго РредзпІїе біут1еАзп АзпСіпСіпіеч 1141 АСССТОСТбО АССОСАСССА СТТССССТАС СССАССАССА ССААССТОСС САССОСССТо - с 5егмаїцеи Азрбо1іутіг бішРБеміаТуг Сіутрг5екг БегАзпіеци РгобекА)амаї п 1201 ТАССОСААСА СССОСАСССТ ССАСАбССТО САССАСАТСС ССССТСАСЛА СААСЛАССТо "» ТукАгуцух БЗегбіутрх Уа1їАзрбегіем АвзрбіШІ1е РгоРкобіп АвпАвпАЗПУа! 1261 ССАССТССАС АбооСтТТСАб ССАСССТСТО АСССАССТОА ССАТСТТОСб САСТОооСТТо РгоРгоАхд Сіпбіурре бекНізАкдією БЗекНнізуа1ї БекмесРпе Акудб5ексіурве т- 1321 АССААСАбСА СССТСАССАТ САТСССТОСА ССТАТСТТСА ОСТОСАТТСА ССССАСТОоСС со ЗекА5пбег бЗегуа15ех І11еїт11еАкдАза РкгоМесРбе бестТгрі1е нізАгудбекА1а 1381 САСТТСААСА АСАТСАТССС САССАСССАС АТСАСССАСА ТОССССТСАС СААСАССАСС - бійРпедзп АзпІ1Теї1є РгобекбексСіп Іїетпкбіп І11еРгоїе)в Тпгрузбектьг («в | 250 7441 ААССТОббСА ССОБСАССАС ССТОСТСААС бОССССбОСТ ТСАССбоСоб ССАСАТОСТО Азпігобіу Зегсіутвг бегузіУаїцув біуРкобіу Рпетигбіу СіуАзрі1їеїтех ЧТ»
    іме) 60 б5
    1501 ССССбСАССА СССССССССА САТСАССАСС СТОСОССТСА АСАТСАСОССС СССССТСАСС . АкЧАтутиг ЗекРкобіу біпІ1ебектТікК ГецпАкууаї АзпІ1етйг А1заРгоГгезбег 1561 САССОСТАСС СССТОСОСАТ ССОСТАСбСС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАбС бСіпАгдтуг АгудуаїАго І1еАсутугАта Зекгтістйг АзпіечСіп Рпенізтігс5ес 1621 АТССАСОбСС СССССАТСАА ССАССССААС ТТСАСССССА ССАТСАССАС ССССАбСААС І1їел5рбіу Агувсоїт1е Азпс1пб1уАзп РбебекАла ТігМеєсбег БекбіубескАзво 1681 СстТоСАбАССС ССАССТТССо САСССТОСОС ТТСАССАССС ССТТСААСТТ САбСААСооС Іеобіпб5ег бі1у5ЗегРНе АгдтігУатїсіу РпетьІтіг РгоРрРБедяп РіебегА5псіу 706 1741 АбСАбССТСТ ТСАСССТОСАб СССССАССТО ТТСААСАССо ССААССАССТ СТАСАТССАС Бескбекуаї! Рретіпгієч 5егА1їанівзУузі Рредзпбех, б1уУАзпбіц Уа1тугі1еАзр 1801 СССАТСОСАСТ ТССТОСССбС ССАССТСАСС ТТССАСОСОС АСТАССАССТ ССАСАССОСТ Агуїтіебіш рремаїРко А1абішуаїтТіс РребісцАтТа бісТукАяр ІТепбізАгФАЇ1а 1861 сСАСААбСССС ТСААССАССТ СТТСАССАСС АССВАССАСА ТОСОССТОАА САСССАССТо біпрузАїа УаїАзпбс1 ТтеоРБетпкбек бекАзпбіп Іч11ебіубеиа ПузтТЬгАвруаї 1921 АСССАСТАСС АСАТССАТ/СА АСТАТОСААТ ТТАСТТСАСТ СТІТАТСТОАТОСААТТТТСТ ТВгАЗртук НізіІ1еазр/Сіпуаії5екАзп Геомаїбій Сузієибесг Азрбо1йРБесув 19581 СтТОоСАТСАДА АДАЛАСААТТ СТОССАСААА СТСАААСАТО СОААСССАСТ ТАСТСАТСАС ТезАЗрої Сузцузбії 1езбекбішбуз Ма1рузНіз А1абузАкд Гесб5егА5Зросіїи 2041 СССААТТТАС ТТСААСАТСС АААСТТТАСА СОСАТСААТА САСААСТАСА СоСТОбСТОоб АкодАзпіємс Геобіпазр РгоАзпрРреАкУ біут1іеАвп Акубіплієи АзрАхбіутегр 2101 АСАССААСТА СООАТАТТАС САТССААбСА СОССАТСАСС ТАТІСАЛАСА СААТТАССТТ Ахкасіубек ТАкКАзріІ1е ТЬхІїебіпбіу біуА5ра5р МаїРБеруз біцАбєптТукуУаї 2161 АСССТАТТОС СТАССТТТСА ТСАСТОСТАТ ССААССТАТТ ТАТАТСАААА ААТАСАТСАС се ТАгіемте біутасРпе Азрої1шСуб5тТух РкоТВсТтТук Гезтукгбіп БузІТеАврої 4 2221 ТобАААТТАА ААСССТАТАС СССТТАССАА ТТААСАСОСТ АТАТССААСА ТАСТСААСАС о б5екрузіеєи ЦуБА1їатТук ТигАксутукєбіп ГечзчАгкусіу Тукі1ебіц АзрбексіпАзр 2281 ТТАСБАААТСТ АТТТААТТОС СТАСААТОСС АААСАССААА САСТААЛАТСТ СССАССТАСо 1еобіоІ1е ТугіечІ1е АхутукАЗпА1а ГузнНізбі ТпкУуаїіїАвсп УаіРкобіутвг « 2341 ССТтТССтТтТАТ боССоСТТТо АСССССААСТ ССААТСССАА ААТСТОСССА ТСАТТСССАТ сіузекгіеи ТгрРкоїец бегаіаРкобек Ргої1есіу цЦузСузА1а НівНізбекнів о 2401 САТТТСТОСТ ТОСАСАТТСА ТСТТССАТСТ АСАСАСТТАА АТСАСОАСТТ АОСТСТАТОС ьо нізРпебес ІїецйА5ЗрІЇє Азруаїбіусуз ТіПгАб5рьесз АзпбічА5р Геобіучма1їтТегр (ее) 2461 СТСАТАТТСА АСАТТААбСАС ССААСАТОСС САТОСААСАС ТАССАЛАТСТ АСААтТтТтТСТС Ууаїї1ерРре БузІ1їецуз ТагбіпА5роїу НізА1алхд теобіудзп тейбіпрРретгеи «І 2521 СбААСАСАДЛАС САТТАСТАбО АСААССАСТА ССТОСТСТСА АААСАбСССА СААААААТОС Січбісруз РкопемУаї біубішАалатечй Азалгууа1ї ГузАгдА1Та січгузБбузткгр 2581 АСАСАСАЛАС СТСАААААТТ СОААТОССАА АСААЛАТАТТО ТТТАТАЛАСА СОСААААСАХ « - АкоАЗзроуз АгобСіобуз теробішТербіш ТвгсАЗпІїе УаїТуєгьуз СішА1ацузсій 2641 ТСТСТАСАТС СТТТАТТТСТ АЛАСТСТСАА ТАТСАТАСАТ ТАСААССССА ТАССААСАТС - с бБекуаїАзр АзїагенРБе УаіАзпбекбіп ТукАб5рАгЯ ІеобіпАЗа АУртьгАЗпІ1е п 2701 ССбАТСАТТС АТССООСАСА ТАААССССТТ.
    САТАССАТТС САСААССТТА ТСТОССтТоАб "» АїамесІїе НізА1заліа АзррузАгууаї НізбекІїе АкусійА1та: ТухкіеоРгобім 2761 СтТотТСстТСстТсА ТТоСсоСТСтТ СЛАТоСоОоСТ АТТТТТСААС ААТТАСААСо СССТАтТтТтТТС Іеєоб5екчаї ІїеРкобіу МаїляпАа1таліа Іт11еРБесіз бішезсі С1уАкЧдІ1ерРье шк 2821 АСТОССАТТСТ СССТАТАТСА ТОССАСБАААТ СТСАТТАААА АТОСТСАТТТ ТААТААТОоОС со ТВгА1арРве бЗекіечТуг АзрАЗМаАкдАєп Уаїї1ецуз АзпСіуАЗр РреазпАЗПпПСІ1уУ 2881 ТтТАТОСТОСТ бСЛАССТСАА АБСОСАТСТА САТСТАСААС ААСААААСАА ссАсссттоб - ГешбекСуз ТгрАзпуа! Бузбіунізуаї Азруаісіи бійсіпАзпП АзпНізАгобег ще о 2941 СтТОСтТтТСтТтТб ТТССОСАЛАТС ССААССАСАА СТСТСАСААС ААСТТОСТСТ СТСТоСбОоСТ уаїїервуаї УаїРкобіц ТгрбічА1їабіш Уаії5екбіп бішУа)Агу МаїСузРгобіу «г»
    іме) бо б5
    3001 ССТоОСТАТА ТОСТТССТСТ САСАСССТАС ААБСАСОСАТ АТОСАСААСОо ТТОССТААСС, Акусіутухг І1ієїсцакд УаїтвкАзїатує цузбішбіу Тухб1іусі Сіусузуаї1їтТьг 3061 АТТСАТСАСА ТССАСААСАА ТАСАСАССАА СТСААСТТТА ССААСТСТСТ АСЛАСАССАХ Іїенізбіц І1ебішА5зп АхатвкАЗрб1ї ГемцбузРре 5егАзпСуз МаїСсіпбішсі1і 3121 СТАТАТССАА АСААСАСССТ ААССТСТААТ САТТАТАСТО ССАСТСААСА АСААТАТСАС УаїтукРго АзпАзЗптіпх Уа1іТтпгСузАзп АзртТустіх Азатпкбіп СіоСістугбію 3181 бСтТАССТАСА СТТСТССТАА ТОСАССАТАТ САСОСАСОСТ АТСАЛАССАА ТТСТТСТоТА сіутьстТук тТнгбекАаго АзпАакубіутук АзрбіуАзла Тукбійбег Азпб5екбтекУаї 3241 ССАССТСАТТ АТССАТСАСС СТАТСААСАА АААССАТАТА САСАТОСАСС ЛАСАСАСАХТ Рголіадвр ТугА1а5ег Азіатукбі»Сім БузА1їаТухт ТВкАзрбіу АкдАахкдАврАвп 3301 сСсСтТтТСтТСААТ СТААСАСАСо АТАТССОСАТ, ТАСАСАССАС тТАССАССТоо СТАТОТОАКА РгоСузСіо бЗекА5пАгу біутуксіуАзруітуєтвсько ТечргоАІіа бі1утукуаїтТЬг 3361 АААСААТТАС АСТАСТТССС АСАААСОССАТ ААССТАТОСА ТТСАСАТОСО АСАЛАСОСАХ музбіцією бістутРве РгобістВкгА5р цузУаіїТгр І11ебіші1е СіуСіотвсс1о 75 3421 ССААСАТТСА ТССТОСАСАб ССТОСААТТА СТТСТТАТОС АССААТАА сіутпсрРре І1еуа1А5р бекгуаїбіоїеч Гезбеонеєс Сіоб1в--- последовательность, представленную на фигуре 9 : АТОБАСААСА АССССААСАТ СААССАСТОС АТССССТАСА АСТОССТСАб СААССССбАС МмесАЗзрА5п АЗпРгОоАЗл І1І1еАзлбішСуз І1еРкоТуг АзпСузцеи б5егА5аРгобіє 61 СТОбАССТОС ТОССССОССА ССОСАТССАб АССбОСТАСА СССССАТССА САТСАбССТо МаїбізМа)! цеобіубіу б1ЧАг9І1ебіц Твгбіутух ТВЕР;РКОЇ1е А5рііїебегіес 121 АбССтТСАССС АСТТоСТоСТ бАбСбАСТТо стосссббсб собосттостТ бстоббссте зекцеоТпг біпРпесеш ГеоЗекб1іоРпе Ма1іРкобіу А1абіурРпе УаіїГеобіубе» 181 СТОбАСАТСА ТСТОбббСАТ СТТОббСССС АбССАСТОСб АССССТТОССТ ОбТОСАСАТС с УаїАЗрІ1їе І1еТгрбсіу І1ерРпебіуРко ЗекбіптТер А5зрА1аРпе ГесмаїбіпІ1е о 241 бАбСАбСТСА ТСААССАбСС САТСбАбСАС ТТОбСССбСА АССАССССАТ САбССбССТе сішбіпреч Ізедзпбіп Акгд9І1їестоб)іш Рпедіадху АзпбсіпА1а І1ебегАготео 321 бАбСОССТбА бСААССТСТА ССАААТСТАС ССССАСАССТ ТССОСбАбТо ССАСССССАС біобіубеч БегА5зпіез ТукбіпІ1еТує Аїабіцбег РвеАкг9бів ТеррізА)алвр « НІ
    36. о сСссАССААСС ССоСССТоСо ССАССАСАТС СОСАТССАСТ ТСААССАСАТ ОААСАССОСС о РЕОТпПЕАЗа РгоАз1абе АгабіобічМес АкдІ1ебіп РпеАБпАБр МесАєпбегдіа «-- 421 СТбАССАССО ССАТСССССТ СТТСбСССТо САСААСТАСС АССТоСССсСТ бСтТоАбССТІ цеотпітйг А1ат11еРго ГечРНеАазіаМаї СіпАзпТуг біпМаїРго ГестеобегуУаї со 481 ТАССТОСАбб ССОССААССТ бСАССТбАбС бТоСТОоСоСб АССТСАбССТ СТТоббсСсАб Тугуаїб'ою А1адіад5п ГеуУунізіеобет МаїПцечлго Азрма)бетг хаі1Рпесіусіай « 74: СОСТоббССТ ТССАСССССС САССАТСААС АСССССТАСА АССАССТСАС ССОССТбАТС АгЧтерб1іу Рпед5рАа1а АїатпсІ1еАЗп б5егАготух АЗзпАЗріцеМ ТпгАгобречнітї1їе 501 ббСААСТАСА СССАССАСОоС ССТОСбСТОб ТАСААСАССС бССТобАбсСо СсстТотТобобт « б1уАзптТух ТВпгАЗзрНні А1їачУазїАтУТер ТукАзптТпг б1уцреобі» АкуМаїТтроіїу -о 661 СССбАСАбСС СССАСТОСАТ САССТАСААС САСТТССССС бСбАбСТОАС ССТСАСССтТо с РгоА5рбеї АхоА5рТІр І11еАсотТукАзп б1пРпеАко Акобіссеч Тпгіеотпгмаї з 721 СтТОбАСАТСС ТСАбССТоТТ ССССААСТАС бАСАбССбСА ССТАССССАТ ССбСАСССТо ТїезАзріїе Уаібегіеу РпеРгоАзЗзатТуг АзрбегАгУ ТВгТухРкКо 11еАготпгуаї 781 АбССАССТСА ССССССАСАТ ТТАСАССААС СССбТОоСТОб. АСАДСТТСбА СОбСАССТТС їх Бегбіпіею ТВтАгобіо І11іеТуєтакАзп Рхоуаїцеюв бізАЗзпРпе АзрбіубегРве 84) СбСОбСАбСС СССАССССАТ ССАбСССАСС АТССОСАССС СССАССТСАТ ССАСАТОСТо (ог) Агобіу5ет Азіабіпбіу ч11ебіобіубек І11еАхуд5ег РгоНізГе МесА5рі1іецеу - 901 ААСАбССАТСА ССАТСТАСАС СбАСбСССАС СбОбОССАСТ АСТАСТОСАб СбСССАССАб Азпзегі1е ТпгІ1їеТує ТигА5рА1Їаніз Акдбіубіи ТусТтускТкр бегбіунівзсіп («в) 9361 АТСАТОбССА бССССоТСбо СТТСАбСбОС СССбАСТТСА ССТТСССССТ СТАССбСАСС ї» 11емесА1а 5егРІоМаї біуРребегбіу РгобіоРпе ТВхРПпеРго бесотукбіутьг іме) 60 65
    1021 АТСОбСААСо СТОСАССТСА ОСАССбСАТС СТОбСАСАбС ТбббСсСАСОС АСТСтТАССОоС Месбіудеп Аз)адіаРко біпбіпАкді1іе МаїА1зїасіп Беобіубіл біуМаїТугАгу 1051 АСССТОАССА ССАСССТСТА СССТССАССТ ТТСААСАТСС ССАТСААСАА ССАССАССТо Твгреобег Зектігіеи ТугАсдАкуРго РпедлепІі)1є С1ут1еА5п Азпбіпбіпіе) 1141 АбСсотТосСтТоб АССбСАСССА СТТСОССТАС СОСАССАССА ССААССТОоСС СсАбсбСССто 5ЗегМаїцеу АзрбСіутиг біоРпедіаТук С1і1утТпсбек 5егАбпрем РгобегА1ама) 1291 ТАССССААСА СССОСАСССТ СБАСАбССТО САССАСАТСС ССССТСАбАА СААСААСоТо ТукАгацув5 Бекбіутпг Ма1їАзрб5екрем АзрбіцІ1е РгоРкобіп АзпАзпАвзпУаї 1261 ССАССТССАС АббОСТТСАС ССАСССТСТО АСССАССТСА бСАТСТТССб САСТОоССТТС РгоРгоАгЯ біпбСіурРпе"ЗесгнізАгдаБео б5екНізМа1 бекМесРпе Агдбекбс1урпе 1321 АбСААСАССА бССТСАССАТ САТСССТОСА ССТАТСТТСА ССТОСАТТСА ФеосАСтоСс ЗекАзпоетг бегуа15ег І1еїт11еАкоУА1а ВтоМмесрне зекТгрі1е НібзАгобегА1а Ї 1351 САСТТСААСА АСАТСАТССС САОСАбССАб АТСАСССАСА ТСССССТбАС СААСАбСАСС біоРпедвзп А5пІ)еї11е Ргобекбегбіп т11еТрпгбіп І1їеРкгоце) Тпгрузб5ектг 1441 ААССТОбОСА СССоСАССАС ССТОСТСААС сбссссоостТ ТеАссобсоо СбАСАТССТо Азпрезбіу бегос1утТії ЗегуаїМа1їцувз біуРгобіу Рпетпгбіу СбіуА5зрі1їєтец 150: ССССбСАССА СССССССССА САТСАССАСС СТОСОССТСА АСАТСАССОоС СССССтТоАСС УгЗАгЗТНІ 5екРІСбСІіу біпчІ1ебЗегтрг ГечАгуМаї АзпІїетпг А1аггоїеибег: 1951 САбБСОСТАСС СССТССбСАТ ССОСТАСССС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАСС біпАгуТут АгоУа1їАгу І1їеАгутукаіа БестпктТВвг Азпреубіп РпенізТпебЗег Ї621 АТСбАСббСС СССССАТСАА ССАСООСААС ТТСАбССОССА ССАТСАССАб СбОСАССААС т11еА5роїу АгуРгої11є Азпбіпбіудзп РрбебЗегА1а ТпгМесбек бекбіузегА5п 168) СтТоСАСАбСО бСАССТТССб САСССТОбОС ТТСАССАССС ССТТСАЛАСТТ САбСААСсоОоС см Геобіпбег біубетгРпе АсутпгУа1біу РпетТпстТВйх РгоРпеАвл РпебегА5по1у о 1741 АбСАбССТСТ ТСАСССТСАС СОСССАССТО ТТСААСАССС ССААССАССТ СТАСАТССАС БекгбЗегУаї Рпетпгіе» 5егліаНнізуа1! Рпедзпбех б1уд5пбіи т орнслвсос 1801 ССсСАТССАСтТ тостТоССсос ССАССТСАСС ТТССАССССС АСТАССАССТ ССАСАбСОСТ Аг911ебі0 РпемаїРкго Азїабісуаїтьх: РпебісАзїа бсіотТугаА5р ПеобійАакгдліа «І 1861 САСААСОССС ТСААССАССТ СТТСАССАбС АССААССАСА ТСбОССТбАА САСССАССТо ав! біпрузАїа маїАзпбіо ГешРпетисбек бекАзпбіп Іїебіубем ПузТЬгА5зрУа1 1921 АСССАСТАСС АСАТССАТСА АСТАТСОСААТ ТТАСТТОАСТ СТТТАТСТСА ТОААТТТТоТ -- ТагА5рТухк НібІ1еАзр Сіпуа15егА5зп ПесУаїбій Сузієцб5ег А5рб1ішРНПесуз со 1981 СтТОоСАТСААЛА АЛАЛАСААТТ бТСССАбААА СТСАААСАТО ССААбССАСТ ТАСТОАТСАСб цечнА5рбСі БДузцузбі Пцеобекбіцбуз МаїцузНів АіацузАгу Бен5егА5рс1о «І 2041 СббААТТТАС ТТСААСАТСС АААСТТТАСА бОСАТСААТА САСААСТАСА СссстТооСстоС АгЯ9А5преш КешбіплАЗр РгоАзаПРпедлку біут1еА5Зп Агдбіпльео А5рАгобіуТгр 2101 АСАбСААСТА СОСАТАТТАС САТССААССА БОСОАТСАСС ТАТТСАААбА СААТТАССТС « Агубіубег ТАгА5рІі1їе ТіПгІ)ебіпбіу б1уАзрА5р УМа1їРпецуз біпА5злтугМаї З7З с 2161 АСбСТАТТОС СТАССТТССА ССАСТОСТАС СССАССТАСС ТОТАССАСАА бАТССАССАС Твгресре біутпгРпе АзрбсічСузТуг РсоТПпгТух ГемтТусгбіп ПузІ1елвросі19 . и"? 2221 АбСААССТСА АбОССТАСАС ССОСТАССАС СТОСОССОСТ АСАТССАССА САБССАССАС бегцузрем цЦува1іаТук ТапкАкутуєбіп Т1епАгЯабіу ТукІі1ебій АврбексіпАвеЕ 2281 СТОСАААТСТ АССТСАТССС СТАСААСоСС ДАбСАССАСА СССТСААССТ бСССббСАСС їз тїечбіцІ1їе Тукіечі)1е АкотутА5пА1а цузнНізсіо ТпгУа)їдзл маїРгобіутв: 2251 БОСАбСССТСТ бОоССССТбАС СОСССССАбС СССАТСбОСА АСТОСОСОбА СССбААТСОХ (о) сіузЗегкгцеч ТгрРгоцем 5екА1аРгобекг РгоЇІ1еСіу БузСузбіу біоРгоА5пАг5 - 2501 ТОСОСТССбС АССТОСАСТО СААСССОБАС СТАБАСТОСА ОСТОСАбОСА СОБОСАСААС СубА1аРго Нібзтенбі ТЕрАБпПРгоАЗзр ТеоАврсСуз 5екСузАгу Азроіубіцшув («в) 2461 ТОСОСССАСС АСАбССАССА СТТСАбССТО бАСАТССАСО ТОБОСТОСАС СОАССТОААС ї» СубА1ані Нібзб5егНів НізРпебекгцеи АЗзріІ1зїедБр МаїбіуСсув5 ТпгАзрієцАв5л іме) 60 б5
    2521 САСбАССТоС бССТоТобСтТ САТСТТСААб АТСААСАССС АССАСобССА сссссоссто біозАБрІео біууаїТер Ма)11ервецу5 І11еїсузтйг СіпА5рсіу НізА1аАготєц 2581 СОСААТСТАС ААТТТСТОбБА АбБАбАДАССА ТТАСТАССАС ААбСАСТАСС ТССТСТОАХА біуАзпреш біоРпебеч біобісьузрРкго дечмаїбіу бівАзацеу А1аАгоуаї цу 241 АБАбСбСАСА ААЛААТОСАС АСАСАЛАССТ бАЛАЛАТТОС ААТСССАЛАС -АЛАТАТТСТІ Ах9А1їабіо рузцузТгр АгоАзрЬузАку біобузьем біотгрбСі ТагА5лі1емаї 2701 ТАТАААбАбС СААЛАСААТС ТСТАСАТОСТ ТТАТТТСТАА АСТСТСААТА ТОАТАСАТТА Тутцувзбіу ліагу5б1З бекУазїА5раіа ГепрРпемаї Азпбегбіп ТугА5ЗрАготео 2761 СААбСббАТА ССААСАТСОС бАТСАТТСАТ СССССАСАТА ААССССТТСА ТАбСАТТССА біпАзаАвр ТагАЗпІ1Їе АїаМмесІі1еніз Аз1аА1адзр ТузАгууаї Ніз5егІ1едгд 2821 бААбСТТАТС ТОССТоАССТ СТСТСТСАТТ ССООСТОТСА АТОСООСТАТ ТТТТОДАСАХ бічА1їатуг ПешРгобіч ГезбЗекча)ї1е РгобіуУаї АзпА1аліа І11еРпебішбію . 2881 ТТАСААбССС СТАТТТТСАС ТОСАТТСТОС СТАТАТСАТО ССАСАЛАТОТ ОАТТААЛААТ цечбіоб)іу АгуІі1ерпе ТигА1аРйебек ТеоТугАзр АзаАгуалзп Маїт11ецувзАвп 2941 бСТСАТТтТтТА АТААТСОСТТ АТОСТОСТОб ААССТОАААС СОСАТСТАСА ТОТАСЛАСЛА б1уАЗрРпе АзпАЗзпбіу Гечб5ехкСузтТгр АзпУуаїцуз біунізуаї АзруаїСс1обіц 3001 СААААСААСС АСССтТтТооСтТ ССТТСТТоТТ ССБбААТОСС ААССАСААСТ СТСАСААСАХ біпАзпАзп НізАгудбег МаїібезУуаїУуаї РгобійТгр б1чА1їабізч Уа15екбіпбіи 3061 стТтТостТстТстТ стТосбосТоб ТОбСТАТАТС ОГТССтТСТСА САБССТАСАА бСАСОСАТАТ уаїАгууаї СузРгобіу Агубіутугі1е ГенАгуМмаії ТигА1їатуг БУБо1об1Утук 3121 ббАбААССТТ СССТААССАТ ТСАТСАСАТС САСААСААТА САБАССААСТ бААСТТТАСбС біубіобіу СузМаїтТлІ І11еНнізбіШІ1іе бішАЗзпАєп ТпПгАЗрбіцш ГесогузРНнезбег? 3181 ААСТСТОТАб ДАСАОСААСТ АТАТССААЛАС ААСАСССТАА ССТОТААТСА ТТАТАСТОСО сч АвпсСувзуаї біобіобі УаїТугРгоА5п А5пТрІМаї! ТВпгСувАвп АзртуєтігАїа Ге) 3231 АСТСААбААб ААТАТСАССС ТАССТАСАСТ ТСТССТААТС бАбСАТАТСА СОСАбССТАТ ТпЕбіпбів біотукбіо біутопгтуктТапг 5ехАгудА5п Акубіутут АзроїуАзатуг 5301 бАААССААТТ СТТСТОТАСС АССТСАТТАТ ССАТСАСССТ АТОААСАААЛА АбСАТАТАСА « бівбегА5п бегбегуаі РгоА1їадазртуг А1їабегАаза Тукбізб1і» ЦцузАзіатТуттнв:
    32361 бАТОСАССАА САСАСААТСС ТТСТСААТСТ ААСАСАССАТ АТССОСАТТА САСАССАСТА о А5рб1іуАгЯ АкЧАБрАбп РкоСузбіцбек АзпАкЧ9біу ТукбіуАвр ТугТПпгРгоїви х щ ч- 32421 ССАбСТббСТ АТСТСАСААА АСАДТТАСАС ТАСТТСССАб АААСССАТАА ССТАТОбАТІ Ркодіабіу ТукМаїтТпйх цЦузбісрешбі ТукгРпеРко біоТтпгА5Зр цузмаїТиеріїє (со) 3481 бАСАТСОСАС АААСОСААбСО АЛАСАТТСАТС ОТОбАСАССО ТОСААТТАСТ ТеСТТАТОоОАС «І біоІ1ебіу бісотвгбіч біутвпгРвеї1е УаїАзрб5ек Маїбіогец теуїеомессієс 3541 бААТАА Фі0в--- « последовательность, представленную на фигуре 11 1 АТббАСААСА АССССААСАТ СААССАСТОС АТССССТАСА АСТОССТСАб СААССССбАС шщ с месА5рАбп АБпПРІОДБП І11ед5пбіоСуз І1І1еРкоТук АзпСузцемн БегА5пРгобіюв п 61 бтТбСАбСТоС ТобССббССА бСбСАТОСАС АСССССТАСА ГССССАТССА САТСАСССТО «» маїб)іцуаї їеобіубіу бізАгуї1еєб1ій Тпубіутут ТВгРІгОї1е АЗрі)езЗегіво 3121 АбССТСАССС АСТТоСТОоСТ САбССАСТТо стоСесбосо сСсбосттост остоооссте Фекрестру біпРІпегез ГечзбекбіоРпе МаїіРкобіу Аіїабіурпе Маїгеобіуїеє» ве 181 СтТобАСАТСА ТСТобСССАТ СТТСббСССС АСССАСТООб АСОССТТССТ ССТоСАСАТС со ма1їАвріїе І1еТегрсіу 11еРпебіуРко бЗегбіптТкр АзрАі1аРпйе ТеоуаїбіпІ1е 2141 бАбСАбСТСА ТСААССАССО САТСбАбСАС ТТСБСССССА АССАбОССАТ сАСССоССте - б1іобіпрец І1ед5пбіп АкдІ1ебішбіш РведіаАагоЯ АзпбіпА1а І1ебекАкдтеч С) ОО 00303 бАбобсстоА осСААССТСТА ССАЛАТСТАС бССбАСАССТ ТССбСбАСТО бОАСОССбАС біобіуцею 5егА5зпіез ТусгСіпІ)еТук А1іабіобег Рпедгубію ТгрбіпцА1алдер ЧТ»
    іме) 60 65
    351 СОСАССААСС СссоСссСстосб СОАСбАБАТО СССАТССАСТ ТСААССАСАТ СААСАССОСІ РІОТВКА5пП РгоАЛіагеч АкобівСіІцМесє Аго11еСіп РредзпАзр МесАз5пзегаАїіз, 421 СТСАССАССб ССАТСССССТ СТТОбСОСТб САСААСТАСС АостоСсСсст ССстТбдоСссте БечтвпстТВіг А)заї11еРго БепРПпеАліауаї біпАзптух біпуа1їРго Гесбебегуа) 481 ТАССТОСАСС ССОССААССТ бСАССТСАСС СТоСТоСССо АССТСАССоТ Стос туїмаїсСій Азадіадвп цеонізіеобєт УаїТепАкга Азрчуа15ех МаРнестусія 541 СоСТоОобоСТ ТОСАСОСССС САССАТСААС АбССОСТАСА АССАССТСАС ССбССТбАТІ АгЧТегрбіу Рпедз5рАїа дМіатигІ)еа5п 5ЗекАгтуг АЗпАзрреч ТигАгогеціїе 70 601 ббСААСТАСА СССАССАСОС СОТОСОСТОС ТАСААСАССо бССТобАССо ССТотТОобост б1уАзпТуг ТВпгА5рРНІіІв А1іаМа1їАгутгтр ТугАвзпПТйг біуеоСі АгоУаїТгросіу 661 СССбАСАССС СССАСТОСАТ САССТАСААС САСТТССбСС СССАбСТбАС ССТоАСССТо РкгоА5рбЗет АгоАБрТІр І1еАгутусгАБпП біпРпеАгУу Агубіобем Тпсгреотпгуа!ї 721 СтТОбАСАТСС ТСАСССТоТтТ ССССААСТАС САСАбСССОСА ССТАССССАТ ССбСАСССТе речА5ріІ1е Уа15егцец РпеРгоАзпТук АзрбекАга ТпЕТухРго Іч1І1еАгутпгуаї 781 АбССАбСТСА ССССССАСАТ ТТАСАССААС СОССТОСТОб АСААСТТОСА ССССАССТТС 5егбіпцен ТвгАкгубіш ч11етуєтагА5Зп РгоУаїгеш бійА5пРпе АзрбСіубетрРпе 841 СоСоОСАССС СССАСОССАТ ССАбСбСАСС АТССОСАССС СССАССТбАТ ССАСАТССТо Аг9біубЗег Азабіпбіу 11ебізбіубек І11еАгубех РеоНізцеш МесАзрі1ецеи / ; 901 ААСАССАТСА ССАТСТАСАС ССАСССССАС:СОСООСОАСТ АСТАСТОбАС СбОССАССАС АзпбекІ1їе тікгІ1їєтТук ТакАв5рАіанів А зо1уст» туктустТгр Зехлунізсїв їв 961 АТСАТобССА бССССсстТобо СТТСАбСбоС СССбАСТТСА ссттосссст стАСоОСАСС 11еМмесА)а бекРкоУаї с1уРпебекбіу РкгобішРле ТпгРперго ГПеотуксіУтвг с 1921 АТОбОСААСОо СТОСАССТСА ССАбСССАТС СТОБСАСАСС ТООБССАбОСС АСТОТАССОС о Месбіудзп А1адіаРго біпбіпАгудІ1їе УаїАзкцабіп реобіубіпл біуУаїтугАг9 1081 АСССТСАбСА ССАСССТОТА СССТОбАССТ ТТСААСАТСС бСАТСААСАА ССАССАСбСТО Тпгречбег бегтТпгірец ТугАгуАгоРго РпеазпІ1е б1ут1еАв5п Авпбіпбіптео 1141 АбССТОСТОоб АСбОСАССбА СТТСОССТАС ббСАССАбСА ССААССТоСС САбСбСССТо « бегуаїцем АзрбіуТтпг б1оРпедліаТут б1уТпг5ег 5екАзпірео Ргоб5егді1іамаї о 1201 ТАССССААСА ССОССАСССТ СбАСАбССТО САССАСАТСС ССССТСАСАА СЛАСААСбТо ТугАкЧдруз бЗекб)іутпг УаіїАзрбегіео АзрбічнІ1е РгоРгобіп А5пАзпАвзпУуа) ч- 1261 ССАССТОбАС АбООСТТСАС ССАСССТСТО АСССАССТСА ССАТОТТССб САСТоОСТТо (ев РгоРкгоАгу біпбіуРвйе бекНізАгуїбец 5екгНнівУМаї бекМесРпе АгобекгбіурРле « 1321 АбСААСАбСА СССТСАбСАТ САТСССТОСА ССТАТСТТСА ОСТОСАТТСА ССбСАСТОСІ 5екАвзпбег бегУМа1їб5ег 11е1т11еАгудА1їа РкоМесрРпе бегтТІрії1еє НізАкудбегАїа 1361 САСТТСААСА АСАТСАТССС САБСАбССАб АТСАСССАСА ТОССССТоАС СЛАСАССАСЯ біоРпеАаЗл АЗпІ)їеї1е Ргобегбегбіп 11етпикбіп 11еРгоїеш ТрІцузбестрвг « 1441 ААССТОбОСА ССбССАССАС ССТОСТОСААС боСССССОСТ ТСАССббСоо ССАСАТОСТо шщ с Азпіреобіу бекбіутйг бегУаїМаї)цуз біуРгоб)іу Рпетпгбіу б1уА5рІі1ете»ч 1501 СОССбСАССА СССССООССА САТСАССАСС СТОСОСОТОА АСАТСАССОС СССССТодСС :з» АхЗАхУТпг ЗегРІобіу біпі1ебесгТпг ГезАкууа1ї Азпі1еТВг АзіаРгогесйбе: 1561 САбСОСТАСС бССТССОСАТ ССОСТАСОСС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАбІ біплаготуг АгоУа1їАку І1І1еАкутукА1їа бегТпстТйг Азпреобіп РренізТпг5ег т» і521 АТССАССбСС СССССАТСАА ССАбСбСААС ТТСАбСОССА ССАТСАССАС СОбСАССААС ! І1едзрсіу АгуРго11е А5зпбіпбіуд5зп РпебекАзїа ТпІМесбег 5екбіубекАвп (ее) 1681 СстТоСАбАбСо ССАбСТТССо САСССТобоС ТТСАССАССС ССТТСААСТТ САбБСААСобС як, Гечбіпбег біубекРре АкотпгУуа1біу РпетпгтТйг РгоРпеАзп РребегАзпобі1у СО) 70 01741 АбсСАбСССТСТ ТСАСССТСАбС СОСССАССТО ТТСААСАССС ССААССАССТ СТАСАТССАС бБегб5егума1! Рпетіпгцец бегА1іаНізУаї РпедбпбЗек б1УуАБпоіц Ма1ТтТугІзеА5р Т» 1801 СОСАТОСАСТ ТССТоСССОС ССАССТСАСС ТТОбАббССС АСТАССАССТ СбАСАССоСТ АгЧІ1ебі Рпеуа1іРго А1абішуа1іТвкЕ РпебічА1їа бісТукАзр ГеобійпАгоА1а іме) 60 65
    1861 САСААССССС ТСААССАССТ СТТСАССАСС АССААССАСА ТСОСССТОАА САСССАССТо І біпуузАїа МаїА5зпбіш ГеоРпетпгбек бБегАзпбіп Іч11ебіубез БузТпгА5рМаї Кісе і 1921 АСССАСТАСС АСАТССАТСА ОСТСАССААС СТОСТОбАСТ ССТТААСССА ССАСТТСТОС ТагАзртТуг НізІ1едзр біпУаї5екА5п Геруаї1біш Сузцеобек АзрбіоРпесув у 193981 СТОбАССАСА АСААССАССТ САССбАСААС СТОААбСАСо ССААбСбоСТ САСССАССАС цецАзроїч цЦузіузбіш Гезбексічцуз Муайузнів АзацузАгд БепбЗекА5Зрсій 2041 СОСААССТОС ТОСАбСАССС СААСТТССОС СбСАТСААСС бССАССТОбА ссосоостоо АгЯ9А5Зпіеи цепбіпА5р РгоАзпРпедгЧа біутіед5п АгдбіпГеу АЗрАгабіутгр 2101 ССАбССАбСА СССАТАТСАС САТССАСССС СОССАССАСО ТСТТСААССА СААСТАССТОо Агудбіубек ТикАбріїє ТагІ1есіпбіу СіуА5зрАзр Уа1іРМйецуз бійА5зптугмаї 2161 АСССТОСТОСб ССАССТТССА ССАСТОСТАС СССАССТАСС ТСТАССАСАА бАТССАССАб Тпгрецтез біутпгРПпе АзрозінсСузтух РгОотТВІТуг Геотугбіп цУзІ11еАв5рбі 2221 АбСААССТОА АССССТАСАС ССОСТАССАС стосбсбост АСАТССАССА САБССАССАС 5егрузцеи БузАїаТуг ТагАготуго1п БрезАгубіу Тусгі1ебі) АзрбзекбіпА5р 2281 СТОбАААТСТ АССТСАТССО СТАСААСССС ААбСАСБАСА СССТСААССТ бСССббСАСС БрецбіоІі1є Тугрест11є АгутугАзпА1а Пузнізбі ТпгУМаїАзп УаіРгобіуть: до 2341 СОСАСССТОоТ бОССССТбАб СбСССССАбС СССАТССОСА АСТОСОбССА СССбААТССА біубегіеу ТгрРгоїе ЗегА1аРхобехк Ркої1ебіу ГузСузбіу біоРгоОАЗпАгО 2591 ТОСОСТОССбС АССТОбАСТОо СААСССбББАС СТАСАСТОСА ССТОСАСССА СОбОбАСААо СузА1їаРго Нізіеєобі ТгрАзпРЕОАвр ГепА5рСуз 5егСузАгоа АзрбіубіийБув 2461 ТОСОСССАСС АСАбССАССА СТТСАбССТО САСАТССАСС ТОбОСТОСАС СбАССТОААС СузАїіанів нізбегнів НізРпебегієез АзрІ1едзр Ма1б1уСу5 ТИпгА5зрцецйАзп 2521 бАССАССТОоС бССТоТоССтТ САТСТТСААб АТСААСАССС АбСАСбОССА СоСсСсСсосСсТто с бісА5ріеу біума!Ттгр МаіїтіеРпегу5 І11ецув5ТтвІ СІгАзрбіу НівзАзадгоотгех о 2581 ббСААТСТАС ААТТТСТССА АбАСААДАССА ТТАСТАССАС ААбСАСТАСС ТССТОТСАдА біуАзпцеш біоРпецен біобішБувРго ПреоУуаїб1іу бішА1іагеш А1аАгудуаї цу -2541 АСАССОСАСА АЛАХЛАТОСАС АбАСАЛАСОТ СААЛААТТОС ААТСОСАААС АААТАТТОТТ АгаЯАїабіч БузрузТгр АгоАзрОузАгоа б1чгузцео біТербі ТАгАЗпІ1емаї чІ 2701 ТАТАААбАСС СААЛАСААТС ТОТАбАТОСТ ТТАТТТСТАА АСТСТСААТА ТОАТАбАТТА о - Тугрузб)іш Аіацбузбі Зегуа1їА5зрдіа ГеоРпемМмаії Азп5екбіп ТугАзЗрАгоГехм 2761 СААбСОбАТА ССААСАТСОС САТСАТТСАТ ССОССАСАТА ААСССОТТСА ТАбСАТТСОА - біпдіадер ТпгАзЗпІ1е АзїаМесі1іенів Аз1аліадвзр ГузАгоМаї нівзб5егі1еАт со 2821 СААССтТтТАТС ТОССТСАССТ СТСТСТСАТТ ССОССТОТСА АТОСбОСТАТ ТТТТОААСАХ січАїатуг цепРгобіц ГейбекУа1їІ1е Ргобіууаї АзпА1аліа І1їерРвебішсіч чЕ 2881 ТТАСАДЛОбОС СТАТТТТСАС ТОСАТТСТеС СТАТАТСАТО ССАСАААТСТ САТТАААЛАТ й цешбіосіу АгдІі1еРрпе ТвгА)аРрпезехг БеотТугкАзр А1аАгоАзп маїт1іеБузАв5п 2941 ССТОСАТТТТА АТААТОССТТ АТОСТОоСТОС ААССТСАААС СОСАТСТАСА ТСТАСААСАА « б1іуА5рРре А5пА5пбіу Теоб5ексСузТІр АзпуУаіїцуз бі1унізМаї! Азруа1біШшбіо 70 3001 СААААСААСС АСССстТТСостТ ССТТСТТоТТ ССОбААТОСО АДССАСААСТ СТСАСААСАА о) с біпА5пАзп НізАгубесг Маїїезмаїуа1ї Ркобі»ТеЕр Сб1шАз1абі) Уаібегб1псі1о ч 3061 стТтТоСстТотТСстТ СТОоССоСТСо ТОССТАТАТС СТТССТСТСА САСССТАСАА ССАСОСАТАТ и"? маїАгодМаї СузРгобіу АгаоабіутукІі1е БецАгууаї ТБгАзатуг ДПузбіобіутуг 3121 ббАСААССТТ СССТААССАТ ТСАТСАСБАТС бАСААСААТА САбАССААСТ СААСТТТАСС біубішбіу СузуаїТпг 11еНізбіші1е бівА5пАзп ТАгА5рбіЧ БештузРпебе: шк 3181 ААСТОТОТАб ДАСАбСААСТ АТАТССАААС ААСАСОСТАА СОТСТААТСА ТТАТАСТОоСо о Азпсувмаї біобі»бі МаїТукгРЕоАзп АвзптпгМуаї тТвкСувзАбЗп АзЗзрТусгтигАза 3241 АСТСААСАЛО ААТАТСАбОС ТАССТАСАСТ ТСТОСТААТС САбСАТАТСА СббАбССТАТ -- Тпгбіпбіч біотуєгбі б1іутвстуєтве ЗегАгдАЗА Ахобіутух Азрбіуд1іату: . 1 ! СУ 00 5301 САААЛОСААТТ СТТСТОТАСС АССТСАТТАТ ССАТСАСССТ АТСААСАЛАА АбСАТАТАСА . бібегА5зп бегбегуа)! Ргодіалортух А1абЗекА1а Тукбівбію БузАаїатуєт: Т» 3361 бАТОбАССАА САСАСААТСС ТТСТОААТСТ ААСАСАСОАТ АТОСОСАТТА САСАССАСТА Азрб1іУАгЯ АгоАерабЗп РгоСузбій5ет А5пАгобіу ТукбіуА5р ТуттТпгРгоге 1421 ССАССТООСТ АТСТСАСААА АСААТТАСАС ТАСТТСССАС АААСССАТАА ССТАТОСАТІ , оо Ргодіабіу Тугуа!Тиг цузбішіейбі ТугРЛерго біштпгА5р ГузуаїТгріІзе І ГФ) 3481 САБбАТСОСАС АААСОСААСо АДАСАТТСАТС СТОБАСАбСо ТОбААТТАСТ ТСТТАТОСАЄ бічІ1ебіу біштпгб1і біутикРвпеї1е МаїАзрб5ек Маі1бішце ГезцезоМмессіий о 3541 СААТАА біе-- 60 последовательность, представленную на фигуре 13 б5
    1 АТОСАСААСА АССССААСАТ СААСоАСТоС АТССССТАСА АСТбССТбАб СААССССбАС МесАЗрА5п АзпРІоА5Зп І11ед5ЛСіСуз І11еРкоТус АзпСузпцеч 5егА5паРгосбів 61 СТОбАССТОС ТОСбСОбСбА ССССАТССАб АСССОСТАСА СССССАТССА САТСАбССТб Уаїбішуаї Геобіубіу бійАгуї1ебіш Тлгбіутує Тперкої)1є Азрі1езегіе) а 9 121 АбССТСАССС АСТТОСТОСТ САСССАСТТС СтТоСссббсб ссобсттост остобоссто 5екцентвг біпРпеїеми Геобегб)йРве" МаїРгосіу діасіурве Уфііеосіутем 181 СтТобАСАТСА ТСТобСосСАТ СТТСсбСССС АСССАСТОСС дсоссттТест ІССТоСАСАТС уаїАзрі1їе І11еТгрб1у 11еРпебіуРго бегбіпТгр АзрА1аРпе Пепма)біпІ1є 241 САбСАССТбА ТСААССАбСО САТСбАбСАС ТТСССССбСА АССАббССАТ САбССоССТб біобіпрем І1еАзпбіп Агаотї1еб1іоб)іш Рпедіалагу АзпбіпА1а І11е5егАгдгеи 301 бАббОССТбА бСААССТОТА ССАААТСТАС ССССАСАССТ ТСССССАСТо СбАбОСССАС І біобіуцео бегА5прео ТугбілІїетуг Азіабіобег РпеАгобіо ТгрбіпА1адер 361 сСССАССААСС ССбоССТоСб СбАССАСАТО СОСАТССАСТ ТСААССАСАТ бААСсАбСССС РкЕОоТпгАЗп РгоА1іацео АгодбіобішМес Аг9І1ебіп РпеАзпА5р МегАзпбегдіа 19 421 СТОАССАССС ССАТОССССТ СТТСОСОСТО САСААСТАСС АСбТоССССТ остТсАСсСто БрентТвІтТргІ Аі1ач11еРго ГеоРпеА1шаУа1! білАбптТухк біпУаїіРго Цептеобегуаї1ї 481 ТАССТССАбС ССбССААССТ ССАССТОАСС СТОСТоСССб АССТСАбССТ СсТТСоСсСсАб ТусМмаїбіп Аіаліалвп СечкізІіембек МайтесАагу Азруазбет Уа1їіРпебіубій 541 СОоСТообОоСТ ТСбАССССбС САССАТСААС АбССОСТАСА АСбСАССТОАС ССОССТбАТС АгЧтТербсіу РвеазрАа1а матвтт1емдунегасятує АзЗпАЗріеи ТАгАтдечзіїе . чо 1 і 601 ббСААСТАСА СССАССАСоС сстТоСостТо ТАСААСАССС сСсстобАбсСо бототооостТ біуАзптуг ТигА5рНніз А1ама1їАгутІр ТугАзптих біупбемнбіз АгудУвіТгрсіу 661 СССбАСАССС СССАСТОСАТ САССТАСААС САСТТССОСС ССбАбСТСАС сетоАсссто Ргодербекг АгудАЗрТгр І1еАкдтугАзп біпРпедгд Акубіогеч Твгрестпгуаї се 721 СТОСАСАТСС ТСАбССТОТТ ССССААСТАС САСАСССОСА ССТАССССАТ ССОСАСССТо г) ГемАзріїе Уаї5егіео РпеРгоАвзптуг АзроегАку ТпЕТукРто 11еАготпгУаї 781 АСССАССТСА ССССССБАСАТ ТТАСАССААС ССССТОСТОб АСААСТТССА собсАсСстТтТе Зекбіпре ТпгАко9бі 11еТустигА5п РгоМаїцеп бісАзЗзпРпе Азрбо1убекРПе 841 СОССбСАССо СССАбСОСАТ ССАбСОСАбС АТССбСАССС СССАССТСАТ ССАСАТССТо в длк9біубег Аіабіпбіу І1їеб)ічбіубес І1еАкгубетг РкоНізїеи МесА5рі1єгеи о 901 ААСАССАТСА ССАТСТАСАС СОАСОСССАС СОСООССАСТ АСТАСТОСАб СОбССАССАб Азпбекі1е ТапгІ1етук ТпгАзрАа1іаніб Агуб)іусій ТустукТЕр бЗекбіунізсіп ч- 961 АТСАТОСССА бСССССТооС СТТСАССббС ССССАСТТСА ССТТСССССТ СТАССоСАСС Ге І1емесАїа 5егРгоМаї біуРпебЗегб1у Ргобійрре ТпЕрРпеРго тентуго1утиг Зо 1221 АТСбОСААСС СТОСАССТСА бСАССОСАТС СТОССАСАСС ТОбОССАбСб АСТоТАССбО «І Ммесбіудзп АзїадіаРго СіпбіпАгдЧії1е Уаїдіабіп йезбіубіп біумаїтугАг9 1081 АСССТСАССА ССАСССТСТА СССТССАССТ ТТСААСАТСО ССАТСААСАА ССАбСАбСТо ТвгренбЗег ЗекТігієц ТугАгуАгуРго РпедзпІі1е біут1еА5зп Азпріпбіпіеи « 1141 АОССсТОоСТОС АСОбСАСССА СТТССССТАС бОСАССЛоСА оСААССТОоСС сАбсбСсот Зегмаїце АзрбіутТпг бішРведіаТут С1іутТпг5Зекг 5егАзпіГеи Ргоб5екА1аМаї - . и?
    г» (ее) -й
    («в) «з»
    іме) 60 б5
    1201 ТАССССААСА ССОбСАСССТ ССАСАСССТО САССАСАТСС ССССТСАСАА СААСААССТОо ТукАкгдЛ,уз бБекбіутійг УаїА5зрЗекрей Азрб1ізІ11е РкоРхгобіп лАвпавпАвпМаї 1261 ССАССТССАС АСбОСТТСАб ССАСССТСТе ДСССАССТСА ССАТСТТОСС САСТобСТТС РгоРгоАКгу біпбіурре бЗекНніздкдрец бехНібзУаї бекМесРпе Акдб5его1уре 1121 АбСААСАбСА ССОТСАБСАТ САТСССТОСА ССТАТСТТСА ССТОбАТТСА ССбСАСТОСІ ЗекАзпбег 5екма1ї5ег І1їеї11едгЧдАз1а РгоМесРпе 5егтІрі1е НібзАгодбекгкА1їа 551 БАСТТСААСА АСАТСАТССС САбССАБССАС АТСАСССАСА ТСССССТОАС СААбАбСАСС біоРпеА5Ззп АзпІ1їеї1є Ргобекбекбіп 11еТБВгСб)п 11еРгоцео Тпгіувзб5ексктп: 1441 ДАССТОбОСА СССбСАССАС ССТССТОДАС бССССССОСТ ТСАСССоССС ССАСАТСОСТо А5пцеоб)іу бекбіутпг 5егуаїУа1їцуз б1іуРкобіу Рретпсбіу біуА5рі1їете 1901 СбССбСАССА СССССООССА бАТСАССАСС СТОСОССТСА АСАТСАССбС СССССтТбАС АІЗАїгЗІБІ 5егРгобіу біп::тебегтТйх ГПесАгудуа! АзпІїетпг Азаргстеобе: Т561 САбСОСТАСС СССТССбСАТ ССОСТАСОСС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАСС біпАгуотуг Агоууа1їАгу І11єАгутугАїа 5егтпгтаг Авліецбіп Рпенізтпс5ег 621 АТССАСОбСС СССССАТСАА ССАБСОСААС ТТСАбСОССА ССАТОСАССАС СОБСАССААС Іч11еА5рб1у АгуРгої1іє АзпбсіпбСіуАзп РпебекА1їа ТпПІМесб5ехк бегбіубекАвп 1681 СстТОоСАбАбСо ССАССТТОСо САСССТОбОС ТТСАССАССС ССТТСААСТТ слосАЛОСОС БПеобіпбЗег біубегрРле АгутпгУа1біу РпетТбстТпс РгоРпеАзп РпебегАзпобіу
    1741 АбСАбССТСТ ТСАСССТСАС СССССАССТО ТТСААСАбСО ОСААСбАССТ СТАСАТОбБАС б5екб5егуаії Рпетргцем бегАїіанізУаі1 Рпедзпбег біуАбзпбіц Ма1тТугі1едзр 1801 сСосСАТССАСТ тТоСстТоСсСоС ССАССТОСАСС ТТССАССССО АСТАССАССТ СбАСАССОСТ АгЧ9І1еб10 РпемаіїРго Аз1абішуаїТйк РпебіцАзЗа СішТукАвр ГеобіоАгоА1а сч 1861 САСААбСССС ТОААССАбСТ СТТСАССАбС АССААССАСА ТСООССТОАА САССбАСоТо біпцузАіа МаїА5пбіз ПечРпетіпгЗех бекАзпбіл 11ебіуїе цу5тпгАЗруа!1 (о) 1921 АССбАСТАСС АСАТССАТСА ССТСАССААС СТОСТОСАСТ ССТТААСССА ССАСТТСТОС ТвгА5рТуг НізІі1еАа5р біпУа)!бегА5зп Гечуаїб1ім Сузпечнб5ег А5рбо1оРпесув 1981 СТОСАССАбА АСААССАССТ САСССАСААС СТСААССАСО ССААСССОСТ САбССАСбАб Й ГевА5рбіц цузтузбі ресбегбісбуз МаїцузНніз АзїацузАгд ГечнбекА5рос19 о 2041 СбСААССТОС ТОСАССАССС СААСТТСССС ббСАТСААСС СССАбСТоСА ссбссосто5 АгаАзпрео реобіплА5р РгоАзпРпедго б1ут1еА5п Агубіпреч АзрАгобіутТтгр -- 2101 СбАббСАбСА ССбАТАТСАС САТССАбССС СбССАССАСО ТОТТСААбСА бААСТАССТо (2,0) Акобіу5екг ТигАБрІЇе ТагІ1ебіпбіу с1уАзрА5р Ма1Рпецув СішАвптугуаї « 2161 АСССтТОоСтТоб ССАССТТССА ССАСТОСТАС СССАССТАСС ТСТАССАСАА САТССАСоАо Тпгіресгез біутвгРпе АзрбіоСувзтТук РготрйгТухт ГеотТукбіп БузІзіеАзроіч 2221 АбСААССТСА АбОССТАСАС ССОСТАССАС СТОСбСбОСТ АСАТСбАбСА САбССАССАС Зекцузцео БузАзатуг ТігАкутукбіп БезАгобіу ТугІі1ебіМ Азрб5екбіпА5р « 2281 СтТобАААТСТ АССТСАТССО СТАСААСОСС ААССАССАСА СССТСААССТ бСССбосСАСС - с цеоб1ічІі1е Тугіемі1є АготТускАзпАз1а пузНібєСі1іш ТпгМазА5зп Ма)Ргобіутк: - ц 2341 ббСАбССтТоТ боССССТбАб СбСССССАбС СССАТСбССА АСТОСОСССА ФСССААТССА и» біузекцес ТгрРгоцеш 5егА1аРгобет Ргої11ебіу ЦузСу5біу б1іоРгоА5пАхгз 2401 ТОоСОоСТОСоС АССТОСАСТО СААСССОбАС СТАбАСТОСА бСТОСАСОСА СОбОСАбААС СузА1аРко НізГешбі ТЕрАзпРгоАвр ГечАзрСувх бексСувАго Аврбіубіоцув т» 2461 ТОСОСССАСС АСАбССАССА СТТСАСССТО САСАТССАСО ТОбОСТОСАС СбАССТОААТ со СУ5А)1анів нізбБегНніх НізРпебегієц А5зрІ1еАЗзр УМаїбіусСув ТПгА5ЗрІечАдвп 2521 САбСАССТоОо ОСбТоТообТ САТСТТСААС АТСААбАССС АббАСобСсСА сбсссбсстео - біаА5зрцео біуМУаі!тТгтр УаіЇ11еРпегу5з ІїеїузТлг біпА5ро)їу Нізліадгоїеу о 50 2581 СОСААТСТАС АСТТССТОбА бБАбАдбССС СТОобТобОСо АобСССТбоС СооССТбАДС со1уАзптреч бішРпецео біобішцрувзРкго ТГечМУаїб1іу бійАзарео А1алгдУаї уз з» т 541 СбСбССбАбСА АСААСТОССо ССАСААбСОС бАСАЛОСТоб АСТСОСАСАС СААСАТССТо АгуА1аб)ш Бузбузтгр АкЧЯАзрГузАгу бішцузрео біотТгрбі ТпгАЗпі1еуаї 2701 ТАСААСбАбСС ССААССАСАС ССТОбАСоСС СТОТТОСТСА АСАбССАСТА ССАССбСсСсТто Тукцузбсі» А1їшабузбі 5екгуа1їАвзрАіїа ГесорБеуаї Азпбексіп ТухАзрАкУГеу іме) 60 65
    2761 САбССССАСА ССААСАТСОС САТСАТССАС СССССССАСА ДОСОССТосСА с бСАТТСОС ' біпАд1іадвзр ТпгАЗпІ1е АзїаМмесІзїеНнівз Азадіадйзр цузАгуМаії Ніз5егІ1елгу 2821 САСОССТАСС ТОСССбАбСТ САСССТСАТС СССООССТбА АСОССОССАТ СТТССАССАХ сізА1іаТуг ПечРгобіу Гецшб5егкУуа1їІ1е Ргобіуча) АзпАзїадАаізіа І1їеРпесічбів 2981 СТОбАССССС ССАТСТТСАС ССССТТСАСС СТСТАССАСО СССОСААССТ САТСААСААС Меобіобіу Ак9дІ1ЇеРрпе ТпгА1аРпебех БПеоТугА5р А1аАагдАЗп Маіїг1еЦузАвп 2941 ббСбАСТТСА АСААССОССТ САССТОСТбО ААССТСААСО СССАССТОСА ССТОбАССАС біуАзЗрРпе АзпАЗпбСіу БеобексСузТер Азпмаіїцуз СіунізМаї Азруаіб1іобіи 3001 САБбААСАдДСС АССбСАСССТ оСТОобТооТо СССбАСТоОоб ДОБСССАбСТ САбССАСоАС біпАзпАЗп НізАгубЗег МаіцезуаїМаї Ргобіштгтр бічА1абію маї5екбіпсі1о 3061 стТосоСстотТ бССССббССо СбОСТАСАТС СТОСОССТбА СССССТАСАА бОАСбОСТАС уаїАгЧаМУаї Су5Ргобіу Агубіутукі1їе ГезАагоаМаї ТпгА1атуг Цгузбіобіутуг 3121 бОоСбАСбССтТ бССТбАССАТ ССАССАСАТС САБААСААСА СССАССАССТ СААСТТСАСС біубіобіу СузмаїТйг І11еНнізбіцІ11е СівА5пАЗпП ТПгАЗрб1 ТезсузРпебег 3181 ААСТОССТОС АбСАССАбСТ СТАССССААС ДАСАССОТбА ССТОСААССА СТАСАССоСо Авасузмаї бінбіобіч УаіїтТукРгоАвп АзатпгМаї ТигСузАЗп АвртТуктагА1а о ек 3241 АСССАбСАбб АСТАССАбоС САССТАСАСС АбССОСААСС бСООСТАССА СобСоССТАС ТвВгбіпСіо бізТукбів біутвстугтвг 5ехкАкКдАзп АгубіутТух Азрбіудіатух 2301 бАСАССААСА ССАСССТбСС ССССбАСТАС бССАССОССТ АСбАБСАСАА ббССТАСАСС біобегА5п Зегбегуаі РгодіаАазртут А1абекАїа Тугб10б10 Гуздіатуєтвх 3361 САССбССбСС бСбАСААССС СТОСБАСАСС ААССОСООСТ АСССССАСТА сАссссссто 7 АзрСіуАго АгуАзразл РгоСузбійбег АзпАгобіу Тугб1іуАзр ТугТВпгРКОоГецй 3421 СССОСССОСТ АССТОАССАХ СбАССТОСАС ТАСТТоСССо АСАСССАСАА бСТСТоСАТС сі Ргодіабіу Тугмаїтпг Бузбсіціеобіч ТукРперхо біотвгА5Зр ГузМа1ТЕріїе о 3481 бАСАТСбОСО АСАСССАбОО САССТТСАТС СТОСАСАССС ТОБАССТОСТ ОСТоАТобАС бінт1ебіу Сіотпгбіч б1утБгРБеї1е МаїА5рбек Уаїбіццей ценгенмессбі» 3541 САСТАб бін--- « последовательность, представленную на фигуре 15 ав 1 АТОбАСААСА АССССААСАТ СААСбАСТОС АТССССТАСА АСТОССТОАб СААССССбАС МесазрА5л Аб5пРІоАд5л І11еА5пбіоСуз 11еРготТуг АзпСузцео 5егАзпРгобіч ч- 61 бтТобАбССТОоС ТОбОСббСбА бСССАТССАС АССОБСТАСА СССССАТОСА САТСАбССТб с Ууаїбіоуаї цбеобіубіу с1зАгух1ебіч Тпкбіутух ТВгРсої1е Азрі1еб5егьеи « 121 АбССТСАССС АСТТОСТОСТ САбССАСТТО стосссобсо сссосттсст остоооесте б5еглеотіг біпРпеце Гембеко1з1ЧРвпе уаїРгобіу АіабіуРпе Уазїбеобіуїе 181 СтТОобАСАТСА ТСТбббоСАТ СТТоббСССС АСССАСТООО АСОССТТССТ ССТОСАбАТС Уаїд5ріїє 11етгрбіу І11еРпебсіуРто бекгбіптТгр АзрА1аРлпе ГезмаїбіпІіє « 24) бАбСАССТСА ТСААССАбСо САТССАбСАб ТТСОСССОСА АССАСОССАТ САбССоССто з с 7 бісбіпце Ізедзпабіп Агдч11ебінбіо Рпедіалгд АзпбіпА1їа І11е5егАгдтеу ч 301 бАБбОССТОА бСААССТОТА ССАААТСТАС бСССАСАбСТ ТОСОСобАСТо ІОСАБОСССбАС «» бічбіуцею 5егА5піеи ТукбіпІ1їеТуг А1абіо5екх РпедхасСіо Тпро1чЧА1адер 361 СОСАССААСС ССбСССТоСо СБАбСАСАТО СбСАТССАСТ ТСААССАСАТ СААСсАССоСС РЕОотТпгАЗп Ргодіаїтем АгдбішбСіоМес Агдаї1ебіп РпедзпАбзр МесАзпоегАї1а те 421 СтТбАССАССО ССАТСССССТ стТтТобСссто САбААСТАСС АсстТоССССстТ ССстТоАбссТо Бестпгтпг Аз1атіеРго ПеоРпедіамМаї біпАзптТуг біпмаїіРго ПецГецбетгМаї (ее) 481 ТАССТОСАСб СССССААССТ ССАССТбАбС СТоСТоСбСб АСоТСАбСоТ сТТобоСсАб -й Тувугібіа Міалівадзп Беч«Нізтеобеї МаітечА:5 АзвМмаї5ег маїРнесіус)й (ав) 50 541 СОоСТОббОоСтТ ТСбАСбССОС САССАТСААС АбССОСТАСА АССАССТСАС ССОССТОАТо Аготгрбіу Рпедзраіа А1іатпгІ1еАвп б5екАдкКУтут АЗзпАбріем ТПтАгоГечмнт1е з» 7 601 СбСААСТАСА СССАССАСоС СоТоСоСтоб ТАСААСАССо бССТобАбСо СотТотТообоТ біуАзптут ТпгАЗрНі5 Азама1дгтТгр ТугАЗптпг біубеобі АгоУа1їТегро1у іме) 60 б5
    661 СССбАСАбСС СССАСТОСАТ САССТАСААС САСТТССОСС СССАбСТбАС ССТОАСССТо РІсА5рбЗег АгдА5рТтгр Іч11еАгутукАвп біпРпеагу Акобічтечш Тпгіеотвсмаї 721 СтТОбАСАТСО ТОСАбССТоТТ ССССААСТАС САСАбССОСА ССТАССССАТ ССОСАСССТо БевАЗрІїЇе УзібЗегцеу РпеРгоА5Зптуг АзрЗетАх9 ТвЕТукРКо 11еАгУТАгМаї І І 781 АбССАССТОА СССбССАСАТ ТТАСАССААС ССССТОСТоб АСААСТТСбА СОбСАбСТТС бекбіпрею ТпхАкобі ч11етустакА5ЗпП Ргоуаїце) б19А5ЗпРле А5роїіубзесгрРве 841 СбСбоСАССС СССАбСОСАТ ССАССОСАСС АТССОСАбСС СССАССТСАТ БСАСАТоСТо Агабіубеї А1їабіпбіу 11ебі»біубек І11еАгубеї Ркгонізіє МесА5зріїеце» 901 ААСАССАТСА ССАТСТАСАС СБАСОСССАС ССССБССАСТ АСТАСТОСАС СОбССАССАб АзпбекІі1їе ТпгІ)Їетук ТВгА5ЗрАїанів Акдб1іубіє ТустуєТкр бегсіунівосі1їп 961 АТСАТОСССА ССССССТСбо СТТСАбСОСС ССССАСТТСА ССТТСССССТ СТАСобСАСС І1їемесА1їа бегРІоУаї біуРпебекбіу РкобішцРпе ТбгРперко Пестуго1їутьг 1021 АТОБОСААСС СТОСАССТСА бСАбСОСАТС СТОбСАСАСС ТООБССАбОС АСТоТАССоС Месбіудб5п АдіадіаРго біпбіплАгЧі1е Уаї1А1абіл Геобіусіп біумаїТугАг:
    1081 АСССТОАбБСА ССАСССТОТА СССОТСбАССТ ТТСААСАТСО бСАТСААСАА ССАбсСАССТо Тпгуебек бестТйглео ТукАкодАгуРго Рпедвпії1їє біут1едвзп АзпбіпсСіліви 1141 АбССТОоСтТоб АСбОСАССОА бТТСОССТАС ОБСАССАбСА ССААССТОоСС САбСоСсСсото ЗегМа1Гцец Азрбіутийг С1іоРпеАзїатук біутТвг5ек 5екАзпрец РгобегА1ахма) 1201 ТАССОСААСА ССбОСАСССТ ОСАСАСССТО бАССАСАТСС ССССТСАСАА СААСАдСоТІ ТугАгадцуз бекбіутпг МаїА5рбегтеч Азрбіці1ї РкоРгобіп АзпАзпАЗЛлУа! 1261 ССАССТСОАС дОбОСТТСАб ССАСССТСТО АбССАССТСА ОСАТОоТТССб САСТобСТТо РгоРгоАгу біпбіуРне ЗегНнізАгкудцез ЗекНізУМа1ї 5етМесРре Агубекбіурне «132: АБСААСАбСА СССТОАССАТ САТОССТОСА ССОТАТСТТСА ССТОбАТТСА ССОСАСТОоСС 5егА5пбеї бБегМа!5ег І1еїт11еАкЧА1а РгоМесРре бесТеріїе НізАгкгдбекгл1а см 29 1381 бАБТТСААСА АСАТСАТССС САБСАбССАб АТСАСССАСА ТСССССТОАС СААСАбСАСС (о, біоРпеазп А5пІ1еїт1іє РкгобекЗекбіп 11еТпгбіп ч11еРгобез ТпкузбЗегтвх 1441 ААССТОСОСА ОСОССАССАб СОТОСТОААС боССССбОСТ ТСАССОбСОО СбАСАТССТтТо Азпрепбіу бегбіутТпг бегуаїзїМаїцуз біуРкосіу Рбетпгб1іу б1уА5зрІ1етех 1501 ССССБСАССА СССССБоССА САТСАбСАСС СТОСОССТСА АСАТСАССоС ССССсСтТоАС З АгСАтІдТАг 5егРІобіу біпІ1ебегтст ГеолхтзУаї! АзпІ1етрг діаггогеобег о 1561 САбСОСТАСС СССТОСССАТ ССОСТАСОСС АССАССАССА АССТОСАСТТ ССАСАССАСІ біпаготут АгууаїАгУ 11еАгутукА1а 5егтвгТВг А5прецбіп РпенізтТпгоег «- (621 АТСбАССбСС СССССАТСАА ССАССССААС ТІСАбСОССА ССАТСАбСАСб ССОСАбБСАДІ (ее.
    І1іеадзрб1іу АгоРгої11е Азпб1іпбіуА5л РпебегА1а ТпуМесбек бексіубегАв5л 1681 СтТбСАбАбСо бСАбСТТОСо сАсестобос ТТСАССАССС ССТТСААСТТ САбСААСсооС З . Бе»біпбет біубегРпе Агутпкуаїбсіу РпетпхсТВг РгоРБедазп РребегАав5псіу 174) АбСАбССТСТ ТСАСССТСАС СССССАССТО ТТСААСАбСО ССААССАССТ СТАСАТСбАС ЗегбекМаї РпетпгІіец ЗегА1іанівУа1! РпеАазпбег біуАзпбіц МаїтукІ1едзр « 1801 сСосСАТССАСТ ТоСстТоССсСоС ССАССТСАСС ТТОСАСоССо АСТАССАССТ бБАбАСооСТ АгЧІ1їесі РпеуаїРго А1іабіцуа1їТвг РвебіцшА1їа біштугА8р БеобісАхталіа - с 1851 САСААСОССС ТСААССАССТ СТТСАССАСС АССААССАСА ТСССССТОАА САСССАССТО а біпуузА1ї1а УуаїАзпбіо БПеоРпетіпгбЗех бегАзпбіп І1їебіуїеш БувзтпгАзрМУаї1 ни 1521 АСССАСТАСС АСАТСбАТСА АСТАТССААТ ТТАСТТОАСТ СТТТАТСТСА ТОоААТТТТСоТ тТАгАБзртук НізІ1еАЗр біпУа15екА5п цепмаїб1іч Сузцеобек Аврсіорпесув 1981 СтТОбАТСАДЛА АААААСААТТ СТССбАбААА СТСАААСАТО ССААСССАСТ ТАСТОАТСАСо с» Гечпазрбіц їузцузбі ГеобЗегбічсуз Уаїцузнів АїацбузАгд ГБеобегА5роїу (ее) -й
    (ав) «з»
    ко 60 б5
    2041 СОСААТТТАС ТТСААСАТСС ААЛАСТТТАСА бОСАТСААТА САСААСТАбА ССсстТобСстТоо с АгЯ9Азпрец реобіпАбзр РгоАазпРпеАто біут11еА5п Агдбіпьец АзрАгабіутгр 7101 АСАССААСТА СОСАТАТТАС САТССААССА СОССАТСАСО ТАТТСААЛАСА бААТТАССТТ Агубіубек ТпгАврі1є ТлЛгІі1ебіплбіу біудАзразр МаіїіРплецуз бічАзпатукУа! х 2161 АСОСТАТТСС СТАССТТТСА ТСАСТОСТАТ ССААССТАТТ ТАТАТСАААА ААТАСАТСАС Твгрезцео б1іутрІРре АзрбізоСузтТут РгоТПгТут ГезТугбіп Гузт1еАзрбіц 2221 ТСбАААТТАА ААСССТАТАС СССТТАССАА ТТААСАбОСТ АТАТСбСААСА ТАСТСААСАС Зекрузрем цузА1аТуг ТигАгатТугсіп ГепАгоабіу ТукІ1ебіц Азрбегбі1пА5р 70 2281 ТТАБАААТСТ АТТТААТТСС СТАСААТОСС АААСАССАЛА, САСТАААТСТ СССАбСТАСО ТечзчсішчІі1іе ТугіечІ1е АгодтугА5пАа1іїа Пузнівзбі ТигМа1д5зп Ма1Ргобіуть: 2341 ббтТтТоСтТтТАТ СОССоСТТТС АбССССААСТ ССААТССССА АСТОСССОСА ССССААТСбА біубегіеи ТІрРгоГес ЗекАіаРкобЗек Ргоїт11ебіу узСузбіу бійРгоАзпАго 2401 ТбСоСТССбо АССТОСАСТО СААСССОСАС СТАСАСТОСА ОСТОСАСССА СбСОСАСААЄ СузА1їаРго Нібзіешбіц ТІрАЗпРІОАБр БемчАврСув5 5егСузАкЧ Азрбіусічьув 2461 ТОСбСССАСС АСАСССАССА СТТСАбССТО САСАТССАСС ТОООСТОСАС ССАССТОААС Суздіанібх нізбегНів НізРпебекцеи АзрІЗедзр УаїбіуСуз ТпгАвріречАв5п 2521 бАбСАССТОО СССТСТООСТ САТСТТСААС АТСААСАССС АССАСОбССА СбесСбсСсТео бімдєрсец СіуМма1їТгр уа!11еРКегуз 11еГувзтрьк біпАзроїу пібзАІалгогеу 2581 СОСААТСТАб ААТТТСТССА АСАСАЛАССА ТТАСТАССАС ААССАСТАСС ТСОТОСТОААА біуАзпіец біоРпегео біоб1іорузРго Гепузібіу СішА1іацен Аіалгоуа1ї ув 2641 АбАбСОСАСА АААЛАТССАС АбАСАЛАСОТ САЛАААТТОС ААТОССАААС АХЛАТАТТОТТ Аг9А1і1абіш цузцузТгр АгудАзрЦузАгу біоцузрей бійТгро)и ТВгАзпІЗемаї 2791 ТАТААЛАСАСО САЛАЛСААТС ТСТАСАТОСТ ТТАТТТСТАА АСТСТСААТА ТСАТАбАТТА Тугрузбіш діагузбі б5егуа)!А5рА1а ГеоРпемаї АвпбекСіп ТугАєрАгоїТем с 2761 СААбСССАТА ССААСАТСОС САТСАТТСАТ СССССАСАТА ААСОСОТТСА ТАбСАТТОСА Го) біпдіадвр тагАБлІ1е А1їамесІі1енівз Азаліалзр цузАтгуМмаії Нізбегі1елгзд 2821 СААССТТАТС ТОССТСАССТ СТСТСТСАТТ СССОСТСТСА АТСССОСТАТ ТТТТОААСАХ " бічшАз1аТуг ПеоРкобіз ГечЗекуаїт11іе РгобіуМаї АзпА1аАза т16Рпес1іисі1о 2881 ТТАСААССоС СТАТТТТСАС ТОСАТТСТОС СТАТАТСАТО ССАСАЛАТСТ САТТАЛАААТ М Гечбі»біу Агої1іеРпе ТпгАЗаРпебзег речптукАзр А1заАгулзп Маїт11ієеБузАвп о 2941 ССТСАТТТТА АТААТСОСТТ АТОСТОСТОС ААССТСАААС СССАТОТАСА ТСТАСААСАХ біуАЗрРпе АЗпПАЗпо1і1у ГезбексузТур Азпуа1іцуз б1уНізМа) Азруаїбішсів чн: 3001 СААААСЛАСС АСССТТобоТ ССТТСТТСТТ ССбОААТОСо ААССАСААСТ СТСАСААСАХ со біплзпА5а НізАгуЗес МаіценуаїУаї РгобісТетр біцА1їаб)у Ма1ї5егбіпб19 3о 3061 сттТсстстстТ СТоСоостсо ТОССТАТАТС СТТоСТСТСА САСССТАСАА ССАСОСАТАТ т Уа1іАгуМаї) СузРгосСіу АхусіутукІ1їе ПпецАгдМаї ТіпгАзатух Гу5біобіутуг 3121 СбАСААОСТТ СССТААССАТ ТСАТСАСАТС САСААСААТА САСАССААСТ СААСТТТАСС біубінбсіу СузмаїТлг І11енізбсіЧІ1е СІ0А5пАзп ТВгАЗрС1о ГепгуєРНебе: « окт 3181 ААСТСТСТАС ААСАССЛАСТ АТАТССАЛАС ДАСАСССТАА ССТСТААТСА ТТАТАСТОСС АзпСувМаї бішб)інб1о Ма1тТугРкоАзп АзпТПгУМаї ТВЕсСувАвЗп А5рТустпгАза о) с 3241 АСТСААСААС ААТАТСАССС ТАССТАСАСТ ТСТОСТААТС САССАТАТСА СОСАСССТАТ ц Й ТпгЕб1іпбіц біотуго)о біутистТусгтвг 5егАгуА5п Акодбіутуг А5рб1уАіатуг т " 3301 бАААССААТТ СТТСТСТАСС АССТСАТТАТ ССАТСАСССТ АТСААбАДАА АССАТАТАСА біоб5егА5зп ЗегбЗегМаї РгоАліадзртуг А)іабегА1а Туго1біц ГУЗА1атТугтес
    45 . 5361 бАТОСАССАА САСАСААТСС ТТОТОСААТСТ ААСАСАССАТ АТОСОСАТТА САСАССАСТА «» АЗрО1уАкго АгуАЗраАзп РгтоСузбі5ег АзпАгобіу ТукбіуАєр ТугтпгРІгОоГек о 3421 ССАССТСОСТ АТОТСАСААА АСААТТАСАС ТАСТТСССАС АЛАСССАТАА СОТАТОСАТТ РгОоА1іабсіу ТукУМаїТвг цузбішьеобі ТугрРпеРго біотпгА5р Гузма1ТЕерізе -й 3481 САСАТСОбСАС АААСССААСС ААСАТТСАТС СТОСАСАССО ТОСААТТАСТ ТСТТАТОбА5 о 50 б1ічІ1ебіу сіотвгб1іо с1утвеРвеї)е УаїАзрб5ет Уаїбішгеи БезрезМмесбіо 3541 бБААТААб Чл» бін---
    2. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность кодирует СтуІА(Б) протейин и является последовательностью, вьібранной из группьі, включающей 5ЕО ІЮ МО:З3, ЗЕО ІЮ МО:4, последовательность, представленную на фигуре 7. ГФ) З. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность кодирует кю СтуіА(Б) протеин, которьій термостабилен по сравнению с нативньм СгуіА(Б) протеийном, и является последовательностью, вьібранной из группьї, включающей последовательности, представленнье на фигуре 9, фигуре 11, фигуре 13, фигуре 15. 60 4. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность содержит последовательность, которая кодирует СтуІВ протеин и представлена на фигуре 6.
    5. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включаєт первьій промотор, обеспечивающий направленную зкспрессию нуклеотидной последовательности в растительной клетке, операбельно связанньій с указанной кодирующей последовательностью. бо б. Фрагмент ДНК по п. 5, отличающийся тем, что указанньй промотор обеспечиваєт направленную зкспрессию связанной с ним кодирующей последовательности в клетке кукурузь!.
    7. Фрагмент ДНК по п. 5, отличающийся тем, что указанньй промотор вьібран из группьї, включающей индуцибельнье промоторьї, конститутивнье промоторьі, промоторь!ї, регулируемье в процессе развития или во Времени, тканепредпочтительнье или тканеспецифические промоторнь!.
    8. Фрагмент ДНК по п. 5, отличающийся тем, что указанньй промотор обеспечиваєт направленную специфическую для зеленьїх тканей зкспрессию указанной кодирующей последовательности в растительньх клетках.
    9. Фрагмент ДНК по п. 5, отличающийся тем, что указанньй промотор вьібран из группьї, включающей /0о бамму355 промотор, Саммт195 промотор, промотор РЕР карбоксилазьї, промотор, обеспечивающий предпочтительную для сердцевинь! стебля зкспрессию, и промотор, обеспечивающий специфичную для пьІЛЬЦЬ! зкспрессию.
    10. Фрагмент ДНК по п. 8, отличающийся тем, что указанньій промотор является промотором РЕР карбоксилазь.
    11. Фрагмент ДНК по п. 5, отличающийся тем, что указанньій промотор обеспечивает предпочтительную для сердцевинь! стебля зкспрессию, и содержит последовательность, представленную на фигуре 24 1 бААТТСССАТССАТТАЛАСААСТСТТТСААСАСАТТСТАСАСАТСТАСТТТААТСАССТС бо 61 ССААААСТСТТСААЛАААТТСАССССССАССССАТТАССССАССССТАСТСТТАТСТТТТ 120 121 АААСАСААСАССАСТТТСТТСАТСТСТТСТАААСАСАААТСТТТТСТААСААССАТОСТоО 180 181 ТосСтТосСтТСАТССААССТТТТСАТССОСАААТТТТТСАТАСАСАТАТТАСАСССААСАСАЄ 240 241 ССОССАААААСАТССАТСТАААТССЛАСТОСССАССТССТТСАТАССТСССТСАТСТТСА 300 301 АСАСААААТССАТТАТСАААААСТОЛАТОСАТТТТАААСТСТТСТтТТтТТСТТоССсТІТТо 360 361 СААТСАССТСААААТАТСТОСТАТТАТТСТСАТСАСССТСАТТААТСААТСТСТОССТАС 420 421 слАтттостІтолсттвАтВОСІтСтО ЛА воСАОСАТО ТІСТІ ТАААТТОСАСТОСАТАТ 480 481 СААССТтТТТССААТСТАТСАСААТСТСАСАТОССТССААТСТСТСТСАТТТІСТСОАЛАССА 540 541 ТАТССАТСТТАТССАТААССТАТТТСТТСААСТТСТТАТАТТТСССТТССАСАТТТАТАТ 600 601 тТСсСАТССТТТСААСАТТТТТТТСТТСААТСТТТТТТІСТТТТТТТССТТтТССАААСАТССА 660 с 661 ТАСАТТТССТОСТССТСАСАССТААССАССАССТТТСЛАААААССТТСТОСТТТАААСТС 0720 721 АССТСТСАСССТССАССАААССТСАСАТАТСТАААСТСССТСТТСТТАСТТСССАСАСАС 780 о 781 тТСсАСТОСТААСАСАСАТОСССААСАТСАССАСААААААААААТСАТАТТТАССССАСАСАС 840 841 ААСААТАТТСТТСТАСТСОССААСТСТССТТАТССССТАССАААССААТСТАСССААСТТСТ 900 901 САААТСТСТТОССАТСТСААСТАТАТАСАСТАТТСАТСАСТТССААСТСТАТСАААСТСТ 960 961 ССАССТСААТТАТАСАСТТСААТАААСТОСТОСАТСТАТТТОТТСТТАТССТСАТАТТТО 1020 1021 СтТтТААСАТАТТААЛАТСАССТСССАССААСАТТТАААСТОСАССАТТТАААСТСОСТСОС 1082 З 1081 САССАССАЛАССССТСААААССССАЛАТСТТТАССАССТТСССАСССССАСССТТТТІСТА 0/0 1140 1141 ТСтТСАТССТСТІСТТІССТТСТССАССАССОСССАССССССААСССТОСТОСАТССТСТАС 1200 - 1201 ТотТАСАСТАТАТТССАТТТОССАСССАССССАССАТССАТССАСССАСАСТОСССАСТОС 1260 - 84 1261 САСССАСССАТСТОССАСТОССТАССТАТАСТАССТСАССТСАСАТТСАСТСАСАТСССАТ 1320 -465 -405 со « -
    с . и? щ» (ее) - («в) с» іме) 60 б5
    1321 СССАСССАСАТАТТТТАСТОСТСТОСТТСТСТСАСАСАТААТАААССАТТТАТСАССАТТ 1380 1381 ССТОААСАССАСАСАССАТОССТОСАСАТАСАСЛААССТТТСТСТСТТТАТТСССАТССА 1440 1441 ТСТТТСАТТАТСТТТТАТСАТАТАТАТАТААСАСАТАТТАЛАТСАТТСТТССТТОСААТТ 1500 -285 -я-- Її 226 1501 ТАТААТТСАТТТСАСТТТТТТАТССАСССАТССТССТТТТАТТАААЛААЛАТАТТАТААТ 1560 -225 -166 1561 ТАТТСТТАСТТТТТСТТСТААТАТТСТТТАССАТАТААТААЛАСТТТСАТАСТАСТАТСТТ 1620 -165 . -106 49 70 1621 ТССбАССАААААЛААААТАТТААТАТТТАСАТТАССАССССАТТААТТААТТАТАТТОСАЄ 1680 -105 -46 83 «1 1681 АСААСССААССАААССАААССАЛОСТААТСТТОССОСТОСТСТОСАТССАСАСОСССоСТ 1740 745 | 15 . тужжежккиа /5 1741 СТТОСТАТАЛАССАСОСАССТАСАССССАСТССАСТСАТСАСССТСАТСААССТОЄЛОСА 1800 16 ке 7 кеоапвккиаквиниайажж 1 5 1801 АССАССЛАССААСОСАСАССТТСТТОСАСАСЛАСССАСАТСССТТТСССССССАЛЛАССТ 1860 б М А ЕЕ А Р ОК т 5 135 1861 ССтТоСтТОСтТССтТоССтТотТССТоСОССтТоСАСОСАССТСАСТССССОССОСТОСТССТсА 1920 207126 5 55553 А ОА А ОО 5 Р Р В В Ії А 3195 ха ж 41 1921 СОСОСАТСТССТССАССССААСАСССАСАСОСАССТАССАССССССССТССТОСТСАСТА 1980 196 в М 85 8 ТТ А Т Р ВА В ВА У 0 АТА МУ: М МОТО Ж ї265 1981 ССАССАССАСТОСТАСАССТОССОСООСТОСТСТСАСССТТОССССССССССоССобсАСС 0 2040 сч 5256 т т т А ВА А А А А А У ТТ М Р А А Р Р 0 А 1315 з о 75 8 2041 СббОССоССоСССССоСтТоССАССАЛАССААССССССССАССС со 2106 316 с в в В в с он 0 5 К В ВН Р ОО КК 5 КК Р 4355 М101 СоСтТСтТобСАСАССАТОСССССССТСАТОСССААССССААССТТССТАТАСТАСССССоС 0 2160 «376 мМ 8 0 т М А А В М.А К б К - у 2161 СТСтТССтТоСтТоСТтТАТТТТОСОСАТАСССОСОСАСАТАСАССТОСТТТАССТАССТААСА 2220 ав) 2221 ССТАСАТСАТСССТОСАСАСССССТТСАТССССТАСАТСАСССССССССАСССССАССТА 2280 Т А ЕЕ І Р У І Т А б 0 Р б Б «- 2281 СССАССАССССССАСССОСТОССТСТОСТОСАСОССТСТОбСОСССАССТСАТССАССТО 2340 со А т т А Б А Б В В Б 0 б с б А 0 М І Е г 2341 боССтТАСССТОСТСОСАССССТАСАТССАСССССССАТСАТССАССССТооСТооСсоссс 02400 в б У в С 5 0 Р У І 0 б Р ІСІ 0 А 5 М А 240) оСТСТОСССАСССОСАССАССАТССАСССССТОСТОСАСАТССТОАСОСАССТСАССССЯ 2460 А Б А 585 б т т М 0 А У Б Б М Б АВ Б М ТР « 2461 САССТОТОСТОСССССТоСТОСтТоСТСтТоСТАСТАСААССССАТСАТСТСТСССАССТТо 2521 Е Б 5 С Р У У В Ь 5 У ХХ К Р І М 5 В 5 5 - с 521 ССССАБАТСАЛАСАСОСООСОСТССАСОСТААСТАТАССТАССТСТТСССАТСССССТТо 2580 ц А ЕЕ М Кк Б А б ХУ Н ще а 2581 ААТТААТТААТТТАТАСТАСТССАТТСАТСТОАТСАТТТТТСТТТТТСТТТТТАСТСАСА 2640 2641 ОСТСТТАТАСТОССТСАТСТОСССТАССТОСССОСССАСТСССТСТОСАСТСААСССААС 2700 б 0 І М Р 0 Б Р У М А А НО 5 Б М 5 Е А К ї- 2701 ААСААСЛАССТОСАССТОСТАССТТСАЛАТТААСТТСАТССАТСТСАТСАТТТАТСТАССТ 2769 М М М І ЕЕ Б І (ее) 2761 АСАТССАССТАССТАТААТТАССАССАТАТСАССТОСТОСТОАСААСАССАСССАТАССА 2820 - У Ь ТТ РА І Р СУ 00 2821 СкАСАСАСОАТСААССАСАТСАССААСОСТТСАСААСССТТССТСТАССТОСТАСТТАТА 2880 Е р В М Кк ЕЕ І Т К А 5 ЕЕ С ЕЕ У ї ї, Я»
    ко бо 65
    28081 ТСТАТАТАТАСАТССАССАССТААСТСАТТССАСССССАТОСА ' ТАТАТОСАСОСТТСААТ 2940 2941 ТСТОСАСАСАССАССААСАССАССАССАССАСТААСАСТАССТАССССССТАССТІТССАЄ 3000 3001 СТСАСССТСААСССАСТСАСАССТОСТСССССАЛАССТСААСССАССАСТССАСТСАСТС 3060 МУ 5 М МН б У т б Р в А М М М Р А МУ в 5 г, 3061 АТССАССАССТТААСААССТСАСТААСААСССССТТОСТСТТСОСТТССОСАТАТССААС 3120 І 0 ЕЕ М Ко ОКОМ То М ОК ОР ОМ А Моб ЕЕ б 1 5 К 3121 ССССАССАССТОСААССАССТАССТАССТАССТСАССААЛАЛАЛАСТСТТААСААСТТТТС 3185 Р ЕЕ НН М Кк 3181 ТТТСАСААССССССТАСТАССТАССТААСАСТСАТСАСТСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАТ 3240 70 О 1 3241 ТОСОСАСТСССССССТСАСССССТСАТСАТССССАСССССАТОСТСАСССАССТОСОССА 3300 А 0 М б А 0 б МУ І І б 5 А М ХУ А ОО Ьс ЕЕ 3301 АССОССТТСТОССААССААССССТСАССАСССТОСАССАСТАТСССАСССССАТСЛАСАА 3360 А А 5 Р КК 0 б її А В Ь Б Б ХХ А В б М Кі м я Що і 79 3361 соСоСтТОССАТСАСТСОСАТСАСАЛАСТААААССТАСАСАСАСАСТТСАТААТАТСТАТСТ 3420 А Ь Р 3421 АТСАТСТСССАСААСАССАСССАССААТАААААТААСССААСТССАЛАСТСААССТТАЄСТ 3480 3481 СТАТАТАСАСССТАССТССТССТОСТОСТТССССАТССАТСТОСССССССТАССТАССАЄ 3540 3541 ААССТСТАССТАСТАСТАТСТААТССАТОСАСТСТОСАССТАСТАОСТАССТоСсССсСсТтТо 3600 3601 АТТССАТТАТААТТСТТОССТСТОСТОТССТАССАСАТСТАССТАСТССАТСТТСТАССА ЗО 70 звві сслАСААССТОСОСТАССТАССССТСТССАТССТАТАТСТАСТСАТТААТСТОСАСАТТСА 3720 З 3721 АТАААЛАСТАСАСТАСССАТАТСАТОССТАССТАССТСТСТАТАСТТТСТОСТСАТАТАТ 3780 3781 ССТОСТСАТСАССТОССТСАТСТССССАТССАТСТСТСТССТАСТОСТТОСТОТТАААТО 3840 384) ССТТСТТТСАСАСАСАСАССАССАССАССАССАСТСАСССТСТССАСОСССССОСТТТАА 3900 3901 САСАТСТААСАТАТТТТААСАССТАТААСАТАССААССАССАСАЛАТСТОСАССАСТОСС 396 сч 3961 АТАТТОСАААСАСАЛАЛАЛААААСААХАТТАЛАСТСССАССАЛАСТАСАСАТАСТАЛАСА 4020 АО21 ССТОСАТОСАТТАЛААТТАТСТСАТСАТТТТТССАТСТОСТСАААТАСАТССАТАТОСТА 4080 4081 ТТСАСАТСТАТСТТСТАТАСССТТТТСАТТАССТТТСТСАЛАЛАЛАЛАТОСТАТСАТСАЄ 4140 о 7141 ТОоСОСАСТАССТАСОСССТСТСААССАСТСССАТОСОСТТССАССТАСТТСТТТСТоСоСС 0 4200 01 ТАСТССССТТСТАТТТАССТСССАТСССАСТССОССАТОСТССОСТІССАТАСССОСТАЄ 4260 4261 САССАЛАССТССССАССТСАСТТТТАССССССТССССТАСССССАССАССАССССТТТТТА 4320 4321 ААСТСССТАССАСТСССССАТТТААТААСАСАААСАТТОСААЛАЛАТАССТСТАТТТТТТ 4380 4383 АТТТААААТАТАТІСТТТАТТТСТСАААТСТСТАТТАТТТОТААТАТАТАТТАТТСТАТА 4440 «І 4441 ТАСТТАТАТСТТСААТТАТСАТТТАТАААТАТОТТТТТТАТТАТСААСТСААТТТТААСТ 4500 4501 ТтТСАТТТАТСОСТТОСССОССТОСАССАСССАСССТСААСАТТТТТОССТОССОСТТААС 4560 о 4561 СССсТССоССССоСССССтТТССССССАТССАСОССССАТОСССТСТооСССтТосТтТоссТо 4620 4621 АСТТСАСССССТСССАСААСССОТССССООСССССАТААТТААТСССОССТААСССТОоС 4680 4681 СТОСТТАААСССТОССТОССТСЛАСОСАССОСССССОСССССССССССТТТСАСАТСТСТА 4740 -- 4741 СТоСтТСТСАТТАСАСАТОСССАТСССААСССАТСАСТСАТТСССТСТССАСАЛАТТССАТА 4800 4801 ТСААССТТАТССАТАСС 4817 с
    12. Фрагмент ДНК по п.5, отличающийся тем, что указанньій промотор обеспечиваєт специфическую для « пьІЛЬцЬ! зкспрессию, и содержит последовательность, представленную на фигуре 35 ТТАСТУАСАССТСТССААТСОСТТСССТТСССАСАТТСТТАССТТТТАТСАСАТТТТААСАААТАСАСТТСАССАССТТС -- Я; Я 0 Я т т Т Я Я Я Я Я - «6 Ж ЯЗ А 5 « Я - ТЯ А-- й - і ВО « ААААТАТОССТАТАСААТСААТСАТССТТОСАТССААТАТАССТАСАТТСААСТАССТАТАТАТОСТСААТАСААСССТо тн тині щі дуже он т о пінеток нт Денне т пон нт тт тенет тет ять овен етнічне кто нет і во в) с ТОАССАССТСАСАААСАССАСТТСААТТТТСАСАСССТААСССАСТАААТССТТАААСТССТСТТАТТАТТАСТСТТАСС : Конт нижня інт тритон ЦО ;» " АСТТСТССТТССТАААТОСТТСТСАСССАТСТАТАТАТСТТССССАСТСССССАСАТАСТАТАТАТАСССССТТОСАССТ СтАСОСТАТСТСАААСОССТАСТСАСААСААТТСТСААСАСТАТТТААТТТТАТАСАТСТАТСААСАСТОТАССААТТТО т» - ф | - 6. « "-«-6 2 - '« 5 ж'- 5 .- ф 4 :-ю- -7 (ф- «5 :-- 5 15 -: Я « . «Р - Р тт т т А т тт ко ЩО со СТОСССААСССААСАСТОССАССТСТАААТТСССТАССТАААСТТАААТАССССТСТТСТТАТТТАССТТТАТСТАСТС - («в їз» 52 іме) 60 б5
    ТСТАСТТАСАСТААТТСАСАААСААТТТТАСААССТАТОСТТААТСАТАТСТСТАСТСТААССАААТТ ГАССАААСТТАА принт п о оо «р о я т о БВО ААССАСАСААТТАСССАСАТСТСААДАСАТСТСТАТОСТААСТААААСАСТТАТААССАДАААСТСССТСААТССТСААСА пан п п пн ТТ ТСТОСТОСТАТАТСССААТСАТАТТАСАТСССАСААТАТАССССССАААТССАТСТАТАССАТСТСТАССАССАТАССТо ТОСССБАСТОТССААСТОСАСАСАТССАССАТССТСТСТТСТТАСАТТТОСТТАТТАССТААТТОСССТАСААСТТСТТСАА ООСТАСАССАААТТААААААСТААТАТТАААСАТАААААСТТАСОСАААСТАТАСТАААТТАТОСАСССАТССААСААСА ""ССАТОТСТССТОбСТСАТСАСССАССССТСССССАТАСАСССАСАТСАТСТТТССАТАСССАТОСТССТТАТССААТТ щ--- «5 « Я ( «я ти А Ь НА Я пня А інтен. БО ТТСТСТОССААААСАСААСССТТААТАСАСССАСОССАСААТСАТОСААСТОСТССТТТТАССТССТСАТСАТСААСТТСА і --- Я « «Я Єнот т тн тн Мн і 1040
    15 . СССАДААСССАТСАДАТСТААТОСАСАСАААТССТАТТТСТТСТСТТСТАААТСАСССАСАССАСТАССАТСАСТАСАВА Есоні Й ТТСАБААТСАСААТТСАСТСТТССААССАСААТААТСССАССАТСТТСТАААААТТТССАСАДАСТТСТОТТТСАСТТСТ пити 1200 АБСССТСАССТТТССАААТАТТТСААСТТСТОССТОСТСАСАСААСТТСААТСТОСААСТОСТОТТСАТСАСТТТТСССА і? - «6 « 6 4 - :- 2 :' '(:ї 6 626 2 ж - 2 т т ло во САААСАССААССАСССТАТАТАТАТСТСТСАССАСАСАСССТОССССССТСТТСТТТССССССАТТСССТСССТАСССТТ Хва | , . (о) САДААТСТАСАААССТТТТТТТТТССТССССАТАСОССССТОСАТСТСТСССССТТСАТСТСССТОССТОвСТоСССТоС ' --- 4-0 Дт тн отит тя я тини ЯК Р о тн понят нення В птн кт кт ЛО Ц ЦО -- ЇлАМА СТАРТ) СТСССАБСАСССССССССАСТССТТСССССССССАБССАТОССССАСТОСТОСТССААСОСССССССАСАСОСССССССА З зо ЕЕ нн о п п п о п п В У тШВБ-- (юУуУУ)2-:-5 2 6 2 Є - 2 о зксон1і-- ШИ - СССАССССССАААССССАСОССССААССССССОСССТСССССААСААСССССАСОСАСААСОСоССТССТССТОСТССОС 1600 со пннаонтлнааюаа в а ,аап аа вана ,хаоаааа аа аа пока вн а а м и п В діт п - (Я - 8 2 -:- а ЕАА4 л-6 Зо --2 6 25 82322 2Ш2ВЗ-3 3-3 ---З3К30Н1--35332028080-177337-75777773527ТТТНЦНТННЮНЮНЦНЮЦТ-, - сстесстостосссстостестосссстостостессссссссСАССАССААССССОССТСАСССАСССССССССССАССС 168о оо ІІ І ІЕЕ ЕЕ ЕЕ і и пн п ни шт -ш-- ( ою рол я т Я Я « ССАССТСССОСАССАААССВССОССОСССТОобОСАСОСТОСТОВОССООСССАТОСАССАССТОСОССССАССТАСТОС - с --кет ння Я А тн тк. т о ня о 01760 ч - ю« 6-6 («.ШВЗ.6 2 2 22 535 5:35 ЗОНІ - -2 6 Ж--73-33-73----3--- и?» Її (о) -їь 20 («в») т» 25 іме) 60 бо
    Ача! АТССОСААССАССТСССССССССССАСТТСССССТСАСССАССТСТССАСССАССССАССАВСССССАСААССТОСССТС пт нн нн пото точну астронавт ота ран пн я пані інн он ант ут ен ння ло, - ' -Щ----- 7 ---ВИ:УШУШВШЮ.ШВШШШШШШТ ЗОНИ: - - - 6 - т т т От т й 4 ХАБАССАТСИССААССССААССТООССОССАСССАССАССТОСАССАССТОССОСОССАССТОСАСАТСАТОСАССАСС ЕВЕЖ-ЗЗБЗАВБАБИАИЗЗЗЗ2О22О212 22 1 ОО ОО ОЛООпооппоппоплоквонА Я Я - - Хю« « « Л «ТЗ А Я («ло ТСТСССОССАССССААССТоСТоССССТСССССССоССтТАССАССАСААССАСАСССТССАССТССТСАТССАССТСТСС -Ж-------------2ннннннн ЗЗОВНІ ----Т--ННнНнНн--ОВОНО Ачаї . ССОбОСОСССАССТСТТСВАССССАТСАТСОССССССОССАСТАСАСССАСССССОССССССССАССТОСТОССССССАТ - 6 -2--3ШКШВШХ3-- -23Ук50н1------5------7---2353И353-7-7 Ахаї Що ССТОСАСАТССТССАСАССТОССАСТССАТСССССТОАТОСАСССССАСАТСААСССССАСААСТТССТОСТОСТСАССА а ЕІ ЕІ І ЕЕ ЕЕ ЕЕ нн нн 2160 - («-Я Ж Ь 2 2 Зш- Ж « Я 2 3 ЗКЗОНІ- - : :-:-------------- АССАССАССАССССССССТСААССССАСССАСТТСССССТСТСССТСТТСТТСААССАСОСССАССТОСТСАСССАСАТС ----------254- Й .- 4'---й «пк тт ЯК ЕН опт птн я ЦО сі ш- « «юю « «ОЗ « ЗШ ння ------- -- 2-2 2 2 («6Щ( З2 5 65 « « «Л« «Л« « «Л ЗКЗОНІ1-А 25 572 НнНнНнНнНнНнНнНнН-Н- . Ге) Ама! і СТССССАСССССТАСТАСАТСОССССССАССТОСТСААСАССААСТАССССССССАСССССАСАТСТОВАСССТОССССТ ---5---- -5--52--ЖШ---2Б-Б-2ИЗЗЗ--2БЗ---5-2 52 Б 5555 ЗК3оН1--- 5-5 5 ЗБ Б8Б-Ш22ШШ ЙН6ШШ5-252ШШ2Ш8ВБН- й й (ав) Ватні і «- САТССТСТАСАТСТТССТССССССССТоССТОССТТСТоСССАССТСССАТСССТСССТСТТССТССТАСАССАТАТАСА -Ш- « 2-4. 22 Ж 65 ф ми пиття ЗК3ОНІ1 интрон.іІ-- - Ж - - - в СААССССАССАТОСАТТТОСТТСТСАССССТОТТСТТССАТСАССАСАСААССАСААСООСАТСТТСАСССССАТССТОС 2480 а а І ЕЕ ЕЕ І ЕЕ ЕН и пи нин най ян нНТрОНІ1 зказоНнт - - І с САССССАССТТСАССТСТССАСССАСССАТССССАСАСАТСТСССССССАСССААССАТСТССТСААСААВАТССТСААС й птн кетони опт ення Бостстявст ОЗ БО п Молитовні "» янннтнннннШЗ ЗОНИ ЗТ
    ЧК» (ее) шо
    (ав) «з»
    ко 60 б5
    АТСААССССААССАСССССТСАСССССТТССАССТССТСАСТААСТАСССАСАТССТТОСТСТСАТАСАСТСАТАТСААТ -- Л --зкдон2-- - -- - - - Я -ж' - - ---- - -юинтрон2--- - -- ---
    ТСТАТССТТСАТСАССААССАТССАССОСАТТТССТСААСТТОТАСАТСАСССАТССАТСАААСААСАСССАСАСССОСС ------ я ---«--ї интроно Зкаон 3----- ТСАСАССССОСТТСАСААССТТСТТСТССАСАСССТСААССАСТТСАЄССССАТСААССАСТТСААСАДАССАССАТТСА 170 пшано чав ча чи п и нн я ни ин и ни нн п чи М 2800 пнннннжннжжана а айнтлняннанннн аа а а а а а а о а - 6 (ф-- 6 6 56565652 56 5 5 « 5 565«Х НОТ.
    ТОН ТТТТТТТНТНТТТТННТНН СССТАСАТТАТСТСАТААААССТССАСАААТАСААСТТСТСААСААСАССААТССТТАСАСОССАСААТТТТСАТТАТАА ГІД дк тт нт тт нт ОВО те - шт (Й 2 ол ЗО интрон3------------- -- ААТОСТСТТСАТСАСАТААТСТТАСАТСАТАССТОССТОССТАТСССААСАССАСАТСАСАССССТОСААССАСАТСТТСАА о відки СНІП І ПОТ ІТ ово - -- - интрон з зкаонаЄ -------
    СААСАТТСАСААССАТААСАСССССАССАТТАСССТССАССАССТСАААСАССССТТСССАААССАСССССССААССТСТ ню ПІП ПТ, оо ТАСАСАСССАААТССАСАААСТААТССААССАСТСАСТТТТСАСАСТАСААТСТТАААААААССААТТСТСАТТСТТТТС сч о В В т нини нн нн нт и т п т и и тн ВК ВК) о - -- --- шз»хк3он4«4-- 6 - - ---- --- -- 7 ж ж - - ЯЯХинтрон.--- т -- -- - - - ААКАТСААСААСТААТСТОААААСАТСССТОСТСАДАТОСТТТАТАСАТТТССАСССТСАСССТСАССССААССССТТАА нн нт т п п и ВС МіО чІ з Опт дян - - - -- Ь ь- я -интрона зкооні-- («в») Есопі ч ТТАСТАССАССААТТССТСАССССААСАСТОСАТАТСААСАААСТОСАТАСАСААСАССАССТТТАСАСАССАТТССАС с ШО «І Б 5 «РР А ЛО ЛО он -УЮгО- «З « «Р ОА А Р ЛО 5 ' Есов І ТАТТТССАСААССАСААСАСССССТААСТТСААССТТААААТСАТАСАССТОСТАССТСААТТСТОСАСААСАСАТАТСА « У, пн - с - - ж -з3»«3он 5------- 2 ----ят- -оонтрон------------ . а с» (ее) -
    (ав) Я»
    ко бо 65
    ТААСАССАСАСАТАТАТААТТССТТТАТСТСАСАССТАСАТТАСТАААСКАСАССТТСАССАСОССТІ СААССАССААС : з44о - 5 т интрої МНН Я: о ддодже тт СТТСТАТСАСССССАТААААТСАААСАСАТСАТСТСССАТОСССАСТСТСАСААТСТААССААСАААСАТТАТТТАААТТ мет ----- - 3520 п Ада зкзоне он в ТЕАССССАСАААСТАААСТАТАСАЛАССАСАТСАТСАТАТСАААТТТТСАССТОССССТОСТАСАСАААТАСААСССАСТ 170 - 65 - « 2-5 " 6 «6 5 - .«- Ж ------------------------------- - к « - 'Й ЗБО)
    Ї. ванн нове питна пн нн ринв НН по пп В пн пн воно пп пдв дол панни попи опо в пн вв нання І - - « -« « 3 - х |("" й 6 -Ш-Ш-ШШХЯВВЄХинтронв-- - Є2 - - -- - й - -- - - АСАССААААТСАСТААСТТСТСАТСАТТАСТТСТТССТОСТААСТСААСАТТУТСТСТТСТТАСТТТСТТАТТСТТАААСС І Ї, вв нн вав вн спа ДІВ т п подана пн Но полон оон сн А
    175. - --- Ї----Яя»УунтронЙ?Є-- - - -5 - 6 - - -- -ш т- АААСАСТТАААТТСАСТТТТССАСАТОСАССАТССААССАТАСАТТАТТСАСАСТТТСТОСССАТСАТСАССАААСССАС -- ШИ 5 интрон Є стих т---Н-Н--НИ ПСТССТОСССАСССААТСААСАТСААСААСАССССАСАСАТАСТССТАТАСТСААСТСААССАСМААСТСТСТААТСТА т З ЗКВОНТ Ан АТСТСТАТАССАССТСАДАСААССАААТТТСТАСАТСТСТАСАСАААТССААТОСССТТАСТТТТОСААСТТАСТТСАТС 3820 с пня чани а ча ПО и п ни ни нн и ни ншш Ни щі 6) САТОСТТСТОТАССТТСТОСТАТТСАТТОСААСТСАТТТСАААСАСАТССАТАСТТАССААСТСАСААДСАТАСАТСТАС добо ' нн чн а А и а а а М В чи НН и в виш М ТАСТССТАСАСАСАСААСААТАССАТККУААТТСАСТААСТСТСТАТТТСАСААСАСТАСАССТОССАТСТАТТАТТСТС АТТСТССТСССАААААТАСТСАТСАТОСАТТТСАСАСААСААТАТССААСААСАТССАЄСТСССТАТАСТСАСТССТАТІ во о - (ух Ж - - я-- '« - ' 19 5 - - 52 ' т т НН 1 Абосс «- -- 165 - - (ее)
    13. Фрагмент ДНК по п. 5, отличающийся тем, что дополнительно включаєет второй промотор, обеспечивающий направленную зкспрессию связанной с ним кодирующей последовательности в растительной (Ж клетке, операбельно связанньйй с еще одной последовательностью, как описано в любом из пп. 5- 12.
    14. Фрагмент ДНК по п.13, отличающийся тем, что указанная вторая кодирующая последовательность является оптимизированной для кукурузь! последовательностью, которая кодирует инсектицидньй протеин. «
    15. Фрагмент ДНК по п. 14, отличающийся тем, что указанная вторая кодирующая последовательность кодирует протейин Васіиз (пигепдіепвів (В... т с 16. Фрагмент ДНК по п. 15, отличающийся тем, что указанная вторая кодирующая последовательность ч» кодирует СтуІА(в) протеийн. " 17. Фрагмент ДНК по п. 13, отличающийся тем, что указанная вторая кодирующая последовательность является маркерньїм геном.
    18. Фрагмент ДНК, обеспечивающий направленную предпочтительную для сердцевиньі стебля зкспрессию ве связанного с ней структурного гена в растении, и содержащий последовательность, представленную на фигуре о 24.
    19. Фрагмент ДНК, обеспечивающий специфическую для пьІільцьі зкспрессию связанного с ней структурного - гена в растений, и содержащий последовательность, представленную на фигуре 35. о 20 20. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность по п. 18 или п. 19, операбельно связанную со структурньім геном, кодирующим инсектицидньй протеин. ї» 21. Рекомбинантная молекула ДНК по п. 20, отличающийся тем, что указанньй структурньїй ген представляет собой последовательность, которая кодирует инсектицидньй протеин по любому из пп. 1-17.
    22. Способ получения оптимизированной для кукурузьі кодирующей последовательности инсектицидного протеина по любому из пп. 1-4, включающий обнаружение аминокислотной последовательности заранее о определенного инсектицидного протеина и изменение кодирующей последовательности протеина за счет замень! соответствующих нативньїх кодонов на кодонь, которье найболее предпочтительнь! для кукурузь!. ко 23. Способ защитьії растений кукурузьі по меньшей мере от одного насекомого-вредителя, включающий стабильную трансформацию растения кукурузь! по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью по 60 любому из пп. 1-17, или рекомбинантной молекулой ДНК по п. 20 или 21, где кодирующая последовательность кодирует инсектицидньій протеин, за счет чего трансформированное растение кукурузьії зкспрессирует инсектицидньй протеин в количестве, достаточном для защить! растения от насекомого-вредителя.
    24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что инсектициднье протеиньі! зкспрессируются в количестве, достаточном для борьбьї с чешуекрьільми или жесткокрьільмми насекомьми-вредителями. 65 25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что инсектицидньій протеин зксперссируется в количестве, достаточном для борьбь! с насекомьіми, вьібранньіми из группьії, состоящей из мотьілька кукурузного, огневки сахарного тростника, совки, бабочки, походньїх червей, листоедов, проволочника и тлей.
    26. Способ по любому из пп. 22-25, отличающийся тем, что указанньій инсектицидньій протеийн является протеином В.
    27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что протейн В.І. является СтуІА(В) протеином.
    28. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанньій промотор является тканеспецифическим или тканепредпочтительньм. с щі 6) « «в) «- (ее) « -
    с . и? щ» (ее) - («в) с» іме) 60 б5
UA94005307A 1991-10-04 1992-05-10 Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника UA48104C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77202791A 1991-10-04 1991-10-04
US07/951,715 US5625136A (en) 1991-10-04 1992-09-25 Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize
PCT/US1992/008476 WO1993007278A1 (en) 1991-10-04 1992-10-05 Synthetic dna sequence having enhanced insecticidal activity in maize

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA48104C2 true UA48104C2 (uk) 2002-08-15

Family

ID=27118547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA94005307A UA48104C2 (uk) 1991-10-04 1992-05-10 Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника

Country Status (18)

Country Link
US (9) US5625136A (uk)
EP (3) EP0618976B1 (uk)
JP (2) JPH07500012A (uk)
AT (1) ATE221916T1 (uk)
AU (1) AU2795292A (uk)
BG (1) BG62782B1 (uk)
BR (1) BR9206578A (uk)
CA (1) CA2120514C (uk)
CZ (1) CZ292953B6 (uk)
DE (1) DE69232725T2 (uk)
DK (1) DK0618976T3 (uk)
ES (1) ES2181678T3 (uk)
HU (1) HU220294B (uk)
RO (1) RO110263B1 (uk)
RU (1) RU2202611C2 (uk)
SK (1) SK283357B6 (uk)
UA (1) UA48104C2 (uk)
WO (1) WO1993007278A1 (uk)

Families Citing this family (1615)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
CA2074355C (en) * 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6025545A (en) * 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) * 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US6750046B2 (en) 1991-02-22 2004-06-15 Sembiosys Genetics, Inc. Preparation of thioredoxin and thioredoxin reductase proteins on oil bodies
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
AU4469793A (en) * 1992-08-19 1994-02-24 Monsanto Company Method for transforming monocotyledonous plants
US5885571A (en) * 1992-08-27 1999-03-23 Plant Genetic Systems, N.V. Bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins
US5849870A (en) 1993-03-25 1998-12-15 Novartis Finance Corporation Pesticidal proteins and strains
US6281411B1 (en) 1993-08-25 2001-08-28 Dekalb Genetics Corporation Transgenic monocots plants with increased glycine-betaine content
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
AU712874B2 (en) * 1993-08-25 1999-11-18 Monsanto Technology, Llc Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
AU1439995A (en) * 1993-12-13 1995-07-03 Ecogen Inc. Control of aphids with (bacillus thuringiensis) toxin proteins
US5689052A (en) * 1993-12-22 1997-11-18 Monsanto Company Synthetic DNA sequences having enhanced expression in monocotyledonous plants and method for preparation thereof
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
AU691707B2 (en) * 1994-10-24 1998-05-21 The Administrators Of The Tulane Eductional Fund Oral immunization with transgenic plants
US5631152A (en) * 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
JP3761628B2 (ja) * 1995-07-14 2006-03-29 住友化学株式会社 植物プロモーターおよびその利用
NZ312976A (en) * 1995-07-26 1999-06-29 Pioneer Hi Bred Int An expression control sequence for general and effective expression of genes in plants
GB9516241D0 (en) * 1995-08-08 1995-10-11 Zeneca Ltd Dna constructs
DE69638032D1 (de) * 1995-10-13 2009-11-05 Dow Agrosciences Llc Modifiziertes bacillus thuringiensis gen zur kontrolle von lepidoptera in pflanzen
GB9600786D0 (en) * 1996-01-15 1996-03-20 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US5986174A (en) * 1996-06-21 1999-11-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize promoter sequence for leaf- and stalk-preferred gene expression
AU742971B2 (en) 1996-11-20 2002-01-17 Monsanto Technology Llc Broad-spectrum delta-endotoxins
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US7585645B2 (en) 1997-05-27 2009-09-08 Sembiosys Genetics Inc. Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products
US6218188B1 (en) * 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
AU774176B2 (en) * 1997-11-12 2004-06-17 Mycogen Corporation Plant-optimised genes encoding pesticidal toxins
EP1676922B1 (en) * 1997-11-12 2008-09-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
AUPP058797A0 (en) * 1997-11-28 1997-12-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel gene
EP1054972A2 (en) * 1998-02-20 2000-11-29 Novartis Pharma AG. Insecticidal toxins from photorhabdus
US6121521A (en) * 1998-04-01 2000-09-19 Novartis Ag Chimeric insecticidal protein and DNA coding therefor
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
CA2703161C (en) 1998-10-23 2011-12-20 Mycogen Corporation Plant-optimized polynucleotides encoding approximately 15 kda and approximately 45 kda pesticidal proteins
US20110014706A2 (en) * 1998-12-14 2011-01-20 Monsanto Technology Llc Arabidopsis thaliana Genome Sequence and Uses Thereof
US6420630B1 (en) * 1998-12-01 2002-07-16 Stine Biotechnology Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L.
US7252966B2 (en) * 1999-01-29 2007-08-07 Evolutionary Genomics Llc EG307 polynucleotides and uses thereof
US7439018B2 (en) * 1999-01-29 2008-10-21 Evolutionary Genomics, Inc. EG1117 Polynucleotides and uses thereof
US20080047032A1 (en) * 1999-01-29 2008-02-21 Evolutionary Genomics Llc Eg307 nucleic acids and uses thereof
US6278041B1 (en) 1999-07-30 2001-08-21 Syngenta Participations Ag Peroxidase gene sequences
CA2381144C (en) * 1999-08-04 2012-05-01 Tosk, Inc. In vivo high throughput toxicology screening method
US6365129B1 (en) 1999-08-04 2002-04-02 Tosk, Inc. Invivo high throughput toxicology screening method
CN1423520B (zh) 1999-11-10 2011-05-04 安·斯雷德 调节植物细胞分裂的组合物和方法
CA2331674A1 (en) 2000-01-28 2001-07-28 Southern Illinois University Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same
MXPA02009254A (es) * 2000-03-24 2003-05-23 Pioneer Hi Bred Int Metodos de seleccion y desarrollo de plantas que tienen una calidad de raiz mejorada y una raiz resistente al vuelco.
EP2290090A1 (en) 2000-08-11 2011-03-02 Syngenta Participations AG Methods for stable transformation of plants
BR0113512A (pt) 2000-08-25 2005-05-10 Basf Plant Science Gmbh Polinucleotìdeos de planta que codificam novas prenil proteases
US7053265B2 (en) 2000-10-02 2006-05-30 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Application of bi-directional promoters for modification of gene expression
US6593273B2 (en) 2000-10-06 2003-07-15 Monsanto Technology Llc Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with pesticide
US8080496B2 (en) 2000-10-06 2011-12-20 Syngenta Crop Protection, Inc. Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with thiamethoxam pesticide
US6586365B2 (en) 2000-10-06 2003-07-01 Monsanto Technology, Llc Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with clothianidin pesticide
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
US20050287647A9 (en) 2001-05-30 2005-12-29 Carl Perez Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
WO2002099067A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Oishi Karen K Gene expression and production of tgf-b proteins including bioactive mullerian inhibiting substance from plants
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
AU2002332666B2 (en) * 2001-08-27 2006-10-26 Syngenta Participations Ag Self-processing plants and plant parts
AU2002354015B2 (en) 2001-11-07 2007-04-26 Syngenta Participations Ag Promoters for regulation of gene expression in plant roots
US7230168B2 (en) * 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
EP1947201A3 (en) 2002-01-16 2009-05-06 Evolutionary Genomics, LLC Methods to identify evolutionarily significant changes in polynucleotide and polypeptide sequences in domesticated plants and animals
JP2006500908A (ja) 2002-03-06 2006-01-12 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 新規なＶｉｐ３トキシン及び使用方法
JP2005521400A (ja) * 2002-03-29 2005-07-21 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 植物におけるラムダインテグラーゼ媒介型組換え
US20030208790A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Insect resistant plants and methods for making same
EP1970442B1 (en) 2002-05-03 2017-01-18 Monsanto Technology LLC Transgenic high tryptophan plants
US7049491B2 (en) * 2002-05-03 2006-05-23 Bayer Bioscience N.V. Plants made insect resistant by transformation with a nucleic acid encoding a modified Cry1Ab protein and methods for making same
US20030208789A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Wound-inducible expression in plants
US7667099B2 (en) 2002-06-20 2010-02-23 Board Of Trustees Of Michigan State University Plastid division and related genes and proteins, and methods of use
TW200411069A (en) * 2002-08-08 2004-07-01 Evolutionary Genomics Llc Detection of evolutionary bottlenecking by dna sequencing as a method to discover genes of value
US6920521B2 (en) * 2002-10-10 2005-07-19 International Business Machines Corporation Method and system of managing virtualized physical memory in a data processing system
EP1576178A4 (en) 2002-12-26 2008-03-05 Syngenta Participations Ag POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH CELL PROLIFERATION AND USES THEREOF
US7460252B2 (en) * 2003-01-13 2008-12-02 Axiohm Transaction Solutions, Inc. Graphical printing system and method using text triggers
US20040210964A1 (en) * 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
NZ567340A (en) 2003-02-20 2008-10-31 Athenix Corp Delta-endotoxin genes of bacillus thuringiensis and methods for their use as pesticide
US7189694B2 (en) * 2003-04-18 2007-03-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Inhibitors of autophosphorylation protein kinases
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
TWI345587B (en) 2003-06-17 2011-07-21 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of insulin in plants
US8710298B2 (en) * 2003-08-18 2014-04-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Heat stable variants of plant adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase small subunit
EP1670922A2 (en) 2003-10-03 2006-06-21 University of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for synthesis of a flavor and aroma volatile in plants
US7935862B2 (en) * 2003-12-02 2011-05-03 Syngenta Participations Ag Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination
US7368629B2 (en) * 2004-02-04 2008-05-06 Divergence, Inc. Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom
AR048669A1 (es) 2004-03-03 2006-05-17 Syngenta Ltd Derivados biciclicos de bisamida
EP2311965A1 (en) 2004-03-08 2011-04-20 Syngenta Participations AG. Glutamine-rich maize seed protein and promoter
WO2005102034A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Syngenta Participations Ag Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue
ES2665463T3 (es) 2004-06-14 2018-04-25 Evogene Ltd. Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos
EP1761558A1 (en) * 2004-06-30 2007-03-14 Allergan, Inc. Optimizing expression of active botulinum toxin type e
CA2575994A1 (en) * 2004-08-04 2006-02-16 Allergan, Inc. Optimizing expression of active botulinum toxin type a
GB0418047D0 (en) 2004-08-12 2004-09-15 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
GB0422401D0 (en) 2004-10-08 2004-11-10 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
JP5053861B2 (ja) 2004-12-17 2012-10-24 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 除草性組成物
AU2006230352A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Evolutionary Genomics Llc EG1117 and EG307 polynucleotides and uses thereof
MX2007012344A (es) * 2005-04-05 2007-12-13 Pioneer Hi Bred Int Metodos y composiciones para disenar moleculas de acido nucleico para la expresion de polipeptido en plantas usando la desviacion de codon de virus de planta.
JP4879969B2 (ja) 2005-04-08 2012-02-22 アセニクス コーポレイション 新規なクラスのｅｐｓｐシンターゼの同定
CN101203611B (zh) 2005-04-19 2013-08-14 巴斯福植物科学有限公司 控制基因表达的改良方法
MX358750B (es) 2005-04-21 2018-08-31 Univ Florida Materiales y metodos para el control de enfermedades respiratorias en caninos.
WO2006116202A1 (en) * 2005-04-22 2006-11-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for engineering resistance to tomato yellow leaf curl virus (tylcv) in plants
GB0508993D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Syngenta Participations Ag Pesticidal compositions
US7781648B2 (en) 2005-05-18 2010-08-24 Board Of Trustees Of Michigan State University Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm
EP1917359A2 (en) 2005-06-02 2008-05-07 Syngeta Participations AG Ce43-67b, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128568A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag T342-142, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128569A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag 1143-14a, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
US20100024077A1 (en) * 2005-06-02 2010-01-28 Syngenta Participations Ag Ce44-69d insecticidal cotton
JP5149171B2 (ja) 2005-06-30 2013-02-20 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 機能強化製剤
CN101278052A (zh) 2005-07-18 2008-10-01 普罗塔里克斯有限公司 生物活性大分子的粘膜或肠给药
EP2314163A3 (en) 2005-07-21 2011-08-31 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions comprising tebuconazole
KR20080052570A (ko) 2005-07-29 2008-06-11 타게티드 그로스 인코퍼레이티드 야생형 ｋｒｐ에 의한 활성 사이클린-ｃｄｋ 복합체 억제의우성 음성 돌연변이 ｋｒｐ 단백질 보호
EP1937056A4 (en) * 2005-09-02 2009-11-25 Evolutionary Genomics Llc EG8798 AND EG9703 POLYNUCLEOTIDES AND THEIR USE
EP1929019A2 (en) 2005-09-08 2008-06-11 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
EP1763998B1 (en) 2005-09-16 2007-05-23 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
AU2006298844B2 (en) 2005-09-20 2012-01-12 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-siRAN
SI1928238T1 (sl) 2005-09-29 2009-10-31 Syngenta Ltd Fungicidni sestavek, ki obsega ciprodinil
ES2393406T3 (es) 2005-10-19 2012-12-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Virus de la gripe capaces de infectar a cánidos, usos de los mismos
EP1776864A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
BRPI0618965B1 (pt) 2005-10-24 2021-01-12 Evogene Ltd método para aumentar a tolerância de uma planta a uma condição de estresse abiótico, método para aumentar a biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, método para aumentar a eficiência do uso de fertilizante e/ou absorção de uma planta
AR057205A1 (es) 2005-12-01 2007-11-21 Athenix Corp Genes grg23 y grg51 que confieren resistencia a herbicidas
BRPI0620337A2 (pt) 2005-12-22 2011-11-08 Syngenta Participations Ag métodos e composição para engenharia de crescimento e controle de doenças
BRPI0706368A2 (pt) 2006-01-06 2011-03-22 Univ Georgia composição, vetor, método para fornecer resistência ao cisto nematódeo a uma planta, proteìna de fusão, método para inibir atividade biológica, ácido nucléico isolado
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
AR059035A1 (es) 2006-01-16 2008-03-12 Syngenta Participations Ag Insecticidas derivados de antranilamida
CA2643809A1 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 Edenspace Systems Corporation Energy crops for improved biofuel feedstocks
WO2007103768A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Athenix Corporation Methods and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant
US7977535B2 (en) 2006-07-12 2011-07-12 Board Of Trustees Of Michigan State University DNA encoding ring zinc-finger protein and the use of the DNA in vectors and bacteria and in plants
WO2008010228A2 (en) 2006-07-20 2008-01-24 Yeda Research And Development Co. Ltd. Photosyntheticorganisms and compositions and methods of generating same
CA3020590A1 (en) 2006-08-04 2009-02-12 Bp Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP2489265A3 (en) 2006-09-18 2012-10-24 Basf Se Pesticidal mixtures comprising an anthranilamide insecticide and a fungicide
ES2531135T3 (es) 2006-09-21 2015-03-11 Basf Enzymes Llc Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso
US20100162433A1 (en) 2006-10-27 2010-06-24 Mclaren James Plants with improved nitrogen utilization and stress tolerance
WO2008064056A2 (en) * 2006-11-22 2008-05-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Tetracycline repressor and uses thereof
EP1925205A1 (en) 2006-11-23 2008-05-28 Sygenta Participations AG. Plant propagation material treatment nematicides
AU2007333258B2 (en) 2006-12-07 2014-07-17 Kansas State University Research Foundation Acetolactate synthase herbicide resistant sorghum
AU2007335706B2 (en) 2006-12-20 2013-03-28 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
PL2069490T5 (pl) 2006-12-21 2018-09-28 Basf Enzymes Llc Amylazy i glukoamylazy, kwasy nukleinowe kodujące te związki oraz sposoby wytwarzania tych związków oraz stosowania ich
US9617530B2 (en) 2007-01-12 2017-04-11 Kansas State University Research Foundation, Inc. Acetyl-CoA carboxylase herbicide resistant sorghum
EP2118274A4 (en) * 2007-01-29 2010-09-01 Univ Ohio State Res Found GENE EXPRESSION SYSTEM IN PLANTS WITH A VIRUS-BASED EXPRESSION VECTOR
EP2114149A2 (en) 2007-01-29 2009-11-11 Syngeta Participations AG Herbicidal composition
US20100189706A1 (en) 2007-01-30 2010-07-29 Cathy Chang Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
GB0704906D0 (en) 2007-03-14 2007-04-25 Syngenta Participations Ag Fungicides
DE102008059357A1 (de) 2007-03-22 2009-04-23 Sumitomo Chemical Co. Ltd. Agrochemische Zusammensetzung zur Bekämpfung oder Prophylaxe von durch pflanzenpathogene Mikroben verursachten Pflanzenkrankheiten
ES2325523B1 (es) 2007-03-22 2010-06-24 Sumitomo Chemical Company, Limited Composicion agricola para controlar o prevenir enfermedades de las plantas provocadas por microbios patogeos de las plantas.
US9522937B2 (en) 2007-03-28 2016-12-20 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
WO2008121633A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-09 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
JP5256753B2 (ja) 2007-03-29 2013-08-07 住友化学株式会社 イソオキサゾリン化合物とその有害生物防除用途
EP2154946B1 (en) 2007-04-09 2013-06-05 Evogene Ltd. Polynucleotides, polypeptides and methods for increasing oil content, growth rate and biomass of plants
WO2008125410A2 (en) 2007-04-12 2008-10-23 Basf Se Pesticidal mixtures comprising cyanosulfoximine compounds
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
US20110079544A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for sorting resistant seed from a mixture with susceptible seed
JP2008291012A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物ならびにその植物病害防除用途
JP2008291022A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物及びその用途
JP2008291013A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物およびその植物病害防除用途
US20100069499A1 (en) 2007-04-27 2010-03-18 Sumitomo Chemical Company, Limited Amide compound and use thereof
GB0710223D0 (en) 2007-05-29 2007-07-11 Syngenta Ltd Novel Herbicides
EP2005812A1 (en) 2007-06-22 2008-12-24 Syngeta Participations AG A method for growing sugarcane
GB0712653D0 (en) 2007-06-28 2007-08-08 Syngenta Ltd Novel herbicides
EP2179651A4 (en) 2007-06-29 2012-07-11 Sumitomo Chemical Co MEANS FOR THE CONTROL OF PLANT DISEASES AND METHOD FOR THE CONTROL OF PLANT DISEASES
WO2009010260A2 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Syngenta Participations Ag Condensed anthranilamide insecticides
EP2183371B1 (en) 2007-07-24 2015-07-01 Evogene Ltd. Polynucleotides, polypeptides encoded thereby, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance and/or biomass and/or yield in plants expressing same
GB0716414D0 (en) 2007-08-22 2007-10-03 Syngenta Participations Ag Novel insecticides
GB0717082D0 (en) 2007-09-03 2007-10-10 Syngenta Ltd Novel herbicides
UA106719C2 (uk) 2007-09-20 2014-10-10 Басф Се Фунгіцидна композиція, що містить фунгіцидний штам і активну хімічну сполуку
US8349877B2 (en) 2007-09-26 2013-01-08 Basf Se Ternary fungicidal compositions comprising boscalid and chlorothalonil
US8175813B2 (en) * 2007-10-09 2012-05-08 Athenix Corp. Computational methods for synthetic gene design
BRPI0817854B1 (pt) 2007-10-10 2018-05-02 Athenix Corporation Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira bacteriana, e método para proteção de uma planta contra uma praga
WO2009052242A2 (en) * 2007-10-16 2009-04-23 Athenix Corporation Axmi-066 and axmi-076: delta-endotoxin proteins and methods for their use
ATE521605T1 (de) 2007-11-20 2011-09-15 Sumitomo Chemical Co Pyridinverbindung, schädlingsbekämpfungsmittel und verfahren zur bekämpfung von schädlingen
WO2009069123A2 (en) 2007-11-26 2009-06-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Compositions comprising fibrous polypeptides and polysaccharides
MX2010007962A (es) 2007-11-27 2010-11-10 Medicago Inc Particulas tipo virus de influenza recombinante (vlp) producidas en plantas transgenicas que expresan hemaglutinina.
CA2704271C (en) 2007-12-03 2016-07-19 Syngenta Participations Ag Engineering enzymatically susceptible phytases
JP5347463B2 (ja) 2007-12-26 2013-11-20 住友化学株式会社 除草用組成物
MX357387B (es) 2007-12-27 2018-07-06 Evogene Ltd Polipeptidos, polinucleotidos aislados utiles para modificar la eficacia en el uso de agua, eficacia en el uso del fertilizante, la tolerancia al estres biotico/abiotico, el rendimiento y biomasa en plantas.
EA034733B1 (ru) 2008-01-21 2020-03-13 Медикаго Инк. Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение
FR2928070A1 (fr) 2008-02-27 2009-09-04 Sumitomo Chemical Co Composition agricole, utilisation d'un compose pour sa production et procede pour matriser ou prevenir les maladies des plantes.
ES2442931T3 (es) 2008-03-21 2014-02-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Composición para el control de enfermedades de las plantas
JP5365047B2 (ja) 2008-03-28 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
US9074193B2 (en) * 2008-04-09 2015-07-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Heat resistant plants and plant tissues and methods and materials for making and using same
JP5369854B2 (ja) 2008-04-21 2013-12-18 住友化学株式会社 有害節足動物防除組成物および縮合複素環化合物
CA3148194A1 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and peptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
EA020327B1 (ru) * 2008-06-25 2014-10-30 Атеникс Корпорейшн Гены токсинов и способы их применения
US8344209B2 (en) * 2008-07-14 2013-01-01 Syngenta Participations Ag Plant regulatory sequences
WO2010012649A1 (de) 2008-07-29 2010-02-04 Basf Se Piperazinverbindungen mit herbizider wirkung
RU2011108560A (ru) * 2008-08-05 2012-09-10 Юниверсити Оф Саут Флорида (Us) Способы лечения когнитивного нарушения
US9132168B2 (en) 2008-08-05 2015-09-15 University Of South Florida Methods of treating cognitive impairment
BR122021014165B1 (pt) 2008-08-18 2022-08-16 Evogene Ltd. Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, biomassa e/ou tolerância ao estresse por deficiência de nitrogênio e seca de uma planta, e, construção de ácido nucleico isolado
ES2480665T3 (es) 2008-09-08 2014-07-28 Athenix Corporation Composiciones y métodos para la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga en plantas
EP2183969A3 (en) 2008-10-29 2011-01-05 Basf Se Method for increasing the number of seedlings per number of sowed grains of seed
TWI526535B (zh) 2008-09-12 2016-03-21 住友化學股份有限公司 噻唑菌胺對於基因轉殖植物在植物病害之防治方法的用途
US20110201649A1 (en) 2008-09-19 2011-08-18 Sumitomo Chemical Company, Limited agricultural composition
JP5355053B2 (ja) 2008-09-19 2013-11-27 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
TWI489941B (zh) 2008-09-19 2015-07-01 Sumitomo Chemical Co 種子處理劑及保護植物的方法
JP2010100611A (ja) 2008-09-26 2010-05-06 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリジン化合物及びその有害生物の防除用途
CN102171203A (zh) 2008-10-02 2011-08-31 巴斯夫欧洲公司 具有除草作用的哌嗪化合物
JP2010090089A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
JP2010090090A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
AR075465A1 (es) 2008-10-22 2011-04-06 Basf Se Uso de herbicidas de sulfonilurea en plantas cultivadas
AR075466A1 (es) 2008-10-22 2011-04-06 Basf Se Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas
US8921658B2 (en) 2008-10-30 2014-12-30 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides encoding a MAP65 polypeptide and methods of using same for increasing plant yield
GB0820344D0 (en) 2008-11-06 2008-12-17 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
JP5359223B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-04 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5417814B2 (ja) 2008-11-25 2014-02-19 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365161B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365159B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP5365158B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365160B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
US9133475B2 (en) 2008-11-26 2015-09-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Aphid resistant soybean plants
GB0822834D0 (en) 2008-12-15 2009-01-21 Syngenta Ltd Novel herbicides
US8362318B2 (en) 2008-12-18 2013-01-29 Board Of Trustees Of Michigan State University Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae
JP5212350B2 (ja) 2008-12-24 2013-06-19 住友化学株式会社 含ハロゲン有機硫黄化合物およびその用途
JP2010168362A (ja) 2008-12-24 2010-08-05 Sumitomo Chemical Co Ltd 含硫黄化合物およびその用途
AR074925A1 (es) 2008-12-29 2011-02-23 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos codificados, y metodos para utilizarlos para modular la tolerancia al estres abiotico, biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
GB0900864D0 (en) 2009-01-19 2009-03-04 Syngenta Ltd Novel Herbicides
BRPI1007175A2 (pt) 2009-01-22 2015-08-18 Syngenta Participations Ag Polipeptídeos hidroxifenilpriruvato dioxigenase mutantes e métodos de uso
GB0901086D0 (en) 2009-01-22 2009-03-11 Syngenta Ltd Novel herbicides
BRPI1007268A2 (pt) 2009-01-26 2015-08-25 Syngenta Participations Ag Combinações pesticidas.
BRPI1005366B1 (pt) 2009-01-27 2022-02-08 Basf Se Uso de um adesivo, formulação de revestimento de semente, kit de partes, método para regular o crescimento de plantas e/ou para controlar vegetação indesejada e método para controlar pestes
AU2010209008B2 (en) 2009-01-30 2014-07-17 Sumitomo Chemical Company, Limited Coated seed
US8362321B2 (en) * 2009-02-02 2013-01-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and materials for increasing starch biosynthesis in plants
WO2010089244A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Basf Se Method for dressing seeds
GB0901834D0 (en) 2009-02-04 2009-03-11 Syngenta Ltd Novel herbicides
GB0901835D0 (en) 2009-02-04 2009-03-11 Syngenta Ltd Novel herbicides
CA2749356A1 (en) 2009-02-06 2010-09-12 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
WO2010092032A1 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2010092031A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
CN102307479A (zh) 2009-02-11 2012-01-04 巴斯夫欧洲公司 农药混合物
AR075573A1 (es) 2009-02-11 2011-04-20 Basf Se Dimethomorph como protector de plaguicidas con efectos fitotoxicos
WO2010092014A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
GB0902474D0 (en) 2009-02-13 2009-04-01 Syngenta Ltd Chemical compounds
US20120058523A1 (en) 2009-02-17 2012-03-08 Edenspace Systems Corporation Tempering of cellulosic biomass
BRPI1008674A2 (pt) 2009-02-19 2015-08-25 Pioneer Hi Bred Int Métodos de redução do desenvolvimento de pragas resistentes.
WO2010099134A1 (en) * 2009-02-25 2010-09-02 Syngenta Participations Ag Methods for increasing starch content in plant cobs
JP2010222342A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
JP2010222343A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
SI3460062T1 (sl) 2009-03-02 2021-09-30 Evogene Ltd. Izolirani polinukleotidi in polipeptidi in postopki uporabe le-teh za zvišanje donosa in/ali poljedelskih značilnosti rastlin
ES2444270T3 (es) 2009-03-04 2014-02-24 Basf Se Compuestos de 3-arilquinazolin-3-ona para combatir plagas de invertebrados
BRPI1012685A2 (pt) 2009-03-05 2015-09-15 Metabolix Inc método para melhorar as características de uma planta, método para propagação de plantas transgênicas, método para supertransformação de plantas transgênicas, planta trasngênica produzida pelo método, semente da planta transgênica e matéria-prima de biorefinaria
BRPI1013462B1 (pt) 2009-03-06 2018-02-27 Syngenta Limited Formulação herbicida aquosa, sistema de armazenagem e expedição e método de inibir o crescimento de uma planta indesejada
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
WO2010103065A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Basf Se Fungicidal compositions and their use
JP2010235603A (ja) 2009-03-13 2010-10-21 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリダジノン化合物及びその用途
JP5502982B2 (ja) 2009-03-16 2014-05-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア フルオピラム及びメトラフェノンを含む殺菌組成物
PL2408298T3 (pl) 2009-03-20 2016-12-30 Sposób traktowania roślin uprawnych kapsułkowanym pestycydem
MX2011009295A (es) 2009-03-26 2011-09-27 Basf Se Uso de fungicidas sinteticos y biologicos en combinacion para controlar hongos dañinos.
WO2010112545A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Basf Se Isoxazoline compounds for combating invertebrate pests
AU2010233985B2 (en) 2009-04-02 2015-11-19 Basf Se Method for reducing sunburn damage in plants
CA2757665C (en) 2009-04-06 2017-06-27 Syngenta Limited Herbicidal quinoline and 1,8-naphthyridine compounds
US9695403B2 (en) 2009-05-21 2017-07-04 Syngenta Participations Ag Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2010138971A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Edenspace Systems Corporation Plant gene regulatory elements
WO2010141928A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Isolation and targeted suppression of lignin biosynthetic genes from sugarcane
US9096865B2 (en) 2009-06-10 2015-08-04 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
WO2010142779A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl derivatives having a 5- sulfur substituent
EP2443137B1 (en) 2009-06-15 2015-05-20 Biokine Therapeutics Ltd. Novel chemokine binding polypeptides capable of inhibiting the course of autoimmunity, inflammation and cancer
WO2010146032A2 (de) 2009-06-16 2010-12-23 Basf Se Fungizide mischungen
US20120108422A1 (en) 2009-06-18 2012-05-03 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl Derivatives
EP2443098A1 (en) 2009-06-18 2012-04-25 Basf Se Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives
WO2010146116A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
CN102802416A (zh) 2009-06-18 2012-11-28 巴斯夫欧洲公司 杀真菌混合物
JP2012530112A (ja) 2009-06-18 2012-11-29 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア イオウ置換基を有しているトリアゾール系化合物
WO2010146115A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
US20120088664A1 (en) 2009-06-18 2012-04-12 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl derivatives having a 5-sulfur subtituent
DK2443102T3 (da) 2009-06-19 2013-07-08 Basf Se Herbicidale benzoxazinoner
GB0910766D0 (en) 2009-06-22 2009-08-05 Syngenta Ltd Chemical compounds
NO2445928T3 (uk) 2009-06-24 2018-08-25
AR077228A1 (es) 2009-06-25 2011-08-10 Basf Se Uso de mezclas agroquimicas para aumentar la salud de plantas
WO2010149758A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Basf Se Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives
WO2011003796A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2011003776A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
WO2011003775A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
CA2749383A1 (en) 2009-07-10 2011-06-09 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
WO2011006886A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Basf Se Azole compounds carrying a sulfur substituent xiv
GB0912385D0 (en) 2009-07-16 2009-08-26 Syngenta Ltd Novel herbicides
US9125414B2 (en) 2009-07-24 2015-09-08 Basf Se Pyridine derivatives compounds for controlling invertebrate pests
KR20120107068A (ko) 2009-07-28 2012-09-28 바스프 에스이 다년생 식물의 저장 조직에서 유리 아미노산의 수준을 증가시키는 방법
EP2458981A2 (en) 2009-07-28 2012-06-06 Basf Se Pesticidal suspo-emulsion compositions
EP2459569B1 (en) 2009-07-30 2015-07-22 Merial, Inc. Insecticidal 4-amino-thieno[2,3-d]-pyrimidine compounds and methods of their use
US9051300B2 (en) 2009-07-31 2015-06-09 Syngenta Limited Herbicides
FR2948531B1 (fr) * 2009-07-31 2011-08-26 Stallergenes Sa Machine a recolter le pollen
FR2948535B1 (fr) * 2009-07-31 2013-07-05 Stallergenes Sa Procede de preparation de pollen brut
FR2948530B1 (fr) * 2009-07-31 2011-08-26 Stallergenes Sa Machine a recolter du pollen
UY32838A (es) 2009-08-14 2011-01-31 Basf Se "composición activa herbicida que comprende benzoxazinonas
US11096345B2 (en) 2009-09-01 2021-08-24 Basf Se Method for treating post-emergent rice
TW201113376A (en) 2009-09-01 2011-04-16 Basf Agrochemical Products Bv Herbicide-tolerant plants
KR101876401B1 (ko) 2009-09-11 2018-08-09 임페리얼 이노베이션스 리미티드 미분화 식물세포로부터 리피 바이오매스를 생산하는 방법
GB0916267D0 (en) 2009-09-16 2009-10-28 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
CA2771173A1 (en) 2009-09-21 2011-03-24 Syngenta Participations Ag Control of elasmopalpus
HRP20220478T1 (hr) 2009-09-22 2022-05-27 Medicago Inc. Način pripreme proteina od biljaka
WO2011036074A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Basf Se Aminoquinazoline compounds for combating invertebrate pests
JP2013505910A (ja) 2009-09-25 2013-02-21 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 植物の雌花の発育不全を減少させる方法
EA022594B1 (ru) 2009-09-29 2016-01-29 Басф Се Пестицидные смеси
BR112012006805A2 (pt) 2009-09-29 2020-08-18 Basf Se misturas, composição pesticida, método para controlar pragas, método para controlar pragas e/ou aprimorar a saúde de plantas, método para proteção de material de propagação de planta de pragas e material de propagação de planta
NZ598784A (en) 2009-09-30 2013-03-28 Basf Se Low volatile amine salts of anionic pesticides
GB201117019D0 (en) 2011-10-04 2011-11-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
CN105753950B (zh) * 2009-10-02 2020-06-16 先正达参股股份有限公司 杀虫蛋白
EP2308297A1 (en) 2009-10-07 2011-04-13 Syngenta Participations AG Pesticidal composition for coating seed with a herbicide
WO2011042378A1 (de) 2009-10-09 2011-04-14 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
GB0917934D0 (en) 2009-10-13 2009-11-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
WO2011048120A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Syngenta Participations Ag Synergistic fungicidal composition containing a n-2-(pyrazolyl) ethylphenylcarboxamide
DE102010042867A1 (de) 2009-10-28 2011-06-01 Basf Se Verwendung heterozyklischer Verbindungen als Herbizide
WO2011051212A1 (de) 2009-10-28 2011-05-05 Basf Se Verwendung heteroaromatischer verbindungen als herbizide
DE102010042866A1 (de) 2009-10-30 2011-05-05 Basf Se Substituierte Thioamide mit herbizider Wirkung
JP2013509379A (ja) 2009-11-02 2013-03-14 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草剤テトラヒドロフタルイミド
US8329619B2 (en) 2009-11-03 2012-12-11 Basf Se Substituted quinolinones having herbicidal action
WO2011054741A2 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Basf Se Crystalline complexes of 4-hydroxy benzoic acid and selected pesticides
WO2011057989A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 Basf Se Heterocyclic compounds having herbicidal action
WO2011057942A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Basf Se Insecticidal methods using pyridine compounds
WO2011058036A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Basf Se Tricyclic compounds having herbicidal action
EP2499136B1 (en) 2009-11-13 2013-12-04 Basf Se 3-(3,4-dihydro-2h-benzo[1,4]oxazin-6-yl)-1h-pyrimidin-2,4-dione compounds as herbicides
CN102686573B (zh) 2009-11-17 2015-03-11 梅里亚有限公司 用于抵御无脊椎动物害虫的氟化的氧杂或硫杂杂芳基烷基硫化物衍生物
WO2011064188A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Se Insecticidal methods using nitrogen-containing heteroaromatic compounds
WO2011067184A1 (de) 2009-12-01 2011-06-09 Basf Se 3- (4, 5 -dihydroisoxazol- 5 -yl) benzoylpyrazolverbindungen und ihre mischungen mit safenern
CN102638977A (zh) 2009-12-02 2012-08-15 巴斯夫欧洲公司 唑蚜威与嗜球果伞素类的农药混合物
BR112012012754A2 (pt) 2009-12-02 2015-09-08 Basf Se "misturas, composição pesticida, método de controle de pragas, método de proteção de material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal"
GB0921343D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921346D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921344D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
ES2546100T3 (es) 2009-12-04 2015-09-18 Merial, Inc. Compuestos pesticidas bis-organosulfurados
US9562235B2 (en) 2009-12-06 2017-02-07 A.B. Seeds Ltd. MicroRNA compositions and methods for enhancing plant resistance to abiotic stress
WO2011069912A1 (de) 2009-12-07 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel
WO2011069955A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Basf Se Sulfonimidamide compounds for combating animal pests
WO2011069916A1 (de) 2009-12-08 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung als fungizide sowie sie enthaltende mittel
US20120245031A1 (en) 2009-12-08 2012-09-27 Basf Se Pesticidal Mixtures
CN102647903B (zh) 2009-12-08 2015-09-16 巴斯夫欧洲公司 农药混合物
WO2011069894A1 (de) 2009-12-08 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel
CA2782883A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2011069930A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Basf Se Pesticidal mixtures
CN102711465A (zh) 2009-12-17 2012-10-03 辛根塔有限公司 包括一种吡喃二酮除草剂以及一种共除草剂的除草剂组合物
BR112012014571A2 (pt) 2009-12-17 2015-09-15 Syngenta Ltd "composições herbicidas que compreendem, e métodos de uso de, pirandionas ativas como herbicida".
CN102724873A (zh) 2009-12-18 2012-10-10 先正达参股股份有限公司 防治与控制害虫的方法
WO2011073143A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Basf Se Substituted cyanobutyrates having herbicidal action
BR112012014944A2 (pt) 2009-12-18 2015-09-15 Basf Se compostos de azolina substituída , composição , uso de um composto , e, métodos para controlar pragas invertebradas e para tratar , controlar , prevenir ou proteger animais contra infestação ou infecção por parasitas.
US9493785B2 (en) 2009-12-28 2016-11-15 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
CA2785654C (en) 2009-12-29 2018-02-27 Syngenta Participations Ag Pesticidal composition
WO2011082253A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Board Of Trustees Of Michigan State University A method to produce acetyldiacylglycerols (ac-tags) by expression ofan acetyltransferase gene isolated from euonymus alatus (burning bush)
BR112012016980B8 (pt) 2010-01-18 2018-03-06 Basf Se composição, alcoxilato de amina (a), processo para preparar o alcoxilato de amina (a), método para controlar fungos fitopatogênicos e uso do alcoxilato de amina (a)
EP2353388A1 (en) 2010-01-28 2011-08-10 Syngenta Participations AG Insecticidal composition
KR20120125332A (ko) 2010-02-01 2012-11-14 바스프 에스이 동물 해충을 퇴치하기 위한 치환된 케톤계 이속사졸린 화합물 및 유도체
WO2011098417A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Basf Se Substituted cyanobutyrates having herbicidal action
WO2011101303A2 (de) 2010-02-16 2011-08-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von iso-heptadecylamin
US20130085064A1 (en) 2010-02-25 2013-04-04 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and insecticide or nematoicidal biological agent
BR112012021238A2 (pt) 2010-02-25 2016-06-21 Syngenta Ltd misturas pesticidas contendo derivados de isoxazolina e um fungicida
GB201003551D0 (en) 2010-03-03 2010-04-21 Syngenta Participations Ag Weed control method
EP2363023A1 (en) 2010-03-04 2011-09-07 Basf Se Synergistic fungicidal and insecticidal mixtures
WO2011107741A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Syngenta Participations Ag Herbicidal composition comprising a mixture of a first herbicide and pinoxaden
WO2011110583A2 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Basf Se Fungicidal mixtures comprising triazole derivatives
UY33281A (es) 2010-03-17 2011-10-31 Basf Agrochemical Products Bv Plantas tolerantes a herbicidas
KR20130051927A (ko) 2010-03-17 2013-05-21 바스프 에스이 살충제 및 분지형 노닐 아민의 알콕실레이트를 포함하는 조성물
AR081526A1 (es) 2010-03-23 2012-10-03 Basf Se Piridazinas sustituidas que tienen accion herbicida
WO2011117152A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridothiazines having herbicidal action
AR081527A1 (es) 2010-03-23 2012-10-03 Basf Se Piridinas sustituidas que tienen accion herbicida
BR112012023765A2 (pt) 2010-03-23 2015-09-29 Basf Se piridina substituída, composição e método para controlar vegetação indesejada
JP2013522347A (ja) 2010-03-23 2013-06-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 無脊椎有害生物を防除するためのピリダジン化合物
EP2550279A1 (en) 2010-03-23 2013-01-30 Basf Se Pyrazinothiazines having herbicidal action
JP2013522341A (ja) 2010-03-23 2013-06-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草作用を有する置換ピリダジン
BR112012023757B1 (pt) 2010-03-23 2020-10-20 Basf Se composto de piridazina, método para controlar pragas invertebradas e método para proteger material de propagação de plantas
WO2011117198A2 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
EP2549878A2 (en) 2010-03-24 2013-01-30 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures
JP2013523609A (ja) 2010-03-26 2013-06-17 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア アゾロピリミジニルアミン類に基づく殺菌混合物
EP2371219A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 Basf Se Herbicidal acylhydrazides
WO2011131602A2 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Basf Se Fungicidal mixtures based on azolopyrimmidinylamines
CN101812527B (zh) * 2010-04-20 2014-09-17 北京农业职业学院 一种快速检测6种转基因玉米的方法
WO2011135491A1 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Basf Se Herbicidal azolopyrimidines
JP2011246436A (ja) 2010-04-28 2011-12-08 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
AU2011246876B2 (en) 2010-04-28 2016-06-23 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
WO2011134539A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Basf Se Use of oxylipins as safeners and safening herbicidal compositions comprising oxylipins
WO2011138345A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Basf Se Fungicidal mixtures based on gallic acid esters
WO2011144593A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Basf Se Pesticidal mixtures comprising insecticides and pyraclostrobin
GB201008290D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Syngenta Ltd Chemical compounds
WO2011148886A1 (ja) 2010-05-24 2011-12-01 Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 有害生物防除剤
BR112012028881B1 (pt) 2010-05-28 2018-03-20 Basf Se Misturas sinérgicas, composição pesticida, método para controlar pragas animais, método para proteger material de propagação de planta e uso de uma mistura
JP5782116B2 (ja) 2010-05-28 2015-09-24 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 殺有害生物混合物
EP2576555A1 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Syngenta Participations AG 1, 8 -diazaspiro [4.5]decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides
AR081767A1 (es) 2010-05-31 2012-10-17 Syngenta Participations Ag Composiciones pesticidas
MX337380B (es) 2010-05-31 2016-03-02 Syngenta Participations Ag Composiciones pesticidas.
EP2576554A1 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Syngenta Participations AG 1, 8 -diazaspiro [4.5]decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides
WO2011151261A2 (en) 2010-05-31 2011-12-08 Basf Se Method for increasing the health of a plant
WO2011151146A1 (en) 2010-05-31 2011-12-08 Syngenta Participations Ag Method of crop enhancement
US20130210625A1 (en) 2010-05-31 2013-08-15 Syngenta Crop Protection Llc Spiroheterocyclic pyrrolidine derivatives based pesticides
ES2729780T3 (es) 2010-06-07 2019-11-06 Syngenta Participations Ag Composición química estabilizada
US20130210623A1 (en) 2010-06-09 2013-08-15 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives
WO2011154434A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives
US20130261069A1 (en) 2010-06-09 2013-10-03 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures comprising isoxazoline derivatives
WO2011158242A2 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Futuragene Israel Ltd. Pest -resistant plants containing a combination of a spider toxin and a chitinase
FR2961375B1 (fr) 2010-06-16 2016-05-13 Inst De Rech Pour Le Dev (Ird) Surproduction d'acide jasmonique dans des plantes transgeniques
US20130102463A1 (en) 2010-06-24 2013-04-25 Basf Se Herbicidal Compositions
WO2011161131A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Se Herbicidal mixtures
WO2011161132A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Se Pesticidal mixtures
EP2402344A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole fused bicyclic compounds
EP2401915A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402336A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402343A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole-fused bicyclic compounds
EP2402339A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402345A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole fused bicyclic compounds
KR101559094B1 (ko) 2010-06-29 2015-10-15 에프엠씨 코포레이션 6-아실-1,2,4-트리아진-3,5-디온 유도체 및 제초제
EP2402338A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402340A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2409570A3 (en) 2010-06-29 2013-11-13 Basf Se Fungicidal mixtures based on pyrazolopyridine compounds
EP2402335A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
WO2012007426A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Basf Se Azoline substituted isoxazoline benzamide compounds for combating animal pests
EP2593554A2 (en) 2010-07-15 2013-05-22 Technion Research And Development Foundation Ltd. Nucleic acid construct for increasing abiotic stress tolerance in plants
DK2595995T3 (en) 2010-07-22 2016-02-29 Basf Se Herbicidal isoxazolo [5,4-b] pyridines
WO2012016989A2 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Basf Se Fungicidal compositions
TW201210488A (en) 2010-08-09 2012-03-16 Basf Se Fungicidal mixtures
DE102011080568A1 (de) 2010-08-16 2012-02-16 Basf Se Substituierte Cyanobutyrate mit herbizider Wirkung
WO2012022729A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Basf Se Method for improving the health of a plant
CA2805770A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Basf Se Agrochemical mixtures for increasing the health of a plant
WO2012028993A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
WO2012034961A1 (en) 2010-09-13 2012-03-22 Basf Se Pyridine compounds for controlling invertebrate pests i
WO2012034960A1 (en) 2010-09-13 2012-03-22 Basf Se Pyridine compounds for controlling invertebrate pests ii
WO2012034959A2 (en) 2010-09-13 2012-03-22 Basf Se Pyridine compounds for controlling invertebrate pests iii
PE20131355A1 (es) 2010-09-14 2013-12-06 Basf Se Composicion que contiene un insecticida de piripiropeno y un adyuvante
AU2011303965B9 (en) 2010-09-14 2014-12-18 Basf Se Composition containing a pyripyropene insecticide and a base
JP4991973B2 (ja) 2010-09-29 2012-08-08 東海ゴム工業株式会社 水系ホース用ゴム組成物およびそれを用いて得られる水系ホース
CN103221409B (zh) 2010-10-01 2016-03-09 巴斯夫欧洲公司 除草的苯并*嗪酮类
BR112013007056A2 (pt) 2010-10-01 2019-09-24 Basf Se compostos de imina
AR083112A1 (es) 2010-10-01 2013-01-30 Syngenta Participations Ag Metodo para controlar enfermedades fitopatogenas y composiciones fungicidas utiles para dicho control
BR112013007038A2 (pt) 2010-10-01 2019-09-24 Basf Se "derivados de 2,4-diaril-pirrolina substituída por imina como pesticidas"
GB201016761D0 (en) 2010-10-05 2010-11-17 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
CA2811789A1 (en) 2010-10-06 2012-04-12 Bp Corporation North America Inc. Variant cbh i polypeptides with reduced product inhibition
CN103237447A (zh) 2010-10-07 2013-08-07 巴斯夫欧洲公司 嗜球果伞素用于增加冬季禾谷类中面筋强度的用途
EP2443923A1 (de) 2010-10-25 2012-04-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein Pestizid und ein Polycarboxylatether
CN103179853A (zh) 2010-10-11 2013-06-26 巴斯夫欧洲公司 包含农药和聚羧酸化物醚的组合物
CN103180307A (zh) 2010-10-28 2013-06-26 先正达参股股份有限公司 新颖的杀微生物剂
EP2447262A1 (en) 2010-10-29 2012-05-02 Basf Se Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides
EP2447261A1 (en) 2010-10-29 2012-05-02 Basf Se Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides
US20130225404A1 (en) 2010-11-02 2013-08-29 Syngenta Participations Ag Pesticidal combinations
CA2815927A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusale M Ltd. Transgenic plants with improved saccharification yields and methods of generating same
EP2460404A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Basf Se Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides
CN103347865B (zh) 2010-11-12 2016-02-03 辛根塔有限公司 除草化合物
WO2012066122A1 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Syngenta Participations Ag 2 - (pyridin- 2 -yl) -quinazoline derivatives and their use as microbicides
EP2643302A1 (en) 2010-11-23 2013-10-02 Syngenta Participations AG Insecticidal compounds
WO2012069601A1 (en) 2010-11-25 2012-05-31 Syngenta Participations Ag Substituted quinazolines as fungicides
CN103260410A (zh) 2010-12-08 2013-08-21 巴斯夫欧洲公司 农药混合物
WO2012077077A1 (en) 2010-12-08 2012-06-14 Basf Se Fungicidal mixtures
EP2462807A1 (en) 2010-12-08 2012-06-13 Basf Se Pesticidal mixtures comprising pyraclostrobin
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
EP2648518A2 (en) 2010-12-10 2013-10-16 Basf Se Pyrazole compounds for controlling invertebrate pests
ES2524422T3 (es) 2010-12-14 2014-12-09 Syngenta Participations Ag Derivados de estrigolactamas y su uso como reguladores del crecimiento vegetal
EP2465350A1 (en) 2010-12-15 2012-06-20 Basf Se Pesticidal mixtures
US20130267415A1 (en) 2010-12-15 2013-10-10 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
WO2012080419A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
CN103260412B (zh) 2010-12-15 2015-09-02 巴斯夫欧洲公司 除草组合物
BR112013014986A2 (pt) 2010-12-17 2016-07-12 Syngenta Participations Ag compostos inseticidas
CA2818914A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Basf Se Pesticidal active mixtures comprising pyrazole compounds
CA2819301A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Basf Se Agrochemical mixtures for increasing the health of a plant
CA2821257C (en) 2010-12-22 2020-12-22 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or nitrogen use efficiency of plants
WO2012085081A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Basf Se Sulfoximinamide compounds for combating invertebrate pests ii
WO2012084755A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal activity
US20130296436A1 (en) 2010-12-27 2013-11-07 Sumitomo Chemical Company, Limited Amidine compounds and use thereof for plant disease control
JP5842594B2 (ja) 2010-12-27 2016-01-13 住友化学株式会社 ピリダジノン化合物、それを含有する除草剤及び有害節足動物防除剤
EP2474226A1 (en) 2011-01-07 2012-07-11 Basf Se Herbicidally active composition comprising cyanobutyrates
EP2476313A1 (en) 2011-01-14 2012-07-18 Basf Se Synergistic pesticidal compositions comprising a dithiocarbamate and an insecticide
SI3272861T1 (sl) 2011-01-20 2020-06-30 Protalix Ltd. Alfa-galaktozidazni sestavki
EP2481284A3 (en) 2011-01-27 2012-10-17 Basf Se Pesticidal mixtures
EP2484210A1 (en) 2011-02-08 2012-08-08 Basf Se Pesticidal compositions
MX2013009067A (es) 2011-02-09 2013-10-01 Syngenta Participations Ag Compuestos insecticidas.
EA023452B1 (ru) 2011-02-11 2016-06-30 Басф Се Гербицидные композиции, содержащие топрамезон, пиноксаден и клохинтоцет
EP2675273A1 (en) 2011-02-16 2013-12-25 Basf Se Method for controlling phytopathogenic fungi
EA022869B1 (ru) 2011-02-28 2016-03-31 Басф Се Композиция, содержащая пестицид, сурфактант и алкоксилат 2-пропилгептиламина
JP2011137030A (ja) 2011-03-01 2011-07-14 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法。
CN103597078B (zh) 2011-03-02 2016-12-14 富途锐基尼以色列有限公司 具有功能失调的t3ss蛋白的抗菌性转基因植物
MY161279A (en) 2011-03-07 2017-04-14 Sumitomo Chemical Co Method for controlling weeds in paddy rice cultivation
GB201104199D0 (en) 2011-03-11 2011-04-27 Syngenta Participations Ag Plant growth regulator compounds
WO2012126881A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds
ES2660555T3 (es) 2011-03-23 2018-03-22 Basf Se Composiciones que contienen compuestos iónicos, poliméricos que comprenden grupos imidazolio
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
WO2012130823A1 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Basf Se Suspension concentrates
KR20140025429A (ko) 2011-04-06 2014-03-04 바스프 에스이 동물 해충을 퇴치하기 위한 치환된 피리미디늄 화합물
AR085872A1 (es) 2011-04-08 2013-10-30 Basf Se Derivados heterobiciclicos n-sustituidos utiles para combatir parasitos en plantas y/o animales, composiciones que los contienen y metodos para combatir dichas plagas
GB201106062D0 (en) 2011-04-08 2011-05-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
UY34014A (es) 2011-04-15 2012-11-30 Dow Agrosciences Llc Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones
AR086098A1 (es) 2011-04-15 2013-11-20 Syngenta Participations Ag Composiciones plaguicidas
WO2012143395A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Syngenta Participations Ag 4,5-dihydro-isoxazole derivatives as fungicides
JP2014512373A (ja) 2011-04-21 2014-05-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ３，４−二置換ピロール２，５−ジオン及び殺菌剤としてのそれらの使用
CA2829974C (en) 2011-04-26 2023-08-01 Syngenta Participations Ag Enhanced transformation of recalcitrant monocots
CA2833190C (en) 2011-05-02 2020-04-28 Basf Se A method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines
MX354195B (es) 2011-05-03 2018-02-16 Evogene Ltd Polipeptidos y polinucleotidos aislados y metodos para su uso, para aumentar el rendimiento, la biomasa, el indice de crecimiento, el vigor, el contenido de aceite, la tolerancia al estrés abiotico de las plantas y la eficiencia en el uso de nitrogeno.
CN103717063A (zh) 2011-05-06 2014-04-09 先正达参股股份有限公司 包含唑啉草酯和氟草烟的除草剂组合物及其使用方法
EP2524596A1 (en) 2011-05-18 2012-11-21 Basf Se Seed treatment uses
MX2013013211A (es) 2011-05-18 2014-02-20 Syngenta Participations Ag Compuestos insecticidas a base de derivados de ariltioacetamida.
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
JP2014159374A (ja) 2011-05-20 2014-09-04 Nippon Nohyaku Co Ltd 作物の枯凋落葉剤組成物
UA114402C2 (uk) 2011-05-26 2017-06-12 Сінгента Партісіпейшнс Аг Композиція для біоконтролю у вигляді гранул, що диспергуються у воді
AR086587A1 (es) 2011-05-31 2014-01-08 Syngenta Participations Ag Compuestos insecticidas
EP2713717A1 (en) 2011-06-01 2014-04-09 Basf Se Method of preparing an aqueous tank mix comprising a base
GB201109309D0 (en) 2011-06-02 2011-07-20 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
WO2012168210A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Basf Se Seed treatment formulation aid containing polymeric sticker and silicon oil
EP2718298A1 (en) 2011-06-09 2014-04-16 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal activity
WO2012168241A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Basf Se Substituted pyrazines having herbicidal activity
EP2532661A1 (en) 2011-06-10 2012-12-12 Syngenta Participations AG Novel insecticides
CA2836020A1 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Basf Se Compositions comprising fungicidal substituted dithiines and further actives
US20140135217A1 (en) 2011-06-17 2014-05-15 Basf Se Use of Tetracyanodithiines as Fungicides
WO2012175474A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 Syngenta Participations Ag 1,2,3 triazole pesticides
AR087008A1 (es) 2011-06-22 2014-02-05 Syngenta Participations Ag Derivados de n-oxi-pirazolo-triazepina-diona
WO2012175899A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Syngenta Limited Herbicidal composition comprising a pyrandione herbicide and a sulfonyl urea herbicide
US20140148493A1 (en) 2011-06-29 2014-05-29 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Agricultural and Horticultural Insecticide Composition and Method for Using the Same
EP2540718A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Syngenta Participations AG. Novel insecticides
WO2013005211A2 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Boron complexing plant materials and uses thereof cross-reference to related applications
WO2013006861A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Sorghum grain shattering gene and uses thereof in altering seed dispersal
WO2013007550A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Syngenta Participations Ag Fungicide mixtures
HUE027461T2 (en) 2011-07-13 2016-09-28 Basf Agro Bv Fungicide substituted 2- [2-haloalkyl-4- (phenoxyphenyl) -1- [1,2,4] triazol-1-yl-ethanol compounds
CA2841011A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Basf Se Pesticidal methods using substituted 3-pyridyl thiazole compounds and derivatives for combating animal pests ii
CN103648281B (zh) 2011-07-15 2016-05-25 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的烷基取代的2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-1-[1,2,4]三唑-1-基乙醇化合物
IN2014CN00832A (uk) 2011-07-15 2015-04-03 Basf Se
BR112014000821A2 (pt) 2011-07-15 2016-08-23 Basf Se compostos, processo, composições agroquímicas, uso de compostos da fórmula i, método para combate de fungos nocivos e semente
WO2013011010A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Fungizide mixtures
US9861105B2 (en) 2011-07-28 2018-01-09 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
KR20140053264A (ko) 2011-08-02 2014-05-07 바스프 에스이 방제물질 및 하이드로젠카르보네이트의 알칼리 염으로부터 선택되는 염기를 포함하는 수성 조성물
US10119149B2 (en) 2011-08-05 2018-11-06 Dow Agrosciences Llc Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer
JP2014525748A (ja) * 2011-08-05 2014-10-02 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ｃｒｙ１Ａｂと組み合わせたＤＩＧ３殺虫性結晶タンパク質の使用
EA201400215A1 (ru) 2011-08-12 2014-07-30 Басф Се Антраниламидные соединения и их применение в качестве пестицидов
AU2012297003B2 (en) 2011-08-12 2016-11-03 Basf Se Aniline type compounds
CN103842342A (zh) 2011-08-12 2014-06-04 巴斯夫欧洲公司 邻氨基苯甲酰胺化合物及其作为农药的用途
EP2742036A1 (en) 2011-08-12 2014-06-18 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
AR087516A1 (es) 2011-08-12 2014-03-26 Basf Se Compuestos de n-tio-antranilamida y sus usos como plaguicidas
US20140162875A1 (en) 2011-08-12 2014-06-12 Basf Se N-Thio-Anthranilamide Compounds and Their Use as Pesticides
US20140243195A1 (en) 2011-08-12 2014-08-28 Basf Se N-Thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
EP2559688A1 (en) 2011-08-15 2013-02-20 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-butoxy-ethyl}-1h [1,2,4]triazole compounds
UY34257A (es) 2011-08-15 2013-02-28 Basf Se Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]-2-alquiniloxi-etil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos
WO2013024080A1 (en) 2011-08-15 2013-02-21 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl ]-2-alkoxy-2-cyclyl-ethyl}-1h [1,2,4]triazole compounds
UY34258A (es) 2011-08-15 2013-02-28 Basf Se Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]-2-alcoxi-2-alquinil/alquenil-etil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos
JP2014529594A (ja) 2011-08-15 2014-11-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 殺菌性置換１−｛２−シクリルオキシ−２−［２−ハロ−４−（４−ハロゲン−フェノキシ）−フェニル］−エチル｝−１ｈ−［１，２，４］トリアゾール化合物
MX2014000824A (es) 2011-08-15 2014-02-27 Basf Se Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]- 2-alcoxi-3-metil-butil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos.
KR20140054236A (ko) 2011-08-15 2014-05-08 바스프 에스이 살진균 치환된 1-｛2-［2-할로-4-(4-할로겐-페녹시)-페닐］-2-에톡시-에틸｝-1h-［1,2,4］트리아졸 화합물
WO2013024081A1 (en) 2011-08-15 2013-02-21 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkoxy-hexyl}-1h [1,2,4]triazole compounds
JP2014524434A (ja) 2011-08-18 2014-09-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 有害無脊椎動物を駆除するためのカルバモイルメトキシベンズアミドおよびカルバモイルメチルチオベンズアミドおよびカルバモイルメチルアミノベンズアミド
WO2013024170A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Basf Se Carbamoylmethoxy- and carbamoylmethylthio- and carbamoylmethylamino benzamides for combating invertebrate pests
BR112014003595A2 (pt) 2011-08-18 2017-03-01 Basf Se compostos, método de preparação de um composto, composição agrícola, método de combate ou controle de pestes invertebradas, métodos de proteção do crescimento de plantas e de proteção de sementes, semente, uso de um composto e método de tratamento de animal infestado
CN103732567A (zh) 2011-08-22 2014-04-16 先正达参股股份有限公司 作为杀虫化合物的二氢呋喃衍生物
WO2013026724A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Dihydrofuran derivatives as insecticidal compounds
WO2013026900A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Pyridine derivatives as microbiocides
PL2747564T3 (pl) 2011-08-25 2015-08-31 Basf Se Kompozycje herbicydowe zawierające chloroacetamidy
WO2013026695A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds
WO2013026933A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds
AU2012298448A1 (en) 2011-08-25 2014-03-06 Syngenta Participations Ag Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds
WO2013026929A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Dihydropyrrole derivatives as insecticidal compounds
US20140200136A1 (en) 2011-09-02 2014-07-17 Basf Se Agricultural mixtures comprising arylquinazolinone compounds
KR20140063757A (ko) 2011-09-02 2014-05-27 바스프 에스이 아릴퀴나졸리논 화합물을 포함하는 살곤충 활성 혼합물
EP2750506A2 (en) 2011-09-02 2014-07-09 Basf Se Use of pesticidal active 3-arylquinazolin-4-one derivatives in soil application methods
GB201115564D0 (en) 2011-09-08 2011-10-26 Syngenta Ltd Herbicidal composition
US9078444B2 (en) 2011-09-13 2015-07-14 Syngenta Participations Ag Isothiazoline derivatives as insecticidal compounds
BR112014005714A2 (pt) 2011-09-13 2017-04-04 Basf Agrochemical Products Bv método para o controle das ervas daninhas parasitas, método para aumentar o rendimento do vegetal de cultura, mistura, utilização e composições
EP2570404A1 (en) 2011-09-16 2013-03-20 Syngenta Participations AG. Plant growth regulating compounds
EP2570406A1 (en) 2011-09-16 2013-03-20 Syngenta Participations AG. Plant growth regulating compounds
WO2013050317A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Syngenta Limited Polymorphs of an isoxazoline derivative
JP2014534182A (ja) 2011-10-03 2014-12-18 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 殺虫化合物としてのイソオキサゾリン誘導体
JP2014528957A (ja) 2011-10-03 2014-10-30 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 殺虫性化合物
BR112014008186A2 (pt) 2011-10-07 2017-04-11 Syngenta Participations Ag método para proteção de plantas úteis ou material de propagação de plantas
AR090394A1 (es) 2011-10-27 2014-11-12 Syngenta Participations Ag Formulacion
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
CN103930401B (zh) 2011-11-04 2017-01-11 先正达参股股份有限公司 杀虫化合物
WO2013064519A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Syngenta Participations Ag Pesticidal compounds
BR112014010566A2 (pt) 2011-11-04 2017-04-25 Syngenta Participations Ag compostos pesticidas
MX2014005197A (es) 2011-11-04 2014-05-28 Syngenta Participations Ag Compuestos plaguicidas.
PL2776038T3 (pl) 2011-11-11 2018-06-29 Gilead Apollo, Llc Inhibitory acc i ich zastosowania
WO2013072300A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
AR088886A1 (es) 2011-11-16 2014-07-16 Basf Se Compuestos de 1,2,5-oxadiazol sustituido y su uso como herbicidas ii
AU2012338748A1 (en) 2011-11-18 2014-06-05 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides III
PT2785708E (pt) 2011-11-29 2016-06-03 Syngenta Participations Ag Derivados de triazinona inseticidas
TWI572282B (zh) 2011-11-30 2017-03-01 先正達合夥公司 含有螺雜環吡咯啶二酮的殺有害生物混合物
BR112014013486A8 (pt) 2011-12-05 2017-06-27 Basf Agrochemical Products Bv método de controle de vegetação indesejável e uso de composições
GB201121317D0 (en) 2011-12-09 2012-01-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
GB201121314D0 (en) 2011-12-09 2012-01-25 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
UA116097C2 (uk) 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
US9918470B2 (en) 2011-12-14 2018-03-20 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
WO2013087710A2 (en) 2011-12-14 2013-06-20 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
GB201121539D0 (en) 2011-12-14 2012-01-25 Syngenta Participations Ag Plant growth regulating compounds
FR2984076A1 (fr) 2011-12-15 2013-06-21 Inst Rech Developpement Ird Surproduction de jasmonates dans des plantes transgeniques
GB201121803D0 (en) 2011-12-16 2012-02-01 Syngenta Participations Ag Plant growth regulating compounds
WO2013092430A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Syngenta Participations Ag Strigolactam derivatives as plant growth regulating compounds
WO2013092244A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Basf Se Herbicidal triazines
BR112014015531A8 (pt) 2011-12-21 2017-07-04 Basf Se compostos, composição agrícola ou veterinária, métodos, semente e utilização d eum composto
PL2793589T3 (pl) 2011-12-21 2018-05-30 Syngenta Limited Związki herbicydowe
WO2013092943A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Basf Se Isothiazoline compounds for combating invertebrate pests
IN2014CN04204A (uk) 2012-01-12 2015-07-17 Basf Se
BR112014017298B1 (pt) 2012-01-17 2020-11-03 Syngenta Participations Ag mistura pesticida, método de controle de insetos, ácaros, nematódeos ou moluscos e método de proteção de uma semente contra o ataque de pragas
MX2014008511A (es) 2012-01-17 2014-08-21 Syngenta Participations Ag Mezclas pesticidas que incluyen pirrolidindionas espiroheterociclicas.
WO2013107794A2 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
ES2590852T3 (es) 2012-01-17 2016-11-23 Syngenta Participations Ag Mezclas pesticidas que incluyen pirrolidindionas espiroheterocíclicas
TWI566701B (zh) 2012-02-01 2017-01-21 日本農藥股份有限公司 芳烷氧基嘧啶衍生物及包含該衍生物作為有效成分的農園藝用殺蟲劑及其使用方法
EP2809780B1 (en) 2012-02-01 2018-05-02 Protalix Ltd. Dnase i polypeptides, polynucleotides encoding same, methods of producing dnase i and uses thereof in therapy
WO2013113789A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
AU2013214833B2 (en) 2012-02-02 2018-04-19 Conicet HaHB11 provides improved plant yield and tolerance to abiotic stress
WO2013113788A1 (en) 2012-02-03 2013-08-08 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
WO2013118120A2 (en) 2012-02-06 2013-08-15 Rosetta Green Ltd. Isolated polynucleotides expressing or modulating micrornas or targets of same, transgenic plants comprising same and uses thereof in improving nitrogen use efficiency, abiotic stress tolerance, biomass, vigor or yield of a plant
EP2814321B1 (en) 2012-02-14 2018-09-26 Syngenta Participations AG Nematicidal cis (hetero)arylcyclopropylcarboxamide derivatives
AU2013219927B2 (en) 2012-02-16 2018-11-08 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins
KR20140130495A (ko) 2012-02-19 2014-11-10 프로탈릭스 리미티드 고셰병 치료용 경구형 단위 투약 형태 및 이의 용도
WO2013124250A2 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Basf Se Fungicidal substituted thiophenes
WO2013127780A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
WO2013127859A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in soybeans
WO2013127768A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Pyridine carboxamide pesticides
WO2013127853A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Agrochemical compositions
BR112014021525A2 (pt) 2012-03-01 2017-07-18 Basf Se usos de uma composição, método para controlar vegetação indesejada e método para dessecação e/ou desfolhação de plantas de soja
WO2013127820A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in rapeseed
WO2013127821A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rapeseed
WO2013127848A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in corn
WO2013127845A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers
US20150150259A1 (en) 2012-03-01 2015-06-04 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in corn
WO2013127843A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers
EP2819511A1 (en) 2012-03-01 2015-01-07 Basf Se Adjuvants based on optionally alkoxylated reaction products of glycerol carbonate and alkylamines
WO2013127857A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in cereals
US20150018215A1 (en) 2012-03-01 2015-01-15 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in cereals
WO2013127855A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in cereals
EP2863749A1 (en) 2012-03-01 2015-04-29 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rapeseed
WO2013127818A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in soybeans
WO2013127846A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in corn
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
CA2866166C (en) 2012-03-09 2023-10-17 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
EP2825045B1 (en) 2012-03-12 2016-02-03 Basf Se Liquid concentrate formulation containing a pyripyropene insecticide ii
ES2566911T3 (es) 2012-03-12 2016-04-18 Basf Se Formulación de concentrado líquido que contiene un insecticida de piripiropeno I
EP2825043B1 (en) 2012-03-12 2018-09-05 Basf Se Method for producing an aqueous suspension concentrate formulation of a pyripyropene insecticide
WO2013135674A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Syngenta Participations Ag Insecticidal 2-aryl-acetamide compounds
EA201400995A1 (ru) 2012-03-13 2015-02-27 Юниверсити Оф Гуэлф Способы повышения выносливости к тепловому стрессу и содержания аминокислот в растениях
EA201491667A1 (ru) 2012-03-13 2015-03-31 Басф Се Фунгицидные соединения пиримидина
WO2013135672A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
KR102056607B1 (ko) 2012-03-13 2019-12-17 바스프 에스이 피리피로펜 살충제 ｉｉｉ 함유 액체 농축 제형
AR090376A1 (es) 2012-03-20 2014-11-05 Syngenta Ltd Compuestos herbicidas
CA2866416A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Basf Se Liquid or particulate tank mix adjuvant comprising a base selected from a mixture of carbonate and hydrogencarbonate
JP2015512379A (ja) 2012-03-21 2015-04-27 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ アルキルポリグルコシド及び塩基を含むタンクミックスアジュバント
WO2013139779A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Basf Se Glyphosate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate
EP2827715A1 (en) 2012-03-21 2015-01-28 Basf Se Solid particulate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate
EP2644595A1 (en) 2012-03-26 2013-10-02 Syngenta Participations AG. N-Cyclylamides as nematicides
WO2013144224A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Syngenta Participations Ag Acetylenic microbiocides
WO2013144228A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Basf Se Pesticidal methods using heterocyclic compounds and derivatives for combating animal pests
GB201205654D0 (en) 2012-03-29 2012-05-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
CA2867504A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Basf Se Co-crystals of dicamba and a co-crystal former b
GB201205657D0 (en) 2012-03-29 2012-05-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
EP2830421B1 (en) 2012-03-30 2017-03-01 Basf Se N-substituted pyridinylidene thiocarbonyl compounds and their use for combating animal pests
WO2013144223A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Basf Se N-substituted pyrimidinylidene compounds and derivatives for combating animal pests
US20150065343A1 (en) 2012-04-02 2015-03-05 Basf Se Acrylamide compounds for combating invertebrate pests
EP2647626A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Syngenta Participations AG. 1-Aza-spiro[4.5]dec-3-ene and 1,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-ene derivatives as pesticides
MX2014011995A (es) 2012-04-03 2015-09-04 Basf Se Compuestos de furanona heterobicíclicos n-sustituidos y derivados para combatir plagas de animales.
WO2013150115A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Basf Se N- substituted hetero - bicyclic compounds and derivatives for combating animal pests
AU2013245040B2 (en) 2012-04-05 2016-09-29 Basf Se Soluble liquid formulations of quinclorac ammonium salts
EP2649879A1 (en) 2012-04-10 2013-10-16 Basf Se Pesticidal mixtures containing fluxapyroxad
WO2013156331A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Basf Se Synergistic compositions comprising pyraclostrobin and an insecticidal compound
WO2013156433A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Insecticidally active thiazole derivatives
WO2013156431A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole and thiadiazole derivatives
WO2013076315A2 (en) 2012-04-27 2013-05-30 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
JP2015519316A (ja) 2012-04-27 2015-07-09 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 置換型ｎ−（テトラゾール−５−イル）−およびｎ−（トリアゾール−５−イル）ヘタリールカルボキサミド化合物ならびに除草剤としてのそれらの使用
AU2013206392B2 (en) 2012-04-27 2016-05-12 Basf Se Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
IN2014MN02211A (uk) 2012-04-27 2015-07-10 Basf Se
EP2659777A1 (en) 2012-05-04 2013-11-06 Syngenta Participations AG. New use of a pesticide
US9174967B2 (en) 2012-05-04 2015-11-03 Basf Se Substituted pyrazole-containing compounds and their use as pesticides
BR112014027133A2 (pt) 2012-05-09 2017-06-27 Basf Se compostos, composição agrícola ou veterinária, método para o controle das pragas de invertebrados, material de propagação dos vegetais e método para o tratamento ou proteção de um animal.
CN104487439B (zh) 2012-05-24 2017-06-09 巴斯夫欧洲公司 N‑硫代邻氨基苯甲酰胺化合物及其作为杀害虫剂的用途
WO2013181454A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Biostrategies LC Plant lectins as carriers of associated drug substances into animal and human cells
BR112014029531A2 (pt) 2012-06-01 2017-06-27 Basf Se composto de piridina, composição e método para controlar vegetação indesejada
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
WO2013182472A1 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Basf Se Pyrazolopyrans having herbicidal and pharmaceutical properties
EP2671881A1 (en) 2012-06-07 2013-12-11 Syngenta Participations AG. Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole derivatives
GB201210395D0 (en) 2012-06-11 2012-07-25 Syngenta Participations Ag Crop enhancement compositions
GB201210397D0 (en) 2012-06-11 2012-07-25 Syngenta Participations Ag Crop enhancement compositions
BR112014030412A2 (pt) 2012-06-14 2017-06-27 Basf Se método para combater ou controlar pragas, método para proteger culturas, compostos, processo para a preparação de compostos, uso de um composto, composição agrícola ou veterinária e semente.
BR122019015137B1 (pt) 2012-06-20 2020-04-07 Basf Se mistura pesticida, composição, composição agrícola, métodos para o combate ou controle das pragas de invertebrados, para a proteção dos vegetais em crescimento ou dos materias de propagação vegetal, para a proteção de material de propagação vegetal, uso de uma mistura pesticida e métodos para o combate dos fungos fitopatogênicos nocivos e para proteger vegetais de fungos fitopatogênicos nocivos
BR112014030842B1 (pt) 2012-06-21 2019-11-19 Basf Se uso de um alcoxilato, composição aquosa e métodos para preparar uma mistura em tanque e para controlar vegetação indesejada
ES2677475T3 (es) 2012-06-21 2018-08-02 Basf Se Adyuvante que comprende un alcoxilato de 2-propilheptilamina, surfactante a base de azúcar, y agente de control de neblina y humectante
MX370669B (es) 2012-06-22 2019-12-19 Syngenta Participations Ag Control biológico de plagas de coleópteros.
WO2014001121A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Syngenta Participations Ag Isothiazole derivatives as insecticidal compounds
WO2014001120A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Syngenta Participations Ag Isothiazole derivatives as insecticidal compounds
JP2015521989A (ja) 2012-07-03 2015-08-03 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ アニオン性殺有害生物剤及び塩基を含む高濃度水性製剤
KR20150036462A (ko) 2012-07-09 2015-04-07 바스프 코포레이션 폴리프로필렌 글리콜 및 3블록 중합체를 포함하는 비산방지제
EP2684879A1 (en) 2012-07-09 2014-01-15 Basf Se Substituted mesoionic compounds for combating animal pests
WO2014009137A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Basf Se Substituted thiadiazoles and their use as fungicides
WO2014009293A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Basf Se New substituted thiadiazoles and their use as fungicides
EP3594331A1 (en) 2012-07-29 2020-01-15 Yeda Research and Development Co. Ltd. Use of the reductive glycine pathway for generating formatotrophic and autotrophic microorganisms
US20150189883A1 (en) 2012-08-03 2015-07-09 Syngenta Participations Ag Methods of controlling insects
WO2014023531A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Syngenta Participations Ag Trifluoromethylpyridine carboxamides as pesticides
CA2881787A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
EP2700634A1 (en) 2012-08-20 2014-02-26 Basf Se 5-difluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity
EP2700635A1 (en) 2012-08-20 2014-02-26 Basf Se 5-Trifluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity
AU2013305200B2 (en) 2012-08-24 2016-10-20 Syngenta Participations Ag Methods of soil pest control
CN104582487B (zh) 2012-08-24 2019-05-31 先正达参股股份有限公司 控制昆虫的方法
EP2887810B1 (en) 2012-08-24 2018-10-31 Syngenta Participations AG Methods of controlling insects
WO2014033241A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rice
WO2014033242A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rice
AR092868A1 (es) 2012-09-03 2015-05-06 A B Seeds Ltd Metodo para mejorar la tolerancia al estres abiotico de plantas y plantas generadas mediante dicho metodo
CN104812901B (zh) 2012-09-13 2018-08-10 美国印第安纳大学研究和技术公司 赋予植物抗病性的组合物和系统及其使用方法
WO2014043435A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
BR112015006299A2 (pt) 2012-09-21 2017-07-04 Basf Se ''composto, composição agrícola, método para a proteção dos vegetais de cultura, método para a proteção do material de propagação dos vegetais e material de propagação''
CN104768379A (zh) 2012-10-01 2015-07-08 巴斯夫欧洲公司 控制鱼尼汀-调节剂杀虫剂耐药性昆虫的方法
AR093771A1 (es) 2012-10-01 2015-06-24 Basf Se Metodo para controlar insectos resistentes a insecticidas
US20150250175A1 (en) 2012-10-01 2015-09-10 Basf Se Pesticidally active mixtures comprising anthranilamide compounds
WO2014053401A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Method of improving plant health
WO2014053405A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Pesticidally active mixtures comprising anthranilamide compounds
WO2014053407A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
CN104812242A (zh) 2012-10-01 2015-07-29 巴斯夫欧洲公司 包含茉莉酮酸或其衍生物的农药混合物
CN104768378A (zh) 2012-10-01 2015-07-08 巴斯夫欧洲公司 N-硫代-邻氨基苯甲酰胺化合物在栽培植物上的用途
WO2014056985A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
WO2014056780A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Basf Se A method for combating phytopathogenic harmful microbes on cultivated plants or plant propagation material
BR112015009475A2 (pt) 2012-10-31 2017-07-04 Syngenta Participations Ag compostos inseticidas
WO2014079935A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds based on arylthioacetamide derivatives
WO2014079804A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079770A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079820A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections
WO2014079766A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079774A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079841A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079772A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079728A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
RU2658997C2 (ru) 2012-11-22 2018-06-26 Басф Корпорейшн Пестицидные смеси
US20150313241A1 (en) 2012-11-22 2015-11-05 Basf Corporation Pesticidal Mixtures
US20160100585A1 (en) 2012-11-22 2016-04-14 Basf Corporation Pesticidal Mixtures
WO2014079752A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079813A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014082871A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides
US20150313229A1 (en) 2012-11-27 2015-11-05 Basf Se Substituted [1,2,4] Triazole Compounds
WO2014082881A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides
WO2014082879A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2738171A1 (en) 2012-11-30 2014-06-04 Syngenta Participations AG. Pesticidally active tricyclic pyridyl derivatives
WO2014086601A1 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Basf Se New substituted 1,4-dithiine derivatives and their use as fungicides
CN104995177A (zh) 2012-12-14 2015-10-21 巴斯夫欧洲公司 用于防治动物害虫的丙二腈化合物
EP2746255A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746264A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2014095381A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
BR112015014583B1 (pt) 2012-12-19 2020-04-28 Basf Se compostos, processo para a preparação de compostos, compostos intermediários, composição, usos de um composto de fórmula i e método para combater fungos nocivos
EP2746277A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746263A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Alpha-substituted triazoles and imidazoles
BR112015014579A2 (pt) 2012-12-19 2017-07-11 Basf Se compostos da fórmula i, uso de um composto da fórmula i, método para combater fungos nocivos e sementes.
WO2014095534A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746278A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746279A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
WO2014095555A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746256A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746262A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds for combating phytopathogenic fungi
EP2746275A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2745691A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted imidazole compounds and their use as fungicides
BR112015014303A2 (pt) 2012-12-19 2017-07-11 Basf Se compostos de fórmula i, processo para a preparação dos compostos de fórmula i, composições agroquímicas, utilização de um composto de fórmula i, método para o combate dos fungos, semente e compostos intermediários xx3
EP2746276A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746274A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2746266A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
PL2934147T3 (pl) 2012-12-20 2020-06-29 BASF Agro B.V. Kompozycje zawierające związki triazolowe
EP2746260A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746257A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
MX2015008110A (es) 2012-12-21 2015-11-06 Basf Se Cicloclavina y derivados de esta para controlar plagas de invertebrados.
EP2746259A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746258A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
CN105189489A (zh) 2012-12-27 2015-12-23 巴斯夫欧洲公司 用于防除无脊椎动物害虫的带有亚胺或亚胺衍生取代基的2-(吡啶-3-基)-5-杂芳基噻唑化合物
CN105007729B (zh) 2012-12-31 2017-09-08 巴斯夫欧洲公司 包含cornexistin的除草组合物
CA2836403A1 (en) 2013-01-04 2014-07-04 Board Of Trustees Of Michigan State University New sources of aphid resistance in soybean plants
US9650646B2 (en) 2013-01-11 2017-05-16 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods to increase plant growth and yield
WO2014118099A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Basf Se Fungicidal naphthoquinones and derivatives
AR095109A1 (es) 2013-01-31 2015-09-30 Univ Guelph Plantas tolerantes a herbicidas auxínicos
WO2014118170A1 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Syngenta Participations Ag Novel microbiocides
TWI628170B (zh) 2013-02-05 2018-07-01 先正達合夥公司 植物生長調節化合物
EP2762468A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Syngenta Participations AG. 2-aminopyridine derivatives as plant growth regulating compounds
WO2014124850A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2014124988A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Syngenta Limited Pyridine derivatives and their use as herbicides
WO2014128136A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Basf Se Anthranilamide compounds and their use as pesticides
US9738595B2 (en) 2013-02-27 2017-08-22 Syngenta Participations Ag Carboxamide compounds
WO2014131732A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Plant growth regulating compounds
WO2014131735A1 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Use of chemical compounds as herbicides
WO2014131837A1 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Isoxaline derivatives for use in cotton plants
US20160017020A1 (en) 2013-03-06 2016-01-21 Protalix Ltd. Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same
EP2964669B1 (en) 2013-03-06 2018-09-12 Protalix Ltd. Use of plant cells expressing a tnfalpha polypeptide inhibitor in therapy
EP2964033A1 (en) 2013-03-07 2016-01-13 Basf Se Co-crystals of pyrimethanil and selected dithiine tetracarboximide
RU2020105862A (ru) * 2013-03-07 2020-02-28 Атеникс Корп. Гены токсинов и способы их применения
UY35421A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Nihon Nohyaku Co Ltd Compuesto heterocíclico condensado o su sal, insecticida agrícola u hortícola que comprende el comp uesto y método de uso del insecticida
AU2014237167B2 (en) 2013-03-15 2018-07-12 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Constitutive soybean promoters
EP2783569A1 (en) 2013-03-28 2014-10-01 Basf Se Compositions comprising a triazole compound
BR112015024526A2 (pt) 2013-03-28 2017-07-18 Syngenta Ltd métodos de controle de pragas resistentes a neonicotinoides
JP6505080B2 (ja) 2013-04-02 2019-04-24 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺虫性化合物
JP6488278B2 (ja) 2013-04-02 2019-03-20 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺虫性化合物
WO2014167133A1 (en) 2013-04-12 2014-10-16 Syngenta Participations Ag Fungicides comprising boron
CN105324374B (zh) 2013-04-19 2018-12-04 巴斯夫欧洲公司 用于对抗动物害虫的n-取代酰基-亚氨基-吡啶化合物和衍生物
WO2014173880A1 (en) 2013-04-22 2014-10-30 Syngenta Participations Ag Novel microbiocides
BR112015028152A2 (pt) 2013-05-10 2017-07-25 Nimbus Apollo Inc inibidores de acc e usos dos mesmos
KR20160005364A (ko) 2013-05-10 2016-01-14 님버스 아폴로, 인코포레이티드 Acc 억제제 및 이의 용도
GB201308607D0 (en) 2013-05-14 2013-06-19 Syngenta Ltd Mixtures of haloalkylsulfonanilide derivatives and herbicides
WO2014184019A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
DK2997016T3 (en) 2013-05-15 2018-01-08 Basf Se SUBSTITUTED N- (TETRAZOL-5-YL) AND N- (TRIAZOL-5-YL) -ARYLCARBOXAMIDE COMPOUNDS AND THEIR USE AS HERBICIDES
WO2014184014A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014184058A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
US20160081342A1 (en) 2013-05-23 2016-03-24 Syngenta Participations Ag Tank-mix formulations
EP3004117A1 (en) 2013-05-24 2016-04-13 Basf Se Substituted pyridine compounds having herbicidal activity
GB201310047D0 (en) 2013-06-05 2013-07-17 Syngenta Ltd Compounds
WO2014201156A1 (en) 2013-06-11 2014-12-18 Florida State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for controlling bundle sheath cell fate and function in plants
EP2813499A1 (en) 2013-06-12 2014-12-17 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2815647A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Basf Se Novel strobilurin-type compounds for combating phytopathogenic fungi
EP2815649A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Basf Se Fungicidal mixtures II comprising strobilurin-type fungicides
BR112015032381A2 (pt) 2013-06-26 2017-07-25 Basf Se métodos para o aprimoramento da eficácia dos herbicidas aniônicos e para o controle da vegetação indesejada, utilização de aminocarboxilatos e composição
BR112016000059B1 (pt) 2013-07-02 2020-12-29 Syngenta Participations Ag compostos heterociclos bi ou tricíclicos, composição compreendendo os referidos compostos, método para combater e controlar pragas, método para a proteção de material de propagação vegetal do ataque por pragas e material de propagação vegetal revestido com a referida composição
MY183895A (en) 2013-07-08 2021-03-17 Syngenta Participations Ag 4-membered ring carboxamides used as nematicides
WO2015003991A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Syngenta Participations Ag Novel microbiocides
WO2015004091A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Syngenta Participations Ag Nicotinamide derivatives and their use against nematodes
MX2016000669A (es) 2013-07-15 2016-11-11 Basf Se Compuestos plaguicidas.
CN105377836B (zh) 2013-07-18 2018-04-10 巴斯夫欧洲公司 取代的n‑(1,2,4‑三唑‑3‑基)芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途
BR112016002562A2 (pt) 2013-08-05 2017-08-01 Syngenta Ltd pirrolinonas de pirazolila e utilização como herbicidas.
EP3030081B1 (en) 2013-08-05 2017-08-02 Syngenta Participations AG Pyrazolyl pyrrolinones and their use as herbicides
EP2835052A1 (en) 2013-08-07 2015-02-11 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pyrimidine fungicides
AR100017A1 (es) 2013-08-12 2016-09-07 Basf Se Hidroxifenilpiruvato dioxigenasas resistentes a herbicidas
WO2015021991A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Cheminova A/S Combination of 2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (z)-(1r)-cis-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate with at least one insecticide, acaricide, nematicide and/or fungicide.
EP2839745A1 (en) 2013-08-21 2015-02-25 Basf Se Agrochemical formulations comprising a 2-ethyl-hexanol alkoxylate
DK3036328T3 (da) 2013-08-21 2022-01-24 Commw Scient Ind Res Org Gen for rustresistens
US20160237449A1 (en) 2013-09-13 2016-08-18 University Of Bremen Transgenic plants for nitrogen fixation
CN105722833A (zh) 2013-09-16 2016-06-29 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的嘧啶化合物
WO2015036059A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
KR20160058863A (ko) 2013-09-19 2016-05-25 바스프 에스이 Ｎ-아실이미노 헤테로시클릭 화합물
WO2015040141A1 (en) 2013-09-23 2015-03-26 Syngenta Participations Ag Cyclobutylcarboxamides as nematicides
HUE060756T2 (hu) 2013-10-03 2023-04-28 Syngenta Participations Ag Fungicid hatású készítmények
WO2015052173A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se Tetrazole and triazole compounds and their use as herbicides
US9902704B2 (en) 2013-10-10 2018-02-27 Basf Se Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
WO2015052178A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
AR097995A1 (es) 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
EP3456201B1 (en) 2013-10-18 2023-08-30 BASF Agrochemical Products B.V. Use of pesticidal active carboxamide derivative in soil and seed application and treatment methods
EP2868197A1 (en) 2013-11-05 2015-05-06 Basf Se Herbicidal compositions
EP2868196A1 (en) 2013-11-05 2015-05-06 Basf Se Herbicidal compositions
BR112016010566A2 (pt) 2013-11-11 2018-05-02 Syngenta Ltd derivados de 1-(piridazin-3-il)-imidazolidin-2-ona como herbicidas.
RU2664574C1 (ru) 2013-11-12 2018-08-21 Нихон Нохияку Ко., Лтд. Амидное соединение или его соль, сельскохозяйственный и садовый инсектицид и бактерицид, содержащие данное соединение, и способ применения данного инсектицида и бактерицида
EP2873668A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 Syngenta Participations AG. Pesticidally active bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents
EP2878199A1 (en) 2013-11-27 2015-06-03 Syngenta Participations AG. Method of protecting a plant propagation material
EP2881388A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
EP2881387A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
ES2697757T3 (es) 2013-12-10 2019-01-28 Yeda Res & Dev Uso de enzimas que catalizan la síntesis de piruvato a partir de formiato y acetil-CoA y bacterias que expresan la misma
CN105873909A (zh) 2013-12-12 2016-08-17 巴斯夫欧洲公司 取代的[1,2,4]三唑和咪唑化合物
JP2017502022A (ja) 2013-12-18 2017-01-19 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ Ｎ−置換イミノ複素環式化合物
EP3083596A1 (en) 2013-12-18 2016-10-26 Basf Se Azole compounds carrying an imine-derived substituent
CN105829324B (zh) 2013-12-20 2018-12-14 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性经取代的5,5-二环杂环
US20170000132A1 (en) 2013-12-23 2017-01-05 Syngenta Participations Ag Benzoxaborole fungicides
EP3556744B1 (en) 2013-12-23 2022-06-01 Syngenta Participations AG Insecticidal compounds
JP2015172030A (ja) 2013-12-25 2015-10-01 日産化学工業株式会社 ハロアルキルスルホンアミド誘導体
WO2015104422A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Basf Se Dihydrothiophene compounds for controlling invertebrate pests
BR102015000943A2 (pt) 2014-01-17 2016-06-07 Dow Agrosciences Llc expressão aumentada de proteína em planta
US10392629B2 (en) 2014-01-17 2019-08-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Increased caloric and nutritional content of plant biomass
EP3096775B1 (en) 2014-01-24 2023-01-11 University of Florida Research Foundation, Inc. Socs mimetics for the treatment of diseases
AR100304A1 (es) 2014-02-05 2016-09-28 Basf Corp Formulación de recubrimiento de semillas
WO2015118547A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Protalix Ltd. Method of maintaining disease stability in a subject having gaucher's disease
EP2907807A1 (en) 2014-02-18 2015-08-19 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2015132784A1 (en) 2014-03-03 2015-09-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Method and device for detection of pseudomonas aeruginosa
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
AU2015238666B2 (en) 2014-03-26 2018-11-15 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds as fungicides
WO2015143567A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Medicago Inc. Modified cpmv enhancer elements
EP2924027A1 (en) 2014-03-28 2015-09-30 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole fungicidal compounds
WO2015150465A2 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2015150541A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Basf Se Diaminotriazine compound useful as herbicide
EP2930174A1 (en) 2014-04-07 2015-10-14 Basf Se Diaminotriazine derivatives as herbicides
CN106470962A (zh) 2014-04-17 2017-03-01 巴斯夫欧洲公司 新型硝化抑制剂和生物农药的组合以及(硫代)磷酸三酰胺和生物农药的组合
US20170223964A1 (en) 2014-04-17 2017-08-10 Basf Se Combination of Novel Nitrification Inhibitors and Herbicides as Well as Combination of (Thio)Phosphoric Acid Triamides and Herbicides
CA2944277C (en) 2014-04-23 2022-12-13 Basf Se Diaminotriazine compounds as herbicides
ES2637029T3 (es) 2014-05-19 2017-10-10 Syngenta Participations Ag Derivados amídicos activos como insecticidas con grupos piridino o fenilo sustituidos con azufre
EP3145947A2 (en) 2014-05-22 2017-03-29 Yeda Research and Development Co., Ltd. Recombinant microorganisms capable of carbon fixation
EP2949216A1 (en) 2014-05-30 2015-12-02 Basf Se Fungicidal substituted alkynyl [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2949649A1 (en) 2014-05-30 2015-12-02 Basf Se Fungicide substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
AR100743A1 (es) 2014-06-06 2016-10-26 Basf Se Compuestos de [1,2,4]triazol sustituido
AU2015270651B2 (en) 2014-06-06 2018-11-15 Basf Se Use of substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP2952507A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2952512A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2952506A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2015193653A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas Oxidative resistance chimeric genes and proteins, and transgenic plants including the same
EA032078B1 (ru) 2014-06-25 2019-04-30 Басф Агро Б.В. Пестицидные композиции
WO2015197831A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Basf Agrochemical Products B.V. Seed treatment with acetolactate synthase (als) inhibitors
EP2962567A1 (en) 2014-07-01 2016-01-06 Basf Se Ternary mixtures comprising biopesticides and at least two chemical insecticides
US20170191041A1 (en) 2014-07-11 2017-07-06 Biostrategies LC Materials and methods for treating disorders associated with sulfatase enzymes
WO2016008740A1 (en) 2014-07-14 2016-01-21 Basf Se Pesticidal compositions
EP2979549A1 (en) 2014-07-31 2016-02-03 Basf Se Method for improving the health of a plant
WO2016016131A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active cyclic enaminones
JP6689821B2 (ja) 2014-08-12 2020-04-28 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
JP6568862B2 (ja) 2014-08-19 2019-08-28 日本農薬株式会社 オキサゼピン化合物及び該化合物を有効成分として含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
WO2016034615A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 BASF Agro B.V. Aqueous insecticide formulation containing hyperbranched polymer
EP3517616A1 (en) 2014-10-16 2019-07-31 Monsanto Technology LLC Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins
WO2016061197A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
WO2016071168A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Basf Se Pesticidal mixtures
GB201419826D0 (en) 2014-11-07 2014-12-24 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
EP3224363B1 (en) 2014-11-27 2021-11-03 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Nucleic acid constructs for genome editing
EP3028573A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Use of a triazole fungicide on transgenic plants
ES2806598T3 (es) 2014-12-11 2021-02-18 Syngenta Participations Ag Derivados tetracíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
CN106998697B (zh) 2014-12-12 2021-09-03 先正达参股股份有限公司 用于控制植物有害生物的组合物和方法
WO2016091674A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Use of cyclaniliprole on cultivated plants
WO2016091675A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Method for improving the health of a plant
CA2969105A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
EP3247200A4 (en) 2015-01-21 2018-06-13 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
EP3250566B1 (en) 2015-01-29 2018-12-19 Basf Se Herbicidal phenylpyridines
KR20170107536A (ko) 2015-01-30 2017-09-25 바스프 에스이 제초 페닐피리미딘
WO2016120182A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active amide heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
AU2016214305B2 (en) 2015-02-06 2020-10-08 Basf Se Pyrazole compounds as nitrification inhibitors
WO2016128470A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 Basf Se Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases
EP3070080A1 (en) 2015-03-19 2016-09-21 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
EP3070079A1 (en) 2015-03-19 2016-09-21 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
ES2935981T3 (es) 2015-03-27 2023-03-13 Syngenta Participations Ag Intermedios para la preparación de derivados heterobicíclicos microbicidas
AU2016239537B2 (en) 2015-03-31 2020-02-06 Basf Se Composition comprising a pesticide and isononanoic acid N,N-dimethyl amide
US11064696B2 (en) 2015-04-07 2021-07-20 Basf Agrochemical Products B.V. Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants
UA125114C2 (uk) 2015-04-10 2022-01-12 Сінгента Партісіпейшнс Аг Кормова композиція для тварин і способи її застосування
US10104893B2 (en) 2015-04-24 2018-10-23 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five membered ring heterocyles
EP3656770A3 (en) 2015-04-24 2020-09-09 Syngenta Participations AG Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five-membered ring heterocycles
WO2016174042A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
AU2016260805A1 (en) 2015-05-12 2017-11-23 Basf Se Thioether compounds as nitrification inhibitors
EP3103798A1 (en) 2015-06-09 2016-12-14 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
CA2986505A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Basf Agrochemical Products B.V. Method for managing flea beetles of the family chrysomelidae in brassica crops
US10745396B2 (en) 2015-07-01 2020-08-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents
ES2762958T3 (es) 2015-07-01 2020-05-26 Syngenta Participations Ag Derivados tetracíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
WO2017001252A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions comprising a triazole compound
EP3111763A1 (en) 2015-07-02 2017-01-04 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions comprising a triazole compound
WO2017009056A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and dimethenamid
DK3319434T3 (da) 2015-07-10 2019-07-29 Basf Agro Bv Herbicidsammensætning, der omfatter cinmethylin og pethoxamid
EP3162209A1 (en) 2015-10-27 2017-05-03 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and imazamox
EP3319432B1 (en) 2015-07-10 2020-01-01 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and pendimethalin
EP3319435B1 (en) 2015-07-10 2020-02-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and clomazone
CN107846892B (zh) 2015-07-10 2024-02-20 巴斯夫农业公司 包含环庚草醚和特异性喹啉羧酸的除草组合物
JP6875368B2 (ja) 2015-07-10 2021-05-26 ビーエーエスエフ アグロ ベー．ブイ． シンメチリン及びアセトクロール又はプレチラクロールを含む除草剤組成物
WO2017009054A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and metazachlor
WO2017009089A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin, metazachlor and quinolinecarboxylic acids
PL3319433T3 (pl) 2015-07-10 2020-03-31 BASF Agro B.V. Kompozycja chwastobójcza zawierająca cynmetylinę i określone inhibitory syntezy lipidów bez udziału accazy
BR112018000465B1 (pt) 2015-07-10 2022-07-19 Basf Agro B.V Composição herbicida, uso da composição e método para o controle da vegetação
AR105640A1 (es) 2015-08-12 2017-10-25 Syngenta Participations Ag Derivados heterobicíclicos microbicidas
EP3135113A1 (en) 2015-08-31 2017-03-01 Basf Se Use of herbicidal compositions for controlling unwanted vegetation
CN108137531A (zh) 2015-09-25 2018-06-08 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
EP3353173B1 (en) 2015-09-25 2021-07-21 Syngenta Participations AG Pesticidally active polycyclic derivatives with 5-membered sulfur containing heterocyclic ring systems
EP3356343B1 (en) 2015-09-28 2020-03-18 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
MX2018004038A (es) 2015-10-02 2019-07-18 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol microbicidas.
BR112018006314A2 (pt) 2015-10-05 2018-10-16 Basf Se composto da fórmula, composição, uso de composto da fórmula, método de combate a fungos fitopatogênicos e semente revestida
WO2017067837A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2017067839A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
JP2018537426A (ja) 2015-10-28 2018-12-20 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物オキサジアゾール誘導体
WO2017076757A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3165094A1 (en) 2015-11-03 2017-05-10 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
BR112018008288A2 (pt) 2015-11-04 2018-10-30 Basf Se uso de compostos de fórmula, compostos de fórmula, mistura, composição agroquímica e método para combater fungos
EP3371153A1 (en) 2015-11-04 2018-09-12 Syngenta Participations AG Microbiocidal anilide derivatives
EP3165093A1 (en) 2015-11-05 2017-05-10 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2017080870A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
EP3167716A1 (en) 2015-11-10 2017-05-17 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
AU2016354357A1 (en) 2015-11-12 2018-05-24 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines
BR112018009579A2 (pt) 2015-11-13 2018-11-06 Basf Se composto da fórmula i, mistura, composição agroquímica, uso de composto e método de combate a fungos
US20180354920A1 (en) 2015-11-13 2018-12-13 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
JP2018537457A (ja) 2015-11-19 2018-12-20 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 植物病原菌を駆除するための置換オキサジアゾール
KR20180083417A (ko) 2015-11-19 2018-07-20 바스프 에스이 식물병원성 진균을 퇴치하기 위한 치환 옥사디아졸
EP3380470A1 (en) 2015-11-23 2018-10-03 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur and cyclopropyl containing substituents
PT3380479T (pt) 2015-11-25 2023-03-13 Gilead Apollo Llc Inhibidores de triazol acc e seus usos
JP2019502660A (ja) 2015-11-25 2019-01-31 ギリアド アポロ， エルエルシー ピラゾールａｃｃ阻害剤およびその使用
HUE053175T2 (hu) 2015-11-25 2021-06-28 Gilead Apollo Llc ACC-gátló észterek és azok alkalmazása
US20180368403A1 (en) 2015-12-01 2018-12-27 Basf Se Pyridine compounds as fungicides
CN108290839A (zh) 2015-12-01 2018-07-17 巴斯夫欧洲公司 作为杀真菌剂的吡啶化合物
EP3385261A4 (en) 2015-12-01 2019-04-24 Nihon Nohyaku Co., Ltd. 3H-PYRROLOPYRIDINE COMPOUND OR ITS N-OXIDE, OR SALTS THEREOF, AGRICULTURAL INSECTICIDE AND HORTICULTURAL CONTAINING THE SAME, AND USE THEREOF
US10640497B2 (en) 2015-12-02 2020-05-05 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
DK3389379T3 (da) 2015-12-15 2021-04-12 Syngenta Participations Ag Mikrobiocide phenylamidinderivater
CN108368099B (zh) 2015-12-17 2021-11-12 先正达参股股份有限公司 杀微生物的噁二唑衍生物
KR20180095901A (ko) 2015-12-17 2018-08-28 바스프 에스이 벤즈아미드 화합물 및 제초제로서 그들의 용도
BR112018012926B1 (pt) 2015-12-22 2022-08-16 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol ativos em termos pesticidas, composição pesticida, método para controle de pragas, método para a proteção de material de propagação vegetal do ataque por pragas e material de propagação vegetal revestido
EP3405030B1 (en) 2016-01-22 2020-11-04 Basf Se Biodegradable polyester capsules comprising an aqueous core and a pesticide
EP3202267A1 (en) 2016-02-05 2017-08-09 Basf Se Pesticidal mixtures
US20190031667A1 (en) 2016-02-05 2019-01-31 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
EP3205208A1 (en) 2016-02-09 2017-08-16 Basf Se Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides
EP3205209A1 (en) 2016-02-09 2017-08-16 Basf Se Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides
BR112018016794B1 (pt) 2016-02-18 2022-07-19 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de pirazol ativos em termos pesticidas, composição pesticida, método para controle de pragas, método para a proteção de material de propagação vegetal do ataque por pragas e material de propagação vegetal
UY37137A (es) 2016-02-24 2017-09-29 Merial Inc Compuestos antiparasitarios de isoxazolina, formulaciones inyectables de acción prolongada que los comprenden, métodos y usos de los mismos
LT3421475T (lt) 2016-02-26 2022-01-25 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Kondensuotas heterociklinis junginys, turintis prijungtų heterociklų, ir jo druskos, žemės ūkio (sodininkytės) insekticidas, turintis minėtą junginį, ir minėto junginio panaudojimo būdas
RU2709615C1 (ru) 2016-02-26 2019-12-19 Нихон Нохияку Ко., Лтд. Соединение бензоксазола или его соль, сельскохозяйственный и садовый инсектицид, содержащий соединение, и способ применения инсектицида
PT3426032T (pt) 2016-03-10 2020-09-04 Syngenta Participations Ag Derivados de (tio)carboxamida quinolina microbiocidas
BR112018017034A2 (pt) 2016-03-10 2018-12-26 Basf Se misturas e seu uso, composição agroquímica, método de controle de fungos daninhos fitopatogênicos e material de propagação vegetal
CN108779109B (zh) 2016-03-15 2022-03-11 先正达参股股份有限公司 杀微生物的噁二唑衍生物
GB201604970D0 (en) 2016-03-23 2016-05-04 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
JP2019514851A (ja) 2016-03-24 2019-06-06 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物オキサジアゾール誘導体
EP3440068B1 (en) 2016-04-07 2020-04-22 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2017174158A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3442969A1 (en) 2016-04-12 2019-02-20 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2017178408A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Syngenta Participations Ag Microbiocidal silicon containing aryl derivatives
EP3245872A1 (en) 2016-05-20 2017-11-22 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
WO2017202774A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
ES2900867T3 (es) 2016-05-24 2022-03-18 Basf Se Uracilpiridina herbicida
KR102477603B1 (ko) 2016-05-30 2022-12-13 신젠타 파티서페이션즈 아게 살미생물 티아졸 유도체
WO2017207368A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions
CA3026316A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Basf Se Benzoxaborole compounds
EP3464251B1 (en) 2016-06-03 2021-03-03 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
AR108745A1 (es) 2016-06-21 2018-09-19 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol microbiocidas
EP3269246A1 (en) 2016-07-13 2018-01-17 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3484291A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Basf Se Fungicidal mixtures comprising a carboxamide
CR20190081A (es) 2016-07-15 2019-05-22 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas
CA3029873A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Basf Se Herbicidal compositions comprising phenylpyrimidines
US20200138028A1 (en) 2016-07-22 2020-05-07 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3487843A1 (en) 2016-07-22 2019-05-29 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018015449A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
AU2017302980A1 (en) 2016-07-25 2019-01-03 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
CN109561685A (zh) 2016-07-25 2019-04-02 巴斯夫欧洲公司 除草的嘧啶化合物
WO2018019758A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019555A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2018019721A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019755A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
US11149030B2 (en) 2016-07-27 2021-10-19 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2018019767A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
US20190269133A1 (en) 2016-07-27 2019-09-05 Basf Se Herbicidal Pyrimidine Compounds
WO2018019770A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
EP3275877A1 (en) 2016-07-28 2018-01-31 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
BR112018077215A2 (pt) 2016-07-28 2019-04-09 Basf Se compostos de pirimidina de fórmula, utilização de compostos de pirimidina de fórmula, composições herbicida, método para o controle da vegetação indesejada e utilização das composições herbicidas
WO2018019845A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
WO2018019842A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
WO2018024696A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
US20210352900A1 (en) 2016-08-05 2021-11-18 Basf Se Method for Controlling PPO Resistant Weeds
EP3278667A1 (en) 2016-08-05 2018-02-07 Basf Se Method for controlling ppo-inhibitor resistant weeds
EP3281525A1 (en) 2016-08-09 2018-02-14 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
EP3281523A1 (en) 2016-08-09 2018-02-14 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
EP3281524A1 (en) 2016-08-09 2018-02-14 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
WO2018029030A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
WO2018029031A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
AU2017311446B2 (en) 2016-08-09 2022-04-28 Basf Se Method for controlling PPO resistant weeds
WO2018029242A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018041729A2 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2018041648A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Basf Se Fungicidal mixtures comprising a formamidine
WO2018043675A1 (ja) 2016-09-01 2018-03-08 日本農薬株式会社 ヒドラゾニル基を有する縮合複素環化合物又はその塩類及び該化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
EP3512339A1 (en) 2016-09-13 2019-07-24 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3515908A1 (en) 2016-09-23 2019-07-31 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018055133A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Syngenta Participations Ag Microbiocidal tetrazolone derivatives
WO2018054723A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
WO2018054721A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
WO2018054711A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
EP3518676A1 (en) 2016-09-27 2019-08-07 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018065182A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Basf Se Reduced quinoline compounds as antifuni agents
ES2862453T3 (es) 2016-10-06 2021-10-07 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol microbiocidas
WO2018069110A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Basf Se Pesticidal mixtures
BR112019006044A2 (pt) 2016-10-10 2019-06-25 Basf Se misturas de pesticidas, composições pesticida, métodos para controle de pragas fitopatogênicas, para o aprimoramento da saúde dos vegetais e para a proteção do material de propagação dos vegetais e material de propagação dos vegetais
BR112019005932A2 (pt) 2016-10-10 2019-06-11 Basf Se misturas pesticidas, composição pesticida, métodos para controlar pragas fitopatogênicas, método para melhorar a saúde de plantas, método para a proteção do material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal
BR122022025239B1 (pt) 2016-10-10 2023-10-31 Basf Se Mistura pesticida, composição pesticida, métodos para controlar pragas fitopatogênicas, para melhorar a saúde de plantas e para a proteção do material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal
US11124507B2 (en) 2016-10-13 2021-09-21 Nihon Nohyaku Co., Ltd. 1H-pyrrolopyridine compound, N-oxide thereof or salt thereof, agricultural and horticultural insecticide comprising the compound, and method for using the insecticide
MX2019003932A (es) 2016-10-13 2019-06-10 Nihon Nohyaku Co Ltd Compuesto de 1h-pirrolopiridina, n-oxido del mismo o sal del mismo, insecticida agricola y horticola que comprende el compuesto, y metodo para utilizar el insecticida.
WO2018073110A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Basf Se Quinoline compounds as fungicides
BR112019008023A2 (pt) 2016-10-21 2019-07-09 Vestaron Corp peptídeo, proteína inseticida e/ou nematicida, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, constructo de dna, planta, ou parte da mesma, e, método de controle de uma infecção por peste de uma planta.
JP7077314B2 (ja) 2016-10-27 2022-05-30 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄およびヒドロキシルアミン置換基を有する有害生物防除的に活性な複素環式誘導体
GB201618266D0 (en) 2016-10-28 2016-12-14 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
JP6683830B2 (ja) 2016-11-01 2020-04-22 日本農薬株式会社 オキシム基を有するキノリン化合物、ｎ‐オキサイド又はその塩類及び該化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
WO2018084141A1 (ja) 2016-11-01 2018-05-11 日本農薬株式会社 Ｎ‐アルキルスルホニルインドリン化合物及び該化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
CN109952288A (zh) 2016-11-15 2019-06-28 先正达参股股份有限公司 杀微生物的苯基脒衍生物
WO2018091389A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2018095795A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents
BR112019008661A2 (pt) 2016-11-28 2019-07-09 Basf Se composto de diaminotriazina, composição agroquímica, método para o controle da vegetação indesejada e utilização do composto
EP3329777A1 (en) 2016-11-30 2018-06-06 Basf Se Pesticidal mixtures
US10961248B2 (en) 2016-12-01 2021-03-30 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018108612A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines
WO2018108726A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AU2017375394B2 (en) 2016-12-16 2021-10-21 Basf Se Herbicidal phenyltriazolinones
CN110291072A (zh) 2016-12-16 2019-09-27 巴斯夫欧洲公司 农药化合物
CA3044728A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
EP3339297A1 (en) 2016-12-20 2018-06-27 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US20200087271A1 (en) 2016-12-20 2020-03-19 Syngenta Participations Ag N-cyclobutyl-thiazol-5-carboxamides with nematicidal activity
WO2018116072A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Pi Industries Ltd. Heterocyclic compounds
EP3338552A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 Basf Se Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants
KR102235393B1 (ko) 2016-12-27 2021-04-01 니혼노야쿠가부시키가이샤 4h-피롤로피리딘 화합물, 또는 그 염류, 및 이들의 화합물을 함유하는 농원예용 살충제 및 그 사용 방법
JP6728399B2 (ja) 2016-12-27 2020-07-22 日本農薬株式会社 オキシム基を有する縮合複素環化合物又はその塩類、及びそれらの化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
US20190359589A1 (en) 2017-01-23 2019-11-28 Basf Se Fungicidal pyridine compounds
RU2019127399A (ru) 2017-02-01 2021-03-02 Басф Се Эмульгируемый концентрат
EP3576529A1 (en) 2017-02-02 2019-12-11 Basf Se Enhancement of soil herbicide activity with anionic alkoxylated phenols
WO2018149754A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Basf Se Pyridine compounds
TWI793104B (zh) 2017-02-21 2023-02-21 瑞士商先正達合夥公司 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物
UY37623A (es) 2017-03-03 2018-09-28 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol tiofeno fungicidas
BR112019018056A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos
BR112019018175A2 (pt) 2017-03-07 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
BR112019018059A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, método para produzir um polipeptídeo, método de controle de ervas daninhas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
EP3592738A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
KR20190128639A (ko) 2017-03-14 2019-11-18 바스프 에스이 제초적 아진
ES2909091T3 (es) 2017-03-20 2022-05-05 Syngenta Participations Ag Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas
KR102596592B1 (ko) 2017-03-28 2023-10-31 바스프 에스이 살충 화합물
JP2020515576A (ja) 2017-03-31 2020-05-28 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 向上した植物安全特性を有する殺微生物性フェニルアミジン誘導体
EP3606913B1 (en) 2017-04-03 2022-04-27 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184982A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
US11472797B2 (en) 2017-04-05 2022-10-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
US11142519B2 (en) 2017-04-05 2021-10-12 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
US11040962B2 (en) 2017-04-05 2021-06-22 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2018184987A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184986A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112019020819B1 (pt) 2017-04-05 2023-12-05 Syngenta Participations Ag Composto de fórmula (i), composição agroquímica, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por micro-organismos fitopatogênicos e uso de um composto de fórmula (i)
BR112019020756B1 (pt) 2017-04-05 2023-11-28 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de oxadiazol microbicidas, composição agroquímica compreendendo os mesmos, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e uso desses compostos
WO2018184985A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3606914A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Basf Se Pyridine compounds
WO2018185211A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018189001A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Basf Se Fungicide mixtures for use in rice
US11109591B2 (en) 2017-04-24 2021-09-07 Taminco Bvba Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba
US20200216441A1 (en) 2017-04-25 2020-07-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP6818131B2 (ja) 2017-04-27 2021-01-20 日本農薬株式会社 縮合複素環化合物又はその塩類、及びそれらの化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
CN110730779B (zh) 2017-05-02 2023-05-02 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
CN110612301B (zh) 2017-05-08 2023-05-23 先正达参股股份有限公司 具有含硫的苯基和吡啶基取代基的咪唑并嘧啶衍生物
WO2018206419A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterobicyclic derivatives
WO2018210658A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018210661A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018210659A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018210660A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018215304A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Syngenta Participations Ag Tetracyclic pyridazine sulphur containing compounds and their use as pesticides
BR112019025295A2 (pt) 2017-05-30 2020-06-23 Basf Se Compostos, composição, uso de um composto da fórmula i, método para combater fungos fitopatogênicos e semente
WO2018219936A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides ii
EP3630734A1 (en) 2017-05-30 2020-04-08 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
EP3630753A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3412150A1 (en) 2017-06-06 2018-12-12 Basf Se Mixtures of meptyldinocap with sdhi fungicides
WO2018224861A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 International Rice Research Institute Increasing hybrid seed production through higher outcrossing rate in cytoplasmic male sterile gramineae plants and related materials and methods
CA3064513A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
CN110770223B (zh) 2017-06-19 2023-08-22 先正达参股股份有限公司 杀有害生物活性吡唑衍生物
AR112112A1 (es) 2017-06-20 2019-09-18 Basf Se Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas
BR112019026409A2 (pt) 2017-06-23 2020-07-21 Basf Se misturas pesticidas, composição, métodos de controle ou combate a pragas, de proteção de plantas e de proteção de material, material de propagação vegetale uso de mistura de pesticidas
CN110891949B (zh) 2017-07-05 2023-05-23 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
WO2019007839A1 (en) 2017-07-05 2019-01-10 BASF Agro B.V. FUNGICIDE MIXTURES OF MEFENTRIFLUCONAZOLE
WO2019007717A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
WO2019007719A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
US20200131177A1 (en) 2017-07-07 2020-04-30 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US11659837B2 (en) 2017-07-10 2023-05-30 Basf Se Mixtures comprising an urease inhibitor (UI) and a nitrification inhibitor such as 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrazol-1-yl)succinic acid (DMPSA) or 3,4-dimethyl pyrazolium glycolate (DMPG)
EP3427587A1 (en) 2017-07-10 2019-01-16 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2019011923A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019011928A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
BR112020000457A2 (pt) 2017-07-11 2020-07-21 Syngenta Participations Ag derivados oxadiazol microbiocidas
WO2019011929A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
BR112020000414A2 (pt) 2017-07-12 2020-07-21 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbicidas
BR112020000371A2 (pt) 2017-07-12 2020-07-14 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbiocidas
WO2019012003A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019016385A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Basf Se BENZAMIDE COMPOUNDS AND THEIR USE AS HERBICIDES
WO2019020540A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
AR112673A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol activos como plaguicidas
US20200288713A1 (en) 2017-08-11 2020-09-17 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
AR112672A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de tiofeno activos como plaguicidas
WO2019030358A1 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Syngenta Participations Ag ACTIVE PYRAZOLE DERIVATIVES ON THE PESTICIDE PLAN
AR112682A1 (es) 2017-08-17 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Compuestos herbicidas
EP3447048A1 (en) 2017-08-23 2019-02-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
EP3915379A1 (en) 2017-08-29 2021-12-01 Basf Se Pesticidal mixtures
CN111094247A (zh) 2017-09-13 2020-05-01 先正达参股股份有限公司 杀微生物的喹啉(硫代)甲酰胺衍生物
US11241011B2 (en) 2017-09-13 2022-02-08 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
US11178869B2 (en) 2017-09-13 2021-11-23 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
US11266146B2 (en) 2017-09-13 2022-03-08 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2019053019A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE
EP3681867B1 (en) 2017-09-13 2021-08-11 Syngenta Participations AG Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
JP7202367B2 (ja) 2017-09-13 2023-01-11 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物性キノリン（チオ）カルボキサミド誘導体
AU2018332263B2 (en) 2017-09-18 2023-02-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JPWO2019059244A1 (ja) 2017-09-21 2020-11-05 日本農薬株式会社 シクロプロピルピリジル基を有するベンゾイミダゾール化合物又はその塩類、及びそれらの化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
WO2019057660A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Basf Se INDOLE AND AZAINDOLE COMPOUNDS HAVING 6-CHANNEL SUBSTITUTED ARYL AND HETEROARYL CYCLES AS AGROCHEMICAL FUNGICIDES
UY37912A (es) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag Derivados de picolinamida fungicidas que portan grupos terminales heteroarilo o heteroariloxi
UY37913A (es) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag Derivados de picolinamida fungicidas que portan un grupo terminal cuaternario
US11459318B2 (en) 2017-10-06 2022-10-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrrole derivatives
WO2019068820A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Syngenta Participations Ag PYRROLE DERIVATIVES ACTIVE ON THE PESTICIDE PLAN
WO2019076778A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Syngenta Participations Ag HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDAL ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR AND SULFONIMIDAMIDES
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
WO2019086474A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionics heterocyclic compounds
EP3710429B1 (en) 2017-11-15 2023-04-05 Syngenta Participations AG Microbiocidal picolinamide derivatives
CA3081961A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Basf Se Tank-mix
CN111356679A (zh) 2017-11-20 2020-06-30 先正达参股股份有限公司 杀微生物的噁二唑衍生物
UA126246C2 (uk) 2017-11-21 2022-09-07 Сінгента Партісіпейшнс Аг Фунгіцидні композиції
WO2019101560A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Basf Se Benzoxaborole compounds
CA3080276A1 (en) 2017-11-23 2019-05-31 Basf Se Herbicidal pyridylethers
WO2019101551A1 (en) 2017-11-23 2019-05-31 Basf Se Herbicidal phenylethers
CA3082950A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Syngenta Participations Ag Microbiocidal thiazole derivatives
WO2019106568A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2019105995A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
EP3707642A1 (en) 2017-12-03 2020-09-16 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
US11504748B2 (en) 2017-12-03 2022-11-22 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
US11503757B2 (en) 2017-12-03 2022-11-22 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
EP3720846A1 (en) 2017-12-04 2020-10-14 Syngenta Participations AG Microbiocidal phenylamidine derivatives
US20200392138A1 (en) 2017-12-13 2020-12-17 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionic heterocyclic compounds
US11535594B2 (en) 2017-12-19 2022-12-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal picolinamide derivatives
WO2019121408A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2019121373A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
EP3728204A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 PI Industries Ltd. Fluoralkenyl compounds, process for preparation and use thereof
WO2019121352A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2019121374A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
US11758907B2 (en) 2017-12-20 2023-09-19 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for controlling harmful organisms in crops
EP3728199A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 Basf Se Pesticidal compounds
WO2019122345A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2019122347A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)-benzamide compounds and their use as herbicides
JP7165681B2 (ja) 2017-12-28 2022-11-04 日本農薬株式会社 オキサジアゾール化合物又はその塩類及び該化合物を含有する農園芸用殺菌剤並びにその使用方法
EP3508480A1 (en) 2018-01-08 2019-07-10 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
UA127764C2 (uk) 2018-01-09 2023-12-27 Басф Се Силілетинілгетарильні сполуки як інгібітори нітрифікації
GB201800305D0 (en) 2018-01-09 2018-02-21 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
BR112020014341A2 (pt) 2018-01-15 2020-12-08 Syngenta Participations Ag Derivados heterocíclicos pesticidamente ativos com substituintes contendo enxofre
JP2021511034A (ja) 2018-01-17 2021-05-06 ビーエイエスエフ・ソシエタス・エウロパエアＢａｓｆ Ｓｅ 除草剤耐性の増大した植物
WO2019141552A1 (en) 2018-01-18 2019-07-25 Basf Se Herbicidal triazine compounds
US11286242B2 (en) 2018-01-30 2022-03-29 Pi Industries Ltd. Oxadiazoles for use in controlling phytopathogenic fungi
WO2019150311A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Pi Industries Ltd. 1-3 dithiol compounds and their use for the protection of crops from phytopathogenic microorganisms
BR112020016306A2 (pt) 2018-02-12 2020-12-15 Curators Of The University Of Missouri Gene (saur) suprarregulado pequeno de auxina para o melhoramento da arquitetura do sistema radicular da planta, tolerância ao encharcamento, resistência à seca, e rendimento
WO2019162308A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2019162309A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
EP3530118A1 (en) 2018-02-26 2019-08-28 Basf Se Fungicidal mixtures
EP3530116A1 (en) 2018-02-27 2019-08-28 Basf Se Fungicidal mixtures comprising xemium
WO2019166561A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Basf Se Use of alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors
BR112020015467A2 (pt) 2018-02-28 2020-12-08 Basf Se Misturas fungicidas, composição fungicida, métodos para controlar fungos fitopatogênicos, para melhorar a saúde das plantas e para proteção de material de propagação de plantas contra fungos fitopatogênicos e material de propagação de planta
IL302719A (en) 2018-02-28 2023-07-01 Basf Se Use of N-functional alkoxy pyrazole compounds as nitrification inhibitors
CN111683528B (zh) 2018-02-28 2022-12-13 巴斯夫欧洲公司 吡唑炔丙基醚作为硝化抑制剂的用途
JP7225201B2 (ja) 2018-03-02 2023-02-20 日本農薬株式会社 アミド化合物又はその塩類、及びそれらの化合物を含有する農園芸用殺菌剤並びにその使用方法
EP3533333A1 (en) 2018-03-02 2019-09-04 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen
EP3533331A1 (en) 2018-03-02 2019-09-04 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen
EP3536150A1 (en) 2018-03-06 2019-09-11 Basf Se Fungicidal mixtures comprising fluxapyroxad
US10470428B2 (en) 2018-03-07 2019-11-12 Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc Cotton variety ST 5471GLTP
US20210002232A1 (en) 2018-03-09 2021-01-07 Pi Industries Ltd. Heterocyclic compounds as fungicides
EP3539384A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Basf Se 3-components mixtures comprising fluxapyroxad
AR114422A1 (es) 2018-03-30 2020-09-02 Syngenta Participations Ag Compuestos herbicidas
BR112020021645A2 (pt) 2018-04-26 2021-01-26 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbicidas
JP2021523150A (ja) 2018-05-08 2021-09-02 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 植物、その繁殖及び植物に由来する産物に対する損傷を防除するために１種以上の特定のヘテロアリール−１，２，４−トリアゾール及びヘテロアリール−テトラゾール化合物を適用する方法
WO2019219689A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
CN112119069B (zh) 2018-05-22 2023-10-03 日本农药株式会社 苯并咪唑化合物或其盐类和含有该化合物的用于农业园艺的杀虫杀螨剂以及其使用方法
CN112154141A (zh) 2018-05-25 2020-12-29 先正达参股股份有限公司 杀微生物的吡啶甲酰胺衍生物
WO2019229088A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019229089A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019234158A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
AR115495A1 (es) 2018-06-06 2021-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos con sustituyentes que contienen azufre activos como plaguicidas
GB201810047D0 (en) 2018-06-19 2018-08-01 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2020002472A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Basf Se Use of alkynylthiophenes as nitrification inhibitors
US20210269426A1 (en) 2018-06-29 2021-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
JP2021528473A (ja) 2018-06-29 2021-10-21 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺有害生物活性アゾール−アミド化合物
WO2020007646A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Basf Se Pesticidal mixtures
BR112020027003A2 (pt) 2018-07-02 2021-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de 3-(2-tienil)-5-(trifluorometil)-1,2,4-oxadiazol como fungicidas agroquímicos
US20210251233A1 (en) 2018-07-02 2021-08-19 Basf Se Pesticidal Mixtures
EP3835301A4 (en) 2018-07-10 2022-03-16 Nihon Nohyaku Co., Ltd. BENZIMIDAZOLE COMPOUND HAVING A HALOGENABLE ALKYLENEDIOXY GROUP OR A SALT THEREOF, AGRICULTURAL AND HORTICULTURAL PESTICIDE CONTAINING SUCH COMPOUND, AND METHOD OF USE THEREOF
WO2020011808A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
EP3823966A1 (en) 2018-07-16 2021-05-26 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
CN112424147B (zh) 2018-07-23 2023-06-30 巴斯夫欧洲公司 取代噻唑烷化合物作为硝化抑制剂的用途
WO2020020777A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Basf Se Use of substituted 2-thiazolines as nitrification inhibitors
GB201812692D0 (en) 2018-08-03 2018-09-19 Syngenta Participations Ag Microbiocidal compounds
WO2020025658A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020030503A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
EP3833187A1 (en) 2018-08-08 2021-06-16 Basf Se Use of fungicidal active compound i derivative and mixtures thereof in seed application and treatment methods
JP7407114B2 (ja) 2018-08-08 2023-12-28 日本農薬株式会社 オキサジアゾリン化合物又はその塩類及び該化合物を含有する農園芸用殺菌剤並びにその使用方法
WO2020030754A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020035826A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Pi Industries Ltd. 1,2-dithiolone compounds and use thereof
WO2020035565A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
CN112601457A (zh) 2018-08-27 2021-04-02 巴斯夫欧洲公司 苯唑草酮的含水组合物
TW202023386A (zh) 2018-09-13 2020-07-01 瑞士商先正達合夥公司 殺有害生物活性唑-醯胺化合物
TW202019901A (zh) 2018-09-13 2020-06-01 瑞士商先正達合夥公司 殺有害生物活性唑-醯胺化合物
KR20210060514A (ko) 2018-09-18 2021-05-26 바스프 에스이 디아미노트리아진 화합물
CN112739685A (zh) 2018-09-19 2021-04-30 先正达农作物保护股份公司 杀微生物的喹啉甲酰胺衍生物
US20210368794A1 (en) 2018-09-19 2021-12-02 Basf Se Pesticidal mixtures comprising a mesoionic compound
CA3112042A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Basf Se Method of controlling pests by seed treatment application of a mesoionic compound or mixture thereof
BR112021005508A2 (pt) 2018-10-01 2021-06-22 Pi Industries Ltd. novos oxadiazóis
JP2022501410A (ja) 2018-10-01 2022-01-06 ピーアイ インダストリーズ リミテッドPi Industries Ltd 新規なオキサジアゾール
EP3860987B1 (en) 2018-10-02 2023-07-19 Syngenta Participations Ag Pesticidally active benzene- and azine-amide compounds
WO2020069876A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Basf Se Microemulsion compositions of topramezone
EP3860993B1 (en) 2018-10-06 2022-08-10 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
WO2020070132A1 (en) 2018-10-06 2020-04-09 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
GB201816459D0 (en) 2018-10-09 2018-11-28 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201816931D0 (en) 2018-10-17 2018-11-28 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
BR112021007156A2 (pt) 2018-10-17 2021-07-20 Syngenta Crop Protection Ag derivados de oxadiazol microbiocidas
AR116628A1 (es) 2018-10-18 2021-05-26 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos microbiocidas
WO2020078795A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and azoles
BR112021006045A2 (pt) 2018-10-19 2021-06-29 Basf Se misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para o combate de parasitas fitopatogênicos
ES2953567T3 (es) 2018-10-19 2023-11-14 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida plaguicidamente activos
BR112021006019A2 (pt) 2018-10-19 2021-06-29 Basf Se misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas
EP3643175A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Ternary pesticidal mixtures containing metyltetraprole and fenpropimorph
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
TW202035404A (zh) 2018-10-24 2020-10-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含亞碸亞胺的取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
BR112021007905A2 (pt) 2018-11-02 2021-08-03 Nihon Nohyaku Co., Ltd. composição de controle de organismo prejudicial e método para uso da mesma
WO2020095161A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Pi Industries Ltd. Nitrone compounds and use thereof
WO2020094363A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Syngenta Participations Ag Pesticidally active azole-amide compounds
GB201818013D0 (en) 2018-11-05 2018-12-19 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compunds
GB201818350D0 (en) 2018-11-12 2018-12-26 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
EP3879983A1 (en) 2018-11-12 2021-09-22 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
GB201818348D0 (en) 2018-11-12 2018-12-26 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
GB201818349D0 (en) 2018-11-12 2018-12-26 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
WO2020109039A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Basf Se Pesticidal compounds
AR117200A1 (es) 2018-11-30 2021-07-21 Syngenta Participations Ag Derivados de tiazol microbiocidas
AR117183A1 (es) 2018-11-30 2021-07-14 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de tiazol microbiocidas
AR117291A1 (es) 2018-12-14 2021-07-28 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heterocíclicos de cianamida con actividad pesticida
WO2020120694A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
EA202191586A1 (ru) 2018-12-18 2021-10-19 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидная композиция
EA202191655A1 (ru) 2018-12-18 2021-11-01 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидные комбинации
WO2020126582A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
WO2020126584A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
EP3897138A1 (en) 2018-12-18 2021-10-27 BASF Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
EA202191606A1 (ru) 2018-12-18 2021-10-26 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидные комбинации
GB201820671D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Syngenta Participations Ag Herbicidal compositions
WO2020127345A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
GB201821036D0 (en) 2018-12-21 2019-02-06 Syngenta Participations Ag Nematicidal compositions
WO2020141135A1 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP2022515896A (ja) 2018-12-31 2022-02-22 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
EP3680223A1 (en) 2019-01-10 2020-07-15 Basf Se Mixture comprising an urease inhibitor (ui) and a nitrification inhibitor (ni) such as an ni mixture comprising 2-(3,4-dimethyl-1h-pyrazol-1-yl)succinic acid (dmpsa) and dicyandiamide (dcd)
AR117990A1 (es) 2019-02-06 2021-09-08 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
WO2020161208A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal fused pyridazine compounds
WO2020161209A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal fused pyridazine compounds
GB201901617D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2020161138A1 (en) 2019-02-07 2020-08-13 Syngenta Crop Protection Ag Pyridazinium compounds for use in controlling unwanted plant growth
GB201901760D0 (en) 2019-02-08 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201901757D0 (en) 2019-02-08 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201901808D0 (en) 2019-02-11 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201901878D0 (en) 2019-02-11 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201901866D0 (en) 2019-02-11 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Pre-harvest desiccation method
GB201901961D0 (en) 2019-02-13 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2020164994A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020164993A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
GB201902064D0 (en) 2019-02-14 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201902013D0 (en) 2019-02-14 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2020165403A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Phenyl substituted thiazole derivatives as microbiocidal compounds
WO2020164924A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
CA3128409A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB201902107D0 (en) 2019-02-15 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CN113423273A (zh) 2019-02-15 2021-09-21 先正达农作物保护股份公司 除草组合物
AU2020220608A1 (en) 2019-02-15 2021-08-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
EA202192220A1 (ru) 2019-02-15 2022-01-20 Сингента Кроп Протекшн Аг Гербицидные композиции
EP3696175A1 (en) 2019-02-18 2020-08-19 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active azole-amide compounds
WO2020169526A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active cyanamide heterocyclic compounds
GB201902383D0 (en) 2019-02-21 2019-04-10 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
EP3698632A1 (en) 2019-02-21 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
GB201902438D0 (en) 2019-02-22 2019-04-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
EP3698634A1 (en) 2019-02-25 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3698633A1 (en) 2019-02-25 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
TW202045011A (zh) 2019-02-28 2020-12-16 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
TW202100015A (zh) 2019-02-28 2021-01-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
GB201903000D0 (en) 2019-03-06 2019-04-17 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CN113825753A (zh) 2019-03-08 2021-12-21 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
US20220167618A1 (en) 2019-03-08 2022-06-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole-amide compounds
CA3133166A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Endogenous plant expression enhancer
WO2020188014A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole amide compounds
WO2020188027A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole amide compounds
WO2020193341A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Syngenta Crop Protection Ag N-[1-(5-bromo-2-pyrimidin-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)ethyl]-2-cyclopropyl-6-(trifluoromethyl)pyridine-4-carboxamide derivatives and related compounds as insecticides
GB201903993D0 (en) 2019-03-22 2019-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201903942D0 (en) 2019-03-22 2019-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
EP3947371B1 (en) 2019-03-27 2023-11-22 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal thiazole derivatives
AR118478A1 (es) * 2019-03-28 2021-10-06 Syngenta Crop Protection Ag Modulación de expresión transgénica
UY38623A (es) 2019-03-29 2020-10-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de diazina-amida activos como pesticidas
WO2020204112A1 (ja) 2019-04-01 2020-10-08 日産化学株式会社 ピリダジノン化合物及び除草剤
CN113661165A (zh) 2019-04-05 2021-11-16 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的二嗪-酰胺化合物
MX2021012326A (es) 2019-04-08 2021-11-12 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos de oxidazol para controlar o prevenir hongos fitopatogenicos.
JP2022527836A (ja) 2019-04-08 2022-06-06 ピーアイ インダストリーズ リミテッド 植物病原性真菌を制御又は予防するための新規オキサジアゾール化合物
US20220135531A1 (en) 2019-04-08 2022-05-05 Pi Industries Ltd. Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi
WO2020208095A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal picolinamide derivatives
JOP20210273A1 (ar) 2019-04-11 2023-01-30 Syngenta Crop Protection Ag مركبات دايازين - أميد نشطة بشكل مبيد للآفات
EP3730489A1 (en) 2019-04-25 2020-10-28 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
GB201907231D0 (en) 2019-05-22 2019-07-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal composition
US20220242869A1 (en) 2019-05-27 2022-08-04 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Condensed heterocyclic compound having a bridgehead nitrogen atom or salt thereof, agricultural or horticultural insecticide comprising the compound, and method for using the insecticide
EP3744174A1 (en) 2019-05-27 2020-12-02 Basf Se Use of metyltetraprol and mixtures of metyltetraprol for combating phytopathogenic fungi on cotton
AR119009A1 (es) 2019-05-29 2021-11-17 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de alcoxipiridina y alcoxipirimidina microbicidas
BR112021023843A2 (pt) 2019-05-29 2022-01-04 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas
US20230192628A1 (en) 2019-05-29 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal derivatives
AR119011A1 (es) 2019-05-29 2021-11-17 Syngenta Crop Protection Ag DERIVADOS DE [1,3]DIOXOLO[4,5-c]PIRIDIN-4-CARBOXAMIDA, COMPOSICIONES AGROQUÍMICAS QUE LOS COMPRENDEN Y SU EMPLEO COMO FUNGICIDA PARA CONTROLAR O PREVENIR LA INFESTACIÓN DE PLANTAS ÚTILES
RS65168B1 (sr) 2019-05-29 2024-02-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidna jedinjenja
WO2020254530A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Syngenta Crop Protection Ag 7-sulfonyl-n-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-quinoxaline-6-carboxamide derivatives and the respective -benzimidazole-5-, -imidazo[4,5-b]pyridine-5-, -3h-furo[3,2b]pyridine-5-, -quinoline-2-, and -naphthalene-2-carboxamide derivatives as pesticides
WO2020256113A1 (ja) 2019-06-21 2020-12-24 日本農薬株式会社 オキサジアゾール化合物又はその塩類及び該化合物を含有する農園芸用殺菌剤並びにその使用方法
EP3994124A1 (en) 2019-07-05 2022-05-11 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal picolinamide derivatives
GB201910040D0 (en) 2019-07-12 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910037D0 (en) 2019-07-12 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB201910168D0 (en) 2019-07-16 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910166D0 (en) 2019-07-16 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2021009311A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
GB201910291D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201910290D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
GB201910641D0 (en) 2019-07-25 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvments in or relating to organic compounds
US20220298522A1 (en) 2019-07-30 2022-09-22 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
GB201910930D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910926D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910940D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to oranic compounds
WO2021029308A1 (ja) 2019-08-09 2021-02-18 日本農薬株式会社 オキサゼピノン誘導体及び該誘導体を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
AR119774A1 (es) 2019-08-19 2022-01-12 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol que contienen un anillo heteroaromático de 5 miembros para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
JP2022545266A (ja) 2019-08-23 2022-10-26 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性なピラジン－アミド化合物
EP4025053A1 (en) 2019-09-03 2022-07-13 Basf Se Polymers for spray drift control of pesticide spray
EP4029866A4 (en) 2019-09-12 2023-06-28 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Insecticide agent for agricultural or horticultural use or animal ectoparasite or endoparasite control agent each containing imidazopyridazine compound or salt thereof as active ingredient, and use of said insecticide agent and said control agent
AU2020347697B2 (en) 2019-09-12 2023-07-13 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Agricultural or horticultural insecticide or animal ectoparasite or endoparasite control agent each comprising a condensed heterocyclic compound having a substituted cyclopropane-oxadiazole group or a salt thereof as active ingredient, and method for using the insecticide or the control agent
US20220340578A1 (en) 2019-09-12 2022-10-27 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Agricultural or horticultural insecticide or animal ectoparasite or endoparasite control agent each comprising an imidazopyridazine compound having a substituted cyclopropane-oxadiazole group or a salt thereof as active ingredient, and method for using the insecticide or the control agent
US20220372026A1 (en) 2019-09-20 2022-11-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur and sulfoximine containing substituents
UY38885A (es) 2019-09-20 2021-04-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de azetidinil-, pirrolidinil-,piperdinil- o piperazinil-piridinil carbonilo pesticidamente activos
GB201913752D0 (en) 2019-09-24 2019-11-06 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201914277D0 (en) 2019-10-03 2019-11-20 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2021084526A1 (en) 2019-10-31 2021-05-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Engineered autotrophic bacteria for co2 conversion to organic materials
BR112022008131A2 (pt) 2019-11-01 2022-07-19 Syngenta Crop Protection Ag Compostos heteroaromáticos bicíclicos fundidos pesticidamente ativos
MX2022005328A (es) 2019-11-05 2022-07-21 Pairwise Plants Services Inc Composiciones y metodos para el reemplazo de alelos con adn codificado por arn.
BR112022007554A2 (pt) 2019-11-07 2022-07-05 Nihon Nohyaku Co Ltd Compostos de oxadiazolina ou sais dos mesmos, fungicidas agrohorticulturais contendo os compostos, e uso do mesmo
AR120374A1 (es) 2019-11-08 2022-02-09 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol que contienen anillos de heterociclilo fusionados para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
US20220386594A1 (en) 2019-11-11 2022-12-08 Ibi-Ag Innovative Bio Insecticides Ltd. Insect control nanobodies and uses thereof
GB201916600D0 (en) 2019-11-14 2020-01-01 Syngenta Crop Protection Ag 81991-gb-reg-org-nat-1
GB201916601D0 (en) 2019-11-14 2020-01-01 Syngenta Crop Protection Ag 81989-gb-reg-org-nat-1
CN114727597A (zh) 2019-11-15 2022-07-08 巴斯夫公司 使用包含阴离子性农药和缓冲剂的组合物的方法
GB201916676D0 (en) 2019-11-15 2020-01-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
AR120445A1 (es) 2019-11-15 2022-02-16 Syngenta Crop Protection Ag N-tetrazolil o n-1,3,4-oxadiazolil benzamidas como herbicidas
BR112022010388A2 (pt) 2019-11-28 2022-10-25 Nihon Nohyaku Co Ltd Composto de benzimidazol ou sal deste, agente inseticida e acaricida agrícola e hortícola que contém o referido composto e método para sua utilização
CN115003666A (zh) 2019-12-04 2022-09-02 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的稠合二环杂芳香族氨基化合物
GB201917898D0 (en) 2019-12-06 2020-01-22 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2021122272A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Basf Corporation Low volatile polyamine salts of anionic pesticides
WO2021122645A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole-amide compounds
US20230039941A1 (en) 2019-12-23 2023-02-09 Basf Se Enzyme enhanced root uptake of agrochemical active compound
CN115023425A (zh) 2019-12-31 2022-09-06 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
GB202000011D0 (en) 2020-01-02 2020-02-19 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
AR120982A1 (es) 2020-01-06 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
WO2021144354A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
WO2021144195A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Basf Se Mixtures comprising nitrification inhibitors and carriers
US20230052403A1 (en) 2020-01-16 2023-02-16 Basf Se Mixtures comprising a solid carrier comprising an urease inhibitor and a further solid carrier comprising a nitrification inhibitor
EP4093735A1 (en) 2020-01-24 2022-11-30 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
JP2023513047A (ja) 2020-01-30 2023-03-30 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に有効な縮合二環式芳香族複素環式アミノ化合物
WO2021155109A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
CN115335392A (zh) 2020-01-31 2022-11-11 成对植物服务股份有限公司 植物避荫反应的抑制
WO2021158798A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Pairwise Plants Services, Inc. Thornless / prickleless rubus plants
EP4103549A1 (en) 2020-02-11 2022-12-21 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2021160419A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 Syngenta Crop Protection Ag Method of controlling fungi
EP4107274A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Improved resistance to soybean cyst nematode through gene editing
WO2021170881A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active diazine-bisamide compounds
WO2021175822A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally amidine-substituted benzoic acid amide compounds
US20230096145A1 (en) 2020-03-13 2023-03-30 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
US20230126361A1 (en) 2020-03-13 2023-04-27 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola, cercospora sojina and/or cercospora kikuchii
EP4117437A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
US20230112306A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
EP4117436A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2021180592A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
US20210292754A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Pairwise Plants Services, Inc. Natural guide architectures and methods of making and using the same
US20210301282A1 (en) 2020-03-26 2021-09-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US11882808B2 (en) 2020-03-27 2024-01-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving resistance to soybean rust
WO2021197884A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and strobilurins
WO2021197885A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, azoles and strobilurins
EP4125365A1 (en) 2020-04-02 2023-02-08 BASF Corporation Aqueous formulations of dicamba
WO2021206683A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Basf Corporation High-load solution concentrates of dicamba
US20230175006A1 (en) 2020-04-06 2023-06-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for increasing resistance to ear rot and stem rot disease in maize
AR121734A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbicidas de tipo dihidropirrolopirazina de quinolina
AR121733A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de tipo dihidro-(tiazina)oxazina de quinolina
GB202005175D0 (en) 2020-04-08 2020-05-20 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
EP4132924B1 (en) 2020-04-08 2024-02-21 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
CN115697045A (zh) 2020-04-16 2023-02-03 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
EP4136080B1 (en) 2020-04-17 2024-04-24 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
WO2021213929A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active substituted 1,3-dihydro-2h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-one derivatives with sulfur containing substituents
CN115443267A (zh) 2020-04-28 2022-12-06 巴斯夫欧洲公司 杀害虫化合物
GB202006386D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal Compounds
JP2023523456A (ja) 2020-04-30 2023-06-05 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
GB202006399D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006480D0 (en) 2020-05-01 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006606D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
WO2021224409A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP4156909A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
KR20230019144A (ko) 2020-06-03 2023-02-07 신젠타 크롭 프로텍션 아게 살진균 조성물
JP2023527894A (ja) 2020-06-03 2023-06-30 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺菌性組成物
AU2021286139A1 (en) 2020-06-03 2022-12-15 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal derivatives
EP4161268A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Syngenta Crop Protection AG Fungicidal compositions
AR122187A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122189A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122199A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122485A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122484A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
CA3181596A1 (en) 2020-06-15 2021-12-23 Rodney F. Klima A stable, solvent-free, self-emulsifiable concentrate
CA3186972A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US20230295108A1 (en) 2020-06-26 2023-09-21 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Aryltetrahydropyridine derivative or salt thereof, insecticidal agent containing the compound, and method of use thereof
AU2021296100A1 (en) 2020-06-26 2023-02-16 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Aryltetrahydropyridazine derivative or salt thereof, insecticidal agent containing the compound, and method of use thereof
WO2022006226A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
EP4175476A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 PI Industries Ltd. A pesticidally active mixture comprising thietanyloxy compound, oxides or salts thereof
GB202011068D0 (en) 2020-07-17 2020-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2022013417A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2022017975A1 (en) 2020-07-18 2022-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR123052A1 (es) 2020-07-27 2022-10-26 Pi Industries Ltd Una mezcla pesticidamente activa que comprende el compuesto de pirazolopiridina antranilamida, sus óxidos o sales de los mismos
AR123264A1 (es) 2020-08-18 2022-11-16 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos heterocíclicos para combatir los hongos fitopatógenos
EP4204436A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas proteins and methods of use thereof
CA3189161A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
BR112023003835A2 (pt) 2020-09-01 2023-04-04 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre ativos em termos pesticidas
JP2023540953A (ja) 2020-09-02 2023-09-27 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
US20230265102A1 (en) 2020-09-02 2023-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
UY39411A (es) 2020-09-09 2022-04-29 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de indazolil pirazolo[3,4-c] piridina pesticídicamente activos con sustituyentes que contienen azufre
GB202014303D0 (en) 2020-09-11 2020-10-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2022058877A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Pi Industries Limited Novel picolinamide compounds for combating phytopathogenic fungi
UY39424A (es) 2020-09-15 2022-03-31 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos
GB202014840D0 (en) 2020-09-21 2020-11-04 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
TW202229241A (zh) 2020-09-26 2022-08-01 印度商皮埃企業有限公司 殺線蟲化合物及其用途
US20230374447A1 (en) 2020-10-05 2023-11-23 Protalix Ltd. Dicer-like knock-out plant cells
EP4225034A1 (en) 2020-10-08 2023-08-16 Basf Se Mixtures containing cyclobutrifluram
GB202016569D0 (en) 2020-10-19 2020-12-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202016568D0 (en) 2020-10-19 2020-12-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2022098993A2 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
WO2022101265A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
GB202017990D0 (en) 2020-11-16 2020-12-30 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2022112072A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
EP4255189A1 (en) 2020-12-01 2023-10-11 Basf Se Mixtures containing metarylpicoxamid
WO2022128554A1 (en) 2020-12-15 2022-06-23 Basf Se Mixtures containing n-methoxy-n-[[4-[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]phenyl]methyl]cyclopropanecarboxamide
AR124335A1 (es) 2020-12-18 2023-03-15 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
EP4018830A1 (en) 2020-12-23 2022-06-29 Basf Se Pesticidal mixtures
CN116783193A (zh) 2021-01-21 2023-09-19 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
EP4281185A2 (en) 2021-01-23 2023-11-29 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heteroaromatic compounds
JP2024505187A (ja) 2021-01-27 2024-02-05 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ジアミノトリアジン化合物
AU2022212381A1 (en) 2021-01-27 2023-08-10 Basf Se Diaminotriazine compounds
US20240101496A1 (en) 2021-02-02 2024-03-28 Basf Se Synergistic action of dcd and alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors
CA3210785A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants
GB202102147D0 (en) 2021-02-16 2021-03-31 Syngenta Crop Protection Ag New use
EP4294187A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Syngenta Crop Protection AG Insect and acarina pest control
WO2022175420A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Syngenta Crop Protection Ag Insect and acarina pest control
US20220380792A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 Pairwise Plants Services, Inc Methods and compositions for modifying root architecture in plants
WO2022180096A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidal compositions
AR124935A1 (es) 2021-03-01 2023-05-24 Syngenta Crop Protection Ag Formulaciones plaguicidas
JPWO2022186133A1 (uk) 2021-03-01 2022-09-09
WO2022200364A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2022207479A1 (en) 2021-03-27 2022-10-06 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal isonicotinic amide derivatives
BR112023019828A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de amina cíclica pesticidamente ativos
EP4066643A1 (en) 2021-03-30 2022-10-05 Basf Se Pesticidal mixtures
UY39696A (es) 2021-03-31 2022-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de quinolin/quinoxalin-benzotiazina como agentes fungicidas, en particular c
GB202104745D0 (en) 2021-04-01 2021-05-19 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
AU2022253338A1 (en) 2021-04-07 2023-10-12 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
AR125342A1 (es) 2021-04-16 2023-07-05 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas
BR112023021626A2 (pt) 2021-04-20 2024-02-20 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de quinolina/quinoxalina isoquinolina
BR112023022854A2 (pt) 2021-05-05 2024-01-23 Pi Industries Ltd Compostos heterocíclicos fusionados inovadores para combater fungos fitopatogênicos
CN117222627A (zh) 2021-05-07 2023-12-12 先正达农作物保护股份公司 除草化合物
KR20240006593A (ko) 2021-05-10 2024-01-15 신젠타 크롭 프로텍션 아게 제초제로서 치환된 벤즈아미드
CN117295401A (zh) 2021-05-10 2023-12-26 先正达农作物保护股份公司 除草组合物
GB202106945D0 (en) 2021-05-14 2021-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
CN117320551A (zh) 2021-05-14 2023-12-29 先正达农作物保护股份公司 种子处理组合物
EP4337015A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Syngenta Crop Protection AG Insect, acarina and nematode pest control
AU2022277401A1 (en) 2021-05-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Weed control method
WO2022243158A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Syngenta Crop Protection Ag Thiophene derivatives and weed control method
EP4091449A1 (en) 2021-05-19 2022-11-23 Syngenta Crop Protection AG Weed control method
EP4091450A1 (en) 2021-05-19 2022-11-23 Syngenta Crop Protection AG 3,3-difluoro-2-oxoindoline derivatives useful in weed control
AR125954A1 (es) 2021-05-21 2023-08-30 Basf Se Uso de compuestos de etinilpiridina como inhibidores de nitrificación
CA3219128A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Barbara Nave Use of an n-functionalized alkoxy pyrazole compound as nitrification inhibitor
EP4094579A1 (en) 2021-05-28 2022-11-30 Basf Se Pesticidal mixtures comprising metyltetraprole
CA3219744A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Christopher Charles SCARBOROUGH Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives
IL309024A (en) 2021-06-02 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag Heterocyclic derivatives are active using pesticides with sulfoximine-containing substituents
WO2022258481A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active diazine-amide compounds
US20220396803A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Nant Holdings Ip, Llc Methods And Systems For Producing A Protein Of Interest In A Plant
US20220403475A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Pairwise Plants Services, Inc. Reporter constructs, compositions comprising the same, and methods of use thereof
CN117897050A (zh) 2021-06-17 2024-04-16 成对植物服务股份有限公司 大豆中生长调节因子家族转录因子的修饰
AU2022296764A1 (en) 2021-06-21 2024-01-04 Basf Se Metal-organic frameworks with pyrazole-based building blocks
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
WO2022268815A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
CA3221180A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag 2-[3-[1 [(quinazolin-4-yl)amino]ethyl]pyrazin-2-yl]thiazole-5-carbonitrile derivatives and similar compounds as pesticides
WO2022268813A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023278651A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
KR20230006252A (ko) * 2021-07-02 2023-01-10 주식회사 바이오에프디엔씨 고주파 특이적 발현 프로모터
WO2023280999A1 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023006634A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
WO2023006789A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
AU2022323303A1 (en) 2021-08-02 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2023012081A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
AR126729A1 (es) 2021-08-10 2023-11-08 Syngenta Crop Protection Ag Mezcla fungicida
AR126700A1 (es) 2021-08-10 2023-11-01 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
CA3229056A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023023496A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
AR126789A1 (es) 2021-08-19 2023-11-15 Syngenta Crop Protection Ag Método para controlar plagas resistentes a diamidas y compuestos para esto
WO2023034731A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
CN117897378A (zh) 2021-09-03 2024-04-16 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 对除草剂具有增加的耐受性的植物
WO2023036984A1 (en) 2021-09-13 2023-03-16 Plantibodies Genetically modified organism for recombinant protein production
AU2022352997A1 (en) 2021-09-21 2024-04-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
US20230266293A1 (en) 2021-09-21 2023-08-24 Pairwise Plants Services, Inc. Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same
WO2023046853A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023060028A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
US20230116819A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
AU2022361189A1 (en) 2021-10-08 2024-03-14 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Pyrimidinyl triazole compound or salt thereof, pest control agent containing said compound as active ingredient, and pest control method
AU2022364034A1 (en) 2021-10-14 2024-04-04 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
AR127279A1 (es) 2021-10-14 2024-01-03 Syngenta Crop Protection Ag Composición química estabilizada con nanocristales de celulosa
GB202114863D0 (en) 2021-10-18 2021-12-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202115018D0 (en) 2021-10-20 2021-12-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2023072945A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023072849A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
CA3234095A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Syngenta Crop Protection Ag Agrochemical formulations for mitigating crystallization
WO2023078743A1 (en) 2021-11-02 2023-05-11 Syngenta Crop Protection Ag Micronized wax and silicone agrochemical formulation
WO2023089049A2 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal isonicotinic amide derivatives
AR127682A1 (es) 2021-11-19 2024-02-21 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas de aureobasidina
WO2023094304A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal heterobiaryl amide derivatives
WO2023094303A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal heterobiaryl amide derivatives
TW202332376A (zh) 2021-12-02 2023-08-16 瑞士商先正達農作物保護公司 在熱緊迫下保留玉蜀黍花粉活力之方法
AR127799A1 (es) 2021-12-02 2024-02-28 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
GB202117474D0 (en) 2021-12-03 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202117598D0 (en) 2021-12-06 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202117597D0 (en) 2021-12-06 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202117595D0 (en) 2021-12-06 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
WO2023105065A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023104714A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
WO2023105064A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
US20230295646A1 (en) 2021-12-13 2023-09-21 Pairwise Plants Services, Inc. Model editing systems and methods relating to the same
WO2023110710A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4197333A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
AR127922A1 (es) 2021-12-15 2024-03-13 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos bicíclicos microbiocidas
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
AR127972A1 (es) 2021-12-17 2024-03-13 Pi Industries Ltd Novedosos compuestos de piridina carboxamida bicíclica sustituida fusionada para combatir hongos fitopatogénicos
WO2023111215A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine-substituted benzothiazine derivatives
WO2023110871A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
AR127992A1 (es) 2021-12-21 2024-03-13 Syngenta Crop Protection Ag Composición agroquímica
WO2023117670A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Triazine herbicidal compounds
WO2023118011A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal aza-heterobiaryl derivatives
WO2023133440A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for trichome removal
WO2023139166A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Syngenta Crop Protection Ag Methods for controlling plant pathogens
TW202346271A (zh) 2022-01-26 2023-12-01 瑞士商先正達農作物保護公司 除草化合物
WO2023144711A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 Pi Industries Ltd. 1,2,3-triazole carbonyl sulfonylamide compounds and use thereof
WO2023147526A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
WO2023148206A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal n-amide derivatives
WO2023148368A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023148369A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023152340A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023156402A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
GB202202314D0 (en) 2022-02-21 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202202315D0 (en) 2022-02-21 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2023164722A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas effector proteins and methods of use thereof
WO2023165873A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Syngenta Crop Protection Ag Pyrimidinyl-oxy-quinoline based herbicidal compounds
WO2023165874A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Syngenta Crop Protection Ag Pyrimidinyl-oxy-quinoline based herbicidal compounds
WO2023166067A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridazinone amide derivatives
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023169984A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
WO2023187191A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US20230357789A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023203038A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
US20230383305A1 (en) 2022-04-21 2023-11-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2023203066A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Basf Se Synergistic action as nitrification inhibitors of dcd oligomers with alkoxypyrazole and its oligomers
WO2023208866A1 (en) 2022-04-25 2023-11-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
US20230348922A1 (en) 2022-05-02 2023-11-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
WO2023217989A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Syngenta Crop Protection Ag Alkoxy heteroaryl- carboxamide or thioamide compounds
WO2023222836A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023222834A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2023222831A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202207819D0 (en) 2022-05-27 2022-07-13 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202209005D0 (en) 2022-06-20 2022-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2023247552A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal bicyclic heterocyclic carboxamide derivatives
WO2023247360A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
GB202209172D0 (en) 2022-06-22 2022-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202209286D0 (en) 2022-06-24 2022-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2024006679A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240002873A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024006791A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024012968A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrimidinone derivatives
GB202210443D0 (en) 2022-07-15 2022-08-31 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2024020360A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Pairwise Plants Services, Inc. Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc'
WO2024017762A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024023035A1 (en) 2022-07-25 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024022910A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
WO2024036240A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024038054A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024046890A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrazole compounds
US20240090466A1 (en) 2022-09-08 2024-03-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
WO2024056732A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2024068950A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2024068947A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2024074414A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal imidazole compounds

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4467036A (en) 1981-11-12 1984-08-21 The Board Of Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
US4448885A (en) 1981-04-27 1984-05-15 Board Of The Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
DE3416978A1 (de) 1983-05-12 1984-12-06 Stauffer Chemical Co., Westport, Conn. Durch liposom vermittelte transformation eukaryotischer zellen
US5380831A (en) * 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
EP0160390A3 (en) 1984-04-16 1987-04-08 Sandoz Ltd. Embryogenic callus and cell suspension of inbred corn
CA1301094C (en) 1984-08-31 1992-05-19 Helen Riaboff Whiteley Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment
US4830966A (en) 1984-09-07 1989-05-16 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5371003A (en) 1987-05-05 1994-12-06 Sandoz Ltd. Electrotransformation process
DE3887375T2 (de) * 1987-05-05 1994-06-09 Sandoz Ag Pflanzengewebe-Transformation.
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
ATE125418T1 (de) 1987-05-20 1995-08-15 Ciba Geigy Ag Zeamays-pflanzen und transgenetische zeamays- pflanzen, die aus protoplasten oder aus von protoplasten erhaltenen zellen regeneriert wurden.
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
ES2150410T3 (es) 1988-06-20 2000-12-01 Novartis Ag Procedimiento para el combate de parasitos de plantas.
GB8818706D0 (en) * 1988-08-05 1988-09-07 Ici Plc Dna constructs & plants incorporating them
NZ230375A (en) * 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
NZ231804A (en) 1988-12-19 1993-03-26 Ciba Geigy Ag Insecticidal toxin from leiurus quinquestriatus hebraeus
GB8901697D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Male flower specific gene sequences
DE69033816T2 (de) * 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
EP0400246A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
WO1991002059A1 (en) 1989-08-01 1991-02-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activators of anthocyanin biosynthesis as visual markers for plant transformation
US20010003849A1 (en) * 1989-08-07 2001-06-14 Kenneth A. Barton Expression of genes in plants
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5177308A (en) * 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
CA2074355C (en) 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
ATE225853T1 (de) * 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
EP0528819A1 (en) * 1990-04-18 1993-03-03 Plant Genetic Systems, N.V. Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
DK0558676T3 (da) 1990-11-23 2000-09-25 Aventis Cropscience Nv Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter
DK0539563T3 (da) 1991-05-15 2001-11-12 Monsanto Technology Llc Fremgangsmåde til skabelse af en transformeret risplante
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
TW261517B (uk) * 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5530197A (en) * 1992-08-19 1996-06-25 Plant Genetic Systems, N.V. Control of ostrinia
US5689052A (en) 1993-12-22 1997-11-18 Monsanto Company Synthetic DNA sequences having enhanced expression in monocotyledonous plants and method for preparation thereof
US6350689B1 (en) * 2001-04-23 2002-02-26 Chartered Semiconductor Manufacturing Ltd. Method to remove copper contamination by using downstream oxygen and chelating agent plasma

Also Published As

Publication number Publication date
ES2181678T3 (es) 2003-03-01
AU2795292A (en) 1993-05-03
US6018104A (en) 2000-01-25
DE69232725T2 (de) 2003-04-03
US20030046726A1 (en) 2003-03-06
DK0618976T3 (da) 2002-12-02
EP1213356A2 (en) 2002-06-12
EP1209237A2 (en) 2002-05-29
HU220294B (hu) 2001-11-28
US6051760A (en) 2000-04-18
EP1213356A3 (en) 2002-06-19
CZ76994A3 (en) 1995-03-15
HU9400960D0 (en) 1994-06-28
US5859336A (en) 1999-01-12
RU2202611C2 (ru) 2003-04-20
SK37894A3 (en) 1994-10-05
EP1209237A3 (en) 2002-07-31
BG62782B1 (bg) 2000-07-31
EP0618976A1 (en) 1994-10-12
US5625136A (en) 1997-04-29
CA2120514A1 (en) 1993-04-15
US6720488B2 (en) 2004-04-13
HUT68261A (en) 1995-06-28
CZ292953B6 (cs) 2004-01-14
DE69232725D1 (de) 2002-09-12
JP2003189888A (ja) 2003-07-08
SK283357B6 (sk) 2003-06-03
BR9206578A (pt) 1995-04-11
CA2120514C (en) 2008-08-05
RO110263B1 (ro) 1995-11-30
EP0618976B1 (en) 2002-08-07
US6320100B1 (en) 2001-11-20
US20060021095A1 (en) 2006-01-26
US6121014A (en) 2000-09-19
US6075185A (en) 2000-06-13
ATE221916T1 (de) 2002-08-15
BG98747A (bg) 1995-02-28
JPH07500012A (ja) 1995-01-05
WO1993007278A1 (en) 1993-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA48104C2 (uk) Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
JP4592954B2 (ja) グルホシネート耐性イネ
ES2243954T3 (es) Secuencias promotoras inducibles por frio.
JPH10501972A (ja) 植物ウイルス耐性遺伝子及び方法
JPS6094041A (ja) 昆虫耐性植物
UA43827C2 (uk) Спосіб одержання генетично трансформованих рослин з підвищеним вмістом крохмалю, рекомбінантна дволанцюгова днк-молекула
CN102337275A (zh) 用于dmo的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途
JPH03504806A (ja) 変更された花、種又は胚芽をもつ植物
US8853494B2 (en) Stress tolerant transgenic crop plants
US10647990B2 (en) Rice high temperature resistance gene and use in crop breeding resistance to high temperature thereof
JPH03112488A (ja) 調節ｄｎａ配列
CN110699374B (zh) 一种抗草甘膦油菜的培育方法
HU221515B (en) Transgenic plants with improved biomass production
AU2004210748B2 (en) Gene resistant to Aphis gossypii
MX2014007711A (es) Metodos para mejorar rendimiento de cultivos.
CN110093325B (zh) 烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用
CN109797158B (zh) 基因OsNTL3在改良水稻高温抗性方面的应用及获得的水稻高温抗性基因
US11840693B2 (en) Restorer plants
US20030093835A1 (en) Chimeric genes controlling flowering
EP0967278A2 (en) Flowering regulating gene and its use
US7244875B2 (en) Expression vectors comprising nucleic acids encoding SEBF proteins and uses thereof
JP5051742B2 (ja) 植物体の着色制御遺伝子、およびその利用
CN103710379B (zh) GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用
CN110241130B (zh) 控制植物粒数和粒重的gsn1基因、编码蛋白及其应用
ES2902959T3 (es) Planta restauradora