ES2902959T3 - Planta restauradora - Google Patents

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Ruonan Zhou
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Abstract

Oligonucleótido que presenta una de las siguientes secuencias de nucleótidos: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o un complemento de la misma, o (ii) SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o un complemento de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
Planta restauradora
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo técnico del fitomejoramiento y la biotecnología verde, en particular, al campo de la producción de plantas híbridas por medio de procedimientos de biología molecular, tecnología de marcadores e ingeniería genética. En particular, se ponen a disposición cereales híbridos que se obtienen mediante la restauración de la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (P-CMS) que se genera mediante el citoplasma de tipo Pampa y/o que presentan una restauración completa de la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (P-CMS) que se genera mediante el citoplasma de tipo Pampa. Se caracterizan por suprimir los efectos negativos, en su mayoría reductores del rendimiento, que, de otro modo, están asociados con la introgresión de segmentos cromosómicos que contienen el locus responsable de la restauración en los cultivares. A este respecto, la presente invención pone a disposición plantas, en particular, plantas de centeno, que, como progenitor de polen masculino, pueden restaurar la fertilidad del polen para la P-CMS, en las que, en plantas híbridas derivadas del cruzamiento de este progenitor de polen con un progenitor con CMS femenino, un arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración está reducido o completamente suprimido.
Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que portan la información necesaria para la restauración de la P-CMS, ADN y vectores que contienen una molécula de ácido nucleico de este tipo, células huésped correspondientes, así como una proteína que se puede codificar mediante la molécula de ácido nucleico y anticuerpos dirigidos contra ella. La invención se refiere además al uso de moléculas de ácido nucleico, ADN, vectores y anticuerpos, por ejemplo, en la producción de plantas híbridas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Gracias a su pronunciada tolerancia al estrés en ubicaciones secas y pobres en nutrientes, así como en cuencas hidrográficas con uso de pesticidas limitado, el centeno muestra ventajas de rendimiento considerables con respecto a la cebada y el trigo y, por lo tanto, corresponde a aspectos específicos de una agricultura sostenible. En el centeno, entre otros, el empleo de la androesterilidad citoplasmática (CMS) ha abierto la posibilidad de cultivar variedades híbridas con alto potencial de rendimiento mediante el empleo de la heterosis (Geiger, H. H., y T. Miedaner. "Hybrid rye and heterosis." Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops. Crop Science Society. America, Madison, Wisconsin, USA (1999): 439-450). Los híbridos en el centeno muestran una importancia cada vez mayor como tipo de cultivo agrícola en Europa. Solo en Alemania, Dinamarca y Austria, el centeno híbrido ya representa más de un 70 % de la producción total de centeno. También en otras regiones, en particular, en Europa del Este, se espera un aumento significativo del cultivo de centeno híbrido en los próximos años. Los principales usos del centeno se encuentran en la alimentación animal y la elaboración de pan, para la que, por lo general, se usa el centeno como mezcla con otros cereales. Además, el centeno también obtiene cada vez más importancia como sustrato para la obtención de bioenergía.
Actualmente, la mayoría de los sistemas híbridos en el centeno se basan en el empleo del citoplasma de tipo Pampa (P), que, junto con genes no restauradores en el genoma nuclear, media en la androesterilidad (P-CMS). Esto se descubrió a finales de la década de 1960 en una variedad autóctona argentina (Geiger, H. H., y F. W. Schnell. "Cytoplasmic male sterility in rye (Secale cereale L.)." Crop Science 10.5 (1970): 590-593). Esta CMS muestra una excelente estabilidad con respecto a las condiciones ambientales y es sostenible de forma fiable por genotipos no restauradores que aparecen en todas las poblaciones reproductoras europeas. En la búsqueda de restauradores eficaces para la androfertilidad de P-CMS se descubrieron accesiones de centeno primitivas, como IRAN IX, Pico Gentario o Altevogt 14160 (Geiger HH, Miedaner T (1996) Genetic basis and phenotypic stability of male-fertility restoration in rye. Vortr Pflanzenzüchtg 35:27-38; Miedaner T, Glass C, Dreyer F, Wilde P, Wortmann H, Geiger Hh (2000) Mapping of genes for male fertility restoration in "Pampa" CMS winter rye (Secale cereale L.). Theor Appl Genet 101:1226-1233; Falke KC, Wilde P, Miedaner T (2009) Rye introgression lines as source of alleles for pollen-fertility restoration in Pampa CMS. Plant Breeding 128:528-531). IRAN IX es una población de centeno autoincompatible obtenida en la región de Karaj en Elburz por Kuckuck (1956; Report to the government of Iran on the distribution and variation of cereals in Iran, Informe de la FAO n.° 517:1-22) y almacenada en el banco de genes del antiguo Centro Federal de Investigación para la Agricultura (FAL) alemán. La accesión Pico Gentario proviene de Argentina y la población de Altevogt 14160 también proviene de Irán. Ambas son igualmente autoincompatibles y se pueden obtener en el Jardín Botánico de la Academia Polaca de Ciencias en Varsovia. En comparación con los genotipos restauradores que provienen de fuentes centroeuropeas, los restauradores de IRAN IX, Pico Gentario o Altevogt 14160 muestran una capacidad de restauración alta y estable. A diferencia de las fuentes centroeuropeas, esto se manifiesta en forma de una muy buena liberación de polen, un rasgo que desempeña un papel decisivo en la minimización del cornezuelo. La infestación con cornezuelo es una de las enfermedades económicamente más importantes del centeno (Claviceps purpurea [Fr.] Tul.). Como resultado, desde 2008 la susceptibilidad de las variedades de centeno al cornezuelo se clasifica oficialmente en la lista descriptiva de variedades de la Oficina Federal de Variedades Vegetales alemana y también se tiene en cuenta por la Oficina de Variedades Vegetales polaca (COBORU) al evaluar los híbridos de centeno. La mejora de la capacidad de liberación de polen en variedades híbridas, por ejemplo, en centeno de invierno, mediante locus restauradores eficaces como Rfp1 es actualmente la estrategia más eficaz y sostenible para minimizar la contaminación de la cosecha con cornezuelo en centeno híbrido. En general, la introgresión de estas fuentes restauradoras en las líneas parentales de polen representó un avance significativo para la restauración de la fertilidad de los híbridos.
Los trabajos de cartografiado con respecto a la localización del locus restaurador Rfp1 del donante IRAN IX, Rfp2 del donante Pico Gentario o del locus de Altevogt 14160 revelaron respectivamente una posición en el brazo largo del cromosoma 4R (Miedaner et al. 2000. Mapping of genes for male fertility restoration in "Pampa" CMS winter rye (Secale cereale L.). Theor Appl Genet 101:1226-1233; Stracke et al. 2003. Development of PCR-based markers linked to dominant genes for male-fertility restoration in Pampa CMS of rye (Secale cereale L.), Theor Appl Genet (2003) 106:1184—1190; Falke et al. 2009. Rye introgression lines as source of alleles for pollen-fertility restoration in Pampa CMS. Plant Breeding 128:528-531, Hackauf et al. 2012. Development of COS Markers for the Restorer Gene Rfp1 in Rye. Molecular Breeding 30: 1507-1518). Los estudios con marcadores de selección asociados demuestran que en la región en cuestión en el cromosoma 4 RL pueden estar agrupados varios genes restauradores o bien los genes restauradores en cuestión pueden ser alelos de una misma localización genética (Hackauf et al. (2012) "Development of conserved ortholog set markers linked to the restorer gene Rfp1 in rye." Molecular breeding 30.3: 1507-1518).
Aunque, por un lado, el uso de los locus restauradores anteriores es ventajoso en términos de capacidad de restauración y liberación de polen, por otro lado, los segmentos de introgresión asociados que contienen los locus restauradores disminuyen la capacidad agronómica de las poblaciones reproductoras actuales. En particular, el rendimiento de grano se ve significativamente afectado por la región genómica que flanquea los genes restauradores (arrastre por ligamiento), de modo que la ventaja del efecto de heterosis en los híbridos merma drásticamente o incluso se suprime por completo. Además, también se analizó la posibilidad de que el efecto de arrastre por ligamiento observado, o al menos una parte de él, sea, en realidad, un efecto pleiotrópico del gen restaurador. A pesar del intenso trabajo de retrocruzamiento acompañado de un extenso desarrollo de marcadores durante más de diez años, solo se ha conseguido establecer una posición genética aproximada hasta la fecha. Mediante la selección constante de marcadores en primer plano más o menos estrechamente acoplados y el gen diana, el tamaño del fragmento de introgresión con el locus restaurador se conserva en gran medida y, por tanto, también una gran cantidad de genes de donantes no adaptados, lo que hace inmediatamente plausible el efecto de arrastre por ligamiento observado. Hackauf et al., (2012) ("Development of conserved ortholog set markers linked to the restorer gene Rfp1 in rye." Molecular breeding 30.3 (2012): 1507-1518) muestran para Rfp1 el cartografiado más actual publicado de la región genómica de interés alrededor del locus restaurador en 4R. Aunque un enfoque comparativo de cartografiado génico basado en genomas de gramíneas completamente descodificados consiguió limitar el segmento de introgresión que incluye el propio locus Rfp1 a un intervalo de alrededor de 2,0 cM, flanqueado por los marcadores tc135788 y tc176835, o a un intervalo de 0,7 cM, flanqueado por los marcadores tc256739 y tc300731. Sin embargo, ni se ha podido identificar el propio gen restaurador, ni se han obtenido resultados experimentales bien fundamentados sobre el alcance y la localización de la reducción de la capacidad agronómica. Tampoco se sabe que se hayan producido recombinantes en los que el cambio en el segmento de introgresión y la capacidad agronómica puedan estar relacionados entre sí.
Por lo tanto, el objetivo de la presente invención fue desarrollar adicionalmente los segmentos de introgresión en los que se basan los locus restauradores mencionados anteriormente, de modo que, aunque conserven los rasgos de restauración deseados en el cereal, ya no muestren las reducciones de la capacidad o las reduzcan o minimicen significativamente. En particular, el objetivo de la invención era incluir los genes restauradores, que representan una base sustancial de los programas de mejoramiento de híbridos en gramíneas, preferentemente en cereales, en un cartografiado fino de alta resolución de la región en cuestión y, por tanto, proporcionarlos. Además, en el contexto de la invención, se deben poner a disposición genotipos que, a partir de marcadores estrechamente acoplados alrededor del locus restaurador, describan haplotipos para la región diana a los que se pueda asignar de forma cuantitativa y cualtivativamente precisa el cambio de capacidad agronómico. Además, el objetivo de la presente invención es identificar marcadores que estén situados en el propio gen restaurador, de modo que con ellos se proporcione el gen restaurador con fines de reproducción.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Para resolver el objetivo anterior, se proporciona una planta, en particular, del orden de las gramíneas (Poales), que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática de tipo Pampa (P-CMS). Preferentemente se trata de una planta de la familia de las gramíneas dulces (Poaceae) o del género Secale u Hordeum y preferentemente, en particular, una planta de la especie Secale cereale u Hordeum vulgare. La planta está caracterizada además porque, en la planta o en una planta híbrida obtenible a partir de un cruzamiento de la planta con un progenitor con CMS femenino de la misma especie, un efecto de arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración (véase Hackauf et al. 2012), preferentemente un efecto reductor del rendimiento, está reducido o completamente suprimido. Por tanto, con ayuda de la presente invención se pudo proporcionar una planta en la que los rasgos agronómicos negativos no deseados en el locus restaurador se pudieron desacoplar de los genes restauradores Rfpla y Rfplb. Este desacoplamiento permite combinar un alto rendimiento con una capacidad de restauración eficaz.
Además, las células de la planta pueden presentar un citoplasma que medie en la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa. Por tanto, también se divulga una planta híbrida con alto potencial de rendimiento, que tiene una capacidad de restauración muy eficaz, o una planta que, como progenitor de polen, es adecuada para restaurar preferentemente por completo la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa. Simultáneamente, el arrastre por ligamiento, que puede provocar una reducción significativa de la capacidad agronómica, en particular, una reducción del rendimiento, está reducido o completamente anulado.
Además, puede ser una planta que comprenda un segmento cromosómico que presente al menos una molécula de ácido nucleico que puede mediar en el rasgo de restauración para la androesterilidad citoplasmática de tipo Pampa. Preferentemente, el segmento cromosómico es un intervalo entre los locus marcadores tc256739, ctg32 o ctg24met2a5 y tc300731 o 7_01_H_1441 en el cromosoma 4R de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160. Además, los segmentos cromosómicos descritos también se pueden encontrar en otros donantes relacionados. Dichos donantes se pueden encontrar, en particular, en las regiones mediterráneas, por ejemplo, Turquía o España, con conocimiento de la estructura genética del segmento cromosómico aquí descrito, así como de la al menos una molécula de ácido nucleico. Los marcadores moleculares de acuerdo con la invención se pueden usar aquí, por ejemplo, como se describe más adelante. Por lo tanto, la presente invención no está limitada a los donantes del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160, sino que también incluye siempre, aunque no se mencionen explícitamente, donantes relacionados que pueden servir como fuente del segmento cromosómico de acuerdo con la invención y de la al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Un segmento cromosómico de este tipo puede ser, por ejemplo, uno de los siguientes intervalos: entre los locus marcadores ctg32 y tc300731, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y tc300731, entre los locus marcadores ctg2 y tc300731, entre los locus marcadores ctg16b y tc300731, entre los locus marcadores c40745_1 y tc300731, entre los locus marcadores P20 y tc300731, entre los locus marcadores tc256739 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg32 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg2 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg16b y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores c40745_1 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores P20 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores tc256739 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores tc256739 y P20, entre los locus marcadores tc256739 y c40745_1, entre los locus marcadores tc256739 y ctg16b, entre los locus marcadores ctg32 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores ctg32 y P20, entre los locus marcadores ctg32 y c40745_1, entre los locus marcadores ctg32 y ctg16b, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y P20, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y c40745_1, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y ctg16b, entre los locus marcadores ctg2 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores ctg2 y P20, entre los locus marcadores ctg2 y c40745_1 o entre los locus marcadores ctg2 y ctg16b. Además, el efecto de arrastre por ligamiento es preferentemente el efecto de arrastre por ligamiento que estaba acoplado originalmente con el segmento cromosómico del que proviene la molécula de ácido nucleico restauradora. Además, la molécula de ácido nucleico es preferentemente una molécula de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un factor de terminación de la transcripción mitocondrial (mTERF). Al menos una molécula de ácido nucleico puede significar una, dos, tres, cuatro o cinco moléculas de ácido nucleico; preferentemente al menos una molécula de ácido nucleico quiere decir una o dos moléculas de ácido nucleico.
Como fuente para el segmento cromosómico, que presenta al menos una molécula de ácido nucleico, que puede mediar en el rasgo de restauración para la androesterilidad citoplasmática de tipo Pampa, pueden servir las accesiones de centeno primitivas IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160 (Geiger et al., Vortr Pflanzenzüchtg 35 (1996), 27-38; Miedaner et al., Theor Appl Genet 101(2000), 1226-1233; Falke et al., Plant Breeding 128 (2009), 528-531). IRAN IX es una población de centeno autoincompatible de Karaj en Elburz obtenida por Kuckuck (informe de la FAO n.° 517 (1956), 1-22) y conservada en el banco de genes del Centro Federal de Investigación para la Agricultura (FAL) alemán. La accesión Pico Gentario de Argentina y la población de Altevogt 14160 de Irán son igualmente autoincompatibles y ambas se proporcionaron por el Jardín Botánico de la "Academia Polaca de Ciencias" en Varsovia, Polonia.
La al menos una molécula de ácido nucleico puede presentar una secuencia de nucleótidos que está seleccionada del grupo que consiste en una: (i) secuencia de nucleótidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 28, (ii) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29, (iii) secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (iv) secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de acuerdo con (iii) en condiciones rigurosas, (v) secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 % 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (vi) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID n O : 29. La al menos una molécula de ácido nucleico codifica preferentemente uno o más factores de terminación de la transcripción mitocondriales (mTERF) o un fragmento funcional de los mismos. La familia de proteínas mTERF comparte varias funciones importantes con la familia de los llamados pentatricopéptidos (PPR). Como la familia de proteínas mTERF, la familia de los pentatricopéptidos (PPR) es una familia inusual de proteínas de unión a ARN, que está caracterizada por repeticiones de hélice redundantes. En la familia de PPR, estos consisten en alrededor de 35 aminoácidos (Small et al., Trends Biochem. Sci. 25 (2000), 46—47), a diferencia de las repeticiones en mTERF, que normalmente se caracterizan por tener alrededor de 31 aminoácidos que forman tres hélices en lugar de dos (Hammani et al., Nucleic Acids Res 42 (2014), 5033—5042). No se puede descartar que la presencia de uno o más genes PPR funcionales interfiera con el efecto positivo de las plantas descritas anteriormente con rasgos mejorados. Por lo tanto, en un modo de realización, la molécula de ácido nucleico de la planta preferentemente no presenta ningún un gen pentatricopéptido (PPR) funcional que provenga del donante.
Como se muestra en los ejemplos a continuación, se pudieron identificar marcadores estrechamente flanqueantes de los genes Rfp1 y, por tanto, se proporcionaron marcadores estrechamente acoplados para el cartografiado de alta resolución de los genes Rfp1 en el centeno, lo que posibilitó, entre otras cosas, flanquear el gen restaurador y explorar la región diana de Rfp1 en los genomas del cereal. Por primera vez, es posible una transferencia asistida por marcadores del gen diana en un nuevo material reproductor, en tanto que se incluya una selección eficaz frente al trasfondo genético no deseado del genoma del donante.
El segmento cromosómico de la planta presenta preferentemente uno o más de los siguientes locus marcadores del donante: ctg2 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 4 y 5), P20 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 6 y 7), 72F13_c2_mTERF (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 8 y 9) o ctg16b (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 10 y 11). El rasgo de restauración de la planta también se puede caracterizar por la ausencia de uno o más de los siguientes locus marcadores del donante en el segmento cromosómico: 7_01_H_1441 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 12 y 13), ctg24met2a5 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 14 y 15), o ctg32 (producto de amplificación de los cebadores con s Eq ID NO: 16 y 17).
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta puede presentar los locus marcadores del donante ctg32, ctg24met2a5, ctg2, ctg16b y c40745_1 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 18 y 19) y los locus marcadores del donante tc256739 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 21 y 22), 72F13_c2_mTERF, P20, 7_01_H_1441 y tc300731 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 23 y 24) están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctg32, ctg24met2a5, ctg2 y ctg16b y los locus marcadores del donante tc256739, c40745_1, 72F13_c2_mTERF, P20, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctg32, ctg24met2a5 y ctg2 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg16b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF, P20, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante 72F13_c2_mTERF, P20 y 7_01_H_1441 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, ctg2, ctg16b, c40745_1 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante 72F13_c2_mTERF y P20 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, ctg2, ctg16b, c40745_1, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante c40745_1, 72F13_c2_mTERF, P20 y 7_01_H_1441 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, ctg2, ctg16b y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante c40745_1, 72F13_c2_mTERF y P20 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, ctg2, ctg16b, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctgl6b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF, P20 y 7_01_H_1441 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, ctg2 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctgl6b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF y P20 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, ctg2, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctg2, ctg16b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF, P20 y 7_01_H_1441 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctg2, ctg16b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF y P20 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, ctg24met2a5, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctg24met2a5, ctg2, ctg16b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF, P20 y 7_01_H_1441 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico de la planta también puede presentar los locus marcadores del donante ctg24met2a5, ctg2, ctg16b, c40745_1, 72F13_c2_mTERF y P20 y los locus marcadores del donante tc256739, ctg32, 7_01_H_1441 y tc300731 están ausentes en el segmento cromosómico.
El segmento cromosómico es preferentemente no mayor de 190 kb, no mayor de 150 kb o no mayor de 100 kb, preferentemente no mayor de 75 kb o no mayor de 50 kb, preferentemente, en particular, no mayor de 40 kb, no mayor de 30 kb, no mayor de 25 kb o no mayor de 20 kb. Preferentemente, en particular, el segmento cromosómico comprende una sección de ADN de 18,425 kb, que presenta preferentemente una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 o una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 85 % o 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20.
La molécula de ácido nucleico también puede carecer de un gen pentatricopéptido (PPR) funcional que provenga del donante.
La planta divulgada en el presente documento es preferentemente una planta consanguínea, una planta doble haploide o una planta híbrida y/o preferentemente homocigótica o heterocigótica para el rasgo de restauración, para el segmento cromosómico o la al menos una molécula de ácido nucleico. La planta híbrida puede ser un híbrido 'por cruzamiento simple', un híbrido 'por cruzamiento doble', un híbrido por 'cruzamiento con probador', un híbrido por 'cruzamiento de tres vías', un híbrido por 'cruzamiento triple', un híbrido 'compuesto', un híbrido 'combinado', un híbrido completamente restaurado, un híbrido de 'segunda generación' u otro híbrido. Preferentemente, una planta divulgada en el presente documento actúa como proveedor de polen en un cruzamiento que genera híbridos y/o en la fertilización de granos o semillas en una planta híbrida.
La identificación de los genes restauradores, así como de los factores responsables del arrastre por ligamiento, representada en este trabajo, se llevó a cabo, en general, en gramíneas. Sin embargo, los resultados representados aquí se obtuvieron preferentemente en cereales, englobándose las plantas principalmente en los géneros centeno (Secale), cebada (Hordeum) o una clase de cereal derivado de centeno (primera pareja) y trigo (segunda pareja), el llamado triticale. El efecto negativo del arrastre por ligamiento estrechamente acoplado al locus restaurador Rfp1 desempeña un papel decisivo en el mejoramiento de híbridos de cereales, como, por ejemplo, el centeno, y se sabe que da lugar a una considerable reducción del rendimiento en el centeno. También son conocidas dificultades comparables en el mejoramiento de híbridos de cebada. Debido a las similitudes genéticas en la región cromosómica del locus restaurador entre el centeno y la cebada, así como triticale, la planta divulgada en el presente documento también es una planta del género Secale, Hordeum o Triticale, preferentemente una planta de la especie Secale cereale o Hordeum vulgare.
Además de las plantas con excelentes rasgos de restauración y sin arrastre por ligamiento o con arrastre por ligamiento disminuido, la solicitud también divulga semillas o descendencia de estas plantas, en las que estas comprenden el segmento cromosómico definido o la al menos una molécula de ácido nucleico definida para el rasgo de restauración. La descendencia muestra igualmente los rasgos de restauración mejorados sin arrastre por ligamiento o con arrastre por ligamiento disminuido. Además, también se ponen a disposición órganos, partes, tejidos o células de la planta, que son inherentes a los rasgos de restauración mejorados.
La invención se refiere a un oligonucleótido, preferentemente con una longitud de 50 nucleótidos como máximo, que presenta una de las siguientes secuencias de nucleótidos: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o un complemento de la misma, o (ii) SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o un complemento de la misma. Dichos oligonucleótidos usados como marcadores moleculares o marcadores moleculares basados en dichos oligonucleótidos están igualmente cubiertos por la presente invención. Dichos marcadores moleculares, que detectan la presencia o ausencia de un locus marcador del donante, se basan, por ejemplo, en un SNP (ejemplos: marcador KASPar o TaqMan).
Las mejoras descritas anteriormente del segmento cromosómico descrito, que proviene, por ejemplo, del donante IRAN IX, se debieron exclusivamente al extenso y sofisticado desarrollo y penetración del segmento cromosómico con marcadores moleculares que están estrechamente acoplados al locus de restauración para P-CMS (véanse los marcadores descritos anteriormente, así como la tabla 2) y las regiones flanqueantes que supuestamente portan los genes agronómicamente desfavorables (arrastre por ligamiento). Además, un requisito básico era que los marcadores fueran adecuados para el cribado de alto rendimiento. En el contexto de la presente invención, por primera vez se consiguió la generación, identificación y evaluación de recombinantes, aunque la frecuencia de recombinación sea extremadamente baja debido a la gran distancia genética entre las poblaciones selectas centroeuropeas como receptor del segmento cromosómico y las poblaciones de donante iraníes o argentinas. Estas dificultades también son conocidas para el experto en la técnica a partir de la bibliografía (Ruge B, Linz A, Pickering R, Proeseler G, Greif P, Wehling P (2003) Mapping of Rym14Hb, a gene introgressed from Hordeum bulbosum and confering resistance to BaMMV and BaYMV in barley. Theor Appl Genet 107:965-971).
Además del extraordinario progreso en el campo de genotipado de la región diana de Rfp1, la presente invención solo ha sido posible gracias al desarrollo de un nuevo sistema de fenotipado altamente diagnóstico. Las pruebas de fenotipado con "conjuntos casi isógenos (NIB)" aplicados (véanse los ejemplos 1 y 2) solo permitieron la determinación del efecto de arrastre por ligamiento de forma fiable con la exactitud requerida, ya que solo así se pudo separar fenotípicamente el efecto de arrastre por ligamiento de los efectos del trasfondo genético. Los efectos de arrastre por ligamiento se pueden calcular para todos los marcadores en el intervalo cromosómico como la diferencia (Ae-d) entre los promedios de cruzamiento de prueba de la pareja de NIB que porta el alelo selecto (E) y la pareja de NIB correspondiente que porta el alelo de donante (D) (véase también la fig. 2).
En un aspecto adicional, la presente invención comprende un procedimiento para producir una planta, en particular, del orden de las gramíneas (Poales), preferentemente de la familia de las gramíneas dulces (Poaceae), que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la P-CMS, en el que, en una planta híbrida derivada de un cruzamiento con un progenitor con CMS femenino, un arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración, preferentemente un efecto reductor del rendimiento, está reducido o completamente suprimido. Un procedimiento de este tipo comprende la siguiente etapa: eliminación de uno o más intervalos cromosómicos que contienen uno o más de los siguientes locus marcadores del donante: 7_01_H_1441, ctg24met2a5 o ctg32, del genoma de una planta, preferentemente del cromosoma 4R, conservándose el segmento cromosómico descrito en el presente documento que contiene el gen Rfpla y/o el gen Rfplb (véase también la figura 1) como se describe anteriormente. Por ejemplo, la eliminación de uno o más intervalos cromosómicos se puede lograr mediante recombinación genética durante un procedimiento de cruzamiento entre dos plantas, portando una planta el locus Rfp1 conocido de forma heterocigótica. Esta técnica de reproducción convencional para generar una recombinación genética da lugar al resultado de que al menos uno de los intervalos de donante identificados anteriormente con arrastre por ligamiento se reemplaza por secuencias genómicas del progenitor recurrente que preferentemente están libres de genes no deseados. Por tanto, la eliminación puede comprender las siguientes etapas: (I) cruzamiento de una primera planta, que comprende el locus de restauración de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160, con una segunda planta que no presenta este locus de restauración; (II) selección de la descendencia que presenta el segmento cromosómico de acuerdo con la invención como se describe anteriormente. Preferentemente, la selección se realiza en base a marcadores; los marcadores adecuados son accesibles para el experto en la técnica mediante la presente divulgación. Esta selección basada en marcadores de los genes restauradores puede contribuir sustancialmente a acelerar el procedimiento de reproducción, ya que la información deseada sobre la presencia del gen restaurador se puede registrar temprano y sin costosos cruzamientos de prueba.
En consecuencia, la presente invención también incluye un procedimiento para detectar de una planta de la especie Secale cereale, que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la P-CMS, en el que, en una planta híbrida derivada de un cruzamiento con un progenitor con CMS femenino, un arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración, preferentemente un efecto reductor del rendimiento, está reducido o completamente suprimido. Este procedimiento comprende la detección en la planta de alelos de al menos dos marcadores, provenientes de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160, estando localizados al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre tc256739 y ctg2 y al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre ctg16b y tc300731, o estando localizados al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre tc256739 y c40745_1 y al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre 7_01_H_1441 y tc300731. De forma alternativa, la presente solicitud divulga el procedimiento, que comprende la detección en la planta de la presencia o ausencia de al menos un alelo marcador que proviene de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160, sobre o en el locus Rfp1, y la selección de plantas en las que esté presente el al menos un alelo marcador. El locus Rfp1 preferentemente quiere decir una sección cromosómica entre los locus marcadores tc256739, ctg32 o ctg24met2a5 y tc300731 o 7_01_H_1441 en el cromosoma 4R de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160. El locus Rfp1 puede ser, por ejemplo, uno de las siguientes secciones: entre los locus marcadores ctg32 y tc300731, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y tc300731, entre los locus marcadores ctg2 y tc300731, entre los locus marcadores ctg16b y tc300731, entre los locus marcadores c40745_1 y tc300731, entre los locus marcadores P20 y tc300731, entre los locus marcadores tc256739 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg32 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg2 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores ctg16b y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores c40745_1 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores P20 y 7_01_H_1441, entre los locus marcadores tc256739 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores tc256739 y P20, entre los locus marcadores tc256739 y c40745_1, entre los locus marcadores tc256739 y ctg16b, entre los locus marcadores ctg32 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores ctg32 y P20, entre los locus marcadores ctg32 y c40745_1, entre los locus marcadores ctg32 y ctg16b, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y P20, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y c40745_1, entre los locus marcadores ctg24met2a5 y ctg16b, entre los locus marcadores ctg2 y 72F13_c2_mTERF, entre los locus marcadores ctg2 y P20, entre los locus marcadores ctg2 y c40745_1 o entre los locus marcadores ctg2 y ctg16b. Por ejemplo, para la detección, se pueden usar como marcadores uno o más de los siguientes oligonucleótidos, que presentan una de las siguientes secuencias de nucleótidos: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o un complemento de la misma, o (ii) SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o un complemento de la misma. En el contexto de la presente invención, se identificaron genotipos recombinantes por medio de los marcadores ya descritos anteriormente y se describió el segmento de introgresión restante respectivo; véase el ejemplo 3. El marcador P20, como se representa en el ejemplo 3, desempeñó el papel más importante en la identificación y descripción, ya que con su ayuda se pudieron identificar secuencias de marcador adicionales y diseñar numerosas combinaciones de marcadores, véanse la tabla 2 y el ejemplo 6.
De forma alternativa, la biotecnología moderna pone a disposición del experto en la técnica diversas herramientas adicionales que posibilitan una genomanipulación precisa: los enfoques de ingeniería genética con ayuda de los cuales se apoya o se puede lograr directamente la eliminación de secuencias de nucleótidos portadoras de arrastre por ligamiento del genoma vegetal comprenden el uso de nucleasas TALE (TALEN) o nucleasas con dedos de cinc (ZFN), así como sistemas CRISPR/Cas, que se describen, entre otros, a modo de ejemplo, en la solicitud de patente alemana DE 102013014637 para la eliminación de secuencias de nucleótidos portadoras de arrastre por ligamiento del genoma de maíz (híbrido) resistente a Helminthosporium turcicum; véanse el documento DE 10 2013014637en las páginas 13 y 14, párrafos de [0038] a [0042], y las referencias citadas allí. Estas técnicas, que también están descritas en la solicitud de patente internacional WO 2014/104878, se pueden usar de forma equivalente de acuerdo con la invención en la producción de las plantas divulgadas en la presente solicitud.
La presente solicitud divulga además una combinación de tecnología de reproducción convencional y biotecnología moderna. Por ejemplo, con ayuda de estos novedosos enfoques de modificación del genoma, se pueden generar "puntos calientes" de recombinación en una planta, que tienen lugar en posiciones adecuadas para facilitar directamente la eliminación de los arrastres por ligamiento. Para ello, la presente solicitud pone a disposición del experto en la técnica la información necesaria sobre la localización del arrastre por ligamiento, así como la posición del gen de restauración/de los genes de restauración.
Además, los novedosos enfoques de modificación del genoma también posibilitan que el segmento cromosómico divulgado en el presente documento se introduzca directamente con arrastre por ligamiento disminuido o completamente anulado. Por tanto, también está cubierto por la presente invención un procedimiento adicional para producir una planta divulgada en el presente documento, en particular, del orden de las gramíneas (Poales), preferentemente de la familia de las gramíneas dulces (Poaceae), que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa, en el que, en una planta híbrida derivada de un cruzamiento con un progenitor con CMS femenino, un arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración, preferentemente un efecto reductor del rendimiento, está reducido o completamente suprimido. Un procedimiento de este tipo comprende las siguientes etapas: (I) proporcionar una parte de una planta que preferentemente no porta el locus de restauración descrito anteriormente, como estructura diana que contiene la región diana de ácido nucleico, preferentemente un ADN genómico que corresponde al posicionamiento cromosómico de la región del locus Rfp1; (II) proporcionar una o más construcciones recombinantes que, en conjunto, comprenden o codifican los componentes de la herramienta de modificación del genoma; (III) proporcionar al menos un vector para introducir la(s) construcción/construcciones recombinante(s); (IV) proporcionar al menos una construcción recombinante adicional que comprenda la molécula de ácido nucleico definida anteriormente, el ADN recombinante, el casete de expresión o el segmento cromosómico para la reparación dirigida por homología dirigida de la región diana de ácido nucleico en la estructura diana vegetal o inserción en la región diana de ácido nucleico en la estructura diana vegetal; (V) introducir las construcciones recombinantes de (II) y (IV) en la estructura diana vegetal; (VI) cultivar la estructura diana vegetal en condiciones que activan los componentes de la herramienta de modificación del genoma y permitir, de este modo, un cambio dirigido de la región diana de ácido nucleico en la estructura diana vegetal para obtener una estructura diana vegetal, que comprende al menos una célula que comprende el cambio dirigido de la región diana de ácido nucleico; y (VII) regenerar una planta a partir de la al menos una célula.
La presente solicitud divulga además un procedimiento para producir una planta híbrida de acuerdo con la invención, preferentemente del orden de las gramíneas (Poales), preferentemente, en particular, de la familia de las gramíneas dulces (Poaceae) o del género Secale u Hordeum, y muy preferentemente, en particular, de la especie Secale cereale u Hordeum vulgare. Este procedimiento comprende en una primera etapa (1) uno de los procedimientos para producir una planta que sea adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa, como se define en los párrafos anteriores. En una etapa adicional (2) de este procedimiento, la planta generada en la etapa 1 o una descendencia de la misma, que además presenta el segmento cromosómico divulgado en el presente documento, o la molécula de ácido nucleico definida anteriormente, se cruza, como progenitor de polen masculino, con un progenitor con CMS femenino, preferentemente de la misma especie. Aquí, el progenitor de polen masculino y/o el progenitor con CMS femenino es preferentemente una planta doble haploide, una planta consanguínea, un cruzamiento simple con CMS o un el llamado progenitor de polen sintético. En una etapa (3), se realiza la cosecha de las semillas híbridas del progenitor con CMS femenino. Una etapa opcional (4) comprende sembrar las semillas híbridas para generar la planta híbrida y las etapas opcionales adicionales comprenden (5) cosechar las semillas de la planta híbrida y (6) sembrar las semillas de la planta híbrida. La presente solicitud describe además semillas y plantas o plantas híbridas obtenidas u obtenibles mediante el procedimiento anterior.
En un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que es adecuada para mediar en el rasgo de restauración con arrastre por ligamiento disminuido o completamente anulado, presentando la molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que está seleccionada del grupo que consiste en: (i) secuencia de nucleótidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 28, (ii) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29, (iii) secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (iv) secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de acuerdo con (iii) en condiciones rigurosas, (v) secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 % 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (vi) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la SEQ ID NO: 2 o un fragmento funcional de la misma. Mediante la identificación precisa y el cartografiado fino de los rasgos de restauración del locus restaurador Rfp1, es posible emplear la molécula de ácido nucleico definida anteriormente de otras formas para retener los rasgos mejorados de la planta. Por este motivo, la presente invención también comprende un casete de expresión, ADN recombinante o vectores, comprendiendo cada uno la molécula de ácido nucleico.
En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico comprende un ADN recombinante. Por lo general, están contenidos un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o de la traducción o asociados con ellos. Los promotores usados serán principalmente promotores que posibiliten la transcripción del ADN solo en células predeterminadas. Además de los promotores, hay una pluralidad de elementos de control de la transcripción adicionales, como, por ejemplo, los potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pero no limitados a estos, que están asociados funcionalmente con el ADN para posibilitar una transcripción específica de célula dirigida. Los promotores y otros elementos de regulación de la transcripción son, en general, conocidos y accesibles para el experto en la técnica en la técnica anterior; véase, por ejemplo, el documento WO 00/75359 en la página 23, línea 5, a la página 24, línea 17.
El vector puede ser un plásmido, un cósmido, un fago o un vector de expresión, un vector de transformación, un vector lanzadera o un vector de clonación, puede ser bicatenario o monocatenario, lineal o circular, o puede transformar un huésped procariota o eucariota por integración en su genoma o bien de forma extracromosómica. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención está enlazada de forma funcional en un vector con una o más secuencias reguladoras que permiten la transcripción y opcionalmente la expresión en una célula huésped procariota o eucariota; véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY, 2001 y la solicitud internacional WO 00/75359, página 21, línea 20, hasta la página 22, línea 32. Una secuencia reguladora, preferentemente ADN, puede ser homóloga o heteróloga al ácido nucleico de acuerdo con la invención. Por ejemplo, el ácido nucleico está bajo el control de un promotor o un terminador adecuado. Los promotores adecuados pueden ser promotores que se induzcan constitutivamente (por ejemplo, promotor 35S del "virus del mosaico de la coliflor" (Odell et al.
1985)), que sean específicos de tejido, específicos de estrés o específicos de desarrollo (por ejemplo, expresión específica de antera). Los promotores adecuados también pueden ser promotores sintéticos o quiméricos que no se encuentren en la naturaleza, estén compuestos por varios elementos y contengan un promotor mínimo, así como que presenten al menos un elemento regulador en cis en dirección 5' del promotor mínimo, que sirve como un sitio de unión para factores de transcripción especiales. Los promotores quiméricos se pueden diseñar de acuerdo con las especificidades deseadas y se inducen o reprimen por diferentes factores. Se encuentran ejemplos para dichos promotores en Gurr y Rushton (Gurr, SJ; Rushton, PJ. Engineering plants with increased disease resistance: what are we going to express? TRENDS in Biotechnology, 2005, 23. Jg., n.° 6, S. 275-282) o Venter (Synthetic promoters: genetic control through cis engineering. Trends in Plant Science, 2007, 12. Jg., n.° 3, S.
118-124). Un terminador adecuado, por ejemplo, es el terminador de nos (Depicker, A, Stachel, S, Dhaese, P, Zambryski, P y Goodman, H (1982) J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-575).
Además de los vectores descritos anteriormente, la presente invención también proporciona un procedimiento que comprende introducir un vector descrito en una célula huésped. El vector se puede introducir, por ejemplo, mediante conjugación, movilización, transformación biolística, transformación mediada por agrobacteria, transfección, transducción, infiltración al vacío o electroporación. Dichos procedimientos, así como los procedimientos para preparar los vectores descritos son familiares para el experto en la técnica (Sambrook et al.
2001, Molecular cloning: a laboratory manual (conjunto de 3 volúmenes) (vol. 999). Cold Spring Harbor, New York: Cold spring harbor laboratory press). Además, existen diferentes procedimientos en la técnica anterior con los que se pueden producir plantas transgénicas y se pueden introducir la característica de restauración. Estos incluyen procedimientos directos e indirectos. Los procedimientos incluyen bombardeo de partículas (Weeks et al. Plant Physiol. 102, (1993) 1077-1084; Vasil et al., Bio/Technology 10 (1992), 662-674), transformación por agrobacteria (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506), electroporación de tejido regenerable (Shillito et al. 1985 "High efficiency direct gene transfer to plants." Nature Biotechnology 3.12: 1099-1103), transferencia génica mediada por fibras de carburo de silicio (Dalton et al., Plant Sci. 132 (1998), 31-43) y transferencia génica mediada por protoplastos (Shimamoto et al., Nature, 338 (1989), 274-276), transferencia génica biolística o mediada por agrobacteria (documento WO 01/73084). La introducción de la característica de restauración también se puede realizar mediante introgresión (Harper et al., Annals of Botany 107: (2011), 1313-1320) o también por medio de un enfoque de ingeniería genética. Numerosos procedimientos de ingeniería genética novedosos para introducir ADN, aunque también para inactivar secuencias genómicas, son conocidos para el experto en la técnica (por ejemplo, procedimientos de modificación del genoma basados en nucleasas con dedos de cinc, en TALEN o en un sistema CRISPR/Cas).
De forma alternativa o adicionalmente, la presente invención también se refiere a células huésped que comprenden la molécula de ácido nucleico como transgén, el casete de expresión, el ADN recombinante como transgén o el vector como se representa anteriormente. Una célula huésped dentro en el sentido de la invención puede ser una célula procariota (por ejemplo, bacteriana) o eucariota (por ejemplo, una célula vegetal o una célula de levadura). La célula huésped es preferentemente una agrobacteria, como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes o una célula vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, el ADN recombinante o el vector de la presente invención. Numerosos procedimientos, como la conjugación o electroporación, son conocidos para experto en la técnica, con los que puede introducir la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, el ADN recombinante o el vector de la presente invención en una agrobacteria, así como procedimientos como diversos procedimientos de transformación (transformación biolística, transformación mediada por agrobacteria), con los que puede introducir la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, el ADN recombinante o el vector de la presente invención en una célula vegetal (Sambrook et al.
2001).
Mediante la identificación de los genes que median en la restauración, su empleo también es posible en plantas transgénicas, en las que se puede reducir a un mínimo el arrastre por ligamiento. Por tanto, la invención también incluye la provisión de una planta transgénica o semillas de la misma que comprenden una célula vegetal como se define anteriormente. Una célula vegetal o planta transgénica de este tipo, por ejemplo, es una célula vegetal o planta que está transformada, preferentemente de forma estable, con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, con el casete de expresión, con el ADN recombinante o con el vector de la presente invención. La planta transgénica presenta un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural que es isógena, sin embargo, no esté transformada, preferentemente de forma estable, con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, con el casete de expresión, con el ADN recombinante o con el vector de la presente invención. Preferentemente, estas plantas transgénicas adicionalmente muestran una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o presentan una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural que sea isógena, sin embargo, no esté transformada, preferentemente de forma estable, con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, con el casete de expresión, con el ADN recombinante o con el vector de la presente invención.
Además de la molécula de ácido nucleico que codifica el rasgo de restauración con arrastre por ligamiento disminuido o completamente anulado, la presente invención comprende además una proteína mTERF u homólogo, análogo, ortólogo o un fragmento funcional de la misma que se puede codificar por la molécula de ácido nucleico, así como un anticuerpo que se une específicamente a la proteína mTERF u homólogo, análogo, ortólogo o un fragmento funcional de la misma. La proteína mTERF comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 % 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29. Además, la presente solicitud describe además un anticuerpo que se une específicamente a la proteína mTERF. La producción recombinante de proteínas y fragmentos funcionales de las mismas es familiar para el experto en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY, 2001 Wingfield, P. T. 2008. Production of Recombinant Proteins. Current Protocols in Protein Science. 52:5.0:5.0.1—5.0.4). Se pueden producir anticuerpos policlonales o monoclonales para la proteína de la presente invención por el experto en la técnica de acuerdo con procedimientos conocidos, como se describen en E. Harlow et al. (Herausgeber Antibodies: A Laboratory Manual (1988)). La producción de anticuerpos monoclonales, así como de fragmentos Fab y F(ab')2 , que también son útiles en los procedimientos de detección de proteínas, se puede llevar a cabo mediante diferentes procedimientos habituales, como se describe en Goding (Mononoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs.
98-118, New York: Academic Press (1983)).
El uso de anticuerpos para la producción y selección de plantas híbridas o plantas transgénicas con rendimiento incrementado se describe a modo de ejemplo en la solicitud de patente internacional WO 2011/061656 en los párrafos [00678] y [00847] y las referencias citadas allí. Estas técnicas se pueden usar de forma equivalente en la producción de las plantas divulgadas en el presente documento.
Además, se divulga un procedimiento adicional para producir una planta, en particular, del orden de las gramíneas (Poales), que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa. Un procedimiento de este tipo comprende las siguientes etapas: A) mutagenizar células vegetales o partes de una planta y, a continuación, regenerar plantas a partir de células vegetales mutagenizadas o partes mutagenizadas o mutagenizar plantas, y B) identificar una planta de A) que, en una secuencia de ADN endógeno, sea idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la: (i) secuencia de nucleótidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 28 o un fragmento funcional de la misma, (ii) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29 o un fragmento funcional de la misma, (iii) secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (iv) secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de acuerdo con (iii) en condiciones rigurosas, (v) secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (vi) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %, preferentemente de al menos un 91 %, 92 %, 93 % 94 % o 95 %, o preferentemente, en particular, de al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con respecto a la SEQ ID NO: 2 o un fragmento funcional de la misma, (vii) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, que, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29, presenta desviaciones en forma de deleciones, sustituciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, preferentemente no más de un 30 %, 25 % o 20 %, preferentemente no más de un 18 %, 16 %, 14 %, 12 % o 10 % o preferentemente, en particular, no más de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 % en toda la secuencia de aminoácidos, o presente al menos una mutación en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógeno que provoque que la planta identificada presente un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena y/o presenta una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena.
Preferentemente, la secuencia de ADN endógeno de la etapa B) codifica una proteína mTERF, preferentemente, en particular, para la proteína mTERF de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 29 o un homólogo, análogo u ortólogo de la misma. La secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógeno de la etapa B) es preferentemente un promotor o una parte del mismo. Un ejemplo para una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógeno es el promotor de acuerdo con la SEQ ID NO: 3.
Una mutación quiere decir una modificación a nivel de ADN, es decir, un cambio en la genética y/o epigenética. Por ejemplo, un cambio de la genética puede ser el intercambio de al menos una nucleobase en la secuencia de ADN endógeno o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógeno. Si un intercambio de nucleobases de este tipo tiene lugar, por ejemplo, en un promotor, esto puede dar lugar a una actividad alterada del promotor, ya que, por ejemplo, los elementos reguladores en cis se modifican de tal modo que la afinidad de un factor de transcripción por los elementos reguladores en cis mutados se altera en comparación con el promotor natural, de modo que la actividad del promotor con los elementos reguladores en cis mutados se incrementa o disminuye, dependiendo de si el factor de transcripción es un represor o inductor o de si la afinidad del factor de transcripción por el elemento regulador en cis mutado se incrementa o disminuye. Si un intercambio de nucleobases de este tipo tiene lugar, por ejemplo, en una región codificante de la secuencia de ADN endógeno, esto puede dar lugar a un intercambio de aminoácidos en la proteína codificada, lo que puede provocar un cambio de la actividad o estabilidad de la proteína en comparación con la proteína natural. Los posibles intercambios de aminoácidos se pueden derivar de comparaciones de las secuencias de aminoácidos. La figura 9 muestra una comparación de la secuencia natural de rfp1a (SEQ ID NO: 33) con la secuencia de aminoácidos que media en el rasgo de restauración de IRAN9 (SEQ ID NO: 29). A modo de ejemplo, se pueden derivar aquí los siguientes intercambios de aminoácidos potenciales: en la posición 10 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una alanina (A) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una treonina (t ), en la posición 18 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una prolina (P) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una treonina (T), en la posición 43 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una glutamina (G) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) un ácido aspártico (D), en la posición 45 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta un ácido glutámico (E) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) un ácido aspártico (D), en la posición 62 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una treonina (T) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una alanina (A), en la posición 63 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una alanina (A) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una treonina (T), en la posición 108 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta un ácido glutámico (E) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) un ácido aspártico (D), en la posición 126 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una serina (S) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una alanina (A), en la posición 193 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta un ácido aspártico (D) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una glicina (G), en la posición 213 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una glicina (G) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) un ácido glutámico (E), en la posición 243 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una serina (S) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una cisteína (C), en la posición 272 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una cisteína (C) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una arginina (R), en la posición 276 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una alanina (A) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una treonina (T), en la posición 303 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una isoleucina (I) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una valina (V), en la posición 363 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una alanina (A) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una valina (V), o en la posición 365 de la SEQ ID NO: 29, en la que la proteína mTERF que media en el rasgo de restauración presenta una histidina (H) y una correspondiente (proteína no restauradora) natural (SEQ ID NO: 33) una arginina (R). De forma análoga, se pueden derivar los intercambios de aminoácidos potenciales de la figura 10, que muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos natural de rfp1b (SEQ ID NO: 31) con la secuencia de aminoácidos que media en el rasgo de restauración de IRAN9 (SEQ ID NO: 2). Se pueden derivar, de forma análoga, otras mutaciones potenciales, como una modificación a nivel de ADN (por ejemplo, en forma de intercambios de nucleótidos o inserciones/deleciones), de las comparaciones de las secuencias de nucleótidos codificantes de rfp1a y rfp1b en las figuras 7 y 8.
Un ejemplo adicional de un cambio en la genética es la deleción de nucleótidos en la secuencia reguladora y/o en la secuencia de ADN endógeno, así como la adición de nucleótidos en la secuencia reguladora y/o en la secuencia de ADN endógeno. Das y Martienssen muestran un ejemplo de la regulación de genes mediante inserción de nucleótidos mediante mutagénesis de transposones en el maíz (Das, Lekha y Robert Martienssen. "Site-selected transposon mutagenesis at the hcf106 locus in maize." The Plant Cell 7.3 (1995): 287-294.). Se puede realizar un cambio en la epigenética, por ejemplo, mediante un patrón de metilación modificado del ADN.
El experto en la técnica sabe cómo se puede lograr una mutación en el sentido de la invención mediante el procedimiento de mutagenización en la etapa A) del procedimiento para producir una célula vegetal/planta. Aquí, la mutagenización incluye tanto la mutagénesis convencional como la mutagénesis específica de sitio o la 'modificación del genoma'. En la mutagénesis convencional, la modificación a nivel de ADN no se produce de forma dirigida. La célula vegetal o la planta está expuesta a condiciones mutagénicas, como, por ejemplo, TILLING mediante irradiación con luz UV o el uso de sustancias químicas (Till, Bradley J., et al. "Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING." BMC Plant Biology 4.1 (2004): 12.). Un procedimiento adicional de mutagénesis aleatoria es la mutagénesis con ayuda de un transposón.
La mutagénesis específica de sitio posibilita introducir modificaciones a nivel de ADN de forma dirigida en posiciones predefinidas del ADN. Para ello, se pueden usar, por ejemplo, TALEN (documentos WO 2010/079430, WO 2011/072246), meganucleasas (Silva, George, et al. "Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: perspectives and challenges for gene therapy." Current gene therapy 11.1 (2011): 11.), endonucleasas de asentamiento (Stoddard, Barry L. "Homing endonucleases: from microbial genetic invaders to reagents for targeted DNA modification." Structure 19.1 (2011): 7-15.), nucleasas con dedos de cinc (Lloyd, Alan, et al. "Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102.6 (2005): 2232-2237.) o un sistema CRISPR/Cas (Gaj, Thomas, Charles A. Gersbach, y Carlos F. Barbas. "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering." Trends in biotechnology 31.7 (2013): 397-405.). Por ejemplo, la mutación se realiza sobre todas las copias o alelos o, en su caso, sobre todos los homólogos de las correspondientes secuencias de ADN endógeno. En relación con un organismo diploide como, por ejemplo, Secale cereale o Hordeum vulgare, típicamente esto puede significar al menos dos cambios.
Una planta se puede identificar en la etapa B), por ejemplo, con ayuda de sondas o marcadores moleculares. Las sondas de ADN son, por ejemplo, cebadores o pares de cebadores que se pueden usar en una reacción PCR. Por ejemplo, los mutantes de Tilling se pueden detectar o identificar mediante secuenciación del gen diana en una población de Tilling o procedimientos adicionales que detectan emparejamientos erróneos en el ADN, tales como análisis del punto de fusión o el uso de nucleasas específicas de emparejamientos erróneos. La presente invención igualmente incluye pares de cebador/cebador que se pueden usar para ello, tales como, por ejemplo, cebadores para la detección de mTERF o una forma mutada del mismo. Además, los mutantes generados por medio de transposones se pueden detectar mediante el uso de cebadores específicos de transposón y cebadores específicos de gen diana en la PCR en toda la población y la posterior secuenciación de los productos de PCR. Dichos cebadores también están divulgados en la presente solicitud. El cambio inducido por mutación de la tasa de expresión o nivel de expresión se puede determinar, por ejemplo, con RT-PCR en tejidos vegetales, un cambio inducido por mutación de la estabilidad, por ejemplo, mediante análisis de los sitios de unión a ubiquitina y predicción de cambios de la estructura terciaria. Además, también son adecuadas la expresión recombinante de las proteínas naturales y las correspondientes proteínas mutadas y las pruebas de actividad bioquímicas. Para el experto en la técnica son conocidos medios y procedimientos adicionales a partir de la técnica anterior que puede usar para identificar una planta o célula vegetal en la etapa B).
La presente solicitud también describe marcadores moleculares que detectan la presencia o ausencia de una mutación en la secuencia de ADN endógeno o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógeno. Dichos marcadores se basan, por ejemplo, en un SNP y son específicos para la mutación (ejemplos: marcador KASP o TaqMan). Los SNP adecuados para el desarrollo de marcadores se pueden obtener en la comparación de secuencias de las figuras 7 y 8 para Secale cereale, por ejemplo.
Además, la presente solicitud también divulga una planta que se puede producir o está producida con el procedimiento anterior, o una parte de esta planta. Del mismo modo, la presente invención también incluye una descendencia de la planta que presenta al menos una mutación y, de este modo, un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena y/o presenta una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena.
Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para producir una planta transgénica que presenta un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena y/o presenta una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena. El procedimiento puede incluir las siguientes etapas: A) proporcionar la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente, el casete de expresión o el ADN recombinante, o proporcionar el vector descrito anteriormente, B) transformar, preferentemente transformar de forma estable, al menos una célula vegetal mediante la introducción de la molécula de ácido nucleico, del casete de expresión, del ADN recombinante o del vector de A), C) regenerar plantas transgénicas a partir de la al menos una célula vegetal transformada de B), y opcionalmente D) identificar una planta que presenta un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena y/o presenta una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena, a partir de C). El procedimiento para producir la planta transgénica también incluye proporcionar dos o más de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, opcionalmente también diferentes configuraciones de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y opcionalmente en uno o más casetes de expresión o vectores, y transformar células vegetales mediante introducción de las dos o más moléculas de ácido nucleico.
La presente invención se refiere además a una planta transgénica que se puede producir o está producida con el procedimiento mencionado, o una parte de esta planta. Del mismo modo, la presente invención también incluye una descendencia de la planta transgénica que presenta un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena y/o presenta una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena.
Además, la presente solicitud divulga un procedimiento para mediar en o elevar el rasgo de restauración para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en una célula vegetal o una planta y/o para mediar en o elevar la resistencia a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.). Dicho procedimiento puede incluir las siguientes etapas: A) transformación, preferentemente transformación estable, de al menos una célula vegetal mediante la introducción de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente de acuerdo con la invención, el ADN recombinante o el casete de expresión de la presente invención, o el vector de la presente invención descrito anteriormente, opcionalmente B) regeneración de plantas transgénicas de la al menos una célula vegetal transformada de A). El procedimiento para producir la planta/célula vegetal transgénica también incluye transformar dos o más de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente de acuerdo con la invención, opcionalmente también diferentes configuraciones de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y opcionalmente de uno o más casetes de expresión o vectores de la presente invención.
Además, la presente invención se refiere al uso de la planta descrita anteriormente, la descendencia descrita anteriormente o la planta transgénica mencionada para producir una planta híbrida de acuerdo con la invención o una planta transgénica de acuerdo con la invención, preferentemente del género Secale o Triticale, preferentemente una planta de la especie Secale cereale, cuya fertilidad del polen está restaurada para CMS de tipo Pampa y/o que presenta una resistencia incrementada a un patógeno fúngico, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.).
Además, los objetos descritos anteriormente como oligonucleótidos, ácidos nucleicos, casetes de expresión, ADN recombinante, vectores y anticuerpos también pueden ser útiles en la producción de la planta o la planta transgénica. Por tanto, la presente invención también comprende el uso del oligonucleótido, la molécula de ácido nucleico, el ADN recombinante, el vector o el anticuerpo descritos anteriormente en la producción de una planta híbrida descrita en el presente documento o una planta transgénica de acuerdo con la invención. En un modo de realización preferente, la planta híbrida está seleccionada del género Secale o Triticale, preferentemente una planta de la especie Secale cereale, cuya fertilidad del polen está restaurada para CMS de tipo Pampa y/o que presenta una resistencia incrementada a un patógeno fúngico, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.). En particular, los oligonucleótidos y ácidos nucleicos, así como ADN recombinante, vectores y anticuerpos también pueden ser útiles en la producción de una planta transgénica.
Además, la presente solicitud divulga el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína mTERF, o la proteína mTERF codificada en una planta, en particular, del orden de las gramíneas (Poales), preferentemente de la familia de las gramíneas dulces (Poaceae), para la restauración de una androesterilidad citoplasmática (CMS), en particular, la CMS de tipo Pampa. La restauración se realiza preferentemente mediante cruzamiento de la planta que contiene la molécula de ácido nucleico como progenitor paterno con una segunda planta, preferentemente de la misma especie, que contiene el citoplasma para CMS. La molécula de ácido nucleico es preferentemente la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente de acuerdo con la invención que puede mediar en el rasgo de restauración, o la proteína mTERF es la proteína mTERF descrita anteriormente de acuerdo con la invención.
Otros modos de realización y ventajas de la presente invención surgen de la siguiente descripción detallada, las figuras y los ejemplos.
En primer lugar, algunos de los términos usados en la presente solicitud se explican con más detalle a continuación: con el término "alelo" se entiende una de dos o más secuencias de nucleótidos diferentes que se encuentran en un locus génico determinado en un cromosoma. Un primer alelo se encuentra en un cromosoma, un segundo en un segundo cromosoma en la misma posición. Si los dos alelos difieren, son heterocigóticos; si son los mismos alelos, son homocigóticos. Los diferentes alelos de un gen (alelos génicos) difieren en al menos un SNP (polimorfismo mononucleotídico). Dependiendo del contexto de la descripción, un alelo también quiere decir solo un SNP individual, lo que, por ejemplo, permite una diferenciación entre el donante de RFP1 y el progenitor recurrente. También se pueden detectar diferentes alelos génicos mediante el uso de marcadores. Dichos alelos génicos en un determinado locus también se denominan alelos marcadores. Dependiendo del contexto de la descripción, un locus marcador también se ha de entender como un alelo marcador en un locus determinado.
Las expresiones "fragmento de cromosoma", "segmento de cromosoma" y variaciones de los términos como "segmento cromosómico" o "fragmento cromosómico", a menos que se indique lo contrario, se usan de forma equivalente y designan una sección de ADN cromosómico específica de un cromosoma determinado que comprende al menos un gen. Un fragmento de cromosoma integrado proviene de una fuente de donante. En el sentido de la invención, la sucesión secuencial de los genes dentro de un fragmento de cromosoma integrado puede corresponder a esa sucesión, como está presente en el fragmento de cromosoma original de la fuente de donante. Un fragmento de cromosoma o una parte del mismo puede representar un "haplotipo" específico, presentando entonces el fragmento de cromosoma determinados SNP mediante los que el haplotipo también está claramente especificado y se puede identificar.
Los términos "distal" y "proximal" designan la posición de un intervalo cromosómico o una sección genética en relación con una ubicación de referencia determinada (por ejemplo, un polinucleótido determinado, otro intervalo cromosómico o un gen) en un cromosoma completo, significando distal que el intervalo o la sección se localiza en el lado de la ubicación de referencia que mira en dirección opuesta al centrómero del cromosoma, y significando proximal que el intervalo o la sección se localiza en el lado de la ubicación de referencia que mira hacia el centrómero del cromosoma.
Con los términos "acoplado", "estrechamente acoplado" o "estrechamente flanqueante" se entiende que dos locus (por ejemplo, dos secciones genéticas o dos marcadores (locus marcadores o alelos marcadores)) en una cartografía genética están separados en menos de 2 cM, menos de 1 cM, menos de 0,5 cM, menos de 0,2 cM, menos de 0,1 cM, menos de 0,05 cM o menos de 0,01 cM.
El término "rendimiento" en el sentido de la presente invención se refiere a la productividad por unidad de superficie de un producto vegetal determinado con valor comercial. Por ejemplo, el rendimiento de centeno habitualmente se mide en toneladas métricas de semillas o grano por hectárea (ha) y temporada o en toneladas métricas de biomasa seca por hectárea (ha) y temporada. A menos que se indique o especifique expresamente lo contrario, el rendimiento se puede relacionar con la materia fresca o seca absoluta, la materia fresca o seca relativa, el rendimiento de ensilado (también llamado rendimiento total de materia seca) o el rendimiento en grano. El rendimiento se ve afectado por factores genéticos y ambientales y se compone principalmente de numerosos rasgos agronómicos que representan características de una planta basadas en elementos genéticos y que contribuyen al rendimiento final a lo largo de la temporada. Estos rasgos agronómicos individuales incluyen, por ejemplo, vitalidad vegetativa, tolerancia al estrés, resistencia o tolerancia a enfermedades, resistencia a herbicidas, tendencia al amacollamiento, tiempo de floración, fructificación, número de granos/espiga, masa de mil granos, estabilidad y tendencia al almacenamiento, capacidad de trilla, etc.
Un "fragmento funcional" de una molécula de ácido nucleico quiere decir una sección de una molécula de ácido nucleico que presenta una funcionalidad idéntica o una comparable a la molécula de ácido nucleico completa de la que proviene el fragmento funcional. Como tal, el fragmento funcional puede poseer una secuencia de nucleótidos que sea idéntica u homóloga en una longitud de al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a la molécula de ácido nucleico completa. Un "fragmento funcional" de una proteína quiere decir una sección de la secuencia de aminoácidos de una proteína que presenta una funcionalidad idéntica o comparable a la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de la que proviene el fragmento funcional. Como tal, el fragmento funcional puede poseer una secuencia de aminoácidos que sea idéntica u homóloga en una longitud de al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a la secuencia de aminoácidos completa de la proteína
En el sentido de la invención, con "homólogo" se entiende una proteína del mismo origen filogenético, con "análogo" se entiende una proteína que realiza la misma función, pero tiene otro origen filogenético, y con "ortólogo" se entiende una proteína de otra especie que realiza la misma función.
Con "hibridar" o "hibridación" se entiende un procedimiento en el que una molécula de ácido nucleico monocatenaria se fija a una hebra de ácido nucleico en gran medida complementaria, es decir, se somete a emparejamiento de bases con ella. Los procedimientos estándar para la hibridación están descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY, 2001. Preferentemente, con ello se entiende que al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 %, preferentemente, en particular, un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de la molécula de ácido nucleico se someten a un emparejamiento de bases con la hebra de ácido nucleico en gran medida complementaria. La posibilidad de una unión de este tipo depende de la restricción de las condiciones de hibridación. El término "restricción" se refiere a las condiciones de hibridación. Se da una restricción alta cuando el emparejamiento de bases es difícil, una restricción baja si se facilita el emparejamiento de bases. La restricción de las condiciones de hibridación depende, por ejemplo, de la concentración de sal o fuerza iónica y de la temperatura. En general, la restricción se puede incrementar mediante un incremento de la temperatura y/o disminución del contenido de sal. Con "condiciones de hibridación rigurosas" se ha de entender dichas condiciones en las que la hibridación tiene lugar predominantemente solo entre moléculas de ácido nucleico homólogas. El término "condiciones de hibridación" se refiere no solo a las condiciones que prevalecen durante la unión real de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones que prevalecen en las etapas de lavado posteriores. Las condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo, son condiciones en las que predominantemente solo se hibridan dichas moléculas de ácido nucleico que presentan al menos un 70 %, preferentemente al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia. Las condiciones de hibridación estrictas son, por ejemplo: hibridar en 4 * SSC a 65 °C y, a continuación, lavar varias veces en 0,1 * SSC a 65 °C durante un total de aproximadamente 1 hora. El término "condiciones de hibridación rigurosas" usado aquí también puede significar: hibridar a 68 °C en fosfato de sodio 0,25 M, pH 7,2, SDS al 7 %, EDTA 1 mM y BSA al 1 % durante 16 horas y, a continuación, lavar dos veces con 2 * SSC y SDS al 0,1 % a 68 °C. La hibridación tiene lugar preferentemente en condiciones rigurosas.
El término "intervalo" o "intervalo cromosómico" quiere decir una sección lineal continua en un ADN genómico, que está presente en un cromosoma individual en la planta o en un fragmento de cromosoma y que habitualmente está definida mediante la indicación de dos marcadores que representan los puntos de extremo del intervalo con respecto al lado distal y proximal. Los marcadores que definen de forma terminar el intervalo también pueden ser por sí mismos parte del intervalo. Además, también se pueden superponer dos intervalos diferentes. En la descripción, se especifica un intervalo mediante la indicación "entre el marcador A y el marcador B". Un marcador terminal de un intervalo también se puede localizar en una región de marcador definida en un lado del intervalo. A continuación, se define una región de marcador mediante la indicación de dos marcadores flanqueantes y representa una sección cromosómica en la que se pueden encontrar marcadores adicionales además de los marcadores flanqueantes. Los marcadores flanqueantes determinan los puntos de extremo de una región de marcador y siguen siendo por sí mismos parte de la región de marcador. Si ambos marcadores terminales de un intervalo son marcadores en diferentes regiones de marcador en ambos lados de un intervalo, en la descripción se especifica un intervalo mediante la indicación "entre un marcador en una región de marcador X, que está flanqueada por los marcadores C y D, y un marcador en una región de marcador Y, que está flanqueada por los marcadores E y F".
En relación con la presente invención, el término "introgresión" significa la transferencia de al menos un alelo génico deseado en un locus genético de un trasfondo genético a otro. Por ejemplo, una introgresión de un alelo génico deseado en un locus específico puede transmitirse a una descendencia mediante cruzamiento sexual entre dos progenitores de la misma especie. De forma alternativa, por ejemplo, la transferencia de un alelo génico también se puede producir mediante recombinación entre dos genomas de donante en un protoplasto fusionado, portando al menos un protoplasto de donante el alelo génico deseado en su genoma. En cualquier caso, la descendencia que luego comprende el alelo génico deseado, a continuación, se puede retrocruzar repetidamente con una línea que presente un excelente trasfondo genético y seleccionarse con respecto al alelo génico deseado. El resultado es la fijación del alelo génico deseado en un trasfondo genético seleccionado.
El "arrastre por ligamiento" designa, en general, la expresión fenotípica de genes de donante no deseados que residen en la misma región genómica que el QTL (locus de rasgo cuantitativo) diana y, por lo tanto, están estrechamente acoplados a él. Esto incluye, por ejemplo, la observación de que mediante la introgresión del fragmento de cromosoma que porta el/los gen(es) restaurador(es), los genes de donante de acción negativa se transfieren a la línea de introgresión, de modo que esta produce un menor rendimiento que la línea del receptor original para determinadas características agronómicas.
Para el caso de la restauración de la androfertilidad, los segmentos de introgresión que portan Rfp1 normalmente manifiestan arrastre por ligamiento en forma de efectos adversos sobre el rendimiento, es decir, rendimiento de grano y otros rasgos como altura deseada, tamaño de grano (grano/espiga) y masa de mil granos; véase, por ejemplo, Hackauf et al., J. Kulturpfl. 61 (2009), 15—20; Hackauf et al., Molecular Breeding 30 (2012), 1507-1518.
La característica de que el arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración está reducido o (completamente) suprimido en una planta híbrida divulgada en el presente documento se refiere al arrastre por ligamiento que de otro modo se produce en una planta híbrida (planta de control). La planta de control presenta en su genoma un segmento cromosómico en el cromosoma 4R con al menos un intervalo desde el locus marcador tc256739 al locus marcador tc176835 de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160. Lo mismo se aplica para el intervalo Xp15/55—Xscxx04 del segmento de IRAN IX; véase Hackauf et al., Molecular Breeding 30 (2012), 1507-1518. A menos que se indique lo contrario, con la característica de que el arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración está reducido o completamente anulado, adicionalmente o de forma alternativa también se entiende la mejora de un rasgo de la planta híbrida de acuerdo con la invención con respecto a una planta de control. Por ejemplo, una liberación de polen incrementada, que dar lugar a una minimización de la infestación por cornezuelo.
Un "locus" es una posición en un cromosoma donde se encuentran uno o más genes o uno o más alelos génicos que provocan o influyen en una característica agronómica. En particular, aquí locus quiere decir aquí el locus Rfp1, que restaura la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa.
El término "marcador" designa a una secuencia de nucleótidos que se usa como punto de referencia o de orientación. Un marcador para reconocer un acontecimiento de recombinación debería ser adecuado para supervisar diferencias o polimorfismos dentro de una población vegetal. Para los marcadores, estas diferencias se encuentran a nivel de ADN y son, por ejemplo, diferencias en la secuencia de polinucleótidos como, por ejemplo, SSR (repeticiones de secuencias simples), RFLP (fragmentos de restricción de longitud polimórfica), FLP (fragmentos de longitud polimórfica) o s Np (polimorfismos mononucleotídicos). Los marcadores se pueden derivar de ácidos nucleicos genómicos o expresados, como, por ejemplo, ARN empalmado, ADNc o EST, y también se pueden referir a ácidos nucleicos que se usan como sondas o pares de cebadores y, como tales, son adecuados para amplificar un fragmento de secuencia usando procedimientos basados en PCR. Los marcadores que reconocen polimorfismos genéticos entre miembros de una población se pueden detectar por medio de procedimientos establecidos de la técnica anterior (An Introduction to Genetic Analysis. 7.a edición, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Estos engloban, por ejemplo: secuenciación de ADN, amplificación específica de secuencia basada en PCR, detección de RFLP, detección de polimorfismos polinucleotídicos por medio de hibridación específica de alelo (ASH), detección de SSR, SNP o RFLP. También son conocidos procedimientos para la detección de EST (etiquetas de secuencia expresadas) y RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente). Dependiendo del contexto, el término marcador en la descripción también puede significar una posición cromosómica específica en el genoma de una especie donde se puede encontrar un marcador específico (por ejemplo, SNP). Una posición de marcador de este tipo se puede emplear para supervisar la presencia o ausencia de un locus acoplado, por ejemplo, un locus acoplado que contribuye a la expresión de una determinada característica fenotípica (por ejemplo, Rfp1 o arrastre por ligamiento). Por ejemplo, el locus marcador también se puede emplear para observar la segregación de alelos en un locus (QTL o gen individual) que están estrechamente acoplados genética o físicamente con la posición del marcador.
"Enlazado de forma funcional" quiere decir asociado en una molécula de ácido nucleico común, de forma que los elementos asociados estén posicionados y/u orientados entre sí de modo que tenga lugar una transcripción de la molécula de ácido nucleico. Un ADN que está enlazado de forma funcional con un promotor está bajo el control transcripcional de ese promotor.
Los "órganos" vegetales quieren decir, por ejemplo, hojas, tallo, eje de brotes, raíces, yemas vegetativas, meristemos, embriones, anteras, óvulos, semillas o frutos, en particular, semillas. El término "parte de planta" o "partes de planta" incluye, pero no se limita a, el eje de brotes o tallo, hojas, flores, inflorescencias, raíces, frutos y semillas, así como el polen. Las "partes" vegetales quieren decir además una fusión de varios órganos, por ejemplo, una flor o una semilla, o una parte de un órgano, por ejemplo, una sección transversal del eje de brotes. Los "tejidos" vegetales son, por ejemplo, tejido de callos, tejido de almacenamiento, tejido meristemático, tejido de hojas, tejido de brotes, tejido de raíces, tejido de tumor vegetal o tejido reproductivo, así como el tejido de formación, tejido intersticial (el llamado parénquima), tejido vascular, tejido de sostén y tejido epitelial (la denominada epidermis). Sin embargo, el tejido no se limita por esta lista. Con "células" vegetales se ha de entender, por ejemplo, células aisladas con una pared celular o agregados de las mismas o protoplastos.
Una "planta" en el sentido de la presente solicitud puede, a menos que se indique lo contrario, provenir de cualquier especie dicotiledónea, monocotiledónea y gimnosperma. Las plantas son preferentemente monocotiledóneas y de interés para la agricultura y horticultura o para la generación de bioenergía (bioetanol, biogás, etc.). Entre ellas se encuentran, a modo de ejemplo, Gossypium sp., Zea mays, Brachypodium distachyon, Triticum sp., Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum sp., Musa sp., Saccharum officinarum, Secale cereale, Avena sp., césped y hierba forrajera. Una planta divulgada en el presente documento es preferentemente una planta del género Secale, en particular, de la especie de centeno (Secale cereale).
La expresión "resistencia" o "resistente" a un patógeno se ha de entender como la capacidad de resistencia o resistencia de una planta o célula vegetal a los efectos nocivos del patógeno y se extiende desde un retraso en el desarrollo de la enfermedad hasta una supresión completa del desarrollo de la enfermedad. Por ejemplo, la defensa de los híbridos portadores de Rfp1 con respecto al cornezuelo es una resistencia basada en un mecanismo de "escape": a las esporas del hongo se les impide mecánicamente el acceso al gineceo por las glumas que se cierran rápidamente tras la fecundación por el polen. Una resistencia mediada puede ser una resistencia recién adquirida o un incremento de una resistencia parcial ya existente. En relación con la presente invención, una planta/célula vegetal es resistente o posee una resistencia al patógeno cornezuelo, es decir, una planta híbrida que presenta una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr .).
Con "plantas de cereal" se entienden, en particular, plantas monocotiledóneas que pertenecen al orden de las gramíneas (Poales), preferentemente a la familia de las gramíneas dulces (Poaceae). Los ejemplos de estas son las plantas pertenecientes a los géneros Avena (avena), Triticum (trigo), Secale (centeno), Oryza (arroz), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (mijo), Zea (maíz), etc., preferentemente es Hordeum (cebada). Preferentemente, en particular, Secale (centeno), es decir, una planta de Secale cereale, S. africanum, S. ancestrale, S. dalmaticum, S. kuprijanovii, S. montanum, S. silvestre, S.vavilovii.
Una "planta transgénica" se refiere a una planta en cuyo genoma está integrado al menos un polinucleótido, preferentemente un polinucleótido heterólogo. Preferentemente, el polinucleótido está integrado forma estable, lo que significa que el polinucleótido integrado se conserva de forma estable en la planta, se expresa y también se puede transmitir de forma estable a la descendencia. La introducción estable de un polinucleótido en el genoma de una planta también incluye la integración en el genoma de una planta de la generación parental anterior, pudiéndose heredar el polinucleótido de forma estable. El término "heterólogo" significa que el polinucleótido introducido proviene, por ejemplo, de una célula o un organismo con un trasfondo genético diferente de la misma especie o una especie diferente, o es homólogo a la célula huésped procariota o eucariota, pero luego se localiza en un entorno genético diferente y, por tanto, difiere de un polinucleótido correspondiente posiblemente presente de forma natural. Puede estar presente un polinucleótido heterólogo además del gen endógeno correspondiente.
Con "efecto reductor del rendimiento" se entiende la expresión fenotípica de una secuencia de ADN que está acoplada o estrechamente acoplada con el gen diana, aquí el gen restaurador, y por lo tanto cosegregada. Este es un problema que se produce con frecuencia en programas de retrocruzamiento con donantes exóticos de herencia común de genes deseados y genéticamente no deseados desde el punto de vista de reproducción, que se describe, por ejemplo, por Brinkmann et al., Crop Sci. 17 (1977), 165-168 y Tanksley et al., Bio/Technology 7, (1989) 257-264. Este complejo de genes restauradores y genes no deseados adicionales, que parcialmente son reductores del rendimiento, hasta ahora siempre se ha transferido completa o en parte al material reproductor, con lo que las líneas de introgresión contienen, por ejemplo, además de los rasgos de restauración ventajosos, características negativas adicionales, que, por ejemplo, provocan una reducción del rendimiento significativa según la ubicación. En consecuencia, aquí el arrastre por ligamiento es preferentemente un efecto sobre el rendimiento negativo, que está asociado con una capacidad de restauración eficaz.
Existe una reducción o disminución del arrastre por ligamiento cuando sus rasgos fenotípicos negativos solo se expresan en de un 0 a un 75 % con respecto a la planta de control, lo que corresponde a una reducción de un 25-100 %. En un modo de realización preferente, la reducción está en un 50-100 % o un 75-100 %. En un modo de realización preferentemente, en particular, los rasgos negativos, que están asociados con el arrastre por ligamiento, están casi completamente o completamente anulados y la disminución del arrastre por ligamiento está entre un 90 a un 100%. Una reducción o disminución del arrastre por ligamiento, en particular, para plantas híbridas, también puede significar el efecto de arrastre por ligamiento sobre el rendimiento inferior a 7 dt/ha (quintales por hectárea), inferior a 6,5 dt/ha o inferior a 6 dt/ha, preferentemente inferior a 5,5 dt/ha, inferior a 5 dt/ha, inferior a 4,5 dt/ha o inferior a 4 dt/ha, o muy preferentemente inferior a 3,5 dt/ha, inferior a 3 dt/ha, inferior a 2,5 dt/ha o inferior a 2 dt/ha en comparación con una planta casi isógena o planta híbrida correspondiente que no presente el segmento cromosómico descrito anteriormente o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Para cuantificar el arrastre por ligamiento, se puede usar una estandarización del efecto de arrastre por ligamiento como un porcentaje de la capacidad de la pareja de NIB con E, como se describe a continuación en los ejemplos 1 y 2.
El término "vector" o "sistema de vector", como se usa aquí en relación con la modificación del genoma, se refiere a un medio de transporte para convertir directa o indirectamente una construcción recombinante, que comprende ácidos nucleicos o polipéptidos y, si corresponde, secuencias adicionales como secuencias reguladoras o secuencias de localización, directa o indirectamente en una célula diana deseada o en una estructura diana vegetal en el compartimento celular deseado. La introducción directa tiene lugar directamente en una célula diana vegetal o una estructura diana vegetal que contiene ácidos nucleicos que, de acuerdo con la presente divulgación, se deben cambiarse de forma dirigida. La introducción indirecta incluye la introducción en una estructura, por ejemplo, células de hojas u órganos y tejidos vegetales adicionales, que no comprenden directamente la célula diana vegetal de interés, con lo que se proporciona la propagación sistémica y la entrega del vector que comprende una construcción recombinante de acuerdo con la presente divulgación en la estructura diana vegetal, por ejemplo, tejidos o células meristemáticas o células madre. En el contexto de la transfección de secuencias de aminoácidos, el término vector incluye agentes adecuados para la transfección de péptidos o proteínas, como, por ejemplo, mezclas de lípidos iónicas o agentes que son adecuados para la transfección de un ácido nucleico, como, por ejemplo, materiales portadores mediante lo que se pueden introducir secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos en una célula mediante el bombardeo de partículas, como, por ejemplo, partículas de oro y volframio. Este término también comprende vectores víricos, es decir, virus modificados, como, por ejemplo, los que provienen de uno de los siguientes virus: virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV), virus del mosaico de Brome (BMV), virus del enanismo amarillo del maíz (MYDV) y vectores bacterianos, como, por ejemplo, Agrobacterium spp., como, por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens. Finalmente, el término también incluye medios de transporte adecuados para introducir ácidos nucleicos lineales (mono- o bicatenarios) en una célula diana. Para el experto en la técnica son conocidas secuencias adicionales que debe tener un vector para ser funcional en una célula diana deseada. Para el experto en la técnica también es conocida la producción, el procesamiento y la aplicación convencionales dichos vectores.
El término "construcción recombinante" como se usa en el presente documento en relación con la modificación del genoma se refiere a una construcción que comprende, entre otros, plásmidos o vectores plasmídicos, cósmidos, cromosomas de levaduras o bacterianos (YAC y BAC) artificiales, fagémidos, vectores de bacteriófagos, un casete de expresión, secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos monocatenarias o lineales, y vectores víricos, es decir, virus modificados, que se pueden introducir en una célula diana de acuerdo con la presente divulgación. Una construcción recombinante puede comprender herramientas de modificación del genoma o partes de las mismas. Por ejemplo, las herramientas CRISPR/Cas o partes de las mismas comprenden al menos un ARNg o al menos una variante de nucleasa Cas y/o al menos un dominio efector adicional en forma de un ácido nucleico o bien de una secuencia de aminoácidos. Las herramientas de TALEN o partes de las mismas comprenden, por ejemplo, al menos un dominio efector de TAL y/o al menos una variante de nucleasa, preferentemente una endonucleasa de tipo II, como, por ejemplo, FokI. Además, la construcción recombinante puede comprender secuencias reguladoras y/o secuencias de localización. La construcción recombinante se puede integrar en un vector plasmídico y/o aislar de un vector plasmídico, por ejemplo, en forma de una secuencia polipeptídica o de un ácido nucleico mono- o bicatenario enlazado a un vector no plasmídico. Después de la introducción, la construcción es introcromosómica o, preferentemente, extracromosómica y no está integrada en el genoma y habitualmente está en forma de ADN mono- o bicatenario, de un ARN mono o bicatenario o de un polipéptido.
Las configuraciones y modos de realización de la presente invención se describen de forma ejemplar con referencia a las figuras y secuencias adjuntas:
Fig. 1: cartografía genética y física del locus Rfp1. A) Cartografía genética de alta resolución del locus Rfp1 en el brazo largo del cromosoma de centeno 4R. Los números por debajo de la línea horizontal superior describen el número de acontecimientos de recombinación observados entre los marcadores en cuestión en 4563 plantas individuales analizadas. La información sobre la codificación de los marcadores se proporciona en la tabla 2 del apéndice. B) cóntigo que abarca Rfp1 de clones de BAC de la genoteca Sce-B-R05104. C) Genes predichos en el locus Rfp1. Los recuadros resaltados representan exones de genes funcionales o fragmentos de gen, pseudogenes o genes mutados. La orientación de los genes se indica mediante flechas horizontales. La línea vertical en el gen mTERF 175O19_c7 describe un codón de parada prematuro en la secuencia génica. Las abreviaturas F y C indican que se ha observado una herencia dominante específica del genotipo restaurador que confiere fertilidad (F) o una herencia codominante (C) para el marcador en cuestión.
Fig. 2: cartografiado de genes restauradores funcionales en el locus Rfp1. Con ayuda de marcadores de selección moleculares, se identificaron plantas individuales recombinantes con segmentos de cromosoma de donante (D) de diferentes longitudes en el trasfondo genético de una línea parental de polen (E) en 2 series experimentales ejemplares. La expresión de los genes restauradores Rfpla y Rfplb funcionales se determinó en la descendencia de cruzamiento de prueba de cada planta recombinante con el genotipo probador androestéril Lo6-P(SR) altamente diagnóstico. La tabla 2 refleja el haplotipo marcador de la pareja de NIB con D que porta el segmento de introgresión de donante. Ae-d: diferencia entre los promedios de cruzamiento de prueba de parejas de NIB que portan de forma homocigótica el alelo selecto (E) o el alelo de donante (D). Esta diferencia en promedio en 7 ubicaciones determina el efecto de arrastre por ligamiento para el rendimiento de grano en términos absolutos en dt/ha y en porcentaje de la pareja de NIB con E. LSD al 5 %: mínima diferencia significativa al 5 % de probabilidad de error.
Fig. 3: cartografiado del gen restaurador Rfplb. Entre 13 plantas recombinantes entre los marcadores P20 y 7_01_H_1441, el alelo del genotipo de donante IR9 se puede detectar inequívocamente en 4 plantas en el locus marcador 72F13_c2_mTERF. El fenotipo de Rfplb se registró en la descendencia de cruzamiento de prueba de los genotipos recombinantes con el probador para CMS Lo6-P(SR) y está en perfecta concordancia con los genotipos marcadores del factor de terminación de la transcripción mitocondrial (mTERF) representados mediante 72F13_c2_mTERF [A= portador homocigótico del alelo selecto; H= portador heterocigótico del alelo selecto o de donante; Rfp1b*=Rfp1. Se registraron fenotipos selectos a partir de la capacidad de liberación de polen de 15 descendencias de cruzamiento individuales del genotipo recombinante y del probador Lo6-P(SR) altamente diagnóstico.].
Fig. 4: muestra el efecto de arrastre por ligamiento para el rendimiento de grano (Ae-d) del segmento de introgresión 455 y 765 (eje y), representado frente al efecto de arrastre por ligamiento medio para cada una de las siete ubicaciones sometidas a prueba (eje x). El recombinante con el segmento de introgresión corto 455 muestra un pequeño efecto de arrastre por ligamiento, el recombinante con 765 con un segmento de introgresión largo muestra un gran efecto de arrastre por ligamiento. También está claro a partir de los datos experimentales que los efectos de arrastre por ligamiento difieren mucho para los siete ambientes. Los datos meteorológicos sugieren que las condiciones de estrés durante la fase de brotación son, en particular, particularmente responsables de ello.
Fig. 5: producción de semillas de cruzamiento de prueba con parejas de conjuntos casi isógenos como progenitor de polen y probador de cruzamiento simple para CMS T911 como progenitor femenino. Se muestra el uso de parejas de NlB (pares de NIB) en parcelas de aislamiento que sirven para la producción de semillas de semillas de cruzamiento de prueba. Aquí, las parejas de NIB polinizan un probador de cruzamiento simple para CMS, que representa la reserva heterótica opuesta. Las semillas cosechadas en los probadores para CMS se siembran luego en experimentos de campo con múltiples ambientes para determinar fenotípicamente el efecto de arrastre por ligamiento.
Fig. 6: casete de expresión en el vector pYFrfpl que contiene el gen de restauración rfp lb (SEQ ID NO: 1) bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz con el primer intrón y del terminador de nos.
Fig. 7: comparación de la secuencia de nucleótidos del gen rfp1a natural (SEQ ID NO: 32) con la secuencia de nucleótidos del gen rfp1a de IRAN9 (SEQ ID NO: 28).
Fig. 8: comparación de la secuencia de nucleótidos del gen rfp1b natural (SEQ ID NO: 30) con la secuencia de nucleótidos del gen rfp1b de IRAN9 (SEQ ID NO: 1).
Fig. 9: comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína rfp1a natural (SEQ ID NO: 33) con la secuencia de aminoácidos de la proteína rfp1a de IRAN9 (SEQ ID NO: 29).
Fig. 10: comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína rfp1b natural (SEQ ID NO: 31) con la secuencia de aminoácidos de la proteína rfp1b de IRAN9 (SEQ ID n O: 2).
Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin embargo, sin limitar el objetivo de la invención. A menos que se indique lo contrario, se usaron procedimientos estándar.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: desarrollo de 'conjuntos casi isógenos' a modo de ejemplo de la línea de centeno 455 en el trasfondo Lo310
Como se representa en la figura 5, se produjeron parejas con D y E de NIB para todos los genotipos recombinantes cruzando conjuntos de más de 100 plantas BC6 S1 cada uno, que son no portadores o portadores homocigóticos de Rfp1 en el probador para CMS de cruzamiento simple T911. Gracias a las paredes de aislamiento contiguas, se aseguró que no tuviera lugar ninguna polinización cruzada. Las semillas de cruzamiento de prueba generadas así se usaron luego para experimentos de campo en múltiples ambientes. Las plantas con cruzamientos de prueba se verificaron para determinar el estudio genealógico correcto mediante (i) análisis de marcadores posteriores y (ii) evaluación de la liberación de polen en los experimentos de campo. Todas las plantas con cruzamientos de prueba evaluadas que se generaron por las parejas con D de NIB mostraron una liberación de polen completa, mientras que aquellas que se derivaron de las parejas con E mostraron una androfertilidad muy significativamente reducida y solo parcialmente restaurada.
Ejemplo 2: experimentos de campo
Los experimentos para evaluar el rendimiento se llevaron a cabo en ubicaciones con diferentes condiciones ambientales. Por ejemplo, en el año 2012 en siete ubicaciones en Alemania (D) y Polonia (PL). Como se puede ver en la tabla 1, las ubicaciones se eligieron de modo que cumplan las condiciones prácticas agrícolas en Europa Central con diferentes condiciones de estrés (estrés por sequía y deficiencia de nitrógeno). En el régimen de bajo contenido de nitrógeno, se usó nitrógeno en cantidades muy por debajo de la dosis habitual. En un experimento sin riego, la precipitación natural fue la única fuente de agua, mientras que en los experimentos con riego se aplicó una cantidad de agua adicional de aproximadamente 25 mm a la semana. Por tanto, fue posible medir los efectos de los segmentos de introgresión con Rfp1 en ambientes muy diferentes. Luego, se emplearon los resultados (1) para la determinación del efecto de arrastre por ligamiento específico del segmento de introgresión, (2) para la identificación de segmentos de introgresión con alta estabilidad ambiental y (3) para la identificación de ambientes de diagnóstico que hacen que el arrastre por ligamiento sea más visible.
Tabla 1: descripción de las ubicaciones experimentales y los tratamientos aplicados en 2012 (BEK=Bekedorf (Baja Sajonia); KON=Kondratowice (Baja Silesia); BBG=Bernburgo (Sajonia-Anhalt); KO2 y KO3=Bergen (Baja Sajonia); PET_I y PET_N=Petkus con riego (I) y variantes de nitrógeno (N) (Brandeburgo); puntos del suelo: índice que mide la calidad de la superficie cultivada. La escala de valores posibles varía de 1 (muy malo) a 100
(muy bueno).)
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Se aplicó un diseño experimental de "parcela subdividida" para todos los ambientes. Los cruzamientos de prueba de las líneas BC6 S1 recombinantes se usaron como parcelas principales. Sus respectivos pares de conjuntos con D y E casi isógenos NIB sirvieron como subparcelas. La "pareja con D de NIB" es un portador homocigótico del segmento de introgresión de donante, mientras que la "pareja con E de NIB" es un portador homocigótico del segmento de la línea selecta correspondiente. Las parejas con D y E correspondientes se sembraron inmediatamente contiguas entre sí para minimizar las diferencias del entorno y así poder medir las diferencias atribuibles al segmento de introgresión con un mayor grado de exactitud. Las unidades experimentales de los experimentos de rendimiento fueron los cruzamientos de prueba de 7 líneas BC6 S1 , que, a su vez, representaron cuatro haplotipos diferentes. De forma ejemplar, los resultados del recombinante con el segmento de introgresión más corto (455) en comparación con aquellos con el segmento de introgresión más largo (765) se consideran en detalle. Este último ya es significativamente más corto que los segmentos que están disponibles actualmente para las variedades híbridas que ya se han aprobado.
La preparación e implementación de los experimentos de rendimiento corresponden a las reglas generales y son bien conocidas para el experto en la técnica. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo en dos etapas: en primer lugar, se calculó un análisis de la varianza sobre todas las repeticiones en cada ubicación individual, con el objetivo de determinar la exactitud del experimento y determinar los valores de rendimiento medio específicos de ubicación para las líneas recombinantes y sus segmentos de introgresión. En una segunda etapa, se usaron luego los promedios mencionados para un análisis en todos los ambientes.
Se detectaron diferencias drásticas y estadísticamente significativas (prueba de la t) para el efecto de arrastre por ligamiento, por ejemplo, entre los genotipos recombinantes 455 y 765. Como se representa en la fig. 2, el efecto de arrastre por ligamiento (Ae-d) promediado sobre las ubicaciones fue de 3,7 dt/ha para el haplotipo 455, mientras que alcanzó casi el doble (7,0 dt/ha) para el haplotipo 765. Las diferencias entre los dos recombinantes se manifiestan, en particular, significativamente en la ubicación PET_N con un alto estrés debido a la sequía primaveral. Aquí, el efecto de arrastre por ligamiento (Ae-d) del recombinante con 765 se elevó a 18 dt/ha, mientras que se mantuvo en solo 3 dt/ha para el haplotipo 455. En otra ubicación (BBG) con condiciones de estrés moderado, el efecto de arrastre por ligamiento (Ae-d) desciende a 11 dt/ha para el haplotipo 765, sin embargo, varias veces mayor que el del haplotipo 455 con solo aproximadamente 3 dt/ha. En el experimento llevado a cabo en el año 2014 se encuentran condiciones básicamente análogas. Aquí también, el acortamiento del segmento de introgresión corresponde a una disminución del arrastre por ligamiento para el rendimiento. Para poder comparar los dos experimentos de 2012 y 2014, se recomienda estandarizar el efecto de arrastre por ligamiento como porcentaje de la capacidad de la pareja con E de NIB. La fig. 2 muestra que el arrastre por ligamiento de los recombinantes con los segmentos de introgresión más cortos (1120 y 455) es solo de entre un 3,9 y un 4,7 %, mientras que los recombinantes con los segmentos de introgresión más largos (1110 y 765) experimentan considerables pérdidas de capacidad de un 6,2 y un 7,1 %. Sin embargo, las últimas reducciones del rendimiento aún son relativamente pequeñas si se comparan con el hecho de que los segmentos de introgresión conocidos actualmente, que contienen los dos marcadores tc256739 y tc300731, provocan efectos de arrastre por ligamiento por encima de un 10 %.
Las ubicaciones difieren en términos de su valor de diagnóstico para la detección del arrastre por ligamiento (véase la figura 4). Los promedios para Ae-d en todos los segmentos de introgresión sometidos a prueba en 2012 (serie 018/2012) variaron de 3,2 (PET_I), 3,3 (KON), 4,1 (KO2), 4,6 (BBG), 5,7 (Ko3), 6,7 (BEK) hasta 10,0 (PET_N) dt/ha. El efecto de arrastre por ligamiento medio más bajo se pudo observar en los experimentos con riego en Petkus (PET_I), en los que la disponibilidad de agua no estaba limitada. Por el contrario, los experimentos sin riego en el mismo macroambiente (PET_N) se vieron gravemente afectados por la sequía en la fase de prefloración. Se demostró (figura 4) que el segmento de 765 reacciona significativamente al estrés ambiental (coeficiente de regresión sobre el efecto de arrastre por ligamiento medio: 1,6 dt/ha). A diferencia de esto, el segmento de 455 presenta una estabilidad ambiental muy alta, que se pudo confirmar en el entorno de estrés PET-N.
Ejemplo 3: identificación de genotipos recombinantes
Se usaron los siguientes marcadores para identificar genotipos recombinantes y para describir el segmento de introgresión restante: ctg24, ctg32, ctg16b, P20, c40745, siendo el marcador P20 el que desempeñó el papel más importante en todo el trabajo posterior. Con ayuda del marcador P20, se pudo desarrollar una genoteca de BAC de centeno de acceso público a partir de cv. Blanco (Shi BJ, et al. (2009) Physical analysis of the complex rye (Secale cereale L.) Alt4 aluminium (aluminum) tolerance locus using a whole-genome BAC library of rye cv. Blanco. Theor Appl Genet. 119(4):695-704), que no es portador del gen Rfp1, identificándose los BAC como una fuente de secuencias de marcador adicionales. Se consiguió aislar y secuenciar un BAC prometedor. Esto abrió la posibilidad de poner a disposición una genoteca de BAC del genotipo portador del gen restaurador (aquí denominada "IR9" o ROS104), que se pudo cribar con sondas de ADN específicas por medio de PCR. Con ayuda de esta genoteca no se pudo crear ningún cóntigo de BAC que abarcara el locus Rfp1, pero se pudieron identificar al menos los clones de BAC que flanqueaban el locus. Se diseñaron numerosas combinaciones de marcadores a partir de las secuencias; véase la tabla 2. Estas se utilizaron para la selección de nuevos recombinantes y se convirtieron parcialmente en un nuevo sistema de marcadores (basado en SNP).
Además, basándose en los análisis con mTerf, se pudo identificar un nuevo gen Rf que aún no se ha descrito como pertinente para la restauración de la fertilidad en ninguna especie vegetal. Se pudo demostrar por primera vez que en el segmento de introgresión 4R están activos dos genes Rf independientes y, en el trasfondo de la capacidad de restauración, también equivalentes.
A partir de marcadores estrechamente flanqueantes y una prueba fenotípica se pudo mostrar para ambos genes Rf implicados que los segmentos de introgresión de donante respectivos se pudieron reducir adicionalmente y se pudor retener la capacidad de restauración en toda su extensión.
Ejemplo 4: desarrollo de marcadores estrechamente acoplados
Para el desarrollo de marcadores estrechamente acoplados para el locus Rfp1 en el centeno, así como para el aislamiento del gen restaurador funcional, se empleó un alelo de Rfp1 de la variedad autóctona exótica IRAN IX como la fuente más eficaz de restauración de la fertilidad. Sin embargo, asociado a esta capacidad de restauración tan eficaz, hay un arrastre por ligamiento que, dependiendo de la ubicación, puede provocar una reducción del rendimiento significativa.
Además del marcador P20 estrechamente acoplado, se pusieron a disposición marcadores estrechamente acoplados de forma proximal adicionales para el cartografiado fino de la región de Rfp1. Esencialmente, esto se realizó por medio de dos estrategias que permitieron seleccionar un intervalo genómico reducido de forma recombinante usando marcadores moleculares y, por tanto, en última instancia, identificar y reducir el arrastre por ligamiento no deseado.
1) La primera estrategia se basó en el empleo de sintéticos conservados entre centeno y Brachypodium, así como centeno y cebada. De esta forma, se derivaron nuevos marcadores estrechamente acoplados a partir de los dos modelos de gramíneas/clases de cereales mencionados por medio de información genética.
2) La segunda estrategia se basó en la suposición de que el acoplamiento estrecho del marcador P20 también indica un acoplamiento físico estrecho, en el procedimiento de paseo cromosómico. Esto significa que se buscó una genoteca de BAC de centeno disponible gratuitamente (variedad de polinizacion 'Blanco' (Shi et al., Theor Appl Genet 119 (2009), 695-704) por medio de marcadores estrechamente acoplados para crear un cóntigo de BAC inicial como punto de partida para un análisis de cóntigos del locus Rfp1. Para ello, se pudo cribar una genoteca de BAC recién creada del genotipo portador del gen restaurador (aquí denominada "IR9" o ROS104) con sondas de ADN específicas por medio de PCR.
Con ayuda de estas genotecas, se pudieron identificar clones de BAC, de los que se pudieron derivar nuevos marcadores, que finalmente permitieron una selección de un intervalo reducido en torno a Rfp1.
Ejemplo 5: cartografiado de nuevos marcadores en la población ROS13024-BC1 e identificación de dos locus independientes, pero de acción equivalente del rasgo de restauración (Rfpla y Rfplb)
De forma complementaria al marcador P20, se desarrollaron nuevos marcadores individuales adecuados para la selección sobre la base de los clones de BAC aislados de la genoteca de BAC ROS104 en el contexto de la presente invención. Se usaron los marcadores obtenidos a partir de los clones de BAC aislados para el cartografiado de alta resolución en material reproductor avanzado, con lo que finalmente se permitió que el intervalo objetivo se resolviera adicionalmente. El cartografiado de estos marcadores en el intervalo diana, así como en relación con el gen diana, se realizó en numerosos experimentos en poblaciones divididas y autodesarrolladas. Los marcadores y las secuencias de cebador asociadas con ayuda de los que se pueden identificar los locus del rasgo de restauración en plantas se resumen en la tabla 2 a continuación.
Con ayuda de los marcadores de selección recién establecidos, de forma sorprendente, se pudo mostrar por primera vez en el trabajo de cartografiado que el rasgo de restauración se puede asignar a dos genes restauradores independientes, pero estrechamente acoplados y de acción equivalente (Rfpla y Rfplb) en el locus Rfp1 (fig. 1). Además, uno de los genes Rf implicados, a saber, el gen Rfplb, resultó ser un gen que codifica una proteína mTERF. El Rfpla también muestra concordancias secuenciales muy altas e igualmente se anota con una alta probabilidad como gen mTERF. Ya que hasta la fecha no se sabía que un gen de este tipo era pertinente para la restauración de la fertilidad y/o la liberación de polen en los cereales, este resultado fue completamente inesperado.
En consecuencia, a partir de la presente invención y los experimentos asociados con ella, fue posible por primera vez demostrar que dos genes Rf independientes eran eficaces en el segmento de introgresión 4R y también casi equivalentes en el trasfondo de la capacidad restauradora. Por lo tanto, estos dos genes ahora también se pueden evaluar por separado en términos de reproducción, por ejemplo, con ayuda de los marcadores descritos en la presente invención, y emplearse por separado o en combinación entre sí. Por tanto, la presente solicitud también divulga el uso del gen Rf R fpla solo o en combinación con Rfplb. En un modo de realización adicional, el gen Rf Rfplb también se puede emplear independientemente de Rfpla. Preferentemente, ambos locus de acción equivalente mencionados previamente dan lugar a una restauración de la fertilidad.
Tabla 2: visión general de los marcadores (Tf=temperatura de fusión; * descrito en Hackauf et al., 2012)
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continuación
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En uno de los experimentos realizados (Ro14037), se genotiparon casi 5000 plantas individuales de una población BCxSI. Aquí, se pudo detectar un polimorfismo genético entre el segmento de cromosoma de donante con Rfp1 y la línea parental de polen Lo727 para los marcadores disponibles. La huella genética creada sobre la base de estos marcadores permitió la identificación fiable de solo unas 20 plantas, que se pudieron caracterizar mediante recombinación en la región de la valiosa variante del gen Rfp1. Por tanto, el intervalo genético en torno a Rfp1 en el trasfondo genético de la línea Lo727 se define mediante los marcadores flanqueantes ctg2 y 7_01_H_1441, para los que se pudo calcular una distancia genética de aproximadamente 0,2 cM o aproximadamente 120 kb (fig. 1). La cartografía genética creada documenta que el intervalo diana en torno a Rfp1 se puede resolver de forma deseada con ayuda de los marcadores recién desarrollados. Inicialmente, los primeros marcadores basados en genes, así como el marcador c40745_1 se emplearon para seleccionar el trasfondo genético de un genotipo progenitor de polen selecto. El marcador P20 se usó para detectar el segmento con el gen restaurador Rfp1. En una serie experimental (018/2012) se consiguió observar la expresión de Rfp1 y la restauración completa asociada de la androfertilidad para segmentos de introgresión de Rfp1 de diferentes longitudes (fig. 2, parte inferior) a partir de cruzamientos de prueba con el probador para CMS androestéril Lo6-P(SR).
Este hallazgo confirma (1) el acoplamiento entre Rfp1 y P20, así como (2) el valor de los marcadores de selección desarrollados para la reducción recombinante del segmento de cromosoma de donante.
En base a este resultado, se genotiparon en primer lugar familias de BCx de escisión adicionales con el marcador P20 en experimentos adicionales (por ejemplo, Ro12011). En un experimento designado como serie experimental 12-1-23, se identificaron aproximadamente 3200 plantas individuales que eran homocigotas para el alelo de la línea selecta Lo310 en este locus marcador. Con los marcadores basados en genes mencionados anteriormente, se identificaron 4 plantas recombinantes con segmentos de introgresión de Rfp1 de diferentes longitudes en este grupo de materiales (fig. 2, arriba). En cruzamientos de prueba de estas 4 líneas, así como del genotipo de control n.° 1058 sin segmento donante con Rfp1, con el probador para CMS androestéril Lo6-P(SR), se pudo observar la expresión de Rfp1 en 3 descendencias completamente androfértiles de las líneas 1110, 1039 y 1120. La constitución genética de los recombinantes permite llegar a la conclusión de que un gen restaurador independiente y de acción equivalente adicional está localizado en la región del intervalo diana. Este gen restaurador acoplado con el marcador ctg2 se denomina Rfpla, mientras que el gen restaurador acoplado con P20 se denomina Rfplb (véase también la fig. 1).
Se llevaron a cabo experimentos de cartografiado adicionales (por ejemplo, Ro13030) para la localización exacta del gen restaurador Rfplb. De forma análoga a los experimentos anteriores, las plantas individuales BCx, en las que el segmento de cromosoma de donante se había reducido previamente de forma recombinante con ayuda de los marcadores basados en gen del clon 541014 de BAC, se genotiparon en primer lugar con el marcador P20. De esta forma, se identificaron casi 4300 genotipos que eran homocigotos en la ubicación de este gen marcador para el alelo selecto de la línea parental de polen Lo310. En este grupo de materiales, por ejemplo, el marcador 7_01_H_1441 pudo detectar un total de 13 recombinantes para el marcador P20 (fig. 3). En el locus marcador 72F13_c2_mTERF, se pudo observar el alelo de donante del recurso genético en 4 de estos 13 recombinantes (fig. 3). Se estableció la descendencia de cruzamiento de prueba en la que la androfertilidad se había restaurado completamente para 3 de estos 4 recombinantes. Por el contrario, la descendencia de cruzamiento de prueba de los 9 portadores del alelo marcador no restaurador de mTERF mostró un fenotipo completamente androestéril.
La concordancia de los fenotipos observados con los genotipos marcadores de un factor de terminación de la transcripción mitocondrial (mTERF) permitió calcular una distancia genética entre P20 y Rfplb de r=0,094 cM. Esta estimación de recombinación está en muy en concordancia con la estimación de la recombinación r=0,011 cM calculada en experimentos previos entre P20 y el gen mTERF.
Ejemplo 6: creación de cóntigo con Rfp1 con ayuda de la genoteca de BAC ROS104
Los clones de BAC seleccionados de la genoteca de BAC ROS104 sirvieron como base para desarrollar sondas y cebadores para continuar el paseo cromosómico. A través de esto, se consiguió derivar un cóntigo de alrededor de 350 kpb. Mediante los marcadores y su cartografiado en el material reproductor avanzado demuestran que este cóntigo lleva marcadores que flanquean ambos locus restauradores (fig. 1 y tabla 2). Los análisis han demostrado que no hay ningún gen que codifique la proteína PPR en este intervalo, pero hay 3 genes denominados mTERF (factor de terminación de la transcripción mitocondrial) o fragmentos de gen, que, por tanto, claramente se deben considerar como gen candidato para Rfp1.
Sobre la base del trabajo anterior, se pudo construir un cóntigo de BAC del locus Rfp1 en el trasfondo de un genotipo restaurador (línea consanguínea selecta Lo310 de la reserva génica de progenitores de polen) y demostrar la presencia de dos genes Rf mediante análisis de la descendencia recombinante.
Ejemplo 7: validación de los resultados
Además de la detección llevada a cabo en el ejemplo 5 del gen Rfplb identificado mediante recombinación genética, también se comprueba la funcionalidad del gen en el enfoque transgénico. Para ello, se aplica el protocolo para la transformación de centeno mediada por Agrobacterium tumefaciens de Herzfeld (2002. Development of a genetic transformation protocol for rye (Secale cereale L.) and characterisation of transgene expression after biolistic or Agrobacterium-mediated gene transfer. Dissertation, IPK, Deuschland). Para ello, se cultivan plantas donantes de la línea consanguínea L22 en un invernadero a aproximadamente 20 °C y 16 h de luz en el momento de la floración, a continuación, se esterilizan en superficie cariópsides inmaduras y se preparan embriones inmaduros. Estas se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio inductor de callos (que contiene sales de MS (Murashige y Skoog, 1962. "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures." Physiologia plantarum 15.3: 473-497.), se añaden 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de glutamina, 30 g/l de sacarosa, 2,5 mg/l de 2,4-D, pH 5,8, 3,0 g/l de Phytagel) y se precultiva en oscuridad a 25 °C durante un periodo de 5 días antes de la transformación. Para la transformación, los embriones inmaduros se colocan en macroplacas 6x (Greiner Cellstar) después de un precultivo previo y se suspenden en 10 ml de medio líquido inductor de callos. Para el tratamiento osmótico, el medio líquido se intercambia con 10 mg de medio osmótico (que contiene sales de MS (Murashige y Skoog, 1962), 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de glutamina, 30 g/l de sacarosa, 6.0 mg/l de 2,4-D, 72,9 g/l de manitol, pH 5,8) y se plasmolizan los explantes durante un periodo de 4-6 h. A continuación, se vuelve a eliminar el medio osmótico y se inoculan los callos con aproximadamente 300 pl de suspensión de agrobacterias. A esto le sigue un tratamiento al vacío a 500 mbar durante un minuto y, a continuación, se incuba durante 10 min. Los explantes se mezclan dos veces en 10 mg de medio de infección (que contiene sales de MS (Murashige y Skoog, 1962), 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de glutamina, 15 g/l de sacarosa, 15 g/l de glucosa, 6,0 mg/l de 2,4 D, pH 5,2, acetosiringona 200 pM) y se cocultiva durante la noche a 22 °C. Después de 14-16 h, los explantes se lavan de nuevo varias veces en el medio de infección y finalmente se transfieren a medio de cocultivo sólido (medio de infección complementado con 3,0 g/l de Phytagel), con el lado del escutelo apuntando hacia arriba. Los explantes se cultivan durante dos días más y, a continuación, se transfieren a un medio sólido inductor de callos que está enriquecido con 150 mg/l de Timentin para inhibir el crecimiento de agrobacterias.
Después de 14 días, los callos se transfieren al medio de regeneración selectivo (que contiene sales de MS (Murashige y Skoog, 1962), 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de glutamina, 30 g/l de sacarosa, pH 5,8, 5.0 g/l de agarosa de tipo I, 150 mg/l de Timentin, 30 mg/l de paromomicina). Después de tres semanas adicionales, los callos se transfirieron a recipientes de cultivo adecuados que contenían un medio de regeneración selectivo con 50 mg/l de sulfato de paromomicina para la extensión de los brotes.
El vector pYFrfpl (figura 6) que contiene el gen de restauración rfplb (SEQ ID NO: 1) bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz con el primer intrón y el terminador de 35-S insertado en el vector pPZP111 se introducen mediante electroporación (Mersereau et al., 1990. "Efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens by electroporation." Gene 90.1: 149-151) en la cepa agrobacteriana AGLO (Lazo et al., 1991. "A DnA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium." Nature Biotechnology 9.10 (1991): 963-967). Se cultiva un cultivo de AGLO (pYFrfp1) durante la noche en medio LB a 50 mg/l hasta que se produce la saturación (DO6602-2,5). Se centrifugaron 2 mg a 5000 RCF durante 5 min y el sedimento se disolvió en 1 mg de medio LB y 1 mg de medio de infección. Antes de que los implantes se infecten, las bacterias se incuban nuevamente durante aproximadamente dos horas (DO660 1,5-2,0).
Para analizar el ADNt, se amplifica la región de unión del borde de ADNt y del genoma de centeno usando PCR inversa (Ochman et al., 1990. "Amplification of flanking sequences by inverse PCR." PCR protocols: A guide to methods and applications: 219-227). Para ello, se digiere el ADN de las plantas de centeno transgénicas con BamHI o BglII, se circulariza mediante ADN ligasa T4 y, a continuación, se usa como molde para la PCR. La amplificación se lleva a cabo en el contexto de una PCR anidada con el GeneAmp-PCR System 9700 (Perkin Elmer). Las condiciones de reacción correspondieron a las recomendadas por el fabricante, utilizándose 200 ng de ADN molde en la primera reacción y 0,5 pl de la primera reacción como molde para la segunda reacción, por lo que el volumen final corresponde a 25 pl.
Para el borde derecho (RB) se usaron los siguientes cebadores para la primera reacción (28 ciclos a 94 °C durante 30 s, 48 °C durante 60 s y 72 °C durante 2 min): RB1R 5'- CTG AAT GGC GAA TGC TAG AGC AG -3' (región LacZ) y UBIF 5'- CTG CAG TGC AGC GTG ACC CG -3' (región 3' del promotor de ubiquitina de maíz). Para la segunda reacción (32 ciclos a 94 °C durante 30 s, 52 °C durante 60 s y 72 °C durante 2 min) se usan los siguientes cebadores: RB2R 5'- CGT TTC CCG CCT TCA GTT TAA AC -3' y cebador de UBIF. Los productos de amplificación por PCR de extremos romos se obtienen añadiendo ADN polimerasa de Pwo al segundo lote de reacción. Estos productos de amplificación se clonan en el vector de PCR (Invitrogen, San Diego, CA), llevándose a cabo después un análisis de secuencia.
Las plantas de centeno transformadas con éxito se reprodujeron y cruzaron con líneas consanguíneas androestériles de tipo Pampa. La descendencia que porta y expresa el gen de restauración rfplb como transgén muestra una restauración de la androesterilidad.
De forma alternativa al enfoque transgénico descrito anteriormente, la función del gen también se puede realizar inactivando el gen de restauración en una línea de restauración. Para ello, el experto en la técnica también puede utilizar TILLING o la modificación del genoma (por ejemplo, TALEN o CRISPR/Cas), por ejemplo, para introducir un codón de parada prematuro en la secuencia codificante o para provocar un desplazamiento del marco de lectura mediante una inserción/deleción. El resultado sería una proteína mTERF no funcional y una pérdida de capacidad de restauración.
Ejemplo 8: caracterización del material vegetal en el trasfondo de la liberación de polen:
los presentes resultados permiten a un fitomejorador usar la restauración deseada para la CMS de tipo Pampa en conjunto con una excelente liberación de polen en el desarrollo de nuevas plantas de cereal, en particular, centeno y cebada. En el transcurso de esto, las características agronómicas negativas sobre el rendimiento se pudieron reducir significativamente y, simultáneamente, minimizar el riesgo de infestación por cornezuelo. El grado de liberación de polen que se logra mediante un progenitor de polen masculino descrito aquí se puede determinar en una escala del 1 al 9 (Geiger HH, Morgenstern K (1975) Angewandt-genetische Studien zur cytoplasmatischen Pollensterilitat bei Winterroggen. Theor Appl Genet 46:269-276). Aquí, los valores de 1 a 3 indican anteras vacías no emergentes con bajos niveles de degeneración, los valores de 4 a 6 indican una androesterilidad parcialmente anulada con de <10 % a >50 % de anteras fértiles, los valores de 7 a 8 indican anteras con liberación de polen con un aumento del tamaño de las anteras y un valor de 9 corresponde a una planta completamente androfértil, como se esperaría en un citoplasma normal. Los cruzamientos de prueba dieron como resultado plantas divulgadas en el presente documento que mostraron un valor de 7 o más, preferentemente incluso un valor de 8 o más o casi regularmente un valor de 9.
En Alemania, la susceptibilidad al cornezuelo de nuevas variedades de centeno se somete a prueba en experimentos de campo con inoculación artificial durante varios años y en diferentes ubicaciones. La evaluación de la susceptibilidad al cornezuelo se basa en un sistema de clasificación de 1 (muy baja susceptibilidad) a 9 (muy susceptible). Como se representa en la tabla 3, las variedades híbridas que portan un gen de restauración de los donantes IRAN IX, Pico Gentario o Altevogt 14160 (n.° 1 - n.° 4) muestran una infestación significativamente reducida con patógenos de cornezuelo (Claviceps purpurea) debido a la excelente liberación de polen.
Tabla 3. Niveles de expresión para la susceptibilidad al cornezuelo para cuatro variedades híbridas que portan genes de restauración de los donantes IRAN IX, Pico Gentario o Altevogt 14160 (mitad izquierda; n.° 1 a n.° 4) y para cuatro variedades híbridas con otros sistemas de restauración (mitad derecha).
Figure imgf000026_0001
En el contexto de las determinaciones especiales de la cosecha, el MRI (Instituto Max Rubner, Instituto Federal de Investigación para la Nutrición y Alimentación alemán) registra regularmente datos de infestación por cornezuelo de la cosecha de centeno en la agricultura alemana. Las propias evaluaciones de estos datos muestran que la incidencia de cornezuelo se puede reducir a más de la mitad si, en lugar de utilizar variedades híbridas con un nivel de expresión de 5 a 6 variedades, se emplean variedades con un nivel de expresión de 3-4 que sean significativamente menos susceptibles al cornezuelo.
Ejemplo 9: comparación estructural de r fpla y rfplb a nivel de ADN y de aminoácidos:
las comparaciones estructurales de r fpla y rfplb a nivel de ADN (tabla 4) y de aminoácidos (tabla 5) muestran un grado de correspondencia comparativamente alto entre IRAN9 natural no restaurado y restaurado. De forma sorprende, sin embargo, r fpla y rfplb de IRAN9 muestran una concordancia muy baja con solo un 76 % a nivel de ADN y solo un 66 % o un 68 % a nivel de proteína, aunque ambos tienen un efecto mediador de la restauración. Esto muestra que la idoneidad de las proteínas mTERF para restaurar la androfertilidad es posible en una amplia variabilidad estructural.
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000026_0003
Ejemplo 10: evidencia de la capacidad de restauración de los genes r fpla y rfplb individualmente y en combinación, así como de diferentes fuentes:
la tabla 6 muestra claramente que las plantas con cruzamientos de prueba que están equipadas con una sola copia, r fpla o rfplb, presentan una liberación de polen y un tamaño de antera ligeramente inferior, pero, en general, completamente adecuados, en comparación con las plantas que poseen ambas copias.
Tabla 6. Clasificación de anteras de acuerdo con Geiger y Morgenstern (1975) de plantas con cruzamientos de rueba Tx... con diferentes e ui os de co ias de rf 1:
Figure imgf000026_0004

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Oligonucleótido que presenta una de las siguientes secuencias de nucleótidos:
(i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o un complemento de la misma, o
(ii) SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o un complemento de la misma.
2. Molécula de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
(i) secuencia de nucleótidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 28,
(ii) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29,
(iii) secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii), (iv) secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de acuerdo con (iii) en condiciones rigurosas, (v) secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 90% con respecto a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con (i) o (ii),
(vi) secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90% con respecto a la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29.
3. Casete de expresión, ADN recombinante o vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Célula huésped o célula vegetal que comprende el casete de expresión, el ADN recombinante como transgén o un vector de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Una planta transgénica o semillas de la misma que comprende una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Proteína que se codifica por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90% con respecto a la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 29.
7. Procedimiento para producir una planta del género Secale que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa, que comprende (A) la eliminación de uno o más intervalos cromosómicos que contienen uno o más de los locus marcadores del donante IRAN IX, Pico Gentario o Altevogt 14160 seleccionados de 7_01_H_1441 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 12 y 13), ctg24met2a5 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 14 y 15) o ctg32 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 16 y 17), del genoma de una planta, o (B) la introducción de un segmento cromosómico que presenta al menos la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, que puede mediar en el rasgo de restauración, comprendiente tanto (A) como (B) las siguientes etapas (I)-(VII):
(I) proporcionar una parte de una planta como estructura diana que contiene una región diana de ácido nucleico; (II) proporcionar una o más construcciones recombinantes que, en conjunto, comprenden o codifican los componentes de la herramienta de modificación del genoma;
(III) proporcionar al menos un vector para introducir la(s) construcción/construcciones recombinante(s);
(IV) proporcionar al menos una construcción recombinante adicional que comprenda la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, el ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o el segmento cromosómico para la reparación dirigida por homología dirigida de la región diana de ácido nucleico en la estructura diana vegetal o inserción en la región diana de ácido nucleico en la estructura diana vegetal;
(V) transformar las construcciones recombinantes de (II) y (IV) en la estructura diana vegetal;
(VI) cultivar la estructura diana vegetal en condiciones que activan los componentes de la herramienta de modificación del genoma y permitir, de este modo, un cambio dirigido de la región diana de ácido nucleico en la estructura diana vegetal para obtener una estructura diana vegetal, que comprende al menos una célula que comprende el cambio dirigido de la región diana de ácido nucleico; y
(VII) regenerar una planta a partir de al menos una célula.
8. Procedimiento para producir una planta transgénica que presenta un rasgo de restauración recién mediado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa o un rasgo de restauración mejorado para la fertilidad del polen para la androesterilidad citoplasmática (CMS) de tipo Pampa en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena y/o presenta una resistencia recién mediada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.), o una resistencia incrementada a un patógeno, preferentemente a un hongo, en particular, al hongo Claviceps purpurea (Fr.) en comparación con una planta natural no mutada, que de otro modo es isógena, que comprende las siguientes etapas:
A) proporcionar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, el casete de expresión o el ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, o proporcionar el vector de acuerdo con la reivindicación 3, B) transformar al menos una célula vegetal mediante la introducción de la molécula de ácido nucleico, el casete de expresión, el ADN recombinante o el vector de A), y
C) regenerar plantas transgénicas a partir de la al menos una célula vegetal transformada de B).
9. Procedimiento para detectar una planta de la especie Secale cereale que es adecuada, como progenitor de polen masculino, para restaurar la fertilidad del polen para la P-CMS, en el que, en una planta híbrida derivada de un cruzamiento con un progenitor con CMS femenino, un arrastre por ligamiento de otro modo acoplado con el rasgo de restauración está reducido o completamente suprimido, que comprende la etapa de detectar, en la planta, alelos de al menos dos marcadores provenientes de un donante seleccionado del grupo que consiste en IRAN IX, Pico Gentario y Altevogt 14160, en el que
(i) al menos un marcador está localizado sobre o en el intervalo cromosómico entre tc256739 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 21 y 22) y ctg2 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 4 y 5) y al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre ctg16b (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 10 y 11) y 7_01_H_1441 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 12 y 13), o
(ii) al menos un marcador está localizado sobre o en el intervalo cromosómico entre ctg32 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 16 y 17) y ctg2 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 4 y 5) y al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre ctg16b (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 10 y 11) y tc300731 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 23 y 24), o
(iii) al menos un marcador está localizado sobre o en el intervalo cromosómico entre ctg32 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 16 y 17) y c40745_1 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 18 y 19) y al menos un marcador sobre o en el intervalo cromosómico entre 7_01_H_1441 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 12 y 13) y tc300731 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID NO: 23 y 24).
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