JP4592954B2 - グルホシネート耐性イネ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特にＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にある、イネゲノム中の特定の場所の、bar遺伝子の存在による特定の形質転換イベントを有することにより特徴づけられるイネ植物、植物材料及び種子に関する。本発明のイネ植物は、グルホシネート耐性と最も望ましい全体的な農業的性能、すなわち遺伝的安定性及び異なった遺伝的背景に対する適合性とを兼ね備えている。
【０００２】
ここで指摘する全ての文献は、ここに、参考文献によってこの文章中に組み込まれる。
【０００３】
【従来の技術】
植物における導入遺伝子の表現型の発現は、遺伝子そのものの構造及び該植物ゲノム中でのその位置によって決定される。同時に、ゲノム中における異なる位置の導入遺伝子の存在は、その植物の表現型全般に影響し得る。遺伝的操作によって、植物において、商業的に興味深い形質の農業上又は産業上の首尾よい導入は異なる要因に依存して、非常に長い手順になり得る。遺伝的に形質転換された植物の実際の形質転換及び再生は、広範囲にわたる遺伝的特徴づけ、育種及び圃場試験における評価を含む、一連の選択段階の最初に過ぎない。
【０００４】
米の生産は、共通して種々の雑草の脅威にさらされる。それらの中には、競争力が強く、激しく繁茂した場合は、その作物を経済的に魅力のないものにしてしまうほどの収穫減という結果になり得る。温帯生産に典型的な、直播の、機械化されたイネ栽培にとって、栽培技能（例えば、輪作、潅漑管理）及び除草剤が雑草の制御のために不可欠である（Hill et.al）。
【０００５】
ｂａｒ遺伝子（Thompson et al, 1987, EMBO J. 6:2519-2523;Deblock et al. 1987, EMBO J. 6:2513-2518）は、ホスフィノスリシン・アセチル化トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードしている遺伝子であり、それが植物中で発現すると、除草剤化合物ホスフィノスリシン（グルホシネートとも呼ばれる）又はバイアラホス（例えば米国特許第５６４６０２４号及び第５５６１２３６号も参照のこと）及びそれらの塩及びそれらの光学異性体に対する耐性を与える。ＰＡＴをコードする他の遺伝子は既に記載されている（例えば：Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37; EP 275957; US 5276268; US5637489; US5273894を参照のこと）。
【０００６】
密集した胚カルスを形成することができる完全な組織又はそのような組織から得られた密集したカルスのエレクトロポレーションによる単子葉植物の形質転換は米国特許第５６４１６６４号に記載されている。ここに、ｂａｒ遺伝子のエレクトロポレーションによるイネ密集胚カルスの形質転換及びトランスジェニックイネ植物の再生が開示されている。
【０００７】
ＤＮＡでコートした金粒子と一緒の爆発による未成熟イネカルスの細胞の形質転換によって得られた、ｂａｒ遺伝子又はハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇ遺伝子と一緒にｇｕｓ遺伝子を含む、トランスジェニックイネ植物が、記載されている（Christou et al,:1991: Biotechnology 9:957）
【０００８】
集合懸濁細胞のエレクトロポレーションによるイネのｂａｒ遺伝子での形質転換は、米国特許第５６７９５５８号に記載されている。
【０００９】
しかしながら、前述の文献は、本発明を教示又は示唆するものではない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明のまとめ
本発明は、以下の特徴：
ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、
ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片；
ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである一対のＢａｍＨＩ断片；
iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そして他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥｃｏＲＶ断片；
iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、１つのＨｉｎｄIII断片；
ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片；
vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである、１つのＮｓｉＩ断片；
（ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３２７bp断片とハイブリダイズすることができる）
の群から選択される制限断片の１つ以上、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましくは６つを生じることができ、及び／又は、
ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用いることができる（又は、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅された約２９０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を含む）
の片方又は両方によって特徴づけられるトランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１１】
本発明は、その植物、細胞、組織又は種子が、上のｉ）、ii）、iii）、iV）及びvi）に記載された制限断片又は制限断片対（ここで、選択は、上のｉ）、ii）、iii）、iV）及びvi）のいかなる組合わせも含むことができる）を含む上記の群から選択される、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましくは６つを生じることができることを特徴とする、トランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１２】
本発明は、好ましくは上記ａ）及びｂ）に記載された特長の両方によって特徴づけられる、トランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１３】
本発明は、ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子、この種子から育成された植物、及びこの種子から育成された植物の細胞又は組織にも関する。
【００１４】
本発明は、さらに、ここで議論した３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子フランキング領域（ここで議論した）のその間を含む植物、種子、細胞もしくは組織（例えば、イネ植物、種子、細胞又は組織）、又は、ここに開示した、フランキング領域−３５Ｓ−bar、遺伝子−フランキング領域構築物、又は挿入領域のような配列の、少なくとも６５％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは９７％でもよく、又は１００％同じヌクレオチド配列を含む植物、種子、細胞又は組織（例えばイネ植物、種子、細胞又は組織）にも関する。
【００１５】
本発明は、さらに上記の本発明のイネ植物の栽培方法、さらに特定すると、グルホシネートを活性成分とする除草剤を栽培されるイネ植物に施すことを含む方法に関する。
【００１６】
本発明のイネ植物は、グルホシネートを活性成分とする除草剤を施す上記の方法に従って栽培された場合、同じ栽培種の形質転換されていないイネに比較して改善された成長を示すことが確かめられている。したがって、本発明は、イネ植物の生産力又は成長を改善するための方法であると解することができる。
【００１７】
本発明は、本発明のイネ植物との交雑を含む、イネの育種方法も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号９を特徴とする、イネ細胞の染色体ＤＮＡの一部への、組み換えＤＮＡ分子の挿入、及び場合により、該形質転換イネ細胞からのイネ植物の再生を含む、イネ植物のトランスジェニック細胞又はそれから得られる植物体の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、トランスジェニック植物又はその細胞若しくは組織を同定する方法であって、該方法が、トランスジェニック植物、細胞又は組織のゲノムＤＮＡが以下の特徴：
ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、
ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片；
ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである一対のＢａｍＨＩ断片；
iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そして他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥｃｏＲＶ断片；
iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、１つのＨｉｎｄIII断片；
ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片；
vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである、１つのＮｓｉＩ断片；
（ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３２７bp断片とハイブリダイズすることができる）
の群から選択される制限断片又は制限断片対の少なくとも３つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましくは６つを生じることができ、及び／又は、
ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用いることができる
の片方又は両方を確認することを含む方法にも関する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の選ばれた事項を含むトランスジェニック植物を同定するためのキットであって、該キットが、ＰＣＲ同定プロトコル中で用いる、外来ＤＮＡを認識するＰＣＲプローブ及びＧＡＴ−ＯＳ２の３′又は５′フランキング配列、好ましくは、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有するプローブを含むキットに関する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
以下の、実施例によって説明されるが、本発明を記載された特定の実施態様に限定しようとするものではない、詳細な説明は、参照として組み込まれる、付随している図と関連して理解されなければならない。
【００２２】
詳細な説明
ここで用いられる用語「遺伝子」は、一緒になってプロモーター領域を形成するプロモーター及び５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）、コーディング領域（タンパク質をコードしていてもしていなくてもよい）、及びポリアデニル化部位を含む非翻訳３′領域（３′ＵＴＲ）のような、作動可能に連結された数個のＤＮＡ断片を含むいかなるＤＮＡ配列をもいう。典型的に植物細胞中においては、５′ＵＴＲ、コーディング領域及び３′ＵＴＲは、タンパク質をコードしている遺伝子である場合にはタンパク質に翻訳されるＲＮＡに転写される。１つの遺伝子は例えばイントロンのような付加的なＤＮＡ断片を含んでもよい。ここで用いられているように、遺伝子座とは、ある遺伝子の植物のゲノムにおける位置である。
【００２３】
遺伝子又はＤＮＡ配列に対していう場合の「キメラ」は、その遺伝子又は配列が、（プロモーター、５′ＵＴＲ、コーディング領域、３′ＵＴＲ、イントロンのように）少なくとも２つの機能的に関係のあるＤＮＡ断片であって、天然では互いに関連しておらず、例えば他の材料に由来するものを含んでいるという事実に言及するのに用いられる。植物種に関する遺伝子又はＤＮＡ配列についての「外来」は、その植物種に天然では発見されない遺伝子又はＤＮＡ配列を示すために用いられる。
【００２４】
ここで用いられているように、用語「導入遺伝子」とは、植物のゲノムに組み込まれた組み換えＤＮＡ分子をいう。用語「組み換えＤＮＡ分子」は、組み換え又は他の手順で得ることができる、ＤＮＡであり得るような、単離された核酸分子を含むことができ、かつ例証するために用いられる。この組み換えＤＮＡ分子は、通常、形質転換された植物に１つ以上の特徴を与えることができる、少なくとも１つの「問題の遺伝子」（例えばキメラ遺伝子）の少なくとも１つのコピーを含む。「トランスジェニック植物」は、その全ての細胞のゲノムに導入遺伝子を含む植物をいう。
【００２５】
組み換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組み込みは、典型的には細胞又は組織の形質転換（又は他の遺伝的操作）から結果として生じる。組み込みの特定の部位は、機会又は予め決定された場所（もし標的を定めた組み込み法が用いられた場合は）による。
【００２６】
導入遺伝子は、場所及び植物ゲノム中における組み換えＤＮＡ分子の組み込み部位の相対的位置によって特徴づけられる。導入遺伝子が挿入されている植物ゲノム中での部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」として言及されている。導入遺伝子の植物ゲノム中への挿入は、その植物ＤＮＡの欠失と関連しており「標的部位欠失」として言及されている。ここで用いられているように、「フランキング領域」又は「フランキング配列」は、導入遺伝子のすぐ上流でかつ隣接しているか、又はすぐ下流でかつ隣接している少なくとも２０bp、好ましくは５０bp、及び５０００bpまでの植物ゲノムの配列をいう。導入遺伝子のランダム組み込みに先行する形質転換手順は、特徴づけられ、それぞれの形質転換体に独特の、異なるフランキング領域を有する形質転換体を生ずる。伝統的な交配によって導入遺伝子が植物に導入された場合、植物ゲノムにおけるその挿入部位又はそのフランキング領域は一般的に変化しないであろう。ここで用いられているように、「挿入領域」は、その挿入部位（及び起こり得る標的部位の欠失）、及びその（まだ形質転換されていない）植物ゲノムにおける導入遺伝子の上流及び下流フランキング領域、によって囲まれた領域に相当する領域をいう。
【００２７】
導入遺伝子の表現は、該導入遺伝子に含まれる問題の遺伝子（単数又は複数）が、該植物に１つ以上の形態的形質（その形態的形質は、形質転換で用いられる組み換えＤＮＡ分子−形質転換するＤＮＡ（問題の遺伝子（単数又は複数）の一部又は全部の構造及び機能を基礎として）の導入によって与えられようとされていたものである）（例えば除草剤耐性）を与えるように発現されることを示すために用いられる。
【００２８】
イベントは、遺伝的操作の結果、問題の遺伝子の少なくとも１コピーを含む導入遺伝子を有する（人工的な）遺伝子座として定義される。１つのイベントの典型的な対立遺伝子の状態は、導入遺伝子の存在又は不存在である。イベントは、導入遺伝子の発現によって形態的に特徴づけられる。分子レベルでは、イベントは制限地図（例えばサザンブロッティングによって決定されるようなもの）及び／又は導入遺伝子の上流及び／若しくは下流及び／又は該導入遺伝子の分子の相対的位置によって特徴づけられる。通常、問題の遺伝子の少なくとも１つを含む形質転換する遺伝子による植物の形質転換は、其々が独特な、多数のイベントへと導かれる。
【００２７】
ここで用いられる、エリートイベントは、同じ形質転換ＤＮＡでの形質転換により得られるイベントの群から、該導入遺伝子の発現及び安定性、及びそれを含む植物の最も望ましい農業的特長に基づいて選択されるイベントである。エリートイベントの選択のための規準は、以下：
ａ）導入遺伝子の存在が、農業的性能又は商業的価値のような、該植物の他の望ましい特徴を損なわないこと；
ｂ）該イベントが、安定に遺伝し、同一性管理のための適当な診断ツールが開発できる、よく定義された分子構成によって特徴づけられること；
ｃ）ヘテロ接合体（又は半接合体）及びホモ接合体のイベント状態のどちらにおいても、そのイベントを有する植物が正常な農業的使用において暴露されるような環境状態の範囲における商業的に許容しうるレベルで、導入遺伝子中の問題の遺伝子（単数又は複数）が、正しい、適切なそして安定な空間的及び時間的な形態発現を示すこと；
の１つ以上、好ましくは２つ以上、有利には全てである。
【００３０】
導入遺伝子は、好ましい商業的な遺伝的背景への遺伝子移入を可能とする植物ゲノム中の位置と結び付いていることが望ましい。エリートイベントとしてのイベントの状態は、異なった、相当する遺伝的背景中への、該エリートイベントの遺伝子移入及び例えば上記ａ）、ｂ）及びｃ）の規準の１つ、２つ又は全てに従っていることの観察によって確認される。
【００３１】
したがって、「エリートイベント」は、上記の規準に一致する導入遺伝子を含む遺伝子座をいう。植物体、植物材料又は種子のような後代は、そのゲノム中に該エリートイベントを含む。
【００３２】
エリートイベント又はエリートイベントを有する植物若しくは植物材料を同定するために開発された診断ツールは、該導入遺伝子を含むゲノム領域の特定の制限地図及び／又は該導入遺伝子のフランキング領域（単数又は複数）の配列等の、当該エリートイベントの特定の遺伝的特徴に基づいている。ここで用いられる「制限地図」は、特定の制限酵素又は制限酵素のセットで植物ゲノムＤＮＡを切断し、、該導入遺伝子と配列類似性を共有するプローブとの（特定の条件下における）ハイブリダイゼーションをした後に得られるサザンブロットパターンのセットをいう。導入遺伝子の組み込み前に植物ゲノム中に存在する（内因的な）制限部位により、導入遺伝子の挿入は、そのゲノムの特定の制限地図を変えるであろう。このように、特定の形質転換体又はそれに由来する後代は、１つ以上の特定の制限パターンによって同定され得る。１つのイベントの制限地図を決定する条件は、制限地図同定プロトコル中に示されている。
【００３３】
代替的には、エリートイベントを含む植物又は植物材料は、ＰＣＲ同定プロトコルによる試験で同定することができる。これは、該エリートイベントを特異的に認識するプライマーを用いるＰＣＲである。要するに、プライマーの１セットは、
ａ）エリートイベントの３′又は５′フランキング配列、及び
ｂ）外来のＤＮＡ中の配列
を認識し、それらのプライマーは、好ましくは１００〜３５０ヌクレオチドの断片（組み込み断片）を増幅するように開発される。好ましくは、該植物種の管理維持遺伝子中の断片を増幅するプライマーの１セットとしての対照が含まれる（断片は好ましくは増幅された組み込み断片よりも大きいものである）。該特異的プライマーの配列を含む、ＰＣＲに最も好ましい条件は、ＰＣＲ同定プロトコル中に特定されている。
【００３４】
例えば、ヌクレオチド配列に関する、用語「類似性」は、２つの配列間のホモロジーの量的測定を示すことを目的とする。配列類似性百分率は、
（Ｎref−Ｎdif）＊１００／Ｎdif
〔式中、Ｎdifは、並べたときに２つの配列中の非同一塩基の合計数であり、Ｎrefは、一方の配列中の塩基の数である〕
のように計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと、７５％の類似性を有することとなる（Ｎref＝８、Ｎdif＝２）。本発明は、核酸分子及び、ここに開示されている配列と、少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８０％又は有利には少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又はさらに９７％若しくは１００％の類似性を有する配列、並びにそのような核酸分子を含有する植物、細胞、組織、種子、及びその後代（例えば、イネ植物、細胞、組織、種子及びその後代）を包含する。代替的に、又は加えて、配列についての「類似性」は、２つの配列のうちの短いほうのヌクレオチド数によって分割される同一のヌクレオチドの位置の数に関係する（ここで、２つの配列の並び（アラインメント）は、読み枠サイズ２０ヌクレオチド、１単語長さ４ヌクレオチド、ギャップペナルティ４を用いたWilburとLipmannのアルゴリズム（Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726）にしたがって決定することができ、コンピュータ支援解析及び並びを含めた配列データの解釈は、Intelligenetics（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Intelligenetics 社、CA）のプログラムを用いて簡便に実施することができる）。「本質的に類似の」配列は、少なくとも約７５％、有利には少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、特に約９５％、例えば少なくとも９７％、及び特に約１００％の配列の類似性又は同一性を有する。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似する、又は類似するという場合には、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考慮される。
【００３５】
本発明は、イネにおけるエリートイベント、ＧＡＴ−ＯＳ２、このイベントに由来する植物、植物材料又は植物細胞に関する。エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含有する植物は、実施例１に記載するように、プラスミドｐＢ／３５Ｓｂａｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片（配列番号８）での形質転換を通じて得られる。このエリートイベントをつくり出すために用いられる組み換えＤＮＡ分子は、酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ及びカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを含む（ここで、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする配列は、（「３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子」と称する）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの調節下にある）。３５Ｓプロモーターは、イネにおいて「構成的」発現パターンを有し（Battraw et al., 1990, Plant Mol Biol 15:527-538）、それは、ほとんどの植物において、植物ライフサイクルのほとんどの間、著しく発現することを意味する。イネ植物における３５Ｓ−ｂａｒの発現は、除草剤化合物ホスフィノスリシン又はバイアラホス又はグルホシネート又はより一般的にはグルタミンシンテターゼ阻害剤又はその塩若しくは光学異性体に対する耐性を与える。
【００３６】
ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（１）に記載された制限地図同定プロトコルにしたがって同定することができる。簡単には、イネゲノムＤＮＡを、以下の制限酵素：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩの選択（好ましくは少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、例えば３つから６つ）で消化し、ナイロンメンブレン上にトランスファーし、プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの約１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズする。次に、用いたそれぞれの制限酵素について以下の断片：
・ＥｃｏＲＩ：約１１５９〜１７００bpの、好ましくは約１３２７bpの１つの断片
・ＢａｍＨＩ：約１７００bp〜２１４０bpの、好ましくは約２．０kbpの１つの断片及び約８０５〜１０９３bpの、好ましくは約８０５bpの１つの断片
・ＥｃｏＲＶ：約５０７７bpより大きい、好ましくは約１２kbpの１つの断片及び約２８３８〜４５０７bpの、好ましくは約３．８kbpの１つの断片
・ＨｉｎｄIII：約５０７７〜１１４９７bpの、好ましくは約５．３kbpの１つの断片
・ＮｃｏＩ：約２８３８〜約４５０７bpの、好ましくは１つが約４．１kbpであり１つが約３．１kbpである２つの断片
・ＮｓｉＩ：約４７４９〜約１１４９７bpの、好ましくは約５．１kbpの１つの断片
が同定されるかどうかを測定する。ＤＮＡ断片の長さは公知の長さのＤＮＡ断片のセット、特にファージλＤＮＡのＰｓｔＩ断片との比較で測定される。
もし、これらの制限酵素の、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好ましくは全てで消化した後の植物材料が、上に記載したものと同じ長さのＤＮＡ断片を生ずるならば、該イネ植物は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００３７】
ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（２）に記載されたＰＣＲ同定プロトコルにしたがって同定することもできる。簡単には、ＧＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識するプライマー、特に配列番号５の配列のプライマー、及び導入遺伝子中の配列を認識するプライマー、特に配列番号４の配列のプライマーを用いて、イネゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅する。内因性のイネプライマーを対照として用いる。もし、植物材料が、約２９０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpの断片を生ずれば、該イネ植物はエリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００３８】
ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、それらのグルホシネート耐性によっても特徴づけられ、それは本発明の文脈において、植物が、除草剤Liberty（登録商標）に対して耐性であることを含んでいる。Liberty（登録商標）に対する耐性は、３〜４葉の段階で２００g活性成分/ヘクタール（g.a.i/ha）、好ましくは４００g.a.i/ha、そして可能ならば１６００g.a.i/haまでの噴霧が、該植物を殺さないという規準で決定される。ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、さらにその細胞中の、ＰＡＴアッセイ（De Block et al, 1987, supra）で測定されるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼの存在によって特徴づけられる。
【００３９】
ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、例えばＡＴＣＣにＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託されている種子から得ることができる。そのような植物は、従来の育種スキームにおいて、同じ特徴についてさらに形質転換された植物を作るため、又は同じ植物種の他の栽培種に本発明のエリートイベントを導入するために、さらに増殖及び又は使用することができる。これらの植物から得られた種子は、それらのゲノムに安定に組み込まれるエリートイベントを含んでいる。
【００４０】
本発明のイネ植物は、従来の方法で栽培することができる。導入遺伝子の存在は、それらがグルホシネートに対して耐性であることを確保する。したがって、そのようなイネ植物が育成される圃場中の雑草は、グルホシネートを活性成分として含有する除草剤（Liberty（登録商標）のような）の適用によって調節することができる。
【００４１】
ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、以下の市場で入手可能な米国におけるイネ品種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と同様の農業的特長によって特徴づけられる。関連する農業的特長は、植物丈、穂の強度／硬直性、耐倒伏性、葉形態（長さ、幅、刀状葉片の角度）、成熟までの期間、小花の構成、多穂、種子外皮の完全閉覆、穀粒サイズ及び形状、及び穀粒生産及び収量である。
【００４２】
イネ植物ゲノムのこの領域、さらに詳しくはイネ植物ゲノムにおけるこの部位における導入遺伝子の存在が、このイベントに対して特定の問題とする表現型の又は分子レベルでの特徴を与えることが観察されている。さらに詳細には、ゲノム中のこの特定部位の導入遺伝子の存在が、該植物の望ましい農業的性質のいかなる側面も有意に損なうことのない、導入遺伝子の安定した表現型発現を生じさせるのである。このように、配列番号９に相当する挿入領域、さらに詳しくはその中のＧＡＴ−Ｓ２の挿入部位は、除草剤抵抗性遺伝子、さらに特定すると３５Ｓプロモーターの調節下のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、特にプラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片のような、問題の遺伝子（単数又は複数）の導入に特に適切であることが示されている。
【００４３】
組み換えＤＮＡ分子はこの挿入領域に標的挿入法を用いて特異的に挿入され得る。そのような方法は、当業者によく知られており、例えば、限定されるものではないが、Saccharomyces cervisiae 由来のＦＬＰリコンビナーゼ（米国特許第５５２７６９５号）、Escherichia Coli ファージ Ｐ１由来のＣＲＥリコンビナーゼ（公開されたＰＣＴ出願明細書ＷＯ９１０９９５７）、Saccharomyces rouxiiのｐＳＲＩ由来のリコンビナーゼ（Araki et al., 1985, J Mol Biol 182:191-203）、又は米国特許第４６７３６４０号に記載されているようなλファージ組み換え系を用いた相同性組み換えを含む。
【００４４】
ＤＮＡは、エレクトロポレーション法、ＤＮＡで被覆した金粒子又は生分解性物質の火薬打ち込み法、又はアグロバクテリウム若しくはポリエチレングリコール媒介法等の方法を含む技術によって、イネゲノム等の植物ゲノム中に挿入することができる。
【００４５】
ここで用いる「含む」は、言及された特長、整数、関連する工程又は成分の存在を定義するが、１つ以上の特徴、整数、工程若しくは成分、又はそれらの群の存在又は添加を排除しないというように解釈される。したがって、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又はタンパク質は、実際に指摘したよりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでもよく、すなわち、より大きい核酸又はタンパク質に埋め込まれていてもよい。機能的に又は構造的に定義されるＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、付加的なＤＮＡ配列等を含んでいてよい。
【００４６】
以下の実施例は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有するイネ植物の開発及び特徴を記載している。
【００４７】
特に述べる場合を除き、全ての組み換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY 及びAsusubel et al.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA の第１巻及び第２巻に記載された標準プロトコルにしたがって実施した。植物分子実験のための標準材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK) 及び Blackwell Scientific Publications, UK によって出版された、R.D.D. Croy による、Plant Molecular Biology Labfax (1993) に記載されている。
【００４８】
発明の詳細な説明及び実施例において、以下の配列の参照事項を述べる：
配列番号１： ＧＡＴ−ＯＳ２の５′フランキング領域を含む配列である
配列番号２： ＧＡＴ−ＯＳ２の３′フランキング領域を含む配列である
配列番号３： ＧＡＴ−ＯＳ２の挿入部位を含む配列である
配列番号４： ＯＳＡ０３：ＰＣＲ同定プロトコルのプライマーである
配列番号５： ＯＳＡ０４：ＰＣＲ同定プロトコルのＧＡＴ−ＯＳ２特異的プライマーである
配列番号６： ＯＳＡ０１イネ内因性プライマーである
配列番号７： ＯＳＡ０２イネ内因性プライマーである
配列番号８： プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒである
配列番号９： 挿入領域である
【００４９】
【実施例】
実施例１ 除草剤抵抗性をコードする遺伝子でのイネの形質転換
ａ）３５Ｓプロモーターの調節下のbar遺伝子を含むキメラＤＮＡ（ｐＢ５／３５Ｓｂａｒ）の構築
【００５０】
プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒを、以下の標準プロトコルに従って構築した。プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの配列は、配列番号８に与えられている。ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII消化によって、以下の遺伝的要素を含む１５０１bpの断片が生じた。
【００５１】
【表１】
【００５２】
該１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片は、電気泳動後のこの断片の抽出によって精製した。
【００５３】
ｂ）イネの形質転換
ベンガル品種は、ルイジアナ農業研究所のイネ研究所が開発した中粒イネである。該品種は１９９２年に公的に開放された。来歴にはＭＡＲＳ及びＭ２０１（linscombe S.D. et al. 1993, Crop Science: 33: 645-646）が含まれている。
【００５４】
ｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片でのイネ植物の形質転換は、直接ＤＮＡ移入を用いて実施した。選抜は、生育を加速するためにＰＰＴ不存在において行った幼植物の再生段階を除く、全ての段階でホスフィノスリシン（ＰＰＴ）について行った。その結果、最初の形質転換体のセット（世代Ｔ0の植物）を生じた。
【００５５】
実施例２ イベントの開発
ａ）トランスジェニックホモ接合体系統の開発
種々のＴ0半接合体幼植物を組織培養から転化し、温室土壌に移し、開花及び結実を可能にした。幼植物を、ねん性、生産力、及びアンモニアグルホシネートに対する耐性について評価した。自家受粉によるＴ1種子をこれらの植物体から集め、圃場で生育した。Ｔ1植物にLiberty（登録商標）除草剤を１ヘクタールあたり活性成分８００g（g.a.i./ha；農家への推奨用量は４００g.a.i./ha）で噴霧した。除草剤の適用を生き延びたイベント及び除草剤耐性について３：１に分離したイベントを更なる評価のために選抜した。耐性植物は、損傷（葉先端枯れ）について評価した。
【００５６】
Ｔ2種子は選抜されたイベントの全ての耐性植物の穂から収穫した。それらを列に蒔き、除草剤耐性の分離を評価するため、Ｔ2植物にLiberty（登録商標）除草剤（１６００g.a.i／ha）を噴霧した。１００％の生存を有した列、すなわち導入遺伝子についてホモ接合体である系統に相当する列を選抜した。それらを除草剤損傷および表現形質について再び評価した。その穂系列の（望ましい特徴に関しての）表現型の均一性に基づいて更なるイベントの選択を行った。
【００５７】
ｂ）導入遺伝子のイベントの特徴づけ−ＧＡＴ−ＯＳ２の選択
導入遺伝子のイベントは、サザンブロットパターン、一般的形質及び農業的性質、そして収穫量についてさらに特徴づけられた。それが適切である場合には、それらの特徴は、圃場状態下で決定された。
【００５８】
サザンブロット解析
導入遺伝子の存在は、イネゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＶでの酵素消化産物及びｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とのハイブリダイゼーションを用いた標準的なサザンブロット解析によって確認した。関係するバンド強度は、導入遺伝子座について植物がホモ接合体であるか半接合体であるかについて示唆を提供した。２つのイベントは、単純な挿入であることがわかった。導入遺伝子の分離パターンは、単純な遺伝子座のメンデル遺伝によって説明できることが確認された。
【００５９】
Ｔ1及びＴ2植物を、植物丈、穂の強度／硬直性、倒伏性、葉形態（刀状葉片について、細すぎる又は異常な角度）、晩生、小花の構成、穂の不稔又は不完全稔性、種子外皮の不完全閉覆（病害感受性を増加させることにつながる）、穀粒サイズ及び形状、及び穀粒生産及び収量を含む、多くの表現形質について評価した。系統は、形質転換されていないベンガル品種及び以下のイネ品種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と比較して、提示された農業的特長において同様である（又は改善されている）ことが評価された。いくつかのケースにおいては、１つ以上の上述の形質について、１つの穂系列中の植物がソマクローナル変異に関して分離した。これが農業的に興味深い表現形質の導入という結果にならない限り、これらの植物体は、排除した。
【００６０】
収量評価のための圃場形質
Ｔ2種子を、選抜したホモ接合体集団からバルクで収穫し、標準品種ベンガルと比較した。種子を、穂系列としてそれぞれのイベントを表す隔離された区画に植えた。トランスジェニックの区画は、１６００g.a.i.／haのLiberty（登録商標）除草剤を噴霧するか、噴霧しなかった（「非噴霧」区画）。非トランスジェニック品種標準の区画は、Liberty（登録商標）を噴霧しなかった。その土地の雑草を調節するための標準除草剤処理を、全ての区画に適用した。
【００６１】
トランスジェニックイベントを、ルイジアナ及びプエルトリコ（冬季種苗場）を含む異なった場所で収量特性について試験した。
【００６２】
農業的パラメーター及び植物形態の順位統計の統計的解析、及び他の非パラメーターデータを、親品種ベンガル及び以下のイネ品種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と競争するための最適な商業的候補を同定するためにそろえた。ＧＡＴ−ＯＳ２が、育種系統の組を作るために最も有用であることを示すイベントであった。
【００６３】
実施例３ イベントＧＡＴ−ＯＳ２の特徴づけ
ａ）該遺伝子座の詳細な分子的及び遺伝学的解析
ＧＡＴ−ＯＳ２イベントが、導入遺伝子の発現並びに農業的性質全般が最良であるイベントであると同定されると、導入遺伝子の遺伝子座が分子レベルで詳細に解析された。これには、サザンブロット解析及び導入遺伝子のフランキング領域のシークエンスも含まれた。
【００６４】
（１）複数の制限酵素を用いたサザンブロット解析
葉組織をトランスジェニック植物及び対照植物から収穫した。Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21)にしたがって、葉組織から全ゲノムＤＮＡを単離した。吸光度計で２６０nmの波長の吸光度を測定することにより、それぞれの調製物のＤＮＡ濃度を測定した。
【００６５】
ゲノムＤＮＡ１０ngを、製造者の推奨条件を適用して最終反応量４０μlで制限酵素で消化した。消化の時間及び／又は制限酵素の量は、非特異的消化を伴わないゲノムＤＮＡの完全な消化を確実なものとするように調節した。消化の後、消化したＤＮＡサンプルに４μlの泳動用色素（loading dye）を添加し、１％アガロースゲル上に装填した。
【００６６】
以下の対照ＤＮＡもゲル上に装填した：
・非トランスジェニック植物から調製したゲノムＤＮＡの陰性対照
この陰性対照は、バックグラウンドハイブリダイゼーションがないことを確認するために用いられる。
・ＤＮＡ陽性対照：導入遺伝子をヘテロ接合のシングルコピーで組み込んだOryza sativaゲノムであり、ゲノムＤＮＡ１０μgは、ｐＢ５／３５ＳｂａｒＤＮＡの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片の±１９ピコグラムと同数の分子当量を有する（Oriza sativaの２倍体ゲノムサイズ：０．８×１０9bp）。ゲノム当り１コピーのプラスミドを示す量を、消化された非トランスジェニックOryza sativaＤＮＡ１μgに添加した。この再構成サンプルは、ハイブリダイゼーションがプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施されたことを示すために用いられた。
【００６７】
ＰｓｔＩで消化したファージλＤＮＡ（ＣＩｉｎｄ１ｔｓ８５７Ｓａｍ７株、Life Technologies）をサイズスタンダードとして含めた。
【００６８】
電気泳動の後、ＤＮＡサンプル（消化したイネゲノムＤＮＡ、対照、及びサイズスタンダード）を、１２〜１６時間のキャピラリーブロッティングでナイロンメンブレン上にトランスファーした。プローブの調製に用いたＤＮＡテンプレートは、プラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＥｃｏＲＩでの制限酵素消化物であった。これは、形質転換ＤＮＡ（１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片）に関係する部分を包含する１３２７bpのＤＮＡ断片を放出した。精製の後、ＤＮＡ断片を標準的な手順にしたがってラベルし、該メンブレンに対してハイブリダイズのために用いた。
【００６９】
ハイブリダイゼーションは、標準的なストリンジェント条件下で行った。ラベルしたプローブを９５℃〜１００℃のウォーターバス中で５〜１０分加熱して、氷上で５〜１０分冷却することにより変性し、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、ＮａＣｌ３．０Ｍ、クエン酸Ｎａ０．３M、pH７．０である）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液＝フィコール２％、ポリビニルピロリドン２％、ウシ血清アルブミン２％である）、ＳＤＳ０．５％及び変性したキャリアＤＮＡ（１本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長さ１２０〜３０００ヌクレオチド）２０μg／ml）に添加した。ハイブリダイゼーションは、６５℃で一晩行った。ブロットを洗浄溶液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で、６５℃、２０〜４０分で３回行った。
【００７０】
オートラジオグラフを、電子的にスキャンした。
異なった制限酵素でのＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡの消化後に得られた制限パターンを図１に示し、及びまとめを表１に示した。
【００７１】
【表２】
【００７２】
（２）フランキング配列の同定
ＧＡＴ−ＯＳ２イベント中の挿入された導入遺伝子のフランキング領域の配列を、Liu et al.（1995, The Plant Journal 8(3):457-463）により記載されたように、温度非対称組合わせ（ＴＡＩＬ−）ＰＣＲ法を用いて決定した。この方法は、連続する反応中で、３つの入れ子状態の特異的プライマーを、より短い任意の緩認識（arbitrary degenerate: AD）プライマーと一緒に、特異的及び非特意的産物の相対的増幅効率を温度で調節できるように用いる。特異的プライマーは、導入遺伝子の境界にアニーリングするように、そしてそれらのアニーリング条件に基づいて選択された。未精製第二及び第三ＰＣＲ産物の少量（５μl）を、１％アガロースゲル上で解析した。第三ＰＣＲ産物を、予備増幅に用い、精製してDyeDeoxy Terminator cycleキットを用いた自動シークエンサーでシークエンスした。
【００７３】
１．ＨｉｎｄIII部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ
使用したプライマー：
【００７４】
【表３】
【００７５】
ＭＤＢ５５６−ＭＤＢ４１１を用いて増幅した断片は、およそ４００bpであり、その１１３bpをシークエンスした（５′フランク：配列番号１）。bp１〜bp９２は、植物ＤＮＡを含んでおり、一方bp９３〜bp１１３は、ｐＢ５／３５ＳｂａｒのＤＮＡに相当する。
【００７６】
ＰｖｕＩ部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ
使用したプライマー：
【００７７】
【表４】
【００７８】
ＭＤＢ２８５−ＭＤＢ４１０を用いて増幅した断片は、およそ１２００bpであった（３′フランク：配列番号２）。bp１〜bp６０４は、ｐＢ５／３５ＳｂａｒのＤＮＡに相当し、bp６０５〜bp１２７９は植物ＤＮＡを含んでいる。
【００７９】
（３）標的部位欠失の同定
野生型Oryza sativa品種ベンガルにおける導入遺伝子のフランキング領域中の配列に相当するプライマーをテンプレートとして用い、導入遺伝子の挿入部位を同定した。
以下のプライマーを用いた：
【００８０】
【表５】
【００８１】
これは、bp８３〜５５が標的部位欠失に相当する、１６８bpの断片（配列番号３）を生じた。
【００８２】
したがって、シークエンスしたイネ挿入領域（配列番号９）は：
１〜９２： ５′フランキング領域 配列番号１のbp１〜９２
９３〜１１０： 標的部位欠失 配列番号３のbp３８〜５５
１１１〜７８５： ３′フランキング領域 配列番号２のbp６０５〜１２７９
を含む。
【００８３】
（４）該遺伝子座の遺伝的解析
挿入断片の遺伝的安定性を、数代に渡る後代植物における分子及び表現型解析で確認した。
【００８４】
Ｔ0、Ｔ1及びＴ2世代のＧＡＴ−ＯＳ２イネ植物のグルホシネート耐性植物のサザンブロット解析を比較し、同一であることがわかった。これは、ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物における導入遺伝子の分子構成が安定しているということを証明している。
【００８５】
ＧＡＴ−ＯＳ２イベントは、挿入断片が安定であることを示している少なくとも３つの連続する後代において、単一遺伝子座としての導入遺伝子についてメンデル分離を示している。
【００８６】
上記の結果に基づいて、ＧＡＴ−ＯＳ２は、エリートイベントであると同定された。
【００８７】
ｂ）同一性調節のための診断ツールの開発
該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むいかなるイネ植物材料をも同定するために以下のプロトコルが開発された。
【００８８】
（１）ＧＡＴ−ＯＳ２エリートイベント制限地図同定プロトコル
該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むイネ植物は、実施例３ａ）（１）に記載されたのと本質的に同じサザンブロッティングによって同定することができる。すなわち、イネゲノムＤＮＡを、以下：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩ、の制限酵素の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好ましくは全てで消化し、２）ナイロンメンブレン上にトランスファーし、そして３）プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。用いられたそれぞれの制限酵素について、もしＤＮＡ断片が表１に列記したそれらと同じ長さであると同定されれば、そのイネ植物は、該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００８９】
（２）エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２のポリメラーゼ連鎖反応同定プロトコル未知のもののスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照でテストランをしなければならない。示したプロトコルは、研究所によって異なるであろう成分（テンプレートＤＮＡの調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ、サーマルサイクラー等）について最適化が必要とされるであろう。
【００９０】
該プロトコルにおいて、内因性の配列の増幅が重要な役割を果たす。既知のゲノムＤＮＡテンプレート中の内因の及び導入遺伝子の配列の両方を等モルの量で増幅するＰＣＲ及び温度サイクル条件を得なければならない。アガロースゲル電気泳動で判断して、目的の内因性断片が増幅されない場合や、同じエチジウムブロミド染色強度で目的配列が増幅されない場合には、ＰＣＲ条件の最適化が必要とされよう。
【００９１】
テンプレートＤＮＡ
テンプレートＤＮＡは、Edwards et al.（Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991）に従って調製した。他の方法で調製したＤＮＡを用いる場合は、異なる量のテンプレートを用いたテストランをすべきである。通常、最高の結果で５０ngのＤＮＡテンプレートが得られる。
【００９２】
用いられる陽性及び陰性対照
以下の陽性及び陰性対照が、ＰＣＲの実施に含められるべきである：
＊マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応液にＤＮＡを添加しないＰＣＲである。期待される結果、すなわちＰＣＲ産物がないという結果が観察された場合、ＰＣＲカクテルが目的ＤＮＡで汚染されていないということを示している。
＊ＤＮＡ陽性対照（導入遺伝子を含むことがわかっているゲノムＤＮＡサンプル）。この陽性対照の成功した増幅は、ＰＣＲが、目的配列を増幅することができる条件下で行われたことを証明する。
＊野生型ＤＮＡ対照。これは、用いられたテンプレートＤＮＡが、非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。期待される結果、すなわち導入遺伝子のＰＣＲ産物の増幅がないが内因性ＰＣＲ産物の増幅があること、が観察された場合、これはゲノムＤＮＡサンプル中に、検出し得る導入遺伝子バックグラウンド増幅がないことを示す。
【００９３】
プライマー
導入遺伝子及びＧＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識する、以下のプライマーを用いた：
【００９４】
【化１】
【００９５】
内因性配列を標的とするプライマーは、ＰＣＲカクテル中に常に含まれている。これらのプライマーは、未知のサンプル中及びＤＮＡ陽性対照での内部対照として働く。内因性プライマーペアでの陽性の結果は、ゲノムＤＮＡの調製において、ＰＣＲ産物が作られるために適切な品質のサンプルＤＮＡが得られたことを証明する。用いられた内因性のプライマーは、以下のものである：
【００９６】
【化２】
【００９７】
増幅された断片
ＰＣＲ反応における、期待される増幅断片は、
プライマーペアＯＳＡ０１−ＯＳＡ０２について： ４５７bp（内因性対照）
プライマーペアＯＳＡ０３−ＯＳＡ０４について： ３１３bp（エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２）
である。
【００９８】
ＰＣＲ条件
５０μl反応のためのＰＣＲ混合液は：
テンプレートＤＮＡ ５μl
１０×増幅バッファー（Ｔａｑポリメラーゼとともに供給される） ５μl
１０mMｄＮＴＰ １μl
ＯＳＡ０１（１０pmol／μl） １μl
ＯＳＡ０２（１０pmol／μl） １μl
ＯＳＡ０３（１０pmol／μl） ２μl
ＯＳＡ０４（１０pmol／μl） ２μl
Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット／μl） ０．２μl
水で５０μlにするである。
【００９９】
【０１００】
アガロースゲル解析
１０〜２０μlのＰＣＲサンプルを、適当な分子量マーカー（例えば１００bpラダー ファルマシア）を備えた１．５％アガロースゲル（トリス−ホウ酸バッファー）上に装填する。
【０１０１】
結果の有効性
１つのＰＣＲ反応及び１つのＰＣＲカクテルに含まれるトランスジェニック植物ＤＮＡサンプルからのデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が期待されるＰＣＲ産物（導入及び内因性の断片）を示すこと、２）ＤＮＡ陰性対照が、ＰＣＲ増幅に対して陰性であること（断片なし）、及び３）野生型ＤＮＡ対照が期待される結果（内因性断片の増幅）を示すこと、なしには受け入れられない。
【０１０２】
期待されるサイズの導入及び内因性ＰＣＲ産物の可視量を示しているレーンは、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植物が、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有していることを示す。導入ＰＣＲ産物の可視量を示さず、内因性ＰＣＲ産物の可視量を示しているレーンは、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植物が、該エリートイベントを有していないことを示す。内因性及び導入ＰＣＲ産物の可視量を示していないレーンは、ゲノムＤＮＡの質及び／又は量が、ＰＣＲ産物を作ることができないものであることを示している。ゲノムＤＮＡの調製をくり返し、適切な対照といっしょの新しいＰＣＲ反応を実施しなければならない。
【０１０３】
ＧＡＴ−ＯＳ２を同定するための、弁別ＰＣＲプロトコルの使用
異なるトランスジェニックイベントを含む植物からのイネ葉材料（サンプル１〜１０）を、上述のプロトコルに従って試験した。Ｍ２０２野生型及びベンガル野生型からのサンプルを、陰性対照として採用した。
【０１０４】
ＰＣＲ解析の結果を、図２に示す。サンプル８及び９（実際には同じイベントに由来する植物からのＤＮＡを含んでいる）が、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含んでいると認識された。試験された他の全ての系統は、このエリートイベントを含んでいない。
【０１０５】
実施例４ 好ましい栽培種へのＧＡＴ−ＯＳ２の導入交雑
エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２は、反復戻し交雑により以下の栽培種に導入された：
＊カリフォルニア産温帯ジャポニカ種（Ｍ２０４、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３等であるが、これに限定されるわけではない）
＊カリフォルニア産熱帯ジャポニカ種（Ｌ２０１、Ｌ２０２等であるが、これに限定されるわけではない）
＊日本産及び韓国産温帯ジャポニカ種（コシヒカリ及びミリアン等であるが、これに限定されるわけではない）
＊オーストラリア産温帯ジャポニカ種（ミリン及びジャラー等であるが、これに限定されるわけではない）
＊地中海産温帯ジャポニカ種（バリラ、アルボリオ等であるが、これに限定されるわけではない）
＊中国産インディカ種（ギチャオ、コンギ３１４、テキン等であるが、これに限定されるわけではない）
＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種（ドゥルー、サイプレス、ジェファーソン、プリシラ、コッケイドー等であるが、これに限定されるわけではない）
＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種、中粒種（ベンガル、マース、ブラッツォ、マーキュリー等であるが、これに限定されるわけではない）
＊南アメリカ産熱帯ジャポニカ種、長粒種（エルパソ１４４、ＩＲＧＡ４０９等であるが、これに限定されるわけではない）
＊極東産バスマティ及びジャスミン型（カシミール、クワオダックマリ）
＊アフリカ産ジャバニカ型（青米種）
【０１０６】
これらの栽培種へのエリートイベントの導入は、これらの栽培種のいかなる望ましい表現型又は農業的特性にも重大に影響しておらず（連鎖障害なし）、一方グルホシネート耐性によって測定される導入遺伝子の発現は、商業的に受け入れられるレベルに合致していた。これは、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２の状況をエリートイベントとして確認するものである。
【０１０７】
上記請求項で用いられている通り、明確に示されている場合を除いて、用語「植物」は、限定されないいかなる種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを含む、成熟のいかなる段階の植物組織、並びに、いかなるそのような植物から採取した／に由来する、いかなる細胞、組織又は器官、をも包含することを意図する。
【０１０８】
エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含む種子は、ＡＴＣＣに番号：ＡＴＣＣ２０３３５２で、ＧＡＴ−ＯＳ２として寄託されている。
【０１０９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡ消化後に得られた制限地図である。
サザンブロットによって解析したゲルの装填順：レーン１、ＰｓｔＩで消化したλＤＮＡ、レーン２、ＥｃｏＲＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン３ＢａｍＨＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン４、ＥｃｏＲＶで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン５、ＨｉｎｄIIIで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン６、ＮｃｏＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン７、ＮｓｉＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン８、未トンスジェニックイネＤＮＡ、レーン９、ＥｃｏＲＩで消化した対照プラスミドＤＮＡ。
【図２】 ＧＡＴ−ＯＳ２ ＰＣＲ同定プロトコルを用いた、異系統のＰＣＲ解析。
ゲルの装填順：レーン１、分子量マーカー（１００bpラダー）、レーン２〜１１、異なったトランスジェニックイベントを含むイネ植物由来のＤＮＡサンプル、Ｍ２０２野生型由来のＤＮＡ、レーン１３、ベンガル野生型由来のＤＮＡ、レーン１４、陰性対照（水）、レーン１５、分子量マーカー（１００bpラダー）
【発明の属する技術分野】
本発明は、特にＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にある、イネゲノム中の特定の場所の、bar遺伝子の存在による特定の形質転換イベントを有することにより特徴づけられるイネ植物、植物材料及び種子に関する。本発明のイネ植物は、グルホシネート耐性と最も望ましい全体的な農業的性能、すなわち遺伝的安定性及び異なった遺伝的背景に対する適合性とを兼ね備えている。
【０００２】
ここで指摘する全ての文献は、ここに、参考文献によってこの文章中に組み込まれる。
【０００３】
【従来の技術】
植物における導入遺伝子の表現型の発現は、遺伝子そのものの構造及び該植物ゲノム中でのその位置によって決定される。同時に、ゲノム中における異なる位置の導入遺伝子の存在は、その植物の表現型全般に影響し得る。遺伝的操作によって、植物において、商業的に興味深い形質の農業上又は産業上の首尾よい導入は異なる要因に依存して、非常に長い手順になり得る。遺伝的に形質転換された植物の実際の形質転換及び再生は、広範囲にわたる遺伝的特徴づけ、育種及び圃場試験における評価を含む、一連の選択段階の最初に過ぎない。
【０００４】
米の生産は、共通して種々の雑草の脅威にさらされる。それらの中には、競争力が強く、激しく繁茂した場合は、その作物を経済的に魅力のないものにしてしまうほどの収穫減という結果になり得る。温帯生産に典型的な、直播の、機械化されたイネ栽培にとって、栽培技能（例えば、輪作、潅漑管理）及び除草剤が雑草の制御のために不可欠である（Hill et.al）。
【０００５】
ｂａｒ遺伝子（Thompson et al, 1987, EMBO J. 6:2519-2523;Deblock et al. 1987, EMBO J. 6:2513-2518）は、ホスフィノスリシン・アセチル化トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードしている遺伝子であり、それが植物中で発現すると、除草剤化合物ホスフィノスリシン（グルホシネートとも呼ばれる）又はバイアラホス（例えば米国特許第５６４６０２４号及び第５５６１２３６号も参照のこと）及びそれらの塩及びそれらの光学異性体に対する耐性を与える。ＰＡＴをコードする他の遺伝子は既に記載されている（例えば：Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37; EP 275957; US 5276268; US5637489; US5273894を参照のこと）。
【０００６】
密集した胚カルスを形成することができる完全な組織又はそのような組織から得られた密集したカルスのエレクトロポレーションによる単子葉植物の形質転換は米国特許第５６４１６６４号に記載されている。ここに、ｂａｒ遺伝子のエレクトロポレーションによるイネ密集胚カルスの形質転換及びトランスジェニックイネ植物の再生が開示されている。
【０００７】
ＤＮＡでコートした金粒子と一緒の爆発による未成熟イネカルスの細胞の形質転換によって得られた、ｂａｒ遺伝子又はハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇ遺伝子と一緒にｇｕｓ遺伝子を含む、トランスジェニックイネ植物が、記載されている（Christou et al,:1991: Biotechnology 9:957）
【０００８】
集合懸濁細胞のエレクトロポレーションによるイネのｂａｒ遺伝子での形質転換は、米国特許第５６７９５５８号に記載されている。
【０００９】
しかしながら、前述の文献は、本発明を教示又は示唆するものではない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明のまとめ
本発明は、以下の特徴：
ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、
ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片；
ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである一対のＢａｍＨＩ断片；
iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そして他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥｃｏＲＶ断片；
iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、１つのＨｉｎｄIII断片；
ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片；
vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである、１つのＮｓｉＩ断片；
（ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３２７bp断片とハイブリダイズすることができる）
の群から選択される制限断片の１つ以上、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましくは６つを生じることができ、及び／又は、
ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用いることができる（又は、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅された約２９０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を含む）
の片方又は両方によって特徴づけられるトランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１１】
本発明は、その植物、細胞、組織又は種子が、上のｉ）、ii）、iii）、iV）及びvi）に記載された制限断片又は制限断片対（ここで、選択は、上のｉ）、ii）、iii）、iV）及びvi）のいかなる組合わせも含むことができる）を含む上記の群から選択される、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましくは６つを生じることができることを特徴とする、トランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１２】
本発明は、好ましくは上記ａ）及びｂ）に記載された特長の両方によって特徴づけられる、トランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１３】
本発明は、ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子、この種子から育成された植物、及びこの種子から育成された植物の細胞又は組織にも関する。
【００１４】
本発明は、さらに、ここで議論した３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子フランキング領域（ここで議論した）のその間を含む植物、種子、細胞もしくは組織（例えば、イネ植物、種子、細胞又は組織）、又は、ここに開示した、フランキング領域−３５Ｓ−bar、遺伝子−フランキング領域構築物、又は挿入領域のような配列の、少なくとも６５％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは９７％でもよく、又は１００％同じヌクレオチド配列を含む植物、種子、細胞又は組織（例えばイネ植物、種子、細胞又は組織）にも関する。
【００１５】
本発明は、さらに上記の本発明のイネ植物の栽培方法、さらに特定すると、グルホシネートを活性成分とする除草剤を栽培されるイネ植物に施すことを含む方法に関する。
【００１６】
本発明のイネ植物は、グルホシネートを活性成分とする除草剤を施す上記の方法に従って栽培された場合、同じ栽培種の形質転換されていないイネに比較して改善された成長を示すことが確かめられている。したがって、本発明は、イネ植物の生産力又は成長を改善するための方法であると解することができる。
【００１７】
本発明は、本発明のイネ植物との交雑を含む、イネの育種方法も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号９を特徴とする、イネ細胞の染色体ＤＮＡの一部への、組み換えＤＮＡ分子の挿入、及び場合により、該形質転換イネ細胞からのイネ植物の再生を含む、イネ植物のトランスジェニック細胞又はそれから得られる植物体の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、トランスジェニック植物又はその細胞若しくは組織を同定する方法であって、該方法が、トランスジェニック植物、細胞又は組織のゲノムＤＮＡが以下の特徴：
ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、
ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片；
ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである一対のＢａｍＨＩ断片；
iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そして他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥｃｏＲＶ断片；
iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、１つのＨｉｎｄIII断片；
ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片；
vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである、１つのＮｓｉＩ断片；
（ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３２７bp断片とハイブリダイズすることができる）
の群から選択される制限断片又は制限断片対の少なくとも３つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましくは６つを生じることができ、及び／又は、
ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用いることができる
の片方又は両方を確認することを含む方法にも関する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の選ばれた事項を含むトランスジェニック植物を同定するためのキットであって、該キットが、ＰＣＲ同定プロトコル中で用いる、外来ＤＮＡを認識するＰＣＲプローブ及びＧＡＴ−ＯＳ２の３′又は５′フランキング配列、好ましくは、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有するプローブを含むキットに関する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
以下の、実施例によって説明されるが、本発明を記載された特定の実施態様に限定しようとするものではない、詳細な説明は、参照として組み込まれる、付随している図と関連して理解されなければならない。
【００２２】
詳細な説明
ここで用いられる用語「遺伝子」は、一緒になってプロモーター領域を形成するプロモーター及び５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）、コーディング領域（タンパク質をコードしていてもしていなくてもよい）、及びポリアデニル化部位を含む非翻訳３′領域（３′ＵＴＲ）のような、作動可能に連結された数個のＤＮＡ断片を含むいかなるＤＮＡ配列をもいう。典型的に植物細胞中においては、５′ＵＴＲ、コーディング領域及び３′ＵＴＲは、タンパク質をコードしている遺伝子である場合にはタンパク質に翻訳されるＲＮＡに転写される。１つの遺伝子は例えばイントロンのような付加的なＤＮＡ断片を含んでもよい。ここで用いられているように、遺伝子座とは、ある遺伝子の植物のゲノムにおける位置である。
【００２３】
遺伝子又はＤＮＡ配列に対していう場合の「キメラ」は、その遺伝子又は配列が、（プロモーター、５′ＵＴＲ、コーディング領域、３′ＵＴＲ、イントロンのように）少なくとも２つの機能的に関係のあるＤＮＡ断片であって、天然では互いに関連しておらず、例えば他の材料に由来するものを含んでいるという事実に言及するのに用いられる。植物種に関する遺伝子又はＤＮＡ配列についての「外来」は、その植物種に天然では発見されない遺伝子又はＤＮＡ配列を示すために用いられる。
【００２４】
ここで用いられているように、用語「導入遺伝子」とは、植物のゲノムに組み込まれた組み換えＤＮＡ分子をいう。用語「組み換えＤＮＡ分子」は、組み換え又は他の手順で得ることができる、ＤＮＡであり得るような、単離された核酸分子を含むことができ、かつ例証するために用いられる。この組み換えＤＮＡ分子は、通常、形質転換された植物に１つ以上の特徴を与えることができる、少なくとも１つの「問題の遺伝子」（例えばキメラ遺伝子）の少なくとも１つのコピーを含む。「トランスジェニック植物」は、その全ての細胞のゲノムに導入遺伝子を含む植物をいう。
【００２５】
組み換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組み込みは、典型的には細胞又は組織の形質転換（又は他の遺伝的操作）から結果として生じる。組み込みの特定の部位は、機会又は予め決定された場所（もし標的を定めた組み込み法が用いられた場合は）による。
【００２６】
導入遺伝子は、場所及び植物ゲノム中における組み換えＤＮＡ分子の組み込み部位の相対的位置によって特徴づけられる。導入遺伝子が挿入されている植物ゲノム中での部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」として言及されている。導入遺伝子の植物ゲノム中への挿入は、その植物ＤＮＡの欠失と関連しており「標的部位欠失」として言及されている。ここで用いられているように、「フランキング領域」又は「フランキング配列」は、導入遺伝子のすぐ上流でかつ隣接しているか、又はすぐ下流でかつ隣接している少なくとも２０bp、好ましくは５０bp、及び５０００bpまでの植物ゲノムの配列をいう。導入遺伝子のランダム組み込みに先行する形質転換手順は、特徴づけられ、それぞれの形質転換体に独特の、異なるフランキング領域を有する形質転換体を生ずる。伝統的な交配によって導入遺伝子が植物に導入された場合、植物ゲノムにおけるその挿入部位又はそのフランキング領域は一般的に変化しないであろう。ここで用いられているように、「挿入領域」は、その挿入部位（及び起こり得る標的部位の欠失）、及びその（まだ形質転換されていない）植物ゲノムにおける導入遺伝子の上流及び下流フランキング領域、によって囲まれた領域に相当する領域をいう。
【００２７】
導入遺伝子の表現は、該導入遺伝子に含まれる問題の遺伝子（単数又は複数）が、該植物に１つ以上の形態的形質（その形態的形質は、形質転換で用いられる組み換えＤＮＡ分子−形質転換するＤＮＡ（問題の遺伝子（単数又は複数）の一部又は全部の構造及び機能を基礎として）の導入によって与えられようとされていたものである）（例えば除草剤耐性）を与えるように発現されることを示すために用いられる。
【００２８】
イベントは、遺伝的操作の結果、問題の遺伝子の少なくとも１コピーを含む導入遺伝子を有する（人工的な）遺伝子座として定義される。１つのイベントの典型的な対立遺伝子の状態は、導入遺伝子の存在又は不存在である。イベントは、導入遺伝子の発現によって形態的に特徴づけられる。分子レベルでは、イベントは制限地図（例えばサザンブロッティングによって決定されるようなもの）及び／又は導入遺伝子の上流及び／若しくは下流及び／又は該導入遺伝子の分子の相対的位置によって特徴づけられる。通常、問題の遺伝子の少なくとも１つを含む形質転換する遺伝子による植物の形質転換は、其々が独特な、多数のイベントへと導かれる。
【００２７】
ここで用いられる、エリートイベントは、同じ形質転換ＤＮＡでの形質転換により得られるイベントの群から、該導入遺伝子の発現及び安定性、及びそれを含む植物の最も望ましい農業的特長に基づいて選択されるイベントである。エリートイベントの選択のための規準は、以下：
ａ）導入遺伝子の存在が、農業的性能又は商業的価値のような、該植物の他の望ましい特徴を損なわないこと；
ｂ）該イベントが、安定に遺伝し、同一性管理のための適当な診断ツールが開発できる、よく定義された分子構成によって特徴づけられること；
ｃ）ヘテロ接合体（又は半接合体）及びホモ接合体のイベント状態のどちらにおいても、そのイベントを有する植物が正常な農業的使用において暴露されるような環境状態の範囲における商業的に許容しうるレベルで、導入遺伝子中の問題の遺伝子（単数又は複数）が、正しい、適切なそして安定な空間的及び時間的な形態発現を示すこと；
の１つ以上、好ましくは２つ以上、有利には全てである。
【００３０】
導入遺伝子は、好ましい商業的な遺伝的背景への遺伝子移入を可能とする植物ゲノム中の位置と結び付いていることが望ましい。エリートイベントとしてのイベントの状態は、異なった、相当する遺伝的背景中への、該エリートイベントの遺伝子移入及び例えば上記ａ）、ｂ）及びｃ）の規準の１つ、２つ又は全てに従っていることの観察によって確認される。
【００３１】
したがって、「エリートイベント」は、上記の規準に一致する導入遺伝子を含む遺伝子座をいう。植物体、植物材料又は種子のような後代は、そのゲノム中に該エリートイベントを含む。
【００３２】
エリートイベント又はエリートイベントを有する植物若しくは植物材料を同定するために開発された診断ツールは、該導入遺伝子を含むゲノム領域の特定の制限地図及び／又は該導入遺伝子のフランキング領域（単数又は複数）の配列等の、当該エリートイベントの特定の遺伝的特徴に基づいている。ここで用いられる「制限地図」は、特定の制限酵素又は制限酵素のセットで植物ゲノムＤＮＡを切断し、、該導入遺伝子と配列類似性を共有するプローブとの（特定の条件下における）ハイブリダイゼーションをした後に得られるサザンブロットパターンのセットをいう。導入遺伝子の組み込み前に植物ゲノム中に存在する（内因的な）制限部位により、導入遺伝子の挿入は、そのゲノムの特定の制限地図を変えるであろう。このように、特定の形質転換体又はそれに由来する後代は、１つ以上の特定の制限パターンによって同定され得る。１つのイベントの制限地図を決定する条件は、制限地図同定プロトコル中に示されている。
【００３３】
代替的には、エリートイベントを含む植物又は植物材料は、ＰＣＲ同定プロトコルによる試験で同定することができる。これは、該エリートイベントを特異的に認識するプライマーを用いるＰＣＲである。要するに、プライマーの１セットは、
ａ）エリートイベントの３′又は５′フランキング配列、及び
ｂ）外来のＤＮＡ中の配列
を認識し、それらのプライマーは、好ましくは１００〜３５０ヌクレオチドの断片（組み込み断片）を増幅するように開発される。好ましくは、該植物種の管理維持遺伝子中の断片を増幅するプライマーの１セットとしての対照が含まれる（断片は好ましくは増幅された組み込み断片よりも大きいものである）。該特異的プライマーの配列を含む、ＰＣＲに最も好ましい条件は、ＰＣＲ同定プロトコル中に特定されている。
【００３４】
例えば、ヌクレオチド配列に関する、用語「類似性」は、２つの配列間のホモロジーの量的測定を示すことを目的とする。配列類似性百分率は、
（Ｎref−Ｎdif）＊１００／Ｎdif
〔式中、Ｎdifは、並べたときに２つの配列中の非同一塩基の合計数であり、Ｎrefは、一方の配列中の塩基の数である〕
のように計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと、７５％の類似性を有することとなる（Ｎref＝８、Ｎdif＝２）。本発明は、核酸分子及び、ここに開示されている配列と、少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８０％又は有利には少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又はさらに９７％若しくは１００％の類似性を有する配列、並びにそのような核酸分子を含有する植物、細胞、組織、種子、及びその後代（例えば、イネ植物、細胞、組織、種子及びその後代）を包含する。代替的に、又は加えて、配列についての「類似性」は、２つの配列のうちの短いほうのヌクレオチド数によって分割される同一のヌクレオチドの位置の数に関係する（ここで、２つの配列の並び（アラインメント）は、読み枠サイズ２０ヌクレオチド、１単語長さ４ヌクレオチド、ギャップペナルティ４を用いたWilburとLipmannのアルゴリズム（Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726）にしたがって決定することができ、コンピュータ支援解析及び並びを含めた配列データの解釈は、Intelligenetics（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Intelligenetics 社、CA）のプログラムを用いて簡便に実施することができる）。「本質的に類似の」配列は、少なくとも約７５％、有利には少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、特に約９５％、例えば少なくとも９７％、及び特に約１００％の配列の類似性又は同一性を有する。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似する、又は類似するという場合には、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考慮される。
【００３５】
本発明は、イネにおけるエリートイベント、ＧＡＴ−ＯＳ２、このイベントに由来する植物、植物材料又は植物細胞に関する。エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含有する植物は、実施例１に記載するように、プラスミドｐＢ／３５Ｓｂａｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片（配列番号８）での形質転換を通じて得られる。このエリートイベントをつくり出すために用いられる組み換えＤＮＡ分子は、酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ及びカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを含む（ここで、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする配列は、（「３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子」と称する）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの調節下にある）。３５Ｓプロモーターは、イネにおいて「構成的」発現パターンを有し（Battraw et al., 1990, Plant Mol Biol 15:527-538）、それは、ほとんどの植物において、植物ライフサイクルのほとんどの間、著しく発現することを意味する。イネ植物における３５Ｓ−ｂａｒの発現は、除草剤化合物ホスフィノスリシン又はバイアラホス又はグルホシネート又はより一般的にはグルタミンシンテターゼ阻害剤又はその塩若しくは光学異性体に対する耐性を与える。
【００３６】
ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（１）に記載された制限地図同定プロトコルにしたがって同定することができる。簡単には、イネゲノムＤＮＡを、以下の制限酵素：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩの選択（好ましくは少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、例えば３つから６つ）で消化し、ナイロンメンブレン上にトランスファーし、プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの約１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズする。次に、用いたそれぞれの制限酵素について以下の断片：
・ＥｃｏＲＩ：約１１５９〜１７００bpの、好ましくは約１３２７bpの１つの断片
・ＢａｍＨＩ：約１７００bp〜２１４０bpの、好ましくは約２．０kbpの１つの断片及び約８０５〜１０９３bpの、好ましくは約８０５bpの１つの断片
・ＥｃｏＲＶ：約５０７７bpより大きい、好ましくは約１２kbpの１つの断片及び約２８３８〜４５０７bpの、好ましくは約３．８kbpの１つの断片
・ＨｉｎｄIII：約５０７７〜１１４９７bpの、好ましくは約５．３kbpの１つの断片
・ＮｃｏＩ：約２８３８〜約４５０７bpの、好ましくは１つが約４．１kbpであり１つが約３．１kbpである２つの断片
・ＮｓｉＩ：約４７４９〜約１１４９７bpの、好ましくは約５．１kbpの１つの断片
が同定されるかどうかを測定する。ＤＮＡ断片の長さは公知の長さのＤＮＡ断片のセット、特にファージλＤＮＡのＰｓｔＩ断片との比較で測定される。
もし、これらの制限酵素の、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好ましくは全てで消化した後の植物材料が、上に記載したものと同じ長さのＤＮＡ断片を生ずるならば、該イネ植物は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００３７】
ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（２）に記載されたＰＣＲ同定プロトコルにしたがって同定することもできる。簡単には、ＧＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識するプライマー、特に配列番号５の配列のプライマー、及び導入遺伝子中の配列を認識するプライマー、特に配列番号４の配列のプライマーを用いて、イネゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅する。内因性のイネプライマーを対照として用いる。もし、植物材料が、約２９０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpの断片を生ずれば、該イネ植物はエリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００３８】
ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、それらのグルホシネート耐性によっても特徴づけられ、それは本発明の文脈において、植物が、除草剤Liberty（登録商標）に対して耐性であることを含んでいる。Liberty（登録商標）に対する耐性は、３〜４葉の段階で２００g活性成分/ヘクタール（g.a.i/ha）、好ましくは４００g.a.i/ha、そして可能ならば１６００g.a.i/haまでの噴霧が、該植物を殺さないという規準で決定される。ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、さらにその細胞中の、ＰＡＴアッセイ（De Block et al, 1987, supra）で測定されるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼの存在によって特徴づけられる。
【００３９】
ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、例えばＡＴＣＣにＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託されている種子から得ることができる。そのような植物は、従来の育種スキームにおいて、同じ特徴についてさらに形質転換された植物を作るため、又は同じ植物種の他の栽培種に本発明のエリートイベントを導入するために、さらに増殖及び又は使用することができる。これらの植物から得られた種子は、それらのゲノムに安定に組み込まれるエリートイベントを含んでいる。
【００４０】
本発明のイネ植物は、従来の方法で栽培することができる。導入遺伝子の存在は、それらがグルホシネートに対して耐性であることを確保する。したがって、そのようなイネ植物が育成される圃場中の雑草は、グルホシネートを活性成分として含有する除草剤（Liberty（登録商標）のような）の適用によって調節することができる。
【００４１】
ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、以下の市場で入手可能な米国におけるイネ品種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と同様の農業的特長によって特徴づけられる。関連する農業的特長は、植物丈、穂の強度／硬直性、耐倒伏性、葉形態（長さ、幅、刀状葉片の角度）、成熟までの期間、小花の構成、多穂、種子外皮の完全閉覆、穀粒サイズ及び形状、及び穀粒生産及び収量である。
【００４２】
イネ植物ゲノムのこの領域、さらに詳しくはイネ植物ゲノムにおけるこの部位における導入遺伝子の存在が、このイベントに対して特定の問題とする表現型の又は分子レベルでの特徴を与えることが観察されている。さらに詳細には、ゲノム中のこの特定部位の導入遺伝子の存在が、該植物の望ましい農業的性質のいかなる側面も有意に損なうことのない、導入遺伝子の安定した表現型発現を生じさせるのである。このように、配列番号９に相当する挿入領域、さらに詳しくはその中のＧＡＴ−Ｓ２の挿入部位は、除草剤抵抗性遺伝子、さらに特定すると３５Ｓプロモーターの調節下のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、特にプラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片のような、問題の遺伝子（単数又は複数）の導入に特に適切であることが示されている。
【００４３】
組み換えＤＮＡ分子はこの挿入領域に標的挿入法を用いて特異的に挿入され得る。そのような方法は、当業者によく知られており、例えば、限定されるものではないが、Saccharomyces cervisiae 由来のＦＬＰリコンビナーゼ（米国特許第５５２７６９５号）、Escherichia Coli ファージ Ｐ１由来のＣＲＥリコンビナーゼ（公開されたＰＣＴ出願明細書ＷＯ９１０９９５７）、Saccharomyces rouxiiのｐＳＲＩ由来のリコンビナーゼ（Araki et al., 1985, J Mol Biol 182:191-203）、又は米国特許第４６７３６４０号に記載されているようなλファージ組み換え系を用いた相同性組み換えを含む。
【００４４】
ＤＮＡは、エレクトロポレーション法、ＤＮＡで被覆した金粒子又は生分解性物質の火薬打ち込み法、又はアグロバクテリウム若しくはポリエチレングリコール媒介法等の方法を含む技術によって、イネゲノム等の植物ゲノム中に挿入することができる。
【００４５】
ここで用いる「含む」は、言及された特長、整数、関連する工程又は成分の存在を定義するが、１つ以上の特徴、整数、工程若しくは成分、又はそれらの群の存在又は添加を排除しないというように解釈される。したがって、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又はタンパク質は、実際に指摘したよりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでもよく、すなわち、より大きい核酸又はタンパク質に埋め込まれていてもよい。機能的に又は構造的に定義されるＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、付加的なＤＮＡ配列等を含んでいてよい。
【００４６】
以下の実施例は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有するイネ植物の開発及び特徴を記載している。
【００４７】
特に述べる場合を除き、全ての組み換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY 及びAsusubel et al.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA の第１巻及び第２巻に記載された標準プロトコルにしたがって実施した。植物分子実験のための標準材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK) 及び Blackwell Scientific Publications, UK によって出版された、R.D.D. Croy による、Plant Molecular Biology Labfax (1993) に記載されている。
【００４８】
発明の詳細な説明及び実施例において、以下の配列の参照事項を述べる：
配列番号１： ＧＡＴ−ＯＳ２の５′フランキング領域を含む配列である
配列番号２： ＧＡＴ−ＯＳ２の３′フランキング領域を含む配列である
配列番号３： ＧＡＴ−ＯＳ２の挿入部位を含む配列である
配列番号４： ＯＳＡ０３：ＰＣＲ同定プロトコルのプライマーである
配列番号５： ＯＳＡ０４：ＰＣＲ同定プロトコルのＧＡＴ−ＯＳ２特異的プライマーである
配列番号６： ＯＳＡ０１イネ内因性プライマーである
配列番号７： ＯＳＡ０２イネ内因性プライマーである
配列番号８： プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒである
配列番号９： 挿入領域である
【００４９】
【実施例】
実施例１ 除草剤抵抗性をコードする遺伝子でのイネの形質転換
ａ）３５Ｓプロモーターの調節下のbar遺伝子を含むキメラＤＮＡ（ｐＢ５／３５Ｓｂａｒ）の構築
【００５０】
プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒを、以下の標準プロトコルに従って構築した。プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの配列は、配列番号８に与えられている。ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII消化によって、以下の遺伝的要素を含む１５０１bpの断片が生じた。
【００５１】
【表１】
該１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片は、電気泳動後のこの断片の抽出によって精製した。
【００５３】
ｂ）イネの形質転換
ベンガル品種は、ルイジアナ農業研究所のイネ研究所が開発した中粒イネである。該品種は１９９２年に公的に開放された。来歴にはＭＡＲＳ及びＭ２０１（linscombe S.D. et al. 1993, Crop Science: 33: 645-646）が含まれている。
【００５４】
ｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片でのイネ植物の形質転換は、直接ＤＮＡ移入を用いて実施した。選抜は、生育を加速するためにＰＰＴ不存在において行った幼植物の再生段階を除く、全ての段階でホスフィノスリシン（ＰＰＴ）について行った。その結果、最初の形質転換体のセット（世代Ｔ0の植物）を生じた。
【００５５】
実施例２ イベントの開発
ａ）トランスジェニックホモ接合体系統の開発
種々のＴ0半接合体幼植物を組織培養から転化し、温室土壌に移し、開花及び結実を可能にした。幼植物を、ねん性、生産力、及びアンモニアグルホシネートに対する耐性について評価した。自家受粉によるＴ1種子をこれらの植物体から集め、圃場で生育した。Ｔ1植物にLiberty（登録商標）除草剤を１ヘクタールあたり活性成分８００g（g.a.i./ha；農家への推奨用量は４００g.a.i./ha）で噴霧した。除草剤の適用を生き延びたイベント及び除草剤耐性について３：１に分離したイベントを更なる評価のために選抜した。耐性植物は、損傷（葉先端枯れ）について評価した。
【００５６】
Ｔ2種子は選抜されたイベントの全ての耐性植物の穂から収穫した。それらを列に蒔き、除草剤耐性の分離を評価するため、Ｔ2植物にLiberty（登録商標）除草剤（１６００g.a.i／ha）を噴霧した。１００％の生存を有した列、すなわち導入遺伝子についてホモ接合体である系統に相当する列を選抜した。それらを除草剤損傷および表現形質について再び評価した。その穂系列の（望ましい特徴に関しての）表現型の均一性に基づいて更なるイベントの選択を行った。
【００５７】
ｂ）導入遺伝子のイベントの特徴づけ−ＧＡＴ−ＯＳ２の選択
導入遺伝子のイベントは、サザンブロットパターン、一般的形質及び農業的性質、そして収穫量についてさらに特徴づけられた。それが適切である場合には、それらの特徴は、圃場状態下で決定された。
【００５８】
サザンブロット解析
導入遺伝子の存在は、イネゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＶでの酵素消化産物及びｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とのハイブリダイゼーションを用いた標準的なサザンブロット解析によって確認した。関係するバンド強度は、導入遺伝子座について植物がホモ接合体であるか半接合体であるかについて示唆を提供した。２つのイベントは、単純な挿入であることがわかった。導入遺伝子の分離パターンは、単純な遺伝子座のメンデル遺伝によって説明できることが確認された。
【００５９】
Ｔ1及びＴ2植物を、植物丈、穂の強度／硬直性、倒伏性、葉形態（刀状葉片について、細すぎる又は異常な角度）、晩生、小花の構成、穂の不稔又は不完全稔性、種子外皮の不完全閉覆（病害感受性を増加させることにつながる）、穀粒サイズ及び形状、及び穀粒生産及び収量を含む、多くの表現形質について評価した。系統は、形質転換されていないベンガル品種及び以下のイネ品種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と比較して、提示された農業的特長において同様である（又は改善されている）ことが評価された。いくつかのケースにおいては、１つ以上の上述の形質について、１つの穂系列中の植物がソマクローナル変異に関して分離した。これが農業的に興味深い表現形質の導入という結果にならない限り、これらの植物体は、排除した。
【００６０】
収量評価のための圃場形質
Ｔ2種子を、選抜したホモ接合体集団からバルクで収穫し、標準品種ベンガルと比較した。種子を、穂系列としてそれぞれのイベントを表す隔離された区画に植えた。トランスジェニックの区画は、１６００g.a.i.／haのLiberty（登録商標）除草剤を噴霧するか、噴霧しなかった（「非噴霧」区画）。非トランスジェニック品種標準の区画は、Liberty（登録商標）を噴霧しなかった。その土地の雑草を調節するための標準除草剤処理を、全ての区画に適用した。
【００６１】
トランスジェニックイベントを、ルイジアナ及びプエルトリコ（冬季種苗場）を含む異なった場所で収量特性について試験した。
【００６２】
農業的パラメーター及び植物形態の順位統計の統計的解析、及び他の非パラメーターデータを、親品種ベンガル及び以下のイネ品種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と競争するための最適な商業的候補を同定するためにそろえた。ＧＡＴ−ＯＳ２が、育種系統の組を作るために最も有用であることを示すイベントであった。
【００６３】
実施例３ イベントＧＡＴ−ＯＳ２の特徴づけ
ａ）該遺伝子座の詳細な分子的及び遺伝学的解析
ＧＡＴ−ＯＳ２イベントが、導入遺伝子の発現並びに農業的性質全般が最良であるイベントであると同定されると、導入遺伝子の遺伝子座が分子レベルで詳細に解析された。これには、サザンブロット解析及び導入遺伝子のフランキング領域のシークエンスも含まれた。
【００６４】
（１）複数の制限酵素を用いたサザンブロット解析
葉組織をトランスジェニック植物及び対照植物から収穫した。Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21)にしたがって、葉組織から全ゲノムＤＮＡを単離した。吸光度計で２６０nmの波長の吸光度を測定することにより、それぞれの調製物のＤＮＡ濃度を測定した。
【００６５】
ゲノムＤＮＡ１０ngを、製造者の推奨条件を適用して最終反応量４０μlで制限酵素で消化した。消化の時間及び／又は制限酵素の量は、非特異的消化を伴わないゲノムＤＮＡの完全な消化を確実なものとするように調節した。消化の後、消化したＤＮＡサンプルに４μlの泳動用色素（loading dye）を添加し、１％アガロースゲル上に装填した。
【００６６】
以下の対照ＤＮＡもゲル上に装填した：
・非トランスジェニック植物から調製したゲノムＤＮＡの陰性対照
この陰性対照は、バックグラウンドハイブリダイゼーションがないことを確認するために用いられる。
・ＤＮＡ陽性対照：導入遺伝子をヘテロ接合のシングルコピーで組み込んだOryza sativaゲノムであり、ゲノムＤＮＡ１０μgは、ｐＢ５／３５ＳｂａｒＤＮＡの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片の±１９ピコグラムと同数の分子当量を有する（Oriza sativaの２倍体ゲノムサイズ：０．８×１０9bp）。ゲノム当り１コピーのプラスミドを示す量を、消化された非トランスジェニックOryza sativaＤＮＡ１μgに添加した。この再構成サンプルは、ハイブリダイゼーションがプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施されたことを示すために用いられた。
【００６７】
ＰｓｔＩで消化したファージλＤＮＡ（ＣＩｉｎｄ１ｔｓ８５７Ｓａｍ７株、Life Technologies）をサイズスタンダードとして含めた。
【００６８】
電気泳動の後、ＤＮＡサンプル（消化したイネゲノムＤＮＡ、対照、及びサイズスタンダード）を、１２〜１６時間のキャピラリーブロッティングでナイロンメンブレン上にトランスファーした。プローブの調製に用いたＤＮＡテンプレートは、プラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＥｃｏＲＩでの制限酵素消化物であった。これは、形質転換ＤＮＡ（１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片）に関係する部分を包含する１３２７bpのＤＮＡ断片を放出した。精製の後、ＤＮＡ断片を標準的な手順にしたがってラベルし、該メンブレンに対してハイブリダイズのために用いた。
【００６９】
ハイブリダイゼーションは、標準的なストリンジェント条件下で行った。ラベルしたプローブを９５℃〜１００℃のウォーターバス中で５〜１０分加熱して、氷上で５〜１０分冷却することにより変性し、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、ＮａＣｌ３．０Ｍ、クエン酸Ｎａ０．３M、pH７．０である）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液＝フィコール２％、ポリビニルピロリドン２％、ウシ血清アルブミン２％である）、ＳＤＳ０．５％及び変性したキャリアＤＮＡ（１本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長さ１２０〜３０００ヌクレオチド）２０μg／ml）に添加した。ハイブリダイゼーションは、６５℃で一晩行った。ブロットを洗浄溶液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で、６５℃、２０〜４０分で３回行った。
【００７０】
オートラジオグラフを、電子的にスキャンした。
異なった制限酵素でのＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡの消化後に得られた制限パターンを図１に示し、及びまとめを表１に示した。
【００７１】
【表２】
（２）フランキング配列の同定
ＧＡＴ−ＯＳ２イベント中の挿入された導入遺伝子のフランキング領域の配列を、Liu et al.（1995, The Plant Journal 8(3):457-463）により記載されたように、温度非対称組合わせ（ＴＡＩＬ−）ＰＣＲ法を用いて決定した。この方法は、連続する反応中で、３つの入れ子状態の特異的プライマーを、より短い任意の緩認識（arbitrary degenerate: AD）プライマーと一緒に、特異的及び非特意的産物の相対的増幅効率を温度で調節できるように用いる。特異的プライマーは、導入遺伝子の境界にアニーリングするように、そしてそれらのアニーリング条件に基づいて選択された。未精製第二及び第三ＰＣＲ産物の少量（５μl）を、１％アガロースゲル上で解析した。第三ＰＣＲ産物を、予備増幅に用い、精製してDyeDeoxy Terminator cycleキットを用いた自動シークエンサーでシークエンスした。
【００７３】
１．ＨｉｎｄIII部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ
使用したプライマー：
【００７４】
【表３】
ＭＤＢ５５６−ＭＤＢ４１１を用いて増幅した断片は、およそ４００bpであり、その１１３bpをシークエンスした（５′フランク：配列番号１）。bp１〜bp９２は、植物ＤＮＡを含んでおり、一方bp９３〜bp１１３は、ｐＢ５／３５ＳｂａｒのＤＮＡに相当する。
【００７６】
ＰｖｕＩ部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ
使用したプライマー：
【００７７】
【表４】
ＭＤＢ２８５−ＭＤＢ４１０を用いて増幅した断片は、およそ１２００bpであった（３′フランク：配列番号２）。bp１〜bp６０４は、ｐＢ５／３５ＳｂａｒのＤＮＡに相当し、bp６０５〜bp１２７９は植物ＤＮＡを含んでいる。
【００７９】
（３）標的部位欠失の同定
野生型Oryza sativa品種ベンガルにおける導入遺伝子のフランキング領域中の配列に相当するプライマーをテンプレートとして用い、導入遺伝子の挿入部位を同定した。
以下のプライマーを用いた：
【００８０】
【表５】
これは、bp８３〜５５が標的部位欠失に相当する、１６８bpの断片（配列番号３）を生じた。
【００８２】
したがって、シークエンスしたイネ挿入領域（配列番号９）は：
１〜９２： ５′フランキング領域 配列番号１のbp１〜９２
９３〜１１０： 標的部位欠失 配列番号３のbp３８〜５５
１１１〜７８５： ３′フランキング領域 配列番号２のbp６０５〜１２７９
を含む。
【００８３】
（４）該遺伝子座の遺伝的解析
挿入断片の遺伝的安定性を、数代に渡る後代植物における分子及び表現型解析で確認した。
【００８４】
Ｔ0、Ｔ1及びＴ2世代のＧＡＴ−ＯＳ２イネ植物のグルホシネート耐性植物のサザンブロット解析を比較し、同一であることがわかった。これは、ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物における導入遺伝子の分子構成が安定しているということを証明している。
【００８５】
ＧＡＴ−ＯＳ２イベントは、挿入断片が安定であることを示している少なくとも３つの連続する後代において、単一遺伝子座としての導入遺伝子についてメンデル分離を示している。
【００８６】
上記の結果に基づいて、ＧＡＴ−ＯＳ２は、エリートイベントであると同定された。
【００８７】
ｂ）同一性調節のための診断ツールの開発
該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むいかなるイネ植物材料をも同定するために以下のプロトコルが開発された。
【００８８】
（１）ＧＡＴ−ＯＳ２エリートイベント制限地図同定プロトコル
該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むイネ植物は、実施例３ａ）（１）に記載されたのと本質的に同じサザンブロッティングによって同定することができる。すなわち、イネゲノムＤＮＡを、以下：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩ、の制限酵素の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好ましくは全てで消化し、２）ナイロンメンブレン上にトランスファーし、そして３）プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。用いられたそれぞれの制限酵素について、もしＤＮＡ断片が表１に列記したそれらと同じ長さであると同定されれば、そのイネ植物は、該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００８９】
（２）エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２のポリメラーゼ連鎖反応同定プロトコル未知のもののスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照でテストランをしなければならない。示したプロトコルは、研究所によって異なるであろう成分（テンプレートＤＮＡの調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ、サーマルサイクラー等）について最適化が必要とされるであろう。
【００９０】
該プロトコルにおいて、内因性の配列の増幅が重要な役割を果たす。既知のゲノムＤＮＡテンプレート中の内因の及び導入遺伝子の配列の両方を等モルの量で増幅するＰＣＲ及び温度サイクル条件を得なければならない。アガロースゲル電気泳動で判断して、目的の内因性断片が増幅されない場合や、同じエチジウムブロミド染色強度で目的配列が増幅されない場合には、ＰＣＲ条件の最適化が必要とされよう。
【００９１】
テンプレートＤＮＡ
テンプレートＤＮＡは、Edwards et al.（Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991）に従って調製した。他の方法で調製したＤＮＡを用いる場合は、異なる量のテンプレートを用いたテストランをすべきである。通常、最高の結果で５０ngのＤＮＡテンプレートが得られる。
【００９２】
用いられる陽性及び陰性対照
以下の陽性及び陰性対照が、ＰＣＲの実施に含められるべきである：
＊マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応液にＤＮＡを添加しないＰＣＲである。期待される結果、すなわちＰＣＲ産物がないという結果が観察された場合、ＰＣＲカクテルが目的ＤＮＡで汚染されていないということを示している。
＊ＤＮＡ陽性対照（導入遺伝子を含むことがわかっているゲノムＤＮＡサンプル）。この陽性対照の成功した増幅は、ＰＣＲが、目的配列を増幅することができる条件下で行われたことを証明する。
＊野生型ＤＮＡ対照。これは、用いられたテンプレートＤＮＡが、非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。期待される結果、すなわち導入遺伝子のＰＣＲ産物の増幅がないが内因性ＰＣＲ産物の増幅があること、が観察された場合、これはゲノムＤＮＡサンプル中に、検出し得る導入遺伝子バックグラウンド増幅がないことを示す。
【００９３】
プライマー
導入遺伝子及びＧＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識する、以下のプライマーを用いた：
【００９４】
【化１】
内因性配列を標的とするプライマーは、ＰＣＲカクテル中に常に含まれている。これらのプライマーは、未知のサンプル中及びＤＮＡ陽性対照での内部対照として働く。内因性プライマーペアでの陽性の結果は、ゲノムＤＮＡの調製において、ＰＣＲ産物が作られるために適切な品質のサンプルＤＮＡが得られたことを証明する。用いられた内因性のプライマーは、以下のものである：
【００９６】
【化２】
増幅された断片
ＰＣＲ反応における、期待される増幅断片は、
プライマーペアＯＳＡ０１−ＯＳＡ０２について： ４５７bp（内因性対照）
プライマーペアＯＳＡ０３−ＯＳＡ０４について： ３１３bp（エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２）
である。
【００９８】
ＰＣＲ条件
５０μl反応のためのＰＣＲ混合液は：
テンプレートＤＮＡ ５μl
１０×増幅バッファー（Ｔａｑポリメラーゼとともに供給される） ５μl
１０mMｄＮＴＰ １μl
ＯＳＡ０１（１０pmol／μl） １μl
ＯＳＡ０２（１０pmol／μl） １μl
ＯＳＡ０３（１０pmol／μl） ２μl
ＯＳＡ０４（１０pmol／μl） ２μl
Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット／μl） ０．２μl
水で５０μlにするである。
【００９９】
アガロースゲル解析
１０〜２０μlのＰＣＲサンプルを、適当な分子量マーカー（例えば１００bpラダー ファルマシア）を備えた１．５％アガロースゲル（トリス−ホウ酸バッファー）上に装填する。
【０１０１】
結果の有効性
１つのＰＣＲ反応及び１つのＰＣＲカクテルに含まれるトランスジェニック植物ＤＮＡサンプルからのデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が期待されるＰＣＲ産物（導入及び内因性の断片）を示すこと、２）ＤＮＡ陰性対照が、ＰＣＲ増幅に対して陰性であること（断片なし）、及び３）野生型ＤＮＡ対照が期待される結果（内因性断片の増幅）を示すこと、なしには受け入れられない。
【０１０２】
期待されるサイズの導入及び内因性ＰＣＲ産物の可視量を示しているレーンは、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植物が、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有していることを示す。導入ＰＣＲ産物の可視量を示さず、内因性ＰＣＲ産物の可視量を示しているレーンは、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植物が、該エリートイベントを有していないことを示す。内因性及び導入ＰＣＲ産物の可視量を示していないレーンは、ゲノムＤＮＡの質及び／又は量が、ＰＣＲ産物を作ることができないものであることを示している。ゲノムＤＮＡの調製をくり返し、適切な対照といっしょの新しいＰＣＲ反応を実施しなければならない。
【０１０３】
ＧＡＴ−ＯＳ２を同定するための、弁別ＰＣＲプロトコルの使用
異なるトランスジェニックイベントを含む植物からのイネ葉材料（サンプル１〜１０）を、上述のプロトコルに従って試験した。Ｍ２０２野生型及びベンガル野生型からのサンプルを、陰性対照として採用した。
【０１０４】
ＰＣＲ解析の結果を、図２に示す。サンプル８及び９（実際には同じイベントに由来する植物からのＤＮＡを含んでいる）が、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含んでいると認識された。試験された他の全ての系統は、このエリートイベントを含んでいない。
【０１０５】
実施例４ 好ましい栽培種へのＧＡＴ−ＯＳ２の導入交雑
エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２は、反復戻し交雑により以下の栽培種に導入された：
＊カリフォルニア産温帯ジャポニカ種（Ｍ２０４、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３等であるが、これに限定されるわけではない）
＊カリフォルニア産熱帯ジャポニカ種（Ｌ２０１、Ｌ２０２等であるが、これに限定されるわけではない）
＊日本産及び韓国産温帯ジャポニカ種（コシヒカリ及びミリアン等であるが、これに限定されるわけではない）
＊オーストラリア産温帯ジャポニカ種（ミリン及びジャラー等であるが、これに限定されるわけではない）
＊地中海産温帯ジャポニカ種（バリラ、アルボリオ等であるが、これに限定されるわけではない）
＊中国産インディカ種（ギチャオ、コンギ３１４、テキン等であるが、これに限定されるわけではない）
＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種（ドゥルー、サイプレス、ジェファーソン、プリシラ、コッケイドー等であるが、これに限定されるわけではない）
＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種、中粒種（ベンガル、マース、ブラッツォ、マーキュリー等であるが、これに限定されるわけではない）
＊南アメリカ産熱帯ジャポニカ種、長粒種（エルパソ１４４、ＩＲＧＡ４０９等であるが、これに限定されるわけではない）
＊極東産バスマティ及びジャスミン型（カシミール、クワオダックマリ）
＊アフリカ産ジャバニカ型（青米種）
【０１０６】
これらの栽培種へのエリートイベントの導入は、これらの栽培種のいかなる望ましい表現型又は農業的特性にも重大に影響しておらず（連鎖障害なし）、一方グルホシネート耐性によって測定される導入遺伝子の発現は、商業的に受け入れられるレベルに合致していた。これは、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２の状況をエリートイベントとして確認するものである。
【０１０７】
上記請求項で用いられている通り、明確に示されている場合を除いて、用語「植物」は、限定されないいかなる種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを含む、成熟のいかなる段階の植物組織、並びに、いかなるそのような植物から採取した／に由来する、いかなる細胞、組織又は器官、をも包含することを意図する。
【０１０８】
エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含む種子は、ＡＴＣＣに番号：ＡＴＣＣ２０３３５２で、ＧＡＴ−ＯＳ２として寄託されている。
【０１０９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡ消化後に得られた制限地図である。
サザンブロットによって解析したゲルの装填順：レーン１、ＰｓｔＩで消化したλＤＮＡ、レーン２、ＥｃｏＲＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン３ＢａｍＨＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン４、ＥｃｏＲＶで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン５、ＨｉｎｄIIIで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン６、ＮｃｏＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン７、ＮｓｉＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン８、未トンスジェニックイネＤＮＡ、レーン９、ＥｃｏＲＩで消化した対照プラスミドＤＮＡ。
【図２】 ＧＡＴ−ＯＳ２ ＰＣＲ同定プロトコルを用いた、異系統のＰＣＲ解析。
ゲルの装填順：レーン１、分子量マーカー（１００bpラダー）、レーン２〜１１、異なったトランスジェニックイベントを含むイネ植物由来のＤＮＡサンプル、Ｍ２０２野生型由来のＤＮＡ、レーン１３、ベンガル野生型由来のＤＮＡ、レーン１４、陰性対照（水）、レーン１５、分子量マーカー（１００bpラダー）
Claims (9)
- ＡＴＣＣに番号２０３３５２で寄託されている種子から育成したイネ植物の繁殖及び／又は該イネ植物との育種によって得ることができる、トランスジェニックの、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子。
- ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子から育成される植物。
- 請求項２記載の植物の細胞又は組織。
- ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子。
- 請求項１記載の植物の育成を含む、イネ植物の栽培方法。
- 栽培されているイネ植物にグルホシネートを活性成分として含む除草剤を適用することを更に含む、請求項５記載の方法。
- 請求項１記載の植物の交配を含む、イネの育種方法。
- 請求項１記載のトランスジェニック植物、又はその細胞、組織又は種子を同定する方法であって、該方法が、該トランスジェニック植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、３１３bpのＤＮＡ断片を増幅することに用いることができるかどうかを確かめることを含む、方法。
- 請求項１記載のトランスジェニック植物、その細胞、組織又は種子を同定するためのキットであって、該キットが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する少なくとも２つのＰＣＲプライマーを含む、キット。
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