JP2002528114A - グルホシネート耐性イネ - Google Patents

グルホシネート耐性イネ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定の形質転換イベントを有すること、特にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下にあるｂａｒ遺伝子の、イネゲノム中の特定の位置における存在によって特徴づけられるイネ植物、植物材料及び種子に関する。本発明のイネ植物は、グルホシネート耐性と、最大限の全般的な農業的性質、遺伝的安定性及び異なる遺伝的背景への適合性とをあわせ持つ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特にＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にある、イネゲノム中
の特定の場所の、bar遺伝子の存在による特定の形質転換イベントを有すること
により特徴づけられるイネ植物、植物材料及び種子に関する。本発明のイネ植物
は、グルホシネート耐性と最も望ましい全体的な農業的性能、すなわち遺伝的安
定性及び異なった遺伝的背景に対する適合性とを兼ね備えている。
【０００２】 ここで指摘する全ての文献は、ここに、参考文献によってこの文章中に組み込
まれる。
【０００３】
【従来の技術】
植物における導入遺伝子の表現型の発現は、遺伝子そのものの構造及び該植物
ゲノム中でのその位置によって決定される。同時に、ゲノム中における異なる位
置の導入遺伝子の存在は、その植物の表現型全般に影響し得る。遺伝的操作によ
って、植物において、商業的に興味深い形質の農業上又は産業上の首尾よい導入
は異なる要因に依存して、非常に長い手順になり得る。遺伝的に形質転換された
植物の実際の形質転換及び再生は、広範囲にわたる遺伝的特徴づけ、育種及び圃
場試験における評価を含む、一連の選択段階の最初に過ぎない。
【０００４】 米の生産は、共通して種々の雑草の脅威にさらされる。それらの中には、競争
力が強く、激しく繁茂した場合は、その作物を経済的に魅力のないものにしてし
まうほどの収穫減という結果になり得る。温帯生産に典型的な、直播の、機械化
されたイネ栽培にとって、栽培技能（例えば、輪作、潅漑管理）及び除草剤が雑
草の制御のために不可欠である（Hill et.al）。
【０００５】 ｂａｒ遺伝子（Thompson et al, 1987, EMBO J. 6:2519-2523;Deblock et al.
1987, EMBO J. 6:2513-2518）は、ホスフィノスリシン・アセチル化トランスフ
ェラーゼ（ＰＡＴ）をコードしている遺伝子であり、それが植物中で発現すると
、除草剤化合物ホスフィノスリシン（グルホシネートとも呼ばれる）又はバイア
ラホス（例えば米国特許第５６４６０２４号及び第５５６１２３６号も参照のこ
と）及びそれらの塩及びそれらの光学異性体に対する耐性を与える。ＰＡＴをコ
ードする他の遺伝子は既に記載されている（例えば：Wohlleben et al., 1988,
Gene 70:25-37; EP 275957; US 5276268; US5637489; US5273894を参照のこと）
。
【０００６】 密集した胚カルスを形成することができる完全な組織又はそのような組織から
得られた密集したカルスのエレクトロポレーションによる単子葉植物の形質転換
は米国特許第５６４１６６４号に記載されている。ここに、ｂａｒ遺伝子のエレ
クトロポレーションによるイネ密集胚カルスの形質転換及びトランスジェニック
イネ植物の再生が開示されている。
【０００７】 ＤＮＡでコートした金粒子と一緒の爆発による未成熟イネカルスの細胞の形質
転換によって得られた、ｂａｒ遺伝子又はハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇ
遺伝子と一緒にｇｕｓ遺伝子を含む、トランスジェニックイネ植物が、記載され
ている（Christou et al,:1991: Biotechnology 9:957）
【０００８】 集合懸濁細胞のエレクトロポレーションによるイネのｂａｒ遺伝子での形質転
換は、米国特許第５６７９５５８号に記載されている。
【０００９】 しかしながら、前述の文献は、本発明を教示又は示唆するものではない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明のまとめ 本発明は、以下の特徴： ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、 ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥ
ｃｏＲＩ断片； ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして
他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである
一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そ
して他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥ
ｃｏＲＶ断片； iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、
１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長
さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片； vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである
、１つのＮｓｉＩ断片； （ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８の
ヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３
２７bp断片とハイブリダイズすることができる） の群から選択される制限断片の１つ以上、例えば少なくとも２つ、有利には少な
くとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好まし
くは６つを生じることができ、及び／又は、 ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号
５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用
いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用い
ることができる（又は、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列
を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅された約２９
０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を含む） の片方又は両方によって特徴づけられるトランスジェニック、グルホシネート耐
性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１１】 本発明は、その植物、細胞、組織又は種子が、上のｉ）、ii）、iii）、iV）
及びvi）に記載された制限断片又は制限断片対（ここで、選択は、上のｉ）、ii
）、iii）、iV）及びvi）のいかなる組合わせも含むことができる）を含む上記
の群から選択される、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なく
とも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましく
は６つを生じることができることを特徴とする、トランスジェニック、グルホシ
ネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１２】 本発明は、好ましくは上記ａ）及びｂ）に記載された特長の両方によって特徴
づけられる、トランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又
は種子に関する。
【００１３】 本発明は、ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子、この
種子から育成された植物、及びこの種子から育成された植物の細胞又は組織にも
関する。
【００１４】 本発明は、さらに、ここで議論した３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子フランキング領域（
ここで議論した）のその間を含む植物、種子、細胞もしくは組織（例えば、イネ
植物、種子、細胞又は組織）、又は、ここに開示した、フランキング領域−３５
Ｓ−bar、遺伝子−フランキング領域構築物、又は挿入領域のような配列の、少
なくとも６５％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば少なくと
も９０％、例えば少なくとも９５％若しくは９７％でもよく、又は１００％同じ
ヌクレオチド配列を含む植物、種子、細胞又は組織（例えばイネ植物、種子、細
胞又は組織）にも関する。
【００１５】 本発明は、さらに上記の本発明のイネ植物の栽培方法、さらに特定すると、グ
ルホシネートを活性成分とする除草剤を栽培されるイネ植物に施すことを含む方
法に関する。
【００１６】 本発明のイネ植物は、グルホシネートを活性成分とする除草剤を施す上記の方
法に従って栽培された場合、同じ栽培種の形質転換されていないイネに比較して
改善された成長を示すことが確かめられている。したがって、本発明は、イネ植
物の生産力又は成長を改善するための方法であると解することができる。
【００１７】 本発明は、本発明のイネ植物との交雑を含む、イネの育種方法も提供する。
【００１８】 本発明はさらに、配列番号９を特徴とする、イネ細胞の染色体ＤＮＡの一部へ
の、組み換えＤＮＡ分子の挿入、及び場合により、該形質転換イネ細胞からのイ
ネ植物の再生を含む、イネ植物のトランスジェニック細胞又はそれから得られる
植物体の製造方法を提供する。
【００１９】 本発明はさらに、トランスジェニック植物又はその細胞若しくは組織を同定す
る方法であって、該方法が、トランスジェニック植物、細胞又は組織のゲノムＤ
ＮＡが以下の特徴： ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、 ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥ
ｃｏＲＩ断片； ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして
他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである
一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そ
して他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥ
ｃｏＲＶ断片； iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、
１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長
さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片； vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである
、１つのＮｓｉＩ断片； （ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８の
ヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３
２７bp断片とハイブリダイズすることができる） の群から選択される制限断片又は制限断片対の少なくとも３つ、例えば少なくと
も５つ、さらに好ましくは６つを生じることができ、及び／又は、 ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号
５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用
いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用い
ることができる の片方又は両方を確認することを含む方法にも関する。
【００２０】 本発明はさらに、本発明の選ばれた事項を含むトランスジェニック植物を同定
するためのキットであって、該キットが、ＰＣＲ同定プロトコル中で用いる、外
来ＤＮＡを認識するＰＣＲプローブ及びＧＡＴ−ＯＳ２の３′又は５′フランキ
ング配列、好ましくは、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列
を有するプローブを含むキットに関する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
以下の、実施例によって説明されるが、本発明を記載された特定の実施態様に
限定しようとするものではない、詳細な説明は、参照として組み込まれる、付随
している図と関連して理解されなければならない。
【００２２】 詳細な説明 ここで用いられる用語「遺伝子」は、一緒になってプロモーター領域を形成す
るプロモーター及び５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）、コーディング領域（タンパ
ク質をコードしていてもしていなくてもよい）、及びポリアデニル化部位を含む
非翻訳３′領域（３′ＵＴＲ）のような、作動可能に連結された数個のＤＮＡ断
片を含むいかなるＤＮＡ配列をもいう。典型的に植物細胞中においては、５′Ｕ
ＴＲ、コーディング領域及び３′ＵＴＲは、タンパク質をコードしている遺伝子
である場合にはタンパク質に翻訳されるＲＮＡに転写される。１つの遺伝子は例
えばイントロンのような付加的なＤＮＡ断片を含んでもよい。ここで用いられて
いるように、遺伝子座とは、ある遺伝子の植物のゲノムにおける位置である。
【００２３】 遺伝子又はＤＮＡ配列に対していう場合の「キメラ」は、その遺伝子又は配列
が、（プロモーター、５′ＵＴＲ、コーディング領域、３′ＵＴＲ、イントロン
のように）少なくとも２つの機能的に関係のあるＤＮＡ断片であって、天然では
互いに関連しておらず、例えば他の材料に由来するものを含んでいるという事実
に言及するのに用いられる。植物種に関する遺伝子又はＤＮＡ配列についての「
外来」は、その植物種に天然では発見されない遺伝子又はＤＮＡ配列を示すため
に用いられる。
【００２４】 ここで用いられているように、用語「導入遺伝子」とは、植物のゲノムに組み
込まれた組み換えＤＮＡ分子をいう。用語「組み換えＤＮＡ分子」は、組み換え
又は他の手順で得ることができる、ＤＮＡであり得るような、単離された核酸分
子を含むことができ、かつ例証するために用いられる。この組み換えＤＮＡ分子
は、通常、形質転換された植物に１つ以上の特徴を与えることができる、少なく
とも１つの「問題の遺伝子」（例えばキメラ遺伝子）の少なくとも１つのコピー
を含む。「トランスジェニック植物」は、その全ての細胞のゲノムに導入遺伝子
を含む植物をいう。
【００２５】 組み換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組み込みは、典型的には細胞又は組織の
形質転換（又は他の遺伝的操作）から結果として生じる。組み込みの特定の部位
は、機会又は予め決定された場所（もし標的を定めた組み込み法が用いられた場
合は）による。
【００２６】 導入遺伝子は、場所及び植物ゲノム中における組み換えＤＮＡ分子の組み込み
部位の相対的位置によって特徴づけられる。導入遺伝子が挿入されている植物ゲ
ノム中での部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」として言及されている。
導入遺伝子の植物ゲノム中への挿入は、その植物ＤＮＡの欠失と関連しており「
標的部位欠失」として言及されている。ここで用いられているように、「フラン
キング領域」又は「フランキング配列」は、導入遺伝子のすぐ上流でかつ隣接し
ているか、又はすぐ下流でかつ隣接している少なくとも２０bp、好ましくは５０
bp、及び５０００bpまでの植物ゲノムの配列をいう。導入遺伝子のランダム組み
込みに先行する形質転換手順は、特徴づけられ、それぞれの形質転換体に独特の
、異なるフランキング領域を有する形質転換体を生ずる。伝統的な交配によって
導入遺伝子が植物に導入された場合、植物ゲノムにおけるその挿入部位又はその
フランキング領域は一般的に変化しないであろう。ここで用いられているように
、「挿入領域」は、その挿入部位（及び起こり得る標的部位の欠失）、及びその
（まだ形質転換されていない）植物ゲノムにおける導入遺伝子の上流及び下流フ
ランキング領域、によって囲まれた領域に相当する領域をいう。
【００２７】 導入遺伝子の表現は、該導入遺伝子に含まれる問題の遺伝子（単数又は複数）
が、該植物に１つ以上の形態的形質（その形態的形質は、形質転換で用いられる
組み換えＤＮＡ分子−形質転換するＤＮＡ（問題の遺伝子（単数又は複数）の一
部又は全部の構造及び機能を基礎として）の導入によって与えられようとされて
いたものである）（例えば除草剤耐性）を与えるように発現されることを示すた
めに用いられる。
【００２８】 イベントは、遺伝的操作の結果、問題の遺伝子の少なくとも１コピーを含む導
入遺伝子を有する（人工的な）遺伝子座として定義される。１つのイベントの典
型的な対立遺伝子の状態は、導入遺伝子の存在又は不存在である。イベントは、
導入遺伝子の発現によって形態的に特徴づけられる。分子レベルでは、イベント
は制限地図（例えばサザンブロッティングによって決定されるようなもの）及び
／又は導入遺伝子の上流及び／若しくは下流及び／又は該導入遺伝子の分子の相
対的位置によって特徴づけられる。通常、問題の遺伝子の少なくとも１つを含む
形質転換する遺伝子による植物の形質転換は、其々が独特な、多数のイベントへ
と導かれる。
【００２９】 ここで用いられる、エリートイベントは、同じ形質転換ＤＮＡでの形質転換に
より得られるイベントの群から、該導入遺伝子の発現及び安定性、及びそれを含
む植物の最も望ましい農業的特長に基づいて選択されるイベントである。エリー
トイベントの選択のための規準は、以下： ａ）導入遺伝子の存在が、農業的性能又は商業的価値のような、該植物の他の望
ましい特徴を損なわないこと； ｂ）該イベントが、安定に遺伝し、同一性管理のための適当な診断ツールが開発
できる、よく定義された分子構成によって特徴づけられること； ｃ）ヘテロ接合体（又は半接合体）及びホモ接合体のイベント状態のどちらにお
いても、そのイベントを有する植物が正常な農業的使用において暴露されるよう
な環境状態の範囲における商業的に許容しうるレベルで、導入遺伝子中の問題の
遺伝子（単数又は複数）が、正しい、適切なそして安定な空間的及び時間的な形
態発現を示すこと； の１つ以上、好ましくは２つ以上、有利には全てである。
【００３０】 導入遺伝子は、好ましい商業的な遺伝的背景への遺伝子移入を可能とする植物
ゲノム中の位置と結び付いていることが望ましい。エリートイベントとしてのイ
ベントの状態は、異なった、相当する遺伝的背景中への、該エリートイベントの
遺伝子移入及び例えば上記ａ）、ｂ）及びｃ）の規準の１つ、２つ又は全てに従
っていることの観察によって確認される。
【００３１】 したがって、「エリートイベント」は、上記の規準に一致する導入遺伝子を含
む遺伝子座をいう。植物体、植物材料又は種子のような後代は、そのゲノム中に
該エリートイベントを含む。
【００３２】 エリートイベント又はエリートイベントを有する植物若しくは植物材料を同定
するために開発された診断ツールは、該導入遺伝子を含むゲノム領域の特定の制
限地図及び／又は該導入遺伝子のフランキング領域（単数又は複数）の配列等の
、当該エリートイベントの特定の遺伝的特徴に基づいている。ここで用いられる
「制限地図」は、特定の制限酵素又は制限酵素のセットで植物ゲノムＤＮＡを切
断し、、該導入遺伝子と配列類似性を共有するプローブとの（特定の条件下にお
ける）ハイブリダイゼーションをした後に得られるサザンブロットパターンのセ
ットをいう。導入遺伝子の組み込み前に植物ゲノム中に存在する（内因的な）制
限部位により、導入遺伝子の挿入は、そのゲノムの特定の制限地図を変えるであ
ろう。このように、特定の形質転換体又はそれに由来する後代は、１つ以上の特
定の制限パターンによって同定され得る。１つのイベントの制限地図を決定する
条件は、制限地図同定プロトコル中に示されている。
【００３３】 代替的には、エリートイベントを含む植物又は植物材料は、ＰＣＲ同定プロト
コルによる試験で同定することができる。これは、該エリートイベントを特異的
に認識するプライマーを用いるＰＣＲである。要するに、プライマーの１セット
は、 ａ）エリートイベントの３′又は５′フランキング配列、及び ｂ）外来のＤＮＡ中の配列 を認識し、それらのプライマーは、好ましくは１００〜３５０ヌクレオチドの断
片（組み込み断片）を増幅するように開発される。好ましくは、該植物種の管理
維持遺伝子中の断片を増幅するプライマーの１セットとしての対照が含まれる（
断片は好ましくは増幅された組み込み断片よりも大きいものである）。該特異的
プライマーの配列を含む、ＰＣＲに最も好ましい条件は、ＰＣＲ同定プロトコル
中に特定されている。
【００３４】 例えば、ヌクレオチド配列に関する、用語「類似性」は、２つの配列間のホモ
ロジーの量的測定を示すことを目的とする。配列類似性百分率は、 （Ｎref−Ｎdif）＊１００／Ｎdif 〔式中、Ｎdifは、並べたときに２つの配列中の非同一塩基の合計数であり、Ｎr ef は、一方の配列中の塩基の数である〕 のように計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、
配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと、７５％の類似性を有することとなる（Ｎref＝８、Ｎd if ＝２）。本発明は、核酸分子及び、ここに開示されている配列と、少なくとも
６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８
０％又は有利には少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくと
も９５％又はさらに９７％若しくは１００％の類似性を有する配列、並びにその
ような核酸分子を含有する植物、細胞、組織、種子、及びその後代（例えば、イ
ネ植物、細胞、組織、種子及びその後代）を包含する。代替的に、又は加えて、
配列についての「類似性」は、２つの配列のうちの短いほうのヌクレオチド数に
よって分割される同一のヌクレオチドの位置の数に関係する（ここで、２つの配
列の並び（アラインメント）は、読み枠サイズ２０ヌクレオチド、１単語長さ４
ヌクレオチド、ギャップペナルティ４を用いたWilburとLipmannのアルゴリズム
（Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726）にしたがって決定することがで
き、コンピュータ支援解析及び並びを含めた配列データの解釈は、Intelligenet
ics（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Intelligenetics 社、CA）のプログラムを用いて
簡便に実施することができる）。「本質的に類似の」配列は、少なくとも約７５
％、有利には少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、好ましくは少な
くとも約９０％、特に約９５％、例えば少なくとも９７％、及び特に約１００％
の配列の類似性又は同一性を有する。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似
する、又は類似するという場合には、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は、ＲＮＡ
配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考慮される。
【００３５】 本発明は、イネにおけるエリートイベント、ＧＡＴ−ＯＳ２、このイベントに
由来する植物、植物材料又は植物細胞に関する。エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ
２を含有する植物は、実施例１に記載するように、プラスミドｐＢ／３５Ｓｂａ
ｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片（配列番号８）での形質転換を通
じて得られる。このエリートイベントをつくり出すために用いられる組み換えＤ
ＮＡ分子は、酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする
ＤＮＡ及びカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを含む（ここで
、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする配列は、（「３
５Ｓ−ｂａｒ遺伝子」と称する）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモ
ーターの調節下にある）。３５Ｓプロモーターは、イネにおいて「構成的」発現
パターンを有し（Battraw et al., 1990, Plant Mol Biol 15:527-538）、それ
は、ほとんどの植物において、植物ライフサイクルのほとんどの間、著しく発現
することを意味する。イネ植物における３５Ｓ−ｂａｒの発現は、除草剤化合物
ホスフィノスリシン又はバイアラホス又はグルホシネート又はより一般的にはグ
ルタミンシンテターゼ阻害剤又はその塩若しくは光学異性体に対する耐性を与え
る。
【００３６】 ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（１）に記載さ
れた制限地図同定プロトコルにしたがって同定することができる。簡単には、イ
ネゲノムＤＮＡを、以下の制限酵素：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈ
ｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩの選択（好ましくは少なくとも１つ、例えば少
なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも
５つ、例えば３つから６つ）で消化し、ナイロンメンブレン上にトランスファー
し、プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの約１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブ
リダイズする。次に、用いたそれぞれの制限酵素について以下の断片： ・ＥｃｏＲＩ：約１１５９〜１７００bpの、好ましくは約１３２７bpの１つの断
片 ・ＢａｍＨＩ：約１７００bp〜２１４０bpの、好ましくは約２．０kbpの１つの
断片及び約８０５〜１０９３bpの、好ましくは約８０５bpの１つの断片 ・ＥｃｏＲＶ：約５０７７bpより大きい、好ましくは約１２kbpの１つの断片及
び約２８３８〜４５０７bpの、好ましくは約３．８kbpの１つの断片 ・ＨｉｎｄIII：約５０７７〜１１４９７bpの、好ましくは約５．３kbpの１つの
断片 ・ＮｃｏＩ：約２８３８〜約４５０７bpの、好ましくは１つが約４．１kbpであ
り１つが約３．１kbpである２つの断片 ・ＮｓｉＩ：約４７４９〜約１１４９７bpの、好ましくは約５．１kbpの１つの
断片 が同定されるかどうかを測定する。ＤＮＡ断片の長さは公知の長さのＤＮＡ断片
のセット、特にファージλＤＮＡのＰｓｔＩ断片との比較で測定される。 もし、これらの制限酵素の、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利に
は少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好
ましくは全てで消化した後の植物材料が、上に記載したものと同じ長さのＤＮＡ
断片を生ずるならば、該イネ植物は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有する
と決定される。
【００３７】 ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（２）に記載
されたＰＣＲ同定プロトコルにしたがって同定することもできる。簡単には、Ｇ
ＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識するプライマー、特に配列番号
５の配列のプライマー、及び導入遺伝子中の配列を認識するプライマー、特に配
列番号４の配列のプライマーを用いて、イネゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅
する。内因性のイネプライマーを対照として用いる。もし、植物材料が、約２９
０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpの断片を生ずれば、該イネ植物はエリー
トイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００３８】 ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、それらのグルホシネート耐性によっても特徴
づけられ、それは本発明の文脈において、植物が、除草剤Liberty（登録商標）
に対して耐性であることを含んでいる。Liberty（登録商標）に対する耐性は、
３〜４葉の段階で２００g活性成分/ヘクタール（g.a.i/ha）、好ましくは４００
g.a.i/ha、そして可能ならば１６００g.a.i/haまでの噴霧が、該植物を殺さない
という規準で決定される。ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、さらにその細胞中の
、ＰＡＴアッセイ（De Block et al, 1987, supra）で測定されるホスフィノス
リシンアセチルトランスフェラーゼの存在によって特徴づけられる。
【００３９】 ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、例えばＡＴＣＣにＡＴＣＣ２０３３５２の番
号で寄託されている種子から得ることができる。そのような植物は、従来の育種
スキームにおいて、同じ特徴についてさらに形質転換された植物を作るため、又
は同じ植物種の他の栽培種に本発明のエリートイベントを導入するために、さら
に増殖及び又は使用することができる。これらの植物から得られた種子は、それ
らのゲノムに安定に組み込まれるエリートイベントを含んでいる。
【００４０】 本発明のイネ植物は、従来の方法で栽培することができる。導入遺伝子の存在
は、それらがグルホシネートに対して耐性であることを確保する。したがって、
そのようなイネ植物が育成される圃場中の雑草は、グルホシネートを活性成分と
して含有する除草剤（Liberty（登録商標）のような）の適用によって調節する
ことができる。
【００４１】 ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、以下の市場で入手可能な米国におけるイネ品
種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン
、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と同様
の農業的特長によって特徴づけられる。関連する農業的特長は、植物丈、穂の強
度／硬直性、耐倒伏性、葉形態（長さ、幅、刀状葉片の角度）、成熟までの期間
、小花の構成、多穂、種子外皮の完全閉覆、穀粒サイズ及び形状、及び穀粒生産
及び収量である。
【００４２】 イネ植物ゲノムのこの領域、さらに詳しくはイネ植物ゲノムにおけるこの部位
における導入遺伝子の存在が、このイベントに対して特定の問題とする表現型の
又は分子レベルでの特徴を与えることが観察されている。さらに詳細には、ゲノ
ム中のこの特定部位の導入遺伝子の存在が、該植物の望ましい農業的性質のいか
なる側面も有意に損なうことのない、導入遺伝子の安定した表現型発現を生じさ
せるのである。このように、配列番号９に相当する挿入領域、さらに詳しくはそ
の中のＧＡＴ−Ｓ２の挿入部位は、除草剤抵抗性遺伝子、さらに特定すると３５
Ｓプロモーターの調節下のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、特
にプラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片のような、問
題の遺伝子（単数又は複数）の導入に特に適切であることが示されている。
【００４３】 組み換えＤＮＡ分子はこの挿入領域に標的挿入法を用いて特異的に挿入され得
る。そのような方法は、当業者によく知られており、例えば、限定されるもので
はないが、Saccharomyces cervisiae 由来のＦＬＰリコンビナーゼ（米国特許第
５５２７６９５号）、Escherichia Coli ファージ Ｐ１由来のＣＲＥリコンビ
ナーゼ（公開されたＰＣＴ出願明細書ＷＯ９１０９９５７）、Saccharomyces ro
uxiiのｐＳＲＩ由来のリコンビナーゼ（Araki et al., 1985, J Mol Biol 182:1
91-203）、又は米国特許第４６７３６４０号に記載されているようなλファージ
組み換え系を用いた相同性組み換えを含む。
【００４４】 ＤＮＡは、エレクトロポレーション法、ＤＮＡで被覆した金粒子又は生分解性
物質の火薬打ち込み法、又はアグロバクテリウム若しくはポリエチレングリコー
ル媒介法等の方法を含む技術によって、イネゲノム等の植物ゲノム中に挿入する
ことができる。
【００４５】 ここで用いる「含む」は、言及された特長、整数、関連する工程又は成分の存
在を定義するが、１つ以上の特徴、整数、工程若しくは成分、又はそれらの群の
存在又は添加を排除しないというように解釈される。したがって、例えばヌクレ
オチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又はタンパク質は、実際に指摘したよりも
多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでもよく、すなわち、より大きい核酸又
はタンパク質に埋め込まれていてもよい。機能的に又は構造的に定義されるＤＮ
Ａ配列を含むキメラ遺伝子は、付加的なＤＮＡ配列等を含んでいてよい。
【００４６】 以下の実施例は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有するイネ植物の開発及
び特徴を記載している。
【００４７】 特に述べる場合を除き、全ての組み換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al.(1989
) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Ha
rbour Laboratory Press, NY 及びAsusubel et al.(1994) Current Protocols i
n Molecular Biology, Current Protocols, USA の第１巻及び第２巻に記載され
た標準プロトコルにしたがって実施した。植物分子実験のための標準材料及び方
法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK) 及び Blackwell Scientific Pub
lications, UK によって出版された、R.D.D. Croy による、Plant Molecular Bi
ology Labfax (1993) に記載されている。
【００４８】 発明の詳細な説明及び実施例において、以下の配列の参照事項を述べる： 配列番号１： ＧＡＴ−ＯＳ２の５′フランキング領域を含む配列である 配列番号２： ＧＡＴ−ＯＳ２の３′フランキング領域を含む配列である 配列番号３： ＧＡＴ−ＯＳ２の挿入部位を含む配列である 配列番号４： ＯＳＡ０３：ＰＣＲ同定プロトコルのプライマーである 配列番号５： ＯＳＡ０４：ＰＣＲ同定プロトコルのＧＡＴ−ＯＳ２特異的
プライマーである 配列番号６： ＯＳＡ０１イネ内因性プライマーである 配列番号７： ＯＳＡ０２イネ内因性プライマーである 配列番号８： プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒである 配列番号９： 挿入領域である
【００４９】
【実施例】
実施例１ 除草剤抵抗性をコードする遺伝子でのイネの形質転換 ａ）３５Ｓプロモーターの調節下のbar遺伝子を含むキメラＤＮＡ（ｐＢ５／３
５Ｓｂａｒ）の構築
【００５０】 プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒを、以下の標準プロトコルに従って構築した
。プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの配列は、配列番号８に与えられている。Ｐ
ｖｕＩ−ＨｉｎｄIII消化によって、以下の遺伝的要素を含む１５０１bpの断片
が生じた。
【００５１】
【表１】
【００５２】 該１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片は、電気泳動後のこの断片の抽出
によって精製した。
【００５３】 ｂ）イネの形質転換 ベンガル品種は、ルイジアナ農業研究所のイネ研究所が開発した中粒イネであ
る。該品種は１９９２年に公的に開放された。来歴にはＭＡＲＳ及びＭ２０１（
linscombe S.D. et al. 1993, Crop Science: 33: 645-646）が含まれている。
【００５４】 ｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片でのイネ植
物の形質転換は、直接ＤＮＡ移入を用いて実施した。選抜は、生育を加速するた
めにＰＰＴ不存在において行った幼植物の再生段階を除く、全ての段階でホスフ
ィノスリシン（ＰＰＴ）について行った。その結果、最初の形質転換体のセット
（世代Ｔ0の植物）を生じた。
【００５５】 実施例２ イベントの開発 ａ）トランスジェニックホモ接合体系統の開発 種々のＴ0半接合体幼植物を組織培養から転化し、温室土壌に移し、開花及び
結実を可能にした。幼植物を、ねん性、生産力、及びアンモニアグルホシネート
に対する耐性について評価した。自家受粉によるＴ1種子をこれらの植物体から
集め、圃場で生育した。Ｔ1植物にLiberty（登録商標）除草剤を１ヘクタールあ
たり活性成分８００g（g.a.i./ha；農家への推奨用量は４００g.a.i./ha）で噴
霧した。除草剤の適用を生き延びたイベント及び除草剤耐性について３：１に分
離したイベントを更なる評価のために選抜した。耐性植物は、損傷（葉先端枯れ
）について評価した。
【００５６】 Ｔ2種子は選抜されたイベントの全ての耐性植物の穂から収穫した。それらを
列に蒔き、除草剤耐性の分離を評価するため、Ｔ2植物にLiberty（登録商標）除
草剤（１６００g.a.i／ha）を噴霧した。１００％の生存を有した列、すなわち
導入遺伝子についてホモ接合体である系統に相当する列を選抜した。それらを除
草剤損傷および表現形質について再び評価した。その穂系列の（望ましい特徴に
関しての）表現型の均一性に基づいて更なるイベントの選択を行った。
【００５７】 ｂ）導入遺伝子のイベントの特徴づけ−ＧＡＴ−ＯＳ２の選択 導入遺伝子のイベントは、サザンブロットパターン、一般的形質及び農業的性
質、そして収穫量についてさらに特徴づけられた。それが適切である場合には、
それらの特徴は、圃場状態下で決定された。
【００５８】 サザンブロット解析 導入遺伝子の存在は、イネゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＶでの酵素消化産物及びｐ
Ｂ５／３５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とのハイブリダイゼーション
を用いた標準的なサザンブロット解析によって確認した。関係するバンド強度は
、導入遺伝子座について植物がホモ接合体であるか半接合体であるかについて示
唆を提供した。２つのイベントは、単純な挿入であることがわかった。導入遺伝
子の分離パターンは、単純な遺伝子座のメンデル遺伝によって説明できることが
確認された。
【００５９】 Ｔ1及びＴ2植物を、植物丈、穂の強度／硬直性、倒伏性、葉形態（刀状葉片に
ついて、細すぎる又は異常な角度）、晩生、小花の構成、穂の不稔又は不完全稔
性、種子外皮の不完全閉覆（病害感受性を増加させることにつながる）、穀粒サ
イズ及び形状、及び穀粒生産及び収量を含む、多くの表現形質について評価した
。系統は、形質転換されていないベンガル品種及び以下のイネ品種：プリシラ、
サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ
２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と比較して、提示され
た農業的特長において同様である（又は改善されている）ことが評価された。い
くつかのケースにおいては、１つ以上の上述の形質について、１つの穂系列中の
植物がソマクローナル変異に関して分離した。これが農業的に興味深い表現形質
の導入という結果にならない限り、これらの植物体は、排除した。
【００６０】 収量評価のための圃場形質 Ｔ2種子を、選抜したホモ接合体集団からバルクで収穫し、標準品種ベンガル
と比較した。種子を、穂系列としてそれぞれのイベントを表す隔離された区画に
植えた。トランスジェニックの区画は、１６００g.a.i.／haのLiberty（登録商
標）除草剤を噴霧するか、噴霧しなかった（「非噴霧」区画）。非トランスジェ
ニック品種標準の区画は、Liberty（登録商標）を噴霧しなかった。その土地の
雑草を調節するための標準除草剤処理を、全ての区画に適用した。
【００６１】 トランスジェニックイベントを、ルイジアナ及びプエルトリコ（冬季種苗場）
を含む異なった場所で収量特性について試験した。
【００６２】 農業的パラメーター及び植物形態の順位統計の統計的解析、及び他の非パラメ
ーターデータを、親品種ベンガル及び以下のイネ品種：プリシラ、サイプレス、
ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１
０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と競争するための最適な商業的候補
を同定するためにそろえた。ＧＡＴ−ＯＳ２が、育種系統の組を作るために最も
有用であることを示すイベントであった。
【００６３】 実施例３ イベントＧＡＴ−ＯＳ２の特徴づけ ａ）該遺伝子座の詳細な分子的及び遺伝学的解析 ＧＡＴ−ＯＳ２イベントが、導入遺伝子の発現並びに農業的性質全般が最良で
あるイベントであると同定されると、導入遺伝子の遺伝子座が分子レベルで詳細
に解析された。これには、サザンブロット解析及び導入遺伝子のフランキング領
域のシークエンスも含まれた。
【００６４】 （１）複数の制限酵素を用いたサザンブロット解析 葉組織をトランスジェニック植物及び対照植物から収穫した。Dellaporta et
al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21)にしたが
って、葉組織から全ゲノムＤＮＡを単離した。吸光度計で２６０nmの波長の吸光
度を測定することにより、それぞれの調製物のＤＮＡ濃度を測定した。
【００６５】 ゲノムＤＮＡ１０ngを、製造者の推奨条件を適用して最終反応量４０μlで制
限酵素で消化した。消化の時間及び／又は制限酵素の量は、非特異的消化を伴わ
ないゲノムＤＮＡの完全な消化を確実なものとするように調節した。消化の後、
消化したＤＮＡサンプルに４μlの泳動用色素（loading dye）を添加し、１％ア
ガロースゲル上に装填した。
【００６６】 以下の対照ＤＮＡもゲル上に装填した： ・非トランスジェニック植物から調製したゲノムＤＮＡの陰性対照 この陰性対照は、バックグラウンドハイブリダイゼーションがないことを確認
するために用いられる。 ・ＤＮＡ陽性対照：導入遺伝子をヘテロ接合のシングルコピーで組み込んだOryz
a sativaゲノムであり、ゲノムＤＮＡ１０μgは、ｐＢ５／３５ＳｂａｒＤＮＡ
の１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片の±１９ピコグラムと同数の分子当
量を有する（Oriza sativaの２倍体ゲノムサイズ：０．８×１０9bp）。ゲノム
当り１コピーのプラスミドを示す量を、消化された非トランスジェニックOryza
sativaＤＮＡ１μgに添加した。この再構成サンプルは、ハイブリダイゼーショ
ンがプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施
されたことを示すために用いられた。
【００６７】 ＰｓｔＩで消化したファージλＤＮＡ（ＣＩｉｎｄ１ｔｓ８５７Ｓａｍ７株、
Life Technologies）をサイズスタンダードとして含めた。
【００６８】 電気泳動の後、ＤＮＡサンプル（消化したイネゲノムＤＮＡ、対照、及びサイ
ズスタンダード）を、１２〜１６時間のキャピラリーブロッティングでナイロン
メンブレン上にトランスファーした。プローブの調製に用いたＤＮＡテンプレー
トは、プラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＥｃｏＲＩでの制限酵素消化物であっ
た。これは、形質転換ＤＮＡ（１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片）に関
係する部分を包含する１３２７bpのＤＮＡ断片を放出した。精製の後、ＤＮＡ断
片を標準的な手順にしたがってラベルし、該メンブレンに対してハイブリダイズ
のために用いた。
【００６９】 ハイブリダイゼーションは、標準的なストリンジェント条件下で行った。ラベ
ルしたプローブを９５℃〜１００℃のウォーターバス中で５〜１０分加熱して、
氷上で５〜１０分冷却することにより変性し、ハイブリダイゼーション溶液（６
×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、ＮａＣｌ３．０Ｍ、クエン酸Ｎａ０．３M、pH７．
０である）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液＝フィコール２％、
ポリビニルピロリドン２％、ウシ血清アルブミン２％である）、ＳＤＳ０．５％
及び変性したキャリアＤＮＡ（１本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長さ１２０〜３０００
ヌクレオチド）２０μg／ml）に添加した。ハイブリダイゼーションは、６５℃
で一晩行った。ブロットを洗浄溶液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で、６５℃
、２０〜４０分で３回行った。
【００７０】 オートラジオグラフを、電子的にスキャンした。 異なった制限酵素でのＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡの消化後に得られた制限パ
ターンを図１に示し、及びまとめを表１に示した。
【００７１】
【表２】
【００７２】 （２）フランキング配列の同定 ＧＡＴ−ＯＳ２イベント中の挿入された導入遺伝子のフランキング領域の配列
を、Liu et al.（1995, The Plant Journal 8(3):457-463）により記載されたよ
うに、温度非対称組合わせ（ＴＡＩＬ−）ＰＣＲ法を用いて決定した。この方法
は、連続する反応中で、３つの入れ子状態の特異的プライマーを、より短い任意
の緩認識（arbitrary degenerate: AD）プライマーと一緒に、特異的及び非特意
的産物の相対的増幅効率を温度で調節できるように用いる。特異的プライマーは
、導入遺伝子の境界にアニーリングするように、そしてそれらのアニーリング条
件に基づいて選択された。未精製第二及び第三ＰＣＲ産物の少量（５μl）を、
１％アガロースゲル上で解析した。第三ＰＣＲ産物を、予備増幅に用い、精製し
てDyeDeoxy Terminator cycleキットを用いた自動シークエンサーでシークエン
スした。
【００７３】 １．ＨｉｎｄIII部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ 使用したプライマー：
【００７４】
【表３】
【００７５】 ＭＤＢ５５６−ＭＤＢ４１１を用いて増幅した断片は、およそ４００bpであり
、その１１３bpをシークエンスした（５′フランク：配列番号１）。bp１〜bp９
２は、植物ＤＮＡを含んでおり、一方bp９３〜bp１１３は、ｐＢ５／３５Ｓｂａ
ｒのＤＮＡに相当する。
【００７６】 ＰｖｕＩ部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ 使用したプライマー：
【００７７】
【表４】
【００７８】 ＭＤＢ２８５−ＭＤＢ４１０を用いて増幅した断片は、およそ１２００bpであ
った（３′フランク：配列番号２）。bp１〜bp６０４は、ｐＢ５／３５Ｓｂａｒ
のＤＮＡに相当し、bp６０５〜bp１２７９は植物ＤＮＡを含んでいる。
【００７９】 （３）標的部位欠失の同定 野生型Oryza sativa品種ベンガルにおける導入遺伝子のフランキング領域中の
配列に相当するプライマーをテンプレートとして用い、導入遺伝子の挿入部位を
同定した。 以下のプライマーを用いた：
【００８０】
【表５】
【００８１】 これは、bp８３〜５５が標的部位欠失に相当する、１６８bpの断片（配列番号
３）を生じた。
【００８２】 したがって、シークエンスしたイネ挿入領域（配列番号９）は： １〜９２： ５′フランキング領域 配列番号１のbp１〜９２ ９３〜１１０： 標的部位欠失 配列番号３のbp３８〜５５ １１１〜７８５： ３′フランキング領域 配列番号２のbp６０５〜１２７９
を含む。
【００８３】 （４）該遺伝子座の遺伝的解析 挿入断片の遺伝的安定性を、数代に渡る後代植物における分子及び表現型解析
で確認した。
【００８４】 Ｔ0、Ｔ1及びＴ2世代のＧＡＴ−ＯＳ２イネ植物のグルホシネート耐性植物の
サザンブロット解析を比較し、同一であることがわかった。これは、ＧＡＴ−Ｏ
Ｓ２を含む植物における導入遺伝子の分子構成が安定しているということを証明
している。
【００８５】 ＧＡＴ−ＯＳ２イベントは、挿入断片が安定であることを示している少なくと
も３つの連続する後代において、単一遺伝子座としての導入遺伝子についてメン
デル分離を示している。
【００８６】 上記の結果に基づいて、ＧＡＴ−ＯＳ２は、エリートイベントであると同定さ
れた。
【００８７】 ｂ）同一性調節のための診断ツールの開発 該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むいかなるイネ植物材料をも同定する
ために以下のプロトコルが開発された。
【００８８】 （１）ＧＡＴ−ＯＳ２エリートイベント制限地図同定プロトコル 該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むイネ植物は、実施例３ａ）（１）に
記載されたのと本質的に同じサザンブロッティングによって同定することができ
る。すなわち、イネゲノムＤＮＡを、以下：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩ、の制限酵素の少なくとも３つ、好まし
くは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好ましくは全てで消化し、２
）ナイロンメンブレン上にトランスファーし、そして３）プラスミドｐＢ５／３
５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。用いられた
それぞれの制限酵素について、もしＤＮＡ断片が表１に列記したそれらと同じ長
さであると同定されれば、そのイネ植物は、該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２
を有すると決定される。
【００８９】 （２）エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２のポリメラーゼ連鎖反応同定プロトコル
未知のもののスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照でテストランをし
なければならない。示したプロトコルは、研究所によって異なるであろう成分（
テンプレートＤＮＡの調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄ
ＮＴＰ、サーマルサイクラー等）について最適化が必要とされるであろう。
【００９０】 該プロトコルにおいて、内因性の配列の増幅が重要な役割を果たす。既知のゲ
ノムＤＮＡテンプレート中の内因の及び導入遺伝子の配列の両方を等モルの量で
増幅するＰＣＲ及び温度サイクル条件を得なければならない。アガロースゲル電
気泳動で判断して、目的の内因性断片が増幅されない場合や、同じエチジウムブ
ロミド染色強度で目的配列が増幅されない場合には、ＰＣＲ条件の最適化が必要
とされよう。
【００９１】 テンプレートＤＮＡ テンプレートＤＮＡは、Edwards et al.（Nucleic Acid Research, 19, p1349
, 1991）に従って調製した。他の方法で調製したＤＮＡを用いる場合は、異なる
量のテンプレートを用いたテストランをすべきである。通常、最高の結果で５０
ngのＤＮＡテンプレートが得られる。
【００９２】 用いられる陽性及び陰性対照 以下の陽性及び陰性対照が、ＰＣＲの実施に含められるべきである： ＊マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応液にＤＮＡを添加しな
いＰＣＲである。期待される結果、すなわちＰＣＲ産物がないという結果が観察
された場合、ＰＣＲカクテルが目的ＤＮＡで汚染されていないということを示し
ている。 ＊ＤＮＡ陽性対照（導入遺伝子を含むことがわかっているゲノムＤＮＡサンプル
）。この陽性対照の成功した増幅は、ＰＣＲが、目的配列を増幅することができ
る条件下で行われたことを証明する。 ＊野生型ＤＮＡ対照。これは、用いられたテンプレートＤＮＡが、非トランスジ
ェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。期待される結果
、すなわち導入遺伝子のＰＣＲ産物の増幅がないが内因性ＰＣＲ産物の増幅があ
ること、が観察された場合、これはゲノムＤＮＡサンプル中に、検出し得る導入
遺伝子バックグラウンド増幅がないことを示す。
【００９３】 プライマー 導入遺伝子及びＧＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識する、以下
のプライマーを用いた：
【００９４】
【化１】
【００９５】 内因性配列を標的とするプライマーは、ＰＣＲカクテル中に常に含まれている
。これらのプライマーは、未知のサンプル中及びＤＮＡ陽性対照での内部対照と
して働く。内因性プライマーペアでの陽性の結果は、ゲノムＤＮＡの調製におい
て、ＰＣＲ産物が作られるために適切な品質のサンプルＤＮＡが得られたことを
証明する。用いられた内因性のプライマーは、以下のものである：
【００９６】
【化２】
【００９７】 増幅された断片 ＰＣＲ反応における、期待される増幅断片は、 プライマーペアＯＳＡ０１−ＯＳＡ０２について： ４５７bp（内因性対照） プライマーペアＯＳＡ０３−ＯＳＡ０４について： ３１３bp（エリートイベン
トＧＡＴ−ＯＳ２） である。
【００９８】 ＰＣＲ条件 ５０μl反応のためのＰＣＲ混合液は： テンプレートＤＮＡ ５μl １０×増幅バッファー（Ｔａｑポリメラーゼとともに供給される） ５μl １０mMｄＮＴＰ １μl ＯＳＡ０１（１０pmol／μl） １μl ＯＳＡ０２（１０pmol／μl） １μl ＯＳＡ０３（１０pmol／μl） ２μl ＯＳＡ０４（１０pmol／μl） ２μl Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット／μl） ０．２μl 水で５０μlにする
である。
【００９９】 最良の結果のために行われる温度サイクルのプロフィールは以下： ９５℃ ４分 その後：９５℃ １分 ５７℃ １分 ７２℃ ２分 を５サイクル その後：９２℃ ３０秒 ５７℃ ３０秒 ７２℃ １分 を２２〜２５サイクル その後：７２℃ ５分
【０１００】 アガロースゲル解析 １０〜２０μlのＰＣＲサンプルを、適当な分子量マーカー（例えば１００bp
ラダー ファルマシア）を備えた１．５％アガロースゲル（トリス−ホウ酸バッ
ファー）上に装填する。
【０１０１】 結果の有効性 １つのＰＣＲ反応及び１つのＰＣＲカクテルに含まれるトランスジェニック植
物ＤＮＡサンプルからのデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が期待されるＰＣＲ産物
（導入及び内因性の断片）を示すこと、２）ＤＮＡ陰性対照が、ＰＣＲ増幅に対
して陰性であること（断片なし）、及び３）野生型ＤＮＡ対照が期待される結果
（内因性断片の増幅）を示すこと、なしには受け入れられない。
【０１０２】 期待されるサイズの導入及び内因性ＰＣＲ産物の可視量を示しているレーンは
、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植物が、エリートイベントＧＡＴ−Ｏ
Ｓ２を有していることを示す。導入ＰＣＲ産物の可視量を示さず、内因性ＰＣＲ
産物の可視量を示しているレーンは、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植
物が、該エリートイベントを有していないことを示す。内因性及び導入ＰＣＲ産
物の可視量を示していないレーンは、ゲノムＤＮＡの質及び／又は量が、ＰＣＲ
産物を作ることができないものであることを示している。ゲノムＤＮＡの調製を
くり返し、適切な対照といっしょの新しいＰＣＲ反応を実施しなければならない
。
【０１０３】 ＧＡＴ−ＯＳ２を同定するための、弁別ＰＣＲプロトコルの使用 異なるトランスジェニックイベントを含む植物からのイネ葉材料（サンプル１
〜１０）を、上述のプロトコルに従って試験した。Ｍ２０２野生型及びベンガル
野生型からのサンプルを、陰性対照として採用した。
【０１０４】 ＰＣＲ解析の結果を、図２に示す。サンプル８及び９（実際には同じイベント
に由来する植物からのＤＮＡを含んでいる）が、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ
２を含んでいると認識された。試験された他の全ての系統は、このエリートイベ
ントを含んでいない。
【０１０５】 実施例４ 好ましい栽培種へのＧＡＴ−ＯＳ２の導入交雑 エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２は、反復戻し交雑により以下の栽培種に導入
された： ＊カリフォルニア産温帯ジャポニカ種（Ｍ２０４、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０
３等であるが、これに限定されるわけではない） ＊カリフォルニア産熱帯ジャポニカ種（Ｌ２０１、Ｌ２０２等であるが、これに
限定されるわけではない） ＊日本産及び韓国産温帯ジャポニカ種（コシヒカリ及びミリアン等であるが、こ
れに限定されるわけではない） ＊オーストラリア産温帯ジャポニカ種（ミリン及びジャラー等であるが、これに
限定されるわけではない） ＊地中海産温帯ジャポニカ種（バリラ、アルボリオ等であるが、これに限定され
るわけではない） ＊中国産インディカ種（ギチャオ、コンギ３１４、テキン等であるが、これに限
定されるわけではない） ＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種（ドゥルー、サイプレス、ジェファーソン、プリ
シラ、コッケイドー等であるが、これに限定されるわけではない） ＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種、中粒種（ベンガル、マース、ブラッツォ、マー
キュリー等であるが、これに限定されるわけではない） ＊南アメリカ産熱帯ジャポニカ種、長粒種（エルパソ１４４、ＩＲＧＡ４０９等
であるが、これに限定されるわけではない） ＊極東産バスマティ及びジャスミン型（カシミール、クワオダックマリ） ＊アフリカ産ジャバニカ型（青米種）
【０１０６】 これらの栽培種へのエリートイベントの導入は、これらの栽培種のいかなる望
ましい表現型又は農業的特性にも重大に影響しておらず（連鎖障害なし）、一方
グルホシネート耐性によって測定される導入遺伝子の発現は、商業的に受け入れ
られるレベルに合致していた。これは、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２の状況
をエリートイベントとして確認するものである。
【０１０７】 上記請求項で用いられている通り、明確に示されている場合を除いて、用語「
植物」は、限定されないいかなる種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細
胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを含む、成熟のいかなる段階の植物組
織、並びに、いかなるそのような植物から採取した／に由来する、いかなる細胞
、組織又は器官、をも包含することを意図する。
【０１０８】 エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含む種子は、ＡＴＣＣに番号：ＡＴＣＣ２
０３３５２で、ＧＡＴ−ＯＳ２として寄託されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡ消化後に得られた制限地図である。 サザンブロットによって解析したゲルの装填順：レーン１、ＰｓｔＩで消化し
たλＤＮＡ、レーン２、ＥｃｏＲＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン３
ＢａｍＨＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン４、ＥｃｏＲＶで消化した
ＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン５、ＨｉｎｄIIIで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮ
Ａ、レーン６、ＮｃｏＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン７、ＮｓｉＩ
で消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン８、未トンスジェニックイネＤＮＡ、
レーン９、ＥｃｏＲＩで消化した対照プラスミドＤＮＡ。
【図２】 ＧＡＴ−ＯＳ２ ＰＣＲ同定プロトコルを用いた、異系統のＰＣＲ解析。 ゲルの装填順：レーン１、分子量マーカー（１００bpラダー）、レーン２〜１
１、異なったトランスジェニックイベントを含むイネ植物由来のＤＮＡサンプル
、Ｍ２０２野生型由来のＤＮＡ、レーン１３、ベンガル野生型由来のＤＮＡ、レ
ーン１４、陰性対照（水）、レーン１５、分子量マーカー（１００bpラダー）
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２８日（２０００．４．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項４２】 該キットが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレ
オチド配列を有するＰＣＲプローブを含む、請求項４１記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月２７日（２００１．６．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 グルホシネート耐性イネ
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は、特にＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にある、イネゲノム中
の特定の場所の、bar遺伝子の存在による特定の形質転換イベントを有すること
により特徴づけられるイネ植物、植物材料及び種子に関する。本発明のイネ植物
は、グルホシネート耐性と最も望ましい全体的な農業的性能、すなわち遺伝的安
定性及び異なった遺伝的背景に対する適合性とを兼ね備えている。
【０００２】 ここで指摘する全ての文献は、ここに、参考文献によってこの文章中に組み込
まれる。
【０００３】
【従来の技術】 植物における導入遺伝子の表現型の発現は、遺伝子そのものの構造及び該植物
ゲノム中でのその位置によって決定される。同時に、ゲノム中における異なる位
置の導入遺伝子の存在は、その植物の表現型全般に影響し得る。遺伝的操作によ
って、植物において、商業的に興味深い形質の農業上又は産業上の首尾よい導入
は異なる要因に依存して、非常に長い手順になり得る。遺伝的に形質転換された
植物の実際の形質転換及び再生は、広範囲にわたる遺伝的特徴づけ、育種及び圃
場試験における評価を含む、一連の選択段階の最初に過ぎない。
【０００４】 米の生産は、共通して種々の雑草の脅威にさらされる。それらの中には、競争
力が強く、激しく繁茂した場合は、その作物を経済的に魅力のないものにしてし
まうほどの収穫減という結果になり得る。温帯生産に典型的な、直播の、機械化
されたイネ栽培にとって、栽培技能（例えば、輪作、潅漑管理）及び除草剤が雑
草の制御のために不可欠である（Hill et.al）。
【０００５】 ｂａｒ遺伝子（Thompson et al, 1987, EMBO J. 6:2519-2523;Deblock et al.
1987, EMBO J. 6:2513-2518）は、ホスフィノスリシン・アセチル化トランスフ
ェラーゼ（ＰＡＴ）をコードしている遺伝子であり、それが植物中で発現すると
、除草剤化合物ホスフィノスリシン（グルホシネートとも呼ばれる）又はバイア
ラホス（例えば米国特許第５６４６０２４号及び第５５６１２３６号も参照のこ
と）及びそれらの塩及びそれらの光学異性体に対する耐性を与える。ＰＡＴをコ
ードする他の遺伝子は既に記載されている（例えば：Wohlleben et al., 1988,
Gene 70:25-37; EP 275957; US 5276268; US5637489; US5273894を参照のこと）
。
【０００６】 密集した胚カルスを形成することができる完全な組織又はそのような組織から
得られた密集したカルスのエレクトロポレーションによる単子葉植物の形質転換
は米国特許第５６４１６６４号に記載されている。ここに、ｂａｒ遺伝子のエレ
クトロポレーションによるイネ密集胚カルスの形質転換及びトランスジェニック
イネ植物の再生が開示されている。
【０００７】 ＤＮＡでコートした金粒子と一緒の爆発による未成熟イネカルスの細胞の形質
転換によって得られた、ｂａｒ遺伝子又はハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇ
遺伝子と一緒にｇｕｓ遺伝子を含む、トランスジェニックイネ植物が、記載され
ている（Christou et al,:1991: Biotechnology 9:957）
【０００８】 集合懸濁細胞のエレクトロポレーションによるイネのｂａｒ遺伝子での形質転
換は、米国特許第５６７９５５８号に記載されている。
【０００９】 しかしながら、前述の文献は、本発明を教示又は示唆するものではない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】 本発明のまとめ 本発明は、以下の特徴： ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、 ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥ
ｃｏＲＩ断片； ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして
他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである
一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そ
して他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥ
ｃｏＲＶ断片； iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、
１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長
さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片； vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである
、１つのＮｓｉＩ断片； （ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８の
ヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３
２７bp断片とハイブリダイズすることができる） の群から選択される制限断片の１つ以上、例えば少なくとも２つ、有利には少な
くとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好まし
くは６つを生じることができ、及び／又は、 ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号
５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用
いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用い
ることができる（又は、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列
を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅された約２９
０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を含む） の片方又は両方によって特徴づけられるトランスジェニック、グルホシネート耐
性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１１】 本発明は、その植物、細胞、組織又は種子が、上のｉ）、ii）、iii）、iV）
及びvi）に記載された制限断片又は制限断片対（ここで、選択は、上のｉ）、ii
）、iii）、iV）及びvi）のいかなる組合わせも含むことができる）を含む上記
の群から選択される、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利には少なく
とも３つ、好ましくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、さらに好ましく
は６つを生じることができることを特徴とする、トランスジェニック、グルホシ
ネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子に関する。
【００１２】 本発明は、好ましくは上記ａ）及びｂ）に記載された特長の両方によって特徴
づけられる、トランスジェニック、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又
は種子に関する。
【００１３】 本発明は、ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子、この
種子から育成された植物、及びこの種子から育成された植物の細胞又は組織にも
関する。
【００１４】 本発明は、さらに、ここで議論した３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子フランキング領域（
ここで議論した）のその間を含む植物、種子、細胞もしくは組織（例えば、イネ
植物、種子、細胞又は組織）、又は、ここに開示した、フランキング領域−３５
Ｓ−bar、遺伝子−フランキング領域構築物、又は挿入領域のような配列の、少
なくとも６５％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば少なくと
も９０％、例えば少なくとも９５％若しくは９７％でもよく、又は１００％同じ
ヌクレオチド配列を含む植物、種子、細胞又は組織（例えばイネ植物、種子、細
胞又は組織）にも関する。
【００１５】 本発明は、さらに上記の本発明のイネ植物の栽培方法、さらに特定すると、グ
ルホシネートを活性成分とする除草剤を栽培されるイネ植物に施すことを含む方
法に関する。
【００１６】 本発明のイネ植物は、グルホシネートを活性成分とする除草剤を施す上記の方
法に従って栽培された場合、同じ栽培種の形質転換されていないイネに比較して
改善された成長を示すことが確かめられている。したがって、本発明は、イネ植
物の生産力又は成長を改善するための方法であると解することができる。
【００１７】 本発明は、本発明のイネ植物との交雑を含む、イネの育種方法も提供する。
【００１８】 本発明はさらに、配列番号９を特徴とする、イネ細胞の染色体ＤＮＡの一部へ
の、組み換えＤＮＡ分子の挿入、及び場合により、該形質転換イネ細胞からのイ
ネ植物の再生を含む、イネ植物のトランスジェニック細胞又はそれから得られる
植物体の製造方法を提供する。
【００１９】 本発明はさらに、トランスジェニック植物又はその細胞若しくは組織を同定す
る方法であって、該方法が、トランスジェニック植物、細胞又は組織のゲノムＤ
ＮＡが以下の特徴： ａ）植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、 ｉ）約１１５９〜約１７００bpの長さ、好ましくは１３２７bpの長さの１つのＥ
ｃｏＲＩ断片； ii）一方が約８０５〜１０９３bpの長さ、好ましくは約８０５bpの長さ、そして
他方が約１７００bp〜２１４０bpの長さ、好ましくは約２．０kbpの長さである
一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が約２８３８〜４５０７bpの長さ、好ましくは約３．８kbpの長さ、そ
して他方が約５０７７bpより長い、好ましくは約１２kbpの長さである一対のＥ
ｃｏＲＶ断片； iv）約５０７７〜１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．３kbpの長さである、
１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方とも約２８３８〜約４５０７bpの長さの、好ましくは約３．１kbpの長
さのもの及び約４．１kbpの長さのものである、一対のＮｃｏＩ断片； vi）約４７４９〜約１１４９７bpの長さ、好ましくは約５．１kbpの長さである
、１つのＮｓｉＩ断片； （ここで、各々の制限断片は標準的なストリンジェント条件下で、配列番号８の
ヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得られる約１３
２７bp断片とハイブリダイズすることができる） の群から選択される制限断片又は制限断片対の少なくとも３つ、例えば少なくと
も５つ、さらに好ましくは６つを生じることができ、及び／又は、 ｂ）該植物、細胞、組織又は種子のＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号
５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用
いて２９０〜３５０bp、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片を増幅するのに用い
ることができる の片方又は両方を確認することを含む方法にも関する。
【００２０】 本発明はさらに、本発明の選ばれた事項を含むトランスジェニック植物を同定
するためのキットであって、該キットが、ＰＣＲ同定プロトコル中で用いる、外
来ＤＮＡを認識するＰＣＲプローブ及びＧＡＴ−ＯＳ２の３′又は５′フランキ
ング配列、好ましくは、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列
を有するプローブを含むキットに関する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】 以下の、実施例によって説明されるが、本発明を記載された特定の実施態様に
限定しようとするものではない、詳細な説明は、参照として組み込まれる、付随
している図と関連して理解されなければならない。
【００２２】 詳細な説明 ここで用いられる用語「遺伝子」は、一緒になってプロモーター領域を形成す
るプロモーター及び５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）、コーディング領域（タンパ
ク質をコードしていてもしていなくてもよい）、及びポリアデニル化部位を含む
非翻訳３′領域（３′ＵＴＲ）のような、作動可能に連結された数個のＤＮＡ断
片を含むいかなるＤＮＡ配列をもいう。典型的に植物細胞中においては、５′Ｕ
ＴＲ、コーディング領域及び３′ＵＴＲは、タンパク質をコードしている遺伝子
である場合にはタンパク質に翻訳されるＲＮＡに転写される。１つの遺伝子は例
えばイントロンのような付加的なＤＮＡ断片を含んでもよい。ここで用いられて
いるように、遺伝子座とは、ある遺伝子の植物のゲノムにおける位置である。
【００２３】 遺伝子又はＤＮＡ配列に対していう場合の「キメラ」は、その遺伝子又は配列
が、（プロモーター、５′ＵＴＲ、コーディング領域、３′ＵＴＲ、イントロン
のように）少なくとも２つの機能的に関係のあるＤＮＡ断片であって、天然では
互いに関連しておらず、例えば他の材料に由来するものを含んでいるという事実
に言及するのに用いられる。植物種に関する遺伝子又はＤＮＡ配列についての「
外来」は、その植物種に天然では発見されない遺伝子又はＤＮＡ配列を示すため
に用いられる。
【００２４】 ここで用いられているように、用語「導入遺伝子」とは、植物のゲノムに組み
込まれた組み換えＤＮＡ分子をいう。用語「組み換えＤＮＡ分子」は、組み換え
又は他の手順で得ることができる、ＤＮＡであり得るような、単離された核酸分
子を含むことができ、かつ例証するために用いられる。この組み換えＤＮＡ分子
は、通常、形質転換された植物に１つ以上の特徴を与えることができる、少なく
とも１つの「問題の遺伝子」（例えばキメラ遺伝子）の少なくとも１つのコピー
を含む。「トランスジェニック植物」は、その全ての細胞のゲノムに導入遺伝子
を含む植物をいう。
【００２５】 組み換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組み込みは、典型的には細胞又は組織の
形質転換（又は他の遺伝的操作）から結果として生じる。組み込みの特定の部位
は、機会又は予め決定された場所（もし標的を定めた組み込み法が用いられた場
合は）による。
【００２６】 導入遺伝子は、場所及び植物ゲノム中における組み換えＤＮＡ分子の組み込み
部位の相対的位置によって特徴づけられる。導入遺伝子が挿入されている植物ゲ
ノム中での部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」として言及されている。
導入遺伝子の植物ゲノム中への挿入は、その植物ＤＮＡの欠失と関連しており「
標的部位欠失」として言及されている。ここで用いられているように、「フラン
キング領域」又は「フランキング配列」は、導入遺伝子のすぐ上流でかつ隣接し
ているか、又はすぐ下流でかつ隣接している少なくとも２０bp、好ましくは５０
bp、及び５０００bpまでの植物ゲノムの配列をいう。導入遺伝子のランダム組み
込みに先行する形質転換手順は、特徴づけられ、それぞれの形質転換体に独特の
、異なるフランキング領域を有する形質転換体を生ずる。伝統的な交配によって
導入遺伝子が植物に導入された場合、植物ゲノムにおけるその挿入部位又はその
フランキング領域は一般的に変化しないであろう。ここで用いられているように
、「挿入領域」は、その挿入部位（及び起こり得る標的部位の欠失）、及びその
（まだ形質転換されていない）植物ゲノムにおける導入遺伝子の上流及び下流フ
ランキング領域、によって囲まれた領域に相当する領域をいう。
【００２７】 導入遺伝子の表現は、該導入遺伝子に含まれる問題の遺伝子（単数又は複数）
が、該植物に１つ以上の形態的形質（その形態的形質は、形質転換で用いられる
組み換えＤＮＡ分子−形質転換するＤＮＡ（問題の遺伝子（単数又は複数）の一
部又は全部の構造及び機能を基礎として）の導入によって与えられようとされて
いたものである）（例えば除草剤耐性）を与えるように発現されることを示すた
めに用いられる。
【００２８】 イベントは、遺伝的操作の結果、問題の遺伝子の少なくとも１コピーを含む導
入遺伝子を有する（人工的な）遺伝子座として定義される。１つのイベントの典
型的な対立遺伝子の状態は、導入遺伝子の存在又は不存在である。イベントは、
導入遺伝子の発現によって形態的に特徴づけられる。分子レベルでは、イベント
は制限地図（例えばサザンブロッティングによって決定されるようなもの）及び
／又は導入遺伝子の上流及び／若しくは下流及び／又は該導入遺伝子の分子の相
対的位置によって特徴づけられる。通常、問題の遺伝子の少なくとも１つを含む
形質転換する遺伝子による植物の形質転換は、其々が独特な、多数のイベントへ
と導かれる。
【００２７】 ここで用いられる、エリートイベントは、同じ形質転換ＤＮＡでの形質転換に
より得られるイベントの群から、該導入遺伝子の発現及び安定性、及びそれを含
む植物の最も望ましい農業的特長に基づいて選択されるイベントである。エリー
トイベントの選択のための規準は、以下： ａ）導入遺伝子の存在が、農業的性能又は商業的価値のような、該植物の他の望
ましい特徴を損なわないこと； ｂ）該イベントが、安定に遺伝し、同一性管理のための適当な診断ツールが開発
できる、よく定義された分子構成によって特徴づけられること； ｃ）ヘテロ接合体（又は半接合体）及びホモ接合体のイベント状態のどちらにお
いても、そのイベントを有する植物が正常な農業的使用において暴露されるよう
な環境状態の範囲における商業的に許容しうるレベルで、導入遺伝子中の問題の
遺伝子（単数又は複数）が、正しい、適切なそして安定な空間的及び時間的な形
態発現を示すこと； の１つ以上、好ましくは２つ以上、有利には全てである。
【００３０】 導入遺伝子は、好ましい商業的な遺伝的背景への遺伝子移入を可能とする植物
ゲノム中の位置と結び付いていることが望ましい。エリートイベントとしてのイ
ベントの状態は、異なった、相当する遺伝的背景中への、該エリートイベントの
遺伝子移入及び例えば上記ａ）、ｂ）及びｃ）の規準の１つ、２つ又は全てに従
っていることの観察によって確認される。
【００３１】 したがって、「エリートイベント」は、上記の規準に一致する導入遺伝子を含
む遺伝子座をいう。植物体、植物材料又は種子のような後代は、そのゲノム中に
該エリートイベントを含む。
【００３２】 エリートイベント又はエリートイベントを有する植物若しくは植物材料を同定
するために開発された診断ツールは、該導入遺伝子を含むゲノム領域の特定の制
限地図及び／又は該導入遺伝子のフランキング領域（単数又は複数）の配列等の
、当該エリートイベントの特定の遺伝的特徴に基づいている。ここで用いられる
「制限地図」は、特定の制限酵素又は制限酵素のセットで植物ゲノムＤＮＡを切
断し、、該導入遺伝子と配列類似性を共有するプローブとの（特定の条件下にお
ける）ハイブリダイゼーションをした後に得られるサザンブロットパターンのセ
ットをいう。導入遺伝子の組み込み前に植物ゲノム中に存在する（内因的な）制
限部位により、導入遺伝子の挿入は、そのゲノムの特定の制限地図を変えるであ
ろう。このように、特定の形質転換体又はそれに由来する後代は、１つ以上の特
定の制限パターンによって同定され得る。１つのイベントの制限地図を決定する
条件は、制限地図同定プロトコル中に示されている。
【００３３】 代替的には、エリートイベントを含む植物又は植物材料は、ＰＣＲ同定プロト
コルによる試験で同定することができる。これは、該エリートイベントを特異的
に認識するプライマーを用いるＰＣＲである。要するに、プライマーの１セット
は、 ａ）エリートイベントの３′又は５′フランキング配列、及び ｂ）外来のＤＮＡ中の配列 を認識し、それらのプライマーは、好ましくは１００〜３５０ヌクレオチドの断
片（組み込み断片）を増幅するように開発される。好ましくは、該植物種の管理
維持遺伝子中の断片を増幅するプライマーの１セットとしての対照が含まれる（
断片は好ましくは増幅された組み込み断片よりも大きいものである）。該特異的
プライマーの配列を含む、ＰＣＲに最も好ましい条件は、ＰＣＲ同定プロトコル
中に特定されている。
【００３４】 例えば、ヌクレオチド配列に関する、用語「類似性」は、２つの配列間のホモ
ロジーの量的測定を示すことを目的とする。配列類似性百分率は、 （Ｎref−Ｎdif）＊１００／Ｎdif 〔式中、Ｎdifは、並べたときに２つの配列中の非同一塩基の合計数であり、Ｎr ef は、一方の配列中の塩基の数である〕 のように計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、
配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと、７５％の類似性を有することとなる（Ｎref＝８、Ｎd if ＝２）。本発明は、核酸分子及び、ここに開示されている配列と、少なくとも
６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８
０％又は有利には少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくと
も９５％又はさらに９７％若しくは１００％の類似性を有する配列、並びにその
ような核酸分子を含有する植物、細胞、組織、種子、及びその後代（例えば、イ
ネ植物、細胞、組織、種子及びその後代）を包含する。代替的に、又は加えて、
配列についての「類似性」は、２つの配列のうちの短いほうのヌクレオチド数に
よって分割される同一のヌクレオチドの位置の数に関係する（ここで、２つの配
列の並び（アラインメント）は、読み枠サイズ２０ヌクレオチド、１単語長さ４
ヌクレオチド、ギャップペナルティ４を用いたWilburとLipmannのアルゴリズム
（Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726）にしたがって決定することがで
き、コンピュータ支援解析及び並びを含めた配列データの解釈は、Intelligenet
ics（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Intelligenetics 社、CA）のプログラムを用いて
簡便に実施することができる）。「本質的に類似の」配列は、少なくとも約７５
％、有利には少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、好ましくは少な
くとも約９０％、特に約９５％、例えば少なくとも９７％、及び特に約１００％
の配列の類似性又は同一性を有する。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似
する、又は類似するという場合には、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は、ＲＮＡ
配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考慮される。
【００３５】 本発明は、イネにおけるエリートイベント、ＧＡＴ−ＯＳ２、このイベントに
由来する植物、植物材料又は植物細胞に関する。エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ
２を含有する植物は、実施例１に記載するように、プラスミドｐＢ／３５Ｓｂａ
ｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片（配列番号８）での形質転換を通
じて得られる。このエリートイベントをつくり出すために用いられる組み換えＤ
ＮＡ分子は、酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする
ＤＮＡ及びカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを含む（ここで
、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする配列は、（「３
５Ｓ−ｂａｒ遺伝子」と称する）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモ
ーターの調節下にある）。３５Ｓプロモーターは、イネにおいて「構成的」発現
パターンを有し（Battraw et al., 1990, Plant Mol Biol 15:527-538）、それ
は、ほとんどの植物において、植物ライフサイクルのほとんどの間、著しく発現
することを意味する。イネ植物における３５Ｓ−ｂａｒの発現は、除草剤化合物
ホスフィノスリシン又はバイアラホス又はグルホシネート又はより一般的にはグ
ルタミンシンテターゼ阻害剤又はその塩若しくは光学異性体に対する耐性を与え
る。
【００３６】 ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（１）に記載さ
れた制限地図同定プロトコルにしたがって同定することができる。簡単には、イ
ネゲノムＤＮＡを、以下の制限酵素：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈ
ｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩの選択（好ましくは少なくとも１つ、例えば少
なくとも２つ、有利には少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも
５つ、例えば３つから６つ）で消化し、ナイロンメンブレン上にトランスファー
し、プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの約１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブ
リダイズする。次に、用いたそれぞれの制限酵素について以下の断片： ・ＥｃｏＲＩ：約１１５９〜１７００bpの、好ましくは約１３２７bpの１つの断
片 ・ＢａｍＨＩ：約１７００bp〜２１４０bpの、好ましくは約２．０kbpの１つの
断片及び約８０５〜１０９３bpの、好ましくは約８０５bpの１つの断片 ・ＥｃｏＲＶ：約５０７７bpより大きい、好ましくは約１２kbpの１つの断片及
び約２８３８〜４５０７bpの、好ましくは約３．８kbpの１つの断片 ・ＨｉｎｄIII：約５０７７〜１１４９７bpの、好ましくは約５．３kbpの１つの
断片 ・ＮｃｏＩ：約２８３８〜約４５０７bpの、好ましくは１つが約４．１kbpであ
り１つが約３．１kbpである２つの断片 ・ＮｓｉＩ：約４７４９〜約１１４９７bpの、好ましくは約５．１kbpの１つの
断片 が同定されるかどうかを測定する。ＤＮＡ断片の長さは公知の長さのＤＮＡ断片
のセット、特にファージλＤＮＡのＰｓｔＩ断片との比較で測定される。 もし、これらの制限酵素の、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、有利に
は少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好
ましくは全てで消化した後の植物材料が、上に記載したものと同じ長さのＤＮＡ
断片を生ずるならば、該イネ植物は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有する
と決定される。
【００３７】 ＧＡＴ−ＯＳ２を含む植物又は植物材料は、ここで実施例３ｂ）（２）に記載
されたＰＣＲ同定プロトコルにしたがって同定することもできる。簡単には、Ｇ
ＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識するプライマー、特に配列番号
５の配列のプライマー、及び導入遺伝子中の配列を認識するプライマー、特に配
列番号４の配列のプライマーを用いて、イネゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅
する。内因性のイネプライマーを対照として用いる。もし、植物材料が、約２９
０〜約３５０bp、好ましくは約３１３bpの断片を生ずれば、該イネ植物はエリー
トイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有すると決定される。
【００３８】 ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、それらのグルホシネート耐性によっても特徴
づけられ、それは本発明の文脈において、植物が、除草剤Liberty（登録商標）
に対して耐性であることを含んでいる。Liberty（登録商標）に対する耐性は、
３〜４葉の段階で２００g活性成分/ヘクタール（g.a.i/ha）、好ましくは４００
g.a.i/ha、そして可能ならば１６００g.a.i/haまでの噴霧が、該植物を殺さない
という規準で決定される。ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、さらにその細胞中の
、ＰＡＴアッセイ（De Block et al, 1987, supra）で測定されるホスフィノス
リシンアセチルトランスフェラーゼの存在によって特徴づけられる。
【００３９】 ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、例えばＡＴＣＣにＡＴＣＣ２０３３５２の番
号で寄託されている種子から得ることができる。そのような植物は、従来の育種
スキームにおいて、同じ特徴についてさらに形質転換された植物を作るため、又
は同じ植物種の他の栽培種に本発明のエリートイベントを導入するために、さら
に増殖及び又は使用することができる。これらの植物から得られた種子は、それ
らのゲノムに安定に組み込まれるエリートイベントを含んでいる。
【００４０】 本発明のイネ植物は、従来の方法で栽培することができる。導入遺伝子の存在
は、それらがグルホシネートに対して耐性であることを確保する。したがって、
そのようなイネ植物が育成される圃場中の雑草は、グルホシネートを活性成分と
して含有する除草剤（Liberty（登録商標）のような）の適用によって調節する
ことができる。
【００４１】 ＧＡＴ−ＯＳ２を有する植物は、以下の市場で入手可能な米国におけるイネ品
種：プリシラ、サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン
、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と同様
の農業的特長によって特徴づけられる。関連する農業的特長は、植物丈、穂の強
度／硬直性、耐倒伏性、葉形態（長さ、幅、刀状葉片の角度）、成熟までの期間
、小花の構成、多穂、種子外皮の完全閉覆、穀粒サイズ及び形状、及び穀粒生産
及び収量である。
【００４２】 イネ植物ゲノムのこの領域、さらに詳しくはイネ植物ゲノムにおけるこの部位
における導入遺伝子の存在が、このイベントに対して特定の問題とする表現型の
又は分子レベルでの特徴を与えることが観察されている。さらに詳細には、ゲノ
ム中のこの特定部位の導入遺伝子の存在が、該植物の望ましい農業的性質のいか
なる側面も有意に損なうことのない、導入遺伝子の安定した表現型発現を生じさ
せるのである。このように、配列番号９に相当する挿入領域、さらに詳しくはそ
の中のＧＡＴ−Ｓ２の挿入部位は、除草剤抵抗性遺伝子、さらに特定すると３５
Ｓプロモーターの調節下のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、特
にプラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片のような、問
題の遺伝子（単数又は複数）の導入に特に適切であることが示されている。
【００４３】 組み換えＤＮＡ分子はこの挿入領域に標的挿入法を用いて特異的に挿入され得
る。そのような方法は、当業者によく知られており、例えば、限定されるもので
はないが、Saccharomyces cervisiae 由来のＦＬＰリコンビナーゼ（米国特許第
５５２７６９５号）、Escherichia Coli ファージ Ｐ１由来のＣＲＥリコンビ
ナーゼ（公開されたＰＣＴ出願明細書ＷＯ９１０９９５７）、Saccharomyces ro
uxiiのｐＳＲＩ由来のリコンビナーゼ（Araki et al., 1985, J Mol Biol 182:1
91-203）、又は米国特許第４６７３６４０号に記載されているようなλファージ
組み換え系を用いた相同性組み換えを含む。
【００４４】 ＤＮＡは、エレクトロポレーション法、ＤＮＡで被覆した金粒子又は生分解性
物質の火薬打ち込み法、又はアグロバクテリウム若しくはポリエチレングリコー
ル媒介法等の方法を含む技術によって、イネゲノム等の植物ゲノム中に挿入する
ことができる。
【００４５】 ここで用いる「含む」は、言及された特長、整数、関連する工程又は成分の存
在を定義するが、１つ以上の特徴、整数、工程若しくは成分、又はそれらの群の
存在又は添加を排除しないというように解釈される。したがって、例えばヌクレ
オチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又はタンパク質は、実際に指摘したよりも
多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでもよく、すなわち、より大きい核酸又
はタンパク質に埋め込まれていてもよい。機能的に又は構造的に定義されるＤＮ
Ａ配列を含むキメラ遺伝子は、付加的なＤＮＡ配列等を含んでいてよい。
【００４６】 以下の実施例は、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を有するイネ植物の開発及
び特徴を記載している。
【００４７】 特に述べる場合を除き、全ての組み換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al.(1989
) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Ha
rbour Laboratory Press, NY 及びAsusubel et al.(1994) Current Protocols i
n Molecular Biology, Current Protocols, USA の第１巻及び第２巻に記載され
た標準プロトコルにしたがって実施した。植物分子実験のための標準材料及び方
法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK) 及び Blackwell Scientific Pub
lications, UK によって出版された、R.D.D. Croy による、Plant Molecular Bi
ology Labfax (1993) に記載されている。
【００４８】 発明の詳細な説明及び実施例において、以下の配列の参照事項を述べる： 配列番号１： ＧＡＴ−ＯＳ２の５′フランキング領域を含む配列である 配列番号２： ＧＡＴ−ＯＳ２の３′フランキング領域を含む配列である 配列番号３： ＧＡＴ−ＯＳ２の挿入部位を含む配列である 配列番号４： ＯＳＡ０３：ＰＣＲ同定プロトコルのプライマーである 配列番号５： ＯＳＡ０４：ＰＣＲ同定プロトコルのＧＡＴ−ＯＳ２特異的
プライマーである 配列番号６： ＯＳＡ０１イネ内因性プライマーである 配列番号７： ＯＳＡ０２イネ内因性プライマーである 配列番号８： プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒである 配列番号９： 挿入領域である
【００４９】
【実施例】 実施例１ 除草剤抵抗性をコードする遺伝子でのイネの形質転換 ａ）３５Ｓプロモーターの調節下のbar遺伝子を含むキメラＤＮＡ（ｐＢ５／３
５Ｓｂａｒ）の構築
【００５０】 プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒを、以下の標準プロトコルに従って構築した
。プラスミドｐＢ５／３５Ｓｂａｒの配列は、配列番号８に与えられている。Ｐ
ｖｕＩ−ＨｉｎｄIII消化によって、以下の遺伝的要素を含む１５０１bpの断片
が生じた。
【００５１】
【表１】
【００５２】 該１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片は、電気泳動後のこの断片の抽出
によって精製した。
【００５３】 ｂ）イネの形質転換 ベンガル品種は、ルイジアナ農業研究所のイネ研究所が開発した中粒イネであ
る。該品種は１９９２年に公的に開放された。来歴にはＭＡＲＳ及びＭ２０１（
linscombe S.D. et al. 1993, Crop Science: 33: 645-646）が含まれている。
【００５４】 ｐＢ５／３５Ｓｂａｒの１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片でのイネ植
物の形質転換は、直接ＤＮＡ移入を用いて実施した。選抜は、生育を加速するた
めにＰＰＴ不存在において行った幼植物の再生段階を除く、全ての段階でホスフ
ィノスリシン（ＰＰＴ）について行った。その結果、最初の形質転換体のセット
（世代Ｔ0の植物）を生じた。
【００５５】 実施例２ イベントの開発 ａ）トランスジェニックホモ接合体系統の開発 種々のＴ0半接合体幼植物を組織培養から転化し、温室土壌に移し、開花及び
結実を可能にした。幼植物を、ねん性、生産力、及びアンモニアグルホシネート
に対する耐性について評価した。自家受粉によるＴ1種子をこれらの植物体から
集め、圃場で生育した。Ｔ1植物にLiberty（登録商標）除草剤を１ヘクタールあ
たり活性成分８００g（g.a.i./ha；農家への推奨用量は４００g.a.i./ha）で噴
霧した。除草剤の適用を生き延びたイベント及び除草剤耐性について３：１に分
離したイベントを更なる評価のために選抜した。耐性植物は、損傷（葉先端枯れ
）について評価した。
【００５６】 Ｔ2種子は選抜されたイベントの全ての耐性植物の穂から収穫した。それらを
列に蒔き、除草剤耐性の分離を評価するため、Ｔ2植物にLiberty（登録商標）除
草剤（１６００g.a.i／ha）を噴霧した。１００％の生存を有した列、すなわち
導入遺伝子についてホモ接合体である系統に相当する列を選抜した。それらを除
草剤損傷および表現形質について再び評価した。その穂系列の（望ましい特徴に
関しての）表現型の均一性に基づいて更なるイベントの選択を行った。
【００５７】 ｂ）導入遺伝子のイベントの特徴づけ−ＧＡＴ−ＯＳ２の選択 導入遺伝子のイベントは、サザンブロットパターン、一般的形質及び農業的性
質、そして収穫量についてさらに特徴づけられた。それが適切である場合には、
それらの特徴は、圃場状態下で決定された。
【００５８】 サザンブロット解析 導入遺伝子の存在は、イネゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＶでの酵素消化産物及びｐ
Ｂ５／３５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とのハイブリダイゼーション
を用いた標準的なサザンブロット解析によって確認した。関係するバンド強度は
、導入遺伝子座について植物がホモ接合体であるか半接合体であるかについて示
唆を提供した。２つのイベントは、単純な挿入であることがわかった。導入遺伝
子の分離パターンは、単純な遺伝子座のメンデル遺伝によって説明できることが
確認された。
【００５９】 Ｔ1及びＴ2植物を、植物丈、穂の強度／硬直性、倒伏性、葉形態（刀状葉片に
ついて、細すぎる又は異常な角度）、晩生、小花の構成、穂の不稔又は不完全稔
性、種子外皮の不完全閉覆（病害感受性を増加させることにつながる）、穀粒サ
イズ及び形状、及び穀粒生産及び収量を含む、多くの表現形質について評価した
。系統は、形質転換されていないベンガル品種及び以下のイネ品種：プリシラ、
サイプレス、ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ
２０１、Ｍ１０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と比較して、提示され
た農業的特長において同様である（又は改善されている）ことが評価された。い
くつかのケースにおいては、１つ以上の上述の形質について、１つの穂系列中の
植物がソマクローナル変異に関して分離した。これが農業的に興味深い表現形質
の導入という結果にならない限り、これらの植物体は、排除した。
【００６０】 収量評価のための圃場形質 Ｔ2種子を、選抜したホモ接合体集団からバルクで収穫し、標準品種ベンガル
と比較した。種子を、穂系列としてそれぞれのイベントを表す隔離された区画に
植えた。トランスジェニックの区画は、１６００g.a.i.／haのLiberty（登録商
標）除草剤を噴霧するか、噴霧しなかった（「非噴霧」区画）。非トランスジェ
ニック品種標準の区画は、Liberty（登録商標）を噴霧しなかった。その土地の
雑草を調節するための標準除草剤処理を、全ての区画に適用した。
【００６１】 トランスジェニックイベントを、ルイジアナ及びプエルトリコ（冬季種苗場）
を含む異なった場所で収量特性について試験した。
【００６２】 農業的パラメーター及び植物形態の順位統計の統計的解析、及び他の非パラメ
ーターデータを、親品種ベンガル及び以下のイネ品種：プリシラ、サイプレス、
ベンガル、コカドリー、ジェファーソン、マジソン、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１
０３、ドゥルー、カイボネット、レイグル、と競争するための最適な商業的候補
を同定するためにそろえた。ＧＡＴ−ＯＳ２が、育種系統の組を作るために最も
有用であることを示すイベントであった。
【００６３】 実施例３ イベントＧＡＴ−ＯＳ２の特徴づけ ａ）該遺伝子座の詳細な分子的及び遺伝学的解析 ＧＡＴ−ＯＳ２イベントが、導入遺伝子の発現並びに農業的性質全般が最良で
あるイベントであると同定されると、導入遺伝子の遺伝子座が分子レベルで詳細
に解析された。これには、サザンブロット解析及び導入遺伝子のフランキング領
域のシークエンスも含まれた。
【００６４】 （１）複数の制限酵素を用いたサザンブロット解析 葉組織をトランスジェニック植物及び対照植物から収穫した。Dellaporta et
al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21)にしたが
って、葉組織から全ゲノムＤＮＡを単離した。吸光度計で２６０nmの波長の吸光
度を測定することにより、それぞれの調製物のＤＮＡ濃度を測定した。
【００６５】 ゲノムＤＮＡ１０ngを、製造者の推奨条件を適用して最終反応量４０μlで制
限酵素で消化した。消化の時間及び／又は制限酵素の量は、非特異的消化を伴わ
ないゲノムＤＮＡの完全な消化を確実なものとするように調節した。消化の後、
消化したＤＮＡサンプルに４μlの泳動用色素（loading dye）を添加し、１％ア
ガロースゲル上に装填した。
【００６６】 以下の対照ＤＮＡもゲル上に装填した： ・非トランスジェニック植物から調製したゲノムＤＮＡの陰性対照 この陰性対照は、バックグラウンドハイブリダイゼーションがないことを確認
するために用いられる。 ・ＤＮＡ陽性対照：導入遺伝子をヘテロ接合のシングルコピーで組み込んだOryz
a sativaゲノムであり、ゲノムＤＮＡ１０μgは、ｐＢ５／３５ＳｂａｒＤＮＡ
の１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片の±１９ピコグラムと同数の分子当
量を有する（Oriza sativaの２倍体ゲノムサイズ：０．８×１０9bp）。ゲノム
当り１コピーのプラスミドを示す量を、消化された非トランスジェニックOryza
sativaＤＮＡ１μgに添加した。この再構成サンプルは、ハイブリダイゼーショ
ンがプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施
されたことを示すために用いられた。
【００６７】 ＰｓｔＩで消化したファージλＤＮＡ（ＣＩｉｎｄ１ｔｓ８５７Ｓａｍ７株、
Life Technologies）をサイズスタンダードとして含めた。
【００６８】 電気泳動の後、ＤＮＡサンプル（消化したイネゲノムＤＮＡ、対照、及びサイ
ズスタンダード）を、１２〜１６時間のキャピラリーブロッティングでナイロン
メンブレン上にトランスファーした。プローブの調製に用いたＤＮＡテンプレー
トは、プラスミドｐＢ５／３５ＳｂａｒのＥｃｏＲＩでの制限酵素消化物であっ
た。これは、形質転換ＤＮＡ（１５０１bpのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII断片）に関
係する部分を包含する１３２７bpのＤＮＡ断片を放出した。精製の後、ＤＮＡ断
片を標準的な手順にしたがってラベルし、該メンブレンに対してハイブリダイズ
のために用いた。
【００６９】 ハイブリダイゼーションは、標準的なストリンジェント条件下で行った。ラベ
ルしたプローブを９５℃〜１００℃のウォーターバス中で５〜１０分加熱して、
氷上で５〜１０分冷却することにより変性し、ハイブリダイゼーション溶液（６
×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、ＮａＣｌ３．０Ｍ、クエン酸Ｎａ０．３M、pH７．
０である）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液＝フィコール２％、
ポリビニルピロリドン２％、ウシ血清アルブミン２％である）、ＳＤＳ０．５％
及び変性したキャリアＤＮＡ（１本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長さ１２０〜３０００
ヌクレオチド）２０μg／ml）に添加した。ハイブリダイゼーションは、６５℃
で一晩行った。ブロットを洗浄溶液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で、６５℃
、２０〜４０分で３回行った。
【００７０】 オートラジオグラフを、電子的にスキャンした。 異なった制限酵素でのＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡの消化後に得られた制限パ
ターンを図１に示し、及びまとめを表１に示した。
【００７１】
【表２】
【００７２】 （２）フランキング配列の同定 ＧＡＴ−ＯＳ２イベント中の挿入された導入遺伝子のフランキング領域の配列
を、Liu et al.（1995, The Plant Journal 8(3):457-463）により記載されたよ
うに、温度非対称組合わせ（ＴＡＩＬ−）ＰＣＲ法を用いて決定した。この方法
は、連続する反応中で、３つの入れ子状態の特異的プライマーを、より短い任意
の緩認識（arbitrary degenerate: AD）プライマーと一緒に、特異的及び非特意
的産物の相対的増幅効率を温度で調節できるように用いる。特異的プライマーは
、導入遺伝子の境界にアニーリングするように、そしてそれらのアニーリング条
件に基づいて選択された。未精製第二及び第三ＰＣＲ産物の少量（５μl）を、
１％アガロースゲル上で解析した。第三ＰＣＲ産物を、予備増幅に用い、精製し
てDyeDeoxy Terminator cycleキットを用いた自動シークエンサーでシークエン
スした。
【００７３】 １．ＨｉｎｄIII部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ 使用したプライマー：
【００７４】
【表３】
【００７５】 ＭＤＢ５５６−ＭＤＢ４１１を用いて増幅した断片は、およそ４００bpであり
、その１１３bpをシークエンスした（５′フランク：配列番号１）。bp１〜bp９
２は、植物ＤＮＡを含んでおり、一方bp９３〜bp１１３は、ｐＢ５／３５Ｓｂａ
ｒのＤＮＡに相当する。
【００７６】 ＰｖｕＩ部位のＴＡＩＬ−ＰＣＲ 使用したプライマー：
【００７７】
【表４】
【００７８】 ＭＤＢ２８５−ＭＤＢ４１０を用いて増幅した断片は、およそ１２００bpであ
った（３′フランク：配列番号２）。bp１〜bp６０４は、ｐＢ５／３５Ｓｂａｒ
のＤＮＡに相当し、bp６０５〜bp１２７９は植物ＤＮＡを含んでいる。
【００７９】 （３）標的部位欠失の同定 野生型Oryza sativa品種ベンガルにおける導入遺伝子のフランキング領域中の
配列に相当するプライマーをテンプレートとして用い、導入遺伝子の挿入部位を
同定した。 以下のプライマーを用いた：
【００８０】
【表５】
【００８１】 これは、bp８３〜５５が標的部位欠失に相当する、１６８bpの断片（配列番号
３）を生じた。
【００８２】 したがって、シークエンスしたイネ挿入領域（配列番号９）は： １〜９２： ５′フランキング領域 配列番号１のbp１〜９２ ９３〜１１０： 標的部位欠失 配列番号３のbp３８〜５５ １１１〜７８５： ３′フランキング領域 配列番号２のbp６０５〜１２７９
を含む。
【００８３】 （４）該遺伝子座の遺伝的解析 挿入断片の遺伝的安定性を、数代に渡る後代植物における分子及び表現型解析
で確認した。
【００８４】 Ｔ0、Ｔ1及びＴ2世代のＧＡＴ−ＯＳ２イネ植物のグルホシネート耐性植物の
サザンブロット解析を比較し、同一であることがわかった。これは、ＧＡＴ−Ｏ
Ｓ２を含む植物における導入遺伝子の分子構成が安定しているということを証明
している。
【００８５】 ＧＡＴ−ＯＳ２イベントは、挿入断片が安定であることを示している少なくと
も３つの連続する後代において、単一遺伝子座としての導入遺伝子についてメン
デル分離を示している。
【００８６】 上記の結果に基づいて、ＧＡＴ−ＯＳ２は、エリートイベントであると同定さ
れた。
【００８７】 ｂ）同一性調節のための診断ツールの開発 該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むいかなるイネ植物材料をも同定する
ために以下のプロトコルが開発された。
【００８８】 （１）ＧＡＴ−ＯＳ２エリートイベント制限地図同定プロトコル 該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含むイネ植物は、実施例３ａ）（１）に
記載されたのと本質的に同じサザンブロッティングによって同定することができ
る。すなわち、イネゲノムＤＮＡを、以下：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩ、の制限酵素の少なくとも３つ、好まし
くは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、さらに好ましくは全てで消化し、２
）ナイロンメンブレン上にトランスファーし、そして３）プラスミドｐＢ５／３
５Ｓｂａｒの１３２７bpのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。用いられた
それぞれの制限酵素について、もしＤＮＡ断片が表１に列記したそれらと同じ長
さであると同定されれば、そのイネ植物は、該エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２
を有すると決定される。
【００８９】 （２）エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２のポリメラーゼ連鎖反応同定プロトコル
未知のもののスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照でテストランをし
なければならない。示したプロトコルは、研究所によって異なるであろう成分（
テンプレートＤＮＡの調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄ
ＮＴＰ、サーマルサイクラー等）について最適化が必要とされるであろう。
【００９０】 該プロトコルにおいて、内因性の配列の増幅が重要な役割を果たす。既知のゲ
ノムＤＮＡテンプレート中の内因の及び導入遺伝子の配列の両方を等モルの量で
増幅するＰＣＲ及び温度サイクル条件を得なければならない。アガロースゲル電
気泳動で判断して、目的の内因性断片が増幅されない場合や、同じエチジウムブ
ロミド染色強度で目的配列が増幅されない場合には、ＰＣＲ条件の最適化が必要
とされよう。
【００９１】 テンプレートＤＮＡ テンプレートＤＮＡは、Edwards et al.（Nucleic Acid Research, 19, p1349
, 1991）に従って調製した。他の方法で調製したＤＮＡを用いる場合は、異なる
量のテンプレートを用いたテストランをすべきである。通常、最高の結果で５０
ngのＤＮＡテンプレートが得られる。
【００９２】 用いられる陽性及び陰性対照 以下の陽性及び陰性対照が、ＰＣＲの実施に含められるべきである： ＊マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応液にＤＮＡを添加しな
いＰＣＲである。期待される結果、すなわちＰＣＲ産物がないという結果が観察
された場合、ＰＣＲカクテルが目的ＤＮＡで汚染されていないということを示し
ている。 ＊ＤＮＡ陽性対照（導入遺伝子を含むことがわかっているゲノムＤＮＡサンプル
）。この陽性対照の成功した増幅は、ＰＣＲが、目的配列を増幅することができ
る条件下で行われたことを証明する。 ＊野生型ＤＮＡ対照。これは、用いられたテンプレートＤＮＡが、非トランスジ
ェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。期待される結果
、すなわち導入遺伝子のＰＣＲ産物の増幅がないが内因性ＰＣＲ産物の増幅があ
ること、が観察された場合、これはゲノムＤＮＡサンプル中に、検出し得る導入
遺伝子バックグラウンド増幅がないことを示す。
【００９３】 プライマー 導入遺伝子及びＧＡＴ−ＯＳ２のフランキング配列を特異的に認識する、以下
のプライマーを用いた：
【００９４】
【化１】
【００９５】 内因性配列を標的とするプライマーは、ＰＣＲカクテル中に常に含まれている
。これらのプライマーは、未知のサンプル中及びＤＮＡ陽性対照での内部対照と
して働く。内因性プライマーペアでの陽性の結果は、ゲノムＤＮＡの調製におい
て、ＰＣＲ産物が作られるために適切な品質のサンプルＤＮＡが得られたことを
証明する。用いられた内因性のプライマーは、以下のものである：
【００９６】
【化２】
【００９７】 増幅された断片 ＰＣＲ反応における、期待される増幅断片は、 プライマーペアＯＳＡ０１−ＯＳＡ０２について： ４５７bp（内因性対照） プライマーペアＯＳＡ０３−ＯＳＡ０４について： ３１３bp（エリートイベン
トＧＡＴ−ＯＳ２） である。
【００９８】 ＰＣＲ条件 ５０μl反応のためのＰＣＲ混合液は： テンプレートＤＮＡ ５μl １０×増幅バッファー（Ｔａｑポリメラーゼとともに供給される） ５μl １０mMｄＮＴＰ １μl ＯＳＡ０１（１０pmol／μl） １μl ＯＳＡ０２（１０pmol／μl） １μl ＯＳＡ０３（１０pmol／μl） ２μl ＯＳＡ０４（１０pmol／μl） ２μl Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット／μl） ０．２μl 水で５０μlにする
である。
【００９９】 最良の結果のために行われる温度サイクルのプロフィールは以下： ９５℃ ４分 その後：９５℃ １分 ５７℃ １分 ７２℃ ２分 を５サイクル その後：９２℃ ３０秒 ５７℃ ３０秒 ７２℃ １分 を２２〜２５サイクル その後：７２℃ ５分
【０１００】 アガロースゲル解析 １０〜２０μlのＰＣＲサンプルを、適当な分子量マーカー（例えば１００bp
ラダー ファルマシア）を備えた１．５％アガロースゲル（トリス−ホウ酸バッ
ファー）上に装填する。
【０１０１】 結果の有効性 １つのＰＣＲ反応及び１つのＰＣＲカクテルに含まれるトランスジェニック植
物ＤＮＡサンプルからのデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が期待されるＰＣＲ産物
（導入及び内因性の断片）を示すこと、２）ＤＮＡ陰性対照が、ＰＣＲ増幅に対
して陰性であること（断片なし）、及び３）野生型ＤＮＡ対照が期待される結果
（内因性断片の増幅）を示すこと、なしには受け入れられない。
【０１０２】 期待されるサイズの導入及び内因性ＰＣＲ産物の可視量を示しているレーンは
、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植物が、エリートイベントＧＡＴ−Ｏ
Ｓ２を有していることを示す。導入ＰＣＲ産物の可視量を示さず、内因性ＰＣＲ
産物の可視量を示しているレーンは、テンプレートＤＮＡを調製した相当する植
物が、該エリートイベントを有していないことを示す。内因性及び導入ＰＣＲ産
物の可視量を示していないレーンは、ゲノムＤＮＡの質及び／又は量が、ＰＣＲ
産物を作ることができないものであることを示している。ゲノムＤＮＡの調製を
くり返し、適切な対照といっしょの新しいＰＣＲ反応を実施しなければならない
。
【０１０３】 ＧＡＴ−ＯＳ２を同定するための、弁別ＰＣＲプロトコルの使用 異なるトランスジェニックイベントを含む植物からのイネ葉材料（サンプル１
〜１０）を、上述のプロトコルに従って試験した。Ｍ２０２野生型及びベンガル
野生型からのサンプルを、陰性対照として採用した。
【０１０４】 ＰＣＲ解析の結果を、図２に示す。サンプル８及び９（実際には同じイベント
に由来する植物からのＤＮＡを含んでいる）が、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ
２を含んでいると認識された。試験された他の全ての系統は、このエリートイベ
ントを含んでいない。
【０１０５】 実施例４ 好ましい栽培種へのＧＡＴ−ＯＳ２の導入交雑 エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２は、反復戻し交雑により以下の栽培種に導入
された： ＊カリフォルニア産温帯ジャポニカ種（Ｍ２０４、Ｍ２０２、Ｍ２０１、Ｍ１０
３等であるが、これに限定されるわけではない） ＊カリフォルニア産熱帯ジャポニカ種（Ｌ２０１、Ｌ２０２等であるが、これに
限定されるわけではない） ＊日本産及び韓国産温帯ジャポニカ種（コシヒカリ及びミリアン等であるが、こ
れに限定されるわけではない） ＊オーストラリア産温帯ジャポニカ種（ミリン及びジャラー等であるが、これに
限定されるわけではない） ＊地中海産温帯ジャポニカ種（バリラ、アルボリオ等であるが、これに限定され
るわけではない） ＊中国産インディカ種（ギチャオ、コンギ３１４、テキン等であるが、これに限
定されるわけではない） ＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種（ドゥルー、サイプレス、ジェファーソン、プリ
シラ、コッケイドー等であるが、これに限定されるわけではない） ＊南合衆国産熱帯ジャポニカ種、中粒種（ベンガル、マース、ブラッツォ、マー
キュリー等であるが、これに限定されるわけではない） ＊南アメリカ産熱帯ジャポニカ種、長粒種（エルパソ１４４、ＩＲＧＡ４０９等
であるが、これに限定されるわけではない） ＊極東産バスマティ及びジャスミン型（カシミール、クワオダックマリ） ＊アフリカ産ジャバニカ型（青米種）
【０１０６】 これらの栽培種へのエリートイベントの導入は、これらの栽培種のいかなる望
ましい表現型又は農業的特性にも重大に影響しておらず（連鎖障害なし）、一方
グルホシネート耐性によって測定される導入遺伝子の発現は、商業的に受け入れ
られるレベルに合致していた。これは、エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２の状況
をエリートイベントとして確認するものである。
【０１０７】 上記請求項で用いられている通り、明確に示されている場合を除いて、用語「
植物」は、限定されないいかなる種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細
胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを含む、成熟のいかなる段階の植物組
織、並びに、いかなるそのような植物から採取した／に由来する、いかなる細胞
、組織又は器官、をも包含することを意図する。
【０１０８】 エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含む種子は、ＡＴＣＣに番号：ＡＴＣＣ２
０３３５２で、ＧＡＴ−ＯＳ２として寄託されている。
【０１０９】
【配列表】 <110> Aventis CropScience N.V. <120> Glufosinate Tolerant Rice <130> EE-OS2 <140> PCT/US99/25667 <141> 1999-11-03 <150> US 09/185,244 <151> 1998-11-03 <160> 18 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial: sequence comprising 5' flanking region of GAT-OS2 <400> 1 000 <210> 2 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial: sequence comprising 3' flanking region of GAT-OS2 <400> 2 000 <210> 3 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial: sequence comprising insertion site GAT-OS2 <400> 3 000 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer OSA03 <400> 4 gactctgtat gaactgttcg c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer OSA04 <400> 5 tcgcatatgt atgtaacacg c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer OSA01 <400> 6 gatcagtgca ggcaatactg g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial: primer OSA02 <400> 7 ttcctaacat gtgggtgtcg 20 <210> 8 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial: genetic elements of pB5/35Sbar <400> 8 000 <210> 9 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial: insertion region <400> 9 000 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB556 <220> <221> variation <222> (1)..(16) <223> "n" = a, c, t or g; "s" = c or g; "w" = a or t <400> 10 cngasnagwt wgcata 16 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB010 <400> 11 gcaccatcgt caaccactac atcg 24 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB559 <400> 12 ttctggcagc tggacttcag c 21
<210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB411 <400> 13 aggcatgccg ctgaaatcac c 21 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial: MDB285 <220> <221> variation <222> (1)..(15) <223> "n" = a, c, t or g; "s" = c or g; "w" = a or t <400> 14 ntcgastwts gwgtt 15 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB424 <400> 15 aaggatagtg ggattgtgcg 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB442 <400> 16 aatggaatcc gaggaggttt cc 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer MDB410 <400> 17 tcgtgctcca ccatgttgac g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial: primer YTP059 <400> 18 tcggacaacc gcgatagttc g 21
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＡＴ−ＯＳ２ゲノムＤＮＡ消化後に得られた制限地図である。 サザンブロットによって解析したゲルの装填順：レーン１、ＰｓｔＩで消化し
たλＤＮＡ、レーン２、ＥｃｏＲＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン３
ＢａｍＨＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン４、ＥｃｏＲＶで消化した
ＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン５、ＨｉｎｄIIIで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮ
Ａ、レーン６、ＮｃｏＩで消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン７、ＮｓｉＩ
で消化したＧＡＴ−ＯＳ２ＤＮＡ、レーン８、未トンスジェニックイネＤＮＡ、
レーン９、ＥｃｏＲＩで消化した対照プラスミドＤＮＡ。
【図２】 ＧＡＴ−ＯＳ２ ＰＣＲ同定プロトコルを用いた、異系統のＰＣＲ解析。 ゲルの装填順：レーン１、分子量マーカー（１００bpラダー）、レーン２〜１
１、異なったトランスジェニックイベントを含むイネ植物由来のＤＮＡサンプル
、Ｍ２０２野生型由来のＤＮＡ、レーン１３、ベンガル野生型由来のＤＮＡ、レ
ーン１４、陰性対照（水）、レーン１５、分子量マーカー（１００bpラダー）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA07 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA10 BA79 CA04 CA09 CA20 DA01 EA04 FA02 GA11 GA27 HA13 HA14 4B063 QA08 QA13 QA18 QQ02 QQ08 QQ44 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QX02 4B065 AA50Y AA88X AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BD50 CA29 CA53

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トランスジェニックの、グルホシネート耐性イネ植物、細胞
    、組織又は種子であって： ａ）該植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、少なくとも３つの制限断片
    又は制限断片対〔ここで、該制限断片又は制限断片対は、以下の群： ｉ）１１５９bp〜１７００bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片； ii）一方が８０５〜１０９３bpの長さを有し、他方が１７００〜２１４０bpの長
    さを有する、一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が２８３８〜４５０７bpの長さを有し、他方が５０７７bpより長い長
    さを有する、一対のＥｃｏＲＶ断片； iv）５０７７〜１１４９７bpの長さの１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方が２８３８〜４５０７bpの長さを有する、一対のＮｃｏＩ断片； vi）４７４９〜１１４９７bpの長さの１つのＮｓｉＩ断片 〔ここで、それぞれの該制限断片は、標準ストリンジェント条件下で、配列番号
    ８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得ることが
    できる１３２７bpの断片とハイブリダイズすることができる〕 から選択される〕を産生することができること、 及び／又は、 ｂ）２９０〜３５０bpの、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片であって、それぞ
    れ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでの
    ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該植物、細胞、組織又は種子、のゲノムＤＮＡ
    から増幅することができるＤＮＡ断片、 を特徴とする、グルホシネート耐性イネ植物、細胞、組織又は種子。
  2. 【請求項２】 ２９０〜３５０bpの、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片で
    あって、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つの
    プライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該植物、細胞、組織又は種子、
    のゲノムＤＮＡから増幅することができるＤＮＡ断片であることを特徴とする、
    請求項１記載の植物、細胞、組織又は種子。
  3. 【請求項３】 ａ）該植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、少なく
    とも３つの制限断片又は制限断片対〔ここで、該制限断片又は制限断片対は、以
    下の群： ｉ）１１５９b〜１７００bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片； ii）一方が８０５〜１０９３bpの長さを有し、他方が１７００〜２１４０bpの長
    さを有する、一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が２８３８〜４５０７bpの長さを有し、他方が５０７７bpより長い長
    さを有する、一対のＥｃｏＲＶ断片； iv）５０７７〜１１４９７bpの長さの１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方が２８３８〜４５０７bpの長さを有する、一対のＮｃｏＩ断片； vi）４７４９〜１１４９７bpの長さの１つのＮｓｉＩ断片 〔ここで、それぞれの該制限断片は、標準ストリンジェント条件下で、配列番号
    ８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得ることが
    できる１３２７bpの断片とハイブリダイズすることができる〕 から選択される〕を産生することができることを特徴とする、請求項１記載の植
    物、細胞、組織又は種子。
  4. 【請求項４】 該植物、細胞、組織又は種子が、該群から選択される少なく
    とも４つの制限断片又は制限断片対を産生することができる、請求項３記載の植
    物、細胞、組織又は種子。
  5. 【請求項５】 該植物、細胞、組織又は種子が、該群から選択される少なく
    とも５つの制限断片又は制限断片対を産生することができる、請求項３記載の植
    物、細胞、組織又は種子。
  6. 【請求項６】 該植物、細胞、組織又は種子が、該群から選択される６つの
    制限断片又は制限断片対を産生することができる、請求項３記載の植物、細胞、
    組織又は種子。
  7. 【請求項７】 ２９０〜３５０bpの、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片で
    あって、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つの
    プライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該植物、細胞、組織又は種子、
    のゲノムＤＮＡから増幅することができるＤＮＡ断片であることを更なる特徴と
    する、請求項３〜６のいずれか１項に記載の植物、細胞、組織又は種子。
  8. 【請求項８】 ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ２０３３５２の番号で寄託された種子
    から育成される植物。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の植物の細胞又は組織。
  10. 【請求項１０】 ＡＴＣＣに番号２０３３５２で寄託されている種子。
  11. 【請求項１１】 ＡＴＣＣに番号２０３３５２で寄託されている種子から育
    成したイネ植物の繁殖及び／又は該イネ植物の育種によって得ることができる、
    請求項１〜７のいずれか１項に記載の、トランスジェニックの、グルホシネート
    耐性イネ植物。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物の育成を含む、
    イネ植物の栽培方法。
  13. 【請求項１３】 栽培されているイネ植物にグルホシネートを活性成分とし
    て含む除草剤を適用することを含む、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物の交配を含むイ
    ネの育種方法。
  15. 【請求項１５】 組換えＤＮＡ分子を、配列番号９の配列によって特徴づけ
    られるイネ細胞の染色体ＤＮＡの一部に挿入することを含む、イネ植物のトラン
    スジェニック細胞を産生する方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５記載の方法によって得ることができるイネ植物
    のトランスジェニック細胞。
  17. 【請求項１７】 組換えＤＮＡ分子を、配列番号９の配列によって特徴づけ
    られるイネ細胞の染色体ＤＮＡの一部に挿入すること、及びその形質転換された
    イネ細胞からイネ植物を再生することを含む、トランスジェニックイネ植物を産
    生する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７記載の方法によって得ることができるトランス
    ジェニックイネ植物。
  19. 【請求項１９】 エリートイベントＧＡＴ−ＯＳ２を含む、トランスジェニ
    ック植物、又はその細胞若しくは組織を同定する方法であって、該方法が、以下
    の特徴： ａ）該植物、細胞、組織又は種子のゲノムＤＮＡが、少なくとも３つの制限断片
    又は制限断片対〔ここで、該制限断片又は制限断片対は、以下の群： ｉ）１１５９b〜１７００bpの長さの１つのＥｃｏＲＩ断片； ii）一方が８０５〜１０９３bpの長さを有し、他方が１７００〜２１４０bpの長
    さを有する、一対のＢａｍＨＩ断片； iii）一方が２８３８〜４５０７bpの長さを有し、他方が５０７７bpより長い長
    さを有する、一対のＥｃｏＲＶ断片； iv）５０７７〜１１４９７bpの長さの１つのＨｉｎｄIII断片； ｖ）両方が２８３８〜４５０７bpの長さを有し、１つが約４．１kbpである、一
    対のＮｃｏＩ断片； vi）４７４９〜１１４９７bpの長さの１つのＮｓｉＩ断片 〔ここで、それぞれの該制限断片は、標準ストリンジェント条件下で、配列番号
    ８のヌクレオチド配列を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって得ることが
    できる１３２７bpの断片とハイブリダイズすることができる〕 から選択される〕を産生することができる、 及び／又は、 ｂ）２９０〜３５０bpの、好ましくは約３１３bpのＤＮＡ断片であって、それぞ
    れ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーでの
    ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該植物、細胞、組織又は種子、のゲノムＤＮＡ
    から増幅することができるＤＮＡ断片、 の片方又は両方を確かめることを含む方法。
  20. 【請求項２０】 トランスジェニック植物、その細胞又はその組織が、全６
    つの該制限断片又は制限断片対を産生することができるかどうかを確かめること
    を含む、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 トランスジェニック植物又はその細胞若しくは組織のゲノ
    ムＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する２
    つのプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、約３１３bpのＤＮＡ断片を
    増幅するために用いることができるかどうかを確かめることを含む、請求項１９
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 エリートイベントＭＳ−Ｂ２を含むトランスジェニック植
    物を同定するためのキットであって、該キットが、一方がＧＡＴ−ＯＳ２の外来
    ＤＮＡ中の配列を認識し、他方がＧＡＴ−ＯＳ２の３′又は５′フランキングＳ
    領域中の配列を認識する、少なくとも２つのＰＣＲプローブを含むキット。
  23. 【請求項２３】 該キットが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレ
    オチド配列を有するＰＣＲプローブを含む、請求項２２記載のキット。
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