JPH06502533A - 単子葉植物の形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 、植　の　転　法一 本発明は、単子葉植物全般、特にイネ科植物、特定的にはトウモロコシ及び他の 主要穀類の迅速且つ効率的な形質転換方法に係る０本発明は特に、トランスジェ ニック単子葉Ｍ￥ＩＩＩＪを得るための、緻密な胚形成カルスを形成することが 可能な無傷組織又はこのような組織から得られる緻密な胚形成カルスの使用に係 る。

本発明は更に、本発明の形質転換方法により得られる新規トランスジェニックイ ネ科植物、特に穀類に係る。

見ｉα１１− 近年、植物の遺伝子操作の可能性はめざましく拡大している。多数のトランスジ ェニック双子葉植物種が得られた。

しかしながら、多くの植物種、特に単子葉類、特定的には１ヘウモロコシ、コム ギ及びイネのような経済的に重要な種を含むイネ科に属する植物は、安定的な遺 伝子形質転換が非常に困難であるとされている。

問題は、ａ）単子葉植物細胞をＤＮＡで組込み的に形質転換（即ち単子葉植物細 胞の核ゲノムにＤＮＡを安定的に挿入）する点、及びｂ）正常表現型稔性成体単 子葉植物のような正常表現型単子葉植物を形質転換細胞からの再生する点の両方 にある。このような問題は主に１　）ＤＮＡ取り込み、２）取り込まれたＤＮＡ による組込み的形質転換及び３）形質転換細胞から正常表現型単子葉植物を再生 するという点に関してコンピテントな単子葉細胞が得られないことに起因すると 示されている（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　９：５３５）。

一般に、（ポリエチレングリコール処理及び／又はエレクトロポレーションを使 用して）プロトプラストに遺伝子を直接移入すると、成功の可能性が最も高いと 考えられている。このような直接遺伝子移入方法で使用されるプロトプラストは 、はとんどの場合は胚形成細胞懸濁液培養物から得られる（Ｌａｚｚｅｒｉ及び Ｌ６ｒｚ　（１９８８）Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、６．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、ｐ、２９１；　０ｚｉａｓ−Ａ ｋｉｎｓ及びＬ６ｒｚ　（１９８４）　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ２・１１９）。しかしながら、はとんどの遺伝子型ではプロトプラス トから正常表現型植物を再生し難いという事実により、このような方法の成功は 制限されている。

最近になって特定の系統のイネ（Ｓｈｉｍｏｍｏｔｏら＜１９８９）　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３８：２７４；　Ｄａｔｔａら　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ８ニア３６：　及びＨａｙａｓｈｉｍｏｔｏら　（１９９０）Ｐｌａｎ ｔ　Ｐｈｙｓｉｏ＋、９３：８５７）及びトウモロコシ（Ｇｏ　ｒｄｏｎ−Ｋａ ｍｍら　（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２＋６０３；　Ｆｒ。

ｍｍら　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３；　Ｇｏｕｌ ｄら　（１９９１）　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇ３’　９５：４２６；　並 びにＰＣＴ公開明細書Ｗ０９１１０２０７１及びＷＯ３９／１２１０２）を形質 転換し、これらの系統から正常表現型植物を再生するのに成功したことが報告さ れた。しかしながら、これらの形質転換及び再生方法を重子葉類全般、特にイネ 科植物、より特定的には穀類に適用できるかどうかはこのような報告からは明ら かでない。

！ｕΔ１１ 本発明は単子葉植物、特に主要穀類（例えばトウモロコシ、コムギ、イネ、ライ ムギ等）のようなイネ科植物のゲノムを効率的且つ再現可能に形質転換するため の新規方法を提供する。この方法は、ａ＞ｆｆｉ密な胚形成カルスを形成するこ とが可能な単子葉植物の無傷組織又はｂ）このような無傷組織から得られる緻密 な胚形成カルス、特にその胚形成セクターのいずれか一方の細胞をＤＮＡで形質 転換することからなり、このような細胞は１　）ＤＮＡの取り込み、２）ＤＮＡ による植物ゲノム、好ましくはその核ゲノムの組込み的形質転換及び３）これら のゲノムの形質転換後に細胞から正常表現型植物（例えば正常表現型稔性成体植 物）を再生する点に関してコンピテントである。このようなコンピテント細胞は 好ましくは植物の無傷組織又は緻密な胚形成カルスを損傷及び／又は分解するこ とにより得られ、例えばａ）無傷組織及びその細胞又はこのような無傷組織から 得られる緻密な胚形成カルス及びその細胞を切断し、及び／又はｂ）無傷組織又 は緻密な胚形成カルスの性質に依存して、無傷組織又は緻密な胚形成カルスを酵 素で処理し、無傷組織又は緻密な胚形成カルスの細胞壁を分解することにより得 られる。

こうして損傷及び／又は分解され、本発明のコンピテント細胞を含む無傷組織又 は緻密な胚形成カルスは、好ましくはエレクトロポレーションのような直接遺伝 子移入により１個以上のＤＮＡフラグメント（例えば外来ＤＮＡフラグメント） 、好ましくは線状ＤＮＡフラグメントで形質転換することができる。好ましくは 、ＤＭＡフラグメントの少なくとも１個は、形質転換植物細胞の選択可能又はス クリーン可能なマーカー、好ましくは選択可能なマーカーとして機能し得る遺伝 子を含む。このようなマーカーＤＮＡフラグメンＩ〜は別の着目遺伝子と同一の ＤＮＡフラグメンＩ・又は別のＤＮＡフラグメント上に配置され得る。

形質転換細胞は、従来通りに選択的培地で好ましくは長時間培養することにより 非形質転換細胞から分離することができ、こうして選択された形質転換細胞は、 そのゲノム、特に核ゲノムに安定的に組み込まれた着目遺伝子を有する正常表現 型植物（例えば成熟植物）に従来通りに再生され得る。

本発明は更に、１個以上のＤＮＡフラグメントで安定的に形質転換されたゲノム を有する単子葉植物、特にイネ科［物、特に穀類ｍ物の新規コンピテント細胞： このような形質転換細胞から構成される細胞培養物；このような形質転換細胞か ら再生された正常表現型植物（例えば正常表現型植物植物）、及びこのような形 質転換植物の種子を提供する。このような形質転換細胞、細胞培養物、植物及び 種子としては、タンパク質が発現される植物細胞を死滅又は不能にすることが可 能なタンパク質をコードし且つタペー植物を雄性不稔性にする遺伝子を含むＤＮ Ａフラグメントで形質転換されたこのような形質転換細胞、細胞培養物、植物及 び種子を挙げることができる。本発明の形質転換イネ科植物、特に形質転換トウ モロコシ及びイネは、特にこのような植物系統の未形質転換プロトプラスト１ｏ ｏｏ。

あたり、約５００以下、特に約１００以下、特定的には約１０以下、より特定的 には約１以下しか正常表現型植物を再生することができない場合、正常表現型植 物のような形質転換植物を再生させることが従来技術では事実上不可能であるよ うな植物系統、形質転換胚形成懸濁液培養物又は形質転換プロトプラストに由来 することを特徴とする。

・　の、ｆ・ 図１：未成熟接合体胚のエレクトロポレーションにより得られる５個のトウモロ コシ形質転換株の実施例２のＮｐｔＩＩゲルアッセイ。

図２：配列番号２に示す配列をプローブとして使用した実施例１のトウモロコシ 形質転換株（Ｈ９９−Ｍ１４８−１）の１種のゲノムＤＮＡの実施例２のザザン ブロッ１〜．標準フラグメントの長さを表示する。起点は０により表示する。

レーン　１・λファージのＰｓｔＮ消化ＤＮＡ＋ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＴＴＭ１ 　（陽性対照−プローブは２８２４ｂｐ　ｐＴＴＭ１フラグメントにハイブリダ イズする） ２：ＢｇｌＩＩ消化ゲノムＤＮＡ ３：ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡ ４：ＥｃｏＲＶ消化ゲノムＤＮＡ ５：ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ ６　：　ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡ ７　：　Ｐｖｕ　Ｉ消化ゲノムＤＮＡ ８：ＰｖｕＩＩ消化ゲノムＤＮＡ ９・ＰｓｔＩ消化ゲノムＤＮＡ １０：未形質転換１（９９植物のＥｃｏＲＩ消化植物ゲノムＤＮＡ　（陰性対照 ） 図３・未成熟接合体肢に由来する緻密な胚形成カルスフラグメントのエレクトロ ポレーションにより得られた７個の形質転換株の実施例４のＮｐｔｌＩゲルアッ セイ。

図４・配列番号２に示す配列をプローブとして使用した実施例３のトウモロコシ 形質転換株（Ｐａ９１−Ｍ１４６−２）の１個のゲノムＤＮＡの実施例４のサザ ンプロット。

標準フラグメントの長さを表示する。起点はＯにより表示する。

Ｌ／−ン　１：λファージのＰｓｔＩ消化ＤＮＡ＋Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ消化ｐＴＴ Ｍ１１陽性対照−プローブは２８２４ｂｐ　ｐＴＴＭ１フラグメントにハイブリ ダイズする） ２：ＢｇｌＩＩ消化ゲノムＤＮＡ ３　：　ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡ ４：ＥｃｏＲＶ消化ゲノムＤＮＡ ５：ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ ６：ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡ ７　：　Ｐｖｕ　Ｉ消化ゲノムＤＮＡ ８：ＰｖｕＩＩ消化ゲノムＤＮＡ ９：ＰｓｔＩ消化ゲノムＤＮＡ １０：ＥｃｏＲＩ消化植物ゲノムＤＮＡ　（陰性対照） 配置宍− 配列番号１　：　ｐＤＥ１０８の配列。

配列番号２．サザンハイプリダイゼーションでキメラ１Ｌ配列番号３・プラスミ ドｐＶＥ１０７及びｐＶＥ１０８の横築に使用され且つタバコのＴＡ２９遺伝子 からのプロモーター及びバルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）遺伝子を含むプラスミド ｐＴＴＭ８のＤＮＡフラグメントの配列。

配列番号４・ｐＤＥｌｌｏの配列。

４４１月１ｒ説劃− 単子葉票において、胚形成カルスは２種の異なる周知の型をとり得る（Ｖａｓｉ ｌ　（１９８８）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：３９７：　Ａｒｍｓｔ ｒｏｎｇ及びＧｒｅｅｎ　（１９８８）　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、２８：３６３）。

胚形成カルスの一方の型は、緻密及び／又は結節状と説明すると最適であり、し ばしば有機化しているとみなされ得る６本明細書中で「緻密な胚形成カルス」と 呼称するこのようなカルスは本発明に従って使用される。他方の一般により発生 頻度の低い胚形成カルスの型は、軟弱で砕けやすく、胚形成能が高いと説明する と最適であり、本明細書中で「砕けやすい胚形成カルス」と呼称するこのような カルスは、一般に緻密な胚形成カルスよりも迅速に増殖する。どちらの型のカル スからも正常表現型植物を再生することができ、どちらの型のカルスでも種々の 発生段階に体細胞胚が存在する。２種のカルスの外観及び最終形態は種々の単子 葉種、特に種々の穀類種で異なり得る。しかしながら、２種のカルスは種々の単 子葉種の組織培養物を形成及び操作する当業者により容易に区別することができ る。

トウモロコシにおいて、緻密な胚形成カルス及び砕けやすい胚形成カルスは夫々 タイプＩカルス及びタイプＩＩカルスとしてのほうがよく知られている。タイプ Ｉ及びタイプＩＩ）ウモロコシカルスの構造及び特性の種々の顕著な特徴は、Ａ ｒｍｓｔｒｏｎｇ及びＰｈ１ｌｌｉｐｓ　（１９８８）　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、２ ８：３６３；　５ｐｒｉ　ｎｇｅ　ｒら（１９７９）　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ 　１０１：２６９；　Ｆｒａｎｓｚ　（１９８８）　ｃｙｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎ ｔｉａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃａｌｌｕｓ　１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ 　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｚｅａ　！ＬＬＬｓ　 Ｌ、”、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｇｅｎｉ ｎｇｅｎ、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；　０ｚｉａｓ−Ａｋｉｎｓ　ら　 く　１９８２）　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ　１１０　°　９５；　Ｎ。

ｖａｋら　（１９８３）　Ｍａｙｄｉｃａ　２８：３８１；Ｈｏら　（１９８３ ）　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ　１１８：１６９；　Ｇｒｅｅｎら　（１９７５） 　ＣｒｏｐＳｃｉ、１５：４１７；　Ｆｒｅｅｌｉｎｇら　（１９７６）　Ｍａ ｙｄｉｃａ　２１：９７；　Ｌｕら　（１９８２）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇ ｅｎｅｔ、　６２：１０９；　Ｖａｓｉｌら（１９８５）　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓ ｍａ　１２７：１；　Ｄｕｎｓｔａｎら（１９７８）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ　 ９７：２５１；　Ｖａｓｉｌら（１９８２）　Ｂｏｔ、Ｇａｚ、　１４３：４５ ４；　Ｇｒｅｅｎ　（１９８３）　Ｉｎ：　Ｂａ５ｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ 　ｎｅｗ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｈ ｏｌ　１ａｅｎｄｅｒら編、　Ｐ　ｌ　ｅ　ｎ　ｕ　ｍ　Ｐ　ｌ　ｅ　ｓ　ｓ　 、　Ｎ　ｅ　ｗ　Ｙ　ｏ　ｒ　ｋ　。

ｐｐ、１９５−２０９：　Ｖａｓｉｌら（１９８４）Ａｍ、Ｊ、Ｂｏｔ、７１： １５８；　及びＫａｍｏら（１９８５）　Ｂｏｔ、Ｇａｚ、　１４６：３２７の ような文献に記載されている。

タイプＩトウモロコシカルスはほぼ白色、青みがかった白色又は黄色がかった緻 密な外観を呈しており、多くの場合は結節状表面を有しており、その結節状外観 に示されるように組織の有機化集合体として発生及び増殖する。該カルスは細胞 会合及び分化の程度が高いことと、根、葉構造及び維管束要素のような種々の構 造とにより特徴付けられる６体細胞胚が一般に認識され得る。再生された苗条の 起源は必ずしも明白ではなく、外見からは体細胞胚形成及び器官形成の両方によ り形成されるように見える。体細胞胚形成中に胚様体は融合して堅く白色のカル スを生じるか、又は二次体細胞胚に生長し得る。

タイプＩＩ）ウモロコシカルスは主に軟弱で砕けやすく、白色又は青みががった 黄色の多少透明な外観を有しており、胚形成能が高い、該カルスは迅速に増殖し 、維管束要素を含まない、タイプＩＩカルスは、胚様体をカルスに付着させる胚 柄様構造を有し得る多数の平滑で球状の胚様体を含むという点が砕けやすい非胚 形成カルスと異なる。胚様体は十分に有機化された体細胞胚にも生長し得る。

２種のトウモロコシカルスタイプに見いだされるほぼ同一の項著な特徴を使用し て、他の単子葉種、特にイネ（Ｋｙｏｚｕｋａら（１９８８）　Ｔｂｅｏｒ、Ａ ｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、７６：８８７）、コムギ（Ｒｅ　ｄ　ｗ　ａｙら（１９９ ０）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　７６：６０９：　Ｒｅｄｗａｙら （１９９０）　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　８ニア１４）及びオオム ギのような穀雇種の緻密な胚形成カルスと砕けやすい胚形成カルスとを区別する ことができる。

単子葉植物全般からでは、本発明の緻密な胚形成カルスは未成熟接合体胚、成熟 種子、葉基部、豹、小胞子、幼花序等のような外植片のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養に より得られる。トウモロコシにおいてタイプＩカルスは未成熟接き体肢から最も 効率的に発生する。緻密な胚形成カルスは適切な外植片から誘導され得、十分に 確立された方法に従って培地に維持される（　Ｈｏ　ｄ　ｇ　ｅ　ｓら（１９８ ６）　Ｂｉ。

ｚ’Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：２１９）、カルス培養物の保存中には胚形成細 胞を含むカルスの胚形成セクターのみを選択及びサブ培養するように注意すべき である。このような細胞は一般に小型で緊密に充填され、壁が薄く、細胞質が豊 富であり、多数の小さい気孔、脂質液滴及び澱粉粒子を含む高鼾塩基性細胞とし て特徴付けることができる（Ｖａｓｉｌ　（１９８８＞前出）。緻密な胚形成カ ルスを形成することが可能であるとして知られている組織を植物から取り出す最 も簡便な方法は明解である。

本発明のコンピテント細胞は、注意な胚形成カルスを形成することが可能な無傷 組織を植物から従来方法で切断することにより単子葉植物から直接得られる。こ のように損傷させた無傷組織の細胞はその後、安定的に形質転換することができ る。しかしながら、このような損傷完全細胞をより小さいフラグメントに細分し 、このような組織を更に損傷させ、形質転換のためのよりコンピテントな細胞を 提供すると好適である。組織フラグメンｌ−の平均寸法は好ましくは長さ０．１ 〜５ｍｍ、特に長さ１〜２．５ｍｍ、より好ましくは長さ１．２５〜１．７５ｍ ｍである。この点で本発明の損傷無傷組織は、植物から切断された任意の組織片 又は任意のそのフラグメント（例えば切断片）であり得る。即ち、「無傷組織」 なる用語は組織培養段階を挟まずに天然に存在する植物部分から得られる単子葉 植物細胞の集合体を意味するものと理解すべきである。

本発明のコンピテント細胞を生成するためには、植物から無傷組織を切断し、場 合により更に破壊又は損傷させるように切断することにより無傷組織及びその個 体細胞を機械的に破壊又は損傷させれば一般に十分である。この点でｒｔ１１絨 的破壊」及び「損傷」なる用語は、細胞を暴露し、本発明に従ってＤＮＡフラグ メントを挿入するために、無傷組織の１個以」二の細胞の細胞壁を著しく損傷さ せることを意味する。従って、本発明による「機械的破壊」又は「損傷」は細胞 壁の切断に制限されず、細胞壁をこすったり、押し潰したり、又はたたくなどの 方法で細胞壁の１部分以−１−を物理的に除去するか又は細胞壁を１力所以上不 連続にする他の方法も包含する。

しかしながら、本発明に従って無傷組織を機械的に破壊又は損傷する操作に加え て又はこの操作の代わりに、特に無傷組織が比較的大きい場合には無傷組織を酵 素又は酵素混合物で処理して植物細胞壁を分解してもよい。酵素処理は従来通り に実施することができる。好ましくは、酵素を無傷組織に加えてまず最初に細胞 壁に穴をあける。従って、酵素処理は組織を完全に破壊しないように比較的短時 間（例えば無傷組織の性質及びコンシスチンシーに依存して１〜１０分間）行う と好適である。植物の種類に応じてＰｏｗｅ　Ｉ　ｌ及びＣｈａｐｍａｎ（１９ ８５）　”ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡ ｐｐｒｏａｃｈ″、Ｒ，Ａ、Ｄｉｘｏｎ編、　第３章に記載されているような種 々の酵素又は酵素溶液を使用することができる。

植物から得られる無傷組織が小さすぎて損傷（例えば切断）できない場合又は損 傷させた無傷組織が小さすぎてそれ以上損傷（例えばより小片に細分）できない 場合には、酵素処理を使用して付加的なコンピテント細胞を生成することができ る。このような酵素処理は特に胚、特に生長中の種子から単離された未成熟接合 体肢及び例えばトウモロコシの成熟（例えば乾燥）種子から単離された成熟接合 体肢で本発明のコンピテント細胞を形成するために特に有用であり得る。胚は一 般に種子から取り出すために切断されず、一般に緻密な胚形成カルスを生成する 能力を損なわずに著しく小さいフラグメントに細分することはできない。

未成熟胚は緻密な胚形成カルスの唯一の適切且つ信頼できるソースであるので、 トウモロコシでは特に重要である。

イネ及び他の単子葉類では成熟胚を使用することもできる。

これに関連して、トウモロコシのような植物の場合、無傷組織（例えば未成熟ト ウモロコシ胚）は約０．５〜２ｍｍ、好ましくは０．５〜１．５ｍｍの最大長を 有することが好ましいが、もっと短い０．５〜１ｍｍの長さも使用できる。

本発明によると、無傷組織を好ましくは例えば約１５分間以上、好ましくは約３ ０分間〜約５時間、特に２〜３時間予備原形質分離にかけ、後述するエレクトロ ポレーション用榎衝液のような従来の高張液中に組織を置く、この予備原形質分 離処理の目的は、無傷組織の細胞中でそのプロトプラスト、好ましくはその細胞 膜の全部又は少なくとも一部をその細胞壁から分離することである。このような 予備原形質分離は好ましくは無傷組織の損傷後で無傷組織の酵素処理前に実施さ れる。無傷組織が既に酵素処理により分解されている場合には、その後の予備原 形質分離を短時間だけ行い、上述のＪ：うにトウモロコシの未成熟胚の酵素処理 後、このような原形質分離を全く行わないことが好適である。

本発明のコンピテント細胞は、本発明の無傷組織をｉｎＶ　ｉ　ｔ　ｒ　矢培養 して、緻密な胚形成カルスを生成し、次にカルスをより小さいフラグメントに細 分することによっても得られる。得られるカルスフラグメントは、カルスの胚形 成セクター又は部分を完全又は少なくとも部分的に含むべきである。カルスフラ グメントは更に好ましくは、０゜５〜２．５ｍｍ、特に１〜２ｍｍ、より特定的 には１．２５〜１．７５ｍｍの平均最大長を有しており、好ましくは約０．１ｍ ｍの最小長を有する。十分な量の緻密な胚形成カルスを得るためには、組織外植 片から得られるような一部カルスを少なくとも１力月間増殖させ、このような− 次カルスの胚形成セクターをこの期間に少なくとも１回サブ培養すると好適であ る０本発明のコンピテント細胞を生成するためには、緻密な胚形成カルスの胚形 成セクター及びその細胞を例えば切断により機械的に破壊又は損傷させれば十分 であると考えられる。しかしながら、カルスを機械的に破壊する操作に加えて又 はこの操作の代わりに、特に緻密な胚形成カルスフラグメントがまだ比較的大き い場合にはカルス細胞壁を酵素処理してカルス細胞壁を分解してもよい。この酵 素処理は従来通りに実施することができる。

酵素処理は好ましくはまず最初にカルスフラグメントの細胞の細胞壁に穴をあけ るように実施され、従って、酵素処理は組織を完全に破壊しないように比較的短 時間（例えばカルスフラグメントの性質及びコンシスチンシーに依存して１〜１ ０分間）行うと好適である。単子葉植物に依存してＰｏｗｅ　Ｉ　１及びＣｈａ ｐｍａｎ　（１９８５＞前出に記載されているような種々の酵素又は酵素溶液を 使用することができる。好ましくは、緻密な胚形成カルスフラグメントを同様に 上述のように一定時間（例えば２〜３時間）原形質分離する。

次に本発明のコンピテント単子葉植物細胞を形質転換させるために、上述のよう に得られた損傷及び／又は分解した無傷組織又は緻密な胚形成カルスフラグメン ト、特にその胚形成セクターを、着目遺伝子を含む１個以上のＤＮＡフラグメン トと接触させる。着目遺伝子の少なくとも１１ＩＭが形質転換単子葉植物細胞中 で選択可能なマーカーとして機能するように構成すると好適である。直接遺伝子 移入、特にエレクトロポレーションは最適な形質転換効率を提供すると考えられ る。しかしながら、ポリエチレングリコール、ＤＮＡで被覆した微小発射体の撃 ち込み（即ち例えば粒子銃を使用するバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉＣ ）な形質転換）及びＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで媒介される形質転換を使用す る直接遺伝子移入のような他の既知のＤＮＡ移入技術を使用してもよい。

本発明の植物形質転換方法を実施する際に使用される緻密な胚形成カルスは、砕 けやすい胚形成カルスのいくつかの特徴を有する。この点で緻密な胚形成カルス 又は砕けやすい胚形成カルスは緻密な胚形成カルスのいくつかの特徴と砕けやす い胚形成カルスのいくつかの特徴とを有する型のカルスに変異すること又は変異 させることができる。その結果、このような中間型のカルス及びその胚形成部分 は本発明に従って形質転換され得る。実際に中間型のカルス及び砕けやすい胚形 成カルスで発生する体細胞胚は上述のように単離し、損傷及び／又は分解した後 、形質転換することができる。即ち、本発明の方法を実施するにあたり、中間型 カルス又は砕けやすい胚形成カルスから得られるこのような体細胞胚は、特に体 細胞胚の細胞を形質転換するための手段としてエレクトロポレーションを使用す る場合、生長中又は成熟した種子から得られる未成熟又は成熟接合体肢と等価で あるとみなすことができる。

本発明によると、エレクトロポレーションは従来通りに実施され得る。この点で 損傷及び／又は分解した無傷組織又はカルスフラグメント、特にその分裂又は胚 形成セクション、より特定的にはその胚形成セクションを（例えばＤｅｋｅｙｓ ｅｒら（１９９０）　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ＋＋　２：５９１に記載されて いるように）エレクトロポレーション装胃で使用するのに適したキュベツトに移 すことができる。好ましくは、エレクトロポレーション＊Ｗ液２００μｍ当たり 約１０〜５００ｍｇ、特に約５０〜２００ｍｇ、最適には約１００〜１５０ｍｇ の無傷組織又はカルスフラグメントをキュベツトに移す。トウモロコシのような 穀類の場合（特に酵素処理した未成熟無傷胚を使用するのが好適な場合）には、 エレクトロポレーション緩衝液２００ノＩＩ中に約１０〜５００個、特に約５０ 〜１５０個、より特定的には約７５〜１２５個の胚をキュベツトに移すことが好 ましい。次にＤＮＡをキュベツトに加え、エレクトロポレーションを行う。好ま しくは、エレクトロポレーションの前にＤＮＡを無傷組織又はカルスフラグメン トと共に（例えば約１時間）コインキュベートすると好適である１円形よりもむ しろ線状で比較的小寸法、好ましくは約２０ｋｂ未満、特に１５ｋｂ未満、特定 的には１０ｋｂ未満、より特定的には６ｋｂ未満（例えば約２〜３ｋｂまで）の ＤＮＡで最良の結果が得られると考えられる。この点で、本発明のコンピテント 細胞を複数の着目遺伝子で形質転換するために異なる組成の複数の線状ＤＮＡフ ラグメントを使用することができる。好ましくは、無傷組織又はカルスフラグメ ントを含むキュベツトに約５〜３０μｇ、特に約１０〜２５μｇ、より特定的に は約２０μｇのＤＮＡを加える。特定のエレクトロポレーション条件に限定する 必要はなく、例えば１５０ｍＭ　ＮａＣ＋又は８０ｍＭ　ＫＣＩを含有するエレ クトロポレーション緩衝液を使用して９００μＦキヤパシタから３７５Ｖ／ｃｍ の電界強度でパルス放電することにより良好な結果が得られる（Ｄｅｋｅｙｓｅ ｒら（１９９０）前出）。

（例えばエレン１〜ロボレーシヨンにより）形質転換が完了したら、形質転換し た単子葉細胞を含む無傷組織又はカルスフラグメントを適切な培養培地、好まし くは選択培地（形質転換細胞が選択可能なマーカーを含む場合）に移す。

この転移は形質転換後できるだけ早く、好ましくは形質転換直後、特に形質転換 後１〜３日間以内に実施すべきである。好ましくは、選択可能なマーカーで形質 転換された無傷組織又はカルスフラグメントを、従来の培養条件及び選択剤を補 充した培養培地（例えばＶａｓ　ｉ　ｌ　（１９８８＞前出の引用文献参照）を 使用して培養する０選択剤の選択は、以下に記載するように無傷組織の細胞又は カルスフラグメントを形質転換するためにＤＮＡフラグメント中で使用される選 択可能なマーカーに依存する０選択剤の濃度は、選択可能なマーカーを含有する ＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムに好ましくは完全に組み込んだ安定的形質転 換株のみが生存し、単離できるように、形質転換細胞に非常に高い選択的圧力を 提供するように設定すべきである。このような形質転換無傷組織又はカルスフラ グメントを非選択培地Ｅで数日間培養することもできるが、選択培地にできるだ け早く移し、正常表現型植物を再生するために使用可能な形質転換した緻密な胚 形成カルスのような形質転換形態形成カルスを十分量生成するように長期間（例 えば６力月間）、好ましくは少なくとも１力月、特に２〜３力月間維持すること が好ましい、更に、培地の高張性は例えば培地にマンニトールを補充することに より短期間（例えば２〜３週間まで）維持すると好適である。

本発明によると、単子葉植物のゲノム、特に核ゲノムに任意のＤＮＡフラグメン トを組み込むことができる。一般に、ＤＮＡフラグメントは形質転換植物細胞に おいて機能的であり且つこのような細胞及び細胞から再生される植物に付加的な 特性を与える外来もしくは内在遺伝子又は他のＤＮＡ配列を含む。このために、 ＤＮＡフラグメントは好ましくは次の作動的に連係するＤＮＡ配列：１）植物細 胞中でコーディング配列を発現させることが可能なプロモーター配列（「プロモ ーターＪ）、２）植物細胞内で特異的活性を有するタンパク質（「着目タンパク 質」）をコードする配列（「コーディング配列」）、及び３）適切な３゜転写調 節シグナルを含む１個以上のキメラ遺伝子を含む。

タンパク質の必要な機能を得るためには、シトソール、ミトコンドリア、クロロ プラスト又は小胞体のような植物細胞の１個以上の特定の区画にタンパク質を標 的することも必要であり得る。シトソールに標的するためには、上述のようなキ メラ遺伝子をそのまま使用することができる。一方、他の区画に標的するために は、キメラ遺伝子のＤＮＡフラグメント１〉及び２）の間に付加的な配列（「標 的配列」）が存在することが必要である。必要に応じてキメラ遺伝子は更に転写 及び／又は翻訳エンハンサ−を含んでもよく、ＤＮＡ配列のコドン使用を植物細 胞における発現のために最適化することができる。

本発明のキメラ遺伝子は十分に確立された原理及び方法に従って構築することが できる。この点では、種々のＤＮＡ配列はタンパク質のコーディング配列（又は 標的配列が存在する場合には標的配列）の開始コドンで翻訳が開始するように連 係すべきである。

形質転換双子葉植物で遺伝子を発現させるために現在使用されている器官及び組 織特異的な種々の構成プロモーターは本発明の形質転換単子葉類で使用するため にも適切であると考えられる。この点では着目タンパク質をコードするコーディ ング配列と、その上流（即ち５°）でコーディング配列の発現に適切な外来又は 内在プロモーターとを含むキメラ遺伝子で特定の植物細胞を形質転換させること ができる。適切な外来構成プロモーターは、異種遺伝子を構成的に発現させる（ Ｏｄｅ　ｌ　ｌら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１０）カリフラワーモ ザイクウィルス（ＣａＭＶ）単離株ＣＭ１８４１　（Ｇａｒｄｎｅｒら（１９８ １）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、９：２８７１）及びＣａｂｂＢ−３（Ｆ ｒａｎｃｋら（１９８０）　ＣｅＩＩ、　２１：２８５）（ｒ３５Ｓプロモータ ー」）；ＣａＭＶ単離物ＣａｂｂＢ−Ｊ　Ｉ　（Ｈｕ　ｌ　Ｉ及びＨｏ　ｗ　ｅ Ｉｔ　（１９７８）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８６：４８２）から単離することがで き且つその配列＜３５Ｓ３プロモーターの配列はヨーロッパ特許公開明細書（Ｅ Ｐ）第３５９６１７号に開示されている）及びトランスジェニック植物における 高活性（Ｈａｒｐｓｔｅｒら（１９８８）　Ｍ。

１、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２１２：１８２）において３５３３プロモーターと異 なる関連プロモーター（ｒ３５Ｓ３プロモーター」）；並びにＡ　ｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ（Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、３：２７２３）のＴ− ＤＮＡの夫々１′及び２′遺伝子を発現させ且つ損傷誘導プロモーターであるＴ ＲＩ’及びＴＲ２゜プロモーターを含む。器官特異的、組織特異的及び／又は誘 導可能な適切な外来プロモーターも知られており（例えばＫｕｈｌｅｍｅｉｅｒ ら（１９８７）　Ａｎｎ、ＲｅｖＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、３８＋２２１の 引用文献参照）、例えば光合成組織中のみで活性な光誘導プロモーター（Ｋｒｅ ｂｂｅｒｓら（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１１ニア４５） であるＡ　ｒ　ａ　ｂ　ｉ　ｏ　ｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａの１．５−リ ブロースニリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット遺伝子（例えばＩＡ遺伝子 ）のプロモーター（ｒｓｓｕＪプロモーター）；ヨーロッパ特許第３４４０２９ 号に開示されている豹特異的プロモーター−並びに例えばＡｒａｂｉｏｄｏ　ｓ ｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａの種子特異的プロモーター（Ｋｒｅｂｂｅｒｓら（１９ ８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ。

ｌ、　８７　：　８５９）を挙げることができる。ヨーロッパ特許第３４４０２ ９号に記載されているように重子葉類を雄性不稔性にするように形質転換するた めに特に有用なプロモーターは、タベート特異的プロモーターＰＴＡ２９゜ＰＴ Ａ２６及びＰＴＡ１３．特にヨーロッパ特許第３４４０２９号のＰＴＡ２９であ る。

同様に、形質転換した双子葉植物で使用される既知の３゛転転写節配列及びポリ アデニル化シグナルも本発明の形質転換慴子葉類で使用できると考えられる。こ のような３゛転転写節シグナルはコーディング配列の下流（即ち３゛）に提供さ れ得る。この点では、キメラ遺伝子の発現を得るために適切な外来又は内在転写 終結及びポリアデニル化シグナルのいずれかを含むキメラ遺伝子で特定の植物細 胞を形質転換することができる。例えば、遺伝子７　（Ｖｅ　ｌ　ｔｅｎ及び５ ｃｈｅｌｌ　（１９８５）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：６９９８） 、オクトビンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎら（１，９８３）　Ｅ　Ｍ　Ｂ　 ＯＪ　。

３　：　８３５）及びＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　 ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域のツバリンシンターゼ遺伝子のような遺伝子の 外来３゛未翻訳末端を使用することができる。

形質転換した植物細胞中、好ましくはその細胞質中で発現可能なキメラ遺伝子を 構築し、その後、その着目タンパク質を細胞のミトコンドリア、クロロプラスト 及び／又は小胞体の内腔に転位させるために、適切な標的配列が知られている。

このような標的配列の選択は限定的ではなく、遺伝子の発現産物を転位させる標 的ペプチドをコードする外来又は内在標的配列を含むキメラ遺伝子で特定の植物 細胞を形質転換することができる。「標的ペプチド」なる用語は、一般に真核細 胞内でクロロプラストタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、タンパク質のサ ブユニット、又は小胞体に転位したタンパク質と会合しており且つ細胞の核ＤＮ Ａによりコードされる前駆物質タンパク質の一部として細胞中で産生されるポリ ペプチドフラグメントを意味する。標的ペプチドは核コードされたクロロプラス トタンパク質、ミトコンドリアタンパク質又はサブユニットがクロロプラスト、 ミトコンドリア又は小胞体の内腔に転位する過程に関与する。転位過程中に標的 ペプチドはタンパク質又はサブユニットから分離又はタンパク分解により除去さ れる。ヨーロッパ特許出願（ＥＰＡ）第８５４０２５９６．２号及び８８４０２ ２２２．９号に概説されているように発現された着目タンパク質を形質転換植物 細胞内で転位させ得る標的ペプチドを発現させるためには、キメラ遺伝子に標的 配列を配置すればよい。クロロプラストに輸送するために適切な標的ペプチドは 、酵素１．５−リブロースニリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのトラン ジットペプチド＜Ｋｒｅｂｂｅｒｓら（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ、　１１ニア４５；　ＥＰＡ　８５．４０２５９６．２＞であるが、Ｗａｔ ｓｏｎ　（１９８４）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２：５１４５及びＶｏ ｎ　Ｈｅ１ｊｎｅら（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｍ。

！、Ｂｉｏ１．Ｒｅｐ、９：１０４に記載されているような他のクロロプラスト トランジットペプチドも使用できる。適切なミトコンドリア標的ペプチドは５ｃ ｈａｔｚ（１９８７）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６５１及びＷａｔｓ ｏｎ　（１９８４）前出に記載されているようなミドコン′ドリアトランジット ペプチドである。着目タンパク質を植物細胞の小胞体の内腔に転位させ得る適切 な標的ペプチドは、例えばＶｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　９４７　：　３０７及びＷａｔｓｏｎ　（１９ ８４）前出に記載されているようなシグナルペプチドである。

トランスジェニック双子葉植物の作出に使用可能なコーディング配列は周知であ り（例えばＷｅｉｓｉｎｇら（１９８８）　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ 、２２：４２１に記載されているコーディング配列を参照のこと）、このような コーディング配列は本発明の形質転換単子葉植物で同様に良好に使用できると考 えられる。この点ではコーディング配列は植物に対して外来でも内在的でもよく 、例えば昆虫種に対して毒性であり、従って植物を昆虫の攻撃から保護しくＥＰ １９３２５９．ＥＰ３０５２７５及びＥＰ３５８５５６）；　植物をストレス条 件から保護しくＥＰ３５９６１７）；　特定の除草剤に対する耐性を植物に与え （ＥＰ２４２２３６）；　コーディング配列が雄性又は雌性器官特異的プロモー ターの制御下にあるときに、タンパク質が植物を夫々雄性稔性（ＥＰ３４４０２ ９）又は雌性稔性（ＥＰ４１２００６）にできるようにタンパク質が発現される 植物細胞を死滅又は不能にし；　植物又は選択された′Ｍ物器官から抽出するこ とができ、場合により経済的に重要なペプチド又はタンパク質源として使用でき るように更に処理することができ（ＥＰ３１９３５３）；又はタンパク質が発現 される形質転換植物又はその器官を高栄養レベルの食品として動物又はヒトに使 用できるように栄養的に重要なアミノ酸が豊富であるタンパク質を例えばコード することができる。

単子葉類を昆虫耐性にするように形質転換するために特に有用なコーディング配 列は、殺虫性結晶タンパク質及びその殺虫性ポリペプチド毒素をコードするＢａ ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ見工土１１ユｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）株及びその截頭部分から単 離した遺伝子である（参考のためにＨＯｆ　ｔ、　ｅ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ　（ １９８９）　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１、Ｒｅｖ、５３：２４２を参照）、穀類く例えばトウモロコシ、イネ、コムギ 及びオオムギ）における昆虫駆除に特に重要であると考えられるＢｔ遺伝子とし ては、Ｈｅ１ｉｃＯとＬＬＬ支種（例えばＨ，ｚｅａ及びＨ，ａｒｍｉＫ」−Ｌ ３−＞の駆除用としてＣｒｙＩＡｂ遺伝子（ＥＰ１９３２５９）及びＣｒｙＩＡ ｃ遺伝子；　トウモロコシにおける０ｓｔｒｉｎｉａ種（例えばＯ，ｎｕｂｉ　 １ａｌｉｓ）の駆除用としてＣｒｙＩＡｂ遺伝子及びＣｒｙＩｂ遺伝子（ＥＰ３ ５８５５７）；　トウモロコシ及びコムギにおけるＡ　ｒｏｔｉｓ種の駆除用と してＣｒ　ｙ　Ｉ　Ａ　ｃ遺伝子：及びトウモロコシにおける３」ト巴−生Ｊシ Ｐ」二±−ｒａ種（例えばＳ、ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ）の駆除用としてＣｒｙＩ Ｄ及びＣｒｙＩＥ遺伝子（ＥＰ３５８５５７）などの遺伝子が挙げられる。トラ ンスジェニック植物の組織でこのような遺伝子を十分に発現させるためには、Ｐ ＣＴ出願ＰＣＴ、’ＥＰ　９１１００７３３（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１６４３２ ）に記載されているように遺伝子を修飾すると好適である。

本発明の選択可能なマーカーはキメラ遺伝子であり、該遺伝子のコーディング配 列は、該遺伝子が発現される植物細胞に抗生物質及び／又は除草剤のような選択 剤に対する耐性を与えるタンパク質をコードする５本発明のスクリーン可能なマ ーカーはキメラ遺伝子であり、該遺伝子のコーディング配列は、該遺伝子が発現 される植物細胞に異なる色のような異なる外観を与えるタンパク質をコードし、 こうしてスクリーン可能なマーカーで形質転換された植物を手動的に分離できる ようにする。本発明に従って単子葉植物を形質転換するための選択可能又はスク リーン可能なマーカー、好ましくは選択可能なマーカーの選択は非限定的であり 、従来の選択可能なマーカー及びスクリーン可能なマーカー（例えばＷｅｉｓｉ ｎｇら＜１９８８）前出に記載されているようなマーカー）を使用することがで きる。

選択可能なマーカーの適切なコーディング配列の例は、抗生物質カナマイシンに 対する耐性を与える酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎ ｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：３２７）；　抗生物質 ハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素ハイグロマイシンホスホトランスフ ェラーゼをコードする加ＬＬ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ及びＤａｖｉｅｓ　（１９８３ ）　Ｇｅｎｅ　２５：１７９）；　及び除草剤ホスフィノトリシン＜ｐｈｏｓｐ ｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルト ランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ　２４２２３６）である。

クロロプラスト代謝に作用する除草剤又は他の選択剤に対する耐性を与えるタン パク質をコードする選択可能なマーマーカー遺伝子は上記のようなりロロブラス ト標的配列を有するキメラ構造の一部であると好適である。スクリーン可能なマ ーカーの適切なコーディング配列の例は、β−グルクロニダーゼをコードするｍ −遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６：３９０１）及びルシフェラーゼ遺伝子（Ｏｗら（９８６） 　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：８５６）である。

上述のように、選択剤の存在により提供される選択圧力は１選択可能なマーカー を含む本発明の形質転換植物細胞の培養中にかなり高いことが好ましい。例えば 、ｎｅｏ遺伝子を選択可能マーカーとして使用する場合には、カナマイシンを培 地中に少なくとも約１００〜２００　ｍ　ｇ　／　１、好ましくは少なくとも約 ２００　ｍ　ｇ　／　ｌの濃度で使用すべきである。このような高い選択圧力は 更に長期間（例えば２〜４力月）維持すべきである。しかしながら、特定の選択 圧力及び期間に限定する必要はなく、選択圧力及びその期間は従来通りに選択で きると考えられる。一方、ｂａｒ遺伝子を選択可能マーカー遺伝子として使用す る場合には、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を培地中に０．５〜５０、特に２〜 ２０　ｍ　ｇ　／　１の濃度で使用すると好ましい。

本発明の緻密な胚形成カルスの損傷及び／又は分解した無傷組織又は損傷及び／ 又は分解した胚形成セクターの形質転換細胞の培養で産生される形態形成カルス 、好ましくは胚形成カルスの形態形成セクター、好ましくは胚形成セクターを次 に従来方法（例えばＶａｓ　ｉ　Ｉ　（１９８８）前出及びＬａｚｚｅｒｉ及び Ｌ６　ｒｚ　（１９８８＞前出の引用文献参照）で正常表現型（例えば成熟及び 稔性）植物に再生することができる。こうして得られた再生植物はトランスジェ ニックであり、核ゲノムに安定的に組み込まれた選択可能又はスクリーン可能な マーカー、好ましくは選択可能なマーカーを少なくとも有する。次に例えばサザ ンブロンティング及び２／又はポリメラーゼ鎖反応（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９ ９０）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ）のような従来方法で他の着目遺伝子の存在及び発現を調べることができる 。

本発明の目的では、本発明の形質転換及び再生手順により産生されるような正常 表現型植物は、形質転換中に植物のゲノムに導入されるＤＮＡフラグメントの発 現により付加又は変化した特徴以外の如何なる表現型特徴においても同一系統の 未形質転換植物と実質的に相異しない少なくとも１種の植物として理解されるべ きである。当然のことながら、植物を形質転換するためのどの手順を使用した場 合にも、種々の表現型を示す多数のトランスジェニック植物が通常生成され、そ のうちで一部のみが上記に定義したような正常表現型である。

本発明の方法は未成熟及び成熟接合体肢、葉基部、花序形成カルスが得られる全 単子葉植物種に適用することができる１本発明の方法は経済的に重要なイネ科作 物、特にトウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギ、モロコシ、ライム ギ及びアワのような主要穀類の形質転換に特に有用である。本発明のトランスジ ェニック植物は、農学的価値の高い新規系統及び／又は栽培変種植物を迅速且つ 効率的に創製するために使用することができる。この点で、本発明によると、（ 参考資料として本明細書の一部に加える）ＥＰ４１２００６に開示されているよ うなハイブリッド種子の作出用授粉植物、例えば雌性不稔性授粉植物として使用 可能なトランスジェニック植物を創製することができる。

本発明は、形質転換した形態形成カルス、好ましくは緻密な胚形成カルスの培養 物を生成するために無傷組織又は緻密な胚形成カルスを使用して単子葉植物を形 質転換するための迅速で効率的で且つ再現可能な方法を提供する。無傷組織も緻 密な胚形成カルスも一部には安定的形質転換株を得るために適切な出発物質とし て認められていない（■ａｓｉｌ　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ８・７９７）ので、これは驚くべき知見である。本発明に従って無傷組織又は 緻密な胚形成カルスを使用すると、１）ＤＮＡ取り込み、２）組込み的形質転換 及び３）効率的で再現可能な単子葉植物再生に関してコンピテントな砕けやすい 胚形成カルス、胚形成細胞懸濁液培養物及び／又はプロトプラストを使用するこ とが必要であった既存の単子葉形質転換方法を著しく改善することができる。従 来ではこのようなコンピテントの必要により、単子葉類の安定的形質転換は非常 に特定の組織培養物特性を有する植物系統に限られていた。例えばトウモロコシ では、コンピテントな懸濁液培養物及び／又はプロトプラストを相当の頻度で得 られる十分なタイプＩＩカルスを形成する（即ち１０％以上、例えば８０％以上 までの頻度でタイプＩＩカルスを形成する）能力を有するのは、近文系Ａ１８８ のような特定の系統に限られていた。しかしながら、このようなトウモロコシ系 統はいずれも農業的価値が低く、従って、適当な組織培養特性を形質転換可能な 低価値系統から有用なトウモロコシ系統に移入するといった労力のかかる育種ブ ログラムを使用しなければ、経済的に価値のあるトウモロコシ系統を形質転換す ることはできながった。

本発明の方法は比較的短時間のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養しか必要としないので、従 来方法よりも時間及び労力を著しく節約できる０組織培養時間が短いため、ツマ クローナル変異の発生を少なくすることもできる。

本発明の方法は、核ゲノムに安定的に組み込まれた少なくとも１個の（外来）着 目遺伝子で形質転換された新規な正常表現型（例えば稔性）トランスジェニック 単子葉植物、特にイネ科植物、より特定的には穀類、最も特定的にはトウモロコ シ及びイネを提供する。本発明の方法は、形質転換される植物の遺伝子型から独 立しており、緻密な胚形成カルスがその組織の少なくとも１個から得られるよう な任意の植物の細胞を形質転換することが可能であると考えられる。従って、単 子葉種の大部分及び各稚内の実質的数の系統を形質転換することが可能になる。

更に、緻密な胚形成組織を形成する能力を有するある系統がら有さない別の系統 に従来の育種プログラムによりこのような能力を伝達することができる。

形質転換した形態形成カルス、特に形質転換した緻密な胚形成カルスから再生さ れる本発明の新規トランスジェニック単子葉植物は、例えばＤａｔｔａら（１９ ９０）前出、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）前出、Ｈａｙａｓｈ　ｉｍｏｔ ｏら（１９９０）前出、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）前出、及びＦｒ ｏｍｍら（１９９０）前出に記載されているような従来の培養条件を使用してこ のような単子葉植物から胚形成懸濁液培養物及び／又はプロトプラストを得るこ とが実際に不可能であること又は、安定的に形質転換された後に正常表現型（例 えば稔性）トランスジェニック植物として再生される十分な能力を有する胚形成 懸濁液培地及び／又はプロトプラストを得ることが実際に不可能であることを特 徴とする。この第２番目の特徴に関しては、１）正常表現型植物に再生できる確 率が高く、２＞ＤＮＡ取り込み及びこうして取り込まれたＤＮＡの組込み的形質 転換に関してコンピテントである確率が高く、３）こうして形質転換された場合 に正常表現型トランスジェニック植物に再生できる確率が高いこのような単子葉 植物の胚形成懸濁液培養物又はプロトプラストを得ることは実際的でないと考え られる。

特に本発明は、例えばＬｉら（１９９０）　ＰｌａｎｔＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅ ｐｏｒｔ、　８：２７６、　Ｄａｔｔａら（１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｅｉ、 ６７：８３及びＤａｔｔａら＜１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、９ ：２５３に記載の手順に従って（取得可能な場合に）胚形成懸濁液培養物を一般 に取得することができ、例えばＬｉ及びＭｕｒａｉ（１９９０）　ＰｌａｎｔＣ ｅｌｌ　ＲｅＰ、　９：２１６により記載されている手順に従って胚形成懸濁液 培養物から（取得可能な場合に）プロトプラストを一般に取得できるようなイネ 系統の新規トランスジェニックイネ植物を提供する。一方、例えばＳｈｊｍａｍ ｏｔｏら（１９８９）前出、Ｄａｔｔａら（１９９０）前出及びＨａｙａｓｈｉ ｍｏｔｏら（１９９０）前出に記載されているような従来の培養条件下では、こ のようなイネ系統の胚形成懸濁液培養物又はプロトプラストから正常表現型（例 えば稔性）植物を再生することはできない。

本発明は更に、例えば５ｈｉ１１ｉｔｏら（１９８９）Ｂｉｏ、’Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　７：５８１．　Ｐｒ１ｏ１ｉ及びＳ６　ｎｄａｈｌ　（１９８９）　 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：５８９．　Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１ ９９０）前出、　並びにＦｒｏｍｍら（１９９０）前出により記載されている手 順に従って（取得可能な場合に）胚形成懸濁液培養物を一般に取得することがで き、例えば５ｈｉ１１ｉｔｏら（１９８９）前出並びにＰｒ１ｏ１ｉ及び５ｏｎ ｄａｈ　＋　（１９８９）前出により記載されている手順に従ってこのような胚 形成懸濁液培養物から（取得可能な場合に）プロトプラストを一般に取得できる ようなトウモロコシ系統の新規トランスジェニックトウモロコシ植物を提供する 。一方、例えば５ｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）前出、Ｐｒ１ｏｌｉ及びＳ６　 ｎｄａｈｌ　（１９８９）前出、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）前出並 びにＦｒｏｍｍら（１９９０）前出により記載されているような従来の培養条件 下では、このようなトウモロコシ系統の胚形成懸濁液培養物又はプロトプラスト から正常表現型（例えば稔性）植物を再生することはできない、更に、このよう なトウモロコシ系統は高頻度でタイプＩカルスを形成する能力を有するが、１０ ％以上の頻度、特に１０と以上、より特定的には０．１％以上、更に特定的には ０゜０１％以上の頻度でのタイプＩＩカルスを形成する能力をもたない。タイプ ■■トウモロコシカルスは、安定的に形質転換できる胚形成懸濁液培養物及び再 生可能なプロトプラストが適切に得られるトウモロコシカルス組織の唯一の型で あり、従って、特定のトウモロコシ系統でタイプＩＩカルスを得られないことは 、このようなトウモロコシ系統の形質転換カルスから正常表現型（例えば成熟） トランスジェニックトウモロコシ植物を従来再生できなかったことを意味する。

特定のトウモロコシ系統からタイプＩＩカルスを実際に得られるか否かは、Ｇｏ ｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）前出及びＦｒｏｍｍら（１９９０）前出とそ の引用文献により記載されている一般手順により調べることができる。この検査 によると、例えばトウモロコシ系の１０００個の未成熟胚からカルス培養を開始 することができ、３週問おきにサブクローニングすることにより培養を維持する ことができ、典型的なタイプＩＩカルスに最も近似する培養物のみを継代培養す ることができ、６力月後にどの程度の頻度で均質なタイプＩＩカルスが得られる かを決定することができる。

より一般的には、単子葉種の特定の系統から再生可能なプロトプラストを実際に 得られるか否かを決定するためには、以下に述べるような周知手順をとることが できる。これについては、任意の特定の単子葉類で従来手段により生成及び維持 され得る胚形成懸濁液培養物から、再生可能なプロトプラストが効率的且つ確実 に生成されると考えられる。胚形成懸濁液培養の程度及び品質は一般にその遺伝 子型に依存し、一般に胚形成懸濁液培養物が植物を再生可能である場合には形質 転換のために植物系統のプロトプラストを形成することしか価値がない、胚形成 懸濁液培養物は一般に、細胞質に富んだ胚形成細胞の十分に分散した小群から構 成され、カルス組織又は有機化分裂組織を含まず、２７〜３２時間の細胞倍加時 間を有しており、体細胞胚及び植物を形成することが可能であるという特徴を有 する（Ｖａｓｉｌ　（１９８８）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６　：　３９ ７）。単子葉種の特定の系統の胚形成懸濁液培養物が植物再生に適切であるか否 かを決定するには、多数（即ち少なくとも１００個）の細胞集合体を適切な再生 培地におき、どの程度の割合の集合体が正常表現型稔性植物をもたらすかを決定 すればよい、正常稔性植物が細胞集合体の５０％以上から得られる場合には、一 般にプロトプラスト生成を続行すべきであると判断される。一方、従来のプロト プラスト単離、培養及び植物再生技術を使用してプロトプラスト１００００個当 たり約５００以下、特に約１００以下、特定的には約１０以下、より特定的には 約１以下の正常表現型（Ｍえば聴性）植物しか再生できない場合には、特定の単 子葉系統は植物形質転換に適切な再生可能なプロトプラストを提供するために適 切でないと判断することができる。

以下、実施例により本発明を説明する。特に指定しない限り組換ＤＮＡを操作す るための全実験手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９０）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されてい る標準化手順により実施した。オリゴヌクレオチドはＫｒａｍｅｒ及びＦｒ１ｔ ｚ　（１９６８）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５４：３５ ０に要約されている一般規則に従って設計し、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔ ｈｅｒｓ（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：１８ ５９のホスホラミシト法によりＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０ Ａ　ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂ、Ｖ、、Ｍａａ ｒｓｓｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒ　１ａｎｄｓ）で合成した。実施例で使用した以下の 細菌株及びプラスミドはＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｉｉ　ｒ　Ｍ ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　（ＤＳＭ ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ＩＢ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅ ｒｍａｎｙから入手可能である。

１：ＤＮＡを　ム　の未Ｐｔ　・にエレクトロポレーション　ることに　る　Ｉ Ｉ　ｔマー　−道　を　っトウモロコシの′ 約０．５〜１■の接合体の未熟な胚を、２種類のトウモロコシの自家授粉系（Ｐ ａ９１及びＨ２Ｓ）から生長させた種から単離した。新しく単離した胚を、酵素 溶液ｎ　［１０ｇマンニトール及び５霧Ｍ　２−［８−モルフオリノコエタンス ルホン酸（ＭＥＳ）。

ｐＨ５，６を含むＣＰＭ塩（Ｐｏ＠ｅｌｌ　＆　Ｃｈａｐｍａｎ　：　１９８５ 　”Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｕｔｕｒｅ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　＾ｐ ｐｒｏａｅｈ”　、Ｒ，＾、Ｄｉｘｏｎ編、第３章）中の０．３＄　ｍａｃｅｒ ｏｚｙｍｅ（に１ｎｋｉ　ＹａｋｕｌＬ、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉｎｏ、Ｊａｐａｎ ）］で１〜２分酵素処理した。この酵素溶液中で１〜２分インキュベーションし た後、胚を注意深（、Ｎ６ａｐｈ溶液（６ｍＭアスパラギン、１２−Ｍプロリン 、１１ｇ／ｌチアミンーＨＣｌ、０．５ｗｔｔ／１ニコチン酸、１００ｚｙ＃カ ゼイン氷解物、１００ｔｙ＃イノシトール、３０ｙ＃’蔗糖及び５４ｇ７１マン ニトールを補ったＮ６培地［Ｃｈｕら（１９７５）Ｓｃｉ、Ｓｉｎ、Ｐｅｋｉｎ ｇ　１８：６５９］のマクロ−及びミクロ−エレメント）で洗浄した。洗浄後、 胚をトウモロコシエレクトロポレーション緩衝液、ＥＰＭ−ＮａＣ１［１５０Ｊ 　Ｎａ１Ｊ、５１＊ＮＣａＣＩｚ、ＩＯＪ　ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエ チｌレピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）及び０．４２５Ｍマンニトー ル、ｐ）１７．２］中でイ”／　キュベートした。　２００μｌ　ＥＰＮ−Ｎａ Ｃｌ中の約１００個の胚を、各キュベツトに載置した。Ｈｉｎｄｌｌ［で直線化 したプラスミドＤＮ＾、ｐＤＥ１０８約２０μ２を各キュベツトに添加した。ｐ ＤＥ１０８は、５３９９　ｂｐプラスミドであり、その全配列はＳｅｑ、Ｉｄ。

Ｎｏ、１に記載されており、３５Ｓ３プロモーター（ＥＰ３５９６１７）の制御 下でカナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）からなるキメラ遺伝子を含む。

外植片で１時間ＤＮＡをインキュベーションした後、キュベツトを水浴に移した 。氷上で１０分インキュベーション後、エレクトロポレーションを実施した：　 ３７５　Ｖ／ｃｉ＋の電界強度のパルス１個を９００μＦコンデンサーから抜き 出した。エレクトロポレーション装置は、Ｄｅｋｅｙｓｅｒら（１９９０）の記 載と同じものであった（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２：５９１）。エレク トロポレーション直後、新しい液体Ｎ６ａｐｈ基質を、キュベツト中の外植片に 添加し、この後、外植片をさらに氷上で１０分間インキュベーションした。

その後、胚を０．２Ｍマンニトールを補った、Ｍａｈｌ　Ｖｌｌ基質ＣＬＯＯｗ ｙ／１カゼイン氷解物、６＠Ｈアロリン、　０．５ｇ／ｌ　ＭＥＳ。

１ｙｇ＃！　２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）並びに０　、７５ ｇ／ＺＭｇＣＩ　、及び１．６ｇ／ｌ　Ｐｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔｌ、ｏｕｉｓ、Ｎｏ、Ｕ、Ｓ、＾、）で固化 した２ｚ蔗糖、　ｐＨ５，８を補ったＮ６培地のビタミン並びにマクロ及びミク ロエレメント］に移した。系Ｈ９９及びで３日及び系Ｐａ９１で２日後、胚をＺ ＯＯｗｇ／ｌカナマイシンを補った同一基質に移した。約１４日後、胚をカナマ イシンを補った、マンニトールを含まないＭａｈｌ　ＶＩ［基質に移した。さら に胚を約２月間、この選択的基質上で継代培養し、約３週間の間隔をあけて継代 培養した。誘導した胚形成組織を注意深く単離し、系Ｈ９９に関しては５Ｈ／１ ６−ベンジルアミノプリンを、系Ｐａ９１に関しては５ｚｇ／ｌゼラチンを補っ たＮ５培地［Ｈｕｒａｓｈ　ｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ 　。

Ｐｌａｎｔ　１５：４７３］に移した。胚形成組織をこの培地上で約１４日間保 持し、次いで、系Ｈ９９に関してはホルモン及び６ｚ蔗糖を含まない、系Ｐａ９ １に関しては３ｚ蔗糖を含まないＭＳ培地に移した。発育した芽をさらに通常の 苗に発育する閏、１．５ｚ蔗糖を含む１／２　ＭＳ培地に移した。これらの苗を 土壌に移し、温室栽培した。

！−２・　１で形　転−したトウモロコシ植　の特ｌ仇吏 実施例１からの１７本の植物を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によりキメラｎ ｅｏ遺伝子の存在下で分析した。約１０〜２０ｚｇの組織量に合わせたＤｅｌ　 １ａｐｏｒｔａら［（１９８３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　１：１９］により記載されたプロトコルに従ってＤＮＡを調 製した。各植物毎に、特定量の組織をミクロファージ管中の抽出緩衝液でふやか した。ｎｅｏ遺伝子のコード配列の一部に対応する７０６ｂ、フラグメントを、 ヌクレオチド１３８４〜１４０６及び２０８９〜２０６７（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ 、１の番号）のプラスミドｐＤＥ１０８の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプ ローブを使用して、５ａｓｂｒｏｏｋら［（１９９０）、同上］により記載のプ ロトコルに従ってポリメラーゼ鎖反応で増幅した。アニール温度５０℃で全部で ３５サイクル実施した。最終ＤＮＡを、１．５ｚアガロースゲル上の電気泳動に より分析した。　７０６ｂｐフラグメントが全部で１３本の植物で同定された。

後段で陽性の植物のうち１本が枯死した。

ｎｅｏ遺伝子［即ち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ ）］の発現産物の活性を、以下の如く植物９本で分析した。粗抽出物を、抽出Ｍ ｆ１１液［Ｍｅ［１ｏｎｎｅｌら（１９８７）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５：３８０コ中で植物組織を粉砕することにより 調製しな。抽出物をＲｅ１ｓｓら［（１９８４）Ｇｅｎｅ　３０：２１１］に記 載のプロトコルに従って、非−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。

ＮＰＴ［活性を、基質［ＮｃＤｏｎｎｅｌｌら＜１９８７）上述］として［γ− ３２Ｐ］＾ＴＰを使用するカナマイシンのｉｎ　５ｉｔｕホスホリル化により分 析した。ＮＰＴＩＩ活性は、試験した植物の内８本で知見されたく図１）。

ＰＣＲ及びＮＰＴＩＩの両方のアッセイで陽性であることが知見された植物の内 １本（）１９９−Ｍ１４８−１＞をさらに、サザンハイブリダイゼーションによ り分析した。ゲノムＤＮ＾は、残りのＲＮＡを除去するためにＲｎａｓｅを用い る処理を補ったＤｅｌｌａｐｏｒｔａら［（１９８３）上述］に記載のプロトコ ルに従って植物組織から調製した。形質転換していないＨ９９植物を対照として 使用した。　ＤＮＡサンプルを以下の制限酵素：　ＢＨｌ［［、ＥｃｏＲｌ、Ｅ ｃｏＲＶ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、　ＢａｍＨＴ、Ｐｖｕｌ−ＰｖｕｌｌまたはＰｓｔ ｌで消化し、次いで水平方向アガロース電気泳動にがけな、製造業者（＾５ｅｒ ｓｈａａ＋　Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ソリ−レット）により推奨されたように、“＾ １ｋａｌｉ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇｏｒ　ＤＮＡ”プロトコル及び続くハイブリダイ ゼーションによりＨｙｂＯｎｄ＋（＾＋＋＋ｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ　ＰＩ、Ｃ３Ａｍｅｒｓｈａ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）膜への サザントランスファーを実施した。公開方法しＦｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌ ｓｔｅｉｎ（１９８３）＾ｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３２：６］から誘導し た製造業者により供給されたプロトコルに従って、マルチ−プライムＤＮＡラベ ルキット（＾ｍｅｒｓｈａ＋＊）を用いて放射性プローブを調製した。

プローブとして、もう一つのプラスミドから誘導した１１８４ｂｐ　ＥｃｏＲＩ −Ｈｉｎｄｌ１１フラグメントを使用した。このプラスミドの配列は、Ｓｅｑ、 Ｉｄ、Ｎｏ、２に記載されている。バンドパターン（例えば、図２参照）から、 少なくともキメラ凹且遺伝子は、植物のゲノムＤＮ＾に組込まれたことが知見さ れた。

この形質転換した植物（８９９−ｍ１４８−１）の詳細分析から、プラスミド、 ＤＥ１０８の２個の殆ど完全なコピー及び３番目が転移したコピーの一部を保持 していることが知見された。２個の殆ど完全なコピーは明らかにヘッド〜テイル のコンカテマーの植物ゲノムに挿入される。しかしながら、幾つかの転移は、追 加のＮｅｏ１部位及び追加のＢｇ１１１部位が作り出されるように起きなければ ならなかったが、２個のコピーの結合部での旧ｎｄｌ１１部位（エレクトロポレ ーション前のｐＤＥ１０８の直線化に使用した）が欠失していた。植物ゲノムで 組込んだように、２個のプラスミドコピーの結合部のシーフェンシングから、Ｈ ｉｎｄｌ１１部位の突出５′末端のみが欠失していることが明らかになった。こ れにより、　Ｎｅｏ１部位は以下のように： く欠失した塩基には下線を引き、結合部に作り出したＮｅｏ１部位を強調した） 作り出された。さらなる分析から、旧ｎｄ１１１部位の回りでは植物ゲノムをフ ランキングするプラスミド−ＤＮＡ配列は、全くまたは殆ど欠失していなかった 。他の植物はこの方法では試験しなかったが、ＰＣＲ及びＮＰＴＩＩ分析から、 キメラ遺伝子が存在し且つ発現することが知見された。

成熟した形質転換植物は繁殖可能であり、且つ表現型的にも全く正常であった。

サザンハイプリダイゼーションにより予備分析した植物を、形質転換していない 植物（トウモロコシ自家授粉系Ｈ９９から２本及びトウモロコシ自家授粉系Ｐａ ９１から１本）を用いた３つの交雑に於いて花粉媒介植物として使用した。全部 で４４本のＦ１子孫の植物を上記記載の如（ＮＰＴＩＩ活性に関して分析し、そ の内の２０本が陽性であることが知見された。これは、通常のメンデルの分離の 法則下で予想された１：１比とは大きく違っておらず、形質転換した花粉媒介植 物がキメラ遺伝子（Ｘ２＝０．３６）の１つの活性コピー〈または、あるいは、 複数の密接に結合した活性コピー）を持っていたと考えられる。

東［３：　軌ｔ　・の　合体ヲヘｂ−１シたｌ　ルスにＤＮＡをエレクトロポレ ーション　ることに　選　マーカー遺伝子を　いるトウモロコシの）　−長さ約 ０．５〜１ａｉｒの未成熟な胚の接合体を、トウモロコシ自家授粉系Ｐａ９１の 発芽種から単離し、次の継代培養までの間隔を約１４日問として、Ｍａｈｌ　Ｖ ｌｌ基質上で培養した。胚形成組織を発育型（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｔｙｐｅ ）　Ｉカルスから注意深く切開した。最後にＥＰＭ中の胚形成組織（ＮａＣＩを 含まないＥＰＭ−ＮａＣ１）を、最大長約１．５ｚｉのフラグメントに切断した 。得られたカルスフラグメントをこの緩衝液中で３時間、予備原形質分離した。

３時間後、カルスフラグメントをＥＰＭ−ＨａＣｌに移入した。カルスフラグメ ント約１００〜１５０１１１７を、キュベツト１個当たり２００μＮＥＰＭ−Ｎ ａＣ１に移入した。　Ｈｉｎｄｌｌｌで直線化したプラスミドｐＤＥ１０８（Ｓ ｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１）の２０μｇＤＮ＾を各キュベツトに添加した。ＤＮＡを １時間カルスフラグメントとインキュベートし、その後、キュベツトを水浴に移 した。

氷上で１０分インキュベーション後、エレクトロポレーションを実施した。３７ ５Ｖ／ＣＩの電界強度のパルス１個を、９００μＦコンデンサから取り出した。

エレクトロポレーション装置は、Ｄｅｋｅｙｓｅｒら［（１９９０）上述］の記 載と同じものであった。

エレクトロポレーション直後、６Ｊアスパラギン、１２麟台フロリン、ＩＲｇ／ ｌ　＋　７　ミン−ＨＣｌ、０．５ｘｙ／１　二ニア　ｆ　ン酸、１ｏ。

ｗｇ／ｌカゼイン水解物、１００胃ｉｌｌイノシトール、３０ｈ／ｊ！蔗糖及び ５４１ｇ＃マンニトールを補った、新しい液体Ｎ６ａｐｈ基質をカルスフラグメ ントに添加し、次いでさらに氷上で１０分間インキュベートした。

１　ａｔ／Ｉ　Ｚ、４−Ｄを補った液体Ｎ６ａｐｈ基質中で１日培養後、カルス フラグメントを、０．２Ｍマンニトール及び２００Ｂ／１カナマイシンを補った Ｍａｈｌ　Ｖｌｌ基質に移した。１４日後、カルスフラグメントを、マンニトー ルを含まない同一の選択基質で継代培養し、次いで約３週間の継代培養間隔を空 けて約２月この基質でさらに培養した。得られたカルスの胚形成区域を、べとべ とした組織から単離し、３ｚ蔗糖及び発芽させるために５Ｈ／１ゼラチンを補っ たＭＳ基質［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ＰＩａｎｔ　１５：４７３］に移した０組織をこの培地上で約２週間保持し、続 いて３ｚまなは６ｚ蔗糖を含むＭＳ培地に移した。この基質上に発育した芽を、 さらに通常の苗に発育させるために１．５１蔗糖を含む半分の強度のＭＳ培地に 移した。これらの苗を土壌に移し、温室栽培した。

４：　３のラ　したトウモロコシ　の、機付は 実施例３由来の２９本の植物を、ポリメラーゼ鎖反応にょリキメラｎｅｏ遺伝子 の存在について分析した。　ＤＮＡは、約１０〜２０ｚｇの組織量に適用するた めに合わせたＤｅｌｌａｐｏｒｔａら［（１９８３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　１：１９］に従って調製した。

各植物に毎に、特定量の組織をマイクロヒュージ管中の抽出緩衝液中にふやかし た。駐車遺伝子のコード配列の一部に対応する７０６ｂ、フラグメントを、ヌク レオチド１３８４〜１４０６及び２０８９〜２０６７（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１ の番号）のプラスミドｐ［１Ｅ１０８の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプロ ーブを使用してＳａ＋５ｂｒｏｏｋら［（１９９０）上述］に記載のプロトコル に従ったポリメラーゼ鎖反応で増幅した。アニール温度５０℃で全部で３５サイ クル実施した。最終ＤＮＡを１．５ｚアガロースゲル上で電気泳動により分析し た。　７０６ｂｐフラグメントが全部で１４本の植物で同定できた。陽性の植物 の内１つは後段で枯死した。

ｎｅｏ遺伝子のＮＰＴＩＩ発現産物の活性を、以下のように２４本の植物で分析 した。粗抽出物は、植物組織を抽出緩衝液ＬＭｃＤｏｎｎｅｌ　ｌら（１９８７ ）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５：３８０ ］中で粉砕することにより調製した。次いで抽出物をＲｅ５ｓら［（１９８４） Ｇｅｎｅ　３０：２１１］に記載の方法に従って非−変性ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動にかけた。　ＮＰＴＩＩ活性を、基質（ＭｃＤｏｎｎｅｌ　ｌら、同 上）として［７−”Ｐ　］＾ＴＰを使用して、カナマイシンのｉｎ　５ｉｔｕホ スホリル化により分析した。　ＮＰＴＩＩ活性は試験した植物のうち１４本で知 見された（図３）。ＮＰＴ　Ｉ　１陽性であった２本の植物は、ＰＣＲアッセイ では陰性であった。

ＰＣＲ及びＮＰＴＩＩアッセイの両方で陽性であったことが知見された植物のう ち２本（Ｐａ９１−８１４６−２及びＰａ９ｌ−８１４９−１）を、サザンハイ プリダイゼーションによりさらに分析した。ゲノムＤＮ＾は、残りのＲＮＡを除 去するためにＲＮａｓｅとの処理を補ったＤｅｌｌａｐｏｒｔａら［（１９８３ ）上述］に従って植物組織から調製した。形質転換していないＰａ９１植物を対 照として使用した。ＤＮＡサンプルを以下の制限酵素：Ｂｇｌｌｌ、ＥｃｏＲｌ 、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄｌＴｌ、　ＢａｍＨｒ、　Ｐｖｕｌ、Ｐｖｕｌｌまたは ＰｓＬＩのうちの１種で消化し、次いで水平方向アガロース電気泳動にかけた。

製造業者（＾ｓｅｒｓｈａｍ）により推奨されたように、“＾Ｉｋａｌｉ　Ｂｌ ｏｔｔｉｎｇ　ｏｆ　ＤＮＡ”プロトコル及び続くハイブリダイゼーションによ りＨｙｂｏｎｄ＋膜へのサザントランスファーを実施した。

公開方法［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８３）＾ｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、１３２：６］から誘導した製造業者により供給されたプロト コルに従って、マルチ−プライムＤＮＡラベルキット（＾ｍｅｒｓｈａ輸）を用 いて放射性プローブを調製した。プローブとして、もう−１個のプラスミドから 誘導した１１８４ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｌｌｌフラグメントを使用した。こ のプラスミドの配列は、Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ。

２に記載されている。バンドパターン（例えば、図４参照）から、少なくともキ メラｎｅｏ遺伝子は、植物のゲノムＤＮ＾に組込まれたことが知見された。

この形質転換した植物（Ｈ９９−ｍ１４８−２）のさらなる分析から、プラスミ ドｐＤＥ１０８の２個の殆ど完全なコピーは、ヘッド〜テイル配置で保持されて いることが知見された。２個のコピーの結合部での旧ｎｄＩ［１部位（エレクト ロポレーション前のｐＤＥ１０８の直線化に使用した）が欠失していた。植物ゲ ノムに組み込んだように、２個のプラスミドコピーの結合部のシーフェンシング から、Ｈｉｎｃｌ１１１部位の突出５′末端＋Ｗｉｎｄｌ１１部位の一方の下流 の１個の塩基が以下のように：欠失していることが明らかになった（欠失した塩 基には下線を引いた）。さらなる分析から、植物ゲノムをフランキングする旧ｎ ｄ１１１部位の回りではプラスミドＤＮ＾は、全くまたは殆ど欠失していなかっ た。他の植物はこの方法では試験しなかったが、ＰＣＲ及びＮＰＴＩＩアッセイ から、キメラ遺伝子が存在し且つ発現することが知見された。

成熟した形質転換植物は繁殖可能であり、且つ表現型的にも完璧に正常であった 。サザンハイプリダイゼーションにより予備分析した植物のうち１本を、形質転 換していない植物（トウモロコシ自家授粉系Ｈ９９）を用いた交雑に於いて花粉 媒介植物として使用した。全部で２０本のＦ１子孫の植物を−に記記載の如＜　 ＮＰＴＩＩ活性に関してアッセイし、その内の６本が陽性であることが知見され た。これは、通常のメンデルの分離の法則下で予想された１′：１比とは大きく 違っておらず、形質転換した花粉媒介植物がキメラｎｅｏ−遺伝子 （Ｘ２　＝　３．２）の１個の活性コピーを持っていたと考えられる。

尺１−倒−５二】す（熟９−・の　Δ　にＤＭＡを　−エレクトロポレーション ｊ−ることに圃批王盈麦」０【（能（！−カーを　するトウモロコシの多約１〜 １．５ｉ＋ｉの未成熟の胚の接合体を、トウモロコシ自家授粉系Ｈ９９の発育し た種から単離した。新しく単離した胚を酵素的に処理し、実施例１の記載通りに 洗浄した。洗浄後、胚をトウモロコシエレクトロポレーション緩衝液、ＥＰＭ− にＣ１（８０ｍＭＫＣＩ、５ｍＭ　ＣａＣｌ２．１０ｍＮ　ＨＥＰＥＳ及び０． ４２５Ｍマンニトール、ｐＨ７，２）に載置した。２００μＩ　ＥＰＭ−ＫＣｌ 中の約１００個の胚を各キュベツトに載せた。プラスミドＤＮ＾、Ｈｉｎｄｌｌ ｌで直線化したｐＶＥ１０７約２０μｇを各キュベツトに添加した。ｐＶＥ１０ ７は、ｐＴＴＭ８の１２８７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｅｏＲＩフラグメント（Ｅｐ 　３４４０２９；Ｓｅｑ、ｌｄ、Ｎｏ、３）をプラスミドｐＤＥ１０８（Ｓｅｑ 、Ｉｄ、Ｎｏ、１）の大きなＸｂａｒ（フレノウで充填した）−ＥｃｏＲＩフラ グメントに結合することにより得られた６６５９ｂｐプラスミドである。　ｐＶ Ｅ１０７は、３５Ｓ３プロモーターの制御下でカナマイシン耐性遺伝子（駐車） からなるキメラ遺伝子及びＮ１ｃｏＬｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍのＴ＾２９遺伝 子の芽胞−特異的プロモーターの制御のでｂａｒｎａｓｅ遺伝子［Ｒａｒｔｌｅ ｙ（１９８８）Ｊ、Ｎｏ１．８ｉｏ１．２０２：９１３］からなるもう１個のキ メラ遺伝子を含む。

ｂａｒｎａｓｅ遺伝子のフラグメントを含む全ベクター横築は、プラスミドｐＭ ｃ５Ｂｓを含む」、竺往株１１に６で実施した。　ｐＭｅ５Ｂｓは、ｔｉｅプロ モーターの制御下でｂａｒｓｔａｒ遺伝子（ｂａｒｎａｓｅ阻害剤をコードする ）を含む［Ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　。

＾ｃａｄ、ｓｃ　ｉ　、ＵＳ八へ０：２１］。このプラスミドは、プラスミドｐ ＭＴ４１６のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ［ＩＩフラグメント［Ｈａｒｔｌｅｙ（１９ ８８）参照］をプラスミドｐＭｃ５−８（ＤＳＭ　４５６６）のＥｃｏＲＩ及び ｔｌｉｎｄＩＩ［部位にクローニングし；次いで５ｏｌｌａｚｏら［（１９８５ ）Ｇｅｎｅ　３７：１９９］に通常記載の１ｏｏｐｉＢ−ｏｕｔ突然変異発生に より、ｐｈｏ＾シグナル配列の開始コドンで始まり、ｂａｒｓｔａｒコード領域 の翻訳開始コドンの前の最後のヌクレオチドで終端する配列を除去することによ り構築する。

ＤＭＡを外植片と１時間インキュベーションした後、キュベツトを水浴に移した 。氷上で１０分間インキュベーション後、実施例１に記載の如くエレクトロポレ ーションを実施した。エレクトロポレーション直後、新しい液体Ｎ６ａｐｈ基質 をキュベツト中の外植片に添加し、この後、外植片を氷上でさらに１０分間イン キュベートした。

その後、胚を０．２Ｍマンニトール及び２００＊ｙ＃！カナマイシンを補ったＭ ａｈｌ　ＶＩＩ基質に移した。約１４日後、胚をマンニトールを含まないが、同 −選択剤、カナマイシンを含むＭａｈ　ＩＶｌ＋基質に移した。胚を、約３〜４ 週の継代培養期間隔で。

約２箇月この選択的基質上でさらに継代培養した。誘導した胚形成組織を注意深 く単離し、５ｚｙ＃　６−ベンジルアミノプリンを補ったＭＳ培地［Ｍｕｒａｓ ｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２）同上］に移した。胚形成組織をこの培地上 で約１４日間保持し、次いでホルモン及び蔗糖を含まないＭＳ培地に移した。生 長した新芽を、通常の苗に生長させるために、１．５ｚ蔗糖を含む１／２　ＭＳ 培地に移した。これらの苗を土壌に移し、温室で栽培した。

６：　５のヅ　−　した　の、　ｌ九 実施例５からの７本の植物、８２Ｍ１９−Ｚ、８２Ｍ１９−３．８２Ｍ１９−４ ．８２Ｍ１９−５．８２Ｍ１９−６．８２Ｍ１９−７及び８２Ｍ１９−８を、同 一胚形成カルス集団から誘導した。これらを拡張サザン分析にかけたにの場合、 Ｂａ＋＊ＨＩ−Ｎｃｏｌで消化した植物のゲノムＤＮ＾をｐＶＥ１０７及びＰＴ ＴＭ８の小さなＥｅｏＲＶ−Ｘｂａｌフラグメント（ＰＴ＾２９−ｂａｒｎａｓ ｅを含む；　Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３参照）でプローブした。総ての植物に於い て、最も強く検出された帯は、予想した１４００ｂｐフラグメントであった。し かしながら、これら及び他のサザンプロットで知見されたパターンは、非常に複 雑で、形質転換によりｐＶＥ１０７の総てまたは一部が植物のゲノムに多く挿入 されたことを示していた。　ｐＶＥ１０７の挿入されたコピーの幾つかは、明ら かに不完全であるか及び／または転位が起きていた。しかしながら、幾つかの複 雑な組込みバターンは７本の植物総てに知見された。これは、７本の形質転換体 が総て１個の胚形成カルス集団から誘導されたという事実により説明できた。

形質転換した植物は、不稔性の雄株であったが、これ以外には表現型的にも完全 に正常であった。雌株の生殖力は正常であった。雄花の小穂花は、はとんど正常 の長さであったがしかし非常に薄く、空のようであり、全く開かなかった。詳細 な分析からめは殆ど微細な構造に縮んでいることが知見された。この表現型は、 ｂａｒｎａｓｅ遺伝子の少なくとも１個のコピーが発現されただけでなく、豹の 組織の一部または全体で選択的に発現したことも示している。

形質転換体ＲＺＭ１９−３は、形質転換していない１１９９植物からの花粉で授 粉し、５３本の子孫の苗を回収した。５３本の苗の内、３２本（６０％）は、Ｎ ＰＴＩＩアッセイで陽性であったが、２１本（４０りはＮＰＴＩＩ陰性であった 。　Ｆｌ子孫に於けるこの割合は、通常のメンデルの分離の法則下で予測されな １：１比とは大きく離れておらず、形質転換した雌親がキメラ川遺伝子（Ｘ２＝ ２．２８）の１個の活性コピーを有していたと仮定できる。ＮＰＴＩＩ陰性の子 孫は生殖力のある雄株であったが、ＮＰＴＩＩ陽性の子孫は不稔性であった。

ＮＰＴＩＩ陽性の子孫植物３１本を、サザン分析にがけな、これらの植物のうち ２８本は、これらが誘導された元の形質転換体ＲＺＭ１９−３と同じ組込みパタ ーンを示した。残りの３本の植物は、やや異なったパターンを有していた。

７：ＤＮＡの　ｔ　Δ　・へのエレクトロポレーションに　Ｘ　の　の　−び、 　−つ トウモロコシの多 トウモロコシ近親自家授粉系Ｈ９９の接合体の胚を単離し、酵素的に処理し、洗 浄し、次いで実施例５に記載の如くエレクトロポレーションＩＩＩ液に載置した 。各キュベツト毎にＺｏｏμｌ　ＥＰＭ−ＫＣｌ中の約１００個の胚を載置した 。　［１ｉｎｄｌｌｌで直線化したプラスミドＤＮＡ、ｐＶＥ１０８約２０μｇ を各キュベツトに添加した。ｐｖｉ：ｉｏｓは、ＰＴＴＭ８の１２８７ｂｐ　Ｅ ｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ＥＰ　３４４０２９　；　Ｓｅｑ、Ｉｄ、 Ｎｏ、３）をプラスミドｐＤＥ１１０の大きなＥｅｏＲＩ−Ｓｔｕ［フラグメン ト（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、４）に結合することにより得られた５６２０ｂｐプラ スミドである。　ｐＶＥ１０８は、３５Ｓ３プロモーターの制御下で、ホスフィ ノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードし、除草剤のグルタ ミンシンセターゼ阻害剤く例えば、ホスフィノトリシン二ＰＰＴ）に対する耐性 を与えるｍ遺伝子を含むキメラ遺伝子（ＥＰ２４２２３６）　、及びＮ、ｔａｂ ａｃｕｍのＴ＾２９遺伝子（ＥＰ３４４０２９）の芽胞−特異性プロモーターの 制御下で、ｂａｒｎａｓｅ遺伝子［Ｈａｒｔｌｅｙ（１９８８）同上］からなる もう１個のキメラ遺伝子を含む、　ｂａｒｎａｓｅ遺伝子からなるＤＮＡフラグ メントを含む全ベクター構築を、実施例５のプラスミドｐＭａ５Ｂｓを含む１． 咀匡株−に６で実施した６ ＤＮＡを外植片と１時間インキュベーションした後、キュベツトを水浴に移した 。氷上で１０分インキュベーション後、実施例１に記載の如くエレクトロポレー ションを実施した。

エレクトロポレーション直後、新しい液体Ｎ６ａｐｈ基質をキュベツト中の外植 片に添加し、この後、外植片を氷上でさらに１０分イン・キュベートした。

その後、一つのエレクトロポレーション実験からの胚を、０．２Ｍマンニトール 及び２　ｚｇ／Ｉ　ＰＰＴを補ったＭａｈｌ　Ｖｌｌ基質に移した。約１４日後 、胚をマンニトールを含まない、２　Ｈ／ＩＰＰＴを補ツタＭｈｌＶＩＩ基質（ 実施例１　（７）Ｍａｈｌ　Ｖｌｌ基質であるが、プロリン及びカゼイン氷解物 を含まない）に移した。

約４週問後、胚を、１０ｚｙ＃！　ＰＰＴを補ったＭｈｌ　Ｖ［Ｉ基質上でもう １箇月継代培養した。誘導した胚形成組織を注意深く巣離し、５肩ｙ＃６−ベン ジルアミノプリンを補ったＭＳ培地に移した。胚形成組織をこの培地上で約１４ 日間保持し、続いて、ホルモン及び蔗糖を含まないＭＳ培地に移した。生長した 新芽をさらに通常の苗に生長させるために、１．５ｚ蔗糖を含む１／２　ＭＳ培 地に移した。これらの苗は、２　ｌ／ｈａに相当するＢＡＳＴ＾（登録商標；　 Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ａ（、製、　Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ　ａｍ　Ｍａｉｎ。

Ｇｅｒｍａｎｙ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏで噴霧しても生存しな０次いで、これらの 苗を土壌に移し、温室栽培した。この形質転換した苗のうち２本、ＲＺＭ３５− １及びＲＺＭ３５−１８をさらに特徴つけた（実施例８参照）。

第２のエレクトロポレーション実験からの胚を、２　ｍｇ／ＩＰＰＴ及び０．２ Ｍマンニトールを補ったＭｈｌ　Ｖｌｌ基質に移した。

約１４日後、胚を、マンニトールを含まないが２ｍｇＩＩ　ＰＰＴを補ったＭｈ ｌ　Ｖ［基質に移した。さらに約３週間後、胚をマンニトールを含まない、１０ ｔｇ＃’　ＰＰＴを補ツタＭｈｌ　Ｖｌｌ基質に移した。さらに３週間後、誘導 した胚形成組織を注意深く単離し、２り／ｌ　ＰＰＴ及び５ｚｙ＃！６−ベンジ ルアミノプリンを補ったＭＳ培地に移した６胚形成組織をこの培地上で約１４日 間保持し、続いて、ホルモン、蔗糖またはＰＰＴを含まないＭＳ培地に移した。

さらに通常の苗に生長させるために、生長した新芽を１．５ｚ蔗糖を補った１／ ２　ＭＳ培地に移した。

得られた苗を土壌に移し、て、温室栽培した。形質転換した苗のうち３本、８２ Ｍ３４−１．８２Ｍ３４−１２及ヒＲＺＭ３４−４４ヲサラニ特徴つけた〈実施 例８参照）。

実１　８：　７０肛１１」」ＪこトヴえＴジＺ１１へ１徴−２肋。

実ｍ　Ｍ　７　（７）　８２Ｍ３４−１．８２Ｍ３４−１２．８２Ｍ３４−１４ ．８２Ｍ３５−１及び８２Ｍ３５−１８を温室内で生長させた。植物の葉に於け る１リー遺伝子の発現産物の活性を、以下の゛’ＦＡＴアッセイ”で分析した６ 各植物からの葉の組織１００■を、酸で処理した海砂＜Ｍｅｒｅｋ、　Ｄａｒｌ ｌｓｔａｄｔ、、　Ｇｅｒ＋ｍａｎｙ）５０ｍｇ及びポリビニルポリピロリドン （ＰＶＰＰ）　５　ｍｇと一緒に、エッペノドルフ管中、抽出緩衝液（２５＄Ｍ 　Ｔｒｉｓ−ＩＣ１ｐＨ７，５，１ｍＭ　Ｎｍ、−ＥＤＴ＾：エチレンジアミン 四酢酸二ナトリウム塩、０．１５ｘｇ／ｗｌフェニルメチルスルホニルフルオリ ド；ＰＨ５Ｆ、　０．３ｘｙ／ｍｌジチオトレイトール、ＤＴＴ及び０．３ｍｇ ／ｗｅウシ血清アルブミン）５０７ｚ１中でガラス棒で粉砕した。抽出物を、マ イクロヒュージ管中、１６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を回収し、 ＴＥ　２５＃（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１ｓＭ　Ｎａ、−Ｅ ＤＴ＾）で１０倍に希釈した。希釈した抽出物１２μｌに、１ｍＭ　ＰＰＴのＴ Ｅ　２５＃’中の１μｌ、２餉Ｈアセチル補酵素ＡのＴＥ　２５＃！中の１μ！ 及び［”Ｃ］アセチル補酵素Ａ　（６０ｍｅｉ／ｍ請ｏ１．０．０２ｍＣ１＃＋ １；　ＨＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＤＵＰＯＮＴＪｉｌｍｉ ｎｇｔｏｎ、Ｄｅｋａｗａｒｅ、ＬＩＳ＾＞２ｔｔ　１に添加した０反応混合物 を３７℃で３０分インキュベートし、濃縮領域を有するアルミニウムシートシリ カゲル６０ｔ、１．ｃ、プレート（Ｍｅｒｃｋ）にスポットした。上昇クロマト グラフィーを、１−プロパツール及びＮＨ，ＯＲの３対２混合物（２５＄　８８ ．）で実施した。オートラジオグラフィー（Ｘ＾訃５にｏｃｌａｋ　ｆｉｌｍ＞ に−晩がけることにより、”ｃを視覚化した６ 除草剤ＢＡＳＴ＾（登録商標）に対する耐性を、植物１本当たり葉１枚の上面に 近い小領域に除草剤１ｚ溶液をはけで塗り、塗った部位及び近隣に於ける損傷兆 候を観察することニヨリ試験Ｌ　タ、　８２Ｍ３４−１．８２Ｍ３５−１及びＲ Ｚ１４３５−１８４．ｌ：、全く損傷兆候ヲ示さなカッタカ、８２Ｍ３４−１２ 及び８２Ｍ３４−１４Ｇｉ、１４つな部位がやや茶色になり、乾燥していた。

８２Ｍ３４−１．８２Ｍ３４−１２．８２Ｍ３４−１４．８２Ｍ３５−１及ヒＲ ＺＮ３５−１８ハ、不稔性の雄株であることが判明した。これらの植物の各々の 表現型は、実施例６で分析した実施例５の形質転換体に関して記載したものと同 一であった。

サザン分析から、８２Ｍ３５−１及び８２Ｍ３５−１８は、各々のゲノムにプラ スミドｐＶＥ１０８の１個のコピーが存在する、同一組込みパターンを有するこ とが知見された。　Ｈｉｎｄｌ１１部位の近隣のプラスミドＤＮＡ配列の小さな 部分（エレクトロポレーション前に直線化するために使用した）は、組込みコピ ーには存在しないようであった。８２Ｍ３４−１．８２Ｍ３４−１２及び８２Ｍ ３４−１４のサザン分析から、これらの植物の各々は、多分そのゲノム中に組込 まれたｐＶＥ１０８の一部または全部の２個または３個のコピーを有しているこ とが知見された。このコピーは、コンカナマー配置中に殆ど同様には挿入されな い。

形質転換体ＲＺＭ３５−１及び８２Ｍ３４−１を、形質転換していない）１９９ 植物からの花粉で授粉し、子孫の苗を回収した。　８２Ｍ３５−１から回収した 苗３５本のうち、１６本（４６＄）はＦＡＴアッセイで陽性であったが、１９本 （５４＄）はＰＡＴ陰性であった。Ｆ１子孫に於けるこの割合は、キメラーエ遺 伝子（Ｘ２＝０．２６）の１個の活性コピーの通常のメンデルの分離の法則下で 予測された１、１比とは大きくずれていない。

ＲＺＭ３４４カＩ’）　回収しり苗３４本（７）５ち、１９本（５６＄Ｈ１ＰＡ Ｔ７　ッセイで陽性であり、１５本（４４１）はＰＡＴ陰性であった。Ｆｌ子係 に於けるこの比は、通常のメンデルの分離の法則下で予測した１：１比から大き くずれておらず、形質転換した雌たは活性であるが、密着結合した複数のコピー を有していたと考えられる。

９：　）ら３シｔ・　・ノ　コピ［に助人Ｅエレクトロボレーシ　ン　こ　に　 る　、　ｊｌｌｌｌを　るコメのン コメ栽培変種植物Ｎ１ｐｐｏｎｂａｒｅの皮を剥いた成熟種を、表面滅菌し、０ ．５ｚｇ７１ニコチン酸、０．５ｚｇ７１ピリドキシンーＨＣｌ、１．０ｘｇ／ ｌチアミンーＨＣ１，２，Ｏｘｇ／ｌ　２，４−Ｄ、３０ｇ／ｌ蔗糖及びＺ、Ｏ ｇ／Ｉ　Ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５，８を補った固体２Ｎ６培地［Ｎ６培地（Ｃ ｈｕら、　１９７５．同上）］に載置し、２７℃で暗所培養した。カルスが３〜 ４週間以内に胚の胚盤から生長した。−次（ｐｒｉｗａｒｙ）カルスの胚形成部 分を、圧縮胚形成カルスに増殖させるために、０．５璽ｇ／＆ニコチン酸、０． ５ａｇ７１ピリドキシンーＨＣｆ、１．Ｏ肩ｇ／ｌチアミン−ＨＣｌ、２．０ｇ ／ｌカサミノ酸（Ｖｉｔａｍｉｎ　ａｓｓａｙ、Ｄｉｒｃｏ）、１．０ｚｙ／ｌ 　２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ！　６−ベンジルアミノプリン、２０ｇ／ｌ蔗糖 、３０ｇ／ｌソルビトール及びＺ、Ｏｇ／ＩＰｈｙｔａｇｅｌ　、ｐＨ５，８を 補ったＮ６７培地（Ｎ６培地；Ｃｈｕら、１９７５．同上）に移した。

継代培養して３〜４週間後、胚形成カルスを形質転換実験に使用した。カルスを 、最大長さ約１．５〜２ｍｍのフラグメントに切り出した。カルス片をＥＰＮ中 で２回洗浄し、次いで、室温（２５℃）で３０分から３時間、この緩衝液中で前 原形質分離した６次いで、カルスフラグメントをＥＰＮ−ＫＣＩで２回洗浄し、 エレクトロポレーションキュベツトに移した。

各キュベツトには、１００〜２００μＩ　ＥＰＮ−にＣ１中のカルスフラグメン ト約１５０〜ＺＯＯｗｇを載！した。プラスミド［ｌＮ＾、環状ｐＤＥ１１０ま たは旧ｎｄｌＩＩ若しくはＥｃｏＲＩで直線化したｐＤＥｌｌｏの１０〜２０μ ｍを各キュベツトに添加した。ｐＤＥｌｌｏは４８８３ｂｐプラスミドであり、 その全配列はＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、４に記載済みである。このプラスミドは、３ ５Ｓ３プロモーターの制御下で暖遺伝子からなるキメラ遺伝子を含んでいる。

ＤＭＡを、室温で約１時間カルスフラグメントとインキュベートした０次いで実 施例１に記載の如くエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーショ ン後、カサミノ酸を含まない液体Ｎ６７培地をカルスフラグメントに添加した。

次いでカルスフラグメントを、カサミノ酸を含まないが、５．１０または２０ｚ ｙ＃’ＰＰＴを補った固体８６７培地に載置し、約４週間、１６７８時間の明／ 暗しジメ下で、２７℃でこの選択培地上で培養した。生長したＰＰＴ−耐性カル スを単離し、カサミノ酸を含まないが５　ｍｇ７Ｉ　ＰＰＴを含む新しいＮ６７ 培地上で約２〜３週開維代培養した。その後、選択したＰＰＴ−耐性カルスを、 ５ｚｇ／Ｉ　ＰＰＴを補った植物再生培地８６８２５　［０，５ｗｇ１ｌニコチ ン酸、０．５ｚｇ、＃ピリドキシンーＵＣ１，１，０ｍｇ／ｉ’チアミンー１１ ＣＩ、２８８ｚｙ＃アスパルチン酸、１７４ｍｇ＃アルギニン、７．０Ｂ／１グ リシン、１．０肩ｇ／ｌ　０−ナフタレン酢酸（Ｎ＾＾）、５．０ｚｙ＃カイネ チン、ＺＣｈ／１蔗糖及び２．０ｇ／Ｉ　Ｐｈｙｔａｇｅｌを補ったＮ６培地（ Ｃｈｕら、　１９７５．同上）］に移した。苗を約１箇月生長させ、次いで０． ５Ｂ／Ｚニコチン酸、０．５ｍｇ／ｌピリドキシンーＨｔＪ、１．０ｍｙ／ｌチ アミンーＨｔＪ、１．Ｏｔｔ／１カサミノ酸、２０ｔｔ／１蔗糖及びＺ、Ｏｇ／ ｌ　ＰｈｙＬｏｇｅｌ、　ｐＨ５，８を補ったホルモンを含まないＮ６培地（Ｃ ｈｕら、　１９７５．同上）に移した。この上でさらに２〜３週間保持し、その 後、土壌に移して温室栽培した。

上記の２Ｎ６．８６７、Ｎ６Ｎ２５及びホルモンを含まないＮ６培地の組成は、 Ｊａｐａｎ　Ｔａｂａｅｃｏ　Ｉｎｃ、、ＰＩａｎｔ　Ｂｒｅｅｃｌｉｎｇ　ａ ｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、７００　 旧ｇａｓｈｉｂａｒａ、Ｔｏｙｏｄａ、Ｉｗａｔａ。

５ｈｉｚｕｏｋａ　４３８．ＪＡＰ八Ｎへら提供を受けた。

１０：　９のン　したコメ　！纏すしり九種々の形質転換実験で得られた実施例 ９の２本の形質転換したコメ植物を、土壌で４週間栽培し、次いで２１／ｈａに 対応する用量でＢＡＳＴ＾（登録商標）を噴霧した。２本の植物はＢＡＳＴ＾（ 登録商標）耐性であり、除草剤処理でも生存したが、形質転換していない対照の 植物は、茶変し、除草剤を一噴霧して４日以内に枯死した。

実施例９の２種類の形質転換実験から誘導した２本の植物及び他の４本のｉｎ　 ｖｉｔｒｏ苗を、Ｐｖｕｌｌで消化した植物ゲノムＤＮ＾をｐＤＥｌｌｏでプロ ーブしたサザンハイプリダイゼーションにより分析した。この分析がら、分析し た総ての植物に於いて、ｐＤＥｌｌｏの少なくとも１個のコピーがコメゲノムに 組込まれたことが知見された。６本の植物のうち５本に於いて、３５Ｓ−ｂａｒ キメラ遺伝子の殆どを含むｐＤＥ１１０フラグメントに対応する１、６ｋｂフラ グメントが、はっきりと同定できた。

１１：　２　び４のヅ　したトウモロコシ１１１■…ｌ！ＩＪｊＬＬ 実施例２のトウモロコシ形質転換体）１９９−８１４８−１及び実施例４のトウ モロコシ形質転換体Ｐａ９ｌ−８１４６−２の子孫を、ベルギー（＾ｆｓｎｅｅ ）のＰｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎ、Ｖ、実験農場で圃堝染 件下で試験した。圃場試験は、登録番号ＢＩＯＴ／９１／８０６でベルギー農業 省により許可された。Ｆｌ、Ｆ２及びＦ３子孫が、以下の表１に要約されたよう に交雑から得られた。

総ての場合に於いて、親のうち１個はｎｅｏ遺伝子に関するヘテロ接合体である と考えられる。

各種ロットの内１００個以下の種を、長さ５１の平行な５列に撒いた６個々の植 物は０．２５ｇ離れており、列間の距離は１肩であった。実験植物の１０列の内 、対照として形質転換していないＦ９９が１列、形質転換していないＰａ９１植 物が１列入っていた。１区画は、対照を含むＦｌ及びＦ２実験植物からなってい た。これらの区画の各々は、１）ｌｚ幅の通路及び ｉｉ　）形質転換していないトウモロコシ植物（Ｖａｒｉｅｔｙ　５ａｎｏｒａ ）３列（１肩離れている） により囲まれていた。

実験区画を調製し、種を撒き、次いで以下の表２に記載の計画に従って保持した ０種撒きに関しては、植物の穴は、プラントスティックで開け、４〜５ｃ麿の深 さに手で種を入れた。

圃場試験は、実験植物の穂軸（ｃｏｂｓ）全体を手で除去し、続いてスチームす ることにより終了した。残りの植物は、刈り取り機で機械的に切り刻んだ。

以下の観察を実施した。２　”　３葉齢段階で、発芽した種の総数を各種ロット 毎に数えた。以下の表３に見られるように、種ロットＰ４４８２で種の４２ｚシ か発芽しなかったことを除いては、発芽率は６３〜１０ｏｚであった。形質転換 していないＨ９９及びＰ＆９１植物の種ロットの発芽率は、２５〜７５％であっ た。

３〜４葉齢段階で、トランスジェニックｎｅｏ遺伝子の表現型を以下のようにア ッセイした。各植物に於いて、小さなはさみで２枚の葉に葉脈の途中までの切れ 目を入れた。

次いで切れ目を、４ｚカナマイシン及び０．２＄　ＳＤＳの水性懸濁液に浸した １片の綿花で拭った。幾つかの植物は、５ｚカナマイシン及び０．１＄　ＳＤＳ の懸濁液で処理した。新しく形成した葉が黄変したら、その植物は感受性であり 、活性ｎｅ。

遺伝子を欠損していると記載した。新しく形成した葉が正常で脱色していなかっ たら、その植物は耐性があり、活性ｎｅｏ−遺伝子を保持していると記載した。

新しく形成した葉の脱色は、拭ってから約１０日後に評価した。試験した植物の ５〜８ｚは、感受性または耐性であるとはっきりと記載できず、中間の表現型を 有していた。これは、最適カナマイシン（及び／または５ＤＳ）濃度以下である こと及び試験した植物の環境条件及び／まなは生長段階での変動に依存するもの と考えた。

後段の分析に於いて、中間の表現型は感受性の植物と一緒にプールした。各交雑 または自家授粉に関するカナマイシン耐性植物対カナマイシン感受性植物（中間 表現型を含む）の比は、ｎｅｏ遺伝子の１遺伝子座のメンデルの分離の法則を仮 定した場合の適応試験のｃｈｉｓｑｕａｒｅ　Ｈｏｏｄｎｅｓｓ［５ｎｅｄｅｅ ｏｒ　ａｎｄ　Ｃｏｃｈｒａｎ（１９６７）“５ｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ”、ＩｏｗａＳｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、＾ｗｅ ｓ、Ｉｏｗａ、Ｕ、Ｓ、＾、］により決定した。結果を以下の表３に要約する。

表３のデータから、導入されたｎｅｏ遺伝子は、自家授粉、戻し交雑または、関 連しない系との異系交雑から得られたかに関係なく、３世代にわたって安定であ った１分離のパターンは、ｎｅｏ遺伝子の密接に結合した活性コピーをたった１ 個または複数有する各々の元の形質転換体及び、通常のメンデルの１遺伝子座の 遺伝的性質を有するｎｅｏ遺伝子形質と一致した。

総ての場合に於いて、実験植物は、形質転換していない対照の植物と比較すると 、形態学的に全く正常であった。

表１ （１）試験を実施せず 表　２ 表３ コード一種ロット（表１参照）　；　Ｅｍｅｒｇ−苗木数／撒いた種の数：２− はけ分析で使用した溶液中のカナマイシン２：Ｔ＝試験した植物の総数；Ｒ−カ ナマイシン耐性植物数：Ｉ−中間表現型の数；Ｓ−カナマイシン感受性植物数； ＮＤ−苗木が生長停止し枯死したため実施できなかった試験植物数Ｘ２＝Ｒｔｔ Ｉ＋Ｓの分離の法則に関するｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ値（１遺伝子座分離であると 仮定した場合異系交雑に於ケル予測値は、５０＄　Ｒ，−５０％　Ｉ　＋ｓ；自 家授粉に於ケル予測値は、７５＄　Ｒ−５０１ｉ　＋Ｓ）配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　ＰＬＡＮＴ　にＥＮＥＴＩＣＳＹＳＴＥＭ　Ｎ、Ｖ。

（ｉｉ）発明の名称： 単子葉植物を形質転換する方法 （ｉｉ＞配列の数：４ （ｉｉ）連絡先： （Ａ）住所：　Ｐｌａｎｔ　にｅｎｅｔｉｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｎ、Ｖ。

（Ｂ）通り：　Ｐｌａｔｅａｕｓｔｒｉａｔ　２２゜（Ｃ）郵便番号及び市：　 ９０００　Ｇｈｅｎｔ。

（Ｄ）国：　ベルギー （マ）コンピューター読取可能形式： （Ａ）媒体の種類：　５．２５インチディスク、ＤＳ、高密度１．２８ｂフロツ ピーデイスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣ／＾Ｔ（Ｃ）操作システム：　ＤＯＳ　 Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．３（Ｄ）ソフトウェア：　１ｌｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（マ ｉ）本出願データ： （ｖｉｉ）優先権出願データ： 欧州特許出願番号９１４０１８８８．２．１９９１年７月８日欧州特許出願番号 ９０４０３３３２　、１　、１９９０年１１月２３日（２）配列番号；１の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ＋　５３９９ｂｐ （Ｃ）鎖の数＝二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類：　ｐＤＥ１０８：Ｅ　、ｅｏ　ｌ　ｉ中に複製可能なプラ スミド［１８＾（ｉｘ）特徴： １−４５１：　ｐｕｃ誘導配列 ４５２−１２８４：　カリフラワーモザイクウィルス囃離物ＣａｂｂＢ−Ｊ　Ｉ から誘導した’３５Ｓ３”プロモーター配列 １２８５−２１００：　ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のコード 配列 ２１０１−３１６０：　往皿崩Ｊμ山＋ｗ　Ｔ−ＤＮＡオクトビンシンターゼ遺 伝子から誘導したポリアデニ ル化部位を含む３°調節配列 ３１６１−５３９９：　ｐＵｃ１８誘導配列他の情報：　プラスミドは乳、直中 で複製可能であり、バクテリアにアンピシリン耐性 （ｘｉ）配列の説明 ＧＴＧＧ八Ｇ八へＧへ　Ｔ入ＴＴＣにＧＣＴＡ　ＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡ　ＣへＡ ＣＡＧＡＣＡ、八　Ｔ（？ＧＧＣτＧＣＴＣ１４００ＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧ　Ｃ ＴｒＴＴＣＴＧＧＡ　ＴＴＣＡＴＣＧ入ＣＴ　ＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴ　ＧＧＧＴ ＧＴＧＧＣＧ　１９５０ＧＡＣＣＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＧＴｒＧＧ ＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧ　ＣＴＧ入＾ＧＡＧＣＴ　２０００ＧＣＧＧＧ ＡＣＴＣＴ　（’：ＧＧＧＴＴＣＧＡＡ　ＡＴＧＡＣＣＧＡＣＣＡＡＧＣＧＡＣ ＧＣＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＡ　２１５０ＴＣＡＣＧＡＧＡＴＴ　ＴＣＧＡＴＴＣ ＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴ　ＴＧＧＧＣＴＴＣＧＧ　２ ２００ＡＡＴＣＧＴｍＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＧ　ＧＣＴにＧＡＴＧＡＴ　ＣＣＴ ＣＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＴＣＡ　２２５０ＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴ　ＣＴｒ ＣＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＴｒ　ＡＡＴＧＡＧＡＴＡＴ　ＧＣＧ入ＧＡＣ ＧＣＣ２３００Ｔ入丁ＧＡＴＣＧＣＡ　ＴＧＡＴＡＴＴｒＧＣＴＴＴＣ入入ＴＴ ＣＴ　ＧＴＴにＴＧＣＡＣに　ＴｒにＴ入入入入ＡＡ２コ５０ＣＣＴＧＡＧＣＡ ＴＧ　ＴＧＴＡＧＣＴＣＡＧ　ＡＴＣＣＴＴＡＣＣに　ＣＣＧＧＴｒＴＣＧＧ　 ＴｒＣＡＴｒＣＴＡＡ　２４００ＴＧＡＡＴＡＴＡＴＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＴ　 ＡＴＣＧＴＡＴＴＩＴ　ＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴ　ＡＴＴＣＴＣＣにＴｌ’　２４ ５０ＣＡＡＴＴｒＡＣＴＧ　ＡＴＴＧＴＡＣＣＣＴ　ＡＣＴＡＣＴＴＡＴＡ　Ｔ ＧＴＡＣＡＡＴＡＴ　ＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡ　２５００ＡＣＡＡＴＡＴＡＴＴ　 にＴＧＣＴＧＡＡＴＡ　ＧＧＴｒＴＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴに　ＡＴＡＧ ＡＧＣＧＣＣ２５５０ＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡ　ＡＣＡＡＴｒＧＣＧＴ　ＴＴＴＡ ＴＴＡＴｒＡ　ＣＡＡＡＴＣＣＡＡＴ　ＴＴｒＡＡＡＡＡＡＡ　２６００ＧＣＧ ＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＧ　ＡＴｒＡＣＡＴＡ ＡＡ　ＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡ　２６５０ＡＴｒＴＣＡＡＡＡＧ　ＧＣＣＣＣＡＧ ＧＧＧ　ＣＴＡＧＴＡＴＣＴＡ　ＣＧＡＣＡＣＡＣＣＧ　ＡＧＣＧＧＣＧＡＡＣ ２７００ＴＡＡＴＭＣＧＴｒ　ＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧ　ＡＡＣＴＣＣＧＧＴＴ　 ＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧＧＧＴ　２７５０ＧＡＧＡＴＴＣＣＴＴ　 ＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ　ＡＴＴＧＧＣＣにＴＣＣＧＣＴＣＴＡＣＣＧ　入Ａ＾Ｇ ＴＴＡＣＧＧ　２８００ＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴ　ＣにＣＴＣＡＣＴＧＡ　ＣＴＣ ＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣにＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧ（：ＣＧ　コ４５０ＡＧＣ ＧＧＴＡＴＣＡ　ＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡ　ＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴ　ＡＣＧＧＴＴ ＡＴＣＣＡＣＣＧＡＡＴＣＡＧ　３５００ＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡ　ＧＴＧＣＴＧ ＣＡＡＴ　Ｇ入ＴＡＣＣＧＣＧＡ　ＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴ　ＣＡＣＣＧＧＣＴＣ Ｃ４５００ＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧ　ＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡ　ＴＧＧＴＴＡＴＧＧ ＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴ　ＡＡＴｒＣＴＣＴｒＡ　４８５０ＡＴＧＣＣＧＣＡ入 Ａ　ＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡ　ＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧ　ＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡ　５２００ＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴ　ＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡ　Ｇ ＴにＣＣＡＣＣＴＧ　ＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡ　ＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴ　５コ５０ ＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴ　ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡ　ＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴ　ＡＴＣ ＡＣにＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣ５：］９９く３）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）型・核酸 （Ｂ）長さ：　１１８６ｂｒ＋ （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）＋−ボロジー　直鎖 （１１）配列の種類：咳１伝子に対するプローブとして使用したＤＮＡ： （１ｘ）特ｆｉ： １−８：　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍの芽胞特異的プロモーターから 誘導した配列 ９−７９０：　ネオマイシンポスホトランスフエラーゼ遺伝子のコード配列 ７９１−終：　／Ｊｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７から誘導し たポリアデニル化部位を含む３′調節配列 （ｘｉ）配列の説明 （４）配列番号：３の情報： （１）配列の特徴・ （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ：　１２８７ｂｐ （Ｃ）Ｍの数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）配列の種類：キメラ遺伝子を含むＯＮ＾（ｉｘ）特徴： １−５４５：　Ｎ１ｃｏＬｉａｎａ　Ｌａｂａｅ−ｕｓがらのＴ＾２９遺伝子か らのプロモーター ５４６−８８１：　ｂａｒｎａｓｅ遺伝子のコード配列８８２、　へＩＬｒｏ頬 にす亘」Ｔ−ＤＭＡがらのツバリンシンターゼ遺伝子から誘導したポリア デニル化部位を含む３゛調節配列 （ｘｉ）配列の説明 （５）配列番号：４の情報、 （ｉ＞配列の特＠： （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ：　４８８３ｂｐ （Ｃ）Ｈの数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：　ｐＤＥｌｌｏ：Ｅ、ｃｏｌｉ中で複製可能なプラスミド ＯＮ＾（ｉｘ）特１１ｉ： １−３９５：　ｐＵｃ１８誘導配列 ３９６−１７７９：　カリフラワーモザイクウィルス単離物ＣａｂｂＢ−Ｊｌか ら誘導した゛’３５Ｓ３″プロモーター配列 ＋７８０−２３３１　：　ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝 子のコード配列 ２３３２−２６１９：　ｂμｔｖ１五土ｕｓ　Ｔ−ＤＮ＾ツバリンシンターゼ遺 伝子から誘導したポリアデニル 化部位を含む３゛調節配列 ２６２０−４８８３・　ｐＵｃ誘導配列他の情報・プラスミドは１．直中で複製 可能であり、バクテリアに対するアンピシリ ン耐性を与える （ｘｉ）配列の説明 ＣにＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴｒＡ　ＡＴｒＧＴＴＧＣＣＧ　ＧＧＡＡ ＧＣＴＡＧＡ　ＧＴＡＡＧＴＡＧＴｒ　４１００ＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧ ＣＡＧＡＡＣＴＴｒＡＡＡＡＧＴＧ　ＣＴＣＡＴＣＡＴｒＧ　ＧＡＡＡＡＣＧＴ ＴＣ４５００Ｆ工Ｇ、１ Ｆ工Ｇ、２ Ｆ工Ｇ、３ Ｆ工Ｇ、４ λ ＰｓｔＸ　ＣＲに７　：　Ｐａ９Ｌ−）τ１４６−２　ＰＬＩ９ｉ国ｌ１５ｉｌ ｌ査鰯失 、　−ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０２１９１１フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、 　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＲＯ，ＳＤ、ＳＯ，Ｕ Ｓ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．単子葉植物、特にイネ科植物、特定的にはトウモロコシ、コムギ、イネ、エ ンバク、オオムギ、モロコシ、ライムギ及びアワのような穀類植物、より特定的 にはトウモロコシをＤＮＡ、ゲノム特に核ゲノムで形質転換するための方法であ って、ａ）緻密な胚形成カルスを形成することが可能な前記植物の無傷組織又は 前記植物の前記無傷組織から得られた緻密な胚形成カルス、特にその胚形成セク ターを損傷及び／又は分解させ、ｉ）前記ＤＮＡの取り込み、ｉｉ）前記植物ゲ ノムにおける前記ＤＮＡの組込み的形質転換及びｉｉｉ）前記細胞からの前記植 物の再生に関して前記無傷組織又はカルスの細胞をコンピテントにする段階と、 ｂ）前記コンピテント細胞を前記ＤＮＡで形質転換する段階と、次にｃ）形質転 換された前記コンピテント細胞から正常表現型稔性成熱植物のような正常表現型 植物として前記植物を再生させる段階とを含む方法。
2. ２．最大寸法０．１〜５ｍｍ、好ましくは１〜２．５ｍｍ、特に１．２５〜１． ７５ｍｍに切断することにより前記無傷組織を損傷させ、こうして生成された前 記コンピテント細胞を形質転換することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．前記無傷組織を切断することにより損傷させた後、酵素で処理することによ り分解し、好ましくは前記無傷組織の細胞壁に穴をあけ、次にこうして生成され た前記コンピテント細胞を形質転換することを特徴とする請求項１又は２に記載 の方法。
4. ４．前記植物がトウモロコシであり、無傷未成熟トウモロコシ胚を酵素で処理す ることにより分解し、好ましくは前記胚の細胞壁に穴をあけ、次にこうして生成 された前記コンピテント細胞を形質転換することを特徴とする請求項１に記載の 方法。
5. ５．前記カルスを最大長０．５〜２．５ｍｍ、特に１〜２ｍｍ、特定的には１． ２５〜１．７５ｍｍ、及び好ましくは最小長約０．１ｍｍに切断することにより 損傷させ、次いでこうして生成された前記コンピテント細胞を形質転換すること を特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ６．前記カルスを切断することにより損傷させた後、酵素で処理することにより 分解し、好ましくは前記カルスの細胞壁に穴をあけ、次いでこうして生成された 前記コンピテント細胞を形質転換することを特徴とする請求項１又は５に記載の 方法。
7. ７．前記カルスを酵素で処理することにより分解して前記カルスの細胞壁に穴を あけ、次いでこうして生成された前記コンピテント細胞を形質転換することを特 徴とする請求項１に記載の方法。
8. ８．前記コンピテント細胞を直接遺伝子移入、特にエレクトロボレーションによ り形質転換することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．植物中で発現可能なＤＮＡ、特にキメラ遺伝子で組込み的に形質転換された ゲノム、特に核ゲノムを有するイネ科植物、特定的には穀類、より特定的にはト ウモロコシ又はイネであって、Ｄａｔｔａら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　８：７３６、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　 ３３８：２７４、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）　Ｔｈｅ　ＰＩａｎｔ 　Ｃｅｌｌ　２：６０３及びＦｒｏｍｍら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　８：８３３により記載されているような従来の培養条件下においては 、１）前記ＤＮＡの取り込み、２）前記植物ゲノムヘの前記ＤＮＡの組込み的形 質転換及び３）前記ＤＮＡで形質転換された正常表現型稔性植物としての前記植 物の再生に関してコンピテントな前記植物の胚形成懸濁液培養物又はプロトプラ ストを得ることが実質的に不可能であることを特徴とする前記植物。
10. １０．特定系統の植物であって、特に該系統の未形質転換プロトプラスト１００ ００当たり約５００以下、特に約１００以下、特定的には約１０以下、より特定 的には約１以下しか正常表現型植物を再生できない場合に、前記培養条件下では 該系統の形質転換胚形成懸濁液培養物又は形質転換プロトプラストから該系統の 正常表現型稔性植物のような正常表現型植物として植物を再生することが実質的 に不可能であることを特徴とする請求項９に記載の植物。
11. １１．請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により作出される形質転換植 物、特に単子葉植物、特定的にはイネ科植物、より特定的にはトウモロコシ又は イネのような穀類。
12. １２．タイプＩカルスを形成する能力を有するが、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（ １９９０）Ｔｈｅ　ＰＩａｎｔＣｅｌｌ　２：６０３及びＦｒｏｍｍら（１９９ ０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：８３３により記載されている培養条 件下では、１０％以上、特に１％以上、特定的には０．１％以上、より特定的に は０．０１％以上の頻度でのタイプＩＩカルスを形成する能力をもたないことを 特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物。
13. １３．前記ＤＮＡで組込み的に形質転換された請求項９から１２のいずれか一項 に記載の植物の細胞又は複数の該細胞から本質的に構成される培養物。
14. １４．請求項９から１２のいずれか一項に記載の形質転換植物の種子。
15. １５．ハイブリッド植物の作出手段のような授粉植物であることを特徴とする請 求項９から１２のいずれか一項に記載の植物。
16. １６．請求項１５に記載の授粉植物と別の近交系植物とを交配することにより得 られるハイブリッド。
17. １７．タンパク質が発現される植物細胞を死滅又は不能にすることが可能な該タ ンパク質をコードし且つタペート特異的ＰＴＡ２９プロモーターの制御下にある コーディング配列で形質転換された雄性不稔性単子葉植物、好ましくはイネ科植 物、特にトウモロコシ植物、特定的には請求項１２に記載のトウモロコシ植物、 又は雄性不稔性植物の種子。
18. １８．請求項１７に記載の形質転換単子葉植物の細胞又は複数の該細胞から本質 的に構成される培養物。