BR102014031844A2 - ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros - Google Patents

Abstract

ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros. esta revelação refere-se a oléculas de ácidos nucleicos e os métodos de uso destas para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros através da inibição mediada por rna de interferência de sequências alvo codificantes e não codificantes transcritas em pragas de coleópteros e/ou hemípteros. a revelação também se refere a métodos para produção daquele ácido nucleico expresso em moléculas útil para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros, e as células vegetais e plantas obtidas por meio disso

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RAS OPOSTO (ROP) E MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS RELACIONADAS QUE CONFEREM RESISTÊNCIA A PRAGAS DE CO-LEÓPTEROS E HEMÍPTEROS".

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade da data de depósito do Pedido de Patente Americana 61/919.322, depositado em 20 de dezembro de 2013, para "RAS OPPOSITE (ROP) AND RELATED NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RE-SISTANCE TO COLEOPTERAN AND HEMIPTERAN PESTS." CAMPO TÉCNICO

[002] Campo da Invenção: A presente invenção refere-se geralmente ao controle de danos vegetais causados por pragas de coleóp-teros e hemípteros. Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação das sequências alvo codificantes e não codifi-cantes e o uso para reprimir ou inibir a expressão pós-transcricional das sequências alvo codificantes e não codificantes nas células de uma praga de coleópteros e hemípteros para fornecer um efeito protetor vegetal.

ANTECEDENTES

[003] A lagarta-da-raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgi-fera virgifera LeConte, é uma das mais devastadoras espécies de lagarta-da-raiz do milho na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de cultivo de milho no meio-oeste dos Estados Unidos. A lagarta-da-raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie estritamente relacionada que coabi-ta a maior parte da mesma faixa que WCR. Há várias outras subespé-cies relacionadas de Diabrotica que são uma praga significativa na América do Norte: lagarta-da-raiz do milho mexicana (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; lagarta-da-raiz do milho do sul (SCR), D. un- decimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunc-tata tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos estima que atualmente as lagartas-da-raiz do milho causem US$ 1 bilhão em receitas perdidas a cada ano, incluindo US$ 800 milhões em perdas de rendimento e US$ 200 milhões em custos de tratamento.

[004] Tanto ovos de WCR como de NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo ao longo do inverno. Os ovos são oblongos, brancos, e menores que 0,010 cm de comprimento. As larvas incubam até o final do maio ou início do junho, com a regulação de tempo exata da incubação do ovo variando de ano a ano devido a diferenças de temperatura e posição. As larvas incubadas recentemente são vermes brancos que têm menos de 0,3175 cm de comprimento. Uma vez incubadas, as larvas começam a se alimentar das raízes do milho. As lagartas-da-raiz do milho atravessa três instares larvais. Após alimentarem-se por várias semanas, as larvas entram no estágio pupal. Entram em estado de pupa no solo, e em seguida emergem do solo como adultos em julho e agosto. Lagartas-da-raiz adultas têm aproximadamente 0,635 cm de comprimento.

[005] As larvas da lagarta-da-raiz do milho completam o desenvolvimento no milho e várias outras espécies de gramas. As larvas criadas em rabo-de-raposa amarela emergem depois e têm um tamanho de cápsula cefálica menor como em adultos do que as larvas criadas no milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634. WCR adultas alimentam-se de cabelo de milho, pólen e núcleos em pontas expostas. Se WCR adultas emergirem antes dos tecidos reprodutivos do milho estarem presentes, podem se alimentar do tecido das folhas, por meio disso reduzindo o crescimento vegetal e ocasionalmente matando a planta hospedeira. Entretanto, os adultos se deslocarão rapidamente aos cabelos e pólen preferenciais quando estiverem disponí- veis. As NCR adultas também se alimentam dos tecidos reprodutivos da planta de milho, mas em contraste raramente se alimentam das folhas do milho.

[006] A maior parte do dano da lagarta-da-raiz no milho é causada pela alimentação das larvas. As lagartas-da-raiz recentemente incubadas alimentam-se inicialmente das finas raízes capilares do milho e enterram-se nas pontas das raízes. Conforme as larvas tornam-se maiores, alimentam-se e enterram-se nas raízes primárias. Quando as lagartas-da-raiz do milho são abundantes, a alimentação larval muitas vezes resulta na poda de raízes por todo o caminho até a base da haste do milho. A injúria da raiz severa interfere na capacidade das raízes de transportarem água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta e resulta na produção de grãos reduzida, por meio disso muitas vezes drasticamente reduzindo o rendimento total. A injúria da raiz severa também muitas vezes resulta na quebra das plantas de milho, que torna a colheita mais difícil e ainda diminui o rendimento. Além disso, alimentando-se por adultos nos tecidos reprodutivos do milho podem resultar na poda dos cabelos na ponta da orelha. Se este "recorte de cabelo" for bastante severo durante a dispersão do pólen, a polinização pode ser interrompida.

[007] O controle das lagartas-da-raiz do milho pode ser tentado por rotação de culturas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, bactéria gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thuringien-sis), ou uma combinação destes. Rotação de culturas sofre de desvantagem significativa ao colocar restrições não desejadas no uso da terra. Além disso, a oviposição de algumas espécies lagarta-da-raiz pode ocorrer em campos de soja, por meio disso mitigando a eficácia da rotação da cultura praticada com milho e soja.

[008] Os inseticidas químicos são os mais fortemente confiáveis na estratégia de alcançar o controle da lagarta-da-raiz do milho. O uso de inseticidas químicos, entretanto, é uma estratégia de controle imperfeita para a iagarta-da-raiz do milho; mais de US$ 1 bilhão pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano devido à lagarta-da-raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano de lagarta-da-raiz que podem ocorrer apesar do uso dos inseticidas. As altas populações de larvas, chuvas fortes e aplicação inadequada do inseticida(s), todos podem resultar no controle inadequado da lagarta-da-raiz do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar linhagens de lagarta-da-raiz resistentes ao inseticida, bem como causar preocupações ambientais significantes devido à toxicidade de muitos deles para espécies não alvo.

[009] Percevejos (Hemiptera; Pentatomidae) compreendem outro importante complexo de pragas agrícolas. No mundo inteiro, mais de 50 espécies estritamente relacionadas de percevejos são conhecidas por causar danos às culturas. McPherson & McPherson, R.M. (2000) Stink bugs of economic importance in America north of México CRC Press. Estes insetos estão presentes em um grande número de culturas importantes incluindo milho, soja, fruta, verduras e cereais. O percevejo marrom da soja, Euchistus heros, o percevejo pequeno verde da soja, Piezodorus guildinii, percevejo marrom fedorento, Halyomor-pha halys, e o percevejo verde, Nezara viridula, são de particular importância.

[0010] Os percevejos atravessam múltiplos estágios de ninfa antes de alcançarem o estágio adulto. O tempo para se desenvolver de ovos a adultos é aproximadamente 30-40 dias. Múltiplas gerações ocorrem em climas quentes que resultam em pressão significativa de insetos.

[0011] Tanto as ninfas como os adultos alimentam-se da seiva de tecidos moles nos quais também injetam enzimas digestivas que causam digestão de tecido extraoral e necrose. O material vegetal digerido e os nutrientes então são ingeridos. A depleção de água e nutrien- tes do sistema vascular vegetal resulta no dano de tecido vegetal. Dano ao desenvolvimento do grão e sementes é o mais significativo conforme o rendimento e a germinação são significativamente reduzidos.

[0012] A gestão atual de percevejos depende do tratamento com inseticidas em uma base de campo individual. Por isso, estratégias de gestão alternativas são urgentemente necessárias para minimizar as perdas de culturas contínuas.

[0013] Os besouros do pólen europeus (EPB) são pragas sérias na colza, tanto as larvas como os adultos alimentam-se de flores e pólen. O dano do besouro de pólen à cultura pode causar a perda de rendimento de 20-40%. A espécie de praga primária é Meligethes aeneus. Atualmente, o controle de besouro do pólen na colza depende principalmente de piretroides que são esperados ser retirados em etapas logo por causa do seu perfil ambiental e regulador. Além disso, resistência do besouro do pólen a inseticidas químicos existentes foi relatada. Por isso, são urgentemente necessárias soluções de controle de besouro do pólen ambientalmente amigáveis com novos modos de ação.

[0014] Na natureza, os besouros do pólen hibernam como adultos no solo ou sob serrapilheira. Na primavera, os adultos emergem da hibernação e começam a alimentar-se de flores de ervas daninhas e migram para plantas de colza florescentes. Os ovos são postos na colza. As larvas alimentam-se e desenvolvem-se nos botões e nas flores. As larvas de estágio tardio encontram um sítio de pupação no solo. A segunda geração de adultos emerge em julho e agosto e alimenta-se de várias plantas florescentes antes de encontrar os sítios de hibernação.

[0015] Interferência por RNA (RNAi) é um processo que utiliza vias celulares endógenas, pelo qual a molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA)) que é específico para toda, ou qualquer porção de tamanho adequado, de uma sequência gênica alvo resulta na degradação do mRNA codificado por meio disso. Nos últimos anos, RNAi foi usado para realizar o "siienciamento" gênico em diversas espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabitis elegans, plantas, embriões de insetos e células em cultura de tecidos. Ver, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McMa-nus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747.

[0016] RNAi realiza a degradação do mRNA através de uma via endógena incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominados pequeno RNA de interferência (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de fita simples: a fita passageira e a fita guia. A fita passageira é degradada, e a fita guia é incorporada no complexo de siienciamento induzido por RNA (RISC). Moléculas de microácido ribonucleico (miRNA) podem ser similarmente incorporadas no RISC. O siienciamento gênico pós-transcricional ocorre quando a fita guia se liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz a divagem por Argonauta, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido por se disseminar sistemicamente ao longo do organismo apesar de concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucariotos como plantas, nematoides e alguns insetos.

[0017] Somente os transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados, e dessa forma o siienciamento da expressão de mRNA é específico para a sequência. Em plantas, vários grupos funcionais de genes DICER existem. O efeito do siienciamento gênico de RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio na abundância do transcrito direcionado de 90% ou mais, com redução consequente dos níveis da proteína correspon- dente.

[0018] A Patente U.S. No. 7.612.194 e a Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 descrevem uma biblioteca de 9.112 sequências de marcador de sequência expressa (EST) isoladas de pupas de D. v. virgifera LeConte. É sugerido na patente U.S. No. 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 ligar operacionalmente a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma de várias sequências parciais particulares de H+-ATPase tipo vacuolar de D. v. virgifera (V-ATPase) descrita neste para a expressão de RNA antissentido em células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não descoberta (a sequência parcial é afirmada ser 58% idêntica ao produto gênico C56C10.3 em C. eiegans) para a expressão de RNA antissentido em células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas particulares sequências parciais de genes de subunidade beta do coatômero de D. v. virgifera para a expressão de RNA antissentido em células vegetais. Ainda, a Patente U.S. No. 7.943.819 descreve uma biblioteca de 906 sequências de marcador de sequência expressa (EST) isoladas de larvas de D. v. virgifera LeConte, pupas e intestinos médios dissecados, e sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene 4b da proteína do corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão do RNA de fita dupla em células vegetais.

[0019] Nenhuma sugestão adicional é fornecida na patente U.S. No. 7.612.194, e na Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para usar qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências listadas nesta para a interferência de RNA, exceto várias sequências parciais particulares de V-ATPase e sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma da Patente U.S. No. 7.612.194, e Publicações de Patente U.S. No. 2007/0050860 e 2010/0192265 e 2011/0154545 fornecem nenhuma orientação quanto à qual outras das mais de nove mil sequências fornecidas seriam letais, ou até de outra maneira úteis, em espécies de lagarta-da-raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. No. 7.943.819 não fornece nenhuma sugestão para usar qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências listadas nesta para a interferência de RNA, exceto a sequência parcial particular de um gene 4b da proteína do corpo multive-sicular carregado. Além disso, a Patente U.S. No. 7.943.819 não fornece nenhuma orientação quanto à quais outras das mais de novecentas sequências fornecidas seriam letais, ou até de outra maneira úteis, em espécies de lagarta-da-raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Publicação do Pedido de Patente U.S. No. U.S. 2013/040173 e Publicação do Pedido de Patente PCT No. WO 2013/169923 descreve o uso de uma sequência derivada do gene Snf7 de Diabrotica virgifera da interferência de RNA no milho. (Também descrito em Bolognesi et al. (2012) ONE PLos 7 (10): e47534. doi :10.1371/journal.pone.0047534).

[0020] A maioria esmagadora das sequências complementares para DNAs da lagarta-da-raiz do milho (tais como as precedentes) não é letal em espécies de lagarta-da-raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007, Nature Biotechno-logy 25:1322-1326), descrevem os efeitos de inibição de vários alvos gênicos de WCR por RNAi. Estes autores relataram que 8 de 26 genes alvo que testaram não foram capazes de fornecer a mortalidade da praga de coleópteros experimentalmente significante em uma concentração de iRNA muito alta (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm2.

REVELAÇÃO

[0021] São descritas neste pedido moléculas de ácidos nucleicos (por exemplo, genes alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs), e métodos de usos destes, para o controle da praga de coleópteros, incluindo, por exemplo, D. v. virgifera LeConte (lagarta-da-raiz do milho ocidental, "WCR"); D. barberi Smith e Lawrence (la-garta-da-raiz do milho do norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (lagarta-da-raiz do milho do sul, "SCR"); D. v. Krysan zeae e Smith (lagarta-da-raiz do milho mexicana, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; Meligethes aeneus Fabricius (besouro de pólen, "PB"); e praga de hemípteros, incluindo, por exemplo, Euschistus heros (Fabr). (percevejo marrom da soja), Nezara viridula (L). (percevejo verde), Piezodorus guildinii (Westwood) (percevejo pequeno verde da soja) Halyomorpha halys (percevejo marrom fedorento), Acrosternum hilare (Percevejo-acrosterno), e Euschistus servus (Percevejo Marrom). Em exemplos particulares, as moléculas de ácidos nucleicos exemplares são descritas que pode ser homólogo a pelo menos uma porção de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos nativas em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0022] Nestes exemplos e adicionais, a sequência de ácidos nucleicos nativa pode ser um gene alvo, o produto do qual pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido em desenvolvimento larval. Em alguns exemplos, a inibição pós-tradução da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência homóloga a esta pode ser letal em praga de coleópteros e/ou hemípteros, ou resultar em crescimento e/ou repro- dução reduzidos. Em exemplos específicos, um gene que codifica Ras oposto (proteína codificada referida neste pedido como "ROP;" e um ácido nucleico que codifica ROP referido neste pedido como "rop") pode ser selecionado como um gene alvo de silenciamento pós-transcricional. Em exemplos particulares, um gene alvo útil para a inibição pós-transcricional é o novo gene rop. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo rop; o complemento da sequência nucleotídica que codifica rop; e os fragmentos de qualquer um dos precedentes, por isso, são descritos neste pedido. Exemplos de rop incluem, mas não são limitados às SEQ ID NOs:1, 115, 120, 122, 124, 126, 131, e 133.

[0023] Também são descritas moléculas de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto gênico alvo (por exemplo, ROP). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2, 116, 121, 123, 125, 127, 132, ou 134 (um ROP). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de ROP. Ainda são descritas moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma sequência nucleotídica que é o complemento reverso de uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto gênico alvo.

[0024] Também são descritas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene alvo da praga de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo: rop. Em modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, moléculas de cDNA são descritas que podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a tudo ou parte de rop (por exemplo, SEQ ID NOs:1, 115, 120, 122, 124, 126, 131, e 133).

[0025] Ainda são descritos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros e meios para fornecer resistência à praga de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta. Exemplos de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros incluem uma molécula de RNA de fita simples ou dupla consistindo em pelo menos uma da SEQ ID NO:3 (região 1 de rop de Diabrotica ou regí de rop), SEQ ID NO:4 (região 2 de rop de Diabrotica ou reg2 de rop), SEQ ID NO:114 (região v3 de rop de Diabrotica ou v3 de rop), SEQ ID NO:119 (região 1 de rop de Euschistus ou regí de rop de BSB), SEQ ID NO: 128 (região 1 de rop de Meligethes ou regí de rop de EPB), ou o complemento destas. Os equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros incluem moléculas de RNA de fita única ou dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de rop (por exemplo, um gene de WCR compreendendo as SEQ ID NOS:1 ou 115). Os equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros incluem moléculas de RNA de fita única ou dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de rop (por exemplo, um gene de PB compreendendo as SEQ ID NOS: 120, 122, 124, 126, 131, ou 133). Outro exemplo de meios para fornecer resistência à praga de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta é uma molécula de DNA que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros operacionalmente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de estar integrada no genoma da planta de soja ou uma de milho.

[0026] São descritos métodos para controlar uma população de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, compreendendo o fornecimento a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que atua para ser absorvida pela praga de coleópteros e/ou hemípteros para inibir uma função biológica dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, uma molécula de iRNA compreendendo toda ou parte de uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo da: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133; o complemento da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) ou organismo hemíptero (por exemplo, BSB) ou organismo Meligethes (por exemplo, EPB) compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência codifi-cante nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero ou organismo Meligethes compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO: 133; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero ou organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133; e o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero ou organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133.

[0027] Também são descritos neste pedido métodos em que dsR-NAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser fornecidos a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros em células vegetais geneticamente modificadas que expressam dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nestes exemplos e adicionais, dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas da praga de coleópteros e/ou hemípteros. A ingestão de dsRNAs, siRNA, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs da invenção então pode resultar em RNAi nas larvas, que por sua vez pode resultar em silencia-mento de um gene essencial para a viabilidade da praga de coleópteros e/ou hemípteros e conduzir enfim à mortalidade das larvas. Dessa forma, os métodos são descritos em que as moléculas de ácidos nu-cleicos compreendendo sequência(s) de ácido nucleico exemplar útil para o controle da praga de coleópteros e/ou hemípteros são forneci- das a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos particulares, a praga de coleópteros e/ou hemípteros controlada pelo uso de moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem ser WCR, NCR, Meligethes aeneus, Euchistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomor-pha halys, Nezara viridula Acrosternum hilare e Euschistus servus. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A FIG. 1 é uma representação pictórica de uma estratégia para a geração de dsRNA de um molde de transcrição único.

[0029] A FIG. 2 é uma representação pictórica de uma estratégia para a geração de dsRNA de dois moldes de transcrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM

[0030] As sequências de ácidos nucleicos listadas na listagem de sequência acompanhante são mostradas usando abreviaturas de letra padrão para bases de nucleotídeo e aminoácidos, como definido em 37 C.F.R. § 1.822. Somente uma fita de cada sequência de ácidos nucleicos é mostrada, mas a fita complementar e fita complementar reversa são entendidas como incluídas por qualquer referência à fita exibida. Na listagem de sequência acompanhante: [0031] A SEQ ID NO:1 mostra uma sequência de DNA de rop de Diabrotica virgifera.

[0032] A SEQ ID NO:2 mostra uma sequência de aminoácidos de um ROP de Diabrotica virgifera.

[0033] A SEQ ID NO:3 mostra uma sequência de DNA de regí de rop (região 1) de Diabrotica virgifera que foi usado para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor de T7 em extremidades 5’ e 3’ não mostradas).

[0034] A SEQ ID NO:4 mostra uma sequência de DNA de reg2 de rop (região 2) de Diabrotica virgifera que foi usado para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor de T7 em extremidades 5’ e 3’ não mostradas).

[0035] A SEQ ID NO:5 mostra uma sequência de DNA de um promotor de fago T7.

[0036] A SEQ ID NO:6 mostra uma sequência de DNA de um segmento de região codificante de YFP que foi usado para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor de T7 em extremidades 5’ e 3’ não mostradas).

[0037] As SEQ ID NOs:7-12 mostram iniciadores usados para amplificar porções de uma sequência rop de Diabrotica virgifera que compreende regí de rop, reg2 de rop, e iniciadores usados para amplificar um segmento de região codificante de YFP.

[0038] A SEQ ID NO: 13 apresenta um rop v1 da sequência formadora de RNA em grampo de Diabrotica virgifera como encontrado em pDAB114515. As bases em maiusculas são a fita sentido de rop, as bases em minúsculas sublinhadas compreendem o íntron ST-LS1, as bases em minúsculas não sublinhadas são a fita antissentido rop. T C AG C ATG CT GT AAAAT G C AT G ATATAT C AG C AG AAG G C ATTAC AT T G GTT G AAG ATATTAT G AAG AAAAG G G AACC G CTT G GTAC CAT G G A AG CT GT GTACTT GATAAC AC CTT CAGAAAAGT CAGTT CAT G CT CTT AT GAATGACTTT GAACCACCAAGACAGAT GTAC AGAGGGGCACAC GT GTTTTTTAC AG AAG C GT GT CCAGACqactaqtaccqqftqqqaaaqqtatqtt tctqcttctacctttqatatatatataataattatcactaattaqtaataatataqtatttcaaqtatttttttca a a ata a a aq a atqtaqtatataq ctattq cttttctqta qtftata aqtqtqtatatttta atttata a cttttct aatatatqaccaaaacatqqtqatqtqcaqqttqatccqcqqttaqtctqqacacqcttctqtaaaa aacacgtgtgcccctctgtacatctgtcttggtggttcaaagtcattcataagagcatgaactgactttt ctg a ag gtgttatc a a gta c a c a g c ttc c atg gta c c a ag c g gttc c cttttc ttc ata atatc ttc a a c c a atgta atg c cttctg ctgatatatc atg c attttacagc atg ctg a [0039] A SEQ ID NO: 14 apresenta um rop v3 da sequência formadora de RNA em grampo de Diabrotica virgifera como encontrado em pDAB115770. As bases em maiúsculas são a fita sentido rop, as bases em minúsculas sublinhadas compreendem o íntron ST-LS1, as bases em minúsculas não sublinhadas são a fita antissentido rop. CAAGTATGCTACGCATCTTCATCTCGCTGAAGACTGCATGAAGGCC TAT C AG G G GTATATAG AC AAGTT GT GTAAAGTT G AG C AG G ATTT G G C AAT G G G AACT G AT GC CG AAGG C G AG AAAAT CAAG G AT CACAT G C G C AAC AT C GTC C C C AT CTT G CTAG AT C C C AAAAT C ACC AAT G AATA CG ATAAGAqactaqíaccqqttqqqaeaqqlatqtttctqcttctacctttqatatetatataataa ftatc a cta attaqtaqta atataqtatttc a aqtatttttttc aaaataaaaqa atqta qtatataq ctatt q c ttttctqta qtttata a qtqtqtatatttta atttata a cttttcta atatatq a c c a a a a c atq qtq atqtq caqqttqatccqcqqttatcttatcqtattcattqqtqattttqqqatctaqcaaqatqqqqacqatqttq 0 g c atgtg ate ettg attttctc g c ctlc gg c ate agttc o c attg c c a a ate etg etc a a ottta c a c a a cttgtctatatacccctgataggccttcatgcagtcttcagcgagatgaagatgcgtagcatacttg [0040] A SEQ ID NO: 15 mostra uma sequência v2 formadora de RNA em grampo YFP como encontrado em pDAB110853. As bases em maiusculas são a fita sentido YFP, as bases sublinhadas compreendem o íntron ST-LS1, as bases em minúsculas não sublinhadas são a fita antissentido YFP.

AT GT G AT CT G G AG C ACTT CT CTTT C ATG G G AAG ATT C CTTAG GTT G

TGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTG GGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGqactaqtaccqqttqqqa aaqqtatqtttctqcttctacctttqatatatatataataattatcactaattaqtaataatataqtatttcaa qtatttttttcaaaataaaaqaatqtaqtatataqctattqcttttctqtaqtttataaqtqtqtatattttaattt ataacttttctaatatatqaccaaaacatqqtqatqtqcaqqttqatccqcqqttactttcccactqaqq catctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccltccatctccacaacgt aaggaaícttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat [0041] A SEQ ID NO: 16 mostra uma sequência de DNA compreendendo um íntron ST-LS1.

[0042] SEQ ID NO: 17 mostra uma sequência codificante de YFP como encontrada em pDAB110556.

[0043] A SEQ ID NO:18 mostra uma sequência de DNA da região 1 de Anexina.

[0044] A SEQ ID NO: 19 mostra uma sequência de DNA da região 2 de Anexina.

[0045] A SEQ ID NO:20 mostra uma sequência de DNA da região 1 de Beta Espectrina 2.

[0046] A SEQ ID NO:21 mostra uma sequência de DNA da região 2 de Beta Espectrina 2.

[0047] A SEQ ID NO:22 mostra uma sequência de DNA da região mtRP-L4 1.

[0048] A SEQ ID NO:23 mostra uma sequência de DNA da região mtRP-L4 2.

[0049] As SEQ ID NOs:24-47 mostram os iniciadores usados para amplificar as regiões gênicas de Anexina, Beta espectrina 2, mtRP-L4, e YFP para a síntese de dsRNA.

[0050] A SEQ ID NO:48 mostra uma sequência de DNA de milho que codifica uma proteína similar a TIP41.

[0051] A SEQ ID NO:49 mostra uma sequência de DNA de oligo-nucleotídeo T20NV.

[0052] As SEQ ID NOs:50-54 mostra iniciadores e sondas usados para medir níveis de transcrito do milho.

[0053] A SEQ ID NO:55 mostra uma sequência de DNA de uma porção de região que codifica SpecR usada para a detecção de esqueleto do vetor binário.

[0054] A SEQ ID NO:56 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região codificante de AAD1 usada para a análise do número de cópias genômicas.

[0055] A SEQ ID NO:57 mostra uma sequência de DNA de um gene de invertase de milho.

[0056] As SEQ ID NOs:58 a 69 mostram sequências de demonstração de iniciadores e sondas usadas para análises do número de cópias do gene.

[0057] As SEQ ID NOs:70 a 111 mostram sequências de transcrito de Diabrotica que codificam proteínas que têm homologia de sequência à SEQ ID NO:2 por meio de um domínio Sec1.

[0058] As SEQ ID NOs:112 e 113 mostram os iniciadores usados para amplificar porções de uma sequência de rop de Diabrotica com- preendendo rop v3 (região v3).

[0059] As SEQ ID NO:114 mostra uma sequência de DNA da região de rop v3 de Diabrotica virgifera (rop v3) que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor de T7 em extremidades 5’ e 3’ não mostradas).

[0060] A SEQ ID NO:115 mostra uma sequência de DNA de rop de percevejo marrom da soja (Euschistus heros).

[0061] A SEQ ID NO: 116 mostra a proteína de ROP de Euschistus heros [0062] As SEQ ID NOs: 117 e 118 mostram os iniciadores usados para amplificar uma porção da sequência de rop de Euschistus heros compreendendo regí de rop de BSB.

[0063] A SEQ ID NO:119 mostra uma sequência de DNA de regí de rop de BSB.

[0064] A SEQ ID NO: 120 mostra uma sequência de DNA compreendendo rop de Meligethes aeneus.

[0065] A SEQ ID NO: 121 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína de ROP de Meligethes aeneus.

[0066] A SEQ ID NO: 122 mostra uma sequência de DNA compreendendo rop de Meligethes aeneus.

[0067] A SEQ ID NO: 123 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína de ROP de Meligethes aeneus.

[0068] A SEQ ID NO: 124 mostra uma sequência de DNA compreendendo rop de Meligethes aeneus.

[0069] A SEQ ID NO: 125 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína de ROP de Meligethes aeneus.

[0070] A SEQ ID NO: 126 mostra uma sequência de DNA compreendendo rop de Meligethes aeneus.

[0071] A SEQ ID NO: 127 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína de ROP de Meligethes aeneus.

[0072] A SEQ ID NO:128 mostra uma sequência de DNA da regí de rop (região 1) de Meligethes aeneus que foi usado para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor de T7 em extremidades 5’ e 3’ não mostradas).

[0073] As SEQ ID NOs:129 e 130 mostram os iniciadores usados para amplificar porções de uma sequência de rop de Meligethes compreendendo regí de rop (região 1).

[0074] A SEQ ID NO: 131 mostra uma sequência de DNA compreendendo rop-1 de Meligethes aeneus.

[0075] A SEQ ID NO: 132 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína de ROP-1 de Meligethes aeneus.

[0076] A SEQ ID NO: 133 mostra uma sequência de DNA compreendendo rop-2 de Meligethes aeneus.

[0077] A SEQ ID NO: 134 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína de ROP-2 de Meligethes aeneus.

Q MQDO(S) PARA EXECUTARA INVENÇÃO

[0078] São descritos neste pedido métodos e composições para o controle de infestação de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Os métodos para identificar um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para o uso como um gene alvo para controle mediado por RNAi de uma população da praga de coleópteros e/ou hemípteros também são fornecidos. Os vetores de plasmídeo de DNA que codificam uma ou mais moléculas de dsRNA podem ser projetados para suprimir um ou mais genes alvo essenciais para crescimento, sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para repressão pós-transcricional para expressão ou inibição de um gene alvo via moléculas de ácidos nucleicos que são complementares a uma sequência codificante ou não codificante do gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas modalidades e adicio- nais, uma praga de coleópteros e/ou hemípteros podem ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e/ou hpRNA transcritas de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência codificante ou não codificante de um gene alvo, por meio disso fornecendo um efeito protetor vegetal.

[0079] Dessa forma, algumas modalidades envolvem a inibição específica para a sequência da expressão de produtos gênicos alvo, usando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a sequências codificantes e/ou não codificantes do gene(s) alvo para alcançar o controle pelo menos parcial de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. É descrito o grupo de moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas que compreendem uma sequência nucleotídica, por exemplo, como apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131, e SEQ ID NO: 133 e fragmentos destas. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa desta sequência, fragmentos desta ou gene compreendendo uma destas sequências, para silenciamento pós-transcricional ou inibição de um gene alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO:3. Ainda em outras modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO:4. Em modalidades ainda adicionais, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO:114. Em outras modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO:115. Ainda em outras modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133.

[0080] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira re-combinante (por exemplo, uma célula vegetal) tendo no seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a molécula(s) de dsRNA pode ser produzida quando ingerida por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para silencia-mento pós-transcricional ou inibir a expressão de um gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, uma ou mais de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 ou uma sequência parcial de um gene compreendendo uma ou mais das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; ou complementos destas.

[0081] As modalidades particulares envolvem uma célula hospedeira recombinante tendo no seu genoma uma sequência de ácidos nucleicos recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo toda ou parte das SEQ ID NOS:1, 115, 120, 122, 124, 126, 131, e/ou 133. Quando ingerida por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, a molécula(s) de iRNA pode silenciar ou inibir a expressão de um gene alvo compreendendo a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133, na praga de coleópteros e/ou hemípteros, e por meio disso resultar em cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0082] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombi-nante tendo no seu genoma pelo menos uma sequência de ácidos nu-cleicos recombinante que codifica pelo menos uma molécula de dsR-NA pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula vegetal transformada. Além de tais plantas transgênicas, as plantas de progê-nie de qualquer geração de plantas transgênicas, sementes transgênicas e produtos vegetais transgênicos, são todos fornecidos, cada um dos quais compreende a sequência(s) de ácido nucleico recombinante. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Por isso, nestas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada de uma célula vegetal transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada a partir do grupo compreendendo milho (Zea mays), soja (Glycine max) e as plantas da família Poaceae.

[0083] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de dsRNA pode ser operacionalmente liga- da a um promotor e também pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de terminação de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros pode compreender: (a) transformação de uma célula vegetal com um vetor que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de dsRNA; (b) cultura da célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) seleção de uma célula vegetal transformada que integrou o vetor no seu genoma; e (d) determinação de que a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência nucleotídica do vetor. Uma planta pode ser regenerada de uma célula vegetal que tem o vetor integrado no seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência nucleotídica do vetor.

[0084] Dessa forma, também é descrita uma planta transgênica compreendendo um vetor que tem uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de dsRNA integrada no seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência nucleotídica do vetor. Em modalidades particulares, a expressão de uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que entra em contato com a planta ou célula vegetal transformada, por exemplo, alimentando-se da planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal. As plantas transgênicas descritas neste pedido podem exibir resistência e/ou tolerância aumentada à infestação de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Plantas transgênicas particulares podem exibir resistência e/ou tolerância aumentada a uma ou mais pragas de coleópteros e/ou hemípteros selecionada a partir do grupo consistindo em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim, Meligethes aeneus Fabricius, Euchistus heros, Piezodo-rus guildinii, Halyomorpha halys, e Nezara viridula, Acrosternum hilare e Euschistus servus.

[0085] Também são descritos neste pedido métodos para a entrega de agentes de controle, como uma molécula de iRNA, a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Tais agentes de controle podem causar, diretamente ou indiretamente, um prejuízo na capacidade da praga de coleópteros e/ou hemípteros de alimentar-se, crescer ou causar dano de outra maneira em um hospedeiro. Em algumas modalidades, um método de inibir a expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, o método pode resultar consequentemente na morte da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0086] Em algumas modalidades, as composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidas compreendendo uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da invenção para o uso em plantas, animais e/ou ambiente de uma planta ou animal para alcançar a eliminação ou redução de uma infestação de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutritiva ou fonte de alimento para ser alimentada à praga de coleópteros e/ou hemípteros. Algumas modalidades compreende pôr à disposição a composição nutritiva ou fonte de alimento à praga de coleópteros e/ou hemípteros. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da praga de coleópteros e/ou hemípteros, que pode resultar por sua vez na inibição da expressão de pelo menos um gene alvo na céiula(s) da praga de coleópteros e/ou hemíp-teros. A ingestão ou o dano a uma planta ou célula vegetal por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros podem ser limitados ou eliminados em qualquer tecido do hospedeiro ou ambiente no qual a praga de coleópteros e/ou hemípteros está presente fornecendo uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção no hospedeiro da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0087] As composições e os métodos descritos neste pedido podem ser usados em conjunto em combinações com outros métodos e composições para controlar o dano por praga de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, uma molécula de iRNA como descrito neste pedido para proteger plantas de praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, biopesticidas eficazes contra uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, rotação de culturas ou técnicas de genética recombinante que exibem atributos diferentes dos atributos dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi da invenção (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudiciais para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, toxinas de Bt)).

II. ABREVIATURAS dsRNA Um ^c'^° ribonucleico onde pelo menos uma porção do ácido ribonucleico é de fita dupla Gl inibição de crescimento NCBI Centro Nacional de Informação Biotecnológica gDNA DNA genômico iRNA ácido ribonucleico inibitório ORF região de leitura aberta RNAi ácido ribonucleico de interferência miRNA microácido ribonucleico siRNA pequeno ácido ribonucleico de interferência shRNA pequeno ácido ribonucleico em grampo hpRNA ácido ribonucleico contendo grampo UTR região não traduzida WCR lagarta-da-raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) NCR lagarta-da-raiz do milho do norte (planta ou célula vege- tal Smith e Lawrence) MCR lagarta-da-raiz do milho mexicana (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith) PCR Reação de polimerase em cadeia RISC Complexo de silenciamento induzido por RNA SCR lagarta-da-raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunc- tata howardi Barber) BSB percevejo marrom da soja (Euschistus heros Fabricius) PB Besouro do pólen (Meligethes aeneus Fabricius) III. TERMOS

[0088] Na descrição e tabelas que seguem, diversos termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a serem dados tais termos, as seguintes definições são fornecidas: [0089] Praga de Coleópteros: Como usado neste pedido, o termo "praga de coleópteros" refere-se a insetos do gênero Diabrotica, que se alimentam do milho e outras gramas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma praga de coleópteros é selecionada a partir da lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e Meligethes aeneus Fabricius.

[0090] Praga de hemípteros: Como usado neste pedido, o termo "praga de hemípteros" refere-se a insetos da família Pentatomidae, que se alimentam da ampla variação de plantas hospedeiras e têm partes de boca furadoras e sugadoras. Em exemplos particulares, uma praga de hemípteros é selecionada a partir da lista compreendendo, Euschistus heros (Fabr). (percevejo marrom da soja), Nezara viridula (L). (percevejo verde), Piezodorus guildinii (Westwood) (percevejo verde da soja), Halyomorpha halys (percevejo marrom fedorento), Acros-ternum hilare (percevejo-acrosterno), e Euschistus servus (percevejo marrom).

[0091] Contato (com um organismo): Como usado neste pedido, o termo "contato com" ou "ingerido por" um organismo (por exemplo, uma praga de coleópteros e/ou hemípteros), em relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nu-cleico no organismo, por exemplo, e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, alimentando-se); contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e infiltração de organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.

[0092] Contig: Como usado neste pedido, o termo "contig" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que é reconstruída do grupo de segmentos de ácido nucleico de sobreposição derivados de uma fonte genética única.

[0093] Planta de milho: Como usado neste pedido, o termo "planta de milho" refere-se a uma planta da espécie Zea mays (milho).

[0094] Codificação de um dsRNA: Como usado neste pedido, o termo "codificação de um dsRNA" inclui um gene cujo produto de transcrição de RNA é capaz de formar uma estrutura de dsRNA intra-molecular (por exemplo, um grampo) ou estrutura de dsRNA intermo-lecular (por exemplo, hibridizando uma molécula de RNA alvo).

[0095] Expressão: Como usado neste pedido, "expressão" de uma sequência (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA ou cDNA genômico) é convertida em uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, muitas vezes incluindo a síntese de uma proteína. A expressão gênica pode estar sob o efeito de sinais externos; por exemplo, a exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou reduz a expressão gênica. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer local na via de DNA a RNA à proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exemplo, por controles que atuam sobre transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias como mRNA, ou por meio de ativação, inativação, compartimentação ou degradação de moléculas proteicas específicas depois que foram feitos, ou por combinações destes. A expressão gênica pode ser medida no nível de RNA ou no nível proteico por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, northern blot (RNA), RT-PCR, western (imuno)blot, ou ensaio(s) de atividade da proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[0096] Material genético: Como usado neste pedido, o termo "material genético" inclui todos os genes e moléculas de ácidos nucleicos, como DNA e RNA.

[0097] Inibição: Como usado neste pedido, o termo "inibição", quando usado para descrever um efeito sobre uma sequência codifi-cante (por exemplo, um gene), se refere a uma redução mensurável no nível celular do mRNA transcrito da sequência codificante e/ou pep-tídeo, polipeptídeo ou produto proteico da sequência codificante. Em alguns exemplos, a expressão de uma sequência codificante pode ser inibida tal que a expressão é aproximadamente eliminada. "Inibição específica" refere-se à inibição de uma sequência codificante alvo sem afetar consequentemente a expressão de outras sequências codifican-tes (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada.

[0098] Isolado: Um componente biológico "isolado" (como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido à parte de ou purificado longe de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA e RNA cromossômico e extracromossômico, e proteínas). As moléculas de ácidos nucleicos e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácidos nucleicos e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão. O termo também engloba ácidos nucleicos e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácidos nucleicos quimicamente sintetizadas, proteínas e peptídeos.

[0099] Molécula de ácido nucleico: Como usado neste pedido, o termo "molécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma poli-mérica de nucleotídeos, que podem incluir tanto fitas antissentido como sentido de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros mistos dos mencionados acima. Um nucleotídeo pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico," como usado neste pedido, é sinônima para "ácido nucleico" e "polinu-cleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico tem normalmente pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que de outra maneira especificado. Por convenção, a sequência nucleotídica de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5’ à 3’ da molécula. O "complemento" de uma sequência nucleotídica refere-se à sequência, de 5’ a 3’, das nucleobases que formam pares de base com as nucleobases da sequência nucleotídica (isto é, A-T/U e G-C). O "complemento reverso" de uma sequência de ácidos nucleicos refere-se à sequência, de 3’ a 5’, das nucleobases que formam pares de base com as nucleobases da sequência nucleotídica.

[00100] "Moléculas de ácidos nucleicos" incluem formas de fita única e dupla do DNA; formas de fita simples de RNA; e formas de fita dupla do RNA (dsRNA). O termo "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de ácidos nucleicos" refere-se tanto às fitas antissentido como sentido de um ácido nucleico como fitas únicas individuais ou no dú-plex. O termo "ácido ribonucleico" (RNA) é inclusivo de iRNA (RNA inibitório), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (pequeno RNA de interferência), shRNA (pequeno RNA em grampo), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (microRNA), hpRNA (RNA em grampo), tRNA (RNA de transferência, ou carregado ou descarregado com um aminoácido adiado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido desoxirribonucleico" (DNA) é inclusivo de cDNA, DNA genômico e híbridos DNA-RNA. Os termos "segmento de ácidos nucleicos" e "segmento de sequência nucleotídica," ou mais geralmente "segmento", serão entendidos por aqueles na técnica como um termo funcional que inclui ambas as sequências genômicas, sequências de RNA ribossô-mico, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon e sequências nucleotídicas engendradas menores que codificam ou podem ser adaptadas para codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[00101] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados pela divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por polime-rização de precursores de nucleotídeos individuais. Sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos de até várias centenas de bases de comprimento. Como os oligonucleotídeos podem ligar-se a uma sequência nucleotídica complementar, podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA e RNA (transcrito reversamente em um cDNA). Em PCR, o oligo-nucleotídeo é referido tipicamente como um "iniciador", que permite a uma DNA polimerase estender o oligonucleotídeo e replicar a fita complementar.

[00102] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados em conjunto por ligações nucleotídicas de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. Moléculas de ácidos nucleicos podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeos não naturais ou derivadas, como será prontamente apreciado por aqueles especialistas na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações inter-nucleotídicas (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercalantes: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos alfa nucleicos anoméricos, etc.) . O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação to-pológica, incluindo de fita simples, fita dupla, parcialmente duplexada, triplexada, em grampo, circular e conformações em cadeado.

[00103] Que como usado neste pedido, com respeito a DNA, o termo "sequência codificante," "sequência de codificação", "sequência nucleotídica estrutural," ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refe-re-se a uma sequência nucleotídica que é enfim traduzida para um po-lipeptídeo, via transcrição e mRNA, quando colocada sob controle de sequências reguladoras apropriadas. Com respeito ao RNA, o termo "sequência codificante" refere-se a uma sequência nucleotídica que é traduzida para um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência codificante são determinados por um códon de partida de tradução no terminal 5’ e um códon de parada de tradução no terminal 3’. As sequências codificantes incluem, mas não são limitadas a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências nucleotídicas recombinan-tes.

[00104] Genoma: Como usado neste pedido, o termo "genoma" re-fere-se a DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e também se refere a DNA de organelas encontradas dentro de componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal tal que a molécula de DNA esteja integrada no genoma da célula vegetal. Nestas modalidades e adicionais, a molécula de DNA pode estar integrada no DNA nuclear da célula vegetal ou integrada no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo "genoma", como se aplica a bactérias, refere-se tanto ao cromossomo como a plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria tal que a molécula de DNA esteja integrada no genoma da bactéria. Nestas modalidades e adicionais, a molécula de DNA pode estar cromossomicamente integrada ou localizada ou em um plasmídeo estável.

[00105] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", como usado neste pedido, no contexto de dois ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados com correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[00106] Como usado neste pedido, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode referir-se ao valor determinado comparando duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas) sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido ou nucleotídeo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para resultar na porcentagem da identidade de sequência. É dito que uma sequência que é idêntica em cada posição em comparação com uma sequência de referência seja 100% idêntica à sequência de referência, e vice-versa.

[00107] Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et aí. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homolo-gia podem ser encontrados, por exemplo, em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.

[00108] O Instrumento de Pesquisa de Alinhamento Local Básico do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível de várias fontes, incluindo o Centro Nacional de Informação Biotecnológica (Bethesda, MD), e na Internet, para o uso com relação a vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na Internet sob a seção "ajuda" do BLAST™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, a função "sequências Blast 2" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando o conjunto de matriz pré-configurada BLOSUM62 para parâmetros pré-configurados. As sequências de ácidos nucleicos com até maior similaridade às sequências de referência mostrarão identidade de porcentagem crescente quando avaliadas por este método.

[00109] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Como usado neste pedido, os termos "Especificamente hibridizá-vel" e "Especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que ligação estável e específica ocorra entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácidos nucleicos envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as sequências de ácidos nucleicos das duas moléculas de ácidos nucleicos. As duas moléculas então são capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes na fita oposta para formar uma molécula dúplex que, se for suficientemente estável, é detectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido nucleico não tem que ser 100% complementar à sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Entretanto, a quantidade da complementaridade de sequência que deve existir para a hibridização para ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.

[00110] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e a composição e comprimento das se- quências de ácidos nucleicos hibridizantes. Geralmente, a temperatura da hibridização e força iônica (especialmente concentração de Na+ e/ou Mg++) da hibridização determinará a estringência da hibridização. A força iônica do tampão de lavagem e a temperatura de lavagem também influencia na estringência. Os cálculos quanto a condições de hibridização requeridas para alcançar graus particulares de estringência são conhecidos por aqueles especialistas ordinários na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Clo-ninq: A Laboratorv Manual, 2nd ed, vol 1-3, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11 e atualizações; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hvbridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução mais detalhada e orientação quanto à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," em Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloqy - Hvbridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et ai, Eds, Current Protocols in Molecular Bioloqy, Capítulo 2, Greene Publishing e Wiley-Interscience, NY, 1995, e atualizações.

[00111] Como usado neste pedido, "condições estringentes" englobam condições sob as quais a hibridização somente ocorrerá se houver combinação de sequência de mais de 80% entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico alvo. "Condições estringentes" incluem níveis particulares adicionais de estringência. Dessa forma, como usado neste pedido, condições de "estringência moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com a combinação de sequência de mais de 80% (isto é, tendo incompatibilidade de menos de 20%) se hibridizarão; condições de "alta estringência" são aquelas sob as quais as sequências com combinação de mais de 90% (isto é, tendo incompatibilidade de menos de 10%) se hibridizarão; e as condições de "estringência muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com combinação de mais de 95% (isto é, tendo incompatibilidade de menos de 5%) se hibridizarão.

[00112] A seguir são condições representativas, não limitantes de hibridização.

[00113] Condição de alta estringência (detecta sequências que compartilham identidade de sequência de pelo menos 90%): Hibridização em tampão SSC 5X a 65Ό durante 16 horas; lavag em duas vezes em tampão SSC 2X à temperatura ambiente durante 15 minutos cada uma; e lavagem duas vezes em tampão SSC 0,5X a 65Ό durante 20 minutos cada uma.

[00114] Condição de estringência moderada (detecta sequências que compartilham a identidade de sequência de pelo menos 80%): Hibridização em tampão SSC 5X a 6X a 65-70Ό durante 16-20 horas; lavagem duas vezes em tampão SSC 2X à temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada uma; e lavagem duas vezes em tampão SSC 1X a 55-70Ό durante 30 minutos cada uma.

[00115] A condição de controle não estringente (sequências que compartilham a identidade de sequência de pelo menos 50% se hibridizarão): Hibridização em tampão SSC 6X à temperatura ambiente a 55Ό durante 16-20 horas; lavagem pelo menos duas vezes em tampão SSC 2X a 3X à temperatura ambiente a 55Ό durante 20-30 minutos cada uma.

[00116] Como usado neste pedido, o termo "substancialmente homólogo" ou "homologia substancial," em relação a uma sequência de ácidos nucleicos contígua, refere-se a sequências nucleotídicas contíguas com que são carregadas pelas moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes a uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de ácidos nucleicos de referência. Por exemplo, as moléculas de ácidos nucleicos que têm sequências que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácidos nu-cleicos de referência da SEQ ID NO:1 são aquelas moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, condições de estringência moderada apresentadas, supra) a moléculas de ácidos nucleicos que têm a sequência de ácidos nucleicos de referência da SEQ ID NO:1. Sequências substancialmente homólogas podem ter identidade de sequência de pelo menos 80%. Por exemplo, sequências substancialmente homólogas podem ter identidade de sequência de aproximadamente 80% a 100%, como aproximadamente 81%; aproximadamente 82%; aproximadamente 83%; aproximadamente 84%; aproximadamente 85%; aproximadamente 86%; aproximadamente 87%; aproximadamente 88%; aproximadamente 89%; aproximadamente 90%; aproximadamente 91%; aproximadamente 92%; aproximadamente 93%; aproximadamente 94% aproximadamente 95%; aproximadamente 96%; aproximadamente 97%; aproximadamente 98%; aproximadamente 98,5%; aproximadamente 99%; aproximadamente 99,5%; e aproximadamente 100%. A propriedade da homologia substancial é estreitamente relacionada à hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização estringentes.

[00117] Como usado neste pedido, o termo "ortólogo" refere-se a um gene em duas ou mais espécies que se desenvolveu de uma sequência nucleotídica ancestral comum e pode conservar a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00118] Como usado neste pedido, diz-se que duas moléculas da sequência de ácidos nucleicos exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma sequência lida na direção 5’ a 3’ é complementar a cada nucleotídeo de outra sequência quando lida na direção 3’ a 5’. Uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência nucleotídica de referência exibirá uma sequência idêntica à sequência de complemento reversa da sequência nucleotídica de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente entendidos por aqueles especialistas ordinários na técnica.

[00119] Operacionalmente ligado: Uma primeira sequência nucleotídica está operacionalmente ligada com uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. Quando recombinantemente produzidas, as sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas são geralmente contíguas, e, onde necessário, duas regiões codificantes de proteína podem ser juntadas na mesma fase de leitura (por exemplo, em uma ORF fundida traducionalmente). Entretanto, os ácidos nucleicos não têm que ser contíguos para estarem operacionalmente ligados.

[00120] O termo "operacionalmente ligado", quando usado em referência a uma sequência reguladora e uma sequência codificante, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência codificante ligada. "Sequências reguladoras" ou "elementos de controle" se referem a sequências nucleotídicas que influenciam na regulação de tempo e o nível/quantidade de transcrição, processamento de RNA ou estabilidade ou tradução da sequência codificante associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líder de tradução; íntrons; potencializadores; estruturas haste-alça; sequências de ligação repressoras; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência codificante operacionalmente ligada a esta. Também, sequên- cias reguladoras particulares operacionalmente ligadas a uma sequência codificante podem estar localizadas na fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.

[00121] Promotor: Como usado neste pedido, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição, e este pode estar envolvido em reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência codificante para expressão em uma célula, ou um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência sinal que pode ser operacionalmente ligada a uma sequência codificante para expressão em uma célula. Um "promotor vegetal" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos de xilema, tra-queídeos, ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferenciais para o tecido". Os promotores que iniciam a transcrição somente em certos tecidos são referidos como "específicos para o tecido". Um promotor "específico para o tipo celular" principalmente controla a expressão em certos tipos celulares em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "indu-zível" pode ser o promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença da luz. Promotores específicos para o tecido, preferenciais para o tecido, específicos para o tipo celular e induzíveis constitui a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é o promotor que pode estar ativo sob a maioria das condições ambientais ou sob a maioria dos tipos de tecidos ou células.

[00122] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Ver Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa da transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Promotores induzíveis exemplares incluem, mas não são limitados a: Promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; o gene In2 do milho que responde a fitopro-tetores de herbicida benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, a atividade transcricional do qual pode ser induzida por um hormônio glicocorticos-teroide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425).

[00123] Promotores constitutivos exemplares incluem, mas não são limitados a: Promotores de vírus vegetais, como o promotor 35S de Vírus de Mosaico de Couve-flor (CaMV); promotores de genes de acti-na de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histo-na H3 de milho; e o promotor ALS, fragmento de Xba1/Ncol 5’ para o gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma sequência nucleotí-dica similar ao dito fragmento Xba1/Ncol) (Patente U.S. No. 5.659.026).

[00124] Adicionalmente, qualquer promotor específico para o tecido ou preferencial para o tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a um promotor específico para o tecido podem produzir o produto da sequência codificante exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico. Os promotores específicos para o tecido ou preferenciais para o tecido exemplares incluem, mas não são limitados a: Um promotor preferencial para a semente, como aquele do gene de faseolina; um promotor específico para a folha e induzido por luz, como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico para ante- ra como aquele de LAT52; um promotor específico para o pólen como aquele de Zm13\ e um promotor preferencial para o microesporo como aquele de apg.

[00125] Planta de soja: Como usado neste pedido, o termo "planta de soja" refere-se a uma planta das espécies Glycine sp., incluindo Glycine max.

[00126] Transformação: Como usado neste pedido, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico em uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico torna-se estavelmente replicada pela célula, pela incorporação da molécula de ácido nucleico no ge-noma celular, ou pela replicação epissomal. Como usado neste pedido, o termo "transformação" engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados à: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm et aí. (1986) Nature 319:791-793); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417); microinjeção (Muel-ler et al. (1978) Célula 15:579-585); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-4807); entrada de DNA direta; e bombardeio com microprojétil (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00127] Transgene: Uma sequência de ácidos nucleicos exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica uma ou ambas as fitas de uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de ácidos nucleicos antissentido, em que a expressão da se- quência de ácidos nucleicos antissentido inibe a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos alvo. Em exemplos ainda adicionais, um transgene pode ser uma sequência gênica (por exemplo, um gene de resistência ao herbicida), um gene que codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil ou gene que codifica um traço agrícola desejável. Nestes e outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras (por exemplo, um promotor) operacionalmente ligado a uma sequência codificante do transgene.

[00128] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico como introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucleicos que o permite se replicar na célula hospedeira, como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode ser uma molécula de RNA. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, sequências antissentido, e/ou genes de marcador selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, por meio disso fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácidos nucleicos e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para ajudar a alcançar a entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipos-soma, revestimento proteico, etc.).

[00129] Rendimento: Um rendimento estabilizado de aproximadamente 100% ou maior quanto ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento que cresce ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, "rendimento melhorado" ou "melhorando rendimento" significa um cultivar que tem um rendimento estabilizado de 105% a 115% ou maior em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de cresci- mento que contém densidades significantes da praga de coleópteros e/ou hemípteros que é injuriosa para aquela colheita que cresce ao mesmo tempo e sob as mesmas condições.

[00130] Que a menos que especificamente indicado ou contido, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um," como usado neste pedido.

[00131] A menos que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles especialistas ordinários na técnica à qual esta revelação pertence. As definições de termos comuns na biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Genes X de Lewin, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encvclopedia of Molecular Bioloqy. Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy: A Com-prehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens estão em peso e todas as proporções de mistura de solventes estão em volume a menos que de outra maneira observado. Todas as temperaturas estão em graus centígrados.

IV. MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS COMPREENDENDO UMA SEQUÊNCIA DE PRAGA DE COLEÓPTEROS E/OU HEMÍPTEROS

A. RESUMO

[00132] São descritos neste pedido moléculas de ácidos nucleicos úteis para o controle de praga de coleópteros e/ou hemípteros. As moléculas de ácidos nucleicos descritas incluem sequências alvo (por exemplo, genes nativos e sequências não codificantes), dsRNAs, siR-NAs, shRNAs, hpRNAs, e miRNAs. Por exemplo, moléculas de dsR-NA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a toda ou parte de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos nativas em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas modalidades e adicionais, a sequência(s) de ácidos nucleicos nativa pode ser um ou mais genes alvo, o produto dos quais pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido em desenvolvimento larval. As moléculas de ácidos nucleicos descritas neste pedido, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência(s) de ácido nucleico nativa à qual as moléculas de ácidos nucleicos são especificamente complementares, podem iniciar RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão da sequência(s) de ácido nucleico nativa. Em alguns exemplos, a redução ou a eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência especificamente complementar a esta podem ser letais em praga de coleópteros e/ou hemípteros, ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzidos.

[00133] Em algumas modalidades, pelo menos um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende uma sequência nucleotídica que compreende rop (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133). Em exemplos particulares, um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros é selecionado, em que o gene alvo compreende uma sequência nucleotídica nova compreendendo rop (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133).

[00134] Em algumas modalidades, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos contígua que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100%, ou 100% idêntica) à sequência de ami-noácidos de um produto proteico de rop (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133). Um gene alvo pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, a inibição pós-transcricional da qual tem um efeito deletério sobre a praga de coleópteros e/ou hemípteros, ou fornece um benefício protetor contra a praga de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta. Em exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoá-cidos contígua que é pelo menos 85% idêntica, aproximadamente 90% idêntica, aproximadamente 95% idêntica, aproximadamente 96% idêntica, aproximadamente 97% idêntica, aproximadamente 98% idêntica, aproximadamente 99% idêntica, aproximadamente 100% idêntica, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de um produto proteico da sequência nucleotídica nova SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133.

[00135] São fornecidas, de acordo com a invenção, sequências nu-cleotídicas, a expressão das quais resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma sequência codificante em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, após ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, a regulação para baixo da sequência codificante em células da praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser obtida. Em modalidades particulares, a regulação para baixo da sequência codificante em células da praga de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar em um efeito deletério sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00136] Em algumas modalidades, as sequências alvo incluem sequências de RNA não codificantes transcritas, tais como 5’UTRs; 3’UTRs; sequências líder entrançadas; sequências de íntron; sequências de outron (por exemplo, 5’UTR de RNA posteriormente modificado em trans splicing)·, sequências de donatron (por exemplo, RNA não codificante requerido para fornecer sequências doadoras de trans spli-cing)\ e outro RNA não codificante transcrito de genes da praga alvo de coleópteros e/ou hemípteros. Tais sequências podem ser derivadas tanto de genes monocistrônicos como policistrônicos.

[00137] Dessa forma, também são descritas neste pedido, com relação a algumas modalidades, moléculas de iRNA (por exemplo, dsR-NAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades uma molécula de iRNA pode compreender a sequência(s) de nucleotídeos que são complementares a toda ou parte de uma pluralidade de sequências alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sequências alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, como uma planta ou bactéria. Também são descritas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsR-NA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Ainda são descritos construtos de DNA recombinan-tes para o uso no alcance da transformação estável de alvos particulares do hospedeiro. Os alvos do hospedeiro transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miR-NA e/ou hpRNA dos construtos de DNA recombinante. Por isso, também é descrito um vetor de transformação vegetal compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica operacionalmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão da sequência(s) de nucleotídeos resulta em uma molécula de RNA que compreende uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00138] Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nuclei-cos úteis para o controle de praga de coleópteros e/ou hemípteros podem incluir: toda ou parte de uma sequência de ácidos nucleicos nativa isolada de Diabrotica, Meligethes ou organismo hemíptero compreendendo rop (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133); as sequências nucleotídicas que quando expressas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por rop (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133); as moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, shR-NAs, miRNAs e hpRNAs) compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência codificante de rop (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133); as sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de pré-mRNA ou mRNA por rop (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133); e construtos de DNA recombinante para o uso na realização da transformação estável de alvos particulares do hospedeiro, em que um alvo do hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos precedentes.

B. MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

[00139] A presente invenção fornece, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que inibem a expressão gênica alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros; e moléculas de DNA capazes de serem expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão gênica alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00140] Algumas modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, ou mais) sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo da: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NQ:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codifi-cante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115 e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133. Em modalidades particulares, contato ou ingestão por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros da sequência de ácidos nucleicos isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00141] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, ou mais) sequência de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo para inibir a expressão gênica alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Tal sequência(s) de DNA pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de promotor que atua em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou aumentar a transcrição de RNA codificado capaz de formar uma molécula(s) de dsRNA. Em uma modalidade, pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, ou mais) sequência de DNA pode ser derivada de uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133. Os derivados da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133 incluem fragmentos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NQ:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133. Em algumas modalidades, tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos aproximadamente 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO: 133 ou um complemento destas. Dessa forma, tal fragmento pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 ou um complemento destas. Nestas modalidades e adicionais, tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais de aproximadamente 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO: 133 ou um complemento destas. Dessa forma, um fragmento da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133 pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, aproximadamente 25, (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), aproximadamente 30, aproximadamente 40, (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e 45), aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200 ou mais nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 ou um complemento destas.

[00142] Algumas modalidades compreendem a introdução de moléculas de dsRNA parcial ou totalmente estabilizadas em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Quando expressas como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) e ingeridas por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, as sequências de ácidos nucleicos que compreendem um ou mais fragmentos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133 podem causar uma ou mais de morte, inibição de crescimento, modificação na proporção entre sexos, redução de tamanho de ninhada, cessação da infecção e/ou cessação da alimentação por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência nucleotídica incluindo aproximadamente 15 a aproximadamente 300 ou aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotídeos que são substancialmente homólogos a uma sequência gênica alvo da praga de coleópteros e/ou hemípteros e compreendendo um ou mais fragmentos de uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133 são fornecidos. A expressão de tal molécula de dsRNA, por exemplo, pode levar à inibição de crescimento e/ou mortalidade em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que ingere a molécula de dsRNA.

[00143] Em certas modalidades, moléculas de dsRNA fornecidas pela invenção compreendem sequências nucleotídicas complementares a um gene alvo compreendendo a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 e/ou sequências nucleotídicas complementares a um fragmento da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133, a inibição das quais no gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros resulta na redução ou remoção de uma proteína ou agente de sequência nucleotídica que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Uma sequência nucleotídica selecionada pode exibir identidade de sequência de aproximadamente 80% a aproximadamente 100% à SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133, um fragmento contíguo da sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 ou o complemento de qualquer dos precedentes. Por exemplo, uma sequência nucleotídica selecionada pode exibir identidade de sequência de aproximadamente 81%; aproximadamente 82%; aproximadamente 83%; aproximadamente 84%; aproximadamente 85%; aproximadamente 86%; aproximadamente 87%; aproximadamente 88%; aproximadamente 89%; aproximadamente 90%; aproximadamente 91%; aproximadamente 92%; aproximadamente 93%; aproximadamente 94% aproximadamente 95%; aproximadamente 96%; aproximadamente 97%; aproximadamente 98%; aproximadamente 98,5%; aproximadamente 99%; aproximadamente 99,5%; ou aproximadamente 100% à SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133, um fragmento contíguo da sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 ou o complemento de qualquer dos precedentes.

[00144] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão gênica alvo pode compreender uma sequência nucleotídica única que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência de ácidos nucleicos nativa encontrada em uma ou mais espécies alvo da praga de coleópteros e/ou hemípte-ros, ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera de uma pluralidade de tais sequências especificamente complementares.

[00145] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda sequência nucleotídica separada por uma "sequência espaçadora." Uma sequência espa-çadora pode ser uma região que compreende qualquer sequência nucleotídica que facilita a formação de estrutura secundária entre as primeira e segunda sequências nucleotídicas, onde isto é desejado. Em uma modalidade, a sequência espaçadora é parte de uma sequência codificante antissentido ou sentido do mRNA. A sequência espaçadora pode compreender alternativamente qualquer combinação de nucleo-tídeos ou homólogos destas que é capaz de ser ligada covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.

[00146] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma sequência nucleotídica codificante de uma ou mais moléculas de RNA diferentes, em que cada uma das moléculas de RNA diferentes compreende uma primeira sequência nucleotídica e uma segunda sequência nucleotídica, em que as primeira e segunda sequências nucleotídicas são complementares entre si. As primeira e segunda sequências nucleotídicas podem estar conectadas dentro de uma molécula de RNA por uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode constituir parte da primeira sequência nucleotídica ou da segunda sequência nucleotídica. A expressão de uma molécula de RNA que compreende as primeira e segunda sequências nucleotídicas pode levar à formação de uma molécula de dsRNA da presente invenção, pelo pareamento da bases específico das primeira e segunda sequências nucleotídicas. A primeira sequência nucleotídi-ca ou a segunda sequência nucleotídica podem ser substancialmente idênticas a uma sequência de ácidos nucleicos nativo a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um gene alvo ou sequência não codificante transcrita), um derivado desta ou sequência complementar a esta.

[00147] As moléculas de ácidos nucleicos de dsRNA compreendem fitas duplas de sequências de ribonucleotídeo polimerizadas e podem incluir modificações no esqueleto fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. As modificações na estrutura de RNA podem ser adaptadas para permitir inibição específica. Em uma modalidade, moléculas de dsRNA podem ser modificadas por meio de um processo enzimático ubíquo para que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RN Ase III, como DICER em eucariotos, in vitro ou in vivo. Ver Elbashir et ai. (2001) Nature 411:494-498; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286 (5441):950-952. DICER ou enzimas RNAse III funcionalmente equivalentes clivam maiores fitas das moléculas de dsRNA e/ou hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada uma das quais tem tipicamente aproximadamente 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas têm 2 a 3 ressaltos nucleotídicos 3’, e fosfato 5’ e terminais hidroxilas 3’. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RNAse III são desenroladas e separadas em RNA de fita simples na célula. As moléculas de siRNA então especificamente se hibridizam com sequências de RNA transcritas de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são posteriormente degradadas por um mecanismo celular inerente que degrada RNA. Este processo pode resultar na degradação eficaz ou na remoção da sequência de RNA codificada pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é silencia-mento pós-transcricional do gene alvo. Em algumas modalidades, moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAse III endógenas de moléculas de ácidos nucleicos heterólogas podem mediar eficientemente a regulação para baixo de genes alvo em praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00148] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir pelo menos uma sequência nucleotídica que não ocorre naturalmente que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de fita simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo pela hibridização intermolecular. Tais sequências dsRNA tipicamente automontam-se e podem ser fornecidas na fonte de nutrição de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para alcançar a inibição pós-transcricional de um gene alvo. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender duas sequências nucleotídicas diferentes de ocorrência não natural, cada uma das quais é especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Quando tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes na praga de coleópteros e/ou hemípteros.

C. OBTENÇÃO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

[00149] Uma variedade de sequências nativas em praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada como sequências alvo para o desenho de moléculas de ácidos nucleicos da invenção, como moléculas de iRNAs e DNA que codificam iRNAs. A seleção de sequências nativas não é, entretanto, um processo franco. Somente um pequeno número de sequências nativas na praga de coleópteros e/ou hemípteros serão alvos eficazes. Por exemplo, não pode ser predito com cer- teza se uma sequência nativa particular pode ser efetivamente regulada para baixo por moléculas de ácidos nucleicos da invenção, ou se a regulação para baixo de uma sequência nativa particular terá um efeito negativo sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga de coleópteros e/ou hemípteros. A grande maioria das sequências nativas da praga de coleópteros e/ou hemípteros, como ESTs isolados destas (por exemplo, como listados na patente U.S. No. 7.612.194 e Patente U.S. No. 7.943.819), não tem um efeito negativo sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga de coleópteros e/ou hemípteros, como WCR, NCR, Meligethes aeneus, Euschistus heros, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Acrosternum hilare e Euschistus servus.

[00150] Nem é predizível qual das sequências nativas que podem ter um efeito negativo sobre uma praga de coleópteros e/ou hemípteros são capazes de serem usadas em técnicas recombinantes para expressar moléculas de ácidos nucleicos complementares a tais sequências nativas em uma planta hospedeira e fornecer o efeito negativo sobre a praga de coleópteros e/ou hemípteros para alimentar sem causar dano à planta hospedeira.

[00151] Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos da invenção (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros) são selecionadas para sequências de cDNA alvo que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para a sobrevivência da praga de coleópteros e/ou hemípteros, como sequências de aminoáci-dos envolvidas em vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão, reconhecimento da planta hospedeira, e similares. Como descrito neste pedido, a ingestão de composições por um organismo alvo que contém um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento dos quais é especifica- mente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo da praga alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Uma sequência nu-cleotídica, DNA ou RNA, derivada de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada para construir células vegetais resistentes à infestação pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. A planta hospedeira da praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das sequências nucleotídicas derivadas da praga de coleópteros e/ou hemípteros fornecidas neste pedido. A sequência nu-cleotídica transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se formam em uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, dessa forma pondo o dsRNA à disposição se/quando a praga de coleópteros e/ou hemípteros formarem uma relação nutritiva com o hospedeiro transgê-nico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga de coleópteros e/ou hemípteros, e enfim morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

[00152] Dessa forma, em algumas modalidades, um gene é direcionado que está essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Outros genes alvo para o uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes na viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, infectivida-de, estabelecimento de sítios de alimentação e reprodução da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Um gene alvo, por isso, pode ser um gene acessório ou um fator de transcrição. Adicionalmente, uma sequência nucleotídica nativa da praga de coleópteros e/ou hemípteros para o uso na presente invenção também pode ser derivada de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de um gene vegetal, viral, bac- teriano ou de inseto, a função do qual é conhecida por aqueles especialistas na técnica, e a sequência nucleotídica do qual é especificamente hibridizável com um gene alvo no genoma da praga alvo de co-leópteros e/ou hemípteros. Os métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência nucleotídica conhecida por hibri-dização são conhecidos por aqueles especialistas na técnica.

[00153] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para obter uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA). Uma tal modalidade compreende: (a) análise de um ou mais genes alvo para sua expressão, função e fenótipo sobre a supressão gênica mediada por dsRNA em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros; (b) investigação de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo toda ou uma porção de uma sequência nucleotídica ou um homólogo desta de uma praga alvo de coleópteros e/ou hemípteros que exibe um crescimento alterado (por exemplo, reduzido) ou fenótipo de desenvolvimento em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificação de um clone de DNA que especificamente se hibridiza com a sonda; (d) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciamento do fragmento de cDNA ou gDNA compreendendo o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende toda ou uma porção substancial da sequência de RNA ou um homólogo desta; e (f) síntese química de toda ou uma porção substancial de uma sequência gênica, ou um siRNA, ou shRNA, ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00154] Em modalidades adicionais, um método para obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica para produzir uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) inclui: (a) síntese dos primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos especificamente complementares a uma porção de uma sequência nu-cleotídica nativa de uma praga alvo de coleópteros e/ou hemípteros; e (b) amplificação de um inserto de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando os primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA ou miRNA ou shRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00155] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser isolados, amplificados ou produzidos por diversas abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) pode ser obtida pela amplificação por PCR de uma sequência de ácidos nucleicos alvo (por exemplo, um gene alvo ou uma sequência não codificante alvo transcrita) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA ou porções desta. DNA ou RNA podem ser extraídos de um organismo alvo, e as bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas deste usando métodos conhecidos pelos especialistas ordinários na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas de um organismo alvo podem ser usadas para amplificação por PCR e se-quenciamento de genes alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser usado como um molde para a transcrição in vitro para gerar RNA antissentido e sentido com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácidos nucleicos podem ser sintetizadas por qualquer uma de diversos técnicas (Ver, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nu-cleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo uso de um sintetizador de DNA automatizado (por exemplo, P. E. Biosystems, Inc. (Foster City, Califórnia) Sintetizador de DNA / RNA modelo 392 ou 394), usando químicas padrão, como química de fosforamidita. Ver, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S.

Nos. 4.415.732, 4.458.066, 4.725.677, 4.973.679 e 4.980.460. As químicas alternativas que resultam em grupos de esqueletos não naturais, como fosforotioato, fosforamidato, e similares, também podem ser empregadas.

[00156] A molécula de RNA, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por um especialista na técnica por meio de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, ou hpRNA. RNA também pode ser produzido pela síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática in vitro ou orgânica. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polime-rase de bacteriófago (por exemplo, RNA polimerase de T3, RNA polimerase de T7 e RNA polimerase de SP6). Construtos de expressão úteis para clonagem e expressão de sequências nucleotídicas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.593.874, 5.693.512, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas de uma mistura pela extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação destas. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser usadas sem um mínimo da purificação, por exemplo, para evitar perdas devido ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para o armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o anelamento e/ou a estabilização das fitas dúplexes da molécula de dsRNA.

[00157] Em certas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma fita de RNA autocomplementar única ou de duas fitas de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição de uma ou duas fitas de RNA in vivo, ou a RNA polimerase clonada pode ser usada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser direcionada aos hospedeiros pela transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo celular do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico para o tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que é responsivo à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou transcrição de engenharia em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico para o estágio de desenvolvimento). As fitas de RNA que formam uma molécula de dsRNA, se transcrita in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadeniladas, e podem ou não serem capazes de ser traduzidas para um polipeptídeo pelo aparelho de tradução de uma célula.

D. VETORES RECOMBINANTES E TRANSFORMAÇÃO DA CÉLULA HOSPEDEIRA

[00158] Em algumas modalidades, a invenção também fornece uma molécula de DNA para a introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende uma sequência nucleotídica que, de acordo com a expressão para o RNA e ingestão por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, alcança a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Dessa forma, algumas modalidades fornecem uma molécula de ácido nudeico recombinante compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) em uma célula vegetal para inibir a expressão gênica alvo em uma praga de co-leópteros e/ou hemípteros. A fim de iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácidos nucleicos recombinantes podem compreender uma ou mais sequências reguladoras, sequências reguladoras as quais podem ser operacionalmente ligadas à sequência de ácidos nucleicos capaz de ser expressa como um iRNA. Os métodos para expressar uma molécula de supressão gênica em plantas são conhecidos e podem ser usados para expressar uma sequência nucleotídica da presente invenção. Ver, por exemplo, Publicação PCT Internacional No. WO06/073727; e Publicação de Patente U.S. No. 2006/0200878 Al).

[00159] Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão do gene(s) alvo endógeno em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros mediante a ingestão. Em muitas modalidades, RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura em grampo e haste e alça.

[00160] Nestas modalidades e adicionais, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada pela transcrição de uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga a uma sequência nucleotídica consistindo na SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotí-deos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1.

[00161] Em outras modalidades, uma fita de uma molécula de dsR-NA pode ser formada pela transcrição de uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga a uma sequência nucleotídica consistindo na SEQ ID NO:115; o complemento da SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:115; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:115; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 115; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 115; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 19 nucleotí-deos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 115; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 115.

[00162] Nestas modalidades e adicionais, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada pela transcrição de uma sequência nu-cleotídica que é substancialmente homóloga a uma sequência nucleo-tídica consistindo na SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133.

[00163] Em modalidades particulares, uma molécula de DNA re-combinante que codifica uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos dois segmentos de sequência nucleotídica dentro de uma sequência transcrita, tais sequências arranjadas tal que a sequência transcrita compreende um primeiro segmento de sequência nucleotídi-ca de certo modo orientação, e um segundo segmento de sequência nucleotídica (compreendendo o complemento do primeiro segmento da sequência nucleotídica) está em uma orientação antissentido, em relação a pelo menos um promotor, em que o segmento de sequência nucleotídica sentido e o segmento de sequência nucleotídica antissentido estão ligados ou conectados por um segmento de sequência es-paçadora de aproximadamente cinco (-5) a aproximadamente mil (-1000) nucleotídeos. O segmento de sequência espaçadora pode formar uma alça entre os segmentos de sequência antissentido e sentido. O segmento de sequência nucleotídica sentido ou o segmento de sequência nucleotídica antissentido podem ser substancialmente homólogos à sequência nucleotídica de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133) ou fragmento desta. Em algumas modalidades, entretanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar uma molécula de dsRNA sem uma sequência espaçadora. Em modalidades, uma sequência codificante sentido e uma sequência codifican-te antissentido podem ter comprimentos diferentes.

[00164] As sequências identificadas como tendo um efeito deletério sobre a praga de coleópteros e/ou hemípteros ou um efeito protetor para a planta quanto à praga de coleópteros e/ou hemípteros podem ser prontamente incorporadas em moléculas de dsRNA expressas por meio da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais sequências podem ser expressas como um grampo com estrutura de haste e alça tomando um primeiro segmento correspondendo a uma sequência gênica alvo (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131, ou SEQ ID NO:133 e fragmentos destas); ligando esta sequência a uma segunda região de espaçador de segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando esta a um terceiro segmento, em que pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal construto forma uma estrutura de haste e alça pelo parea-mento intramolecular de bases do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça forma e compreende o segundo segmento. Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 2002/0048814 e 2003/0018993; e a Publicação PCT Internacional No. W094/01550 e W098/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de fita dupla como uma estrutura haste-alça (por exemplo, grampo), pela qual a produção do siRNA alvo para uma sequência nativa de praga de coleópteros e/ou hemípteros é aumentada pela coexpressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo, em um cassete exprimível vegetal adicional, que leva à produção de siRNA aumentada ou reduz a metilação para evitar que o silenciamento transcricional do gene do promotor em grampo de dsRNA.

[00165] As modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para alcançar níveis inibitórios de expressão da praga de coleópteros e/ou hemípteros de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante, por exemplo, pode ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou um circular fechado. O sistema de vetores pode ser um vetor único ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. As sequências de ácidos nucleicos da invenção, por exemplo, podem ser apropriadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para controlar a expressão de uma sequência codificante ligada ou outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para esta finalidade, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira particular com a qual é compatível.

[00166] Para transmitir resistência à praga de coleópteros e/ou he-mípteros a uma planta transgênica, o DNA recombinante, por exemplo, pode ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou dos fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga e especificamente hibridizável a uma sequência nucleotídica transcrita correspondente dentro de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que pode causar danos às espécies de plantas hospedeiras. A praga de coleópteros e/ou hemípteros pode entrar em contato com a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, ingerindo células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Dessa forma, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros que infesta a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene alvo na praga alvo de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar na planta que é resistente ao ataque pela praga.

[00167] A fim de permitir a entrega de moléculas de iRNA a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros em uma relação nutritiva com uma célula vegetal que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, a expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula vegetal é requerida. Dessa forma, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência nucleotídica da invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras, como uma sequência de promotor hete-róloga que atua em uma célula hospedeira, como uma célula bacteria-na em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.

[00168] Promotores adequados para o uso em moléculas de ácidos nucleicos da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos, ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes que descrevem tais promotores inclui as Patentes U.S. Nos. 6.437.217 (promotor RS81 de milho); 5.641.876 (promotor de actina de arroz); 6.426.446 (promotor RS324 de milho); 6.429.362 (promotor PR-1 de milho); 6.232.526 (promotor A3 de milho); 6.177.611 (promotores de milho constitutivos); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S de CaMV); 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de milho); 6.429.357 (promotor 2 de actina de arroz e íntron 2 de actina de arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor gama-coixina); e Publicação da Patente U.S. No. 2009/757.089 (promotor de aldolase de cloroplasto de milho). Promotores adicionais incluem promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (16):5745-5749) e promotores de octopina sintase (OCS) (que são transportados em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); promotores de cau-limovírus como o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) promotor 19S (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324); promotor 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; promotor 35S do vírus de mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (19):6624-6628); promotor de sacarose sintase (Yang e Rus-sell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-4148); promotor de complexo gênico R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183); promotor do gene da proteína de ligação da clorofila a/b; 35S de CaMV (Patentes U.S. Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); 35S de FMV (Patentes U.S. Nos. 5.378.619 e 6.051.753); um promotor PC1SV (Patente U.S. No. 5.850.019); promotor SCP1 (Patente U.S. No. 6.677.503); e promotores de AGRtu.nos (No. de Ac-cesso GenBank® V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187).

[00169] Em modalidades particulares, as moléculas de ácidos nu-cleicos da invenção compreendem um promotor específico para o tecido, como um promotor específico para a raiz. Os promotores específicos para a raiz controlam a expressão de sequências codificantes operacionalmente ligadas exclusivamente ou preferencialmente no tecido da raiz. Exemplos de promotores específicos para a raiz são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, uma sequência nucleotídica ou o fragmento de controle de praga de coleópteros e/ou hemípteros de acordo com a invenção podem ser clonados entre dois promotores específicos para a raiz orientados em direções transcricionais opostas quanto à sequência nucleotídica ou fragmento, e que são operáveis em uma célula vegetal transgênica e expressos nesta para produzir moléculas de RNA na célula vegetal transgênica que posteriormente pode formar moléculas de dsRNA, como descrito, supra. As moléculas de iRNA expressas em tecidos vegetais podem ser ingeridas por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para que a supressão da expressão gênica alvo seja alcançada.

[00170] As sequências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmente operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nuclei-co de interesse incluem 5’UTRs que atuam como uma sequência líder de tradução localizada entre uma sequência de promotor e uma sequência codificante. A sequência líder de tradução está presente no mRNA totalmente processado, e pode afetar o processamento do transcrito primário e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líder de tradução incluem líderes de proteínas de choque térmico do milho e petúnia (Patente U.S. No. 5.362.865), líderes de proteína de revestimento de vírus vegetais, líderes de rubisco vegetal e outros. Ver, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3 (3):225-36. Exemplos não limitantes de 5’UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. No. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. No. 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (No. de Acesso GenBank® V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00171] Outras sequências reguladoras que podem ser opcionalmente operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem sequências não traduzidas 3’, regiões de terminação de transcrição 3’ ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência nucleotí-dica e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar o processamento ou a transcrição do mRNA. O sinal de poliadenilação atua em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3’ do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes vegetais, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3’ é a região 3’ de nopalina sintase (nos 3’; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não traduzidas 3’ diferentes é fornecido em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um do gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps. RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (No. de Acesso GenBank® E01312).

[00172] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação vegetal compreendendo uma molécula de DNA isolada e purificada que compreende pelo menos uma das sequências reguladoras descritas acima ligadas operacionalmente a uma ou mais sequências nucleotídicas da presente invenção. Quando expressas, uma ou mais sequências nucleotídicas resultam em uma ou mais moléculas de RNA compreendendo uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Dessa forma, a sequên-cia(s) de nucleotídeos pode compreender um segmento que codifica toda ou parte de uma sequência de ribonucleotídeos presente dentro de um transcrito de RNA direcionado da praga de coleópteros e/ou hemípteros, e pode compreender repetições invertidas de toda ou uma parte de um transcrito direcionado da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Um vetor de transformação vegetal pode conter sequências especificamente complementares a mais de uma sequência alvo, dessa forma permitindo a produção de mais de um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies alvo praga de coleópteros e/ou hemípteros. Os segmentos da sequência nucleotídica especificamente complementar às sequências nucleotídicas presentes em genes diferentes podem ser combinados em uma molécula de ácido nucleico composta única para a expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem estar contíguos ou separados por uma sequência espaçadora.

[00173] Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção que já contém pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial da sequên-cia(s) de nucleotídeo adicional no mesmo plasmídeo, em que a se-quência(s) de nucleotídeo adicional é operacionalmente ligada aos mesmos elementos reguladores que a original pelo menos uma se-quência(s) de nucleotídeo. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser projetada para a inibição de múltiplos genes alvo. Em algumas modalidades, múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos das mesmas espécies de pragas de coleópteros e/ou hemípteros, que podem aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas de coleópteros e/ou hemípteros, que podem ampliar a faixa de pragas de coleópteros e/ou hemípteros contra a qual o agente(s) é eficaz. Quando múltiplos genes são visados para supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser produzido.

[00174] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou o vetor da presente invenção podem compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável a uma célula transformada, como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar para plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar a resistência a biocidas, resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, hi-gromicina, etc.), ou resistência a herbicidas (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a: um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para usar canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica resistência a bialafos; um gene de EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene de nitriiase que confere resistência a bromoxinil; um gene mutante de acetolactato sintase (ALS) que confere resistência à sulfonilureia ou imidazoiinona; e um gene de DHFR resistente a metotrexato. Múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis que conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estrep-tomicina e tetraciclina, e similares. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[00175] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou o vetor da presente invenção também podem incluir um marcador rastreável. Marcadores rastreáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Marcadores rastreáveis exemplares incluem um gene de β-glicuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima pela qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene do locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj ailele by transposon tagging with Ac." Em 18th Stadler Genetics Svmposium, P. Gustafson e R. Appels, eds. (New York: Ple-num), páginas 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima pela qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luci-ferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al. (1983) Gene 46 (2-3):247-55); um gene de amila-se (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina à DOPA e dopaqui-nona que por sua vez se condensa à melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.

[00176] Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nuclei-cos recombinantes, como descrito, supra, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem suscetibilidade reduzida à praga de coleópteros e/ou he-mípteros. Vetores de transformação vegetal podem ser preparados, por exemplo, inserindo moléculas de ácidos nucleicos que codificam moléculas de iRNA em vetores de transformação vegetal e introduzem estes em plantas.

[00177] Métodos adequados para transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como pela transformação de protoplastos (Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.508.184), pela absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Ver, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), pela eletroporação (Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.384.253), pela agitação com fibras de carboneto de silício (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.302.523 e 5.464.765), por transformação mediada por Agrobacterium (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; e 6.384.301) e pela aceleração de partículas recobertas de DNA (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para transformar o milho são descritas, por exemplo, nas patente U.S. Nos. 5.591.616, 7.060.876 e 7.939.3281. Pela aplicação de técnicas como estas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, o DNA transformante está integrado no genoma da célula hospedeira. Em caso de espécies mul-ticelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma destas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00178] O método mais largamente utilizado para introduzir um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de várias espécies Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizo-genes são bactérias de solo patogênicas vegetais que geneticamente transformam células vegetais. Os plasmídeos de Ri e Ti de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, transportam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indutores de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo de Ti, região de Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é limitada pelas repetições terminais. Em vetores binários modificados, genes indutores de tumor foram deletados, e as funções da região de Vir são utilizadas para transferir DNA estranho limitado pelas sequências de borda de T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para recuperação eficiente de células transgênicas e plantas e múltiplo sítio de clonagem para inserir sequências da transferência como um ácido nucleico que codifica dsRNA.

[00179] Dessa forma, em algumas modalidades, um vetor de transformação vegetal é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e Patente Européia No. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação vegetais adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, os descritos por Her- rera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Natu-re 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e os derivados de qualquer um dos precedentes. Outras bactérias como Sinorhizobium, Rhizobium e Me-sorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência gênica para diversas plantas. Estas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser tornadas competentes para a transferência gênica pela aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado como de um vetor binário adequado.

[00180] Após fornecer DNA exógeno a células recipientes, as células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração vegetal. A fim de melhorar a capacidade de identificar as células transformadas, pode-se desejar empregar um gene do marcador selecionável ou rastreável, como anteriormente apresentado, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é usado, as células transformadas são identificadas dentro da população celular potencialmente transformada expondo as células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador rastreável é usado, as células podem ser rastreadas para o traço gênico do marcador desejado.

[00181] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou células que foram marcadas positivas em um ensaio de rastrea-mento, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado pela inclusão de substâncias adicionais, como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniciar esforços de regeneração vegetal, ou após ciclos repetidos de seleção manual, até que a morfoiogia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, tipicamente aproximadamente 2 semanas), em seguida transferido para meios conducentes para formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que a formação de brotos suficiente tenha ocorrido. Uma vez que os brotos estejam formados, são transferidos para meios conducentes para enraizar a formação. Uma vez que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento adicional e maturação.

[00182] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nu-cleico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA que codifica uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão gênica alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros) nas plantas de regeneração, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, como Southern e northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, como detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou imunoblots) ou por função enzimática; ensaios de partes vegetais, como ensaios de folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

[00183] Os eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, pela utilização de amplificação por PCR, por exemplo, inicia-dores oligonucleotídicos específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. Entende-se que a genotipagem de PCR inclui, mas não é limitada à amplificação da reação de polimerase em cadeia (PCR) de DNA genômico derivado do tecido de calo da planta hospedeira isolado predito para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrado no genoma, seguido de clonagem padrão e análise de sequência de produtos de amplificação por PCR. Os métodos da genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e pode ser aplicado a DNA genômico derivado de qualquer espécie de plantas (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas de células.

[00184] Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma sequência de DNA recombinante única inserida em um cromossomo. A sequência de DNA recombinante única é referida como um "evento transgênico" ou "evento de integração." Tais plantas transgênicas são hemizigotas da sequência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota com respeito a um transgene pode ser obtida acasalando sexualmente (autopolinização) uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência gê-nica exógena única, por exemplo, uma planta T0, para produzir a semente T-ι. Um quarto da semente T-ι produzida será homozigota com respeito ao transgene. A germinação da semente TΛ resulta em plantas que podem ser testadas para a heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite distinção entre heterozigotas e homozigotas (isto é, um ensaio de zi-gosidade).

[00185] Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes que têm um efeito inibi-tório de praga de coleópteros e/ou hemípteros são produzidas em uma célula vegetal. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas de múltiplas sequências de ácidos nu-cleicos introduzidas em eventos de transformação diferentes, ou de uma sequência de ácidos nucleicos única introduzida em um evento de transformação único. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob controle de um promotor único. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob controle de múltiplos promotores. As moléculas de iRNA únicas podem ser expressas compreendendo múltiplas sequências de ácidos nucleicos que são cada uma homóloga a loci diferentes dentro de uma ou mais pragas de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, o locus definido pela SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133), tanto em populações diferentes das mesmas espécies de praga de coleópteros e/ou hemípteros, como em espécies diferentes de praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00186] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma primeira planta que tem pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem vegetal que é acessível à transformação para produzir uma planta transgênica, planta transgênica a qual pode ser cruzada com uma segunda linhagem vegetal para introgressão da sequência nucleotídica que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem vegetal.

[00187] A invenção também inclui produtos básicos que contêm uma ou mais das sequências da presente invenção. As modalidades particulares incluem produtos básicos produzidos de uma planta recombinante ou semente que contém uma ou mais das sequências nu-cleotídicas da presente invenção. Um produto básico que contém uma ou mais das sequências da presente invenção é destinado a incluir, mas não ser limitado a farinhas, óleos, grãos esmagados ou inteiros ou sementes de uma planta, ou qualquer alimento ou produto de forragem que compreende qualquer farinha, óleo ou grão triturado ou inteiro de uma planta recombinante ou semente que contém uma ou mais das sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em um ou mais produtos bási- cos contemplados neste pedido é evidência do fato de que o produto básico é produzido de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das sequências nucleotídicas da presente invenção para fins de controlar pragas vegetais de coleópteros e/ou hemípteros usando métodos de supressão gênica mediada por dsRNA.

[00188] Em alguns aspectos, as sementes e os produtos básicos produzidos por plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas estão incluídos, em que as sementes ou os produtos básicos compreendem uma quantidade detectável de uma sequência de ácidos nucleicos da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos básicos podem ser produzidos, por exemplo, obtendo plantas transgênicas e preparando alimento ou ração deles. Os produtos básicos que compreendem uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: farinhas, óleos, grãos esmagados ou inteiros ou sementes de uma planta, e qualquer produto alimentício que compreende qualquer farinha, óleo ou grão triturado ou inteiro de uma planta recombinante ou semente que compreende uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos da invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da invenção em um ou mais produtos básicos é evidência do fato de que o produto básico é produzido de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para fins de controle da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00189] Em algumas modalidades, uma planta transgênica ou semente que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico no seu genoma, incluindo sem limitação: um evento transgênico do qual é transcrito uma molécula de iRNA que visa um locus em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros exceto aquele definido pela SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133, tal como, por exemplo, um ou mais loci selecionados a partir do grupo consistindo em Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), e RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730); um evento transgênico do qual é transcrito uma molécula de iRNA que visa um gene em um organismo exceto uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um nematoide parasíti-co vegetal); um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, tal como, por exemplo, Cry34Ab1 (Pat. U.S. Nos. 6.127.180, 6.340.593 e 6.624.145), Cry35Ab1 (Pat. U.S. Nos. 6.083.499, 6.340.593 e 6.548.291), uma combinação "Cry34/35Ab1" em um evento único (por exemplo, evento de milho DAS-59122-7; Pat. U.S. No. 7.323.556), Cry3A (por exemplo, Pat. U.S. No. 7.230.167), Cry3B (por exemplo, Patente U.S. No. 8.101.826), Cry6A (por exemplo, Pat. U.S. No. 6.831.062), e combinações destas (por exemplo, Pedido de Patente U.S. No. 2013/0167268, 2013/0167269 e 2013/0180016); um gene de tolerância a herbicidas (por exemplo, um gene fornecendo tolerância a glifosato, glufosinato, dicamba ou 2,4-D (por exemplo, Pat. U.S. No. 7.838.733)); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica, como rendimento aumentado, metabolismo alterado de ácido graxo ou restauração da esterilidade masculina citoplas-mática). Em modalidades particulares, as sequências que codificam as moléculas de iRNA da invenção podem ser combinadas com outro controle de insetos ou com traços de resistência a doenças em uma planta para alcançar traços desejados de controle aumentado de dano de insetos e doença vegetal. Combinar traços de controle inseto que empregam modos de ação distintos pode fornecer plantas transgêni-cas protegidas com durabilidade superior sobre plantas que abrigam um traço de controle único, por exemplo, por causa da probabilidade reduzida que a resistência ao traço(s) se desenvolva no campo.

V. SUPRESSÃO DO GENE ALVO EM UMA PRAGA DE COLEQPTE-ROS E/OU HEMÍPTERQS A. VISÃO GERAL

[00190] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a molécula de ácido nucleico leva ao silenciamen-to do gene mediado por RNAi na praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) pode ser fornecida à praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros colocando em contato a molécula de ácido nucleico com a praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida em um substrato alimentício da praga de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo, uma composição nutritiva. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle da praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida pela ingestão do material vegetal que compreende a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente no material vegetal pela expressão de uma sequência de ácidos nucleicos recombinante introduzida no material vegetal, por exemplo, pela transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo a sequência de ácidos nucleicos recombinante e a regeneração de um material vegetal ou planta inteira da célula vegetal transformada.

B. SUPRESSÃO DO GENE ALVO MEDIADA POR RNAI

[00191] Em modalidades, a invenção fornece moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que podem ser projetadas para sequências nucleotídicas nativas essenciais alvo (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, WCR, NCR, Meligethes aeneus, Euschistus heros, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Acrosternum hilare e Euschistus servus), por exemplo, projetando uma molécula de iRNA compreendendo pelo menos uma fita compreendendo uma sequência nucleotídica que é especificamente complementar à sequência alvo. A sequência de tal molécula de iRNA projetada pode ser idêntica à sequência alvo ou pode incorporar incompatibilidades que não previnem a hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência alvo.

[00192] As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para a supressão gênica em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, por meio disso reduzindo o nível ou a incidência do dano causado pela praga em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Como usado neste pedido, o termo "supressão gênica" refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para reduzir os níveis da proteína produzida em consequência da transcrição gênica para mRNA e tradução subsequente do mRNA, incluindo a redução da expressão pro-teica de um gene ou uma sequência codificante incluindo a inibição pós-transcricional da expressão e supressão transcricional. A inibição pós-transcricional é mediada pela homologia específica entre todo ou uma parte de um mRNA transcrito de um gene direcionado para a supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para a supressão. Adicionalmente, a inibição pós-transcricional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade do mRNA disponível na célula para ligação por ribossomos.

[00193] Em algumas modalidades, onde uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de fita dupla gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de fita simples; a "fita passageira" e a "fita guia." A fita passageira pode ser degradada, e a fita guia pode ser incorporada no RISC. A inibição pós-transcricional ocorre por hibridiza-ção específica da fita guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA e divagem subsequente pela enzima, Argonauta (componente catalítico do complexo RISC).

[00194] Em outras modalidades da invenção, qualquer forma da molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles especialistas na técnica entenderão que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis do que são moléculas de RNA de fita simples, durante a preparação e durante a etapa de fornecimento da molécula de iRNA a uma célula, e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Dessa forma, enquanto moléculas de siRNA e de miRNA, por exemplo, podem ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilidade.

[00195] Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nu-cleico é fornecida compreendendo uma sequência nucleotídica, sequência nucleotídica a qual pode ser expressa in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma mo- lécula de ácido nucleico codificada por uma sequência nucleotídica dentro do genoma de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura haste-alça. Após uma praga de coleópteros e/ou hemípteros entrar em contato com a molécula de iRNA transcrita in vitro, a inibição pós-transcricional de um gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

[00196] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência nucleotídica é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nu-cleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% e 100%) com qualquer um dos precedentes pode ser usada. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente se hibridiza a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00197] Em certas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência nucleotídica é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros, em que a sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO:115; o complemento da SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:115; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:115; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero SEQ ID NO:115; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 115; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 115; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 115; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 115; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 115. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nu-cleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% e 100%) com qualquer um dos precedentes pode ser usado. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente se hibridiza a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de coleópte-ros.

[00198] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência nucleotídica é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; uma sequência codificante nativa de um organismo Meli-gethes (por exemplo, EPB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes (por exemplo, EPB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% e 100%) com qualquer uma das precedentes pode ser usada. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente se hibridiza a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00199] Em outras modalidades, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotí-deos contíguos de uma sequência nucleotídica pode ser usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 19 nu-cleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:1; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; uma sequência não codi-ficante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 19 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% e 100%) com qualquer uma das precedentes pode ser usada. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente se hibridiza a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos particulares, tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:1.

[00200] Em modalidades particulares, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência nucleotídica pode ser usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros, em que a sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO:115; o complemento da SEQ ID NO: 115; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:115; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 115; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 115; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 115; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:115; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:115; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 115. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nu-cleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% e 100%) com qualquer uma das precedentes pode ser usada.

Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente se hibridiza a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de coleópte-ros. Em exemplos particulares, tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:115.

[00201] Em outras modalidades, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotí-deos contíguos de uma sequência nucleotídica pode ser usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo da: SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; uma sequência codificante nativa de um organismo Meli-gethes (por exemplo, EPB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124 ou SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO: 133; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes (por exemplo, EPB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes (por exemplo, EPB) compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Meligethes compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Meligethes que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% e 100%) com qual- quer uma das precedentes pode ser usada. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente se hibridiza a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos particulares, tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133.

[00202] É um atributo importante de algumas modalidades da invenção que o sistema de inibição pós-transcricional RNAi é capaz de tolerar variações de sequência entre genes alvo que poderíam ser esperados devido a mutação genética, polimorfismo da cepa ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucleico introduzida não precisaria ser absolutamente homóloga a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hi-bridizável a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida não precisaria ser inteira, quanto a um produto de transcrição primário ou quanto a um mRNA totalmente processado do gene alvo.

[00203] A inibição de um gene alvo usando a tecnologia iRNA da presente invenção é específica para a sequência; isto é, as sequências nucleotídicas substancialmente homólogas à molécula (s) iRNA são visadas para a inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA que compreende uma sequência nucleotídica idêntica a uma porção de uma sequência gênica alvo pode ser usada para a inibição. Nestas modalidades e adicionais, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência nucleotídica com um ou mais de inserção, deleção e/ou mutações pontuais quanto a uma sequência gê- nica alvo podem ser usadas. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene alvo podem compartilhar, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos de aproximadamente 80%, pelo menos de aproximadamente 81%, pelo menos de aproximadamente 82%, pelo menos de aproximadamente 83%, pelo menos de aproximadamente 84%, pelo menos de aproximadamente 85%, pelo menos de aproximadamente 86%, pelo menos de aproximadamente 87%, pelo menos de aproximadamente 88%, pelo menos de aproximadamente 89%, pelo menos de aproximadamente 90%, pelo menos de aproximadamente 91%, pelo menos de aproximadamente 92%, pelo menos de aproximadamente 93%, pelo menos de aproximadamente 94%, pelo menos de aproximadamente 95%, pelo menos de aproximadamente 96%, pelo menos de aproximadamente 97%, pelo menos de aproximadamente 98%, pelo menos de aproximadamente 99%, pelo menos de aproximadamente 100%, e 100%. Alternativamente, a região dúplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de um transcrito gênico alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência de comprimento menos completa que exibe uma maior homologia compensa uma sequência mais longa, menos homóloga. O comprimento da sequência nucleotídica de uma região dúplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um transcrito gênico alvo pode ter pelo menos aproximadamente 15, 16, 7, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos aproximadamente 1.000 bases. Em algumas modalidades, uma sequência maior do que 15 a 100 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência maior do que aproximadamente 200 a 300 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência maior do que aproximadamente 500 a 1.000 nucleotídeos pode ser usada, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00204] Em certas modalidades, a expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros, tal que uma inibição significativa realize-se. Inibição significativa refere-se à inibição sobre um limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, cessação do crescimento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento, mortalidade induzida, etc.), ou uma redução detectável em RNA e/ou produto gênico que corresponde ao gene alvo que é inibido. Embora em certas modalidades da invenção a inibição ocorra em substancialmente todas as células da praga de coleópteros e/ou hemípteros, em outras modalidades, a inibição somente ocorre em um subconjunto de células que expressam o gene alvo.

[00205] Em algumas modalidades, a supressão transcricional em uma célula é mediada pela presença de uma molécula de dsRNA que exibe identidade de sequência substancial a uma sequência de DNA de promotor ou complemento desta, ao efeito que é referido como "supressão do promotor trans". A supressão gênica pode ser eficaz contra genes alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que pode ingerir ou entrar em contato com tais moléculas de dsRNA, por exemplo, ingerindo ou entrando em contato com o material vegetal que contém as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para o uso na supressão do promotor trans podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da praga de coleópteros e/ou hemípteros. A supressão gênica pós-transcricional pelo RNA com orientação antissentido ou sentido para regular a expressão gênica em células vegetais é descrita nas patente U.S. Nos. 5.107.065, 5.231.020, 5.283.184 e 5.759.829.

C. EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS DE IRNA FORNECIDAS A UMA

PRAGA DE CQLEÓPTERQS E/QU HEMÍPTEROS

[00206] A expressão de moléculas de iRNA para inibição gênica mediada por RNAi em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser realizada em qualquer um de muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA então podem ser fornecidas a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo, colocando em contato as moléculas de iRNA com a praga, ou fazendo a praga ingerir ou incorporar de outra maneira as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiras transformadas de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, células vegetais transformadas e pro-gênie de plantas transformadas. As células vegetais transformadas e as plantas transformadas podem ser engendradas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para fornecer um efeito protetor à praga. Dessa forma, quando uma planta ou célula vegetal transgênica é consumida por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. As sequências nucleotídicas da presente invenção também podem ser introduzidas em uma grande variedade de microorganismos hospedeiros procarióticos e eucarióticos para produzir moléculas de iRNA. O termo "micro-organismo" inclui espécies procarióti-cas e eucarióticas, como bactérias e fungos.

[00207] A modulação da expressão gênica pode incluir a supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para supressão da expressão gênica em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros compreende o fornecimento no tecido do hospedeiro da praga de uma quantidade supressiva para o gene de pelo menos uma molécula de dsRNA formada após transcrição de uma sequência nucleotídica como descrito neste pedido, pelo menos um segmento da qual é complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada como uma molécula de siRNA, shRNA, miRNA, ou hpRNA, ingerida por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros conforme a invenção, pode ser pelo menos de aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100% ou 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133. As moléculas de ácidos nucleicos isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitadas a sequências nucleotídicas de ocorrência não natural e cons-trutos de DNA recombinantes para fornecer moléculas de dsRNA da presente invenção, por isso, são fornecidas, que suprimem ou inibem a expressão de uma sequência codificante endógena ou uma sequência codificante alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros quando introduzidas a esta.

[00208] As modalidades particulares fornecem um sistema de entrega para a entrega de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes alvo em uma praga vegetal de coleópteros e/ou hemípteros e controle de uma população da praga vegetal de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, o sistema de entrega compreende ingestão de uma célula da planta hospedeira transgênica ou conteúdos da célula hospedeira compreenden- do moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas modalidades e adicionais, uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica é criada contendo um construto de DNA recombinante que fornece uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. As células vegetais transgênicas e as plantas transgênicas compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (tecnologias básicas as quais são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação vegetal compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar a célula vegetal transgênica ou planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00209] Para transmitir resistência à praga de coleópteros e/ou he-mípteros a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante, por exemplo, pode ser transcrita em uma molécula de iRNA, como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de shRNA, uma molécula de miRNA ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode ser compreendida na parte de uma sequência nucleotídica que é idêntica a uma sequência nucleotídica correspondente transcrita de uma sequência de DNA dentro de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros do tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros é suprimida pela molécula de dsRNA ingerida e a supressão da expressão do gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros resulta, por exemplo, na cessação da alimentação pela praga de coleóp- teros e/ou hemípteros, com um último resultado sendo, por exemplo, que a planta transgênica é protegida de dano adicional pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. Mostrou-se que os efeitos modulatórios de moléculas de dsRNA são aplicáveis a uma variedade de genes expressos na praga, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis por metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes acessórios; fatores de transcrição; genes relacionados à mudança de pele; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos em metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.

[00210] Para a transcrição de um transgene in vivo ou um construto de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor, poten-cializador, silenciador e sinal de poliadenilação) pode ser usada em algumas modalidades para transcrever a fita de RNA (ou fitas). Por isso, em algumas modalidades, como apresentado supra, uma sequência nucleotídica para o uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de promotor funcionais em uma célula hospedeira vegetal. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. A sequência nucleotídica da presente invenção, sob controle de uma sequência de promotor operacionalmente ligada, pode ser ainda flanqueada de sequências adicionais que vantajosamente afetam sua transcrição e/ou estabilidade de um transcrito resultante. Tais sequências podem ser localizadas a montante do promotor operacionalmente ligado, a jusante da extremidade 3’ do construto de expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor como a jusante da extremidade 3’ do construto de expressão.

[00211] Algumas modalidades fornecem métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho ou de soja) causado por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que se alimenta da planta, em que o método compreende fornecimento na planta hospedeira de uma célula vegetal transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a molécula(s) de ácido nucleico atua para ser ingerida pela praga de co-leópteros e/ou hemípteros para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros, inibição da expressão resultando em mortalidade, crescimento reduzido e/ou reprodução reduzida da praga de coleópteros e/ou hemípteros, por meio disso reduzindo o dano à planta hospedeira causada pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula(s) de ácido nucleico compreende moléculas de dsRNA. Nestas modalidades e adicionais, a molécula(s) de ácido nucleico compreende moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência nucleotídica que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula(s) de ácido nucleico consiste de uma sequência nucleotídica que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00212] Em outras modalidades, um método para aumentar o rendimento de uma colheita de milho ou de soja é fornecido, em que o método compreende a introdução em uma planta de milho ou de soja de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivar a planta de milho ou de soja para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácidos nucleicos, em que a expressão de uma molécula de iRNA que compreende a sequência de ácidos nucleicos inibe o crescimento da praga de coleópteros e/ou hemípteros e/ou dano da praga de coleópteros e/ou hemípteros, por meio disso reduzindo ou eliminando uma perda de rendimento devido a infestação da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas modalidades e adicionais, a molécuia(s) de ácido nucleico compreende moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência nucleotídica que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga de coieóp-teros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula(s) de ácido nucleico consiste de uma sequência nucleotídica que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00213] Em modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros é fornecido, o método compreendendo: transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a sequência nucleotídica é operacionalmente ligada a um promotor e uma sequência de terminação de transcrição; cultura da célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais incluindo uma pluralidade de células vegetais transformadas; seleção de células vegetais transformadas que integraram a molécula de ácido nucleico nos seus genomas; rastreamento das células vegetais transformadas para a expressão de uma molécula de iRNA codificado pela molécula de ácido nucleico integrada; seleção de uma célula vegetal transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentação da célula vegetal transgênica selecionada à praga de coleópteros e/ou hemípteros. As plantas também podem ser regeneradas de células vegetais transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas modalidades e adicionais, a molécula(s) de ácido nucleico compreende moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência nucleotídica que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula(s) de ácido nucleico consiste de uma sequência nucleotídica que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00214] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de plantas (por exemplo, milho ou soja), como um produto da expressão de um gene recombinante incorporado em um genoma das células vegetais, ou incorporaram-se em um revestimento ou tratamento de semente que é aplicado à semente antes da plantação. Considera-se que uma célula vegetal que compreende um gene recombinante é um evento transgênico. Também estão incluídos em modalidades da invenção sistemas de entrega para a entrega de moléculas de iRNA à praga de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Os métodos para introdução podem incluir a mistura direta de iRNA com o tecido vegetal de um hospedeiro da praga de coleópteros e/ou hemípteros, bem como aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção para o tecido vegetal hospedeiro. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser pulverizadas a uma superfície vegetal. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um micro-organismo, e o micro-organismo pode ser aplicado à superfície vegetal ou introduzido em uma raiz ou tronco por um meio físico como uma injeção. Como discutido, supra, uma planta transgênica também pode ser geneticamente engendrada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar a praga de coleópteros e/ou hemípteros conhecida por infestar a planta. As moléculas de iRNA produzidas pela síntese química ou enzimática também podem ser formuladas de uma maneira compatível com práticas agrícolas comuns e usadas como produtos de pulverização para controlar o dano vegetal por uma praga de coleópte-ros e/ou hemípteros. As formulações podem incluir hastes e umidifica-dores apropriados requeridos para cobertura foliar eficiente, bem como protetores de UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de dano por UV. Tais aditivos são comumente usados na indústria de bioinseticidas e são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de pulverização de inseticida (baseadas biologicamente ou de outra maneira) para aumentar a proteção vegetal da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00215] Todas as referências discutidas neste pedido, incluindo publicações, patentes, e pedidos de patentes, citados neste pedido, são fornecidas somente para sua revelação antes da data de depósito do presente pedido de patente. Nada neste pedido deve ser interpretado como uma admissão que os inventores não têm direito a antedatar tal revelação em virtude da invenção prévia.

[00216] Os seguintes EXEMPLOS são fornecido para ilustrar certos atributos e/ou aspectos particulares. Este EXEMPLOS não devem ser interpretados para limitar a revelação aos atributos ou aspectos particulares descritos. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Identificação de Genes Alvo Candidatos [00217] Múltiplos estágios de desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para a geração de transcriptoma agrupada para fornecer sequências gênicas alvo candidatas para o controle da tecnologia de resistência a insetos de plantas transgênicas com RNAi.

[00218] Em uma exemplificação, RNA total foi isolado de larvas de WCR de primeiro-ínstar inteiras de aproximadamente 0,9 gramas; (4 a 5 dias pós-incubação; mantidas a 16Ό), e purificadas usando o seguinte método baseado em fenol/TRI REAGENT® (Molecular Research Center, Cincinnati, OH): [00219] As larvas foram homogeneizadas à temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea fosse obtida. Após 5 min. de incubação à temperatura ambiente, o homogenato foi dispensado em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi energicamente agitada por 15 segundos. Após permitir a extração assentar-se à temperatura ambiente por 10 min, as fases foram separadas por centrifugação em 12.000 x g a 4Ό. A fase superior (compreendendo aproximadamente 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo estéril de 1,5 mL, e um volume igual de isopropanol à temperatura ambiente foi adicionado. Após incubação à temperatura ambiente de 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min em 12.000 x g (4Ό ou 25Ό).

[00220] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, e o precipitado de RNA foi lavado duas vezes por vortexação com etanol 75%, com recuperação pela centrifugação por 5 min em 7.500 x g (4Ό ou 25Ό) após cada lavagem. O etanol foi cui dadosamente removido, o precipitado foi deixado secar ao ar de 3 a 5 min, e em seguida foi dissolvido em água estéril sem nucleases. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorvância (A) em 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de aproximadamente 0,9 gramas de larvas produziu mais de 1 mg de RNA total, com uma proporção A260/A280 de 1,9. O RNA extraído dessa forma foi armazenado a -80Ό a té ser processado adicionalmente.

[00221] A qualidade de RNA foi determinada correndo uma alíquota por gel de agarose 1%. A solução de gel de agarose foi feita usando tampão TAE 10X autoclavado (Tris-acetato EDTA; a concentração 1X é Tris-acetato 0,04 M, EDTA 1 mM (sal de sódio de ácido etilenodia-minotetra-acético), pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato) em um recipiente autoclavado. TAE 1Xfoi usado como o tampão de corrida. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente formador de poços foram limpos com RNase Away® (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Dois pL da amostra de RNA foram misturados com 8 pL do tampão TE (Tris HCI 10 mM pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 μΐ_ de tampão de amostra de RNA (Catálogo Novagen® No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70Ό por 3 min, resfriada à temperatura ambiente, e 5 pL (contendo 1 pg a 2 pg de RNA) foram carregados por poço. Os marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente corridos em poços separados para comparação de tamanho molecular. O gel foi corrido em 60 volts por 2 horas.

[00222] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada do RNA total larval por um fornecedor de serviços comerciais (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL), usando preparação randômica. A biblioteca de cDNA larval normalizada foi sequenciada na escala de 1/2 placa pela química série GS FLX 454 Titanium™ em Eurofins MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 bp. 350.000 leituras foram montadas em mais de 50.000 contigs. Tanto as leituras não montadas como os contigs foram convertidos em bancos de dados BLASTable usando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível no NCBI).

[00223] As bibliotecas de RNA total e de cDNA normalizadas foram similarmente preparados de materiais coletados em outros estágios de desenvolvimento de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupada do rastreamento gênico alvo foi construída combinando membros da biblioteca de cDNA que representam vários estágios de desenvolvimento.

[00224] Os genes candidatos para o direcionamento de RNAi foram selecionados usando a informação quanto aos efeitos letais de RNAi de genes particulares em outros insetos como Drosophila e Hemipte-ran. Supôs-se que estes genes eram essenciais para sobrevivência e crescimento em insetos coleópteros e/ou hemípteros. Os homólogos gênicos alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequência de transcriptoma como descrito abaixo. As sequências inteiras ou parciais dos genes alvo foram amplificadas por PCR para preparar moldes para a produção de RNA de fita dupla (dsRNA).

[00225] As buscas com TBLASTN usando as sequências dodifican-tes da proteína candidata foram executadas contra bancos de dados BLASTable contendo as leituras de sequência de Diabrotica não montadas ou os contigs montados. Os acertos significantes a uma sequência de Diabrotica (definido como melhor do que e'20para a homologias de contigs e melhor do que e'10 para homologias de leituras de sequência não montadas) foram confirmados usando BLASTX contra o banco de dados não redundante de NCBI. Os resultados desta busca com BLASTX confirmaram que as sequências gênicas homólogas candidatas de Diabrotica identificadas na busca com TBLASTN de fato compreenderam genes de Diabrotica ou foram o melhor acerto à sequência gênica candidata presente não Diabrotica nas sequências de Diabrotica. Na maioria dos casos, genes candidatos de Hemipteran que foram observados como codificando uma proteína forneceu uma homologia de sequência inequívoca a uma sequência ou sequências nas sequências de transcriptoma de Diabrotica. Em alguns casos, foi claro que alguns contigs de Diabrotica ou leituras de sequência não montadas selecionadas pela homologia a um gene sobreposto não candidato de Diabrotica, e que a montagem dos contigs não tinha con- seguido juntar estas sobreposições. Naqueles casos, Sequencher® v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml) foi usado para reunir as sequências em contigs mais longos.

[00226] Um gene alvo candidato que codifica rop de Diabrotica (SEQ ID NO:1) foi identificado como um gene que pode levar à mortalidade da praga de coleópteros, inibição do crescimento, inibição do desenvolvimento ou inibição da reprodução em WCR.

Genes com Homoloqia a roo de WCR

[00227] ROP contém um domínio conservado da família Sec1 (pfam00995). É conhecido que as proteínas de família Sec1 estão envolvidas em transmissão sináptica e secreção geral. Outras proteínas de Diabrotica virgifera que também contêm este domínio podem compartilhar propriedades estruturais e/ou funcionais, e dessa forma um gene que codifica uma destas proteínas pode compreender um gene alvo candidato que pode levar à mortalidade da praga de coleópteros, inibição do crescimento, inibição do desenvolvimento ou inibição da reprodução em WCR.

[00228] Em Drosophila melanogaster, genes que codificam Ras e Ras oposto {rop) são divergentemente transcritos de um promotor bidi-recional (Harrison et ai, (1995) Genetics 139:1701-1709). A proteína de ROP de 68 kDa compartilha homologia de sequência com proteínas de Saccharomyces cerevisiae SLT1, SEC1 e SLP1, todas as quais estão envolvidas no tráfego da vesícula entre compartimentos celulares da levedura (Salzberg et al., (1993) Development 117:1309-1319). Ainda, ROP regula a liberação de neurotransmissor de uma maneira dependente da dosagem (Wu et al., (1998) EMBO Journal 17:127-139). Os transgenes de dsRNA de rop podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para fornecer direcionamento de RNAi redundante e efeitos de RNAi sinergísticos. Os eventos de milho transgênico que expressam dsRNA que visa rop são úteis para preve- nir o dano por alimentação da raiz pela lagarta-da-raiz do milho. Os transgenes de dsRNA de rop representam novos modos de ação para combinar com a tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thurin-giensis em pirâmides gênicas de gestão de Resistência a Insetos para mitigar o desenvolvimento de populações de lagarta-da-raiz resistentes a qualquer destas tecnologias de controle da lagarta-da-raiz.

[00229] Os clones inteiros ou parciais de sequências de um gene candidato de Diabrotica, rop, foram usados para gerar amplicons de PCR para a síntese de dsRNA.

[00230] A SEQ ID NO:1 mostra uma sequência de DNA de 4816 bp de rop de Diabrotica.

[00231] A SEQ ID NO:3 mostra uma sequência de DNA de 392 bp da regí de rop.

[00232] A SEQ ID NO:4 mostra uma sequência de DNA de 627 bp da reg2 de rop.

[00233] A SEQ ID NO:114 mostra uma sequência de DNA de 201 bp de rop v3. EXEMPLO 2 Amplificação de Genes Alvo para Produzir dsRNA

[00234] Os iniciadores foram projetados para amplificar porções de regiões codificantes de cada gene alvo por PCR. (Ver a Tabela 1 e as SEQ ID NOs:112 e 113). Onde apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TT AAT ACG ACT C ACT AT AG G GAGA; SEQ ID NO:5) foi incorporado nas extremidades 5’ das fitas antissentido ou sentido amplificadas. Ver a Tabela 1. RNA total foi extraído de WCR, e a primeira fita de cDNA foi usada como molde para reações de PCR usando iniciadores opostos posicionados para amplificar toda ou parte da sequência gênica alvo nativa. O dsRNA também foi amplificado de um clone de DNA compreendendo a região codificante de uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO:6; Shagin et al. (2004) Mol.

Biol. Evol. 21 (5):841-50). TABELA 1. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar porções de regiões codificantes do gene alvo rop exemplar e gene de controle negativo YFP. EXEMPLO 3 ' Construtos de RNAi [00235] Preparação de molde por PCR e síntese de dsRNA. Uma estratégia usada para fornecer moldes específicos para produção de dsRNA de rop e YFP é mostrada na FIG. 1. DNAs de molde destinados para o uso em síntese de dsRNA de rop foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como molde de PCR) a primeira fita de cDNA preparada do RNA total isolado de larvas de WCR do primeiro-ínstar. Para cada região gênica alvo selecionada de rop e YFP, as amplificações de PCR introduziram uma sequência de promotor de T7 nas extremidades 5’ das fitas antissentido e sentido amplificadas (o segmento de YFP foi amplificado de um clone de DNA da região codificante de YFP). Os dois fragmentos amplificados por PCR de cada região dos genes alvo então foram misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIG. 1. As sequências dos moldes de dsRNA amplificados com os pares de inicia-dores particulares foram: SEQ ID NO:3 (regí de rop), SEQ ID NO:4 (reg2 de rop), SEQ ID NO:114 (rop v3), e YFP (SEQ ID NO:6). RNA de fita dupla do bioensaio de inseto foi sintetizado e purificado usando um kit Ambion® MEGAscript® RNAi após instruções do fabricante (Invitro-gen). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espec-trofotômetro NanoDrop® 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00236] Construção de vetores de transformação vegetal. Os vetores de entrada (pDAB112649 e pDAB115766) abrigando um construto gênico alvo para formação do grampo compreendendo os segmentos de rop (SEQ ID NO:1) foram montados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação de grampo in-tramolecular por transcritos primários de RNA foi facilitada arranjando (dentro de uma unidade de transcrição única) duas cópias de um segmento gênico alvo em orientação oposta uma a outra, os dois segmentos sendo separados por uma sequência de íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:16) (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220 (2):245-50). Dessa forma, o transcrito de mRNA primário contém duas sequências de segmento do gene rop como grandes repetições inversas entre si, separadas pela sequência do íntron. Uma cópia de um promotor de ubiquitina 1 do milho (Patente U.S. No. 5.510.474) foi usada para controlar a produção do transcrito do grampo de mRNA primário e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3’ de um gene de peroxidase 5 de milho (3’UTR v2 da ZmPer5; Patente U.S. No. 6.699.984) foi usado para terminar a transcrição do gene expressando o RNA em grampo.

[00237] O vetor de entrada pDAB112649 compreende um construto de RNA em grampo de rop v1 (SEQ ID NO:13) que compreende um segmento de rop (SEQ ID NO:1) [00238] O vetor de entrada pDAB115766 compreende um construto de RNA em grampo de rop v3 (SEQ ID NO: 14) que compreende um segmento de rop (SEQ ID NO:1) distinto daquele encontrado em pDAB112649.

[00239] Os vetores de entrada pDAB112649 e pDAB115766 descritos acima foram usados em reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico (pDAB109805) para produzir vetores de transformação de expressão de RNA em grampo de rop para transformações mediadas por Agrobacterium de embrião de milho (pDAB114515 e pDAB115770), respectivamente).

[00240] Um vetor binário de controle negativo, pDAB110853, que compreende um gene que expressa um dsRNA em grampo de YFP, foi construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico (pDAB109805) e vetor de entrada pDAB101670. O Vetor de Entrada pDAB101670 compreende uma sequência em grampo de YFP (SEQ ID NO:15) sob controle de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3’ de um gene de peroxidase 5 de milho (como acima).

[00241] O vetor de destino binário pDAB109805 compreende um gene de resistência a herbicidas (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente U.S. No. 7838733 (B2) e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5) de acordo com a regulação de um promotor de badnavírus baciliforme de cana-de-açúcar (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30). Uma sequência sintética 5’UTR, compreendida de sequências do gene da proteína de revestimento de uma 5’UTR do Vírus de Mosaico do milho (MSV) e íntron 6 de um gene de Álcool Desidrogenase 1 de milho (ADH1), é posicionado entre a extremidade 3’ do segmento de promotor SCBV e o códon de partida da região codificante de AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3’ de um gene de lipase de milho (ZmLip 3’UTR; Patente U.S. No. 7.179.902) foi usado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.

[00242] Um vetor de binário de controle negativo adicional, pDAB110556, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, foi construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico (pDAB9989) e vetor de entrada pDAB100287. O vetor de destino binário pDAB9989 compreende um gene de resistência a herbicidas (ariloxialcanoato dio-xigenase; AAD-1 v3) (como acima) de acordo com a regulação de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento que compreende uma região não traduzida 3’ de um gene de lipase de milho (3’UTR de ZmLip; como acima). O Vetor de Entrada pDAB100287 compreende uma região codificante de YFP (SEQ ID NO: 17) sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento que compreende uma região não traduzida 3’ de um gene de peroxidase 5 de milho (como acima).

[00243] A SEQ ID NO: 13 apresenta uma sequência formadora de RNA em grampo de rop v1 como encontrada em pDAB114515.

[00244] A SEQ ID NO: 14 apresenta uma sequência formadora de RNA em grampo de rop v3 como encontrada em pDAB115770. EXEMPLO 4 Bioensaios de Dieta de Insetos [00245] Preparação de amostra e bioensaios Diversas moléculas de dsRNA (incluindo as que correspondem à regí de rop (SEQ ID NO:3), reg2 de rop (SEQ ID NO:4) e rop v3 (SEQ ID NO:114) foram sintetizadas e purificadas usando um kit MEGAscript® RNAi. As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas no tampão TE, e todos os bioen- saios continham um tratamento de controle consistindo emste tampão, que serviu como uma verificação de referência para mortalidade ou inibição de crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeCon-te). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioen-saio foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP® 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00246] As amostras foram testadas para a atividade de insetos em bioensaios conduzidos com larvas de insetos neonatos na dieta de inseto artificial. Os ovos de WCR foram obtidos de CROP CHARACTE-RISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00247] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas plásticas de 128 poços especificamente projetadas para bioensaios de insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada um dos poços continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta artificial projetada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL da amostra de dsRNA foi entregue pela pipeta à superfície da dieta de cada um dos poços (40 pL/cm2). As concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) da área de superfície (1,5 cm2) no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em uma câmara exaustora até que o líquido na superfície da dieta evaporasse ou fosse absorvido na dieta.

[00248] Em algumas horas da eclosão, larvas individuais foram apanhadas com um pincel de pelos finos umedecido e depositadas na dieta tratada (uma ou duas larvas por poço). Os poços infestados das bandejas plásticas de 128 poços então foram selados com folhas adesivas de plástico claro e com saída para permitir a troca gasosa. As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28Ό, Umidade relativa de -40%, 16:8 (Luz :Escuridão)) durante 9 dias, após tempo o qual o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos e o peso dos insetos so- breviventes foi registrado. A mortalidade percentual média e a inibição de crescimento média foram calculadas para cada tratamento. A inibição de crescimento (Gl) foi calculada como se segue: [00249] onde TWIT é o Peso Total de Insetos Vivos no Tratamento;

[00250] TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento;

[00251] TWIBC é o Peso Total de Insetos Vivos na Verificação de Referência (Controle de tampão); e [00252] TNIBC é o Número Total de Insetos na Verificação de Referência (Controle de tampão).

[00253] A análise estatística foi feita usando o programa JMP® (SAS, Cary, NC).

[00254] LC50 (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% dos insetos teste estão mortos. Gl50 (Inibição de Crescimento) é definido como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio visto em amostras de Verificação de Referência.

[00255] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade e inibição de crescimento surpreendente e inesperada das larvas da lagarta-da-raiz do milho. EXEMPLO 5 Rastreamento de Genes Alvo Candidatos [00256] DsRNA sintético projetado para inibir sequências gênicas alvo identificadas no EXEMPLO 1 causaram mortalidade e inibição de crescimento quando administrado a WCR em ensaios baseados na dieta. A regí de rop, reg2 de rop e rop v3 foram observadas exibir eficácia muito aumentada neste ensaio sobre outro dsRNAs rastreados.

[00257] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivadas de regí de rop, reg2 de rop e rop v3 cada uma resultou na inibição de crescimento e/ou mortalidade de larvas da lagarta-da-raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados de bioensaios de alimentação baseados na dieta de larvas de WCR após exposição de 9 dias a estes dsRNAs, bem como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativa de dsRNA preparado de uma região codificante de proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO:6). TABELA 2. Resultados de ensaios de alimentação da dieta com dsRNA de rop obtidos com larvas da lagarta-da-raiz do milho ocidental após 9 dias de alimentação. A análise com ANOVA encontrou diferenças de significância em Mortalidade Média % e Inibição de Crescimento (Gl) Média %. Os meios foram separados usando o teste de Tukey-Kramer. *SEM = Erro Padrão da Média. As letras em parênteses designam níveis estatísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (P <0,05). ** TE = Tris HCI (10 mM) mais tampão EDTA (1 mM), pH8. *** ypp _ prateína fluorescente amarela TABELA 3. Resumo da potência oral de dsRNA de rop em larvas WCR (ng/cm2).

[00258] Foi sugerido anteriormente que certos genes de Diabrotica spp. possam ser explorados para o controle de insetos mediado por RNAi. Ver a Publicação de Patente U.S. No. 2007/0124836, que descreve 906 sequências e a Patente U.S. No. 7.614.924, que descreve 9.112 sequências. Entretanto, foi determinado que muitos genes sugeridos ter utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Também foi determinado que as sequências regí de rop, reg2 de rop e rop v3 cada um fornecem controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, em comparação com outros genes sugeridos ter utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi.

[00259] Por exemplo, Anexina, Beta espectrina 2 e mtRP-L4, foi cada um sugerido na patente U.S. No. 7.614.924 com sendo eficaz no controle de insetos mediado por RNAi. A SEQ ID NO:18 é a sequência de DNA da região de Anexina 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO:19 é a sequência de DNA da região de Anexina 2 (Reg 2). A SEQ ID NO:20 é a sequência de DNA da região 1 de Beta espectrina 2 (Reg 1), e a SEQ ID NO:21 é a sequência de DNA da região 2 de Beta espectrina 2 (Reg2). A SEQ ID NO:22 é a sequência de DNA da região de mtRP-L4 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO:23 é a sequência de DNA da região de mtRP-L4 2 (Reg 2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO:6) também foi usada para produzir dsRNA como um controle negativo.

[00260] Cada uma das sequências mencionadas acima foi usada para produzir dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia usada para fornecer moldes específicos para a produção de dsRNA é mostrada na FIG. 2. DNAs de molde destinados para o uso na síntese de dsRNA foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 4 e (como molde de PCR) a primeira fita cDNA preparado de RNA total isolado de larvas do primeiro-ínstar de WCR. (YFP foi amplificado de um clone de DNA). Para cada região gênica alvo selecionada, duas amplificações por PCR separadas foram realizadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência de promotor de T7 na extremidade 5’ das fitas sentido amplificadas. A segunda reação incorporou a sequência de promotor de T7 nas extremidades 5’ das fitas antissentido. Os fragmentos amplificados das duas PCR de cada região dos genes alvo então foram misturadas em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIG. 2. RNA de fita dupla foi sintetizado e purificado usando um kit Ambion® MEGAscript® RNAí após instruções do fabricante (Invitrogen). As concentrações de dsR-NAs foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop® 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNAs foram cada um testados pelos mesmos métodos de bioensaio baseados na dieta descritos acima. A tabela 4 lista as sequências dos iniciadores usados para produzir moléculas de dsRNA de Regí de Anexina, Reg2 de Anexi-na, Regí de Beta espectrina 2, Reg2 de Beta espectrina 2, Regí de mtRP-L4 e Reg2 de mtRP-L4. As sequências de iniciador de YFP para o uso no método representadas na FIG. 2 também são listadas na Tabela 4. A tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação baseados na dieta de larvas de WCR após exposição de 9 dias a estas moléculas de dsRNA. Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsRNAs não resultou em nenhuma inibição de crescimento ou mortalidade das larvas da lagarta-da-raiz do milho ocidental acima daquelas vistas com amostras de controle de tampão TE, Água ou proteína YFP. TABELA 4. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar porções de regiões codificantes de genes. TABELA 5. Resultados de ensaios de a imentação de dieta obtidos com larvas da lagarta-da-raiz do milho ocidental após 9 dias. *ΤΕ = Tris HCI (10 mM) mais tampão EDTA (1 mM), pH8. ** YFP = proteína fluorescente amarela EXEMPLO 6 Produção de Tecidos de Milho Transqênico Compreendendo dsRNAs Inseticidas em Grampo Transformação mediada por Aarobacterium [00261] Células, tecidos e plantas de milho transgênico que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que visa um gene compreendendo rop; SEQ ID NO:1) pela expressão de um gene quimérico estavelmente integrado no genoma vegetal foram produzidos após transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação de milho que empregam vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, na patente U.S. No. 8.304.604. Os tecidos transformados foram selecionados pela sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxifop e foram rastreados para a produção dsRNA, como apropriado. As porções de tais culturas de tecido transformado podem ser apresentadas às larvas da lagarta-da-raiz do milho neona-tas para o bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 4.

[00262] Iniciação de Cultura de Aarobacterium Os estoques de gli-cerol de células de Agrobacterium cepa DAt13192 (WO 2012/016222A2) abrigando um vetor de transformação binário pDAB114515, pDAB115770, pDAB110853 ou pDAB110556 descrito acima (EXEMPLO 3) foram riscadas em placas de meio mínimo AB (Watson, et ai, (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo antibióticos apropriados e foram cultivadas a 20°C durante 3 dias. As culturas então foram riscadas para placas de YEP (gm/L: extrato de levedura, 10; Peptona, 10; NaCI 5) contendo os mesmos antibióticos e foram incubadas a 20°C durante 1 dia.

[00263] Cultura de Agrobacterium No dia de um experimento, uma solução de estoque de Meio de Inoculação e acetossiringona foi preparada em um volume apropriado para o número de construtos no experimento e pipetada em um frasco estéril descartável de 250 mL. Meio de inoculação (Frame et ai (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. Em Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341) continha: sais de MS 2,2 g/L; Vitaminas MS Modificadas ISU 1X (Frame et ai, ibid.) sacarose 68,4 g/L; glicose 36 g/L; L-prolina 115 mg/L; e mio-inositol 100 mg/L; em pH 5,4.) Acetossiringona foi adicionada ao frasco contendo Meio de Inoculação a uma concentração final de 200 μΜ de uma solução de estoque de 1 M em dimetil sulfóxido 100% e a solução foi completamente misturada.

[00264] Para cada construto, 1 ou 2 ciclos completos de inoculação de Agrobacterium da placa de YEP foram suspensas em 15 mL da solução de estoque de Meio de Inoculação/acetossiringona em um tubo de centrífuga estéril descartável de 50 mL, e a densidade ótica da solução em 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão então foi diluída a OD550 de 0,3 a 0,4 usando mistura adicional de Meio de Inoculação/acetossiringona. O tubo da suspensão de Agrobacterium então foi colocado horizontalmente em um conjunto de plataforma agitadora em aproximadamente 75 rpm à temperatura ambiente e agitado durante 1 a 4 horas enquanto a dissecação de embrião foi realizada.

[00265] Esterilização da orelha e isolamento do embrião Embriões imaturos de milho foram obtidos de plantas de Zea mays da linhagem endogâmica B104 (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406) cultivadas na estufa e autopolinizadas ou polinizadas com parentesco para produzir as orelhas. As orelhas foram coletadas pós-polinização de aproximadamente 10 a 12 dias. No dia experimental, as orelhas descascadas tiveram a superfície esterilizada por imersão em uma solução 20% de branqueamento comercial (ULTRA CLOROX® Germici-dal Bleach, hipoclorito de sódio 6,15%; com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas por 20 a 30 min, seguido de três enxagues em água deioni-zada estéril em um câmara de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) foram assepticamente dissecados de cada orelha e randomicamente distribuídos em tubos de mi-crocentrífuga contendo 2,0 mL de uma suspensão apropriada de células de Agrobacterium em Meio de Inoculação líquido com 200 μΜ de acetossiringona, em que 2 pL do tensoativo BREAK-THRU® S233 10% (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Alemanha) tinham sido adicionados. Para um conjunto dado de experimentos, os embriões de orelhas agrupados foram usados para cada transformação.

[00266] Cocultura de Agrobacterium Após o isolamento, os embriões foram colocados em uma plataforma oscilante durante 5 minutos. Os conteúdos do tubo então foram vertidos para uma placa de Meio de Cocultura, que continha sais de MS 4,33 gm/L; Vitaminas MS Modificadas ISU 1X; sacarose 30 g/L; L-prolina 700 mg/L; Dicamba 3,3 mg/L em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); mio-inositol 100 mg/L; Hidrolisado Enzimático de Ca-seína 100 mg/L; AgN03 15 mg/L; acetossiringona 200 pM em DMSO; e GELZAN™ 3 g/L, em pH 5,8. A suspensão de Agrobacterium líquida foi removida com uma pipeta de transferência estéril descartável. Os embriões então foram orientados com o escutelo virado para cima usando uma pinça estéril com a ajuda de um microscópio. A placa foi fechada, selada com a fita médica 3M® MICROPORE® e colocada em uma incubadora a 25Ό com luz contínua em aproximad amente 60 pmol m'2s'1 da Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR).

[00267] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Transqênicos Após período de cocultura, os embriões foram transferidos para Meio de Descanso, que era composto de sais de MS 4,33 g/L; Vitaminas MS Modificadas ISU 1X; sacarose 30 g/L; L-prolina 700 mg/L; Dicam-ba 3,3 mg/L em KOH; mio-inositol 100 mg/L; Hidrolisado Enzimático de Caseína 100 mg/L; AgN03 15 mg/L; MES 0,5 g/L (monohidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); Carbenicilina 250 mg/L; e Geizan™ 2,3 g/L; em pH 5,8. Não mais do que 36 embriões foram movidos para cada placa. As placas foram colocadas em uma caixa plástica clara e incubadas a 27Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol nrf2s'1 de PAR durante 7 a 10 dias. Os embriões com calos então foram transferidos (<18/placa) para Meio de Seleção I, que era compreendido do Meio de Descanso (acima) com 100 nM R-Haloxifop ácido (0,0362 mg/L; para seleção de calos abrigando o gene AAD-1). As placas foram devolvidas às caixas claras e incubadas a 27Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m'2s'1 de PAR durante 7 dias. Os embriões com calos então foram transferidos (<12/placa) para o Meio de Seleção II, que é compreendido do Meio de Descanso (acima) com R-Haloxifop ácido 500 nM (0,181 mg/L). As placas foram devolvidas às caixas claras e incubadas a 27Ό com luz contínua em aproxima damente 50 pmol m'2s'1 de PAR durante 14 dias. Esta etapa de seleção permitiu o calo transgênico proliferar mais e se diferenciar.

[00268] Ao proliferarem, os calos embriogênicos foram transferidos (<9/placa) ao meio de Pré-regeneração. Meio de pré-regeneração continha sais de MS 4,33 g/L; Vitaminas MS Modificadas ISU 1X; sacaro- se 45 g/L; L-prolina 350 mg/L; mio-inositol 100 mg/L; Hidrolisado En-zimático de Caseína 50 mg/L; AgN03 1,0 mg/L; MES 0,25 g/L; ácido naftalenoacético 0,5 mg/L em NaOH; ácido abscísico 2,5 mg/L em etanol; 6-benzilaminopurina 1 mg/L; Carbenicilina 250 mg/L; Gelzan™ 2,5 g/L; e Haloxifop ácido 0,181 mg/L; em pH 5,8. As placas foram armazenadas em caixas claras e incubadas a 27Ό com I uz contínua em aproximadamente 50 pmol m'2s'1 de PAR durante 7 dias. Os calos regeneram então foram transferidos (<6/piaca) para o Meio de Regeneração em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28<C com 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia (em aproximadamente 160 pmol m'2s'1 de PAR) durante 14 dias ou até brotos e raízes desenvolvidos. O meio de regeneração continha sais de MS 4,33 g/L; Vitaminas MS Modificadas ISU 1X; sacarose 60 g/L; mio-inositol 100 mg/L; Carbenicilina 125 mg/L; goma Gellan™ 3 g/L; e R-Haloxifop ácido 0,181 mg/L; em pH 5,8. Os pequenos brotos com raízes primárias então foram isolados e transferidos para Meio de Alongamento sem seleção. O meio de alongamento continha sais de MS 4,33 g/L; Vitaminas MS Modificadas ISU 1X; sacarose 30 g/L; e Gelrite® 3,5 g/L: em pH 5,8.

[00269] Os brotos vegetais transformados selecionados pela sua capacidade de crescer no meio contendo Haloxifop foram transplantados de PHYTATRAYS™ para os pequenos potes preenchidos com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTU-RE), recobertos com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e em seguida endurecidos em uma câmara de crescimento CONVIRON (27Ό dia/24O noite, fotoperíodo de 16 horas, RH d e 50-70%, 200 pmol nrf2s'1 de PAR). Em alguns exemplos, as mudas transgênicas pu-tativas foram analisadas para o número de cópias relativas de trans-gene por ensaios de PCR quantitativa em tempo real usando iniciado-res projetados para detectar o gene de tolerância ao herbicida AAD1 integrado no genoma do milho. Ainda, ensaios de qPCR para RNA foram usados para detectar a presença da sequência de íntron ST-LS1 em dsRNAs expressos de transformantes putativos. As mudas transformadas selecionadas então foram movidas em uma estufa de crescimento adicional e teste.

[00270] Transferência e estabelecimento de plantas Tn na estufa para bioensaio e produção de sementes Quando as plantas alcançaram o estágio V3-V4, foram transplantadas na mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e cultivadas até a florescência na estufa (Tipo de Exposição Luminosa: Foto ou Assimilação; Limite de Alta Luminosidade: 1.200 PAR; duração do dia 16 horas; 27°C dia/24O noite).

[00271] As plantas a serem usadas para bioensaios de insetos foram transplantadas dos pequenos potes para TINUS™ 350-4 ROO-TRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, o Canadá;) (uma planta por evento por Rootrainer®). Aproximadamente quatro dias após transplante aos Rootrainers®, as plantas foram infestadas para o bioensaio.

[00272] As plantas da geração T-ι foram obtidas polinizando os cabelos de plantas transgênicas T0 com o pólen coletado de plantas da linhagem endogâmica de elite não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados e plantação das sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos foram realizados quando possível. EXEMPLO 7 Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transqênico [00273] As análises moleculares (por exemplo, qPCR para RNA) de tecidos de milho foram realizadas em amostras de folhas e raízes que foram coletadas de plantas cultivadas em estufa nos mesmos dias que o dano por alimentação das raízes foi avaliado.

[00274] Os resultados de ensaios de qPCR para RNA da 3’UTR de Per5 foram usados para validar a expressão de transgenes em grampo. (Um baixo nível de detecção da 3’UTR de Per5 é esperada em plantas de milho não transformadas, uma vez que há normalmente a expressão do gene Per5 endógeno em tecidos de milho). Os resultados da análise de qPCR para RNA para a sequência de íntron ST-LS1 (que é integral para a formação de moléculas em grampo de dsRNA) em RNAs expressos foram usados para validar a presença de transcritos em grampo. Os níveis de expressão de RNA de transgene foram medidos quanto aos níveis de RNA de um gene de milho endógeno.

[00275] Análises de qPCR para DNA para detectar uma porção da região codificante de AAD1 no DNA genômico foi usado para estimar o número de cópias de inserção do transgene. As amostras destas análises foram coletadas de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados foram comparados com os resultados dos ensaios de qPCR para DNA projetados para detectar uma porção de um gene nativo de cópia única, e os eventos simples (tendo uma ou duas cópias dos transgenes) foram avançados para estudos adicionais na estufa.

[00276] Adicionalmente, ensaios de qPCR projetados para detectar uma porção do gene de resistência à espectinomicina (SpecR; abrigado nos plasmídeos de vetor binário fora do T-DNA) foram usados para determinar se as plantas transgênicas continham sequências de esqueleto de plasmídeo integradas estranhas.

[00277] Nível de expressão de transcrito de RNA em grampo: qPCR da 3’UTR de Per 5 Eventos de célula de calo ou plantas transgênicas foram analisados por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) da sequência da 3’UTR de Per 5 para determinar o nível de expressão relativo do transcrito em grampo completo, comparando com o nível de transcrito de um gene de milho interno (SEQ ID NO:48; No. de Acesso GenBank® BT069734), que codifica uma proteína similar a TIP41 (isto é, um homólogo de milho de No. de Acesso GenBank® AT4G34270; tendo um escore tBLASTX de identidade de 74%). O RNA foi isolado usando um kit RNAEASY™ 96 (Qiagen, Valência, CA). Seguinte à eluição, o RNA total foi submetido a um tratamento com DNAsel de acordo com o protocolo sugerido do kit. O RNA então foi quantificado em um espectrofotômetro NANODROP® 8000 (THERMO SCIENTI-FIC) e a concentração foi normalizada a 25 ng/pL. cDNA de primeiro fita foi preparado usando um kit de síntese HIGH CAPACITY cDNA (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado do fabricante. O protocolo foi modificado levemente para incluir a adição de 10 pL de oligonucleotídeo T20VN (IDT) 100 pM (SEQ ID NO:49; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C, ou G e N é A, C, G, ou T/U) em tubo de 1 mL da mistura de estoque de iniciador ran-dômico, a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores ran-dômicos e oiigo dT combinados.

[00278] Seguinte à síntese de cDNA, as amostras foram diluídas 1:3 com água sem nucleases e armazenadas a -20Ό até serem analisadas.

[00279] Ensaios de PCR em tempo real separados para a 3’ UTR de Per5 e o transcrito similar a TIP41 foram realizados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volumes de reação de 10 pL. Para o ensaio da 3’UTR de Per5, as reações foram corridas com Iniciadores P5U76S (F) (SEQ ID NO:50) e P5U76A(R) (SEQ ID NO:51), e uma ROCHE UNIVERSAL PROBE™ (UPL76; Catálogo no. 4889960001; marcada com FAM). Para o ensaio gênico de referência similar a TIP41, iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO:52) e TIPmxR (SEQ ID NO:53), e Sonda HXTIP (SEQ ID NO:54) marcada com HEX (hexaclorofluoresceína) foram usados.

[00280] Todos os ensaios incluíram controles negativos do sem molde (somente mistura). Para as curvas padrão, um branco (água no poço fonte) também foi incluído na placa fonte para verificar a contaminação cruzada da amostra. Sequências de iniciadores e de sondas são apresentadas na Tabela 6. As receitas dos componentes de reação para a detecção de vários transcritos são descritas na Tabela 7, e as condições de reações de PCR são resumidas na Tabela 8. A porção fluorescente de FAM (6-Carbóxi Fluoresceína Amidita) foi excitada em 465 nm e a fluorescência foi medida em 510 nm; os valores correspondentes da porção fluorescente de HEX (hexaclorofluoresceína) foram 533 nm e 580 nm. TABELA 6. Sequências de iniciadores usadas para análises moleculares de níveis de transcrito no milho transgênico. * proteína similar a TIP41. ** Sequência de NAv Não Disponível no fornecedor. TABELA 7. Receitas de reação de PCR para detecção de transcrito. TABELA 8. Condições de termociclador para qPCR.

[00281] Os dados foram analisados usando o Programa LightCycler™ v1.5 pela quantificação relativa usando um segundo algoritmo de máximo derivado para o cálculo de valores de Cq de acordo com recomendações do fornecedor. Para análises de expressão, os valores de expressão foram calculados usando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que depende da comparação de diferenças de valores de Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado sob a suposição que, para reações de PCR otimizadas, o produto dobra a cada ciclo.

[00282] Tamanho de transcrito em grampo e integridade: Ensaio de Northern Blot Em alguns exemplos, caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida pelo uso da análise de Northern Blot (blot de RNA) para determinar o tamanho molecular do RNA em gram- po de rop em plantas transgênicas que expressam um dsRNA em grampo de rop.

[00283] Todos os materiais e o equipamento são tratados com RNAzap (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos Eppendorf com fechamento seguro de 2 mL, rompidas com um pulverizador de tecido Klecko™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) com três contas de tungs-tênio em 1 mL de TRIzol (INVITROGEN) por 5 min, em seguida incubadas à temperatura ambiente (RT) por 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas por 10 min a 40 em 11.0 00 rpm e o so-brenadante é transferido para um tubo Eppendorf fresco com fechamento seguro de 2 mL. Após, 200 pL de clorofórmio são adicionados ao homogenato, o tubo é misturado pela inversão de 2 a 5 min, incubado à RT durante 10 minutos e centrifugado em 12.000 x g por 15 min a 40. A fase superior é transferida para um tu bo Eppendorf de 1,5 mL estéril, 600 pL de isopropanol 100% são adicionados, seguido de incubação à RT por 10 min a 2 horas, em seguida centrifugada a 12.000 x g por 10 min de 4oa 250. O sobrenadante é descartado e o precipitado de RNA é lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70%, com centrifugação em 7.500 x g por 10 min de 4o a 2 50 entre as lavagens. O etanol é descartado e o precipitado é brevemente seco ao ar por 3 a 5 min antes de ressuspender em 50 pL de água sem nu-cleases.

[00284] RNA total é quantificado usando NANODROP® 8000 (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas a 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) então são adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng da mistura de marcador padrão de DIG RNA (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) são dispensados e adicionados a um volume igual de glioxal. As amostras e RNAs do marcador são desnaturados a 500) por 45 min e armazenados em ge- Io até ο carregamento em um gel de agarose SEAKEM GOLD 1,25% (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de corrida glioxal NORTHERN-MAX 10 X (AMBION/INVITROGEN) RNAs são separados por eletrofo-rese em 65 volts/30 mA por 2 horas e 15 min.

[00285] Seguinte à eletroforese, o gel é enxaguado em SSC 2X por 5 min e imageado em uma estação GEL DOC (BIORAD, Hércules, CA), então RNA é passivamente transferido para uma membrana de náilon (MILLIPORE) durante a noite à RT, usando SSC 10X como o tampão de transferência (SSC 20X consiste de cloreto de sódio 3 M e citrato trissódico 300 mM, pH 7,0). Seguinte à transferência, a membrana é enxaguada em SSC 2X durante 5 minutos, RNA é interligado com UV à membrana (AGILENT/STRATAGENE), e permite-se que a membrana seque à RT durante até 2 dias.

[00286] A membrana é pré-hibridizada no tampão UltraHyb (AMBI-ON/INVITROGEN) durante 1 a 2 hrs. A sonda consiste do produto amplificado de uma PCR que contém a sequência de interesse, (por exemplo, a porção de sequência antissentido da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14, como apropriado) marcado com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridização no tampão recomendado é noturna em uma temperatura de 60Ό em tubos de hibridização. Seguinte à hibridização, o blot é submetido a lavagem de DIG, empacotado, exposto ao filme durante 1 a 30 minutos, então o filme é desenvolvido, todos por métodos recomendados pelo fornecedor do kit de DIG.

Determinação de número de cópias do transqene [00287] Partes da folha de milho aproximadamente equivalentes a 2 punções de folha foram coletadas em placas de coleta de 96 poços (Qiagen). A perturbação de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido Klecko™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise Biosprint96 AP1 (suprido com um BIOSPRINT96 PLANT KIT; QIAGEN) com uma conta de aço inoxidável. Seguinte à maceração de tecido, DNA genômico (gDNA) foi isolado em formato de alto rendimento usando um BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô de extração BIOSPRINT96. DNA genômico foi diluído 2:3 DNA:água antes de estabelecer a reação de qPCR.

[00288] Análise de qPCR A detecção do transgene de pelo ensaio de sonda de hidrólise foi realizada por PCR em tempo real usando um sistema LightCycler®480. Os oligonucleotídeos a serem usados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar a sequência de íntron ST-LS1 (SEQ ID NO: 16) ou para detectar uma porção do gene SpecR (isto é, o gene de resistência à espectinomicina carregado nos plasmí-deos do vetor binário; SEQ ID NO:55; oligonucleotídeos de SPC1 na Tabela 9), foram projetados usando LightCycler® Probe Design Software 2.0. Ainda, os oligonucleotídeos a serem usados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância ao herbicida AAD-1 (SEQ ID NO:56; os oligonucleotídeos de GAAD1 na Tabela 9) foram projetados usando o programa PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS). A tabela 9 mostra as sequências dos inici-adores e sondas. Os ensaios foram multiplexados com reagentes de um gene cromossômico de milho endógeno (Invertase (SEQ ID NO:57; No de Acesso GenBank®: U16123; referido neste pedido como IVR1), que serviu como uma sequência de referência interna para assegurar que gDNA esteve presente em cada ensaio. Para a amplificação, LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER mix (ROCHE APPLIED SCIENCE) foi preparada em concentração final 1X em uma reação múltipla de volume de 10 pL contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 pM de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada como delineado na Tabela 11. A ativação de fluoróforo e a emissão para sondas marcadas com FAM e HEX foram como descritas acima; os conjugados de CY5 são excitados maximamente de 650 nm e fluorescência máxima em 670 nm.

[00289] Os escores de Cp (o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limiar de fundo) foi determinado dos dados de PCR em tempo real usando o algoritmo de pontos de ajuste (programa LIGHTCYCLER® relese 1.5) e o módulo Relative Quant (baseado no método AACt). Os dados foram tratados como descrito anteriormente (acima; qPCR para RNA). TABELA 9. Sequências de iniciadores e sondas (com o conjugado fluorescente) usadas para determinações de número de cópias do gene e detecção do esqueleto de plasmídeo de vetor binário. CY5 = Cianina-5 TABELA 10. Os componentes de reação do gene copiam análises de número e detecção de esqueleto de plasmídeo. *ΝΑ = não aplicável ** ND = não determinado TABELA 11. Condições de termociclador para qPCR de DNA EXEMPLO 8 Bioensaio de Milho Transqênico [00290] Bioensaios de Insetos in vitro Bioatividade de dsRNA da invenção objeto produzida em células vegetais é demonstrada por métodos de bioensaio. Ver, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Bio-technol. 25 (11):1322-1326. Um é capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, alimentando vários tecidos vegetais ou partes de tecido derivadas de uma planta que produz um dsRNA inseticida para visar insetos em um ambiente de alimentação controlado. Alternativamente, os extratos são preparados de vários tecidos vegetais derivados de uma planta que produz o dsRNA inseticida e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados acima das dietas artificiais de bioensaios como anteriormente descrito neste pedido. Os resultados de tais ensaios de ali- mentação são comparados com bioensaios similarmente conduzidos que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida, ou a outras amostras controle.

Bioensaios de insetos com Eventos de Milho Transqênico [00291] Duas larvas da lagarta-da-raiz do milho ocidental (1 a 3 dias) incubadas de ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada poço da bandeja de bioensaio. Os poços então são recobertos com uma cobertura "PULL Ν’ PEEL" (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocados em um incubadora a 280 com um ciclo de luz/escurid ão de 18 h/6 h. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas para a mortalidade, que é calculada como a porcentagem de insetos mortos fora do número total de insetos em cada tratamento. As amostras de inseto são congeladas a -200 durante dois dias, en tão as larvas de inseto de cada tratamento são agrupadas e pesadas. A porcentagem da inibição de crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pelo média de peso médio de dois tratamentos de poço controle. Os dados são expressos como uma Inibição de Crescimento Percentual (dos Controles Negativos). Os pesos médios que excedem o controle peso médio são normalizados a zero.

[00292] Bioensaios de inseto na estufa Os ovos da lagarta-da-raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos no solo de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Os ovos de WCR foram incubados a 28Ό durante 10 a 11 dias. Os ovos foram lavados do solo, colocado em uma solução de ágar 0,15%, e a concentração foi ajustada a aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa de incubação foi estabelecida em uma placa de Petri com uma alíquota da suspensão de ovo para monitorar taxas de incubação.

[00293] O solo em torno das plantas de milho que crescem em ROOTRAINERS® foi infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Permitiu-se que os insetos se alimentassem durante 2 semanas, após este tempo uma "Avaliação de Raiz" foi dada a cada planta. Uma Escala de Injúria de Nodo foi utilizada para classificar essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005, J. Econ. Entomol. 98:1-8). As plantas que passaram por este bioensaio foram transplantadas para potes de 18,9 litros para produção de sementes. Os transplantes foram tratados com o inseticida para prevenir dano adicional da lagarta-da-raiz e a liberação do inseto nas estufas. As plantas foram polinizadas à mão para a produção de sementes. As sementes produzidas por estas plantas foram salvas para avaliação na e gerações subsequentes das plantas.

[00294] Os bioensaios de estufa incluíram dois tipos de plantas controle negativas. As plantas controle negativas transgênicas foram geradas pela transformação com vetores que abrigam genes projetados para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP) ou um dsRNA em grampo de YFP (Ver o Exemplo 4). As plantas controle negativas não transformadas foram cultivadas de sementes de linhagens 7sh382 ou B104. Os bioensaios foram conduzidos em duas datas separadas, com controles negativos incluídos em cada conjunto de materiais vegetais.

[00295] A tabela 12 mostra os resultados combinados das análises moleculares e bioensaios de plantas rop-grampo. O exame dos resultados de bioensaio resumidos na Tabela 12 revela a observação surpreendente e inesperada que a maioria das plantas de milho transgênicas que abrigam construtos que expressam um dsRNA em grampo de rop compreendendo os segmentos da SEQ ID NO:1, por exemplo, como exemplificado com a SEQ ID NO: 13 e a SEQ ID NO: 14, é protegida contra o dano de raiz causado alimentando as larvas da lagarta-da-raiz do milho ocidental. Vinte e dois de 37 eventos classificados ti- nham uma avaliação de raiz de 0,5 ou inferior. A tabela 13 mostra os resultados combinados de análises moleculares e bioensaios de plantas controle negativas. A maioria das plantas não tinham proteção contra a alimentação de larvas de WCR, embora cinco das 34 plantas classificadas tivessem uma avaliação de raiz de 0,75 ou inferior. A presença de algumas plantas tendo escores de avaliações de baixo enraizamento entre o conjunto de plantas controle negativo é às vezes observada e reflete a variabilidade e a dificuldade de conduzir este tipo do bioensaio em uma instalação de estufa. TABELA 12. Bioensaio de estufa e resultados de análises moleculares de plantas de milho expressando rop-grampo. *RTL = Nível de Transcrito Relativo como medido contra níveis de transcrito gênicos similares a TIP4. TABELA 13. Bioensaio de estufa e resultados de análises moleculares de plantas de controle negativas que compreendem trans-gênico e plantas de milho não transformadas. *RTL = Nível de Transcrito Relativo como medido contra níveis de transcrito gênicos similares a TIP4. ** NG = Não Classificado devido ao pequeno tamanho da planta. *** ND = não feito. EXEMPLO 9 Zea mays Transqênico Compreendendo Sequências de Praga de Coleópteros [00296] Dez a 20 T0 plantas transgênicas de Zea mays são geradas como descrito no EXEMPLO 6. 10 a 20 linhagens Ti independentes adicionais de Zea mays que expressam dsRNA em grampo para um construto de RNAi é obtido para o desafio da lagarta-da-raiz do milho. O dsRNA em grampo pode ser derivado como apresentado na SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 ou compreendendo ainda de outra maneira a SEQ ID NO:1. Os dsRNAs em grampo adicionais podem ser derivados, por exemplo, de sequências de praga de coleópteros tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), ΡΡΙ-87Β (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), ou RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA total de linhagens T-ι independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores projetados para ligar-se no íntron ST-LS1 do cassete de expressão em grampo em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos de cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA em planta. A amplificação das bandas desejadas de cada gene alvo confirma a expressão de RNA em grampo em cada planta de Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA em grampo dos genes alvo no siRNA é posteriormente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[00297] Além disso, as moléculas de RNAi que têm sequências de incompatibilidade com identidade de sequência de mais de 80% para genes alvo afetam as lagartas-da-raiz do milho em uma via similar a esta vista com moléculas de RNAi que têm identidade de sequência de 100% para os genes alvo O pareamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA em grampo no mesmo construto de RNAi entrega siRNAs processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentar a praga de coleópteros.

[00298] Entrega in planta de dsRNA, shRNA de siRNA ou mi RNA correspondendo aos genes alvo e a absorção subsequente pela praga de coleópteros por meio da alimentação resulta na regulação para baixo dos genes alvo na praga de coleópteros pelo silenciamento do gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga de coleópteros é afetada, e no caso de pelo menos um de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva à falha de infestação, alimentação, desenvolvimento, e/ou reprodução com sucesso, ou leva à morte da praga de coleópteros. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi então são usadas para controlar a praga de coleópteros.

[00299] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transqênicas e não transformadas de Zea mavs Genes da praga alvo de coleópteros ou sequências selecionadas para criar o dsRNA em grampo não tem similaridade com nenhuma sequência gênica vegetal conhecida. Por isso não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos que visam estes genes da praga de coleópteros ou sequências terão qualquer efeito deletério sobre plantas transgêni-cas. Entretanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" que não tem nenhum gene que expressa o grampo. A raiz, broto, folhagem da planta e as características de reprodução são comparadas. Não há diferença observável em modelos de crescimento e comprimento de raiz de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto vegetal como altura, números e tamanhos de folhas, tempo de florescência, tamanho floral e aparência são similares. Em geral, não há nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem a expressão das moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa. EXEMPLO 10 Zea mavs Transqênico Compreendendo uma Sequência de Praga de Coleópteros e Construtos de RNAi Adicionais [00300] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que visa um organismo exceto uma praga de coleópteros é secundariamente transformada via Agrobacterium ou metodologias WHISKERS™ (ver Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que visa um gene compreendendo a SEQ ID NO:1). Os vetores de plasmídeo de transformação vegetal preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 3 são entregues via Agrobacterium ou métodos de transformação mediados por WHISKERS™ em células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos de uma planta de Zea mays transgênica Hi II ou B104 compreendendo uma sequência codificante heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que visa um organismo exceto uma praga de coleópteros. EXEMPLO 11 Zea mavs Transqênico Compreendendo um Construto de RNAi e Sequências Controle de Praga de Coleópteros Adicionais [00301] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que visa um organismo da praga de coleópteros (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que visa um gene compreendendo a SEQ ID NO:1) é secundariamente transformada via Agrobacterium ou metodologias WHISKERS™ (ver Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de proteínas insetici- das, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3, ou Cry34 e Cry35Ab1. Os vetores de plasmídeo de transformação vegetal preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 3 são entregues via Agrobacte-rium ou métodos de transformação mediados por WHISKERS™ em células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos de uma planta de Zea mays B104 transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga no seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que visa um organismo da praga de coleópte-ros. As plantas duplamente transformadas que são obtidas produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle da praga de coleópteros. EXEMPLO 12 Outras Sequências de Diabrotica Tendo Homoloqia a ROP

[00302] A proteína de ROP (SEQ ID NO:2) contém um domínio conservado da família Sec1 (pfam00995). É conhecido que as proteínas de família Sec1 estão envolvidas em transmissão sináptica e secreção geral, hmmscan foi usado para a predição de domínio PFAM nas sequências de transcriptoma de WCR. As análises de homologia proteica usando um domínio Sec1 identificaram 42 outras sequências de Diabrotica virgifera (SEQ ID NOs:70 a 111) que codificam proteínas que contêm um domínio Sec1 e podem compartilhar consequentemente propriedades estruturais e/ou funcionais com a proteína de ROP. Dessa forma, os genes (isto é, as SEQ ID NOs:70-111) codificando estas proteínas são candidatos adicionais para o controle mediado por RNAi de espécies Diabrotica, incluindo pelo menos um de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella e D. u. undecimpunctata Mannerheim, por métodos descritos neste pedido. EXEMPLO 13 Mortalidade do Percevejo Marrom da Soja (Euschistus heros) após Injeção de RNAi de rojo [00303] Criação de insetos Percevejos Marrons da Soja (BSB; Eus-chistus heros) foram criados na dieta artificial de BSB preparada como se segue (usada em duas semanas da preparação). Os feijões verdes liofílizados foram misturados a um pó fino em um liquidificador MAGIC BULLET® enquanto amendoins crus (orgânicos) foram misturados em um liquidificador MAGIC BULLET® separado. Os ingredientes secos misturados foram combinados (porcentagens em peso: feijões verdes, 35%; amendoins, 35%; sacarose, 5%; complexo de vitaminas (por exemplo, Mistura de Vitaminas Vanderzant para insetos, SIGMA-ALDRICH, Catálogo no. V1007), 0,9%); em um grande liquidificador MAGIC BULLET®, que foi tampado e bem agitado para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos variados então foram adicionados a uma tigela de mistura. Em um recipiente separado, água e agente antifúngico benomil (50 ppm; 25 pL de uma solução 20.000 ppm/50 mL de solução da dieta) foram bem misturados e em seguida adicionados à mistura de ingredientes seca. Todos os ingredientes foram misturados à mão até que a solução fosse totalmente misturada. A dieta foi formatada em tamanhos desejados, empacotada livremente em folha de alumínio, aquecida durante 4 horas a 60Ό, em seguida resfriada e armazenada a 4Ό.

[00304] Seleção alvo de RNAi Seis estágios do desenvolvimento de BSB foram selecionados para a preparação de biblioteca de mRNA. RNA total foi extraído de insetos congelados a -70°C e homogeneizados em 10 volumes do tampão de Lise/Ligação em tubos de 2 mL da MATRIZ de Lise A (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) em um Instrumento FastPrep®-24 (MP BIOMEDICALS). O mRNA total foi extraído usando um Kit de Isolamento de miRNA MirVana™ (AMBION; IN-VITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequencia-mento de RNA usando um sistema illumina® HiSeq™ (San Diego, CA) forneceu sequências gênicas alvo candidatas para uso na tecnologia de controle de RNAi de inseto. HiSeq™ gerou um total de aproximadamente 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra usando o programa de montagem TRINITY (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). Os transcritos montados foram combinados para gerar um transcriptoma agrupado. O transcriptoma agrupado deste BSB contém 378.457 sequências.

[00305] Identificação do ortóloqo de roo de BSB Uma busca com tBLASTn do transcriptoma de BSB agrupado foi realizada usando como sequência de consulta uma proteína de ROP de Drosophila (ROP-PA; No. de Acesso GenBank® AAF47844.1). O rop de BSB (SEQ ID NO:115) foi identificado como um gene alvo do Percevejo Marrom da Soja candidato.

[00306] Preparação de molde e a síntese de dsRNA cDNA foi preparado de RNA de BSB total extraído de um inseto adulto jovem único usando (aproximadamente 90 mg) de Reagente TRIzol® (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizado à temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 200 pL de TRIzol® usando um pilão de peletização (FISHERBRAND Catálogo no. 12-141-363) e Misturador a Motor de Pilão (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Seguinte à homogeneização, 800 pL adicionais de TRIzol® foram adicionados, o homogenato foi vortexado, e em seguida incubado à temperatura ambiente durante cinco minutos. O fragmento celular foi removido pela centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. 200 pL de clorofórmio foram adicionados e a mistura foi vortexada durante 15 segundos. Após permitir a extração assentar à temperatura ambiente de 2 a 3 min, as fases foram separadas pela centrifugação em 12.000 x g a 4Ό durante 15 minutos. A fase aquosa superior foi cuidadosamente transferida para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sem nucleases, e RNA foi precipitado com 500 pL de isopropanol à temperatura ambiente. Após incubação de dez minutos à temperatura ambiente, a mistura foi centrifugada durante 10 minutos como acima. O precipitado de RNA foi enxaguado com 1 mL de etanol 75% à temperatura ambiente e centrifugado durante mais 10 minutos como acima. O precipitado de RNA foi seco à temperatura ambiente e ressuspenso em 200 pL de Tampão Tris de um GFX PCR DNA AND GEL EXTRACTION KIT (illustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) usando Tampão de Eluição Tipo 4 (isto é, Tris-HCI 10 mM pH8,0). A concentração de RNA foi determinada usando um espectro-fotômetro NANODROP® 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00307] O cDNA foi transcrito reversamente de 5 pg do molde de RNA total de BSB e iniciador oligo dT usando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ para RT-PCR (Invitrogen), seguindo o protocolo recomendado do fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi trazido a 100 pL com água sem nucleases.

[00308] Os iniciadores BSB_Rop-1-For (SEQ ID NO: 117) e BSB_Rop-1-Rev (SEQ ID NO:118) foram usados no touch-down de PCR (temperatura de anelamento reduziu de 60Ό a 50Ό em uma redução de lO/ciclo) com 1 pL de cDNA (acima) como o molde. Fragmentos compreendendo um segmento de 499 bp de rop (isto é, regi-ão1 de rop de BSB; SEQ ID NO:119) foram gerados durante os 35 ciclos de PCR. Os iniciadores de BSB_Rop compreenderam uma sequência de promotor de fago T7 (SEQ ID NO:5) nas suas extremidades 5’, e dessa forma permitiram o uso de fragmentos de DNA de regí de rop de BSB para a transcrição de dsRNA.

[00309] O dsRNA foi sintetizado usando 2 pL do produto de PCR (acima) como o molde com um kit MEGAscript™ RNAi (AMBION) usado de acordo com as instruções do fabricante. (Ver FIG. 1). O dsRNA foi quantificado em um espectrofotômetro NANODROP® 8000 e diluí- do a 500 ng/pL em tampão TE 0,1X sem nucleases (Tris HCL 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH7,4).

[00310] Injeção de dsRNA em hemocoel de BSB BSB foi criada na dieta artificial (acima) em uma incubadora a 27Ό na umidade relativa de 65% e fotoperíodo 16:8 horas luz:escuridão. As ninfas de segundo instar (cada pesagem 1 a 1,5 mg) foram suavemente tratadas com um pequeno pincel para prevenir injúria e foram colocadas em uma placa de Petri em gelo para resfriar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de uma solução de dsRNA 500 ng/pL (isto é, 27,6 ng de dsRNA; dosagem de 18,4 a 27,6 pg/g de peso corporal). As injeções foram realizadas usando um injetor NANOJECT™ II (DRUM-MOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA) equipado de uma agulha de injeção puxada do tubo capilar de vidro Drummond de 8,9 cm #3-000=203-G/X. A ponta da agulha foi quebrada e o tubo capilar foi re-enchido com óleo mineral leve, em seguida enchido de 2 a 3 pL de dsRNA. O dsRNA foi injetado no abdome das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por teste), e os testes foram repetidos em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por poço) foram transferidos para bandejas de 32 poços (Bandeja de Criação Bio-RT-32; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo um precipitado de dieta artificial de BSB e recoberto com aba Pull-N-Peel™ (BIO-CV-4; BIO-SERV). A umidade foi suprida por meio de 1,25 ml_ de água em um tubo de microcentrífu-ga de 1,5 ml_ com um pavio de algodão. As bandejas foram incubadas em 26,5°C, umidade de 60% e fotoperíodo 16:8 luz:escuridão. As contagens de viabilidade e os pesos foram tomados no dia 7 após as injeções.

[00311] Injeções identificaram roo de BSB como um alvo de dsRNA letal dsRNA homólogo a uma região codificante de YFP (preparado como no EXEMPLO 2) foram usadas como um controle negativo em experimentos de injeção BSB. Como resumido na Tabela 13, 27,6 ng de dsRNA de BSB_reg1 de rop injetado no hemocoel de ninfas de 2o instar de BSB produziu alta mortalidade dentro de sete dias. A mortalidade causada por dsRNA de BSB_reg1 de rop foi significativamente diferente daquela vista com a mesma quantidade de dsRNA de YFP injetado (controle negativo). TABELA 13. Resultados de injeção de dsRNA de BSB_reg1 de rop no hemocoel das ninfas Percevejos Marrons da Soja de 2o instar sete dias após a injeção. *Dez insetos injetados por teste de cada dsRNA. EXEMPLO 14 Zea mavs Transqênico Compreendendo Sequências de Praga de Hemípteros [00312] Dez a 20 plantas transgênicas T0 de Zea mays que abrigam vetores de expressão de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO: 115 e/ou SEQ ID NO 119 são geradas como descrito no EXEMPLO 6. Um 10 a 20 linhagens Ti independentes adicionais de Zea mays que expressam o dsRNA em grampo para um construto de RNAi é obtido para o desafio de BSB. O dsRNA em grampo pode ser derivado como apresentado na SEQ ID NO:119 ou compreendendo ainda de outra maneira a SEQ ID NO:115. Estes são confirmados por RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA totais de linhagens T-ι independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores projetados para ligar-se no ín-tron ST-LS1 do cassete de expressão em grampo em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos de cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA na planta. A amplificação das bandas desejadas de cada gene alvo confirma a expressão de RNA em grampo em cada planta de Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA em grampo dos genes alvo no siRNA é posteriormente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridi-zações de blot de RNA.

[00313] Além disso, as moléculas de RNAi que têm sequências de incompatibilidade com identidade de sequência de mais de 80% para genes alvo que afetam as lagartas-da-raiz do milho em uma via similar a aquela vista com moléculas de RNAi que têm identidade de sequência de 100% aos genes alvo. O pareamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA em grampo no mesmo construto de RNAi entrega si RN As processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentar a praga de hemípteros.

[00314] Entrega in planta de dsRNA, siRNA, shRNA ou mi RNA correspondendo aos genes alvo e a absorção subsequente pela praga de hemípteros por meio da alimentação resulta na regulação para baixo dos genes alvo na praga de hemípteros pelo silenciamento do gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga de hemípteros é afetada, e no caso de pelo menos um de Euchistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus leva à falha da infestação, alimentação, desenvolvimento e/ou reprodução com sucesso, ou leva à morte da praga de hemípteros. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi então são usadas para controlar a praga de hemípteros.

[00315] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas θ Zea mavs não transformada Genes alvo da praga de hemípteros ou sequências selecionadas para criar o dsRNA em grampo não tem similaridade com nenhuma sequência gênica vegetal conhecida. Por isso não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos que visam estes genes de praga de hemípteros ou sequências terão qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, o desenvolvimento e as características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" que não tem nenhum gene que expressa o grampo. A raiz, broto, folhagem da planta e as características de reprodução são comparadas. Não há diferença observável em modelos de crescimento e comprimento de raiz de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto vegetal como altura, números e tamanhos das folhas, tempo de florescência, tamanho floral e aparência são similares. Em geral, não há nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem a expressão das moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa. EXEMPLO 15 Glvcine max Transqênica Compreendendo Sequências da Praga de Hemípteros [00316] Dez a 20 plantas transgênicas T0 de Glycine max que abrigam vetores de expressão de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO: 115 e/ou SEQ ID NO 119 são geradas como é conhecido na técnica, incluindo por exemplo, por transformação mediada por Agrobacterium, como se segue. Sementes de soja madura (Glycine max) são esterilizadas durante a noite com gás cloro durante dezesseis horas. Seguinte à esterilização com gás cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma câmara de fluxo LAMINAR™ para afastar gás cloro. Depois, as sementes esterilizadas são embebidas com H20 estéril durante dezesseis horas no escuro usando uma caixa preta a 24Ό.

[00317] Preparação de sementes de soja divididas. A semente de soja dividida compreendendo uma porção de um protocolo de eixo embrionário requereu preparação do material da semente de soja que é cortado longitudinalmente, usando uma lâmina #10 afixada a um bis-turi, ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento da semente e para repartir a semente em duas seções de cotiiédo-ne. Atenção cuidadosa é tomada para remover parcialmente o eixo embrionário, em que aproximadamente 1/2 a 1/3 do eixo de embrião permanece ligado à extremidade nodal do cotilédone.

[00318] Inoculação. As sementes de soja divididas compreendendo uma porção parcial do eixo embrionário então são imersas durante aproximadamente 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tu-mefaciens (por exemplo, cepa EH A 101 ou EH A 105) contendo plas-mídeo binário compreendendo a SEQ ID NO: 115 e/ou a SEQ ID NO 119. A solução de Agrobacterium tumefaciens é diluída a uma concentração final de λ = 0,6 OD650 antes de imergir os cotilédones compreendendo o eixo do embrião.

[00319] Cocultura. Seguinte à inoculação, a semente de soja dividida é deixada em cocultura com a cepa de Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias no meio de cocultura (Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Impressão.) em uma placa de Petri recoberta com um pedaço de papel de filtro.

[00320] Indução de broto. Após 5 dias de cocultura, as sementes de soja divididas são lavadas em meios líquidos de Indução de Broto (SI) consistindo em sais B5, vitaminas B5, Ferro 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 30 g/L, MES 0,6 g/L, BAP 1,11 mg/L, Timentina™ 100 mg/L, cefotaxima 200 mg/L e vancomicina 50 mg/L (pH 5,7). As sementes de soja divididas então são cultivadas no Meio de Indução de Broto I (SI I) consistindo em sais de B5, vitaminas B5, ágar Noble 7 g/L, Ferro 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 30 g/L, MES 0,6 g/L, BAP 1,11 mg/L, Timentina™ 50 mg/L, cefotaxima 200 mg/L, vancomi-cina 50 mg/L (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone de frente e a extremidade nodal do cotilédone embutida no meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes da semente de soja dividida transformados são transferidos para o meio de Indução de Broto II (SI II) contendo meio SI I suplementado com glufosinato 6 mg/L (LIBERTY®).

[00321] Alongamento de broto. Após 2 semanas de cultura em meio SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e um suporte de broto fresco contendo o eixo embrionário são extirpados fazendo um corte na base do cotilédone. O suporte de broto isolado do cotilédone é transferido para o meio de Alongamento de Broto (SE). O meio SE consiste de sais de MS, Ferro 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 30 g/L e MES 0,6 g/L, asparagina 50 mg/L, ácido L-piroglutâmico 100 mg/L, IAA 0,1 mg/L, GA3 0,5 mg/L, ribosídeo zeatina 1 mg/L, Timentina™ 50 mg/L, cefotaxima 200 mg/L, vancomicina 50 mg/L, glufosinato 6 mg/L, ágar Noble 7 g/L, (pH 5,7). As culturas são transferidas para o meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas são cultivadas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24Ό com u m fotope-ríodo de 18 h em uma intensidade luminosa de 80-90 pmol/m2s.

[00322] Enraizamento. Os brotos alongados que se desenvolveram do suporte de broto de cotilédone são isolados cortando o broto alongado na base do suporte de broto de cotilédone e mergulhando o broto alongado em IBA 1 mg/L (ácido indol 3-butírico) durante 1 a 3 minutos para promover o enraizamento. Depois, os brotos alongados são transferidos para o meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, Ferro 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 20 g/L e MES 0,59 g/L, asparagina 50 mg/L, ácido L-piroglutâmico 100 mg/L, ágar Noble 7 g/L, pH 5,6) em bandejas phyta.

[00323] Cultivo. Seguinte à cultura em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24Ό, fotoperíodo de 18 h, durante 1-2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em uma taça de sundae coberta e colocada em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Con-trolled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dia longo (16 horas de luz/8 horas de escuridão) em uma intensidade luminosa de 120-150 pmol/m2s sob temperatura constante (22Ό) e umidade (40-50%) para aclimatação das mudas. As mudas enraizadas são aclimatadas em taças de sundae durante várias semanas antes que sejam transferidas para a estufa de aclimatação adicional e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[00324] 10 a 20 linhagens T-, independentes adicionais de Glycine max que expressam dsRNA em grampo para um construto de RNAi são obtidas para o desafio de BSB. O dsRNA em grampo pode ser derivado como apresentado na SEQ ID NO:119 ou compreendendo ainda de outra maneira a SEQ ID NO:115. Estas são confirmadas por RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA total de linhagens T-ι independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores projetados para ligar-se no ín-tron ST-LS1 do cassete de expressão em grampo em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos de cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas de cada gene alvo confirma a expressão de RNA em grampo em cada planta de Glycine max transgênica. O processamento do dsRNA em grampo dos genes alvo no siRNA é posteriormente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridi-zações de blot de RNA.

[00325] Além disso, as moléculas de RNAi que têm sequências de incompatibilidade com identidade de sequência de mais de 80% para genes alvo afetam as lagartas-da-raiz do milho em uma via similar àquela vista com moléculas de RNAi tendo identidade de sequência de 100% aos genes alvo. O pareamento da sequência com incompatibilidades com as sequências nativas para formar um dsRNA em grampo no mesmo construto de RNAi entrega si RN As processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação da praga de hemípteros.

[00326] Entrega in planta de dsRNA, si RN A, shRNA ou mi RN A correspondendo aos genes alvo e a absorção subsequente pela praga de hemípteros por meio da alimentação resulta na regulação para baixo dos genes alvo na praga de hemípteros pelo silenciamento do gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga de hemípteros é afetada, e no caso de pelo menos um de Euchistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus leva à falha da infestação, alimentação, desenvolvimento e/ou reprodução com sucesso, ou leva à morte da praga de hemípteros. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi então são usadas para controlar a praga de hemípteros.

[00327] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transqênicas e de Glvcine max não transformada Genes alvo da praga de hemípteros ou sequências selecionadas para criar o dsRNA em grampo não tem similaridade com nenhuma sequência gênica vegetal conhecida. Por isso não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos que visam estes genes da praga de hemípteros ou sequências terão qualquer efeito deletério sobre as plantas trans-gênicas. Entretanto, o desenvolvimento e as características morfológi- cas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" que não tem nenhum gene que expressa o grampo. A raiz, broto, folhagem da planta e as características de reprodução são comparadas. Não há diferença observável em modelos de crescimento e comprimento da raiz de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto vegetal como altura, números e tamanhos das folhas, tempo de florescência, tamanho floral e aparência são similares. Em geral, não há diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem a expressão das moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa. EXEMPLO 16 Transcriptoma do besouro do pólen [00328] Insetos: Larvas e besouros do pólen adultos foram coletados de campos com plantas de colza florescentes (Giessen, Alemanha). Besouros adultos jovens (cada um por grupo de tratamento: n = 20; 3 replicatas) foram desafiados injetando uma mistura de duas bactérias diferentes (Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa), uma levedura (Saccharomyces cerevisiae) e LPS bacteriano. As culturas bacterianas foram cultivadas a 37Ό com agitaçã o, e a densidade ótica foi monitorada em 600 nm (OD6oo)· As células foram coletadas em OD6oo ~1 por centrifugação e ressuspensas em salina tamponada com fosfato. A mistura foi introduzida ventrolateralmente perfurando o abdome dos imagos do besouro do pólen usando uma agulha de dissecação mergulhada em uma solução aquosa de LPS 10 mg/ml (en-dotoxina purificada de E. colr, Sigma, Taufkirchen, Alemanha) e culturas bacterianas e culturas de levedura. Junto com os besouros imuno desafiados, besouros e larvas naíve foram coletados (n = 20 por e 3 replicatas cada um) no mesmo ponto de tempo.

[00329] Isolamento de RNA: RNA total foi extraído 8 h após imunização usando larvas e besouros congelados TriReagent (Molecular Research Centre, Cincinnati, OH, EUA) e purificado usando RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) em cada caso seguindo as referências dos fabricantes. A integridade do RNA foi verificada usando Agilent 2.100 Bioanalyzer e RNA 6.000 Nano Kit (Agilent Technologies, Paio Alto, CA, EUA). A quantidade de RNA foi determinada usando um espectrofotômetro NANODROP® ND-1000. O RNA foi extraído de cada um dos grupos de adultos de tratamento imunoinduzido, grupos controle de adultos, e grupos larvais individualmente e quantidades iguais de RNA total foram posteriormente combinados em um agrupamento por amostra (adultos imunodesafiados, adultos controle e larvas) para o sequenciamento.

[00330] Informação do transcriptoma: A geração de dados de RNA-Seq e a montagem de RNA-Seq de 100 bp de leitura única foram realizadas separadamente em 5 pg de RNA total isolado de besouros adultos imunodesafiados, besouros naíve (controle) adultos e larvas não tratadas. O sequenciamento foi realizado por Eurofins MWG Ope-ron usando a plataforma lllumina HiSeq-2000. Isto produziu 20,8 milhões de leituras para a amostra do besouro controle adulto, 21,5 milhões de leituras para a amostra do besouro adulto desafiado com LPS e 25,1 milhões de leituras para a amostra larval. As leituras agrupadas (67,5 milhões) foram montadas usando o programa de montagem Vel-vet/Oases (M.H. Schulz et al. (2012) Bioinformatics. 28:1086-92; Zer-bino & E. Birney (2008) Genome Research. 18:821-9). O transcriptoma continha 55.648 sequências.

[00331] Identificação de rop do Besouro do pólen: Uma busca com tblastn do transcriptoma foi usada para identificar os contigs compatíveis. Como uma consulta, a sequência de peptídeos de rop de Tribo-lium castaneum foi usada (GenBank® NP_001164155.1). Dois contigs foram identificados (RGK_contig6910, RGK_contig46722). A lacuna entre os contigs foi completada com leituras não montadas usando um instrumento de adequação. GAP5 (Bonfield JK & Whitwham (2010). Bioinformatics 26: 1699-1703) foi usado para a verificação de sequências. EXEMPLO 17 Mortalidade do Besouro do Pólen (Meliaethes aeneus) após tratamento com RNAi de roo [00332] Os iniciadores específicos para o gene incluindo a sequência de promotor da T7 polimerase na extremidade 5’ foram usados para criar produtos de PCR de aproximadamente 500 bp por PCR (SEQ ID NOs: 129-130). Os fragmentos de PCR foram clonados no vetor pGEM T easy de acordo com o protocolo do fabricante e enviados a uma companhia de sequenciamento para verificar a sequência. O dsRNA então foi produzido pela T7 RNA polimerase (Kit MEGAscript® RNAi, Applied Biosystems) de um construto de PCR gerado do pias-mídeo sequenciado de acordo com o protocolo do fabricante.

[00333] A injeção de -100 nl de dsRNA (1 ug/ul) em larvas e besouros adultos foi realizada com um micromanipulador sob uma dissecação com estereomicroscópio (n=10, 3 replicatas biológicas). Os animais foram anestesiados em gelo antes que fossem afixados à fita dupla face. Os controles receberam o mesmo volume de água. Um dsRNA controle negativo de IMPI (o gene de inibidor de metaloproteinase de inseto do lepidóptero Galleria mellonella) foi conduzido. Todos os controles em todos os estágios não puderam ser testados devido a uma falta de animais.

[00334] Os besouros do pólen foram mantidos em placas de Petri com o pólen seco e um tecido úmido. As larvas foram criadas em caixas plásticas na inflorescência de canola em meios de ágar/água. TABELA 14. Resultados de bioensaio da injeção de besouro do pólen adulto. *Desvio Padrão TABELA 15. Resultados de bioensaio da injeção de besouro do pólen larval. *Desvio Padrão [00335] Os controles foram realizados em uma data diferente devido à disponibilidade limitada de insetos.

[00336] Bioensaio de Alimentação: Os besouros foram mantidos sem acesso à água em tubos falcon vazios por 24 h antes do tratamento. Uma gotícula de dsRNA (~5 pl) foi colocada na pequena placa de Petri e 5 a 8 besouros foram adicionados à placa de Petri. Os animais foram observados sob um estereomicroscópio e aqueles que ingeriram a solução de dieta contendo dsRNA foram selecionados para o bioensaio. Os besouros foram transferidos para placas de Petri com pólen seco e um tecido úmido. Os controles receberam o mesmo volume de água. Um dsRNA controle negativo de IMPI (gene do inibidor de metaloproteinase de inseto do lepidóptero Galleria mellonella) foi conduzido. Todos os controles em todos os estágios não puderam ser testados devido a uma falta de animais. TABELA 16. Resultados do bioensaio de alimentação adulto *Desvio Padrão [00337] Os controles foram realizados em uma data diferente devido à disponibilidade limitada de insetos. EXEMPLO 18 Transformação mediada por Aarobacteríum de hipocótilos de Ca-nola (Brassica napus) Preparação de Aarobacteríum [00338] A cepa de Agrobacterium contendo um plasmídeo binário é riscada em meios de YEP (Bacto Peptona™ 20,0 g/L e Extrato de Levedura 10,0 g/L) contendo estreptomicina (100 mg/ml) e espectinomi-cina (50 mg/mL) e incubada durante 2 dias a 28Ό. A cepa de Agrobacterium propagada contendo o plasmídeo binário é raspada da placa da faixa de 2 dias usando uma alça de inoculação estéril. A cepa de Agrobacterium raspada contendo o plasmídeo binário então é ino-culada em 150 mL do líquido de YEP modificado com estreptomicina (100 mg/ml) e espectinomicina (50 mg/ml) em frasco(s) de 500 mL estéril com defletores e agitados em 200 rpm a 28Ό. As culturas são centrifugadas e ressuspensas no meio M (sais de LS, glicose 3%, vitaminas B5 modificadas, cinetina 1 μΜ, 2,4-D 1 μΜ, pH 5,8) e diluídas à densidade apropriada (50 Unidades Klett como medido usando um espectrofotômetro) antes de transformação dos hipocótilos de canola. Transformação da Canola [00339] Germinação de semente: Sementes de Canola (var. Nexera 710™) têm a superfície esterilizada em Clorox™ 10% durante 10 minutos e enxaguadas três vezes com água destilada estéril (as sementes estão contidas em coadores de aço durante este processo). As sementes são plantadas para a germinação em meio 1/4 MS de Canola (1/2 MS, sacarose 2%, ágar 0,8%) contidas em Phytatrays™ (25 sementes por Phytatray™) e colocadas em uma câmara de crescimento Percival™ com o ajuste do regime de crescimento a 25°C, fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão durante 5 dias de germinação.

[00340] Pré-tratamento: No dia 5, segmentos de hipocótilos de aproximadamente 3 mm de comprimento são assepticamente extirpados, a raiz remanescente e as seções do broto são descartadas (a secagem de segmentos de hipocótilos é evitada imergindo os segmentos de hipocótilos em 10 mL de água milliQ™ estéril durante o processo de excisão). Os segmentos de hipocótilos são colocados horizontalmente no papel de filtro estéril no meio de indução de calo, MSK1D1 (MS, cinetina 1 mg/L, 2,4-D 1 mg/L, sacarose 3,0%, phytagar 0,7%) para pré-tratamento de 3 dias em uma câmara de crescimento Percival™ com o regime de crescimento de 22-23 Ό, e um fotoperíodo de 16 horas de luz, 8 horas de escuridão.

[00341] Cocultura com Agrobacterium: O dia anterior da cocultura de Agrobacterium, frascos do meio de YEP contendo os antibióticos apropriados são inoculados com a cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo binário. Os segmentos de hipocótilos são transferidos do meio de indução de calo de papel de filtro, MSK1D1 para placas de Petri™ vazias de 100 x 25 mm contendo 10 mL do meio M líquido para impedir os segmentos de hipocótilos de secarem. Uma espátula é usada neste estágio para esvaziar os segmentos e transferir os segmentos para o novo meio. O meio M líquido é removido com uma pipe-ta e 40 mL da suspensão de Agrobacterium são adicionados à placa de Petri™ (500 segmentos com 40 mL da solução de Agrobacterium). Os segmentos de hipocótilos são tratados durante 30 minutos com turbilhão periódico da placa de Petri™ para que os segmentos de hipocótilos permaneçam imersos na solução de Agrobacterium. No fim do período de tratamento, a solução de Agrobacterium é pipetada em um copo grande descartável; autoclavada e descartada (a solução de Agrobacterium é completamente removida para prevenir o crescimento excessivo de Agrobacterium). Os hipocótilos tratados são transferidos com pinça de volta às placas originais que contêm meios MSK1D1 recobertos com papel de filtro (cuidado é tomado para assegurar que os segmentos não sequem). Os segmentos de hipocótilos transformados e os segmentos de hipocótilos controle não transformados são devolvidos à câmara de crescimento Percival™ sob intensidade luminosa reduzida (recobrindo as placas com folha de alumínio), e os segmentos de hipocótilos tratados são cocultivados com Agrobacterium durante 3 dias.

[00342] Indução de calo em meio de seleção: Após 3 dias da cocul-tura, os segmentos de hipocótilos são individualmente transferidos com pinça para o meio de indução de calo, MSK1D1H1 (MS, cinetina 1 mg/L, 2,4-D 1 mg/L, MES 0,5 g/L, AgN03 5 mg/L, Timentina™ 300 mg/L, carbenicilina 200 mg/L, Herbiace™ 1 mg/L, sacarose 3%, phyta-gar 0,7%) com o arranjo do regime de crescimento a 22-26°C. Os segmentos de hipocótilos são ancorados no meio mas não são profundamente introduzidos no meio.

[00343] Seleção e regeneração de broto: Após 7 dias no meio de indução de calo, os segmentos de hipocótilos com calos são transferidos para o Meio de Regeneração de Broto 1 com seleção, MSB3Z1H1 (MS, BAP 3 mg/L, zeatina 1 mg/L, MES 0,5 g/L, AgN03 5 mg/L, Timen-tina™ 300 mg/L, carbenicilina 200 mg/L, Herbiace™ 1 mg/L, sacarose 3%, phytagar 0,7%). Após 14 dias, os segmentos de hipocótilos que desenvolvem brotos são transferidos para Meio de Regeneração 2 com seleção aumentada, MSB3Z1H3 (MS, BAP 3 mg/L, Zeatina 1 mg/L, MES 0,5 g/L, AgN03 5 mg/L, Ti menti na™ 300 mg/l, carbenicilina 200 mg/L, Herbiace™3 mg/L, sacarose 3%, phytagar 0,7%) com o ajuste do regime de crescimento a 22-26°C.

[00344] Alongamento de broto: Após 14 dias, os segmentos de hipocótilos que desenvolvem brotos são transferidos do Meio de Regeneração 2 para o meio de alongamento de broto, MSMESH5 (MS, Ti-mentina™ 300 mg/L, Herbiace™ 5 mg/l, sacarose 2%, Ágar TC 0,7%) com o ajuste do regime de crescimento a 22-26°C. Os brotos que já estão alongados foram isolados dos segmentos de hipocótilos e transferidos para MSMESH5. Após 14 dias, os brotos remanescentes que não se alongaram no primeiro turno de cultura no meio de alongamento de broto são transferidos para o meio de alongamento de broto fresco, MSMESH5. Neste estágio, todos os segmentos de hipocótilos remanescentes que não produzem brotos são descartados.

[00345] Indução de raiz: Após 14 dias de cultura no meio de alongamento de broto, os brotos isolados são transferidos para o meio MSMEST (MS, MES 0,5 g/L, Timentina™ 300 mg/L, sacarose 2%, Ágar TC 0,7%) para a indução de raiz a 22-26Ό. Qua Iquer broto que não produz raízes após a incubação na primeira transferência para o meio MSMEST é transferido para um segundo ou terceiro ciclo de incubação no meio MSMEST até que os brotos desenvolvam raízes.

[00346] Análise de PCR: Segmentos de hipocótilos de canola transformados, que se regeneraram em brotos compreendendo raízes são ainda analisados via um ensaio de confirmação molecular de PCR. O tecido da folha é obtido dos brotos verdes e testado via PCR para a presença do gene do marcador selecionável apropriado. Qualquer broto clorótico é descartado e não submetido à análise de PCR. As amostras que são identificadas como positivas para a presença do gene do marcador selecionável apropriado são mantidas e cultivadas no meio MSMEST para continuar o desenvolvimento e o alongamento dos brotos e raízes. As amostras que são identificadas como não contendo o gene do marcador selecionável apropriado negativo de acordo com a análise de PCR são descartadas.

[00347] As plantas de canola transformadas compreendendo brotos e raízes que são positivos por PCR para a presença do gene do marcador selecionável apropriado são transplantadas no solo em uma estufa. Após estabelecimento das plantas de canola dentro do solo, as plantas de canola são ainda analisadas para quantificar o número de cópias do cassete de expressão gênica apropriado via um ensaio de PCR quantitativo Invader™ e Southern blotting. As plantas de canola T0 transgênicas que são confirmadas contendo pelo menos uma cópia do cassete de expressão gênica apropriado são avançadas para a análise adicional da semente. As sementes obtidas destas plantas de canola T0 transgênicas, isto é, sementes de canola Ti, são analisadas para detectar as presenças do gene alvo.

[00348] Embora a presente revelação possa ser suscetível a várias modificações e formas alternativas, as modalidades específicas foram descritas detalhadamente por meio de exemplos neste pedido. Entretanto, deve ser entendido que a presente revelação não é destinada a ser limitada às formas particulares descritas. Em vez disso, a presente revelação deve cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas que estão incluídos no escopo da presente revelação como definido pelas seguintes reivindicações acrescentadas e seus equivalentes legais.

REIVINDICAÇÕES

Claims (29)

1. RNA caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 15 nucleotídeos contíguos tendo, ao longo de seu comprimento completo, identidade de pelo menos 80% a uma sequência de DNA que codifica pelo menos uma porção de Ras oposto (ROP).

2. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA compreende um RNA de fita dupla (dsRNA).

3. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contíguos.

4. RNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dsRNA compreende uma haste e uma alça.

5. RNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da haste da haste-alça do RNA expresso é formada pela ligação de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos à sequência complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contíguos.

6. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA é um iRNA.

7. RNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o iRNA é um dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA ou um hpR-NA.

8. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA compreende um análogo de ácido nucleico.

9. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA é capaz de inibir a expressão de ROP em um co-leóptero ou hemíptero.

10. RNA de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a inibição da expressão de ROP é através do silenci-amento do gene pós-transcricional.

11. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ROP é ROP de Diabrotica virgifera virgifera ou ROP de Euschistus heros ou ROP de Meligethes aeneus.

12. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ROP é codificado pela SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:131 ou SEQ ID NO:133,

13. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica pelo menos uma porção de ROP é selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOS:3, 4, 114, 119, e 128.

14. RNA de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos 15 nucleotídeos contíguos são selecionados a partir do grupo consistindo em 19, 21,25, 29, 30, 40, 50, 70, e 100 nucleotídeos contíguos.

15. RNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identidade de pelo menos 80% é selecionada a partir do grupo consistindo em identidade de 85%, 90%, 95%, e 100%.

16. Célula vegetal caracterizada pelo fato de compreender o RNA como definido na reivindicação 1.

17. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a planta selecionada a partir do grupo consistindo nesta.

18. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de codificar o RNA como definido na reivindicação 1.

19. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas ID SEQ Nos: 3, 4, 114, 119 e 128.

20. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é operacionalmente ligado a um promotor.

21. Vetor caracterizado pelo fato de compreender ácido nu-cleico como definido na reivindicação 17.

22. Célula vegetal caracterizada pelo fato de compreender ácido nucleico como definido na reivindicação 17.

23. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a planta selecionada a partir do grupo consistindo nesta.

24. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico como definido na reivindicação 17 está integrado no genoma da célula vegetal.

25. Método de controle de pragas de insetos, o método caracterizado pelo fato de compreender a expressão de ácido nucleico como definido na reivindicação 18 em uma planta.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a praga de inseto é um coleóptero ou um hemíptero.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a praga de inseto é selecionada a partir do grupo consistindo em Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi, Diabro-tica undecimpunctata howardi, Diabrotica virgifera zeae, Diabrotica bal-teata, Diabrotica undecimpunctata tenella, Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata, Euschistus heros, Nezara viridula, Piezodorus guil-dinii, Halyomorpha halys, Acrosternum hilare, Euschistus servus e Me-ligethes aeneus.

28. Fonte de alimentação de uma praga de insetos caracterizada pelo fato de compreender o RNA como definido na reivindicação 1.

29. Método de controle de pragas de inseto, o método caracterizado pelo fato de compreender alimentação a uma praga de inseto da fonte de alimentação como definida na reivindicação 28.