BR102017028301A2 - Moléculas de ácido nucleico de fator de processamento pré-mrna 8 (prp8) para o controle de pragas de inseto - Google Patents

Abstract

"moléculas de ácido nucleico de fator de processamento pré-mrna 8 (prp8) para o controle de pragas de inseto". esta divulgação refere-se às moléculas de ácido nucleico e a métodos de uso das mesmas para o controle de pragas de inseto através da inibição mediada por interferência de rna da codificação de alvo e sequências não codificadas transcritas em pragas de inseto, incluindo pragas de coleópteros. a divulgação também se refere aos métodos para a produção de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de inseto, e as células vegetais e plantas assim obtidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE FATOR DE PROCESSAMENTO PRÉ-MRNA 8 (PRP8) PARA O CONTROLE DE PRAGAS DE INSETO.

REIVINDICAÇÃO PRIORITÁRIA [001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. §119 (e) ao Pedido de Patente U.S. No. de Série 15/394.576 depositado em 29 de dezembro de 2017, cujas divulgações são aqui incorporadas na sua totalidade por esta referência.

CAMPO TÉCNICO DA DIVULGAÇÃO [002] A presente invenção refere-se de um modo geral ao controle genético do dano das plantas provocado por pragas de inseto (por exemplo, pragas de coleópteros). Nas modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de polinucleotídeos de codificação e não codificação alvo, e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para a expressão de repressão ou inibição pós-transcrição de polinucleotídeos de codificação e não codificação alvo nas células de uma praga de inseto para fornecer um efeito protetor de plantas. FUNDAMENTOS [003] A larva da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de larva da raiz do milho mais devastadoras da América do Norte e é uma preocupação particular nas áreas de cultivo de milho no meio-oeste dos Estados Unidos. A larva da raiz do milho do Norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie estreitamente relacionada que coabita muito do mesmo alcance que a WCR. Existem várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: a larva da raiz do milho mexicana (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a larva da raiz do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella·, D.

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2/164 speciosa Germar; e D. u. Undecimpunctata Mannerheim. O United States Department of Agricultura estima que as larvas da raiz do milho causam $ 1 bilhão em perda de receita por ano, incluindo $ 800 milhões em perda de rendimento e $ 200 milhões em custos de tratamento.

[004] Os ovos tanto da WCR quanto da NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem na fase do ovo ao longo do inverno. Os ovos são oblongos, brancos e com menos de 0,004 polegadas de comprimento. As larvas incubam no final de maio ou início de junho, com o tempo preciso de incubação de ovos variando de ano para ano devido a diferenças de temperatura e localização. As larvas recém-incubadas são vermes brancos com menos de 0,125 polegadas de comprimento. Uma vez incubadas, as larvas começam a se alimentar de raízes de milho. As larvas da raiz do milho passam por três instar larvais. Após a alimentação durante várias semanas, as larvas mudam para o estágio pupal. Elas entram em estado de pupa no solo, e depois emergem do solo como adultas em julho e agosto. As larvas da raiz adultas possuem cerca de 0,25 polegada de comprimento.

[005] As larvas do verme da raiz do milho completam o desenvolvimento sobre o milho e várias outras espécies de gramíneas. As larvas criadas em capim rabo de raposa amarela emergem mais tarde e possuem um tamanho menor de cápsula de cabeça como adultos do que as larvas criadas no milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. Os adultos da WCR se alimentam da seda, pólen e grãos de milho nas pontas das espigas expostas. Se os adultos da WCR emergem antes que os tecidos reprodutivos do milho estejam presentes, eles podem se alimentar do tecido foliar, retardando assim o crescimento da planta e ocasional mente matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos mudarão rapidamente para sedas e pólen preferidos quando estiverem disponíveis. Os adultos da NCR também se

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3/164 alimentam de tecidos reprodutivos da planta de milho, mas ao contrário raramente se alimentam de folhas de milho.

[006] A maior parte do dano da raiz no milho é provocada pela alimentação larval. As larvas da raiz recentemente chocadas alimentam-se inicialmente nos cabelos finos da raiz de milho e fazem covas nas pontas de raiz. À medida que as larvas crescem, elas se alimentam e fazem covas nas raízes primárias. Quando as larvas da raiz de milho são abundantes, a alimentação larval geralmente resulta na poda de raízes até a base da haste de milho. A lesão radicular grave interfere com a capacidade das raízes de transportar água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta e resulta em produção reduzida de grãos, reduzindo assim drasticamente o rendimento geral. A lesão radicular grave também resulta frequentemente na hospedagem das plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui ainda mais o rendimento. Além disso, a alimentação de adultos nos tecidos reprodutores de milho pode resultar na poda de sedas na ponta da espiga. Se este corte de seda for suficientemente grave durante o derrame de pólen, a polinização pode ser interrompida.

[007] O controle das larvas da raiz do milho pode ser tentado por rotação de culturas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thuringiensis), plantas transgênicas que expressam toxinas Bt ou uma combinação destes. A rotação de culturas sofre a desvantagem de colocar restrições indesejadas sobre o uso de terras agrícolas. Além disso, a oviposição de algumas espécies de larvas da raiz pode ocorrer em campos de soja, minimizando assim a eficácia da rotação de culturas praticada com milho e soja.

[008] Os inseticidas químicos são as estratégias mais utilizadas para alcançar o controle da larva da raiz do milho. O uso de inseticidas químicos, no entanto, é uma estratégia imperfeita de controle da larva

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4/164 da raiz do milho; mais de $ 1 bilhão pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano devido à larva da raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados ao custo do dano da larva da raiz do milho que pode ocorrer apesar do uso dos inseticidas. Populações elevadas de larvas, chuvas intensas e aplicação inadequada de inseticidas podem resultar em controle inadequado da larva da raiz do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar cepas de larva da raiz resistentes a inseticidas, além de suscitar preocupações ambientais significativas devido à toxicidade das espécies não visadas.

[009] Os besouros de pólen europeus (PB) são pragas graves na semente de colza para produção de óleo, tanto as larvas como os adultos se alimentam de flores e pólen. O dano do besouro de pólen na cultura pode causar a perda de rendimento de 20 a 40%. A principal espécie de praga é Meligethes aeneus. Atualmente, o controle do besouro do pólen na colza depende principal mente de piretróides que deverão ser eliminados em breve por causa de seu perfil ambiental e regulatório. Além do mais, a resistência do besouro do pólen aos inseticidas químicos existentes tem sido relatada. Portanto, são urgentemente necessárias soluções de controle de besouro de pólen ambientalmente amigáveis com novos modos de ação.

[0010] Na natureza, os besouros de pólen invernam como adultos no solo ou debaixo da camada humífera de folhas. Na primavera, os adultos emergem da hibernação e começam a se alimentar de flores de ervas daninhas, e migram para plantas de colza em floração. Os ovos são colocados em botões da flor de colza. As larvas se alimentam e se desenvolvem nos botões e nas flores. As larvas de fase tardia encontram um local de pupação no solo. A segunda geração de adultos surge em julho e agosto e se alimenta de várias plantas com flores antes de encontrar os locais para a hibernação.

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5/164 [0011] A interferência do RNA (RNAi) é um processo que utiliza as vias celulares endógenas, pelas quais uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para todos ou qualquer parte de tamanho adequado de um genealvo resulta na degradação do mRNA assim codificado. Nos últimos anos, o RNAi tem sido utilizado para executar o gene abatido em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, embriões de insetos e células em cultura de tecidos. Ver, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

[0012] O RNAi executa a degradação do mRNA através de uma via endógena incluindo o complexo da proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominados RNA de interferência pequeno (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de filamento único: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado e o filamento guia é incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Os ácidos micro ribonucleicos (miRNAs) são moléculas estrutural mente muito semelhantes que são clivadas de moléculas precursoras contendo um circuito de polinucleotídeo que conecta os filamentos passageiros e guias híbridos, e eles podem ser incorporados de forma semelhante ao RISC. O silenciamento de genes pós-transcrição ocorre quando o filamento guia se liga especificamente a uma molécula de mRNA complementar e induz a divagem por Argonaute, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido por se espalhar sistematicamente por todo o organismo, apesar das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucariotas tais como plantas, nematóides e alguns insetos.

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6/164 [0013] Somente os transcritos complementares ao siRNA e/ou ao miRNA são clivados e degradados e, portanto, o silenciamento da expressão de mRNA é específica da sequência. Nas plantas, existem vários grupos funcionais de genes DICER. O efeito de silenciamento de genes de RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio na abundância da transcrição alvo de 90% ou mais, com a consequente redução nos níveis da proteína correspondente. Em insetos, existem pelo menos dois genes DICER, onde DlCER1 facilita a degradação direcionada ao miRNA por Argonautel. Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81. DICER2 facilita a degradação direcionada ao siRNA por Argonaute2.

[0014] A Patente U.S. 7.612.194 e as Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 divulgam uma biblioteca de 9112 sequências de marca de sequência expressa (EST) isoladas de pupas de D. v. Virgifera LeConte. Sugere-se na Patente

U.S. 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 ligar de maneira operativa a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma das várias sequências parciais particulares de D. v. virgifera vacuolar-tipo H+-ATPase (V-ATPase) nela divulgadas para a expressão de RNA antissenso nas células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere ligar operativamente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não divulgada (a sequência parcial é mencionada como 58% idêntica ao produto do gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antissenso nas células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere ligar de forma operacional um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares dos genes da subunidade beta do complexo proteico de D. v. Virgifera para a exPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 17/420

7/164 pressão de RNA antissenso nas células vegetais. Além disso, a Patente U.S. 7.943.819 divulga uma biblioteca de 906 sequências de marca de sequência expressa (EST) isoladas das larvas de D. v. Virgifera LeConte, pupas e intestinos intermediários dissecados e sugere ligar de forma operativa um promotor a uma sequência de nucleotídeo que é complementar a um sequência parcial particular de um gene de proteína 4b do corpo multivesicular de D. v. virgifera para a expressão de RNA de filamento duplo nas células vegetais.

[0015] Nenhuma outra sugestão é fornecida na Patente U.S. 7.612.194 e nas Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para uso de qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências nelas listadas para interferência de RNA, diferentes das várias sequências parciais particulares de VATPase e das sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma das Patentes U.S. 7.612.194 e das Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 fornecem qualquer orientação sobre quais outras das mais de nove mil sequências fornecidas seria letal, ou mesmo de outra forma útil, em espécies de larva da raiz do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. 7.943.819 não fornece nenhuma sugestão para uso de qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências nela listadas para interferência de RNA, diferente da sequência parcial particular de um gene de proteína 4b de corpo multivesicular carregado. Além disso, a Patente U.S. 7.943.819 não fornece nenhuma orientação sobre qual outra das mais de novecentas sequências fornecidas seria letal, ou mesmo de outra forma útil, em espécies de larva da raiz de milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. A Publicação do Pedido de Patente U.S. No. U.S. 2013/040173 e a Publicação do Pedido PCT No. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada de um gene de DiabrotiPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 18/420

8/164 ca virgifera Snf7 para interferência de RNA no milho. (Também divulgado em Bolognesi et al. (2012) PLOS ONE 7(10): e47534. doi: 10.1371 /journal .pone.0047534).

[0016] A esmagadora maioria das sequências complementares para DNAs da larva da raiz do milho (tal como o anterior) não fornece um efeito protetor da planta de espécies de larva da raiz do milho quando utilizado como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326, descrevem os efeitos da inibição de vários alvos de gene WCR por RNAi. Esses autores relataram que 8 dos 26 genes-alvo que eles testaram não foram capazes de fornecer mortalidade de pestes de coleópteros experimentalmente significativa em uma concentração muito alta de iRNA (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm².

[0017] Os autores da Patente U.S. 7.612.194 e da Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 prepararam o primeiro relatório de RNAi in planta nas plantas de milho visando a larva da raiz do milho ocidental. Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Estes autores descrevem um sistema de RNAi dietético in vivo de alto rendimento para a triagem de potenciais genes-alvo para o desenvolvimento de milho de RNAi transgênico. De um conjunto genético inicial de 290 alvos, apenas 14 apresentaram potencial de controle de larvas. Um dos RNAs de filamento duplo mais eficazes (dsRNA) direcionou um gene que codifica a subunidade de ATPase vacuolar A (VATPase), resultando em uma supressão rápida do mRNA endógeno correspondente e ativação de uma resposta específica de RNAi com baixas concentrações de dsRNA. Assim, esses autores documentaram pela primeira vez o potencial de RNAi in planta como uma possível ferramenta de manejo de pragas, ao mesmo tempo que simultaneamente demonstra que alvos efetivos não poderiam ser identificados com precisão a priori, mesmo de um conjunto relativamente pequeno de genes

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9/164 candidatos.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO [0018] São aqui divulgadas moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes-alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) e seus métodos de uso, para o controle de pragas de insetos, incluindo, por exemplo, pragas de coleópteros, tais como D. v. virgifera LeConte (larva da raiz do milho ocidental, WCR); D. barberi Smith and Lawrence (larvas da raiz do milho do norte, NCR); D. u. howardi Barber (larva da raiz do milho do sul, SCR); D. v. Zeae Krysan and Smith (larva da raiz do milho mexicano, MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella·, D. speciosa Germar; D. u. Undecimpunctata Mannerheim e Meligethes aeneus Fabricius (besouro de pólen, PB). Nos exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico exemplares são divulgadas que podem ser homólogas a pelo menos uma parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de inseto.

[0019] Nestes e outros exemplos, a sequência de ácido nucleico nativo pode ser um gene-alvo, cujo produto pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; ou envolvido no desenvolvimento larval. Em alguns exemplos, a inibição póstranscrição da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo homólogo pode ser letal para uma praga de inseto ou resultar em crescimento reduzido e/ou desenvolvimento de uma praga de inseto. Nos exemplos específicos, o fator de processamento de pré-mRNA 8 (prp8) ou um prp8homólogo pode ser selecionado como um gene-alvo para o silenciamento póstranscrição. Em exemplos particulares, um gene-alvo útil para a inibição pós-transcrição é um gene prp8 selecionado do grupo que consiste em Diabrotica prp8 (por exemplo, SEQ ID NO: 1 (prp8-1) e SEQ ID NO: 3 (prp8-2)) e Meligethes prp8 (por exemplo, SEQ ID NO: 5). Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo o polinucleotídeo

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10/164 da SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; e/ou fragmentos de qualquer um dos anteriores (por exemplo, SEQ ID NOs: 7 a 12 e os seus complementos) é, portanto, aqui divulgado.

[0020] Também são divulgadas as moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 85% idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um produto do gene-alvo (por exemplo, o produto de um gene prp8). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico ao Diabrotica PRP8 (por exemplo, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4); Meligethes PRP8 (por exemplo, SEQ ID NO: 6); e/ou uma sequência de aminoácido dentro de um produto de um gene prp8. São ainda divulgadas as moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que é o complemento reverso de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um produto do gene-alvo.

[0021] Também são divulgados os polinucleotídeos de cDNA que podem ser utilizados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares de todo ou parte de um gene-alvo de praga de inseto, por exemplo, um gene prp8. Nas modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Nos exemplos particulares, as moléculas de cDNA são divulgadas que podem ser utilizadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte de um gene prp8 (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5).

[0022] Ainda divulgados são os meios para inibir a expressão de

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11/164 um gene prp8 em uma praga Diabrotica, e meios para fornecer proteção de pragas Diabrotica mediada por prp8 a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica é uma molécula de RNA de filamento duplo, em que um filamento da molécula consiste num polirribonucleotídeo selecionado do grupo que consiste da SEQ ID NOs: 86 a 90; e os seus complementos. Os equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica incluem moléculas de RNA de filamento duplo compreendendo um polirribonucleotídeo que é substancialmente homólogo a todo ou parte de um gene prp8 de Diabrotica compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7 a 11. Um meio para fornecer proteção de praga Diabrotica mediada por prp8 para uma planta é uma molécula de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica um meio para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica operacionalmente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0023] Também são divulgados meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Meligethes, e meios para fornecer proteção de praga Meligethes mediada por prp8 à uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Meligethes é uma molécula de RNA de filamento duplo, em que um filamento da molécula consiste do polirribonucleotídeo de SEQ ID NO: 92; e os seus complementos. Os equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Meligethes incluem moléculas de RNA de filamento dupla compreendendo um polirribonucleotídeo que é substancialmente homólogo no todo ou parte de um gene Prp8 de Meligethes compreendendo a SEQ ID NO: 12. Um meio para fornecer proteção contra pragas Meligethes mediada por prp8 a uma planta é uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo

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12/164 que codifica um meio para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Meligethes de maneira operável ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0024] Adicionalmente divulgados são os métodos para o controle de uma população de uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleópteros), compreendendo fornecer a uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleópteros) uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, mRNA, miRNA e hpRNA) que funciona após ser absorvida pela praga para inibir uma função biológica dentro da praga.

[0025] Em algumas modalidades, os métodos para o controle de uma população de uma praga de coleópteros compreendem fornecer à praga de coleópteros uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 84; o complemento da SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 85; o complemento da SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; o complemento da SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; o complemento da SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; o complemento da SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; o complemento da SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; o complemento da SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; o complemento da SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; o complemento da SEQ ID NO: 92; um polinucleotídeo que hibrida com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um polinucleotídeo que se hibrida com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo todo ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um polinucleotídeo que hibrida com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 12; e o complemento de um polinucleotídeo que

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13/164 híbrida com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 12.

[0026] Nas modalidades particulares, um iRNA que funciona após ser absorvido por uma praga de inseto para inibir uma função biológica dentro da praga é transcrito a partir de um DNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer SEQ ID NO: 7 a 11; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo todo ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 12; e o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 12.

[0027] Também são aqui divulgados os métodos em que os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser fornecidos a uma praga de inseto em um ensaio à base de dieta, ou nas células vegetais geneticamente modificadas que expressam os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nestes e outros exemplos, os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos pela praga. A ingestão de dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em RNAi na praga, que por sua vez pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga e, em última análise, levar à mortalidade. Nos exemplos particulares, uma praga de coleópteros controlada pelo uso de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR, NCR,

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SCR e/ou PB.

[0028] As características anteriores e outras tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada das várias modalidades, que prossegue com referência às FIGs. de 1 a 2 anexas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0029] A FIG. 1 inclui uma descrição de uma estratégia utilizada para gerar dsRNA a partir de um único modelo de transcrição com um par isolado de iniciadores.

[0030] A FIG. 2 inclui uma descrição de uma estratégia utilizada para gerar dsRNA a partir de dois modelos de transcrição.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0031] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequências anexas são mostradas utilizando abreviações de letras padrão para bases nucleotídicas, como definido em 37 C.F.R. § 1.822. As sequências de ácido nucleico e aminoácido listadas definem as moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) tendo os monômeros de nucleotídeo e aminoácido dispostos da maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e de aminoácido listadas também definem cada uma de um gênero de polinucleotídeo ou polipeptídeo que compreendem os monômeros de nucleotídeo e aminoácido dispostos da maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, ficará entendido que uma sequência de nucleotídeo incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero de polinucleotídeos que codificam o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo que consiste da sequência de referência. Ficará ainda compreendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero de ORFs polinucleotídicos que codificam esse polipeptídeo.

[0032] Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como incluído por qualquer referência ao filamento exposto. Visto que o comPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 25/420

15/164 plemento e o complemento reverso de uma sequência de ácido nucleico primário são necessariamente divulgados pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de uma sequência de ácido nucleico são incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a não ser seja explicitamente mencionado de ser de outra maneira (ou fique claro de ser diferente do contexto em que a sequência aparece). Além disso, como se entende na técnica que a sequência de nucleotídeo de um filamento de RNA é determinada pela sequência do DNA a partir do qual foi transcrita (mas para a substituição de nucleobases de uracila (U) por timina (T)), uma sequência de RNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de sequência anexa:

[0033] SEQ ID NO: 1 mostra um contig contendo um DNA de prp8 da WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8 da WCR ou prp8-1 da WCR: AAAGAACAAGCTTGTTTTCTATTCTGTGATATGCGCATTGTTTTATA TGTCATTTGTCAGTTGTCATATTGTATTTACGTTGTGTGAACGTTTT CGAAGCATTTTTATATTTAATTTAAGTTTAGATATATGAAACGACAT CGTAAATGTAAAGAACAGTAATTAAAAGTTACAATGTCTTTACCTC CCTATTTGTTGGGGCCCAATCCTTGGGCCACGATGATGGCCCAAC AACATCTAGCAGCGGCTCATGCTCAGGCCCAGGCAGCTGCTGCT CAAGCTCATGCCCATGCTTTACAACAACAAATGCCACCACCTCATC CTAAGCCGGATATTATAACTGAAGATAAATTGCAAGAAAAAGCTCT AAAATGGCATCAATTACAATCTAAAAGATTCGCTGATAAGAGAAAG TTGGGATTCGTGGAAGCTCAGAAGGAGGACATGCCTCCAGAACAT ATTAGAAAAATTATAAGAGACCATGGTGATATGAGTAGCCGTAAAT ATAGACATGATAAAAGGGTTTATTTAGGAGCTCTCAAATATATGCC TCATGCTGTGATGAAACTTCTTGAAAACATGCCTATGCCGTGGGA GCAGATAAGAGATGTTAAAGTATTGTACCATATTACAGGTGCTATT ACTTTTGTGAATGAAATTCCTTGGGTTTGTGAACCTATTTACATTGC

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TCAATGGGGCACCATGTGGATTATGATGAGAAGAGAAAAGAGAGA CAGAAGACACTTTAAGAGAATGCGTTTTCCACCATTTGATGATGAG GAACCTCCTTTAGATTACGCAGATAACGTTTTAGATGTAGAACCTT TAGAAGCTATCCAGATTGAGCTGGACGCTGATGAAGATTCTGCTA TAGCAAAATGGTTTTATGACCACAAGCCGCTAGTTGGAACCAAATA TGTAAATGGGCTAACATATAGAAAATGGAATCTTTCTTTACCCATC ATGGCTACCCTATACCGTTTGGCTAATCAGCTATTGACAGATCTGG TAGATGATAACTATTTTTATCTTTTTGACACAAAAAGTTTCTTTACT GCCAAAGCTCTTAATATGGCAATTCCAGGAGGACCCAAATTTGAA CCACTCATAAAAGATATGAATCCTGCGGATGAAGATTGGAACGAA TTTAATGATATCAATAAAATTATAATAAGACAACCAATTAGAACAGA ATATAGAATTGCATTTCCATATTTGTACAATAATATGCCACATTTTG TTCACTTGTCATGGTACCACGCACCAAATGTTGTATACATCAAGAC AGAAGATCCGGATTTACCGGCCTTTTACTTCGATCCATTGATTAAT CCCATATCTCACAGGCATGCCGTCAAAAGTCTGGAACCTCTACCA GATGACGACGAAGAATATATTTTGCCAGAGTTTGTACAACCATTCT TGCAGGAAACACCGTTGTATACAGATAACACAGCTAATGGAATTTC TTTATTGTGGGCACCCAGACCGTTTAATATGAGATCAGGTCGATGT AGAAGAGCAATTGACGTCCCTCTAGTAAAACCCTGGTATATGGAA CATTGTCCACCAGGCCAACCTGTAAAAGTTAGAGTCAGTTACCAA AAATTACTGAAGTATTACGTATTGAACGCTCTCAAACACAGGCCTC CTAAGGCGCAGAAGAAGAGGTACTTGTTCAGATCGTTCAAGTCTA CCAAATTCTTCCAAACAACTACTTTGGACTGGGTCGAAGCCGGAC TACAAGTTTGCAGGCAAGGTTATAACATGTTGAATCTATTGATTCA TCGAAAGAACTTGAATTACCTGCATTTGGACTACAACTTTAACTTG AAACCAGTTAAGACCTTGACAACGAAGGAAAGAAAGAAGTCTCGT TTTGGAAATGCTTTCCATTTGTGCAGAGAGATATTAAGATTAACAA AACTGATTATTGACTCCCACGTTCAATATCGTTTGAACAATGTTGA TGCTTTTCAATTGGCAGATGGTTTGCAGTATATATTTGCCCACGTT GGACAATTGACTGGAATGTACAGATACAAATACAAACTTATGAGAC

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AAATTAGGATGTGCAAGGACTTGAAGCATCTCATCTATTACAGATT TAACACTGGACCGGTGGGCAAAGGACCGGGTTGCGGTTTTTGGG CGCCTGGATGGAGAGTCTGGTTGTTCTTTATGAGGGGCATTACAC CTCTTTTGGAAAGGTGGTTGGGAAACCTTCTGTCACGTCAATTCG AAGGAAGACACTCGAAAGGAGTTGCAAAAACTGTCACAAAACAAA GGGTTGAGTCTCACTTTGATCTTGAACTTAGAGCTTCGGTTATGCA CGATATTGTCGACATGATGCCTGAAGGTATAAAGCAGAACAAGGC AAGAACTATACTTCAACATTTATCAGAAGCCTGGAGATGTTGGAAA GCTAATATTCCTTGGAAAGTACCAGGTCTGCCGATACCTATCGAAA ACATGATTCTTCGATACGTAAAGATGAAGGCTGATTGGTGGACAA ATACGGCCCATTACAATCGCGAGAGGATCCGTAGAGGAGCAACT GTCGATAAAACAGTTTGCAAGAAAAATCTTGGACGGCTTACTAGAT TATATCTAAAAGCCGAACAAGAAAGACAGCATAACTATTTGAAGGA CGGTCCGTACATTTCACCAGAAGAAGCTGTTGCCATTTACACCAC CACTGTCCATTGGTTGGAATCGAGAAGGTTTGCACCGATACCTTT CCCACCTCTGTCATACAAACACGACACCAAGCTGCTTATTTTGGCA TTAGAAAGATTAAAAGAAGCTTACAGTGTAAAATCGCGTCTGAATC AGAGTCAAAGAGAAGAATTGGGTCTAATTGAGCAGGCTTATGATA ATCCTCACGAAGCTCTATCGAGGATAAAACGTCATCTTTTAACACA AAGAGCTTTCAAAGAGGTAGGGATAGAGTTCATGGATTTGTACAG TCATTTGATACCTGTGTATGATGTAGAACCGCTAGAAAAAATAACT GATGCGTACTTAGATCAATATCTTTGGTATGAAGCTGACAAAAGAC GACTATTTCCTCCGTGGATCAAACCAGCTGATACGGAACCTCCTC CATTACTTGTTTATAAATGGTGCCAAGGCATTAACAATTTACAAGAT GTGTGGGATGTGAATGAAGGGGAGTGTAACGTGTTACTGGAATCT AAGTTTGAAAAACTATATGAAAAGATCGATTTGACTCTACTTAACA GACTTCTCCGATTGATAGTGGACCACAACATAGCTGATTACATGAC CGCTAAGAATAACGTCGTTATAAACTACAAAGATATGAATCACACC AACAGTTACGGAATTATTCGAGGATTGCAGTTTGCCTCGTTCATTA CTCAGTATTATGGTCTGGTTTTGGATCTGCTGGTATTGGGTCTGCA

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GAGAGCCAGTGAAATGGCTGGGCCACCTCAAATGCCTAACGATTT CTTGACGTTCCAAGATGTTCAATCCGAAACGTGCCATCCTATTCG GCTTTACTGCAGATATGTGGACAGAATTCATATGTTTTTCAGATTTT CTGCAGAAGAAGCCAAAGATTTGATCCAAAGATACCTAACAGAAC ATCCAGATCCTAATAATGAAAACATTGTCGGTTACAATAATAAAAAA TGCTGGCCCAGAGATGCAAGAATGCGTCTAATGAAGCACGATGTT AATTTGGGAAGAGCAGTATTTTGGGACATTAAAAACAGATTGCCGA GATCTGTTACAACTATTCAATGGGAGAACAGCTTTGTTAGCGTGTA CTCTAAGGATAATCCCAATCTGTTGTTTAATATGTCTGGATTTGAAT GTAGAATACTACCAAAGTGCCGTACGCAACACGAAGAATTCACCC ATAGGGACGGAGTATGGAACCTTCAACATGAAGGAAGTAAAGAAA GAACGGCTCAATGTTTCTTGCGAGTAGACGATGAATCCATGAGTC GATTTCATAATAGAGTTCGACAGATTCTTATGGCTTCAGGTTCAAC TACATTTACGAAGATTGTAAATAAATGGAACACAGCTCTAATAGGA TTGATGACATATTTCCGAGAAGCCGTGGTAAACACCCAGGAACTA CTAGATTTACTCGTAAAGTGTGAAAATAAAATACAAACTCGTATCA AAATCGGTCTTAATTCAAAAATGCCTAGCAGATTCCCTCCAGTCGT ATTTTACACCCCCAAAGAATTGGGTGGATTGGGTATGTTATCCATG GGCCACGTGTTGATCCCCCAGTCAGACTTGAGATGGTCTAAGCAG ACGGATGTAGGAATCACTCACTTCAGATCTGGTATAAGTCACGAT GAAGATCAGTTGATTCCTAATTTGTACAGATATATCCAACCGTGGG AATCTGAGTTTATAGATTCGCAGAGAGTGTGGGCTGAGTATGCTC TGAAAAGGCAAGAAGCGAACGCTCAGAATAGAAGGCTGACTTTGG AAGACTTGGAAGATTCTTGGGATAGAGGTATACCTAGGATCAATA CGCTTTTCCAGAAAGATAGGCATACTTTGGCGTACGACAAGGGAT GGAGAATTAGGACAGAATTCAAACAGTACCAAGTACTAAAACAAAA TCCGTTCTGGTGGACGCATCAAAGACACGACGGCAAATTATGGAA CTTGAACAACTACCGAACTGACATGATCCAAGCTCTTGGAGGTGT AGAAGGTATTCTCGAGCACACATTATTCAAAGGAACTTATTTCCCA ACATGGGAAGGTCTCTTCTGGGAAAAAGCTTCTGGTTTTGAGGAG

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TCAATGAAATATAAGAAACTAACCAATGCCCAAAGATCTGGTTTGA ACCAGATTCCAAATCGTCGTTTTACCTTATGGTGGTCACCTACAAT AAACAGAGCTAACGTATATGTTGGTTTCCAAGTACAATTGGATTTA ACTGGTATTTTCATGCATGGTAAAATACCCACCTTGAAAATTTCCC TCATTCAGATTTTCAGAGCTCACTTGTGGCAAAAAGTCCATGAATC GATAGTTATGGATTTGTGTCAGGTATTTGATCAAGAATTGGACGCA TTAGAAATTGAAACTGTCCAAAAAGAAACTATCCATCCTAGAAAAT CATACAAGATGAACTCATCTTGTGCGGACATTTTACTGTTTTCGGC ATATAAATGGAATGTATCCCGACCGTCATTATTAGCAGACACAAAG GACACAATGGATAATACAACGACTCAGAAATACTGGATCGATGTTC AACTTAGATGGGGTGATTACGACTCCCACGATGTGGAGAGATATG CTAGAGCCAAATTTTTAGATTATACAACTGATAATATGTCTATATAT CCATCTCCGACTGGAGTTCTTATTGCCATTGATTTGGCATACAATC TGCATAGCGCTTATGGCAACTGGTTCCCAGGTTGCAAACCATTGA TCCAACAAGCTATGGCAAAAATCATGAAGGCCAACCCAGCTCTCT ATGTACTTCGAGAACGCATACGAAAGGCTCTACAATTGTATTCCAG TGAACCTACCGAACCCTACCTTTCGAGTCAGAATTATGGTGAACT GTTCTCGAACCAAATCATTTGGTTCGTCGACGATACTAACGTATAC AGAGTAACGATTCATAAGACGTTCGAAGGCAATTTGACTACGAAA CCTATCAATGGAGCTATATTTATTTTTAACCCAAGGACTGGGCAGT TGTTCTTGAAAATTATTCATACCTCAGTATGGGCAGGACAGAAGCG TTTAGGACAGTTGGCAAAATGGAAAACCGCTGAAGAAGTGGCAGC TCTTATCCGTTCGCTACCAGTTGAAGAACAACCGAAACAAATTATT GTAACAAGGAAAGGAATGTTGGATCCTCTTGAAGTACATTTACTAG ACTTCCCTAATATTGTCATCAAAGGATCCGAACTGCAACTACCCTT CCAAGCTTGTTTGAAAATTGAAAAGTTCGGTGATCTTATTCTTAAA GCTACAGAGCCTCAGATGGTTCTTTTCAACTTGTACGATGATTGGT TGAAGACTATTTCTTCATATACGGCATTTTCAAGACTGATATTAATA TTAAGAGCCTTGCACGTTAACACTGAAAGAACCAAAGTAATATTAA AACCGGATAAGACTACCATCACGGAACTTCATCACATTTGGCCAA

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CTTTATCAGACGATGAATGGATTAAAGTTGAAGTACAGCTTAAGGA TCTAATTCTAGCGGATTATGGAAAGAAGAACAACGTAAATGTTGCA TCTCTAACCCAATCAGAAATTCGTGATATCATCTTGGGTATGGAAA TCAGCGCTCCATCGGCCCAGAGACAGCAAATCGCAGAAATTGAAA AGCAGACTAAAGAGCAGTCTCAGCTTACTGCGACGACTACCAAAA CAGTCAACAAACACGGAGACGAAATTATTACCAGCACTACCAGTA ATTACGAAACGCAAACGTTTAGTTCGAAAACCGAATGGAGAGTTA GAGCTATTTCTGCTACTAATTTACATTTGAGAACCAACCACATCTAT GTCAGTTCTGATGATATCAAGGAAACTGGCTATACTTATATTTTAC CGAAGAATGTCCTGAAGAAGTTTGTAACGATTTCAGATTTGAGAGC ACAGATATGCGCGTTTCTTTATGGAGTCAGCCCACCCGATAATCC ACAAGTAAAAGAACTCAGATGTTTAGTTCTGGCACCGCAATGGGG TACTCATCAAACTGTACACGTTCCTAACACACCGCCCAATCATCCG TTCCTTAAAGATATGGAACCACTCGGATGGATTCACACTCAACCCA ACGAATTACCCCAACTTTCACCCCAGGACATTACCAACCATGCCA AACTTATGTCAGATAATACTACTTGGGACGGTGAAAAGACTATTAT TATTACCTGTTCGTTTACACCTGGGTCATGTTCGTTGACAGCTTAC AAATTGACGCCTTCTGGATTTGAATGGGGAAGGCAAAATACGGAC AAAGGCAATAATCCCAAAGGATATCTACCCAGTCATTATGAAAAAG TACAAATGTTGTTATCAGACAGGTTCTTAGGATTCTTTATGGTTCC AGCCCAAGGATCGTGGAACTATAACTTTATGGGTGTCAGGCATGA CCCCAGTATGAAATATGAATTACAATTAGCAAATCCAAAAGAATTC TACCACGAGGTTCACAGACCTGCACATTTCCTCAACTTCTCCGCC TTAGAAGATGGCGATGGAGCAGGAGCAGATAGAGAAGATGCTTTT GCTTAGATTAGTTTATAGATTATAAAATAATTGATTGTATTATTCGA ACATATATACCTCATGGATGTTGTTGATATAGAATAATATACCCTAT TCCACGAACATAC [0034] SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de PRP8 codificado por um DNA de prp8 da WCR, aqui referido em alguns lugares como PRP8 da WCR ou PRP8-1 da WCR:

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MSLPPYLLGPNPWATMMAQQHLAAAHAQAQAAAAQAHAHALQQQ MPPPHPKPDIITEDKLQEKALKWHQLQSKRFADKRKLGFVEAQKEDM PPEHIRKIIRDHGDMSSRKYRHDKRVYLGALKYMPHAVMKLLENMPM PWEQIRDVKVLYHITGAITFVN ΕIPW VCEPI Yl AQWGTMWIΜ M RREKR DRRHFKRMRFPPFDDEEPPLDYADNVLDVEPLEAIQIELDADEDSAIA KWFYDHKPLVGTKYVNGLTYRKWNLSLPIMATLYRLANQLLTDLVDD NYFYLFDTKSFFTAKALNMAIPGGPKFEPLIKDMNPADEDWNEFNDIN KIIIRQPIRTEYRIAFPYLYNNMPHFVHLSWYHAPNWYIKTEDPDLPAF YFDPLINPISHRHAVKSLEPLPDDDEEYILPEFVQPFLQETPLYTDNTA NGISLLWAPRPFNMRSGRCRRAIDVPLVKPWYMEHCPPGQPVKVRV SYQKLLKYYVLNALKHRPPKAQKKRYLFRSFKSTKFFQTTTLDWVEA GLQVCRQGYNMLNLLIHRKNLNYLHLDYNFNLKPVKTLTTKERKKSR FGNAFHLCREILRLTKLIIDSHVQYRLNNVDAFQLADGLQYIFAHVGQL TGMYRYKYKLMRQIRMCKDLKHLIYYRFNTGPVGKGPGCGFWAPG WRVWLFFMRGITPLLERWLGNLLSRQFEGRHSKGVAKTVTKQRVES HFDLELRASVMHDIVDMMPEGIKQNKARTILQHLSEAWRCWKANIPW KVPGLPIPI ΕΝ ΜILRYVKM KADWWTNTAH YN RERIRRGATVDKTVCK KNLGRLTRLYLKAEQERQHNYLKDGPYISPEEAVAIYTTTVHWLESR RFAPIPFPPLSYKHDTKLLILALERLKEAYSVKSRLNQSQREELGLIEQ AYDNPHEALSRIKRHLLTQRAFKEVGIEFMDLYSHLIPVYDVEPLEKIT DAYLDQYLWYEADKRRLFPPWIKPADTEPPPLLVYKWCQGINNLQD VWDVNEGECNVLLESKFEKLYEKIDLTLLNRLLRLIVDHNIADYMTAK NNWINYKDMNHTNSYGIIRGLQFASFITQYYGLVLDLLVLGLQRASE MAGPPQMPNDFLTFQDVQSETCHPIRLYCRYVDRIHMFFRFSAEEAK DLIQRYLTEHPDPNNENIVGYNNKKCWPRDARMRLMKHDVNLGRAV FWDIKNRLPRSVTTIQWENSFVSVYSKDNPNLLFNMSGFECRILPKC RTQHEEFTHRDGVWNLQHEGSKERTAQCFLRVDDESMSRFHNRVR QILMASGSTTFTKIVNKWNTALIGLMTYFREAWNTQELLDLLVKCEN KIQTRIKIGLNSKMPSRFPPWFYTPKELGGLGMLSMGHVLIPQSDLR WSKQTDVGITHFRSGISHDEDQLIPNLYRYIQPWESEFIDSQRVWAE

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YALKRQEANAQNRRLTLEDLEDSWDRGIPRINTLFQKDRHTLAYDKG WRIRTEFKQYQVLKQNPFWWTHQRHDGKLWNLNNYRTDMIQALGG VEGILEHTLFKGTYFPTWEGLFWEKASGFEESMKYKKLTNAQRSGLN QIPNRRFTLWWSPTINRANVYVGFQVQLDLTGIFMHGKIPTLKISLIQIF RAHLWQKVHESIVMDLCQVFDQELDALEIETVQKETIHPRKSYKMNS SCADILLFSAYKWNVSRPSLLADTKDTMDNTTTQKYWIDVQLRWGDY DSHDVERYARAKFLDYTTDNMSIYPSPTGVLIAIDLAYNLHSAYGNWF PGCKPLIQQAMAKIMKANPALYVLRERIRKALQLYSSEPTEPYLSSQN YGELFSNQIIWFVDDTNVYRVTIHKTFEGNLTTKPINGAIFIFNPRTGQL FLKIIHTSVWAGQKRLGQLAKWKTAEEVAALIRSLPVEEQPKQIIVTRK GMLDPLEVHLLDFPNIVIKGSELQLPFQACLKIEKFGDLILKATEPQMV LFNLYDDWLKTISSYTAFSRLILILRALHVNTERTKVILKPDKTTITELHH IWPTLSDDEWIKVEVQLKDLILADYGKKNNVNVASLTQSEIRDIILGMEI SAPSAQRQQIAEIEKQTKEQSQLTATTTKTVNKHGDEIITSTTSNYET QTFSSKTEWRVRAISATNLHLRTNHIYVSSDDIKETGYTYILPKNVLKK FVTISDLRAQICAFLYGVSPPDNPQVKELRCLVLAPQWGTHQTVHVP NTPPNHPFLKDMEPLGWIHTQPNELPQLSPQDITNHAKLMSDNTTW DGEKTIIITCSFTPGSCSLTAYKLTPSGFEWGRQNTDKGNNPKGYLPS HYEKVQMLLSDRFLGFFMVPAQGSWNYNFMGVRHDPSMKYELQLA NPKEFYHEVHRPAHFLNFSALEDGDGAGADREDAFA [0035] SEQ ID NO: 3 mostra um contig compreendendo um outro DNA de prp8 da WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-2 da WCR:

TGAAAGAATCGATCACCTCCCCAAAAAAACACATACCTGCTTCCCA GATCGGATGATGATCGTCACCCACTATGGGACCGTCAGCTCCACA AGGTGCAAGAACAGTCTGTGTTTTTGGCCGTGAACTTCTTTGAGG CGACCTGTACGAGTACGAGAGCGCTCCCTCACGTGGGATTTCGG TTACATCGTCCTTTAGTCCGCAAAACGTCGTCACCGGAACTTTGG AATGAGGGTTGATGCTCAAAAATCCACAATTATACGACAAGCATTT ATCTAGACCATCGTTGACGTTTGTGTAATTCGTGTGATGTCCTTTT

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GAACATGCATAAAGCATGTTAAGCACAGGTGTGAACCCCTCTTTC GTTGGTAGGCGCTCCTTAGGAATTACCAATGAACTTTCGCCAGAA TTTGGGTTCGAAAAGATTGTGTCCGAGAATTCACAGCTAACAAATT CAGTCGGATTAGTAGTCGTCGCGTTATAGCTGATGAAGCCGCATT CCGGGTCAAGAGAGCACGTGGCGAGCGCGATCTAAGGTGACAAC TATGTCGGAGCAGAGTCTTAGAGCCTCACAGATATTGTCGGCTTA TCCTGCAATACGATAAATCTTTTGCAACTCTTGAAACAACATACCA GACCTTTGAGAGATTTCCGGCCCGTACAGGGGACATCAACATTCT TTAATACGAGTGATGTGATCTCTGGAGTTTGGGGCTCAGTCTCGC CATAACAAGCGGTACTGAAGACATAAAAAGAGGCTAAACTGCGCA TTGAGCACACGCGTGTCTTGGACATGAAGGCCCGACAAATGATCT CCGAAGTTGAGCTTTAAATATTGTGAAGGCGGGGGATGAGCTCAA ATGGGCCAGGTAGTAGCAAGAACATGAATGGCAGGAAGCCGGAA ATGCCTCCAGAGGCTCTGAGGAAGATAATTGCAGATCATGGCGAC ATGAGTAGCCGGAAGTTTCGCCAAGATAAGAGAGTTTACCTTGGA GCGCTGAAGTATGTACCCCATGCTGTTTACAAACTCTTAGAGAATC TACCCATGCCTTGGGAGCAAGTGAGAAACGTAAAAGTCTTGTATC ACACAACTGGGGCAATCTCTTTTGTGAACGAGATACCTTGGGTAG TCGAGCCGATTTTTCTGGCCCAGTGGGGAACAATGTGGATAATGA TGCGACGTGAGAAACGCGATCGCCGTCATTTCAAACGTATGAGAT TTCCGCCTTTCGATGACGAAGAGCCTCCACTTGATTACGCCGACA ACATATTAGACCAACAGCCCCTCGACGCAATACAAATGGAGCTGG ACGCTGAGGAAGACGCTCCAGTGATAGACTGGTTTTACGATCACC AACCTCTCCAATACGATTCTAATTACCTCGCAGGTCCCAAATACCG AAGATGGCGTCTCGATTTGAACCAAATGAGCGTCCTGTATAGATTA GCCCATCAACTTCTGTCTGATATCATTGATGACAATTACTTTTACCT ATTTGATCTGAAATCATTCTTTACAGCCAAAGCGCTAAACCTTGCC ATTCCCGGTGGGCCAAAGTTTGAGCCCCTGGTCCGCGATGTCGC TGATGATTCGGATTGGAACACATTTAATAACATTGACAAGATAATC GTTCGGCATAAAATCCGTACGGAATATAAAATTGCATTCCCCTATC

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TCTACAATGACAGGCCATTCAAAGTTTCTTTGAGTAAATATCATTCT CCGACTGTGGTGTTTGTGAAGCAAGAGGAGGTCGACCAACCTGC ATTCTACTTTGACCCTCTCCTGTATCCAATACCTGCCTATCGAACT AAAACCGACAAGTATTTCTGCCAAACTATCGAAAGTTCAATAGACG ATGACTTCCTTCAGGAGCTTAACAGCTTTGCGTCAAGCGCCAGCG CAGGCATTGGATCCGCTGATAGTCTACTCCAGCCGCTTTTGTTTG AGGCGCCTTTGCAGACCGACACAACATATGGAGGTATAACATTGC TGTGGGCTCCAAGACCCTTCAACATAAGATCCGGGTTGACCAGGA GAGCTCAAGATATTCCACTAGTTCAGTCCTGGTTCCGAGAGCACT GCCCAGGTGCTTCGACCTATCCGGTGAAAGTTCGCGTCTCTTATC AGAAGCTTCTCAAAACTTGGGTACTGAGCCATCTCAGAAGTCGTC CGCCTAAGGCAATGAAGAAGCGCAATCTCCTGAGACTATTTAAAA ACACCAAATTCTTTCAATGTACTGAAACTGATTGGGTGGAGGTTGG TCTGCACGTGTGCCGCCAAGGATATAATATGCTCAATCTCCTGATT CATCGCCGAAATCTAAACTACCTTCATCTGGATTATAATTTCAATCT GAAGCCCATTAAAACATTGACCACTAAAGAACGAAAAAAGAGTCG TTTCGGAAATGCGTTCCATCTATGTCGCGAGATTCTACGTCTCACC AAATTGATTGTTGACTCTCACGTCCAGTACCGGCTGGGGAATATA GATGCATATCAACTGGCAGATGGCTTACAATACATATTCTGCCACG TCGGTCAATTGACATCCATGTATCGATACAAATACCGGCTTATGCG ACAGGTTCGGCTGTGCAAGGATCTCAAGCATCTAATATATTACAGA TTCAACACCGGCCAAGTGGGTAAAGGCCCAGGCTGCGGATTCTG GTTGCCCTCATATCGTGTCTGGTTGTTCTTTCTGCGCGGGATTTTA CCTTTATTGGAGAGATGGTTGGGTAATCTATTGGCTCGTCAGTTTG AAGGTCGAAACTTGCGCGGTCAAGCAAAATCCGTCACGAAGCAAC GAGTGGAAGTCTACTTCGATTTAGAGCTACGAGCTGCTGTGATGC ATGATCTGCTAGATATGATGCCAGAAGGAATCCGAGCAAACAAAG CCAAAATTGTACTTCAGCATCTCAGCGAAGCCTGGAGATGTTGGA AGGCGAATATTCCCTGGAAGGTCGCCGGGATTCCAGCTCCGGTG GAAAACATTATTCTGAGATATGTAAAACTAAAATCTGACTGGTGGA

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CGAATGCCGCATATTTCAATCGGGAGAGAATTAGACGTGGAGCAA CTGTGGACAAGACTGTGTGCAAAAAGAACTTGGGGCGGCTCACTC GTTTGTGGTTGAAGTCAGAGCAAGAACGTCAACATGGGTACATGA AGGATGGTCCCTATCTAACCAGTGAGGAGGCGGTGGCGATTTACA CTACAATGGTACATTGGTTGGATTTGCGAAAATTCACTCATATCCC ATTTCCTCCATTGAACTATAAACACGACACAAAACTTCTGATTCTC GCTCTGGAGCGCTTGAGGGACACATACGCCGTGAAGACACGACT GAATCAAGTTCAGCGTGAAGAGTTGGGTCTAATCGAACACGCGTA CGATAATCCTCATGAGGCCATATCGCGAATAAAACGACATTTATTG ACTCAACGAGCCTTCAAAGACGCCAGTGTTGAGTTCATGGATCTC TACTCGCATTTAGTACCTGTATACGAGATCGATCCACTAGAAAAAA TCACCGACGCTTACCTCGACCAGTATTTATGGTACGAGTCTGACC TCCGCCACCTCTTCCCACCGTGGATAAAACCGAGCGATCACGAGC CTCTGCCTCTGCTGCTCTATAAATGGTCAAACAATATAAATAATTT GGACTCGATATGGGAACATGACGACGGTTCCTGCGTTGCCATGAT GCAAACGAAGTTGAAGAAGATTTTCGAGAAAATTGATCTCACCCTT CTCAATAGATTGCTGAGATTGATAGTTGACCATAATCTCGCTGATT ACATGACCGCGAAAAACAACATTCGGCTGATCTTCAAGGACATGT CCCATACAAATTATTACGGCTTAATCCGCGGCCTCCAGTTCAGCA GTTTCATATTCCAATATTATGCTCTGGTCATAGATCTTCTGATTTTA GGGCTGACGCGAGCCAATGAACTTGCCGGCAGTATAGGTGGCGG CGGAGGCGGAGGTTTCGCTAATCTCAAAGATCGCGAAACGGAGA TAAAACATCCCATCCGCTTGTATTGCCGATATATAGATGAAATATG GATCTGCTTCAAATTCACCAAAGAGGAGTCTCGTAGCTTGATTCAA AGGTATTTGACGGAGAATCCAACCGCTAGTCAGCAGCTCTCCACT GAAGAAGGCATCGACTACCCCATCAAAAAGTGTTGGCCTAAAGAC TGCCGAATGAGAAAAATGAAATTCGACGTTAATATCGGACGAGCC GTTTTCTGGGAGATTCAGAAACGTCTACCGAGAAGTTTAGCTGAG CTGAGTTGGGGCAAAGATGCTGGAGACTCGACATCGTTTGTGTCA GTCTATAGTGTCAATAACCCCAATCTTCTGTTTAGCATGGGCGGCT

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TTGAGGTCCGAATCCTGCCAAAAGTTCGAGGTGGGACTAGTATGG GAACTGGGAGCAGTTCACAAGGCGTATGGCGTTTACAAAACTATC TGACCAAGGAGACGACAGCGTATTGTTACATTAGAGTTGGTGACG AAGCCATACGTAACTTCGAAAATCGAATTCGGCAGATTCTGATGTC ATCCGGCTCGGCAACGTTCACAAAGGTGGCAAACAAATGGAATAC AGCTCTGATCAGCCTTGTGAGTTATTTCAGAGAGGCGATAATATAT ACGGAGGATCTCCTCGATCTGTTGGTGAAATGTGAAAACAAAATA CAAACGAGAATCAAGATCGGTTTGAATAGTAAAATGCCGTCGAGG TTCCCCCCCGTTGTGTTCTACACGCCCAAAGAGCTCGGCGGCTTG GGCATGCTTTCCATGGGGCACATCCTTATCCCTCAATCTGACTTG CGCTATATGAAGCAGACCAATGATTATACCATCACCCATTTCCGCT CGGGAATGACTCACGACGAAGATCAGTTGATACCCAATCTCTATA GATACATCCAGACATGGGAAAGTGAGTTCATCGACAGTCAGCGAG TTTGGTCGGAATATAACATCAAGAGATTTGAAGCAACCACTAACGG CGGCGCCGGTTCAAGTGGCGGCAGCGGCGGGAGTCGCAGACTG ACTTTGGAAGACGTAGAGGAGAACTGGGATCATGGTATTCCCCGT ATTAATACGTTGTTTCAGAAAGATCGACACACGCTGTGCTACGATA AGGGCTGGAGATTACGTCAAGAGTTTAAGCAATATCAGATCCTGC GGAGCAATCCATTCTGGTGGACAAATATCAAGCACGATGGAAAAT TGTGGAATCTCAACAACTATAGAACTGATATGATCCAAGCTTTGGG CGGAGTTGAGGGCATTTTGGAACACACGCTTTTCAAAGGAACTTA CTTCCAGACATGGGAAGGTCTATTCTGGGAAAAGTCTAGTGGCTT CGAGGAATCCATGAAATATAAGAAGTTGACAAACGCGCAAAGAAG TGGGTTAAATCAAATACCTAATCGGAGGTTCACCCTCTGGTGGAG TCCAACGATCAATCGGTCAAATATCTATGTTGGATTCCAAGTCCAA TTAGATCTCACAGGAATTTTCATGCACGGCAAAATCCCAACCCTCA AGATCAGCTTGATTCAAATCTTCCGCGCGCATCTTTGGCAGAAGA TTCATGAGTCAGTTATCATGGATCTCTGTCAGATTTTGGATCTCGA AATTGAATCTTTAGGAATCCACACAGTTAAGAAAGAAACTATCCAT CCTCGAAAAAGTTACAAGATGAATAGCTCTTGTGCAGATATCATTT

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TGTACTCGTCGTACAAATGGAACATCAGCAATGTGCCTACACTTCT ATCAGCCAACGCAAACGCATCGGCCTCATCAACCACCTCAACCAT AAGTTGGCTTGATCTTCAACTCCGATGGGGGGATTACGACTCGCA CGACATCGAAAGATACTGCCGGTCCAAGTATCTTGATTACGTCAA CGACAGCATGTCTATTTATCCGTCGAATACCGGAGTTCTTCTGGG CATAGATTTGGCTTACAATATGTACAGCGGATTTGGAATATGGATT GACGGCTTAAAGGAATTGGTCCGTACGGGCATGCGCAAGATCATC AAATCGAATCCGAGTTTGTATGTCTTGAGAGAACGAATAAGGAAA GGCTTACAACTGTATAGCTCGGAGCCGACAGAGCCAAATCTTGAG TCTTCTAACTATGGTGAACTGTTCACCTCTAACGGCCCCAATACTT GGTTCGTCGATGATACTAATGTTTATAGGGTTACAATTCACAAAAC TTTCGAGGGAAATTTAACAACCAAGCCGACGAATGGGGCCATTGT TATCATCAACCCAGTGACTGGCCAGTTGTTTCTGAAGATTATACAT ACTAGTGTATGGTCAGGTCAGAAACGCTTGAGTCAATTGGCGAAG TGGAAGACCGCTGAGGAAATCACCAGTCTCATCCGGTCTTTGCCT ATTGAAGAACAACCCAAGCAGATTATAGTGACCAGAAAGGGCATG CTGGACCCCTTGGAAGTACATCTGCTAGATTTTCCTAACATCATAA TCAAAGGTTCCGAGTTGGCATTGCCATTCCAAAGTCTCATGAAGTT GGAGAAGTTCTCAGATCTCATTCTAAAAGCTACAAAACCAGATATG GTTCTCTTTAACCTCTATGATGATTGGCTTCAAAACATTTCAGCATA CACTGCATTTTCCAGATTGATTCTTCTACTCCGCTCATTGCACGTG AATCCCGAGAAGACCAAGATCATCTTGAGGCCGGATAGATCCATT ATCACCAAACCACACCATATATGGCCTACCATTAAGAATGAGGACT GGAAGAAGATTGAAGTTCAATTGACCGACCTAATTCTGACTGATTA CTCCAAGGCAAATAATGTCGCTATCAGCTCACTCACCCAGACAGA AATACGTGATATCATTCTAGGTATGGATCTCCAACCACCAAGCCTG CAGAGACAACAAATCGCCGAGATCGGAGGCGAGACGTCCAACAA TGGAGTGGCGTTGTCTGCTTCAGGTATCACTGCAACGACTACGAG TACTACTAATATCAGTGGTGACGCAATGATCGTCACTACCCAGAGT CCTCATGAACAACAGATGTTCTTGAGTAAAACTGACTGGAGAGTTC

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GGGCGATGAACAGCGGGTCCTTGTATTTGAGAGCTGAGAAGATTT ATATCGATGATGACGCGAGAGATGAGACGATCACTGGTACATCAA GTACTGCAACCTCGGACGGATTTACGTATACTATTCCACATAATCT TATTAGGCTATTTCTTGGGGCCGCGGATTTGAGAACTCGAATTGG CGCATACATATTTGGCACAACATCTGCCAAAAATCCTCTTGTGAAA GAGATCAAGACCTTCGTTATGGTTCCGCAATCCAATTCACATGAAA AAGTGGATTTTGTCGACATGTTACCAGATCATCCTATTCTCAAAGA ACTTGAACCATTGGGATGGGTACAAACTACTGCCACTGGATCAAA GCCATCTCTCCACGATATCACATTCACAGCTGCTCTACTCTCGGA CGGTCCATGTCAGATGCCTAGGCTCGATCCTAATGCTTGTGTAAT GCTGTTTGTCGCTTTGACGCAAGGAAGTTGCACGTTGAGCGGTTA CAGATTGACTCCCGCAGGGCTCGAGTGGGCTAGTGGCATTACGG CAACAATACAGGCGGAGGTAGCTCCTCAGTATATTGAGAAAACCC AATTGCTGGTCTCGGATAATACAGCCGGATTCTTTATGGTGCCAG ATGACGGATTTTGGAATTTCGCTTTCATGGGCGTAAGATTCAACAA GAAAACCCCTTACAATTTGGTATTGAACGTTCCGAAATCCTTCTGT GATGAATTGCATCGACCTAATCATTTCTTGCAATTTGCTCAACTGG AAGCGCTGGATGAGTCCGATGGCGTTGAAGCCGAAGACTGGTTA GATTAGATCGGACACGCGTGTGCGCGCGCAAATATAGATAAATGC GCGTGTTGACTAGATTTTTGCCTCTTGCCTCAGTGGCATTCGCAG TCAATGTTGAGCCTTCGCATCAAGTCATGACGCAAGATACTGGAG GAGCTGTATCAAACGTGCTGGGAAGCATCAAGAGTCGATCCAAAC AGCTGGCCCAAAGCATTCCCGGGTCGTCGATAGCTAGCTGTTTGA CTTCCTCAAATCCGGAACTTTGCAAGAAACAGGTTCGCTTCGAGC ATGATTTGAGAGGACTCATGTTGAAAGGTACCACCGATCTGGCTT CCATGCAATCTCTCAAGCAAAAATTAACGGTGCCTAGCGCCTATG GCCTGGACGCCGCTCAAGCTAATGACATTTTTCATCAACTGATAAA GGAGCTTCACTTTGATCAGCAGGCCTACGAATTGGTCACTAATGC AGCAAAAGCAACGACGCCGATGAGCCCGAGTATCTCGCTTCCGA CAGTGGCACCCATACCGATCAACGCAGGTGTGGGCGCTGCGGCA

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GTGAGTCCCGGCATAGCGACCGCAATTAGCCCCTTCGCCACAAC ATCGGTGAGCACATTGGCTCCCTCTTCTGGAGTCTTAAATGCTGC GGCCCTTACGACCGCGGCGCCGACGGCGAGCACACTGATTGCAA GTGTCTCCACCACTGCCTCGACGGCACACTAAATTTCATTTTTTAT TGGAAAGCTAATGTTCGTTGCTCTAGTTTACGGAATCAGTTCTGCT GCATTGGTGCTGGAAACAAAGGGGATTTTGAGAGCTTGTTCAGAC AAGTTGAAGGTTCTGGCCTTACAACAGAGCGTCATAGCGTTATGC TACGTGATCTTGAGCACTGTGAATGCACACAAAAATGGCACACAC GGCTCTGGATTGTGGAGTTTTCAGGACTTCAAACGAGCGATACCG GTGACACTAGCTTTTCTCAGCATGCAGGCAACTCAGATGATTTGC CTCGCCAATTCGAGTATGGGTAGCTACGTGGTCGCGAAAGCAAGT TGTCTGACATTTAATATACTGCTGTTCGGCTGTCTGATTGTGACAA TTGGCGTTGTGCTCCCTGTTTGTAATAGTCGAGCGCACTGCACAA AGTCTGGGTTTTGCGCGGGCTTGATGTCTTCCCTGGCGCAAGCTG CTTTCATGCTTCTGTCATCCGTTGCGACTAAAAGACATTTTGCAGC AGCGCCGATGAAACTCCTCGGTCATTACACATTCTCGGCTGTTGT AGTATTATGGGCTATCCTCTGGCTTCGTGGGTACTCCGATGATTC GACTTGCCAGACCAGGGGGCTTTTGACACGCATAATCTGGTCCG GTATTATCAATGTAGTTGTGGCCATGAGCGCAATGCGATGTTTAAA AAACAGTCATCCAGTTGCATTGAACATGATCAGTTTCGTCAAATCC GTTTTACAGATTTGCTGCGCTGCTTTGTTCTACGGAGACCGCCCC AACAGAACAGAAATAATGGGCGTGGCATTTGTTCTAGGTGGAAGT GCAGTCTACTCGTGCGGCCGATTTTTCATCAAAGAAACAGACTGA GTGCCCT [0036] SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácido de um outro polipeptídeo de PRP8 da WCR codificado por um DNA de prp8 da WCR (isto é, prp8-2f.

MSSNGPGSSKNMNGRKPEMPPEALRKIIADHGDMSSRKFRQDKRV

YLGALKYVPHAVYKLLENLPMPWEQVRNVKVLYHTTGAISFVNEIPW

WEPIFLAQWGTMWIMMRREKRDRRHFKRMRFPPFDDEEPPLDYAD

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NILDQQPLDAIQMELDAEEDAPVIDWFYDHQPLQYDSNYLAGPKYRR WRLDLNQMSVLYRLAHQLLSDIIDDNYFYLFDLKSFFTAKALNLAIPG GPKFEPLVRDVADDSDWNTFNNIDKIIVRHKIRTEYKIAFPYLYNDRPF KVSLSKYHSPTVVFVKQEEVDQPAFYFDPLLYPIPAYRTKTDKYFCQT IESSIDDDFLQELNSFASSASAGIGSADSLLQPLLFEAPLQTDTTYGGI TLLWAPRPFNIRSGLTRRAQDIPLVQSWFREHCPGASTYPVKVRVSY QKLLKTWVLSHLRSRPPKAMKKRNLLRLFKNTKFFQCTETDWVEVG LHVCRQGYNMLNLLIHRRNLNYLHLDYNFNLKPIKTLTTKERKKSRFG NAFHLCREILRLTKLIVDSHVQYRLGNIDAYQLADGLQYIFCHVGQLTS MYRYKYRLMRQVRLCKDLKHLIYYRFNTGQVGKGPGCGFWLPSYRV WLFFLRGILPLLERWLGNLLARQFEGRNLRGQAKSVTKQRVEVYFDL ELRAAVM H DLLD Μ M PEG I RAN KAKIVLQ H LSEAW RCWKANIPWKVA GIPAPVENIILRYVKLKSDWWTNAAYFNRERIRRGATVDKTVCKKNLG RLTRLWLKSEQERQHGYMKDGPYLTSEEAVAIYTTMVHWLDLRKFT HIPFPPLNYKHDTKLLILALERLRDTYAVKTRLNQVQREELGLIEHAYD NPHEAISRIKRHLLTQRAFKDASVEFMDLYSHLVPVYEIDPLEKITDAY LDQYLWYESDLRHLFPPWIKPSDHEPLPLLLYKWSNNINNLDSIWEH DDGSCVAMMQTKLKKIFEKIDLTLLNRLLRLIVDHNLADYMTAKNNIRL IFKDMSHTNYYGLIRGLQFSSFIFQYYALVIDLLILGLTRANELAGSIGG GGGGGFANLKDRETEIKHPIRLYCRYIDEIWICFKFTKEESRSLIQRYL TENPTASQQLSTEEGIDYPIKKCWPKDCRMRKMKFDVNIGRAVFWEI QKRLPRSLAELSWGKDAGDSTSFVSVYSVNNPNLLFSMGGFEVRILP KVRGGTSMGTGSSSQGVWRLQNYLTKETTAYCYIRVGDEAIRNFEN RIRQILMSSGSATFTKVANKWNTALISLVSYFREAIIYTEDLLDLLVKCE NKIQTRIKIGLNSKMPSRFPPWFYTPKELGGLGMLSMGHILIPQSDLR YMKQTNDYTITHFRSGMTHDEDQLIPNLYRYIQTWESEFIDSQRVWS EYNIKRFEATTNGGAGSSGGSGGSRRLTLEDVEENWDHGIPRINTLF QKDRHTLCYDKGWRLRQEFKQYQILRSNPFWWTNIKHDGKLWNLN NYRTDMIQALGGVEGILEHTLFKGTYFQTWEGLFWEKSSGFEESMK YKKLTNAQRSGLNQIPNRRFTLWWSPTINRSNIYVGFQVQLDLTGIFM

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HGKIPTLKISLIQIFRAHLWQKIHESVIMDLCQILDLEIESLGIHTVKKETI HPRKSYKMNSSCADIILYSSYKWNISNVPTLLSANANASASSTTSTIS WLDLQLRWGDYDSHDIERYCRSKYLDYVNDSMSIYPSNTGVLLGIDL AYN M YSG FGIWIDGLKELVRTG M RKIIKS N PSLYVLRERIRKGLQLYS SEPTEPNLESSNYGELFTSNGPNTWFVDDTNVYRVTIHKTFEGNLTT KPTNGAIVIINPVTGQLFLKIIHTSVWSGQKRLSQLAKWKTAEEITSLIR SLPIEEQPKQIIVTRKGMLDPLEVHLLDFPNIIIKGSELALPFQSLMKLE KFSDLILKATKPDMVLFNLYDDWLQNISAYTAFSRLILLLRSLHVNPEK TKIILRPDRSIITKPHHIWPTIKNEDWKKIEVQLTDLILTDYSKANNVAIS SLTQTEIRDIILGMDLQPPSLQRQQIAEIGGETSNNGVALSASGITATT TSTTNISGDAMIVTTQSPH EQQM FLSKTDWRVRAM NSGSLYLRAEKI YIDDDARDETITGTSSTATSDGFTYTIPHNLIRLFLGAADLRTRIGAYIF GTTSAKNPLVKEIKTFVMVPQSNSHEKVDFVDMLPDHPILKELEPLG WVQTTATGSKPSLHDITFTAALLSDGPCQMPRLDPNACVMLFVALTQ GSCTLSGYRLTPAGLEWASGITATIQAEVAPQYIEKTQLLVSDNTAGF FMVPDDGFWNFAFMGVRFNKKTPYNLVLNVPKSFCDELHRPNHFLQ FAQLEALDESDGVEAEDWLD [0037] SEQ ID NO: 5 mostra um DNA de prp8 de PB exemplar: ATGTCTTTGCCACCTTATTTACTGGGCCCAAATCCCTGGTTAATGG CTCAACAGCAGTTAGCTGCAGCTCATGCTCAAGCTCAGGCTGCTG CTGCTCAAGCTCATGCCCAAGCTTTACAACAACAAATTCCTCCTCC ACACCCAAAATCAGATATTATAACAGAGGATAAACTTCAAGAAAAA GCCCAAAAATGGCATCAGTTACAATCAAAAAGGTTTGCAGACAAA AGAAAGTTGGGTTTTGTAGAAGCCCAAAAAGAAGATATGCCACCA GAGCATATTAGAAAAATTATAAGGGATCATGGGGATATGAGCAGT CGTAAATACAGACATGATAAAAGAGTTTATTTAGGAGCTTTAAAAT ATATGCCCCATGCAGTTATGAAATTATTGGAAAATATGCCTATGCC TTGGGAGCAAATTAGAGATGTGAAAGTTTTATATCACATTACAGGT GCTATTACATTTGTAAATGAAATTCCTTGGGTTGTTGAGCCTATTTA TATTGCTCAATGGGGTACTATGTGGATCATGATGAGAAGAGAAAA

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ACGGGACCGTAGACATTTTAAAAGAATGAGGTTTCCTCCTTTTGAT GATGAAGAACCTCCTCTAGATTATGCTGATAATGTTTTAGATGTTG AACCTCTAGAAGCAATTCAAATTGAACTAGATGCTGAAGAAGACTC TGCAATTGCAAAGTGGTTCTACGATCACAAACCACTTGTTGGTTCC AAATTTGTTAATGGCTCCACATACAGAAAGTGGAATTTATCCTTGC CAATGATGGCTACTTTGTATCGGTTGGCAAATCAATTACTTACTGA TTTAGTAGATACAAATTATTTTTATTTGTTTGATACAAAAAGTTTTTT TACTGCTAAAGCTTTAAATATGGCTATACCAGGAGGGCCAAAATTT GAACCCCTTATTAAAGATATGAATCCAGCTGATGAAGATTGGAATG AATTTAATGATATCAACAAAATTATAATTCGTCAACCTATTAGAACT GAATATAGGATAGCTTTTCCTTACTTGTATAATAATATGCCACATTT TGTACATCTATCCTGGTATCATGCACCTAACGTTGTTTACATAAAA ACCGAAGATCCTGATTTGCCCGCGTTTTATTTTGATCCCCTTATCA ACCCCATATCTCATAGACACGCGGTGAAGAGTTTAGAACCTTTAC CCGAGGATGACGAGGAATATATTTTACCTGAAACGGTACAACCAT TCTTGCAAGAAACGCCTCTGTATACCGACAATACTGCTAATGGTAT CGCTCTACTTTGGGCGCCACGACCGTTTAATATGAGATCAGGCAG ATGCAGAAGGGCGATAGACGTACCATTAGTAAAATCTTGGTACAT GGAGCATGTTCCACCAGGTCAACCTGTGAAAGTCCGCGTCAGTTA CCAAAAATTACTGAAATATTACGTACTTAACGCTTTAAAACACAGA GCCCCCAAACCTCAGAAAAAGCGGTATCTGTTTAGATCATTTAAAT CAACAAAATTCTTTCAAACCACAACCCTTGATTGGGTTGAAGCTGG TTTACAAGTCTGCAGACAAGGTTATAACATGTTAAATCTGTTAATTC ATAGAAAGAATTTGAATTACTTACATTTGGATTACAATTTCAACTTG AAACCTGTTAAAACATTGACAACCAAGGAGAGAAAAAAGTCGCGT TTTGGAAACGCTTTCCACTTGTGCCGTGAAATTCTTCGTCTAACAA AATTAATAATTGATTCCCACGTACAATATAGATTAAATAACGTGGAC GCTTTTCAACTGTCTGACGGTTTACAATACATATTCGCCCATGTCG GCCAACTTACTGGAATGTACAGATACAAATACAAACTTATGAGGCA AATCCGCATGTGCAAAGATCTTAAGCATCTGGTGTACTATCGTTTT

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AACACAGGTCCAGTTGGTAAAGGTCCTGGTTGTGGAATCTGGGCT CCAGGTTGGAGAGTGTGGCTGTTCTTTATGAGGGGTATTACTCCG CTTCTTGAAAGATGGCTGGGTAACTTGTTGTCGCGTCAGTTCGAG GGTCGTCACTCTAAAGGTGTGGCAAAAACGGTCACCAAGCAAAGG GTTGAGTCTCACTTTGATCTTGAGTTGAGAGCATCTGTTATGCATG ATATTGTTGATATGATGCCTGAAGGCATAAAACAGAACAAGGCTAG AACAATTTTGCAGCATTTGTCCGAAGCTTGGAGATGTTGGAAGGC GAATATTCCCTGGAAAGTACCTGGGCTACCAATTCCCATCGAAAA CATGATCCTTCGTTACGTTAAAATGAAAGCCGATTGGTGGACAAAC ACCGCTCACTATAACAGAGAAAGAATACGTAGAGGAGCCACTGTC GATAAAACCGTCTGCAAAAAGAACTTAGGTCGCTTAACCAGGCTG TACCTTAAAGCTGAACAAGAAAGACAACATAACTACCTTAAAGACG GTCCTTACATTTCCCCTGAAGAAGCCGTTGCCATTTATACAACTAC TGTGCATTGGTTGGAGTCCAGAAGATTCGCTCCCATACCTTTTCCA CCGCTTTCCTATAAACACGACACCAAACTGCTAATTTTGGCTTTGG AAAGGCTTAAAGAAGCATACAGCGTAAAATCCAGGTTAAATCAAA GTCAAAGAGAAGAACTTGGTCTCATTGAACAAGCCTACGATAATC CACACGAAGCTTTATCGAGAATCAAACGTCATTTGTTGACACAAAG AGCTTTTAAAGAAACGGGGATTGAATTTATGGATTTGTATAGCCAC TTGATACCAGTGTATGATGTTGAACCCTTAGAAAAAATTACAGATG CCTATTTAGATCAATACCTTTGGTATGAAGCCGATAAAAGAAGATT GTTTCCGCCATGGATCAAACCTGCAGACACGGAACCACCGCCGTT ACTTGTATACAAATGGTGTCAAGGCATAAACAACCTTCAGGAGGTT TGGGACGTAAACGAGGGCGAATGTAACGTTTTGCTGGAATCGAAA TTTGAAAAACTTTATGAAAAAATCGATTTGACCCTGCTGAACAGAC TTTTGCGTCTCATCGTTGATCACAACATCGCCGATTACATGACGGC CAAGAACAACGTTGTTATTAATTACAAAGACATGAATCACACAAAC AGTTACGGAATCATAAGAGGACTTCAGTTTGCCTCGTTTGTCACG CAGTATTACGGTTTGGTATTGGATTTGTTAGTTCTCGGCCTACAGA GGGCGTCCGAAATGGCGGGCCCACCCCAAATGCCCAACGACTTT

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TTGACTTTTCAAGATGTTGCAACAGAAAGCTGTCATCCAATCAGAT TGTACTGCAGATATGTCGACAGAATACACATGTTCTTTAGGTTTTC TGCTGAAGAAGCTAAAGACCTGATTCAAAGGTATTTAACAGAACAT CCTGATCCAAACAACGAAAACATCGTTGGTTATAACAACAAAAAAT GCTGGCCCAGGGACGCTAGGATGCGTCTTATGAAACACGATGTTA ACTTGGGCAGGGCCGTATTCTGGGACATTAAAAATCGTCTACCGA GATCTGTAACTACTATCCAATGGGAGAACAGTTTTGTCAGCGTTTA TTCAAAGGATAATCCAAATCTTTTGTTTAACATGTCCGGATTTGAGT GTAGGATTTTGCCTAAATGTCGCACGCAACACGAAGAATTCACCC ATCGCGATGGTGTTTGGAATTTGCAACATGAAGGCAGTAAAGAAA GAACCGCTCAATGTTTCTTGAGAGTTGATGATGAATCAATGTCAAG GTTTCACAACAGAGTCCGACAGATTTTGATGGCTTCTGGATCTACC ACGTTCACAAAGATCGTCAACAAATGGAACACAGCCCTTATAGGT CTAATGACATATTTTAGAGAAGCTGTGGTAAACACGCAAGAACTGC TAGACTTGTTGGTAAAGTGCGAGAACAAAATTCAAACTCGTATCAA AATCGGTCTTAACTCTAAAATGCCCAGCAGATTCCCGCCCGTGGT GTTCTATACTCCCAAAGAATTGGGCGGGTTGGGTATGTTGTCGAT GGGTCACGTTTTAATTCCGCAGTCCGATTTAAGATGGTCTAAACAG ACCGACGTTGGCATCACACATTTTCGTTCAGGTATGAGCCACGAC GAGGACCAGCTAATTCCCAATTTGTATCGTTACATACAGCCGTGG GAGTCGGAGTTTATCGACTCCCAGCGTGTCTGGGCCGAGTACGC ACTCAAAAGACAGGAAGCAAATGCGCAAAACAGGCGTTTGACATT GGAAGATTTGGAAGATTCCTGGGATCGCGGTATTCCCAGGATAAA CACGCTCTTCCAGAAGGACAGGCACACCTTGGCTTACGACAAGG GCTGGAGAATCCGAACGGAGTTCAAGCAGTATCAAGTTTTGAAAC AGAATCCGTTCTGGTGGACTCACCAAAGACACGATGGCAAACTTT GGAACTTGAATAACTACAGAACAGACATGATTCAAGCGTTGGGAG GTGTTGAAGGTATTCTAGAACACACTTTGTTCAAAGGTACATATTT TCCCACTTGGGAAGGTCTTTTCTGGGAAAAGGCTTCTGGTTTTGA GGAATCCATGAAGTACAAAAAGCTCACCAACGCCCAAAGATCCGG

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TTTGAACCAGATTCCCAATCGTAGATTTACGCTTTGGTGGTCACCT ACAATTAACAGGGCCAACGTTTACGTTGGATTTCAGGTACAACTC GATTTGACCGGTATTTTTATGCACGGTAAAATTCCAACTCTCAAAA TCTCTTTGATTCAAATATTCAGGGCTCACTTGTGGCAGAAGGTCCA TGAGTCGATAGTCATGGATCTTTGTCAGGTCTTTGATCAAGAATTG GACGCTTTGGAAATTGAAACAGTTCAAAAAGAAACAATCCATCCCA GAAAGTCATACAAAATGAACTCGTCTTGTGCCGATATTTTACTGTT CTCTGCTTACAAATGGAATGTATCCAGACCGTCCTTACTTGCAGAC ACAAAAGATACCATGGACAACACAACCACCCAAAAATACTGGATA GACGTGCAACTGAGATGGGGTGATTACGATTCCCATGACGTTGAG CGTTACGCCCGTGCCAAATTCTTGGATTACACCACAGACAACATG TCCATCTATCCATCACCAACTGGTGTATTGATCGCCATAGATTTGG CCTACAACTTGCACAGCGCCTACGGAAACTGGTTCCCTGGTTGCA AACCTTTGATTCAACAGGCGATGGCAAAAATAATGAAGGCGAACC CCGCGCTATATGTATTAAGAGAGCGTATCCGTAAAGCTCTCCAATT GTACTCTAGTGAACCTACTGAACCCTACTTGTCGAGTCAAAATTAC GGAGAATTGTTCTCGAATCAAATCATTTGGTTCGTTGATGACACCA ATGTGTACCGTGTCACCATCCACAAGACTTTTGAGGGAAATTTGAC GACGAAGCCAATCAATGGCGCTATATTTATTTTTAACCCCAGAACT GGACAGTTGTTCTTGAAAATTATTCATACTTCTGTATGGGCTGGAC AAAAACGTTTGGGACAATTGGCAAAATGGAAGACCGCCGAAGAAG TAGCCGCTCTAATTCGTTCGCTTCCCGTAGAAGAACAACCCAAAC AAATCATCGTTACCAGAAAAGGAATGTTGGATCCTCTTGAAGTGCA TCTTCTTGATTTCCCCAACATCGTTATCAAAGGATCTGAACTACAA CTGCCTTTCCAGGCTTGCCTCAAGATAGAAAAGTTCGGCGATTTG ATTTTGAAAGCTACCGAACCTCAGATGGTTCTGTTCAATCTTTACG ACGATTGGTTGAAGACCATTTCGTCTTACACCGCCTTCTCCAGGTT GATTTTGATATTAAGGGCATTACACGTCAATACAGAAAGAACTAAG GTTATTCTTAAACCCGACAAAACCACAATTACCGAGCCGCATCATA TTTGGCCTACGCTTTCTGACGATGAATGGATTAAAGTTGAAGTGCA

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ACTTAAGGATCTTATTTTGGCGGATTACGGAAAAAAGAACAACGTG AACGTTGCTTCTCTAACCCAATCAGAAATTCGCGATATTATTCTCG GTATGGAGATCAGCGCGCCATCTGCTCAGAGACAACAGATCGCC GAGATCGAAAAGCAAACGAAGGAACAGTCGCAACTCACTGCTACT ACTACAAGAACTGTCAACAAACACGGCGATGAAATTATTACCAGCA CCACGAGCAATTACGAGACGCAGACGTTCAACTCGAAGACTGAAT GGAGAGTGAGGGCAATTTCAGCAACTAATTTGCATTTGAGGACAA ACCACATTTATGTCAGTTCGGATGATATTAAAGAGACTGGATACAC CTATATTTTGCCCAAGAACGTCTTGAAGAAGTTTGTCACCATTTCC GATCTTAGAGCACAAATTTGCGGCTTTTTGTATGGCGTCAGCCCG CCCGACAATCCTCAAGTGAAGGAACTGCGCTGTTTAGTGCTGCCA CCCCAATGGGGCACACATCAAACGGTTCACATACCACACACGCCG CCAAACCATCCGTTCCTCAAGGACATGGAACCTCTAGGCTGGATA CACACACAACCCAACGAGTTGCCTCAACTGTCACCTCAGGATATC ACCAATCATGCCAAACTGATGGCCGATAATCCCGCTTGGGATGGT GAAAAGACCGTTATCATTACATGCTCATTTACGCCCGGCTCTTGTT CGTTGACAGCGTATAAGTTAACGCCCTCTGGGTTCGAGTGGGGCA GACAAAATACTGATAAAGGTAACAATCCCAAAGGGTACTTGCCCA GTCACTACGAAAAGGTTCAGATGTTGCTGTCTGATAGGTTTCTAG GGTTCTTTATGGTACCTACGCAGGGGTCTTGGAACTACAACTTTAT GGGTGTCAGACACGACCCAAGCATGAAGTATGAATTGCAATTAGC AAATCCAAAAGAGTTTTACCATGAAGTTCACAGGCCGGCTCATTTC CTCAACTTTTCGTCTTTGGAAGACGGAGATGGTGCTGGTGCCGAT CGCGAAGATGCATTCGCTTAA [0038] SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de PRP8 da PB codificado por um DNA de prp8 da PB exemplar:

MSLPPYLLGPNPWLMAQQQLAAAHAQAQAAAAQAHAQALQQQIPP

PHPKSDIITEDKLQEKAQKWHQLQSKRFADKRKLGFVEAQKEDMPP

EHIRKIIRDHGDMSSRKYRHDKRVYLGALKYMPHAVMKLLENMPMP

Petição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 47/420

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WEQIRDVKVLYHITGAITFVN ΕIPW WEPI Yl AQWGTMWIΜ M RREKRD RRHFKRMRFPPFDDEEPPLDYADNVLDVEPLEAIQIELDAEEDSAIAK WFYDHKPLVGSKFVNGSTYRKWNLSLPMMATLYRLANQLLTDLVDT NYFYLFDTKSFFTAKALNMAIPGGPKFEPLIKDMNPADEDWNEFNDIN KIIIRQPIRTEYRIAFPYLYNNMPHFVHLSWYHAPNWYIKTEDPDLPAF YFDPLINPISHRHAVKSLEPLPEDDEEYILPETVQPFLQETPLYTDNTA NGIALLWAPRPFNMRSGRCRRAIDVPLVKSWYMEHVPPGQPVKVRV SYQKLLKYYVLNALKHRAPKPQKKRYLFRSFKSTKFFQTTTLDWVEA GLQVCRQGYNMLNLLIHRKNLNYLHLDYNFNLKPVKTLTTKERKKSR FGNAFHLCREILRLTKLIIDSHVQYRLNNVDAFQLSDGLQYIFAHVGQL TGMYRYKYKLMRQIRMCKDLKHLVYYRFNTGPVGKGPGCGIWAPG WRVWLFFMRGITPLLERWLGNLLSRQFEGRHSKGVAKTVTKQRVES HFDLELRASVMHDIVDMMPEGIKQNKARTILQHLSEAWRCWKANIPW KVPGLPIPI ΕΝ ΜILRYVKM KADWWTNTAH YN RERIRRGATVDKTVCK KNLGRLTRLYLKAEQERQHNYLKDGPYISPEEAVAIYTTTVHWLESR RFAPIPFPPLSYKHDTKLLILALERLKEAYSVKSRLNQSQREELGLIEQ AYDNPHEALSRIKRHLLTQRAFKETGIEFMDLYSHLIPVYDVEPLEKIT DAYLDQYLWYEADKRRLFPPWIKPADTEPPPLLVYKWCQGINNLQEV WDVNEGECNVLLESKFEKLYEKIDLTLLNRLLRLIVDHNIADYMTAKN NWINYKDMNHTNSYGIIRGLQFASFVTQYYGLVLDLLVLGLQRASEM AGPPQMPNDFLTFQDVATESCHPIRLYCRYVDRIHMFFRFSAEEAKD LIQRYLTEHPDPNNENIVGYNNKKCWPRDARMRLMKHDVNLGRAVF WDIKNRLPRSVTTIQWENSFVSVYSKDNPNLLFNMSGFECRILPKCR TQHEEFTHRDGVWNLQHEGSKERTAQCFLRVDDESMSRFHNRVRQ ILMASGSTTFTKIVNKWNTALIGLMTYFREAWNTQELLDLLVKCENKI QTRIKIGLNSKMPSRFPPWFYTPKELGGLGMLSMGHVLIPQSDLRW SKQTDVGITHFRSGMSHDEDQLIPNLYRYIQPWESEFIDSQRVWAEY ALKRQEANAQNRRLTLEDLEDSWDRGIPRINTLFQKDRHTLAYDKG WRIRTEFKQYQVLKQNPFWWTHQRHDGKLWNLNNYRTDMIQALGG VEGILEHTLFKGTYFPTWEGLFWEKASGFEESMKYKKLTNAQRSGLN

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QIPNRRFTLWWSPTINRANVYVGFQVQLDLTGIFMHGKIPTLKISLIQIF RAHLWQKVHESIVMDLCQVFDQELDALEIETVQKETIHPRKSYKMNS SCADILLFSAYKWNVSRPSLLADTKDTMDNTTTQKYWIDVQLRWGDY DSHDVERYARAKFLDYTTDNMSIYPSPTGVLIAIDLAYNLHSAYGNWF PGCKPLIQQAMAKIMKANPALYVLRERIRKALQLYSSEPTEPYLSSQN YGELFSNQIIWFVDDTNVYRVTIHKTFEGNLTTKPINGAIFIFNPRTGQL FLKIIHTSVWAGQKRLGQLAKWKTAEEVAALIRSLPVEEQPKQIIVTRK GMLDPLEVHLLDFPNIVIKGSELQLPFQACLKIEKFGDLILKATEPQMV LFNLYDDWLKTISSYTAFSRLILILRALHVNTERTKVILKPDKTTITEPHH IWPTLSDDEWIKVEVQLKDLILADYGKKNNVNVASLTQSEIRDIILGMEI SAPSAQRQQIAEIEKQTKEQSQLTATTTRTVNKHGDEIITSTTSNYET QTFNSKTEWRVRAISATNLHLRTNHIYVSSDDIKETGYTYILPKNVLKK FVTISDLRAQICGFLYGVSPPDNPQVKELRCLVLPPQWGTHQTVHIP HTPPNHPFLKDMEPLGWIHTQPNELPQLSPQDITNHAKLMADNPAW DGEKTVIITCSFTPGSCSLTAYKLTPSGFEWGRQNTDKGNNPKGYLP SHYEKVQMLLSDRFLGFFMVPTQGSWNYNFMGVRHDPSMKYELQL ANPKEFYHEVHRPAHFLNFSSLEDGDGAGADREDAFA [0039] SEQ ID NO: 7 mostra um outro DNA de prp8 da WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-1 da WCR regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

CAATTTACAAGATGTGTGGGATGTGAATGAAGGGGAGTGTAACGT GTTACTGGAATCTAAGTTTGAAAAACTATATGAAAAGATCGATTTG ACTCTACTTAACAGACTTCTCCGATTGATAGTGGACCACAACATAG CTGATTACATGACCGCTAAGAATAACGTCGTTATAAACTACAAAGA TATGAATCACACCAACAGTTACGGAATTATTCGAGGATTGCAGTTT GCCTCGTTCATTACTCAGTATTATGGTCTGGTTTTGGATCTGCTGG TATTGGGTCTGCAGAGAGCCAGTGAAATGGCTGGGCCACCTCAAA TGCCTAACGATTTCTTGACGTTCCAAGATGTTCAATCCGAAACGTG CCATCCTATTCGGCTTTACTGCAGATATGTGGACAGAATTCATATG

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TTTTTCAGATTTTCTGCAGAAGAAGCCAAAGATTTGATCCAAAGAT ACCTAACAGAACATCCAGATCCTAATAATG [0040] SEQ ID NO: 8 mostra um outro DNA de prp8 da WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-2 da WCR regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

CGGCTTAATCCGCGGCCTCCAGTTCAGCAGTTTCATATTCCAATAT TATGCTCTGGTCATAGATCTTCTGATTTTAGGGCTGACGCGAGCC AATGAACTTGCCGGCAGTATAGGTGGCGGCGGAGGCGGAGGTTT CGCTAATCTCAAAGATCGCGAAACGGAGATAAAACATCCCATCCG CTTGTATTGCCGATATATAGATGAAATATGGATCTGCTTCAAATTC ACCAAAGAGGAGTCTCGTAGCTTGATTCAAAGGTATTTGACGGAG AATCCAACCGCTAGTCAGCAGCTCTCCACTGAAGAAGGCATCGAC TACCCCATCAAAAAGTGTTGGCCTAAAGACTGCCGAATGAGAAAA ATGAAATTCGACGTTAATATCGGACGAGCCGTTTTCTGGGAGATT CAGAAACGTCTACCGAGAAGTTTAGCTGAGCTGAGTTGGGGCAAA G [0041] SEQ ID NO: 9 mostra um outro DNA de prp8 da WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-3 da WCR regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

CTAAGAATAACGTCGTTATAAACTACAAAGATATGAATCACACCAA CAGTTACGGAATTATTCGAGGATTGCAGTTTGCCTCGTTCATTACT CAGTATTATGGTCTGGTTTTGGATCTGCTGGTATTGGGTCTGCAG AGAGCCAGTGAAATGGCTGGGCCACCTCAAATGCCTAACGATTTC TTGACGTTCCAAGATGTTCAATCCGAAACGTGCCATCCTATTCGG CTTTACTGCAGATATGTGGACAGAATTCATATGTTTTTCAGATTTTC TGCAGAAGAAGCCAAAGATTTGATCCAAAGATACCTAACAGAACA TCCAGATCCTAATAATG [0042] SEQ ID NO: 10 mostra um outro DNA de prp8 da WCR

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40/164 exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-3 da WCR v1 (versão 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

CTAAGAATAACGTCGTTATAAACTACAAAGATATGAATCACACCAA CAGTTACGGAATTATTCGAGGATTGCAGTTTGCCTCGTTCATTACT CAGTATTATGGTCTGGTTTTGGATCTGC [0043] SEQ ID NO: 11 mostra um outro DNA de prp8 da WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-3 da WCR v2 (versão 2), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: TGGCTGGGCCACCTCAAATGCCTAACGATTTCTTGACGTTCCAAG ATGTTCAATCCGAAACGTGCCATCCTATTCGGCTTTACTGCAGATA TGTGGACAGAATTCATATGTTTTTCAGATTTTCTGCAGAAGAAGCC AAAGATTTGATCCAAAGATACCTAACAGAACATCCAGATCCTAATA ATG [0044] SEQ ID NO: 12 mostra um outro DNA de prp8 da PB exemplar, aqui referido em alguns lugares como prp8-3 da PB regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

AAATGGAAGACCGCCGAAGAAGTAGCCGCTCTAATTCGTTCGCTT CCCGTAGAAGAACAACCCAAACAAATCATCGTTACCAGAAAAGGA ATGTTGGATCCTCTTGAAGTGCATCTTCTTGATTTCCCCAACATCG TTATCAAAGGATCTGAACTACAACTGCCTTTCCAGGCTTGCCTCAA GATAGAAAAGTTCGGCGATTTGATTTTGAAAGCTACCGAACCTCA GATGGTTCTGTTCAATCTTTACGACGATTGGTTGAAGACCATTTCG TCTTACACCGCCTTCTCCAGGTTGATTTTGATATTAAGGGCATTAC ACGTCAATACAGAAAGAACTAAGGTTATTCTTAAACCCGACAAAAC CACAATTACCGAGCCGCATC [0045] SEQ ID NO: 13 mostra uma sequência de nucleotídeo do promotor de fago T7.

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41/164 [0046] SEQ ID NO: 14 mostra um fragmento de uma região de codificação YFP exemplar.

[0047] SEQ ID NOs: 15 a 26 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as partes das sequências de prp8 exemplares compreendendo a prp8-1 da WCR regí, a prp8-2 da WCR regí, a prp8-3 da WCR regí, a prp8-3 da WCR v1, a prp8-3 da WCR v2, e a prp8 da PB regí utilizadas em alguns exemplos para a produção de dsRNA.

[0048] SEQ ID NO: 27 mostra um gene de YFP exemplar.

[0049] SEQ ID NO: 28 mostra uma sequência de DNA da anexina região 1.

[0050] SEQ ID NO: 29 mostra uma sequência de DNA da anexina região 2.

[0051] SEQ ID NO: 30 mostra uma sequência de DNA da beta espectrina 2 região 1.

[0052] SEQ ID NO: 31 mostra uma sequência de DNA de beta espectrina 2 região 2.

[0053] SEQ ID NO: 32 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 1.

[0054] SEQ ID NO: 33 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 2.

[0055] SEQ ID NOs: 34 a 61 mostram iniciadores utilizados para amplificar as regiões de genes de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para a síntese de dsRNA.

[0056] SEQ ID NO: 62 mostra uma sequência de DNA de milho que codifica uma proteína semelhante a TIP41.

[0057] SEQ ID NO: 63 mostra a sequência de nucleotídeo de um oligonucleotídeo de iniciador T20VN.

[0058] SEQ ID NOs: 64 a 68 mostram iniciadores e sondas utilizadas para análises de expressão de transcritos de dsRNA no milho.

[0059] SEQ ID NO: 69 mostra uma sequência de nucleotídeo de

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42/164 uma parte de uma região de codificação de SpecR utilizada para a detecção da cadeia principal de vetor binário.

[0060] SEQ ID NO: 70 mostra uma sequência de nucleotídeo de uma região de codificação de AAD1 utilizada para a análise do número de cópias genômicas.

[0061] SEQ ID NO: 71 mostra uma sequência de DNA de um gene da invertase de milho.

[0062] SEQ ID NOs: 72 a 80 mostram as sequências de nucleotídeo de oligonucleotídeos de DNA utilizados para as determinações de números de cópias de genes e detecção da cadeia principal do vetor binário.

[0063] SEQ ID NOs: 81 a 83 mostram iniciadores e sondas utilizadas para análises de expressão de milho transcrita de dsRNA.

[0064] SEQ ID NO: 84 a 92 mostram RNAs exemplares transcritos de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotídeos de prp8 exemplares e seus fragmentos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Visão geral das várias modalidades [0065] Desenvolve-se a interferência de RNA (RNAi) como uma ferramenta para o manejo de pragas de inseto, utilizando uma das espécies de praga alvo mais prováveis para plantas transgênicas que expressam dsRNA; a larva da raiz do milho ocidental. Até agora, a maior parte dos genes propostos como alvos para RNAi em larvas de verme da raiz realmente não atingem sua finalidade. Aqui, descrevemos a eliminação mediada pelo RNAi do prp8 nas pragas de inseto exemplares, larva da raiz do milho ocidental e besouro do pólen, que mostra ter um fenótipo letal quando, por exemplo, as moléculas de iRNA são liberadas através do ds RNA de prp8 ingerido ou injetado. Nas modalidades nesse artigo, a capacidade de liberar dsRNA de prp8 através da alimentação de insetos confere um efeito de RNAi que é

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43/164 muito útil para o manejo de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros). Ao combinar RNAi mediado por prp8 com outros alvos de RNAi úteis, o potencial de afetar múltiplas sequências alvo, por exemplo, em vermes de raiz larvais e besouro de pólen, pode aumentar as oportunidades para desenvolver abordagens sustentáveis para o manejo de pragas de insetos envolvendo tecnologias de RNAi.

[0066] São aqui divulgados métodos e composições para o controle genético de infestações de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros). Métodos para identificar um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga de inseto para uso como gene-alvo para o controle mediado por RNAi de uma população de pragas de inseto também são fornecidos. Os vetores plasmídicos de DNA que codificam uma molécula de RNA podem ser designados para suprimir um ou mais genes-alvo essenciais para o crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, métodos são fornecidos para a repressão pós-transcrição da expressão ou inibição de um gene-alvo através de moléculas de ácido nucleico que são complementares de uma sequência de codificação ou não codificação do gene-alvo em uma praga de inseto. Nestas e outras modalidades, uma praga pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA transcritas de toda ou uma parte de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de codificação ou não codificação de um gene-alvo, fornecendo assim um efeito protetor da planta.

[0067] Assim, algumas modalidades envolvem a inibição específica da sequência da expressão de produtos de genes-alvo, utilizando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar às sequências de codificação e/ou não codificação dos genes-alvo para obter pelo menos o controle parcial de uma praga de inseto (por

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44/164 exemplo, coleópteros). É divulgado um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo um polinucleotídeo, por exemplo, como apresentado em uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e seus fragmentos. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir destes polinucleotídeos, seus fragmentos ou um gene que compreende um ou mais desses polinucleotídeos, para o silenciamento pós-transcricional ou inibição de um gene-alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7 a 12) e/ou seu complemento.

[0068] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula vegetal) tendo no seu genoma pelo menos um ADN recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Nas modalidades particulares, uma molécula de dsRNA codificada pode ser fornecida quando ingerida por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros) para silenciar ou inibir de forma pós-transcricional a expressão de um gene-alvo na praga. O DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; e um polinucleotídeo que consiste em uma sequência parcial de um gene compreendendo uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; e/ou seus complementos.

[0069] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante tendo no seu genoma um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) que compreende a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 ou SEQ ID NO: 91 (por exemplo, pelo menos um polirribonucleotídeo selecionado de um grupo que compreende as SEQ ID NOs: 86 a 90 e 92). Quando ingerido por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptePetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 55/420

45/164 ros), as moléculas de iRNA podem silenciar ou inibir a expressão de um DNA de prp8 alvo (por exemplo, um DNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs : 1, 3, 5 e 7 a 12) na praga, e assim resulta na cessação do crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação na praga.

[0070] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante tendo no seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas que compreendem uma tal célula vegetal transformada. Além de tais plantas transgênicas, plantas de progenitura de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgênicas e produtos vegetais transgênicos, são todos fornecidos, cada um dos quais compreende DNAs recombinantes. Em modalidades particulares, uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Portanto, nessas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser isolada a partir de uma célula vegetal transgênica. Nas modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo que compreende milho (Zea mays), soja (Glicina max), algodão, plantas da família Poaceae e colza (Brassica sp.).

[0071] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleópteros). Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode estar de forma operacional ligado a um promotor, e também pode estar operacionalmente ligado a

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46/164 uma sequência de terminação da transcrição. Nas modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto pode compreender: (a) transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura celular vegetal que compreende uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) selecionar uma célula vegetal transformada que integrou o vetor em seu genoma; e (d) determinar que a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula vegetal que possui o vetor integrado no seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor.

[0072] Assim, também é divulgada uma planta transgênica que compreende um vetor tendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada no seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Nas modalidades particulares, a expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero) que coloca em contato a planta ou célula vegetal transformada (por exemplo, através da alimentação da planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal), de tal modo que o crescimento e/ou a sobrevivência da praga é inibida. As plantas transgênicas aqui divulgadas podem apresentar resistência e/ou proteção intensificada às infestações de pragas de inseto. As plantas transgênicas particulares podem apresentar resistência e/ou proteção

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47/164 acentuada de uma ou mais pragas de coleópteros selecionadas do grupo que consiste em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella·, Meligethes aeneus Fabricius; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

[0073] Também são aqui divulgados métodos para a liberação de agentes de controle, tais como uma molécula de iRNA, a uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros). Tais agentes de controle podem provocar, direta ou indiretamente, uma deficiência na capacidade de uma população de pragas de inseto de se alimentar, crescer ou de outra maneira provocar danos no hospedeiro. Em algumas modalidades, é fornecido um método que compreende a liberação de uma molécula de dsRNA estabilizada a uma praga de inseto para suprimir pelo menos um gene-alvo na praga, com isso fazendo com que o RNAi reduza ou elimine o dano da planta em um hospedeiro de praga. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene-alvo na praga de inseto pode resultar na cessação do crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento da praga.

[0074] Em algumas modalidades, composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidas que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) para uso com plantas, animais e/ou no ambiente de uma planta ou animal para conseguir a eliminação ou redução de uma infestação de praga de inseto (por exemplo, coleópteros). Nas modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser alimentada na praga do inseto. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou a fonte de alimento disponível para a praga. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da praga, o que pode, por sua vez, resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene-alvo nas células da praga. A ingestão ou dano de uma planta ou

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48/164 célula vegetal por uma infestação de pragas de inseto pode ser limitada ou eliminada em ou sobre qualquer tecido hospedeiro ou ambiente em que a praga está presente fornecendo uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA no hospedeiro da praga .

[0075] As composições e os métodos aqui divulgados podem ser utilizados em conjunto com as combinações com outros métodos e composições para controlar o dano por pragas de inseto (por exemplo, coleópteros). Por exemplo, uma molécula de iRNA tal como aqui descrita para proteger plantas de pragas de inseto pode ser utilizada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de inseto, biopesticidas eficazes contra uma tal praga, rotação de culturas, técnicas genéticas recombinantes que apresentam características diferentes das características de métodos mediados por RNAi e composições de RNAi (por exemplo, produção recombinante de proteínas nas plantas que são prejudiciais a uma praga de inseto (por exemplo, toxinas Bt e polipeptídeos PIP-1 (Ver a Publicação de Patente U.S. No. 2014/0007292 A1)), e/ou expressão recombinante de outras moléculas de iRNA.

II. Abreviações dsRNA ácido ribonucleico de filamento duplo

EST marca de sequência expressa

Gl inibição do crescimento

NCBI National Ccenter for Biotechnology Information gDNA ácido desoxirribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibidor

ORF estrutura de leitura aberta

RNAi interferência de ácido ribonucleico miRNA ácido micro ribonucleico shRNA ácido ribonucleico na forma de grampo de cabelo pequeno siRNA ácido ribonucleico inibidor pequeno

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49/164 hpRNA ácido ribonucleico na forma de grampo de cabelo

UTR região não transladada

WCR larva da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)

NCR larva da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi Smith and Lawrence)

MCR larva da raiz do milho mexicano (Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith)

PB besouro de pólen (Meligethes aeneus Fabricius)

PCR reação da cadeia da polimerase qPCR reação da cadeia da polimerase quantitativa RISC Complexo de Silenciamento induzido por RNA

SCR larva da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)

SEM erro padrão da média

YFP proteína fluorescente amarela

III. Termos [0076] Na descrição e tabelas que se seguem, vários termos são utilizados. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado em tais termos, são fornecidas as seguintes definições:

[0077] Praga de coleópteros: Tal como aqui utilizado, o termo praga de coleópteros refere-se a insetos de pragas da ordem Coleoptera, incluindo os insetos de praga do gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agrícolas e produtos de cultura, incluindo o milho e outras gramíneas verdadeiras. Nos exemplos particulares, uma praga de coleópteros é selecionada de uma lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. Zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. Undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; e MeliPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 60/420

50/164 gethes aeneus Fabricius (PB).

[0078] Contato (com um organismo): Como aqui utilizado, o termo contato com ou absorção por um organismo (por exemplo, uma praga de coleópteros), em relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internaiização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo, e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, através da alimentação); contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e imersão de organismos com uma solução que compreende a molécula de ácido nucleico.

[0079] Contig: Conforme aqui utilizado, o termo contig refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos derivados de uma única fonte genética.

[0080] Planta de milho: Como aqui utilizado, o termo planta de milho refere-se a uma planta da espécie, Zea mays (milho).

[0081] Expressão: Como aqui utilizado, expressão de um polinucleotídeo de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, gDNA ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, incluindo frequentemente a síntese de uma proteína. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão gênica. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer lugar da via de DNA para RNA para proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exemplo, através de controles que atuam na transcrição, translação, transporte de RNA e processamento, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através de ativação, inativação, comPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 61/420

51/164 partimentação ou degradação de moléculas proteicas específicas depois de terem sido feitas, ou por suas combinações. A expressão de genes pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio da atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[0082] Material genético: Como aqui utilizado, o termo material genético inclui todos os genes e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.

[0083] Inibição: Como aqui utilizado, o termo inibição, quando utilizado para descrever um efeito sobre um polinucleotídeo de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular do mRNA transcrito a partir do polinucleotídeo de codificação e/ou peptídeo, polipeptídeo ou produto proteico do polinucleotídeo de codificação. Em alguns exemplos, a expressão de um polinucleotídeo de codificação pode ser inibida de tal modo que a expressão é aproximadamente eliminada. Inibição específica refere-se à inibição de um polinucleotídeo de codificação alvo sem consequentemente afetar a expressão de outros polinucleotídeos de codificação (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo executada.

[0084] Inseto: Como aqui utilizado no que se refere às pragas, o termo praga de inseto inclui especificamente pragas de insetos de coleópteros.

[0085] Isolado: um componente biológico isolado (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido sem considerar ou purificado fora de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos e proteínas), ao mesmo tempo em que se efetua uma alteração química

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52/164 ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo através da quebra de ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA remanescente no cromossomo). As moléculas de ácido nucleico e as proteínas que foram isoladas incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados através da expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como moléculas de ácido nucleico quimicamente sintetizadas, proteínas e peptídeos.

[0086] Molécula de ácido nucleico: Como aqui utilizado, o termo molécula de ácido nucleico pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir filamentos senso e antissenso de RNA, cDNA, gDNA e formas sintéticas e polímeros misturados do acima. Um nucleotídeo ou nucleobase pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico como aqui utilizada é sinônimo de ácido nucleico e polinucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico geralmente possui pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que seja especificado de outra forma. Por convenção, a sequência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é lida a partir da extremidade 5' até a 3' da molécula. O complemento de uma molécula de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases que podem formar pares de base com as nucleobases da molécula de ácido nucleico (isto é, A-T/U e G-C).

[0087] Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos compreendendo um DNA modelo que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação de 5' a 3', de modo que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção 5' para 3') irá transcrever um ácido nuPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 63/420

53/164 cleico do complemento que pode hibridar com a molécula de mRNA. A menos que seja explicitamente estabelecido o contrário, ou fique claro ser diferente do contexto, o termo complemento, portanto, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases de 5' a 3', que pode formar pares de base com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. Da mesma forma, a não ser que seja explicitamente mencionado de outra forma (ou fique claro ser diferente do contexto), o complemento reverso de um ácido nucleico refere-se ao complemento na orientação inversa. O que precede é demonstrado na seguinte ilustração:

ATGATGATG	polinucleotídeo
TACTACTAC	complemento do polinucleotídeo
CATCATCAT	complemento reverso do polinucleotídeo

[0088] Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi formadoras de RNA na forma de grampo de cabelo. Nessas moléculas de RNAi, o complemento de um ácido nucleico a ser direcionado pela interferência de RNA e o complemento reverso podem ser encontrados na mesma molécula, de tal modo que a molécula de RNA de filamento único pode dobrar e se hibridar com a região compreendendo os polinucleotídeos complementares e complementares re versos.

[0089] As moléculas de ácido nucleico incluem todos os polinucleotídeos, por exemplo: formas de DNA de filamento único e duplo; formas de RNA de filamento único; e formas de RNA de filamento duplo (dsRNA). O termo sequência de nucleotídeo ou sequência de ácido nucleico refere-se aos filamentos tanto sentido quanto antissenso de um ácido nucleico como filamentos únicos individuais ou no dúplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) é inclusivo do iRNA (RNA inibidor), do dsRNA (RNA de filamento duplo), siRNA (RNA de interferência pequeno), shRNA (RNA na forma de grampo de cabelo pequeno), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA ), hpRNA (RNA na

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54/164 forma de grampo de cabelo), tRNA (RNAs de transferência, seja carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo ácido desoxirribonucleico (DNA) é inclusivo de híbridos de cDNA, gDNA e DNA-RNA. Os termos polinucleotídeo e ácido nucleico e seus fragmentos serão compreendidos por aqueles da técnica como um termo que inclui tanto gDNAs, RNAs ribossômicos, RNAs de transferência, RNAs mensageiros, óperons e polinucleotídeos planejados menores que codificam ou podem ser adaptados para codificar, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[0090] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados por divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por polimerização de precursores nucleotídicos individuais. Sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de bases de comprimento. Visto que os oligonucleotídeos podem se ligar a um ácido nucleico complementar, eles podem ser utilizados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser utilizados na PCR, uma técnica para a amplificação de DNAs. Na PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um iniciador, o que permite uma DNA polimerase prolongar o oligonucleotídeo e replicar o filamento complementar.

[0091] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir cada um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações nucleotídicas de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas química ou bioquimicamente, ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou derivadas, como será facilmente observado por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por

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55/164 exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com modificações analógicas, internucleotídicas (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metil\, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc., ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc., componentes pendentes: por exemplo, peptídeos, intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc., agentes quelantes, alquiladores e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo molécula de ácido nucleico também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, de filamento duplo, parcialmente dúplex, triplexada, na forma de grampo de cabelo, circular e com cadeado.

[0092] Como aqui utilizado em relação ao DNA, o termo polinucleotídeo de codificação, polinucleotídeo estrutural ou molécula de ácido nucleico estrutural refere-se a um polinucleotídeo que é finalmente transladado em um polipeptídeo, por meio da transcrição e mRNA, quando colocado sob o controle de elementos reguladores apropriados. Em relação ao RNA, o termo polinucleotídeo de codificação refere-se a um polinucleotídeo que é transladado em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de um polinucleotídeo de codificação são determinados por um códon de iniciação da translação no terminal 5' e um códon de parada da translação no terminal 3'. Os polinucleotídeos de codificação incluem, mas não são limitados a esxtes: gDNA; cDNA; EST; e polinucleotídeos recombinantes.

[0093] Como aqui utilizado, o polinucleotídeo não codificado transcrito refere-se a segmentos de moléculas de mRNA tais como segmentos de 5'UTR, 3'UTR e íntron que não são transladados em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Além disso, o polinucleotídeo de não codificação transcrito refere-se a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estrutuPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 66/420

56/164 rais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) como exemplificado pelo rRNA 5S, rRNA 5,8S, rRNA 16S, rRNA 18S, rRNA 23S e rRNA 28S, e outros mais); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5, U6 e seus semelhantes. Os polinucleotídeos de não codificação transcritos também incluem, por exemplo, e sem limitação, RNAs pequenos (sRNA), cujo termo é frequentemente utilizado para descrever RNAs de não codificação bacterianos pequenos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs (miRNA); RNA interferentes pequenos (siRNA); RNAs que interagem com Piwi (piRNA); e RNA de não codificação longos. Mais ainda, o polinucleotídeo de não codificação transcrito refere-se a um polinucleotídeo que pode existir nativamente como um espaçador intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito em uma molécula de RNA.

[0094] Interferência de RNA letal: Como aqui utilizado, o termo interferência de RNA letal refere-se à interferência de RNA que resulta na morte ou uma redução na viabilidade do paciente individual ao qual, por exemplo, um dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA, e/ou hpRNA é liberado.

[0095] Genoma: Como aqui utilizado, o termo genoma refere-se ao DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e refere-se também ao DNA da organela encontrado dentro dos componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal, de tal modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da célula vegetal. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser integrada no DNA nuclear da célula vegetal, ou integrada no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo genoma, quando se aplica às bactérias, refere-se tanto ao cromossomo quanto aos plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 67/420

57/164 ria de tal modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser integrada de modo cromossômico ou localizada como ou em um plasmídeo estável.

[0096] Identidade de sequência: O termo identidade de sequência ou identidade, como aqui utilizado no contexto de dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se aos resíduos nas sequências das duas moléculas que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[0097] Como aqui utilizado, o termo porcentagem de identidade de sequência pode referir-se ao valor determinado através da comparação de duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências polipeptídicas) de uma molécula sobre uma janela de comparação, em que a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou eliminações) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada mediante a determinação do número de posições em que nucleotídeo idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em cada posição em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência e vice-versa.

[0098] Os métodos para alinhar as sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo: Smith and Waterman (1981)

Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.

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48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[0099] A National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível em várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na internet na seção ajuda para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função Blast 2 sequências do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada utilizando a matriz BLOSUM62 padrão definida como parâmetros padrão. Os ácidos nucleicos com uma similaridade de sequência ainda maior com as sequências dos polinucleotídeos de referência irão mostrar a identidade percentual crescente quando avaliado por este método.

[00100] Especificamente hibridizáveis/especificamente complementares: Como aqui utilizado, os termos especificamente hibridizáveis e especificamente complementares são termos que indicam um grau de complementaridade suficiente de tal modo que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridação entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento anti-paralelo entre as nucleobases das duas moléculas de ácido nucleico. As duas molécuPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 69/420

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Ias são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes no filamento oposto para formar uma molécula dúplex que, se for suficientemente estável, é detectável utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Um polinucleotídeo não precisa ser 100% complementar ao seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementaridade que deve existir para que a hibridação seja específica é uma função das condições de hibridação utilizadas.

[00101] As condições de hibridação que resultam em graus particulares de rigidez variarão dependendo da natureza do método de hibridação de escolha e da composição e comprimento dos ácidos nucleicos de hibridação. Geralmente, a temperatura de hibridação e a força iónica (especialmente a concentração de Na⁺ e/ou Mg⁺⁺) do tampão de hibridação determinarão a rigidez da hibridação, embora os tempos de lavagem também influenciem a rigidez. Os cálculos relativos às condições de hibridação necessárias para atingir graus particulares de rigidez são conhecidos por aqueles de habilidade prática na técnica, e são argumentados, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloninq: A Laboratory Manual. 2^nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization. IRL Press, Oxford, 1985. Outras instruções detalhadas e orientação sobre a hibridação de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bioloqy- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Bioloqy. Chapter 2, Greene Publishing and WileyInterscience, NY, 1995.

[00102] Como aqui utilizado, condições rigorosas abrangem as

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60/164 condições sob as quais a hibridação só ocorrerá se houver menos do que 20% de incompatibilidade entre a sequência da molécula de hibridação e um polinucleotídeo homólogo dentro da molécula de ácido nucleico alvo. Condições rigorosas incluem outros níveis particulares de rigidez. Assim, como aqui utilizado, as condições de rigidez moderada são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 20% de incompatibilidade de sequência não se hibridam; as condições de rigidez elevada são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10% de incompatibilidade não irão hibridar; e as condições de rigidez muito alta são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 5% de incompatibilidade não irão hibridar.

[00103] O que se segue são as condições de hibridação representativas e não limitativas.

[00104] Condição de alta estringência (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridação em tampão SSC 5x a 65 “C durante 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x na temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65 “C d urante 20 minutos cada.

[00105] Condição de estringência moderada (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridação em tampão SSC 5x a 6x em 65 a 70 “C dura nte 16 a 20 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x na temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x em 55 a 70 “C durante 30 minutos cada.

[00106] Condição de controle não rigorosa (polinucleotídeos que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência irão hibridar): Hibridação em tampão SSC 6x na temperatura ambiente a 55 “C durante 16 a 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC

2x-3x na temperatura ambiente a 55 “C durante 20 a 30 minutos cada.

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61/164 [00107] Como aqui utilizado, o termo substancialmente homólogo, substancialmente idêntico ou homologia substancial, em relação a um ácido nucleico, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases contíguas que hibridam sob condições rigorosas com o ácido nucleico de referência. Por exemplo, os ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos a um ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12 são aqueles ácidos nucleicos que hibridam sob condições rigorosas (por exemplo, as condições de Rigidez Moderada apresentadas, supra) com o ácido nucleico de referência. Os polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, os polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como 79%, 80%, ao redor de 81%, ao redor de 82%, ao redor de 83%, ao redor de 84%, ao redor de

85%, ao redor de 86%, ao redor de 87%, ao redor de 88%, ao redor de

89%, ao redor de 90%, ao redor de 91%, ao redor de 92%, ao redor de

93%, ao redor de 94%, ao redor de 95%, ao redor de 96%, ao redor de

97%, ao redor de 98%, ao redor de 98,5%, ao redor de 99%, ao redor de 99,5%; e ao redor de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada à hibridação específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau de complementaridade suficiente para evitar a ligação não específica do ácido nucleico aos polinucleotídeos não alvo em condições onde a ligação específica é desejável, por exemplo, sob condições de hibridação rigorosas.

[00108] Como aqui utilizado, o termo ortóologo refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu a partir de um ácido nucleico ancestral comum e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00109] Como aqui utilizado, duas moléculas de ácido nucleico são

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62/164 ditas de apresentar complementaridade completa quando cada nucleotídeo de um polinucleotídeo lido na direção 5' a 3' é complementar a cada nucleotídeo do outro polinucleotídeo quando lido na direção 3' a 5'. Um polinucleotídeo que é complementar a um polinucleotídeo de referência irá apresentar uma sequência idêntica ao complemento reverso do polinucleotídeo de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles de habilidade prática na técnica.

[00110] Ligado de maneira operável: um primeiro polinucleotídeo está ligado maneira operável com um segundo polinucleotídeo quando o primeiro polinucleotídeo está em uma conexão funcional com o segundo polinucleotídeo. Quando produzidos de forma recombinante, os polinucleotídeos ligados de maneira operável são geralmente contíguos e, onde necessário, juntam duas regiões codificadoras de proteína, na mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF fundida de forma translacional). No entanto, os ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para serem ligados de maneira operável.

[00111] O termo ligado de maneira operável, quando utilizado em referência a um elemento genético regulador e um polinucleotídeo de codificação, significa que o elemento regulador afeta a expressão do polinucleotídeo de codificação ligado. Elementos regulatórios ou elementos de controle referem-se aos polinucleotídeos que influenciam o tempo e o nível/quantidade de transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou translação do polinucleotídeo de codificação associado. Os elementos regulatórios podem incluir promotores, líderes de translação, íntrons, intensificadores, estruturas de tronco-alça, polinucleotídeos de repressão, polinucleotídeos com uma sequência de terminação; polinucleotídeos com uma sequência de reconhecimento de poliadenilação; etc. Elementos reguladores particulares podem estar localizados a montante e/ou a jusante de um polinucleotídeo

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63/164 de codificação ligado de modo operável a ele. Também, elementos reguladores particulares ligados de maneira operável a um polinucleotídeo de codificação podem estar localizados no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo. [00112] Promotor: Como aqui utilizado, o termo promotor refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar ligado de modo operável a um polinucleotídeo de codificação para expressão em uma célula, ou um promotor pode estar ligado de modo operável a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal que pode estar ligado de modo operável a um polinucleotídeo de codificação para expressão em uma célula. Um promotor vegetal pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição nas células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam preferivelmente a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos de xilema, traqueídeos ou esclerenquimas. Tais promotores são referidos como preferidos de tecidos. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em determinados tecidos são referidos como específicos de tecido. Um promotor específico do tipo de célula conduz principal mente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ou folhas. Um promotor induzível pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem as condições anaeróbicas e a presença de luz. Os promotores específicos do tecido, preferidos do tecido, específicos do tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que pode ser ativo na maioria das condições ambientais ou na maioria

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64/164 dos tipos de tecido ou célula.

[00113] Qualquer promotor induzível pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Ver Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não são limitados a estes: Promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 proveniente de milho que responde a protetores de herbicidas de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteróide, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glucocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:0421).

[00114] Os promotores constitutivos exemplares incluem, mas não são limitados a estes: Promotores de vírus da planta, tais como o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV); promotores de genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histonas de milho H3; e o promotor ALS, fragmento Xba1/Ncol 5' para o gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou um polinucleotídeo semelhante ao dito fragmento Xba1/Ncol) (Publicação PCT Internacional No. W096/30530).

[00115] Adicionalmente, qualquer promotor específico do tecido ou preferido do tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo de codificação ligado de modo operável a um promotor específico do tecido podem produzir o produto do polinucleotídeo de codificação exclusivamente, ou de preferência, em um tecido específico. Os promotores específicos do tecido ou preferidos do tecido exemplares incluem, mas não são limitados a estes: Um promotor preferido da semente, tal como aquele do gene de faseolina; um promotor específico da folha e induzido pela luz tal como

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65/164 aquele de cab ou rubisco; um promotor específico da antera tal como o da LAT52; um promotor específico de pólen tal como aquele de Zm13; e um promotor preferido da microspora tal como aquele de apg.

[00116] Transformação: Como aqui utilizado, o termo transformação ou transdução refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico para dentro de uma célula. Uma célula é transformada por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, através da incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou através da replicação epissomal. Como aqui utilizado, o termo transformação abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma tal célula. Os exemplos incluem, mas não são limitados a estes: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmídicos; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7); absorção direta de DNA; e bombardeio de microprojéteis (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00117] Transgene: Um ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um DNA que codifica um ou ambos filamentos de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que compreende um polirribonucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga de coleópteros. Em outros exemplos, um transgene pode ser um gene (por exemplo, um gene de tolerância a herbicida, um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um traço agrícola desejável). Nestes e outros exemplos, um transgene pode conter elementos reguladores ligados de maneira operável a um poliPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 76/420

66/164 nucleotídeo de codificação do transgene (por exemplo, um promotor). [00118] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico como introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir elementos genéticos que o permitem replicar na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a estes: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta DNA exógeno para dentro de uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, incluindo aqueles que produzem moléculas antisentido, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou as proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína, etc.).

[00119] Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou maior em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Nas modalidades particulares, rendimento melhorado ou melhora do rendimento significa uma cultivar tendo um rendimento estabilizado de 105% ou mais em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento que contém densidades significativas das pragas de coleópteros que são prejudiciais a essa cultura que cresce ao mesmo tempo e sob as mesmas condições, que são direcionadas pelas composições e métodos aqui contidos.

[00120] A menos que especificamente indicado ou implícito, os termos um, uma, o e a significam pelo menos um, como aqui utilizado.

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67/164 [00121] A não ser que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que comumente compreendido por aqueles de habilidade prática na técnica a qual essa divulgação pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encvclopedia of Molecular Bioloqy, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 156081-569-8). Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções da mistura de solventes são em volume, salvo indicação em contrário. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.

IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Sequência de Pragas de Inseto

A. Visão geral [00122] Descrevem-se aqui moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de inseto. Em alguns exemplos, a praga de inseto é uma praga de insetos coleópteros. As moléculas de ácido nucleico descritas incluem polinucleotídeos alvo (por exemplo, genes nativos e polinucleotídeos de não codificação), dsRNAs, siRNAs, shRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, as moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a todo ou parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de coleópteros. Nestas e outras modalidades, os ácidos nucleicos nativos podem ser um ou mais genes-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento de larvas. As moléculas de ácido nucleico aqui descritas, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos

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68/164 um ácido nucleico nativo em que as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar o RNAi na célula e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão do ácido nucleico nativo. Em alguns exemplos, a redução ou eliminação da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico especificamente complementar pode resultar na redução ou cessação do crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação na praga de coleópteros.

[00123] Em algumas modalidades, pelo menos um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser selecionado, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo de prp8 de coleópteros. Nos exemplos particulares, um gene-alvo que compreende um polinucleotídeo de prp8 de coleópteros é selecionado, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo de Diabrotica selecionado entre as SEQ ID NOs: 1, 3 e 7 a 11. Em exemplos particulares, um gene-alvo que compreende um polinucleotídeo de prp8 de coleópteros é selecionado, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo de Meligethes selecionado entre as SEQ ID NOs: 5 e 12.

[00124] Em algumas modalidades, um gene-alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser transladado reverso in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos ao redor de 85% idêntica (por exemplo, pelo menos, 84%, 85%, ao redor de 90%, ao redor de 95%, ao redor de 96%, ao redor de 97%, ao redor de 98%, ao redor de 99%, ao redor de 100% ou 100% idêntica) à sequência de aminoácido de um produto de proteína de um polinucleotídeo de prp8. Um gene-alvo pode ser qualquer polinucleotídeo de prp8 em uma praga de inseto, cuja inibição pós-transcricional possui um efeito deletério sobre o crescimento e/ou a sobrevivência da praga, por exemplo, para fornecer um benefício protetor contra a praga a uma planta. Nos exemplos particulares, um gene-alvo é uma molécula de ácido nucleiPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 79/420

69/164 co compreendendo um polinucleotídeo que pode ser transladado reverso in silico para um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos cerca de 85% idêntica, ao redor de 90% idêntica, ao redor de 95% idêntica, ao redor de 96% idêntica, ao redor de 97% idêntica, ao redor de 98% idêntica, ao redor de 99% idêntica, ao redor de 100% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 2, 4 e 6.

[00125] Fornecidos de acordo com a invenção são os DNAs, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por um polinucleotídeo de codificação em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero). Em algumas modalidades, após a ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de inseto, pode-se obter uma infrarregulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga. Em modalidades particulares, a infrarregulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga de insetos resulta em um efeito deletério sobre o crescimento e/ou o desenvolvimento da praga.

[00126] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos alvo incluem RNAs de não codificação transcritos, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; líderes combinados; íntrons; outrons (por exemplo, RNA 5'UTR subsequentemente modificado em combinação trans); donatrons (por exemplo, RNA de não codificação requerido para fornecer sequências doadores para a combinação trans); e outros RNAs transcritos de não codificação de genes-alvo de pragas de inseto. Tais polinucleotídeos podem ser derivados de genes mono-cistrônicos e poli-cistrônicos.

[00127] Assim, também aqui descrito em conexão com algumas modalidades são as moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um

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70/164 polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros). Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA pode compreender polinucleotídeos que são complementares a toda ou parte de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ácidos nucleicos alvo. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Também são divulgados cDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsrNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto. São descritas ainda as construções de DNA recombinantes para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Alvos de hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsrNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA a partir das construções de DNA recombinantes. Portanto, também é descrito um vetor de transformação de plantas que compreende pelo menos um polinucleotídeo ligado de modo operável a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão dos polinucleotídeos resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma filamento de nucleobases contíguas que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto.

[00128] Nos exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros) podem incluir: todo ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de

Diabrotica compreendendo um polinucleotídeo de prp8 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3e7a11); DNAs que quando expressos resultam em uma molécula de RNA compreendendo um poliPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 81/420

71/164 nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por Diabrotica prp8; moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de Diabrotica prp8; cDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsrNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de Diabrotica prp8; todo ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de Meligethes compreendendo um polinucleotídeo de prp8 (por exemplo, SEQ ID NOs: 5 e 12); DNAs que quando expressos resultam em uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por Meligethes prp8; moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de Meligethes prp8; cDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsrNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de Meligethes prp8; e construções de DNA recombinantes para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico anteriores.

B. Moléculas de Ácido Nucleico [00129] A presente invenção fornece, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que inibem a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros); e moléculas de DNA capazes de serem expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou miPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 82/420

72/164 croorganismo para inibir a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto.

[00130] Algumas modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; o complemento de qualquer das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 12); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo a SEQ ID NO: 12; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12.

[00131] Nas modalidades particulares, o contato ou a absorção por

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73/164 um inseto (por exemplo, coleópteros) de um iRNA transcrito do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, o desenvolvimento e/ou a alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato ou a absorção pelo inseto ocorre através da alimentação de matéria vegetal compreendendo o iRNA. Em algumas modalidades, o contato ou a absorção pelo inseto ocorre por meio da pulverização de uma planta que compreende o inseto com uma composição compreendendo o iRNA. [00132] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 84; o complemento da SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 85; o complemento da SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; o complemento da SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; o complemento da SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; o complemento da SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; o complemento da SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; o complemento da SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; o complemento da SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; o complemento da SEQ ID NO: 92; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 84, 85 e 91; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 84, 85 e 91; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 86 a 90; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 86 a 90; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 86 a 90; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 86 a 90;

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74/164 um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 92; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 92; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 92; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 92.

[00133] Nas modalidades particulares, o contato ou a absorção por uma praga de coleóptero do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, o desenvolvimento e/ou a alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato ou a absorção pelo inseto ocorre através da alimentação de matéria vegetal ou isca que compreende o iRNA. Em algumas modalidades, o contato ou a absorção pela praga de coleóptero ocorre mediante a pulverização de uma planta que compreende o inseto com uma composição compreendendo o iRNA.

[00134] Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA fornecidas pela invenção compreendem polinucleotídeos complementares a um transcrito a partir de um gene-alvo compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3, 5e7a12, e seus fragmentos, a inibição do genealvo em uma praga de insetos resulta na redução ou remoção de um polipeptídeo ou agente polinucleotídico que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga. Um polinucleotídeo selecionado pode apresentar de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; um fragmento contíguo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; e o complemento de qualquer um dos anteriores. Por exemplo, um polinucleotídeo selecionado pode apresentar 79%; 80%; ao redor de 81%; ao redor de 82%; ao redor de

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83%; ao redor de 84%; ao redor de 85%; ao redor de 86%; ao redor de 87%; ao redor de 88%; ao redor de 89%; ao redor de 90%; ao redor de 91%; ao redor de 92%; ao redor de 93%; ao redor de 94% cerca de 95%; ao redor de 96%; ao redor de 97%; ao redor de 98%; ao redor de 98,5%; ao redor de 99%; ao redor de 99,5%; ou ao redor de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; um fragmento contíguo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5e7a 12; eo complemento de qualquer um dos anteriores. Em alguns exemplos, uma molécula de dsRNA é transcrita a partir de um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos sentido que é substancialmente idêntica ou idêntica a um fragmento contíguo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12; uma sequência de nucleotídeos antissenso que é pelo menos substancialmente o complemento reverso da sequência de nucleotídeo sentido; e uma sequência de nucleotídeos interveniente posicionada entre o senso e as sequências antisentido, de tal modo que os polirribonucleotídeos senso e antissenso transcritos a partir das respectivas sequências de nucleotídeo se hibridam para formar uma estrutura de tronco no dsRNA, e o polirribonucleotídeo transcrito a partir da sequência interveniente forma um ciclo. Uma tal molécula de dsRNA pode ser referida como uma molécula de RNA na forma de grampo de cabelo (hpRNA).

[00135] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene-alvo pode compreender um polinucleotídeo isolado que é especificamente complementar a todo ou parte de um polinucleotídeo nativo encontrado em uma ou mais espécies de pragas de inseto alvo (por exemplo, uma espécie de praga de coleópteros), ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade desses polinucleotídeos especificamente complementares.

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76/164 [00136] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um primeiro e um segundo polinucleotídeos separados por um espaçador. Um espaçador pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação de estrutura secundária entre o primeiro e o segundo polinucleotídeos, onde isso for desejado. Em uma modalidade, o espaçador é parte de um polinucleotídeo de codificação sentido ou antissenso para mRNA. O espaçador pode alternativamente compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de ser ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico. Em alguns exemplos, o espaçador pode ser um íntron (por exemplo, como íntron ST-LS1 ou um íntron RTM1).

[00137] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender um polinucleotídeo que codifica uma ou mais moléculas de iRNA diferentes, em que cada uma das diferentes moléculas de iRNA compreende um primeiro polirribonucleotídeo e um segundo polirribonucleotídeo, em que o primeiro e o segundo polirribonucleotídeos são complementares entre si. O primeiro e o segundo polirribonucleotídeos podem ser conectados dentro de uma molécula de RNA por um espaçador. O espaçador pode constituir parte do primeiro polirribonucleotídeo ou do segundo polirribonucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA que compreende o primeiro e o segundo polirribonucleotídeos pode levar à formação de uma molécula de dsRNA através do emparelhamento de base intramolecular específica do primeiro e segundo polirribonucleotídeos. O primeiro polirribonucleotídeo ou o segundo polirribonucleotídeo pode ser substancialmente idêntico a um polirribonucleotídeo (por exemplo, uma transcrição de um gene-alvo ou polinucleotídeo de não codificação transcrito) nativo de uma praga de inseto, um derivado deste ou um polinucleotídeo complementar.

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77/164 [00138] As moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem filamentos duplos de ribonucleotídeos polimerizados, e podem incluir modificações na cadeia principal de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. As modificações na estrutura de RNA podem ser adaptadas para permitir a inibição específica. Em uma modalidade, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo de modo que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNase III, tal como DICER em eucariotas, in vitro ou in vivo. Ver Elbashir et al. (2001) Natureza 411:494-8; e Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-

2. DICER ou enzimas RNase III funcionalmente equivalentes clivam os maiores filamentos de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais está ao redor de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas possuem de 2 a 3 projeções de nucleotídeo 3', e terminais 5' de fosfato e 3' de hidroxila. As moléculas de siRNA geradas pelas enzimas RNase III são desenroladas e separadas em RNA de filamento único na célula. As moléculas de siRNA depois se hibridam especificamente com RNAs transcritos a partir de um gene-alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo inerente de degradação de RNA celular. Este processo pode resultar na degradação ou remoção efetiva do RNA codificado pelo gene-alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento pós-transcricional do gene-alvo. Em algumas modalidades, as moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNase III endógenas a partir de moléculas de ácido nucleico heterólogas podem mediar eficientemente a infrarregulação de genes-alvo em pragas de inseto.

[00139] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode incluir pelo menos um polinucleotídeo de ocorrência não natural

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78/164 que pode ser transcrito em uma molécula de RNA de filamento único capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através da hibridação intermolecular. Tais dsRNAs tipicamente se auto-montam, e podem ser fornecidos na fonte de nutrição de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros) para atingir a inibição pós-transcricional de um genealvo. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender dois polinucleotídeos diferentes de ocorrência não natural, cada um dos quais é especificamente complementar a um gene-alvo diferente em uma praga de inseto. Quando uma tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA, por exemplo, uma praga de coleópteros, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes-alvo diferentes na praga.

C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico [00140] Uma variedade de polinucleotídeos em pragas de inseto (por exemplo, coleópteros) pode ser utilizada como alvo para o desenho de moléculas de ácido nucleico, tais como iRNAs e moléculas de DNA que codificam iRNAs. A seleção de polinucleotídeos nativos não é, no entanto, um processo direto. Por exemplo, apenas um pequeno número de polinucleotídeos nativos em uma praga de coleópteros serão alvos efetivos. Não se pode prever com certeza se um polinucleotídeo nativo particular pode ser infrarregulado de forma eficaz por moléculas de ácido nucleico da invenção, ou se a infrarregulação de um polinucleotídeo nativo particular terá um efeito prejudicial no crescimento, viabilidade, alimentação e/ou sobrevivência de uma praga de inseto. A grande maioria dos polinucleotídeos de pragas de coleópteros nativos, tais como ESTs isolados a partir destes (por exemplo, os polinucleotídeos de pagas de coleópteros listados na Patente U.S. 7.612.194), não possui um efeito prejudicial sobre o crescimento e/ou a viabilidade da praga. Nem é previsível qual dos polinucleotídeos nativos que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga de insetos

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79/164 são capazes de serem utilizados em técnicas recombinantes para expressar as moléculas de ácido nucleico complementares a tais polinucleotídeos nativos em uma planta hospedeira e que fornece o efeito prejudicial sobre a praga após a alimentação sem prejudicar a planta hospedeira.

[00141] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira de uma praga de inseto) direcionam os cDNAs alvo que codificam as proteínas ou partes de proteínas essenciais para o desenvolvimento e/ou sobrevivência de pragas, tais como polipeptídeos envolvidos em vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, metabolismo energético, digestão, reconhecimento de plantas hospedeiras e seus semelhantes. Como aqui descrito, a ingestão de composições por um organismo de praga alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento do qual é especificamente complementar ao pelo menos um segmento de RNA substancialmente idêntico produzido nas células do organismo da praga alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Um polinucleotídeo, DNA ou RNA, derivado de uma praga de inseto pode ser utilizado para construir células vegetais protegidas contra infestação pelas pragas. A planta hospedeira da praga de coleópteros (por exemplo, Z. mays ou Brassica sp.), por exemplo, pode ser transformada para conter um ou mais polinucleotídeos derivados da praga de coleópteros como aqui fornecido. O polinucleotídeo transformado no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se formam em uma estrutura de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando assim o dsRNA disponível se/quando a praga forma uma conexão nutricional com o hospedeiro transgênico. Isso pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga e, finalmente, morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

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80/164 [00142] Nas modalidades particulares, um gene é direcionado que está essencialmente envolvido no crescimento e desenvolvimento de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros). Outros genes-alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes na viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, possibilidade de infecção e estabelecimento de locais de alimentação da praga. Um gene-alvo pode, portanto, ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Adicionalmente, um polinucleotídeo de praga de inseto nativo para uso na presente invenção também pode ser derivado de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de um gene vegetal, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é conhecida daqueles de habilidade na técnica, e o polinucleotídeo é especificamente hibridável com um gene-alvo no genoma da praga alvo. Os métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeos conhecida por hibridação são conhecidos daqueles de habilidade na técnica.

[00143] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA). Uma dessas modalidades compreende: (a) analisar um ou mais genes-alvo para a sua expressão, função e fenótipo após a supressão de genes mediada por dsRNA em uma inseto (por exemplo, coleópteros); (b) sondar uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo a totalidade ou uma parte de um polinucleotídeo ou um seu homólogo a partir de uma praga alvo que apresenta um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que se hibrida especificamente com a sonda; (d) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciar o fragmento de cDNA ou gDNA que

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81/164 compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende toda ou uma parte substancial do RNA ou seu homólogo; e (f) sintetizar quimicamente toda ou uma parte substancial de um gene, ou um siRNA, miRNA, shRNA, shRNA, shRNA ou dsRNA.

[00144] Em outras modalidades, um método para obter um fragmento de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma parte substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) inclui: (a) sintetizar o primeiro e o segundo iniciadores oligonucleotídicos especificamente complementares a uma parte de um polinucleotídeo nativo de uma praga de inseto marcada (por exemplo, coleópteros); e (b) amplificar uma inserção de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem utilizando os primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma parte substancial de uma molécula de siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA ou dsRNA.

[00145] Os ácidos nucleicos podem ser isolados, amplificados ou produzidos por várias abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser obtida através da amplificação por PCR de um polinucleotídeo alvo (por exemplo, um gene-alvo ou um polinucleotídeo de não codificação transcrito alvo) derivado de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou suas partes. O DNA ou o RNA podem ser extraídos de um organismo alvo e as bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir destes, utilizando métodos conhecidos daqueles versados na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo alvo podem ser utilizadas para amplificação por PCR e sequenciamento de genes-alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser utilizado como um modelo para a transcrição in vitro para gerar RNA sensitivo e anPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 92/420

82/164 tissenso com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer uma das várias técnicas (ver, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de sintetizador de DNA automático (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) model 392 or 394 DNA/RNA Synthesizer), utilizando químicas padrão, tais como a química de fosforamidita. Ver, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S. 4.980.460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Químicas alternativas que resultam em grupos de cadeia principal não naturais, tais como fosforotioato, fosforamidato, e outros mais.

[00146] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida química ou enzimaticamente por uma pessoa versada na técnica através de reações manuais ou automáticas, ou in vivo em uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica a molécula de RNA, dsrNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA. O RNA também pode ser produzido pela síntese orgânica parcial ou total e qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido através da síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase bacteriófaga (por exemplo, RNA polimerase T3, RNA polimerase T7 e RNA polimerase SP6). As construções de expressão úteis para a clonagem e a expressão de polinucleotídeos são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Publicação PCT Internacional No. WO 97/32016; e as Patentes U.S. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.899.214 e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de

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RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação destes. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser utilizadas sem ou com um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar perdas devido ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secadas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o recozimento, e/ou a estabilização dos filamentos dúplex da molécula dsrNA.

[00147] Nas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por um único filamento de RNA auto-complementar ou a partir de dois filamentos de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição de um ou dois filamentos de RNA in vivo, ou a RNA polimerase clonada pode ser utilizada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser direcionado ao hospedeiro através da transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo celular do hospedeiro (por exemplo, mediante o uso de um promotor específico do tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, através do uso de um promotor induzível que é responsivo à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou planejamento da transcrição em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, mediante o uso de um promotor específico do estágio de desenvolvimento). Os filamentos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, transcritos in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadenilados e podem ou não ser capazes de serem transladados em um polipeptídeo através do mecanismo de translação da célula.

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D. Vetores Recombinantes e Transformação de Células Hospedeiras [00148] Em algumas modalidades, a invenção também fornece uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende um polinucleotídeo que, após a expressão ao RNA e a ingestão por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros), consegue a supressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga. Assim, algumas modalidades fornecem uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) em uma célula vegetal para inibir a expressão do gene-alvo em uma praga de inseto. A fim de iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender um ou mais elementos reguladores, cujos elementos reguladores podem ser ligados de modo operável ao polinucleotídeo capaz de ser expresso como um iRNA. Métodos para expressar uma molécula de supressão de genes em plantas são conhecidos, e podem ser utilizados para expressar um polinucleotídeo da presente invenção. Ver, por exemplo, a Publicação Internacional PCT No. WO 06/073727; e a Publicação de Patente U.S. No. 2006/0200878 A1).

[00149] Nas modalidades específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender um polinucleotídeo que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinante podem codificar os RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de um gene-alvo endógeno em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleópteros) após a ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura de grampo

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85/164 de cabelo e tronco e alça.

[00150] Em algumas modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; os complementos das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7 a 12); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 11; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo a SEQ ID NO: 12; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12.

[00151] Em algumas modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição de um polinucleoPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 96/420

86/164 tídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 7 a 12; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 12; fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 12; e os complementos de fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 12.

[00152] Nas modalidades particulares, uma molécula de DNA recombinante que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA pode compreender uma região de codificação em que pelo menos dois polinucleotídeos estão dispostos de tal modo que um polinucleotídeo está em uma orientação de sentido, e o outro polinucleotídeo está em uma orientação antissenso, em relação a pelo menos um promotor, em que o polinucleotídeo sensitivo e o polinucleotídeo antissenso estão ligados ou conectados por um espaçador, por exemplo, de cerca de cinco (~ 5) a cerca de mil (~ 1000) nucleotídeos. O espaçador pode formar uma alça entre os polinucleotídeos senso e antissenso. O polinucleotídeo sentido ou o polinucleotídeo antissenso pode ser substancialmente homólogo a um gene-alvo (por exemplo, um gene prp8 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12) ou seu fragmento. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA sem um espaçador. Nas modalidades, um polinucleotídeo de codificação senso e um polinucleotídeo de codificação antissenso podem ser de comprimentos diferentes.

[00153] Os polinucleotídeos identificados como tendo um efeito deletério sobre uma praga de inseto ou um efeito protetor da planta em relação à praga podem ser facilmente incorporados em moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais polinucleotídeos podem ser expressos como

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87/164 um forma de grampo de cabelo com estrutura de tronco e alça, tomando um primeiro segmento que corresponde a um polinucleotídeo de gene-alvo (por exemplo, um gene prp8 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3, 5e7a12, e fragmentos de qualquer um dos anteriores); ligando este polinucleotídeo a uma segunda região espaçadora de segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando isso a um terceiro segmento, em que pelo menos uma parte do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. A transcrição de uma tal construção forma uma estrutura de tronco e alça mediante o emparelhamento de base intramolecular do polirribonucleotídeo codificado pelo primeiro segmento com o polirribonucleotídeo codificado pelo terceiro segmento, em que as formas de estrutura de alça compreendem o polirribonucleotídeo codificado pelo segundo segmento. Ver, por exemplo, as Publicações de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e Publicações PCT internacionais WO 94/01550 e WO 98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo, tal como uma estrutura de tronco-alça (por exemplo, na forma de grampo de cabelo), por meio da qual a produção de siRNA direcionado para um polinucleotídeo de praga de inseto nativo (por exemplo, coleóptero) é melhorada através da co-expressão de um fragmento do gene direcionado, por exemplo, em um cassete expresso de plantas adicional, que leva à produção de siRNA melhorada, ou reduz a metilação para evitar o silenciamento de genes transcricionais do promotor na forma de grampo de cabelo de dsRNA.

[00154] Determinadas modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para alcançar níveis inibitórios de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros) de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode,

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88/164 por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetor ou plasmídeo único, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. Os polinucleotídeos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para conduzir a expressão de um polinucleotídeo de codificação ligado ou de outro elemento de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e a seleção do vetor apropriado dependerá principal mente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira particular com a qual é compatível.

[00155] Para transmitir proteção de uma praga de inseto de coleópteros a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender um polirribonucleotídeo que é substancialmente homólogo e especificamente hibridizável com um polibonucleotídeo transcrito correspondente dentro de uma praga de inseto que pode provocar danos às espécies de plantas hospedeiras. A praga pode entrar em contato com a molécula de iRNA que é transcrita nas células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, através da ingestão de células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Assim, em exemplos particulares, a expressão de um gene-alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de pragas de inseto que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas moPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 99/420

89/164 dalidades, a supressão da expressão do gene-alvo em uma praga de coleópteros-alvo pode resultar na planta sendo protegida contra o ataque pela praga.

[00156] De modo a permitir a liberação de moléculas de iRNA a uma praga de inseto em uma conexão nutricional com uma célula vegetal que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, a expressão (isto é, a transcrição) de moléculas de iRNA na célula vegetal é necessária. Assim, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender um polinucleotídeo da invenção ligado de modo operável a um ou mais elementos reguladores, tais como um elemento promotor heterólogo que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.

[00157] Os promotores adequados para uso nas moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos que descrevem tais promotores incluem as Patentes U.S. 6.437.217 (promotor RS81 de milho); 5.641.876 (promotor de actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 de milho); 6.429.362 (promotor PR-1 de milho); 6.232.526 (promotor A3 de milho); 6.177.611 (promotores constitutivos de milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor CaMV 35S); 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de milho); 6.429.357 (promotor de actina 2 de arroz e íntron de atina 2 de arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz); 6.140.078 (promotores induzíveis em sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Publicação da Patente U.S. No. 2009/757.089 (promotor de aldolase de cloroplasto de milho). Os

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90/164 promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(16):5745-9) e os promotores da octopina sintase (OCS) (que são carregados sobre os plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tumefaciens)·, os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:8102, o promotor 35S do vírus do mosaico de escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19):6624- 8), o promotor da sacarose sintase (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83 ), o promotor do gene da proteína de ligação da clorofila a/b, CaMV 35S (Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196), FMV 35S (Patentes U.S. 6.051.753 e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente U.S. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. 6.677.503) e promotores de AGRtu.nos (GenBank™ Accession No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00158] Nas modalidades particulares, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem um promotor específico do tecido, tal como um promotor específico da raiz. Os promotores específicos da raiz conduzem a expressão de polinucleotídeos de codificação ligados de maneira operável exclusiva ou preferencialmente no tecido radicular. Exemplos de promotores específicos da raiz são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo ou fragmento para controle de pragas de coleópteros de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos da raiz orientados em direções transcricionais opostas em relaPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 101/420

91/164 ção ao polinucleotídeo ou fragmento e que são operáveis em uma célula vegetal transgênica e nela expressa para produzir moléculas de RNA na célula vegetal transgênica que subsequentemente podem formar moléculas de dsRNA, conforme descrito, supra. As moléculas de iRNA expressas em tecidos vegetais podem ser ingeridas por uma praga de insetos, de modo que a supressão da expressão do genealvo seja alcançada.

[00159] Elementos reguladores adicionais que podem ser opcionalmente ligados de modo operável a um ácido nucleico incluem 5'UTRs localizados entre um elemento promotor e um polinucleotídeo de codificação que funciona como um elemento líder de translação. O elemento líder de translação está presente no mRNA totalmente processado e pode afetar o processamento da transcrição primária e/ou da estabilidade do RNA. Exemplos de elementos líderes de translação incluem líderes de proteína de choque térmico de milho e petúnia (Patente U.S. 5.362.865), líderes de proteína de revestimento de vírus de plantas, líderes de rubisco de plantas e outros. Ver, por exemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitativos de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank™ Accession No. V00087, e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00160] Elementos reguladores adicionais que podem opcionalmente ser ligados de maneira operável a um ácido nucleico também incluem elementos não transladados 3', regiões de terminação da transcrição 3' ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de um polinucleotídeo, e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação e/ou outros sinais regulatórios capazes de afetar transcrição ou processamento de mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para motivar a adição de

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92/164 nucleotídeos de poliadenilato à extremidade 3' do precursor de mRNA. O elemento de poliadenilação pode ser derivado de uma variedade de genes vegetais, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitativo de uma região de terminação da transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de diferentes regiões 3' não transladada é fornecido em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank™ Accession No. E01312). [00161] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos um dos elementos reguladores acima descritos ligados de maneira operável a um ou mais polinucleotídeos da presente invenção. Quando expressos, um ou mais polinucleotídeos resultam em uma ou mais moléculas de iRNA que compreendem um polirribonucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativo em uma praga de inseto. Assim, os polinucleotídeos podem compreender um segmento que codifica a totalidade ou parte de um polirribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA alvo na praga de insetos e pode compreender repetições invertidas de toda ou parte de uma transcrição de pragas direcionada. Um vetor de transformação de planta pode conter polinucleotídeos especificamente complementares em mais do que um polinucleotídeo alvo, permitindo assim a produção de mais do que um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes nas células de uma ou mais populações ou espécies de pragas de insetos alvo. Segmentos de polinucleotídeos especificamente complementares aos polinucleotídeos presentes em diferentes genes podem ser combinados em uma única molécula de ácido nucleico compósito para expressão

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93/164 em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por um espaçador.

[00162] Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção que já contém pelo menos um polinucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de polinucleotídeos adicionais no mesmo plasmídeo, em que os polinucleotídeos adicionais estão ligados de maneira operável aos mesmos elementos reguladores como o original pelo menos um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser concebida para a inibição de múltiplos genes-alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos a partir das mesmas espécies de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros), que podem aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas de inseto, o que pode ampliar a faixa de pragas contra as quais os agentes são eficazes. Quando múltiplos genes são direcionados para a supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser planejado.

[00163] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis também podem ser utilizados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.) ou tolerância a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a estes: um gene neo que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica

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94/164 a resistência ao bialafos; um gene mutante da EPSP sintase que codifica a tolerância ao glifosato; um gene nitrilase que confere resistência a bromoxinila; um gene mutante da acetolactato sintase (ALS) que confere resistência a imidazolinona ou sulfoniluréia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato. Múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis que conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e outras mais. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas, por exemplo, Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.181.047.

[00164] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção também pode incluir um marcador de triagem. Os marcadores de triagem podem ser utilizados para monitorar a expressão. Os marcadores de triagem exemplares incluem um gene de βglucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene R-lócus, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. ln 18^th Stadler Genetics Svmposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol-dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tirosinase

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95/164 que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que, por sua vez, condensa a melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol 129:2703-14); e uma a-galactosidase.

[00165] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes, como descrito, supra, podem ser utilizadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que apresentam susceptibilidade reduzida a pragas de inseto (por exemplo, coleópteros). Os vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, através da inserção de moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de iRNA em vetores de transformação de planta e as introduzem nas plantas.

[00166] Os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como pela transformação de protoplastos (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.508.184), através da absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Ver, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), através da eletroporação (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.384.253), através da agitação com fibras de carboneto de silício (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765 ), através da transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840 e 6.384.301) e pela aceleração de partículas revestidas com DNA (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 e 6.403.865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para a transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616; e Publicação Internacional PCT WO 95/06722. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de praticamente quaisquer espécies podem ser transformadas de forma estáPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 106/420

96/164 vel. Em algumas modalidades, o DNA transformante é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser utilizada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00167] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas de plantas que transformam geneticamente as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indutor de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de TDNA é limitada por repetições de terminal. Em vetores binários modificados, os genes que induzem tumores foram eliminados e as funções da região Vir são utilizadas para transferir DNA estrangeiro limitado pelos elementos de borda T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente de células e plantas transgênicas e um sítio de múltiplas clonagens para inserir polinucleotídeos para transferência tais como um ácido nucleico que codifica o dsRNA.

[00168] Nas modalidades particulares, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e

5.501.967, e Patente Européia No. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Os vetores de transformação de planta adicionais

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97/164 incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por HerreraEstrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos anteriores. Outras bactérias como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de genes para várias plantas diversas. Estas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser compostas para a transferência de genes mediante a aquisição tanto de um plasmídeo de Ti abrandado quanto de um vetor binário adequado.

[00169] Após fornecer DNA exógeno às células receptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para outro cultivo e regeneração de plantas. A fim de melhorar a capacidade de identificar as células transformadas, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou de triagem, como anteriormente apresentado, com o vetor de transformação utilizado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é utilizado, as células transformadas são identificadas dentro da população celular potencial mente transformada, através da exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador de triagem é utilizado, as células podem ser submetidas a triagem para o traço genético do marcador desejado.

[00170] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou as células que foram marcadas positivamente em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meio MS e N6) pode ser modificado incluindo outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 108/420

98/164 ciar os esforços de regeneração da planta, ou após rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), depois transferido para o meio conducente para a formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que haja formação de brotos suficiente. Assim que os brotos são formados, eles são transferidos para o meio conducente para a formação de raiz. Assim que raízes suficientes se formam, as plantas podem ser transferidas para o solo para um crescimento e maturação adicionais.

[00171] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, um DNA que codifica uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão do gene-alvo em uma praga de coleópteros) nas plantas em regeneração, uma variedade de ensaios pode ser executada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou através da função enzimática; ensaios de partes de planta, tais como ensaios de folhas ou raízes; e análise do fenótipo de toda a planta regenerada.

[00172] Os eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, através da amplificação por PCR utilizando, por exemplo, iniciadores oligonucleotídicos específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem por PCR é entendida de incluir, mas não se limita a estas, amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) de gDNA derivado do tecido de calo da planta do hospedeiro isolado, previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida de clonagem e análise de sequência padrão de produtos de amplificação por PCR. Os métodos de genotipagem da PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G.

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99/164 et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao gDNA derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays, algodão, soja e B. napus) ou tipo de tecido, incluindo culturas de células.

[00173] Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium contém tipicamente um único DNA recombinante inserido em um cromossoma. O polinucleotídeo do DNA recombinante único é referido como um evento transgênico ou evento de integração. Tais plantas transgênicas são heterozigotas para o polinucleotídeo exógeno inserido. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota em relação a um transgene pode ser obtida por acoplamento sexual (autônomo) de uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene exógeno para si próprio, por exemplo, uma planta T_o, para produzir semente T-|. Um quarto da semente Ti produzida será homozigoto em relação ao transgene. A germinação da semente Ti resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que leva em conta a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigozidade).

[00174] Nas modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula vegetal que possui um efeito inibidor de praga de inseto (por exemplo, coleóptero). As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de múltiplos ácidos nucleicos introduzidos em diferentes eventos de transformação, ou a partir de um único ácido nucleico introduzido em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressas sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressas sob o controle de múltiplos promotores. As moléculas de iRNA isolaPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 110/420

100/164 das podem ser expressas que compreendem múltiplos polinucleotídeos que são cada um homólogo em diferentes locais dentro de uma ou mais pragas de inseto (por exemplo, os locais definidos pelas SEQ ID NOs: 1, 3 e 5), tanto em diferentes populações da mesma espécie de pragas de insetos ou em diferentes espécies de pragas de inseto. [00175] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas através do cruzamento de uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta que carece de tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem vegetal que é passível de transformação para produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem vegetal para a introgressão do polinucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem vegetal.

[00176] Em alguns aspectos, as sementes e os produtos de consumo produzidos por plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas são incluídas, em que as sementes ou produtos de consumo compreendem uma quantidade detectável de um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos de consumo podem ser produzidos, por exemplo, obtendo plantas transgênicas e preparando alimentos ou alimento a partir delas. Os produtos de consumo compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: farinhas, óleos, grãos ou sementes trituradas ou integrais de uma planta, e qualquer produto alimentar que inclua qualquer farinha, óleo ou grão triturado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante compreendendo uma ou mais das moléculas de ácido nucleico da invenção. Em exemplos particulares, um produto de consumo é uma composição ou formulação

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101/164 de isca compreendendo uma ou mais das moléculas de ácido nucleico da invenção. A detecção de um ou mais dos polinucleotídeos da invenção em uma ou mais mercadorias ou produtos de consumo é evidência de facto de que a mercadoria ou produto de consumo é produzido a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controle de parasitas de insetos.

[00177] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico em seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico do qual é transcrita uma molécula de iRNA visando um lócus em uma praga de coleópteros diferente da definida por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5, tal como, por exemplo, um ou mais locais selecionados do grupo que consiste em Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577,811), RNA polimerase 11 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/13.,214), RNA polimerase 11140 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854), RNA polimerase 11215 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.202), RNA polimerase 1133 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.210), fator de alongamento da transcrição spt5 (Pedido de Patente U.S. No. 62/168.613), fator de alongamento da transcrição spt6 (Pedido de Patente U.S. No. 62/168.606), nem (Pedido de Patente U.S. No.

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62/095487), dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), COPI alfa (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), e COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216); um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA que direciona um gene em um organismo diferente de uma praga de coleópteros (por exemplo, um nematóide parasita da planta); um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis e um polipeptídeo PIP-1); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene que fornece tolerância ao glifosato); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como aumento do rendimento, metabolismo alterado dos ácidos graxos ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática. Nas modalidades particulares, os polinucleotídeos que codificam moléculas de iRNA da invenção podem ser combinados com outros traços de controle de insetos e de doença em uma planta para obter os traços desejados para o controle reforçado de doença de plantas e dano de insetos. Em alguns exemplos, os genes que codificam as proteínas pesticidas podem ser combinados, incluindo, por exemplo, e sem limitação: moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que codificam os polipeptídeos Alcaligenes Insecticidal Protein-1A e Alcaligenes Insecticidal Protein-1B (AÍIP-1A and AÍIP-1B) (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2014/0033361); ou moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que codificam polipeptídeos PIP (WO 2015038734). A combinação de traços de controle de insetos que empregam modos de ação distintos pode fornecer plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior sobre as plantas que abrigam um único traço de controle, por exemplo, devido à menor probabilidade de que a resistência aos traços se desenvolverá no campo.

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V. Supressão de Genes-alvo em uma Praga de Inseto

A. Visão geral [00178] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros) pode ser fornecida a uma praga de inseto, em que a molécula de ácido nucleico leva ao silenciamento do gene mediada por RNAi na praga. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser fornecida a uma praga de coleópteros. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de inseto pode ser fornecida a uma praga ao entrar em contato com a molécula de ácido nucleico com a praga. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de inseto pode ser fornecida em um substrato de alimentação da praga, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de uma praga de inseto pode ser fornecida através da ingestão de matéria vegetal compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente na matéria vegetal através da expressão de um ácido nucleico recombinante introduzido na matéria vegetal, por exemplo, através da transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico recombinante e regeneração de uma matéria vegetal ou planta inteira a partir da célula vegetal transformada.

[00179] Em algumas modalidades, uma praga é colocada em contato com a molécula de ácido nucleico que leva ao silenciamento do gene mediado por RNAi na praga através do contato com uma composição tópica (por exemplo, uma composição aplicada por pulverização) ou uma isca de RNAi. As iscas de RNAi são formadas quando o dsRNA é misturado com alimentos ou atrativos ou ambos. Quando as praPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 114/420

104/164 gas comem a isca, elas também consomem o dsRNA. As iscas podem assumir a forma de grânulos, géis, pós fluidos, líquidos ou sólidos. Nas modalidades particulares, as moléculas de iRNA que direcionam o prp8 podem ser incorporadas em uma formulação de isca tal como aquela descrita na Patente U.S. No. 8.530.440 que é aqui incorporada por referência. Geralmente, com iscas, as iscas são colocadas no ou ao redor do meio ambiente da praga de inseto, por exemplo, de tal modo que o inseto possa entrar em contato com e/ou ser atraído para a isca.

B. Supressão do Gene-alvo Mediada por RNAi [00180] Em algumas modalidades, a invenção fornece moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que podem ser designadas para direcionar os polinucleotídeos nativos essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma praga de inseto (para por exemplo, uma praga de coleópteros (por exemplo, WCR, SCR, NCR e PB), por exemplo, através da projeção de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos uma filamento que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar ao polinucleotídeo alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim projetada pode ser idêntica àquela do polinucleotídeo alvo, ou pode incorporar as incompatibilidades que não impedem a hibridação específica entre a molécula de iRNA e o seu polinucleotídeo alvo.

[00181] As moléculas de iRNA da invenção podem ser utilizadas em métodos para a supressão de genes em uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros), reduzindo assim o nível ou a incidência de danos provocados pela praga em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Como aqui utilizado, o termo supressão de genes refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para reduzir os níveis de proteína produzidos como um resultado da transcrição de genes para mRNA e

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105/164 subsequente translação do mRNA, incluindo a redução da expressão de proteína de um gene ou um polinucleotídeo de codificação incluindo inibição pós-transcrição da expressão e supressão transcricional. A inibição pós-transcrição é mediada através da homologia específica entre a totalidade ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene direcionado para a supressão e a molécula de iRNA correspondente utilizada para a supressão. Adicionalmente, a inibição póstranscrição refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomas.

[00182] Em algumas modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNA de filamento único; o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro pode ser degradada e o filamento guia pode ser incorporado em RISC. A inibição póstranscrição ocorre através da hibridação específica do filamento guia com um polinucleotídeo especificamente complementar de uma molécula de mRNA e subsequente divagem pela enzima, Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).

[00183] Em outras modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser utilizada. Aqueles de habilidade na técnica irão compreender que as moléculas de dsRNA são tipicamente mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de fornecer a molécula de iRNA a uma célula do que as moléculas de RNA de filamento único e são também tipicamente mais estáveis em uma célula. Assim, enquanto que as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, podem ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser selecionada devido à sua estabilidade.

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106/164 [00184] Nas modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico é fornecida que compreende um polinucleotídeo, cujo polinucleotídeo pode ser expresso in vitro para produzir uma molécula de iRNA que compreende um polirribonucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polirribonucleotídeo de uma molécula de RNA codificada por um polinucleotídeo dentro do genoma de uma praga de insetos. Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de tronco-alça. Depois que uma praga de inseto entra em contato com a molécula de iRNA transcrita in vitro, a inibição pós-transcricional de um gene-alvo na praga (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

[00185] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos) de um polinucleotídeo é utilizada em um método para a inibição pós-transcrição de um gene-alvo em um inseto (por exemplo, coleóptero), em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; o complemento da SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; o complemento da SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; o complemento da SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; o complemento da SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; o complemento da SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; o complemento da SEQ ID NO: 12; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3; um polinucleotídeo de codiPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 117/420

107/164 ficação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 11; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 5; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos ao redor de 80% idêntica (por exemplo, 79%, ao redor de 80%, ao redor de 81%, ao redor de 82%, ao redor de

83%, ao redor de 84%, ao redor de 85%, ao redor de 86%, ao redor de

87%, ao redor de 88%, ao redor de 89%, ao redor de 90%, ao redor de

91%, ao redor de 92%, ao redor de 93%, ao redor de 94%, ao redor de

95%, ao redor de 96%, ao redor de 97%, ao redor de 98% cerca de 99%, ao redor de 100% e 100%) com qualquer um dos anteriores pode ser utilizada. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibrida com uma moPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 118/420

108/164 lécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga inseto de coleóptero (por exemplo, Diabrotica e Meligethes).

[00186] É uma característica importante de algumas modalidades neste documento que o sistema de inibição pós-transcrição de RNAi é capaz de tolerar variações de sequência entre genes-alvo que podem ser esperados devido à mutação genética, polimorfismo da cepa ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser absolutamente homóloga a um produto de transcrição primário ou a um mRNA completamente processado de um gene-alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável a um produto de transcrição primário ou a um mRNA completamente a partir do gene-alvo. Além do mais, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser de comprimento completo, em relação a um produto de transcrição primário ou a um mRNA completamente processado do gene-alvo.

[00187] A inibição de um gene-alvo utilizando a tecnologia de iRNA da presente invenção é específica da sequência; isto é, polinucleotídeos substancialmente homólogos às moléculas de iRNA são direcionados para a inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é idêntica àquela de uma parte de um gene-alvo pode ser utilizada para inibição. Nestas e outras modalidades, uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção e/ou mutações pontuais em relação a um polinucleotídeo alvo pode ser utilizada. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma parte de um gene-alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo mePetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 119/420

109/164 nos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 100% e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região dúplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma parte de um transcrito do gene-alvo. Nas moléculas especificamente hibridadas, um polinucleotídeo menor do que o comprimento total que apresenta uma homologia maior compensa um polinucleotídeo mais longo e menos homólogo. O comprimento do polinucleotídeo de uma região dúplex de uma molécula de dsRNA que é idêntico a uma parte de um transcrito do gene-alvo pode ser pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo maior do que 20 a 100 nucleotídeos pode ser utilizado. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo maior do que cerca de 200 a 300 nucleotídeos pode ser utilizado. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo maior do que cerca de 500 a 1000 nucleotídeos pode ser utilizado, dependendo do tamanho do gene-alvo.

[00188] Em certas modalidades, a expressão de um gene-alvo em uma praga (por exemplo, coleópteros) pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga, de tal modo que uma inibição significativa ocorre. A inibição significativa refere-se à inibição sobre um limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, cessação do crescimento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento, mortalidade induzida, etc.), ou uma diminuição detectável no RNA e/ou produto do gene que corresponde ao gene-alvo sendo inibido. Embora, em certas modalidades da invenção, a inibição ocorra em substanPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 120/420

110/164 cialmente todas as células da praga, em outras modalidades, a inibição ocorre apenas em um subconjunto de células que expressam o gene-alvo.

[00189] Em algumas modalidades, a supressão da transcrição é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA que apresenta uma identidade de sequência substancial para um DNA promotor ou o seu complemento para efetuar o que é referido como trans supressão do promotor. A supressão genética pode ser eficaz contra genes-alvo em uma praga de inseto que pode ingerir ou entrar em contato com tais moléculas de dsRNA, por exemplo, através da ingestão ou contato com a matéria vegetal contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para uso na trans supressão do promotor podem ser especificamente concebidas para inibir ou suprimir a expressão de um ou mais polinucleotídeos homólogos ou complementares nas células da praga de inseto. A supressão do gene póstranscrição por RNA orientado antissenso ou sentido para regular a expressão do gene nas células vegetais é divulgada nas Patentes U.S. 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184 e 5.231.020.

C. Expressão de Moléculas de iRNA Fornecidas a uma Praga de Inseto [00190] A expressão de moléculas de iRNA para a inibição de genes mediada por RNAi em uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros) pode ser realizada em qualquer um dos muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser fornecidas a uma praga de inseto, por exemplo, mediante o contato das moléculas de iRNA com a praga, ou por fazer com que a praga ingira ou de outra maneira internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades incluem plantas hospedeiras transformadas de uma praga de coleópteros, células vegetais transformadas e progênies de plantas transformadas. As células vegetais transformadas e as plantas transformadas

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111/164 podem ser planejadas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para fornecer um efeito protetor de pragas. Assim, quando uma planta transgênica ou célula vegetal é consumida por uma praga de insetos durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros de microorganismo procariotas e eucariotas para produzir moléculas de iRNA. O termo microrganismo inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.

[00191] A modulação da expressão de genes pode incluir a supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para a supressão da expressão do gene em uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros) consiste em fornecer no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade supressora de genes de pelo menos uma molécula de dsRNA formada após a transcrição de um polinucleotídeo como aqui descrito, pelo menos um segmento do qual é complementar a um mRNA dentro das células da praga de inseto. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA, ingerida por uma praga de inseto pode ser pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de DNA de prp8, por exemplo, compreendendo um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 a 12. As moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitado a estes, polinucleotídeos de ocorrência não natural e construções de DNA recombinante para fornecer moléculas de dsRNA, são, portanto, fornecidas, as quais suprimem ou inibem a expressão de um polinucleoPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 122/420

112/164 tídeo de codificação endógeno ou um polinucleotídeo de codificação alvo em uma praga de inseto quando introduzida.

[00192] As modalidades particulares fornecem um sistema de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para a inibição póstranscrição de um ou mais genes-alvo em uma praga de planta de inseto (por exemplo, coleópteros) e controle de uma população da praga de plantas. Em algumas modalidades, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula vegetal transgênica hospedeira ou o conteúdo da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas e outras modalidades, uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica é criada que contém uma construção de DNA recombinante que fornece uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. As células vegetais transgênicas e as plantas transgênicas que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma molécula particular de iRNA podem ser produzidas mediante o emprego de tecnologias de DNA recombinante (essas tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de plantas compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar a célula vegetal transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00193] Para transmitir proteção contra as pragas de inseto a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita para dentro de uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma tal

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113/164 molécula de dsRNA pode compreender, em parte, um polirribonucleotídeo que é idêntico a um polibonucleotídeo correspondente transcrito a partir de um DNA dentro de uma praga de inseto de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene-alvo dentro da praga é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão da expressão do gene-alvo na praga resulta na proteção da planta transgênica contra a praga. Os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA mostraram ser aplicáveis a uma variedade de genes expressos nas pragas, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou pela transformação celular, incluindo os genes de manutenção; fatores de transcrição; genes relacionados com a troca de proteção externa; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.

[00194] Para a transcrição a partir de um transgene in vivo ou uma construção de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor, intensificador, silenciador e sinal de poliadenilação) pode ser utilizada em algumas modalidades para transcrever o filamento de RNA (ou filamentos). Portanto, em algumas modalidades, como apresentadas, supra, um polinucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode estar ligado de modo operável a um ou mais elementos promotores funcionais em uma célula hospedeira da planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. O polinucleotídeo da presente invenção, sob o controle de um elemento promotor ligado de maneira operável, pode ainda ser flanqueado por elementos adicionais que afetam vantajosamente a sua transcrição e/ou a estabilidade de uma transcrição resultante. Tais elementos podem estar localizados a montante do promotor ligado de maneira operável, a jusante da extremidade 3' da construção da expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor quanto a

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114/164 jusante da extremidade 3' da construção de expressão.

[00195] Algumas modalidades fornecem métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) provocado por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros) que se alimenta da planta, em que o método compreende fornecer na planta hospedeira uma célula vegetal transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que as moléculas de ácido nucleico funciona após serem tomadas pelas pragas para inibir a expressão de um polinucleotídeo alvo dentro das pragas, cuja inibição da expressão resulta na mortalidade e/ou crescimento reduzido das pragas, reduzindo assim o dano à planta hospedeira provocada pelas pragas. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA. Nestas e outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que um polirribonucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de coleópteros. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico consistem em um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de insetos.

[00196] Em algumas modalidades, um método para aumentar o rendimento de uma cultura (por exemplo, uma cultura de milho e uma colheita de colza) é fornecido, em que o método compreende a introdução em uma planta de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da invenção; o cultivo da planta para permitir a expressão de uma molécula de iRNA a partir do polinucleotídeo, em que a expressão da molécula de iRNA inibe o dano e/ou o crescimento de pragas de inseto, reduzindo ou eliminando assim uma perda de rendimento devido à infestação de pragas. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas

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115/164 e outras modalidades, as moléculas de dsRNA podem compreender cada uma mais do que um polirribonucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Assim, especificamente, os polirribonucleotídeos de uma molécula de dsRNA podem ser expressos a partir de uma ou mais sequências de nucleotídeo dentro de um polinucleotídeo da invenção.

[00197] Em algumas modalidades, um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma praga de inseto é fornecido, o método compreendendo: transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de iRNA da invenção, em que o polinucleotídeo está ligado de maneira operável a um promotor e a um elemento de terminação da transcrição; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais incluindo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram o polinucleotídeo em seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas para expressão de uma molécula de iRNA codificada pelo polinucleotídeo integrado; selecionar uma célula vegetal transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentar praga de insetos com a célula vegetal transgênica selecionada. As plantas também podem ser regeneradas a partir das células vegetais transgênicas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA que compreende um polirribonucleotídeo que é especificamente hibridizável com a transcrição de um genealvo na praga de inseto. Nestas e outras modalidades, as moléculas de dsRNA compreendem mais do que um polirribonucleotídeo que é transcrito a partir de uma sequência de nucleotídeos dentro do polinuPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 126/420

116/164 cleotídeo que codifica a molécula de dsRNA.

[00198] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho e canola), como um produto da expressão de um gene recombinante incorporado em um genoma das células vegetais, ou como incorporado em um revestimento ou tratamento de semente que aplicado à semente antes do plantio. Uma célula vegetal que compreende um gene recombinante é considerada ser um evento transgênico. Também incluídos nas modalidades da invenção são os sistemas de liberação para a liberação de moléculas de iRNA às pragas de inseto (por exemplo, coleópteros). Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser introduzidas diretamente nas células de uma praga. Os métodos para a introdução podem incluir a mistura direta de iRNA com o tecido vegetal de um hospedeiro pelos insetos, assim como a aplicação de composições que compreendem moléculas de iRNA da invenção ao tecido vegetal do hospedeiro. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a superfície da planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microrganismo, e o microrganismo pode ser aplicado na superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule por um meio físico tal como uma injeção. Conforme debatido, supra, uma planta transgênica também pode ser geneticamente modificada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas de inseto conhecidas por infestar a planta. As moléculas de iRNA produzidas através da síntese química ou enzimática também podem ser formuladas de forma consistente com práticas agrícolas comuns e utilizadas como produtos de pulverização ou iscas para o controle do dano da planta por uma praga de inseto. As formulações podem incluir os adjuvantes apropriados (por exemplo, adesivos e umectantes) requeridos para cobertura foliar eficiente, assim como protetores de UV

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117/164 para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de danos por UV. Tais aditivos são comumente utilizados na indústria de bioinseticidas, e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticida por pulverização (com base biológica ou de outra forma) para aumentar a proteção das plantas contra as pragas.

[00199] Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, aqui citadas, são por meio desta incorporadas por referência na medida em que não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos desta divulgação, e são assim incorporadas na mesma medida como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foram apresentadas aqui na sua totalidade. As referências aqui debatidas são fornecidas apenas para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antedatar tal divulgação em virtude de invenção anterior.

[00200] Os seguintes EXEMPLOS são fornecidos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes EXEMPLOS não devem ser interpretados para limitar a divulgação nas características ou aspectos particulares descritos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Materiais e Métodos [00201] Várias moléculas de dsRNA incluindo aquelas que correspondem ao prp8-1 regí (SEQ ID NO: 7), prp8-2 regí (SEQ ID NO: 8), prp8-3 regí (SEQ ID NO: 9), prp8-3 v1 (SEQ ID NO: 10) e prp8-3 v2 (SEQ ID NO: 11), e foram sintetizadas e purificadas utilizando um kit MEGASCRIPT® T7 RNAi (LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA) ou T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEW ENGLAND BIOLABS, Whitby, Ontario). As moléculas de dsRNA purificadas foram preparaPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 128/420

118/164 das em tampão TE e todos os bioensaios continham um tratamento de controle que consiste neste tampão, o qual serviu como uma verificação dos antecedentes de mortalidade ou inibição de crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsrNA no tampão de bioensaio foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00202] As amostras foram testadas quanto à atividade dos insetos em bioensaios conduzidos com larvas de inseto neonatos ou dieta artificial de insetos. Os ovos de WCR foram obtidos da CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00203] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 reservatórios especificamente concebidas para bioensaios de insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada reservatório continha aproximadamente 1,0 ml de uma dieta artificial projetada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 μΙ de amostra de dsRNA foi liberada por pipeta na superfície da dieta de cada reservatório (40 μΙ/cm²). As concentrações da amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm²) de área superficial (1,5 cm²) no reservatório. As bandejas tratadas foram mantidas em uma capela de exaustão até que o líquido na superfície da dieta evaporasse ou fosse absorvido na dieta.

[00204] Dentro de algumas horas de eclosão, as larvas individuais foram apanhadas com uma escova de cabelo camelo úmida e depositadas na dieta tratada (uma ou duas larvas por reservatório). Os reservatórios infestados das bandejas de plástico de 128 reservatórios foram então selados com folhas adesivas de plástico transparente e ventilados para permitir a troca gasosa. As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28 °C, ~40% de umidade relativa, 16:8 (Luz:Escuridão)) durante 9 dias, após cujo tempo o

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119/164 número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos, e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados. A porcentagem média de mortalidade e a inibição média do crescimento foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (Gl) foi calculada como se segue:

Gl = [1 - (TWIT / TNIT) / (TWIBC / TNIBC)], [00205] onde TWIT é o peso total de insetos vivos no tratamento; [00206] TNIT é o número total de insetos no tratamento;

[00207] TWIBC é o peso total de insetos vivos na verificação de antecedentes (controle de tampão); e [00208] TNIBC é o número total de insetos na verificação de antecedentes (controle de tampão).

[00209] A análise estatística foi feita utilizando o software JMP™ (SAS, Cary, NC).

[00210] A CLso (Concentração Letal) é definida como a dosagem em que 50% dos insetos testados são mortos. A GI₅₀ (Inibição de Crescimento) é definida como a dosagem em que o crescimento médio (por exemplo, o peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio observado nas amostras de Verificação de Antecedentes.

[00211] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma surpreendente e inesperada mortalidade e inibição do crescimento de larvas do verme de raiz de milho.

EXEMPLO 2: Identificação dos Genes-Alvo Candidatos [00212] Os insetos de vários estágios do desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise de transcriptoma agrupada para fornecer sequências de gene-alvo candidato para o controle através da tecnologia de proteção de inseto de plantas transgênicas RNAi.

[00213] Em uma exemplificação, o RNA total foi isolado de 0,9 g de

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120/164 larvas de WCR de primeiro instar inteiras; (4 a 5 dias pós-incubação, mantida a 16 Ό) e purificado utilizando o seguinte método baseado em fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH):

[00214] As larvas foram homogeneizadas na temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 ml com 10 ml de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea foi obtida. Após 5 min. de incubação na temperatura ambiente, o homogenado foi distribuído em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 ml por tubo), 200 pl de clorofórmio foram adicionados e a mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos. Depois de permitir que a extração se assente na temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação em 12.000 x g a 4 Ό. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 ml) foi cuidadosamente transferida para outro tubo esterilizado de 1,5 ml e foi adicionado um volume igual de isopropanol na temperatura ambiente. Após incubação na temperatura ambiente durante 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min em 12.000 x g (4 °o u 25 O).

[00215] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e o grânulo de RNA foi lavado duas vezes por vórtice com 75% de etanol, com recuperação através da centrifugação durante 5 min em 7500 x g (4 Ό ou 25 Ό) após cada lavagem. O etano I foi cuidadosamente removido, o grânulo foi deixado secar ao ar livre durante 3 a 5 min e depois foi dissolvido em água estéril livre de nucleases. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorvência (A) em 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas produziu acrescido de 1 mg de RNA total, com uma relação A₂₆₀/A₂₈₀ de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80 Ό até qu e ainda processado.

[00216] A qualidade do RNA foi determinada por meio da execução de uma alíquota através de um gel de agarose a 1%. A solução de gel

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121/164 de agarose foi preparada utilizando tampão TAE 10x esterilizado (Trisacetato EDTA; concentração 1x é Tris-acetato 0,04 M, EDTA 1 mM (sal de sódio do ácido etilenodiamina tetra-acético), pH 8,0) diluída com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente esterilizado. 1x TAE foi utilizado como o tampão de operação. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente de boa formação foram limpos com RNaseAway™ (INVITROGEN INC., Carlsbad, CA). Dois pi de amostra de RNA foram misturados com 8 μΙ de tampão TE (10 mM Tris HCI pH 7,0; 1 mM EDTA) e 10 μΙ de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catalog No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70 Ό durante 3 minutos, esfriada para a temperatura ambiente e 5 μΙ (contendo 1 μg a 2 μg de RNA) foram carregados por reservatório. Os marcadores de peso molecular de RNA comercial mente disponíveis foram simultaneamente operados nos reservatórios separados para comparação de tamanho molecular. O gel foi operado em 60 volts durante 2 horas.

[00217] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total larval por um fornecedor de serviços comerciais (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), utilizando a iniciação aleatória. A biblioteca de cDNA de larvas normalizada foi sequenciada em escala de 1/2 placa pela química da série GS FLX 454 Titanium™ no EUROFINS MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com uma extensão média de leitura de 348 pb. 350.000 leituras foram montadas em mais de 50,000 contigs. Tanto as leituras desmontadas quanto os contigs foram convertidos em bancos de dados BLASTable utilizando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível da NCBI).

[00218] As bibliotecas de RNA total e de cDNA normalizado foram preparadas de forma semelhante a partir de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento da WCR. Uma biblioteca de transcriPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 132/420

122/164 ptoma reunida para a triagem de genes-alvo foi construída pela combinação de membros da biblioteca de cDNA que representam os vários estágios de desenvolvimento.

[00219] Os genes candidatos para o direcionamento de RNAi foram admitidos em hipótese como essenciais para a sobrevivência e o crescimento na praga de inseto. Os homólogos de genes-alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequência de transcriptoma, conforme descrito abaixo. As sequências completas ou parciais dos genes-alvo foram amplificadas por PCR para preparar modelos para a produção de RNA de filamento duplo (dsRNA).

[00220] As buscas TBLASTN utilizando sequências de codificação de proteínas candidatas foram executadas contra os bancos de dados BLASTable contendo as leituras da sequência Diabrotica não montadas ou os contigs montados. Os êxitos significativos de uma sequência Diabrotica (definida como melhor do que o e'²⁰ para homologias de contigs e melhor do que e'¹⁰ para homologias de leituras de sequência não montadas) foram confirmados utilizando BLASTX contra a base de dados não redundante NCBI. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências do gene candidato homólogo de Diabrotica identificadas na pesquisa TBLASTN de fato constituíam os genes Diabrotica, ou foram o melhor êxito para a sequência do gene candidato não Diabrotica presente nas sequências Diabrotica. Na maioria dos casos, os genes candidatos de Tribolium que foram anotados como codificadores de uma proteína deram uma homologia de sequência inequívoca a uma sequência ou sequências nas sequências do transcriptoma de Diabrotica. Em alguns casos, ficou claro que alguns dos contigs de Diabrotica ou algumas leituras de sequência não montadas selecionadas por homologia com um gene candidato não Diabrotica se sobrepuseram e que a montagem dos contigs não conseguiu unir essas sobreposições. Nesses casos, o Sequencher™ v4.9

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123/164 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml) foi utilizado para montar as sequências em contigs mais longos.

[00221] Vários genes-alvo candidatos que codificam Diabrotica prp8 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3) foram identificados como genes que podem levar à mortalidade da praga de coleópteros, inibição de crescimento, inibição de desenvolvimento e/ou inibição de alimentação na WCR.

[00222] O gene prp8 de Drosophila consiste em um domínio NusG amino-terminal (NGN) e um domínio C-terminal Kyprides-OnzonisWoese (KOW), atuando como um regulador transcricional duplo que funciona como um fator de alongamento tanto negativo quanto positivo. O domínio NGN do prp8 se liga ao RNAP enquanto os domínios KOW recrutam fatores regulatórios adicionais para o RNAP. O domínio KOW em eucariótica é suposto de permitir o recrutamento de um maior número de fatores de transcrição. Além disso, o prp8 também pode participar da regulação do processamento de pré-mRNA, pois interage com a enzima de cobertura. Juntamente com a pequena proteína dedo de zinco SPT4 (supressor de Ty 4), o prp8 forma o complexo heterodimérico DSIF (fator de indução de sensibilidade DRB (5,6-dicloro-1-3D-ribofuranosilbenzimidazol)).

[00223] As sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 são novas. As sequências não são fornecidas em bancos de dados públicos, e não são divulgadas na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2011/025860; Pedido de Patente U.S. No. 20070124836; Pedido de Patente U.S. No. 20090306189; Pedido de Patente U.S. No. US20070050860; Pedido de Patente U.S. No. 20100192265; Patente U.S. 7.612.194; ou Pedido de Patente U.S. No. 2013192256. O prp8-1 de WCR (SEQ ID NO: 1) está ligeiramente relacionado com um fragmento de uma sequência de Tribolium castaneum (GENBANK Accession No. XM 961838.2). O prp8-2 de WCR (SEQ ID NO: 3) está ligeiPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 134/420

124/164 ramente relacionado com um fragmento de uma sequência de Oryctolagus cuniculus (GENBANK Accession No. NM 144353.4). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de WCR PRP8-1 (SEQ ID NO: 2) é uma proteína de Tribolium casetanum tendo GENBANK Accession No. XP 966931.1 (99% semelhante, 98% idêntico na região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido de WCR PRP8-2 (SEQ ID NO: 4) é uma proteína de Gregarina niphandrodes tendo GENBANK Accession No. XP_011131272.1 (85% semelhante, 76% idêntico na região de homologia).

[00224] Os transgenes de dsRNA de prp8 podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para fornecer efeitos de direcionamento de RNAi redundante e de RNAi sinérgico. Os eventos de milho transgênico que expressam dsRNA que direciona o prp8 são úteis para prevenir o dano de alimentação de raízes pela larva da raiz do milho. Os transgenes de ARPp de prp8 representam novos modos de ação para combinar com a tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis em pirâmides de genes de Gerenciamento de Resistência a Insetos para mitigar contra o desenvolvimento de populações de larva da raiz do milho resistentes a cada uma dessas tecnologias de controle da larva da raiz.

EXEMPLO 3: Amplificação de Genes-Alvo para produzir dsRNA [00225] Clones de comprimento completo ou parciais de sequências de um gene candidato de Diabrotica, aqui referido como prp8, foram utilizados para gerar amplicons de PCR para a síntese de dsRNA. Os iniciadores foram projetados para amplificar partes das regiões de codificação de cada gene-alvo por PCR. Ver a Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; SEQ ID NO: 13) foi incorporada nas extremidades 5' dos filamentos de sentido ou antissenso amplificados. Ver a Tabela 1. O RNA total foi extraído da WCR utilizando TRIzol® (Life TechnologiPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 135/420

125/164 es, Grand Island, NY), e foi depois utilizado para produzir o cDNA de primeiro filamento com o SuperScriptlll® First-Strand Synthesis System e as instruções preparadas pelos fabricantes Oligo dT (Life Technologies, Grand Island, NY). O DNAc de primeiro filamento foi utilizado como modelo para reações PCR utilizando iniciadores opostos posicionados para amplificar a totalidade ou parte da sequência do genealvo nativo. O dsRNA também foi amplificado a partir de um clone de DNA que compreende a região de codificação para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 14; Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50).

Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar as partes das regiões de codificação do gene-alvo prp8 exemplar e do gene de controle negativo da YFP.

	Gene ID	Iniciador ID	Sequência
Par 1	prp8-1	Dw-prp8-1_For	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACAATTTACAAGATGTGTGG GATGTG (SEQ ID NO: 15)
Dw-prp8-1_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACATTATTAGGATCTGGATGT TCTGTTAG (SEQ ID NO: 16)
Par 2	prp8-2	Dw-prp8-2_For	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACGGCTTAATCCGCGGCCTC CAGTTCAGCAGTTTC (SEQ ID NO: 17)
Dw-prp8-2_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACTTTGCCCCAACTCAGCTC AGCTAAAC (SEQ ID NO: 18)

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	Gene ID	Iniciador ID	Sequência
Par 3	prp8-3	Dw-prp8-3_For	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACTAAGAATAACGTCGTTATA AACTACAAAGATATG (SEQ ID NO: 19)
Dw-prp8-3_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACATTATTAGGATCTGGATGT TCTGTTAGG (SEQ ID NO: 20)
Par 4	prp8-3 v1	Dw-prp8-3_v1 For	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACTAAGAATAACGTCGTTATA AAC (SEQ ID NO: 21)
Dw-prp83_v1_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGA GAGCAGATCCAAAACCAGACC ATAATAC (SEQ ID NO: 22)
Par 5	prp8-3 v2	Dw-prp8-3_v2_For	TTAATACGACTCACTATAGGGA GATGGCTGGGCCACCTCAAAT G (SEQ ID NO: 23)
Dw-prp83_v2_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGA GAGACATTATTAGGATCTGGA TG (SEQ ID NO: 24)
Par 6	YFP	YFP-FT7	TTAATACGACTCACTATAGGGA GACACCATGGGCTCCAGCGG CGCCC (SEQ ID NO: 34)
YFP-RT7	TTAATACGACTCACTATAGGGA GAAGATCTTGAAGGCGCTCTT CAGG (SEQ ID NO: 37)

EXEMPLO 4: Construções de RNAi [00226] Preparação do modelo por PCR e síntese de dsRNA. Uma estratégia utilizada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA de prp8 e YFP é mostrada na FIG. 1. Os DNAs modelos destinados a serem utilizados na síntese de dsRNA de prp8 foram preparados pela PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como modelo de PCR) cDNA de primeira filamento preparado a partir do RNA total isolado de ovos, larvas de primeiro instar ou adultos de

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WCR. Para cada região do gene-alvo prp8 e YFP selecionada, as amplificações por PCR introduziram uma sequência do promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos de senso e antissenso amplificado (o segmento de YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região codificadora de YFP). Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi utilizada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIG. 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificados com os pares de iniciadores particulares foram: SEQ ID NO: 7 (prp8-1 regí), SEQ ID NO: 8 (prp8-2 regí), SEQ ID NO: 9 (prp8-3 regí), SEQ ID NO: 10 (prp8-3 v1), SEQ ID NO: 11 (prp8-3 v2) e SEQ ID NO: 14 (YFP). O RNA de filamento duplo para o bioensaio de inseto foi sintetizado e purificado utilizando um kit AMBION® MEGASCRIPT® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) ou HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). As concentrações de dsRNAs foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00227] Construção de vetores de transformação de plantas. Os vetores de entrada que abrigam uma construção de gene-alvo para a formação grampo de cabelo compreendendo segmentos de prp8 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3) são montados utilizando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação grampo de cabelo intramolecular por transcritos primários de RNA é facilitada através da disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias do segmento do gene-alvo prp8 em orientação oposta entre si, os dois segmentos sendo separados por um polinucleotídeo conector (por exemplo, um íntron ST-LS1 Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen.

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Genet. 220(2):245-50). Assim, o transcrito de shRNA primário contém as duas sequências do segmento de gene prp8 como grandes repetições invertidas uma da outra, separadas pela sequência de íntron. Uma cópia de um promotor de ubiquitina 1 de milho (Patente U.S. 5.510.474) é utilizada para conduzir a produção do transcrito na forma de grampo de cabelo primário de shRNA e um fragmento compreendendo uma região 3' não trasladada de um gene de peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3'UTR v2; Patente U.S. 6.699.984) é utilizado para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA.

[00228] Um vetor binário de controle negativo que compreende um gene que expressa um dsRNA na forma de grampo de cabelo de YFP, é construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico e um vetor de entrada.

[00229] O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância ao herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase, AAD-1 v3) (Patente U.S. 7.838.733 (B2) e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240- 5) sob a regulação de um promotor de badnavírus baciliforme (ScBV) da cana-de-açúcar (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30). Uma sequência 5'UTR sintética, composta por sequências de um gene da proteína de revestimento do Vírus de Estria do Milho (MSV) 5'UTR e íntron 6 de um gene de Álcool Desidrogenase 1 de milho (ADH1), está posicionada entre a extremidade 3' do segmento promotor SCBV e o códon de partida da região de codificação AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região 3' não trasladada de um gene de lipase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. 7.179.902) é utilizado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.

[00230] Um outro vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico e vetor de entrada. O vetor de destino binário comPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 139/420

129/164 preende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase, AAD-1 v3) (como acima) sob a regulação da expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento que compreende uma região 3' não trasladada de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR, como acima). O vetor de entrada compreende uma região de codificação de YFP (SEQ ID NO: 27) sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento que compreende uma região 3' não trasladada de um gene de peroxidase 5 de milho (como acima).

EXEMPLO 5: Triagem de Genes-Alvo Candidatos [00231] O dsRNA sintético concebido para inibir as sequências do gene-alvo identificadas no EXEMPLO 2 provocou a mortalidade e inibição do crescimento quando administrado a WCR em ensaios à base de dieta.

[00232] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivadas de prp8-2 regí, prp8-2 v1 e prp8-2 v2 resultou em mortalidade e inibição do crescimento de larvas de verme de raiz do milho ocidental. A Tabela 2 mostra os resultados de bioensaios de alimentação à base de dieta de larvas de WCR após a exposição de 9 dias ao dsRNA de prp8-2 regí, prp8-2 v1 e prp8-2 v2, assim como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparada a partir de uma região de codificação de proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 27). A Tabela 3 mostra os resultados de CL₅₀ e GI₅₀ da exposição a dsRNA de prp8-2 v1 e prp8-2 v2.

Tabela 2. Resultados dos ensaios de alimentação de dieta de dsRNA de prp8 obtidos com larvas do verme da raiz do milho ocidental após 9 dias de alimentação. A análise de ANOVA encontrou diferenças significativas na % média de Mortalidade e na % média de Inibição de

Crescimento (Gl). As médias foram separadas utilizando o teste de

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Tukey-Kramer.

NOME DO GENE	DOSE (ng/cm2)	N	MÉDIA (% DE MORTALIDADE) ±SEM*	MÉDIA (Gl) ± SEM
prp8-3	500	6	68,90 ± 8,63 (A)	0,78 ±0,17 (A)
prp8-3 v1	500	20	58,50 ± 6,08 (A)	0,73 ± 0.08 (A)
prp8-3 v2	500	20	58,67 ± 6,52 (A)	0,75 ± 0,07 (A)
yp**	0	20	11,23 ±2,73 (B)	0,01 ± 0,04 (B)
ÁGUA	0	20	9,57 ± 2,66 (B)	-0,01 ± 0,03 (B)
YPP***	500	18	5,40 ± 0,98 (B)	-0,0 ± 0,04 (B)

* SEM = erro padrão da média. As letras entre parênteses designam níveis estatísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (P < 0,05).

**TE = Tris HCI (1 mM) acrescido de tampão EDTA (0,1 mM), pH 7,2. *** γρρ _ p_rot_eína Fluorescente Amarela

Tabela 3. Sumário da potência oral de dsRNA de prp8 em larvas de WCR (ng/cm²).

Nome do Gene	LC5o	Faixa	GI5o	Faixa
prp8-3 v1	14,85	9,86-22,15	2,61	1,57-4,33
prp8-3 v2	20,88	13,34-32,84	1,29	0,46 - 3,60
[00233] Foi anl	teriormente sugerido que certos genes de Diabrotica

spp. podem ser explorados para controle de insetos mediado por RNAi. Ver a Publicação da Patente U.S. No. 2007/0124836, que divulga 906 sequências, e a Patente U.S. No. 7.612.194, que divulga 9112 sequências. No entanto, determinou-se que muitos genes sugeridos de terem utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle da Diabrotica. Também se determinou que a sequência de dsRNA de prp8-2 regí, prp8-2 v1 e prp8-2 v2 fornece controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, em comparação com outros genes sugeridos de ter utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi.

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131/164 [00234] Por exemplo, anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram sugeridas na Patente U.S. 7.612.194 de serem eficazes no controle de insetos mediado por RNAi. A SEQ ID NO: 28 é a sequência de DNA da região de anexina 1 (Reg. 1) e a SEQ ID NO: 29 é a sequência de DNA da região de anexina 2 (Reg 2). A SEQ ID NO: 30 é a sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2 (Reg 1) e a SEQ ID NO: 31 é a sequência de DNA da região beta 2 da espectrina 2 (Reg2). A SEQ ID NO: 32 é a sequência de DNA da região de mtRP-L4 1 (Reg. 1) e a SEQ ID NO: 33 é a sequência de DNA da região de mtRP-L4 2 (Reg

2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO: 14) também foi utilizada para produzir o dsRNA como um controle negativo.

[00235] Cada uma das sequências acima mencionadas foi utilizada para produzir dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia utilizada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA é mostrada na FIG. 2. Os DNAs modelos destinados para uso na síntese de dsRNA foram preparados por PCR utilizando os pares de iniciador na Tabela 4 e cDNA de primeiro filamento (como modelo de PCR) preparado a partir de RNA total isolado de larvas de primeiro instar da WCR. (YFP foi amplificada de um clone de DNA). Para cada região de gene-alvo selecionada, duas amplificações de PCR separadas foram executadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência de promotor T7 na extremidade 5' dos filamentos de sentido amplificados. A segunda reação incorporou a sequência do promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos antissenso. Os dois fragmentos amplificados pela PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi utilizada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIG.

2. O RNA de filamento duplo foi sintetizado e purificado utilizando um kit AMBION® MEGAscript® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNAs foram medidas utilizan-

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132/164 do um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNAs foram cada um testado pelos mesmos métodos de bioensaio à base de dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores utilizados para produzir as moléculas de dsRNA de anexina Regí, anexina Reg2, beta espectrina 2 Regí, beta espectrina 2 Reg2, mtRP-L4 Regí, mtRP-L4 Reg2 e YFP. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação à base de dieta de larvas de WCR após a exposição de 9 dias a essas moléculas de dsRNA. Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsrNAs resultou em nenhuma mortalidade ou nenhuma inibição do crescimento de larvas do verme da raiz do milho ocidental acima daquela observada com amostras de controle de tampão TE, água ou proteína YFP.

Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciador utilizados para amplificar partes das regiões de codificação dos genes.

	Gene (Região)	Iniciador ID	Sequência
Par 6	YFP	YFP-FT7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACACCATGGGCTCCAGCGGCGC CC (SEQ ID NO: 34)
YFP	YFP-R	AGATCTTGAAGGCGCTCTTCAG G (SEQ ID NO: 35)
Par 7	YFP	YFP-F	CACCATGGGCTCCAGCGGCGCC C (SEQ ID NO: 36)
YFP	YFP-RT7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGATCTTGAAGGCGCTCTTCAG G (SEQ ID NO: 37)
Par 8	Anexina (Regí)	Ann-F1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AGCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (SEQ ID NO: 38)
Anexina (Regí)	Ann-R1	CTAATAATTCTTTTTTAATGTTCC TGAGG (SEQ ID NO: 39)

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	Gene (Região)	Iniciador ID	Sequência
Par 9	Anexina (Reg 1)	Ann-F1	GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (SEQ ID NO: 40)
Anexina (Reg 1)	Ann-R1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACTAATAATTCTTTTTTAATGTTC CTGAGG (SEQ ID NO: 41)
Par 10	Anexina (Reg 2)	Ann-F2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ATTGTTACAAGCTGGAGAACTTC TC (SEQ ID NO: 42)
Anexina (Reg 2)	Ann-R2	CTTAACCAACAACGGCTAATAAG G (SEQ ID NO: 43)
Par 11	Anexina (Reg 2)	Ann-F2	TTGTTACAAGCTGGAGAACTTCT C (SEQ ID NO: 44)
Anexina (Reg 2)	Ann-R2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACTTAACCAACAACGGCTAATAA GG (SEQ ID NO: 45)
Par 12	Beta-spect2 (Regí)	Betasp2F1T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGATGTTGGCTGCATCTAGAGA A (SEQ ID NO: 46)
Beta-spect2 (Regí)	Betasp2-R1	GTCCATTCGTCCATCCACTGCA (SEQ ID NO: 47)
Par 13	Beta-spect2 (Regí)	Betasp2-F1	AGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (SEQ ID NO: 48)
Beta-spect2 (Regí)	Betasp2R1T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AGTCCATTCGTCCATCCACTGCA (SEQ ID NO: 49)
Par 14	Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2F2T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AGCAGATGAACACCAGCGAGAA A (SEQ ID NO: 50)
Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-R2	CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (SEQ ID NO: 51)
Par 15	Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-F2	GCAGATGAACACCAGCGAGAAA (SEQ ID NO: 52)

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	Gene (Região)	Iniciador ID	Sequência
	Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2R2T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (SEQ ID NO: 53)
Par 16	mtRP-L4 (Reg 1)	L4-F1T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGTGAAATGTTAGCAAATATAA CATCC (SEQ ID NO: 54)
mtRP-L4 (Reg 1)	L4-R1	ACCTCTCACTTCAAATCTTGACT TTG (SEQ ID NO: 55)
Par 17	mtRP-L4 (Reg 1)	L4-F1	AGTGAAATGTTAGCAAATATAAC ATCC (SEQ ID NO: 56)
mtRP-L4 (Reg 1)	L4-R1T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG AACCTCTCACTTCAAATCTTGAC TTTG (SEQ ID NO: 57)
Par 18	mtRP-L4 (Reg 2)	L4-F2T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACAAAGTCAAGATTTGAAGTGAG AGGT (SEQ ID NO: 58)
mtRP-L4 (Reg 2)	L4-R2	CTACAAATAAAACAAGAAGGACC CC (SEQ ID NO: 59)
Par 19	mtRP-L4 (Reg 2)	L4-F2	CAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGA GGT (SEQ ID NO: 60)
mtRP-L4 (Reg 2)	L4-R2T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACTACAAATAAAACAAGAAGGAC CCC (SEQ ID NO: 61)

Tabela 5. Resultados dos ensaios de alimentação à base de dieta obtidos com larvas do verme da raiz do milho ocidental após 9 dias.

Nome do Gene	Dose (ng/cm2)	Peso Médio da Larva Viva (mg)	% Média de Mortalidade	Inibição Média do Crescimento
anex/na-Reg 1	1000	0,545	0	-0,262
anex/na-Reg 2	1000	0,565	0	-0,301
beta espectrina2 Reg 1	1000	0,340	12	-0,014

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Nome do Gene	Dose (ng/cm2)	Peso Médio da Larva Viva (mg)	% Média de Mortalidade	Inibição Média do Crescimento
beta espectrina2 Reg 2	1000	0,465	18	-0,367
mtRP-L4 Reg 1	1000	0,305	4	-0,168
mtRP-L4 Reg 2	1000	0,305	7	-0,180
Tampão TE*	0	0,430	13	0,000
Água	0	0,535	12	0,000
YPP**	1000	0,480	9	-0,386

*ΤΕ = Tris HCI (10 mM) acrescido de tampão EDTA (1 mM), pH 8. **YFP = Proteína Fluorescente Amarela

EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transgênico compreendendo dsRNAs inseticidas [00236] Transformação mediada por Agrobacterium·. Células, tecidos e plantas de milho transgênico que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene que compreende prp8 (por exemplo, SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3)) através da expressão de um gene quimérico integrado de forma estável no genoma da planta são produzidos após a transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação de milho que empregam vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 8.304.604, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os tecidos transformados são selecionados por sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxyfop e são submetidos a triagem com relação à produção de dsRNA, conforme apropriado. Partes de tais culturas de tecido transformadas podem ser apresentadas às larvas de verme de raiz de milho neonato para bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 1.

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136/164 [00237] Início da Cultura de Agrobacterium. Os estoques de glicerol das células DAÍ13192 de cepa de Agrobacterium (Publicação Internacional PCT No. WO 2012/016222A2) que abrigam um vetor de transformação binário descrito acima (EXEMPLO 4) são estriados em placas de meio mínimo AB (Watson, et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255264) contendo antibióticos apropriados, e são cultivados a 20 °C durante 3 dias. As culturas são então estriadas em placas de YEP (g/L: extrato de levedura, 10, Peptone, 10, NaCI, 5) contendo os mesmos antibióticos e são incubadas a 20 °C durante 1 dia.

[00238] Cultura de Agrobacterium. No dia de um experimento, uma solução de estoque de meio de inoculação e acetossiringona é preparada em um volume apropriado para o número de construções no experimento e pipetada em um frasco estéril descartável de 250 ml. O Meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Τ. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327341) contém: 2,2 g/L de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins (Frame et al., Ibid.) 68,4 g/L de sacarose; 36 g/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; em pH 5,4. A acetossiringona é adicionada ao frasco contendo o meio de inoculação em uma concentração final de 200 uM a partir de uma solução de estoque 1 M em sulfóxido de dimetila 100% e a solução é completamente misturada.

[00239] Para cada construção, 1 ou 2 alças completas de inoculação de Agrobacterium da placa YEP são colocadas em suspensão em 15 ml de solução de estoque de meio de inoculação/acetossiringona em um tubo de centrífuga descartável e estéril de 50 ml e a densidade ótica da solução em 550 nm (OD₅₅₀) é medido em um espectrofotômetro. A suspensão é então diluída para OD₅₅₀ de 0,3 a 0,4 utilizando misturas adicionais de meio de inoculação/acetossiringona. O tubo de

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137/164 suspensão de Agrobacterium é então colocado horizontalmente em um agitador de plataforma ajustado ao redor de cerca de 75 rpm na temperatura ambiente e agitado durante 1 a 4 horas enquanto a dissecção do embrião é executada.

[00240] Esterilização da espiga e isolamento de embriões. Os embriões imaturos de milho são obtidos a partir de plantas da linhagem inerente de Zea mays B104 (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406), cultivadas na estufa e auto-polinizadas ou polinizadas por família para produzir espigas. As espigas são colhidas aproximadamente 10 a 12 dias após a polinização. No dia experimental, as espigas descascadas são esterilizadas na superfície por imersão em uma solução a 20% de alvejante comercial (ULTRA CLOROX® Germicidal Bleach, hipoclorito de sódio a 6,15%, com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas durante 20 a 30 min, seguido por três enxágues em água deionizada estéril em uma coifa de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) são dissecados assepticamente de cada espiga e distribuídos aleatoriamente em tubos de microcentrífuga contendo 2,0 ml de uma suspensão de células apropriadas de Agrobacterium em meio de inoculação líquido com acetossiringona 200 μΜ, nas quais 2 μΙ de tensoativo BREAKTHRU® a 10% (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Germany) são adicionados. Para um determinado conjunto de experiências, são utilizados embriões de espigas reunidas para cada transformação.

[00241] Cocultivo de Agrobacterium. Após o isolamento, os embriões são colocados em uma plataforma basculante durante 5 minutos. Os conteúdos do tubo são então despejados sobre uma placa de meio de cocultivo, que contém 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 30 g/l de sacarose; 700 mg/l de L-prolina; 3,3 mg/l de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2metoxibenzóico); 100 mg/l de mio-inositol; 100 mg/l de Hidrolisado EnPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 148/420

138/164 zimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO₃; 200 μΜ de acetossiringona em DMSO; e 3 g/L de GELZAN™, no pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium é removida com uma pipeta de transferência estéril descartável. Os embriões são então orientados com o escutelo virado para cima utilizando fórceps estéril com a ajuda de um microscópio. A placa é fechada, selada com esparadrapo 3M™ MICROPORE™ e colocada em uma incubadora a 25 “C com luz contínua e m aproximadamente 60 pmol m'²s'¹ de Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR). [00242] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Transqênicos. Após o período de Cocultivo, os embriões são transferidos para o Meio de Descanso, o qual é composto de 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO₃; 0.5 g/L de MES (monoidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenicilina; e

2,3 g/L DE GELZAN™; no pH 5,8. Não mais do que 36 embriões são movidos para cada placa. As placas são colocadas em uma caixa de plástico transparente e incubadas a 27 “C com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m'²s'¹ PAR durante 7 a 10 dias. Os embriões de calos são então transferidos (<18/placa) para o Meio de Seleção I, que é composto de Meio de Descanso (acima) com ácido R-Haloxyifop 100 nM (0,0362 mg/L, para seleção de calos que abrigam o gene AAD-1). As placas são devolvidas para as caixas transparentes e incubadas a 27 “C com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m'²s'¹ PAR durante 7 dias. Os embriões de calos são então transferidos (<12/placa) para o Meio de Seleção II, que é composto de Meio de Descanso (acima) com ácido R-Haloxyifop 500 nM (0,181 mg/L). As placas são devolvidas para as caixas transparentes e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m'²s'¹ PAR durante 14 dias.

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Esta etapa seleção permite o calo transgênico prolifere e diferencie ainda mais.

[00243] Os calos proliferativos embriogênicos são transferidos (<9/placa) para o meio de Pré-Regeneração. O Meio de PréRegeneração contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 45 g/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mioinositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO₃; 0,25 g/L de MES; 0.5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 g/L de GELZAN™; e 0,181 mg/L de ácido Haloxyfop; no pH 5,8. As placas são armazenadas em caixas transparentes e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m'²s'¹ PAR durante 7 dias. Os caules em regeneração são então transferidos (<6/placa) para o Meio de Regeneração em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28 O com 16 horas de luz/8 horas de escuro por dia (em aproximadamente 160 pmol m'²s'¹ PAR) durante 14 dias ou até que os brotos e as raízes se desenvolvam. O meio de regeneração contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 60 gm/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3 g/L de goma GELLAN™; e 0,181 mg/L de ácido R-Haloxyfop; no pH 5,8. Pequenos brotos com raízes primárias são então isolados e transferidos para o meio de alongamento sem seleção. O meio de alongamento contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 30 g/L de sacarose; e 3,5 g/L de GELRITE™: no pH 5,8.

[00244] Os brotos de plantas transformados selecionados por sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxyfop são transplantados de PHYTATRAYS™ para pequenos vasos carregados com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), cobertos com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS) e depois

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140/164 endurecidos em uma câmara de crescimento CONVIRON (dia 27 O/noite 24 °C, fotoperíodo de 16 horas, 50 a 70% de HR, 200 pmol m'²s'¹ PAR). Em alguns casos, as plântulas transgênicas putativas são analisadas com relação ao número relativo de cópias do transgene por ensaios quantitativos de PCR em tempo real utilizando iniciadores projetados para detectar o gene de tolerância ao herbicida AAD1 integrado no genoma do milho. Além disso, os ensaios de qPCR do RNA são utilizados para detectar a presença da sequência de ligação em dsRNAs expressos de transformantes putativos. As plântulas transformadas selecionadas são então movidas para uma estufa para crescimento e testes adicionais.

[00245] Transferência e estabelecimento de plantas Tn na estufa para bioensaio e produção de sementes. Quando as plantas atingem o estágio V3-V4, são transplantadas para a mistura do solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e cultivadas até a floração na estufa (Tipo de Exposição à Luz: Foto ou Assimilação, Limite de Luz Elevado: 1200 PAR; duração do dia de 16 horas, 27 °C dia/24 “C noite).

[00246] As plantas a serem utilizadas para bioensaios de insetos são transplantadas de vasos pequenos para TINUS™ 350-4 ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canada;) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após o transplante para ROOTRAINERS®, as plantas são infestadas para o bioensaio.

[00247] As plantas da geração de T| são obtidas mediante a polinização das sedas de plantas transgênicas T_o com o pólen coletado de plantas da linhagem natural de elite não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados, e plantação das sementes resultantes.

Os cruzamentos recíprocos são executados sempre que possível.

EXEMPLO 7: Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transqênico

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141/164 [00248] As análises moleculares (por exemplo, qPCR de RNA) de tecidos de milho são executadas em amostras de folhas e raízes que foram coletadas de plantas cultivadas em estufa nos mesmos dias em que o dano de alimentação de raiz é avaliado.

[00249] Os resultados de ensaios de qPCR de RNA para o Per5 3'UTR são utilizados para validar a expressão de transgenes na forma de grampo de cabelo. (Um nível baixo da deteção de Per5 3'UTR é esperado em plantas de milho não transformadas, visto que geralmente existe expressão do gene Per5 endógeno nos tecidos de milho). Resultados dos ensaios de qPCR de RNA para sequência intermediária entre as sequências de repetição (que é parte integrante para a formação de moléculas na forma de grampo de cabelo de dsRNA) em RNAs expressos são utilizados para validar a presença de transcritos na forma de grampo de cabelo. Os níveis de expressão de RNA transgene são medidos em relação aos níveis de RNA de um gene de milho endógeno.

[00250] As análises de qPCR de DNA para detectar uma parte da região de codificação de AAD1 em gDNA são utilizadas para estimar o número de cópia de inserção de transgene. As amostras para essas análises são coletadas de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados são comparados aos resultados de qPCR de DNA dos ensaios destinados para detectar uma parte de um gene nativo de uma única célula, e eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes prp8) são avançados para estudos adicionais na estufa.

[00251] Adicionalmente, os ensaios de qPCR concebidos para detectar uma parte do gene de resistência à espectinomicina (SpecR·, alojados nos plasmídeos de vetor binário fora do T-DNA) são utilizados para determinar se as plantas transgênicas contêm sequências de cadeia principal plasmídicas integradas externas.

[00252] Nível de expressão do transcrito de RNA: Per 5 3'UTR

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142/164 qPCR. Os eventos celulares de calo ou as plantas transgênicas são analisados por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) da sequência Per 5 3'UTR para determinar o nível de expressão relativa da transcrição na forma de grampo de cabelo de comprimento total, em comparação com o nível de transcrição de um gene interno de milho (por exemplo, GENBANK Accession No. BT069734), que codifica uma proteína semelhante a TIP41 (isto é, um homólogo de milho do GENBANK Accession No. AT4G34270; tendo uma pontuação tBLASTX de 74% de identidade; SEQ ID NO: 62). O RNA é isolado utilizando um kit RNeasy™ 96 (QIAGEN, Valencia, CA). Após a eluição, o RNA total é submetido a um tratamento de DNasel de acordo com o protocolo sugerido pelo kit. O RNA é então quantificado em um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração é normalizada para 25 ng/μΙ. O cDNA de primeiro filamento é preparado utilizando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pi com 5 μΙ de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo é modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 μΙ de oligonucleotídeo T20VN 100 μΜ (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C ou G e N é A, C, G ou T; SEQ ID NO: 63 ) no tubo de 1 ml de mistura de estoque de iniciador aleatório, de modo a preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.

[00253] Após a síntese de cDNA, as amostras são diluídas 1:3 com água livre de nuclease e armazenadas a -20 “C até q ue analisadas.

[00254] Os ensaios de PCR em tempo real separados para Per5 3'UTR e a transcrição semelhante a TIP41 são realizados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em 10 μΙ de volumes de reação. Para o ensaio de Per5 3'UTR, as reações são operadas com Primers P5U76S (F) (SEQ ID NO: 64) e P5U76A

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143/164 (R) (SEQ ID NO: 65) e um ROCHE UNIVERSAL PROBE™ (UPL76; Catalog No. 4889960001; marcado com FAM). Para o ensaio do gene de referência tipo TIP41, iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO: 66) e TlPmxR (SEQ ID NO: 67) e Probe HXTIP (SEQ ID NO: 68) marcados com HEX (hexaclorofluoresceína) são utilizados.

[00255] Todos os ensaios incluem controles negativos de não modelo (apenas mistura). Para as curvas padrão, um teste em branco (água no reservatório fonte) também está incluído na placa de origem para verificar a contaminação cruzada da amostra. As sequências de iniciador e sonda são apresentadas na Tabela 6. As receitas de componentes de reação para a detecção dos vários transcritos são divulgadas na Tabela 7, e as condições das reações de PCR estão resumidas na Tabela 8. O componente fluorescente FAM (6-Carbóxi Fluoresceína Amidita) é ativada em 465 nm e a fluorescência é medida em 510 nm; os valores correspondentes para o componente fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) são 533 nm e 580 nm.

Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeo utilizadas para análises moleculares de níveis de transcrição no milho transgênico.

Alvo	Oligonucleotídeo	Sequência
Per5 3'UTR	P5U76S (F)	TTGTGATGTTGGTGGCGTAT (SEQ ID NO:64)
Per5 3'UTR	P5U76A (R)	TGTTAAATAAAACCCCAAAGATC G (SEQ ID NO:65)
Per5 3'UTR	Roche UPL76 (FAM-Probe)	Roche Diagnostics Catalog Number 488996001**
TIP41	TIPmxF	TGAGGGTAATGCCAACTGGTT (SEQ ID NO:66)
TIP41	TIPmxR	GCAATGTAACCGAGTGTCTCTCA A (SEQ ID NO:67)
TIP41	HXTIP (HEX-Probe)	TTTTTGGCTTAGAGTTGATGGTGT ACTGATGA (SEQ ID NO:68)

*Proteína semelhante a TIP41.

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144/164 **NAv Sequência Não disponível do fornecedor.

Tabela 7. Receitas de reação PCR para detecção da transcrição.

	Per5 3'UTR	Gene semelhante a TIP
Componente	Concentração Final
Tampão Roche	1 X	1X
P5U76S (F)	0,4 pM	0
P5U76A (R)	0,4 pM	0
Roche UPL76 (FAM)	0,2 pM	0
HEXtipZM F	0	0,4 pM
HEXtipZM R	0	0,4 pM
HEXtipZMP (HEX)	0	0,2 pM
cDNA (2,0 pL)	NA	NA
Água	para 10 pL	para 10 pL

Tabela 8. Condições do termociclador para qPCR de RNA.

Per5 3'UTR e Detecção do Gene semelhante a TIP41

Processo	Temp.	Tempo	No. de Ciclos
Ativação do Alvo	95 “C	10 min	1
Desnaturar	95 “C	10 seg	40
Prolongar	60 “C	40 seg
Adquirir FAM ou HEX	72 “C	1 seg
Esfriar	40 “C	10 seg	1

[00256] Os dados são analisados utilizando o software LIGHTCYCLER™ v1.5 através da quantificação relativa utilizando um segundo algoritmo máximo derivado para cálculo de valores Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para as análises de expressão, os valores de expressão são calculados utilizando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que depende da comparação de diferenças de valores Cq entre dois alvos, com o valor base 2 sendo selecionado sob o pressuposto de que, para reações PCR otimizadas, o produto duplica todos os ciclos.

[00257] Tamanho e integridade da transcrição: Ensaio de Northern Blot. Em alguns casos, a caracterização molecular adicional das planPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 155/420

145/164 tas transgênicas é obtida pelo uso da análise de Northern Blot (mancha de RNA) para determinar o tamanho molecular do dsRNA na forma de grampo de cabelo de prp8 em plantas transgênicas que expressam um dsRNA na forma de grampo de cabelo de prp8.

[00258] Todos os materiais e equipamentos são tratados com RNaseZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. As amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos de 2 ml SAFELOCK EPPENDORF, rompidas com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) com três glóbulos de tungstênio em 1 ml de TRIZOL (INVITROGEN) durante 5 minutos, e depois incubadas na temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas durante 10 minutos a 4 “C em 11000 rpm e o sobrenadante é transferido para dentro de um tubo novo de 2 ml SAFELOCK EPPENDORF. Depois 200 μΙ de clorofórmio são adicionados ao homogeneizado, o tubo é misturado por inversão durante 2 a 5 min, incubado na RT durante 10 minutos e centrifugado em 12000 x g durante 15 minutos a 4 “C. A fase supe rior é transferida para um tubo EPPENDORF esterilizado de 1,5 ml, 600 μΙ de isopropanol a 100% são adicionados, seguido de incubação na RT durante 10 minutos a 2 h e depois centrifugado em 12000 x g durante 10 min em 4 “C a 25 “C. O sobrenadante é descartado e o grânu Io de RNA é lavado duas vezes com 1 ml de etanol a 70%, com centrifugação em 7500 x g durante 10 min em 4 “C a 25 Ό entre lavag ens. O etanol é descartado e o grânulo é secado por curto tempo ao ar livre durante 3 a 5 min antes de colocar novamente em suspensão em 50 μΙ de água livre de nuclease.

[00259] O RNA total é quantificado utilizando o NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas em 5 μς/10 μΙ.

μΙ de glioxal (AMBION/INVITROGEN) são então adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura de marcador padrão DIG RNA

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146/164 (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) são distribuídos e adicionados a um volume igual de glioxal. As amostras e os RNAs marcadores são desnaturados a 50 Ό durante 45 min e a rmazenados em gelo até serem carregados em um gel de agarose SEAKEM GOLD a 1,25% (LONZA, Allendale, NJ) no tampão de operação de glioxal NORTHERNMAX 10 X (AMBION/INVITROGEN). Os RNAs são separados por eletroforese em 65 volts/30 mA durante 2 horas e 15 minutos.

[00260] Após a eletroforese, o gel é enxaguado em SSC 2X durante 5 min e formado imagem em uma estação GEL DOC (BIORAD, Hércules, CA), depois o RNA é transferido passivamente para uma membrana de nylon (MILLIPORE) durante a noite na RT, utilizando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste em 3 cloretos de sódio e citrato trissódico 300 mM, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é enxaguada em 2X SSC durante 5 minutos, o RNA é reticulado por UV para a membrana (AGILENT/STRATAGENE), e a membrana é deixada a secar na temperatura ambiente durante até 2 dias.

[00261] A membrana é pré-hibridada no tampão ULTRAHYB™ (AMBION/INVITROGEN) durante 1 a 2 horas. A sonda consiste em um produto amplificado por PCR contendo a sequência de interesse (por exemplo, a parte de sequência antissenso das SEQ ID NOs: 7 a 11, conforme apropriado) marcado com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridação no tampão recomendado é durante a noite em uma temperatura de 60 Ό em tubos de hibridação. Após a hibridação, a mancha é submetida a lavagens DIG, envolvidas, expostas à película durante 1 a 30 minutos, depois a película é desenvolvida, tudo pelos métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.

[00262] Determinação do número de cópias de transgene. Pedaços

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147/164 de folha de milho aproximadamente equivalentes a 2 punções de folha são coletados em placas de coleta de 96 reservatórios (QIAGEN). O rompimento do tecido é executado com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) no tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um BIOSPRINT96 PLANT KIT, QIAGEN) com um glóbulo de aço inoxidável. Após a maceração dos tecidos, o gDNA é isolado em formato de alto rendimento utilizando um BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô de extração BIOSPRINT96. O DNAc é diluído com DNA:água 2:3 antes da configuração da reação qPCR.

[00263] Análise de qPCR. A detecção de transgene através do ensaio de sonda de hidrólise é executada por PCR em tempo real utilizando um sistema LIGHTCYCLER®480. Os oligonucleotídeos a serem utilizados em ensaios de sonda de hidrólise para detectar a sequência de conexão, ou para detectar uma parte do gene SpecR (isto é, o gene de resistência à espectinomicina possui ligação com os plasmídeos do vetor binário; SEQ ID NO: 69; oligonucleotídeos SPC1 na Tabela 9) são projetados utilizando LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Além disso, os oligonucleotídeos a serem utilizados em ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância ao herbicida AAD-1 (SEQ ID NO: 70; oligonucleotídeos GAAD1 na Tabela 9) são concebidos utilizando o software PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e sondas. Os ensaios são multiplexados com reagentes para um gene cromossômico de milho endógeno (Invertase (SEQ ID NO: 71; GENBANK Accession No: U16123; aqui referido como IVR1), que serve como uma sequência de referência interna para garantir que o gDNA esteja presente em cada ensaio. Para amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) é preparada em uma concentração final de 1x em

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148/164 uma reação multiplex de volume de 10 μΙ contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação de duas etapas é executada como descrito na Tabela 11. A ativação e a emissão de fluoróforo para as sondas marcadas com FAM e HEX são como descritas acima; os conjugados CY5 são ativados no máximo em 650 nm e fluorescem no máximo em 670 nm.

[00264] As pontuações de Cp (o ponto em que o sinal de fluorescência cruza o limiar em segundo plano) são determinadas a partir dos dados de PCR em tempo real utilizando o algoritmo de pontos de ajuste (LIGHTCYCLER® SOFTWARE versão 1.5) e o módulo Relative Quant (com base no método AACt). Os dados são manipulados conforme descrito anteriormente (acima; qPCR de RNA).

Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) utilizadas para determinações de números de cópias de genes e detecção da cadeia principal de plasmídeo de vetor binário.

Nome	Sequência
GAAD1-F	TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (SEQ ID NO: 72)
GAAD1-R	CAACATCCATCACCTTGACTGA (SEQ ID NO: 73)
GAAD1-P (FAM)	CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA (SEQ ID NO: 74)
IVR1-F	TGGCGGACGACGACTTGT (SEQ ID NO: 75)
IVR1-R	AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (SEQ ID NO: 76)
IVR1-P (HEX)	CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC (SEQ ID NO: 77)
SPC1A	CTTAGCTGGATAACGCCAC (SEQ ID NO: 78)
SPC1S	GACCGTAAGGCTTGATGAA (SEQ ID NO: 79)
TQSPEC (CY5*)	CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA (SEQ ID NO: 80)
ST-LS1- F	GTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGAT (SEQ ID NO: 81)
ST-LS1- R	CCATGTTTTGGTCATATATTAGAAAAGTT (SEQ ID NO: 82)

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Nome	Sequência
ST-LS1-P	AGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAAT
(FAM)	(SEQ ID NO: 83)

CY5 = Cianina-5

Tabela 10. Componentes de reação para análise do número de cópias de genes e detecção da cadeia principal do plasmídeo.

Componente	Amt. (pL)	Estoque	Cone. Final
2x Tampão	5,0	2x	1χ
Iniciador Direto Apropriado	0,4	10 μΜ	0,4
Iniciador Reverso Apropriado	0,4	10 μΜ	0,4
Sonda Apropriada	0,4	5 μΜ	0,2
IVR1-Iniciador Direto	0,4	10 μΜ	0,4
IVR1-Iniciador Reverso	0,4	10 μΜ	0,4
IVR1-Sonda	0,4	5 μΜ	0,2
H2O	0,6	ΝΑ*	ΝΑ
gDNA	2,0	ND**	ND
Total	10,0

*NA = Não aplicável **ND = Não Determinado

Tabela 11. Condições do termociclador para qPCR de DNA.

Análises do número de cópias genômicas
Processo	Temp.	Tempo	No. de Ciclos
Ativação do Alvo	95 “C	10 min	1
Desnaturar	95 “C	10 seg	40
Prolongar & Adquirir FAM, HEX, ou CY5	60 “C	40 seg
Esfriar	40 “C	10 seg	1

EXEMPLO 8: Bioensaio de milho transgênico [00265] Bioensaios de inseto. A bioatividade do dsRNA da invenção em questão produzida em células vegetais é demonstrada por métodos de bioensaio. Vera, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25 (11):1322-1326. Um método é capaz de demonstrar eficáPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 160/420

150/164 cia, por exemplo, através da alimentação de vários tecidos vegetais ou pedaços de tecido derivados de uma planta que produz um dsRNA inseticida para insetos alvo em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados de vários tecidos vegetais derivados de uma planta que produz o dsRNA inseticida, e os ácidos nucleicos extraídos são distribuídos em cima das dietas artificiais para bioensaios como aqui descrito anteriormente. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com bioensaios realizados de forma semelhante que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida ou em outras amostras de controle. O crescimento e a sobrevivência de insetos alvo na dieta de teste são reduzidos em comparação com o grupo controle.

[00266] Bioensaios de Inseto com Eventos de Milho Transqênico. Duas larvas de verme da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) incubadas com ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada reservatório da bandeja de bioensaio. Os reservatórios são então cobertos com uma tampa etiquetada PULL Ν' PEEL (BIO-CV-16, BIOSERV) e colocados em uma incubadora a 28 Ό com um ciclo de luz/escuridão de 18 h/6 h. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, que é calculada como a porcentagem de insetos mortos a partir do número total de insetos em cada tratamento. As amostras de insetos são congeladas a -20 Ό durante dois dias, depois as larvas de inseto de cada tratamento são reunidas e pesadas. A porcentagem de inibição do crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais, dividido pela média do peso médio de dois tratamentos de reservatório de controle. Os dados são expressos como uma Inibição de Crescimento Percentual (dos controles negativos). Os pesos médios que excedem o peso médio de controle são normalizados para zero.

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151/164 [00267] Bioensaios de insetos na estufa. Os ovos da larva da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) são recebidos no solo de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Os ovos DE WCR são incubados a 28 Ό durante 10 a 1 1 dias. Os ovos são lavados do solo, colocados em uma solução de ágar a 0,15% e a concentração é ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 ml. Uma placa de incubação é configurada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovos para monitorar as taxas de incubação.

[00268] O solo ao redor das plantas de milho que crescem em ROOTRANERS® é infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos podem se alimentar durante 2 semanas, após o que uma Av aliação da Rais é dada a cada planta. Uma Escala de Nó-Lesão é utilizada para graduação, essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8. As plantas que passam este bioensaio, apresentando lesões reduzidas, são transplantadas para vasos de 5 galões para a produção de sementes. Os transplantes são tratados com inseticida para evitar mais danos pela larva da raiz e liberação de insetos nas estufas. As plantas são polinizadas à mão para a produção de sementes. As sementes produzidas por essas plantas são guardadas para avaliação em T| e nas subsequentes gerações de plantas.

[00269] Os bioensaios de estufa incluem dois tipos de plantas de controle negativo. As plantas de controle negativo transgênicas são geradas através da transformação com vetores que abrigam genes projetados para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP) ou um dsRNA na forma de grampo de cabelo de YFP (Ver o EXEMPLO 4). As plantas de controle negativo não transformadas são cultivadas a partir de sementes de variedades de milho de origem, das quais as plantas transgênicas foram produzidas. Os bioensaios são conduzidos em duas datas separadas, com controles negativos incluídos em cada

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152/164 conjunto de matérias vegetais.

EXEMPLO 9: Zea mays Transqênica compreendendo as Sequências de Pragas de Coleópteros [00270] 10 a 20 plantas T_o Zea mays transgênicas são geradas como descrito no EXEMPLO 6. Mais 10 a 20 linhagens independentes de Zea mays Ti que expressam o dsRNA na forma de grampo de cabelo para uma construção de RNAi são obtidas para o desafio da larva da raiz do milho. O dsRNA na forma de grampo de cabelo compreende uma parte da SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3. Os dsRNAs na forma de grampo de cabelo adicionais são derivados, por exemplo, de sequências de pragas de coleópteros tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811), RNA polimerase 11 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.214), RNA poiymerase 11140 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854), RNA polimerase 11215 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.202), RNA polimerase 1133 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.210), fator de alongamento da transcrição spt5 (Pedido de Patente U.S. No. 62/168.613), fator de alongamento da transcrição spt6 (Pedido de Patente U.S. No. 62/168.606), nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095487), dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), COPI alfa (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), e COPI delta (Pedido de PatenPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 163/420

153/164 te U.S. No. 62/063.216). Estes são confirmados através da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular.

[00271] As preparações de RNA totais a partir das linhagens de T1 independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RTPCR com iniciadores concebidos para se ligar no conector do cassete de expressão na forma de grampo de cabelo em cada uma das construções de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada genealvo em uma construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA na forma de grampo de cabelo em cada planta transgênica de Zea mays. O processamento do pino de dsRNA na forma de grampo de cabelo dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente de modo opcional confirmado nas linhagens transgênicas independentes utilizando hibridizações da mancha de RNA.

[00272] Além do mais, as moléculas de RNAi que possuem sequências de má combinação com mais de 80% de identidade de sequência com os genes-alvo afetam as larvas da raiz do milho de uma forma semelhante àquela observada com moléculas de RNAi tendo 100% de identidade de sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência mal combinada com as sequências nativas para formar um dsRNA na forma de grampo de cabelo na mesma construção de RNAi libera os siRNAs processados na planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade da alimentação de pragas de coleópteros.

[00273] Na liberação in planta de dsRNA, RNAsi ou miRNA correspondentes aos genes-alvo e a subsequente absorção por pragas de coleópteros através da alimentação resulta na infrarregulação dos genes-alvo na praga de coleópteros por meio de silenciamento de genes

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154/164 mediados pelo RNA. Quando a função de um gene-alvo é importante em um ou mais estádios de desenvolvimento, o crescimento e/ou o desenvolvimento da praga de coleópteros são afetados e no caso de pelo menos uma de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. speciosa Germar, D. u. tenella e D. u. Undecimpunctata Mannerheim, leva à falta de infestação, alimentação e/ou desenvolvimento bem sucedido, ou leva à morte da praga de coleópteros. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então utilizadas para controlar as pragas de coleópteros.

[00274] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays não transformadas. Os genes ou sequências de pragas de coleópteros alvo selecionados para criar dsRNA na forma de grampo de cabelo não possuem semelhança com qualquer sequência conhecida do gene da planta. Portanto, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) através de construções que direcionam esses genes ou sequências de pragas de coleópteros tenha qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com as plantas não transformadas, assim como aquelas linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio não tendo nenhum gene que expressa a forma de grampo de cabelo. As características de raiz, broto, folhagem e reprodução da planta são comparadas. Não existe nenhuma diferença observável no comprimento da raiz e padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto da planta tais como altura, número e tamanho das folhas, tempo de floração, tamanho floral e aparência são similares. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológicas observáveis entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

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EXEMPLO 10: Zea mays Transgênicas compreendendo uma Sequência de Praga de Coleópteros e Construções de RNAi Adicionais [00275] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona um organismo diferente de uma praga de coleópteros é transformada secundariamente através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene que compreende a SEQ ID NO: 1 e/ou a SEQ ID NO: 3). Os vetores plasmídicos de transformação de plantas preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados através de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ nas células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta transgênica Hi II ou B104 Zea mays que compreende uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona um organismo diferente de uma praga de coleópteros.

EXEMPLO 11: Zea mays Transgênica gue compreende uma Construção de RNAi e Seguências de Controle de Pragas de Coleópteros Adicionais [00276] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona um organismo de praga de coleópteros (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNAn incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene que compreende a SEQ ID NO: 1 e/ou a SEQ ID NO: 3) é transformada secundariamente através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 166/420

156/164 zir uma ou mais moléculas de proteína inseticidas, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3, Cry34 e Cry35. Os vetores de plasmídeo de transformação de plantas preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados através de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ nas células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta transgênica de Zea mays B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que direciona um organismo de praga de coleópteros. Plantas duplamente transformadas são obtidas que produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de pragas de coleópteros.

EXEMPLO 12: Transcriptoma do Besouro de Pólen [00277] Insetos. As larvas e os besouros de pólen adultos foram coletados de campos com plantas de colza em floração (Giessen, Germany). Os besouros adultos jovens (cada um por grupo de tratamento: n = 20; 3 repetições) foram desafiados pela injeção de uma mistura de duas bactérias diferentes (Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa), uma levedura (Saccharomyces cerevisiae) e LPS bacteriana. As culturas bacterianas cresceram a 37 Ό com agitação e a densidade ótica foi monitorada em 600 nm (OD600). As células foram colhidas em OD600 ~1 por centrifugação e colocadas novamente em suspensão em solução de salina tamponada com fosfato. A mistura foi introduzida ventrolateralmente, picando o abdômen de imago de besouro de pólen utilizando uma agulha de dissecação embebida em uma solução aquosa de LPS de 10 mg/ml (endotoxina purificada de E. coli, SIGMA, Taufkirchen, Germany) e as culturas bacterianas e de levedura. Juntamente com os besouros imuno desafiados, os besouros não experimentados e as larvas foram coletados (n = 20 por e 3 repetições cada) no mesmo instante.

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157/164 [00278] Isolamento de RNA. O RNA total foi extraído 8 h após a imunização de besouros e larvas congelados utilizando TriReagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) e purificado utilizando o RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany) em cada caso seguindo as diretrizes do fabricante. A integridade do RNA foi verificada utilizando um Agilent 2100 Bioanalyzer e um RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Paio Alto, CA, USA). A quantidade de RNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000. O RNA foi extraído de cada um dos grupos de tratamento induzidos por adultos imunes, grupos de controle de adultos e grupos larvais individualmente e quantidades iguais de RNA total foram subsequentemente combinadas em um grupo por amostra (adultos com imunidade desafiada, adultos e larvas controle) para sequenciamento.

[00279] Informações de transcriptoma. A geração e montagem de dados RNA-Seq Single-read 100-pb RNA-Seq foram realizadas separadamente em 5 pg de RNA total isolados de besouros adultos imuno desafiados, besouros adultos não experimentados (controle) e larvas não tratadas. O sequenciamento foi realizado por EUROFINS MWG Operon utilizando a plataforma lllumina HiSeq-2000. Isso produziu 20,8 milhões de leituras para a amostra de besouro de controle adulto, 21,5 milhões de leituras para a amostra de besouro adulto desafiado pelo LPS e 25,1 milhões de leituras para a amostra larval. As leituras agrupadas (67,5 milhões) foram montadas utilizando o software de montagem de Velvet/Oases (Schulz et al. (2012) Bioinformatics. 28:1086-92; Zerbino and Birney (2008) Genome Res. 18:821-9). O transcriptoma continha 55.648 sequências.

[00280] Identificação de prp8 do besouro de pólen. Uma pesquisa tblastn do transcriptoma foi utilizada para identificar os contigs correspondentes. Como uma consulta, a sequência de peptídeo de prp8 de

Drosophila foi utilizada (Genbank NP 652610).

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EXEMPLO 13: Mortalidade do Besouro de Pólen após o tratamento com iRNA de prp8 [00281] Os iniciadores específicos de genes incluindo a sequência promotora da polimerase T7 na extremidade 5' foram utilizados para criar produtos da PCR de aproximadamente 424 pb por PCR (SEQ ID NO: 12). Os fragmentos de PCR foram clonados no vetor natural pGEM T de acordo com o protocolo do fabricante e enviados para uma empresa de sequenciamento para verificar a sequência. O dsRNA foi então produzido pela RNA polimerase T7 (MEGAscript® RNAi Kit, Applied Biosystems) a partir de uma construção de PCR gerada a partir do plasmídeo sequenciado de acordo com o protocolo do fabricante.

[00282] A injeção de ~100 nL de dsRNA (1 pg/ul) em besouros adultos foi executada com um micromanipulador sob um estereomicroscópio dissecante (n = 10, 3 repetições biológicas). Os animais foram anestesiados no gelo antes de serem afixados em fita adesiva dupla. Os controles receberam o mesmo volume de água. Todos os controles em todos os estágios não podem ser testados devido à falta de animais. Os controles foram executados em uma data diferente devido à disponibilidade limitada de insetos. Os besouros de pólen foram mantidos em placas de Petri com pólen seco e um tecido úmido.

Tabela 12. Resultados do bioensaio de injecção de besouro de pólen adulto de M. aeneus (Porcentagem da média de sobrevivência ± desvio padrão (SD), n = 3 grupos de 10).

Tratamento	% Média de Sobrevivência ± SD
DiaO	Dia 2	Dia 4	Dia 6	Dia 8
prp8	100 ±0	100 ±0	100 ±0	97 ±6	77 ±32
Controle	100 ±0	100 ±0	100 ±0	100 ±0	93 ±6
	Dia 10	Dia 12	Dia 14	Dia 16
prp8	73 ±29	43 ±25	37 ±29	23 ± 15
Controle	93 ±6	83 ±6	80 ±0	67 ±6

Ό0283] Bioensaio de Alimentação: Os besouros foram mantidos

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159/164 sem acesso à água em tubos falcon vazios 24 h antes do tratamento. Uma gotícula de dsRNA (~ 5 μΙ) foi colocada em uma pequena placa de Petri e 5 a 8 besouros foram adicionados à placa de Petri. Os animais foram observados sob um estereomicroscópio, e aqueles que ingeriram a solução de dieta contendo dsRNA foram selecionados para o bioensaio. Os besouros foram transferidos para placas de petri com pólen seco e um tecido úmido. Os controles receberam o mesmo volume de água. Todos os controles em todas os esstágios não puderam ser testados devido à falta de animais. Os controles foram executados em uma data diferente devido à disponibilidade limitada de insetos.

Tabela 13. Resultados do bioensaio de alimentação de adultos de M. aeneus (Porcentagem da média de sobrevivência ± desvio padrão (SD), n = 3 grupos de 10).

Tratamento	% Média de Sobrevivência ± SD
DiaO	Dia 2	Dia 4	Dia 6	Dia 8
prp8	100 ±0	100 ±0	100 ±0	97 ±6	87 ±15
Controle	100 ±0	100 ±0	100 ±0	90 ±10	87 ± 12
	Dia 10	Dia 12	Dia 14	Dia 16
prp8	73 ±15	60 ±10	53 ±15	47 ±21
Controle	87 ± 12	87 ± 12	87 ± 12	87 ± 12

Tabela 14. Resultados do bioensaio de alimentação de adultos de M. aeneus (Porcentagem da média de sobrevivência ± desvio padrão (SD), n = 3 grupos de 10).

Tratamento	% Média de Sobrevivência ± SD
DiaO	Dia 2	Dia 4	Dia 6	Dia 8
prp8	100 ±0	97 ±6	97 ±6	93 ±6	93 ±6
Controle	100 ±0	100 ±0	97 ±6	97 ±6	97 ±6
	Dia 10	Dia 12	Dia 14	Dia 16
prp8	90 ±10	77 ±21	77 ±21	73 ±23
Controle	97 ±6	90 ±0	90 ±0	90 ±0

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EXEMPLO 14: Transformação mediada oov Agrobacterium de Hipocótilo de Canola [00284] Preparação de Agrobacterium. A cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo binário é estriada em placas de meio YEP (Bacto Peptone™ 20,0 g/L e Extração de Levedura 10,0 g/L) contendo estreptomicina (100 mg/ml) e espectinomicina (50 mg / ml) e incubada durante 2 dias a 28 Ό. A cepa de Agrobacterium propagada contendo o plasmídeo binário é estriada da placa de estrias de 2 dias utilizando um circuito de inoculação estéril. A cepa de Agrobacterium raspada que contém o plasmídeo binário é então inoculada em 150 ml de líquido de YEP modificado com estreptomicina (100 mg/ml) e espectinomicina (50 mg/ml) no balão defletor estéril de 500 ml e agitada em 200 rpm a 28 Ό. As culturas são centrifugadas e coloca das novamente em suspensão em meio M (sais de LS, 3% de glicose, vitaminas B5 modificadas, cinetina 1 μΜ, 2,4-D 1 μΜ, pH 5,8) e diluídas na densidade apropriada (50 Klett Units conforme medido utilizando um espectrofotômetro) antes da transformação de hipocótilos de canola.

[00285] Transformação de Canola. Germinação de sementes: As sementes de canola (var. NEXERA 710™) são esterilizadas na superfície em Clorox™ 10% durante 10 minutos e enxaguadas três vezes com água destilada estéril (as sementes são contidas em coadores de aço durante este processo). As sementes são plantadas para germinação em % de meio de canola MS (1/2 MS, 2% de sacarose, 0,8% de ágar) contidos em Phytatrays™ (25 sementes por Phytatray™) e colocadas em uma câmara de crescimento Percival™ com um regime de crescimento estabelecido a 25 °C, fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro durante 5 dias de germinação.

[00286] Pré-tratamento: No dia 5, segmentos de hipocótilo de cerca de 3 mm de comprimento são cortados assepticamente, as seções de raiz e broto remanescentes são descartadas (secagem de segmentos

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161/164 de hipocótilo é evitada pela imersão dos segmentos de hipocótilo em 10 ml de água estéril miliQ™ durante o processo de corte). Os segmentos de hipocótilo são colocados horizontalmente em papel de filtro estéril em meio de indução de calo, MSK1D1 (MS, 1 mg/L de cinetina, 1 mg/L de 2,4-D, 3,0% de sacarose, 0,7% de fitoágar) durante 3 dias de pré-tratamento em uma câmara de crescimento Percival™ com regime de crescimento ajustado entre 22 a 23 Ό e um fotoperíodo de 16 horas de luz, 8 horas de escuro.

[00287] Cocultivo com Agrobacterium·. O dia anterior ao cocultivo de Agrobacterium, frascos de meio de YEP contendo os antibióticos apropriados, são inoculados com a cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo binário. Os segmentos de hipocótilo são transferidos do meio de indução de calo do papel de filtro, MSK1D1, para um disco de Petri™ vazio de 100 x 25 mm contendo 10 ml de meio M líquido para evitar que os segmentos de hipocótilo se sequem. Uma espátula é utilizada neste estágio para colher os segmentos e transferir os segmentos para um novo meio. O meio M líquido é removido com uma pipeta e 40 ml de suspensão de Agrobacterium são adicionados à placa de Petri™ (500 segmentos com 40 ml de solução de Agrobacterium). Os segmentos de hipocótilo são tratados durante 30 minutos com o turbilhão periódico da placa de Petri™, de modo que os segmentos de hipocótilo permanecem imersos na solução de Agrobacterium. No final do período de tratamento, a solução de Agrobacterium é pipetada para um copo de béquer de resíduos; autoclavada e descartada (a solução de Agrobacterium é completamente removida para evitar o excesso de crescimento de Agrobacterium). Os hipocótilos tratados são transferidos com fórceps de volta para as placas originais contendo meios MSK1D1 sobrepostos com papel de filtro (cuidado é tomado para garantir que os segmentos não sequem). Os segmentos de hipocótilo transformados e os segmentos de hipocótilo de controle não transforPetição 870170102415, de 27/12/2017, pág. 172/420

162/164 mados são devolvidos à câmara de crescimento Percival™ sob intensidade de luz reduzida (cobrindo as placas com folha de alumínio), e os segmentos de hipocótilo tratados são cocultivados com Agrobacterium durante 3 dias.

[00288] Indução de Calo no meio de seleção: Após 3 dias de cocultivo, os segmentos de hipocótilo são transferidos individualmente com fórceps para o meio de indução de calo, MSK1D1H1 (MS, 1 mg/l de cinetina, 1 mg/l de 2,4-D, 0,5 mg/l de MES, 5 mg/l de AgNO₃, 300 mg/l de Timentin™, 200 mg/l de carbenicilina, 1 mg/l de Herbiace™, sacarose a 3%, fitoágar a 0,7%) com um regime de crescimento estabelecido em 22 a 26 °C. Os segmentos de hipocótilo são ancorados no meio, mas não estão profundamente encaixados no meio.

[00289] Seleção e regeneração do broto: Após 7 dias no meio de indução de calo, os segmentos de hipocótilo de calo são transferidos para o meio de regeneração de broto 1 com seleção, MSB3Z1H1 (MS, 3 mg/L de BAP, 1 mg/L de zeatina, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgNO₃, 300 mg/L de Timentin™, 200 mg/L de carbenicilina, 1 mg/L de Herbiace™, sacarose a 3%, fitoágar a 0,7%). Após 14 dias, os segmentos de hipocótilo que desenvolvem brotos são transferidos para o Meio de Regeneração 2 com seleção aumentada, MSB3Z1H3 (MS, 3 mg/L de BAP, 1 mg/L de Zeatina, 0,5 gm/L de MES, 5 mg/L de AgNO₃, 300 mg/l de Timentin™, 200 mg/L de carbenicilina, 3 mg/L de Herbiace™, sacarose a 3%, fitoágar a 0,7%) com regime de crescimento estabelecido entre 22 a 26 °C.

[00290] Alongamento do broto: Após 14 dias, os segmentos de hipocótilo que desenvolvem brotos são transferidos do Meio de Regeneração 2 para o meio de alongamento de broto, MSMESH5 (MS, 300 mg/L de Timentin™, 5 mg/l de Herbiace™, sacarose a 2%, TC Agar a

0,7%) com regime de crescimento estabelecido em 22 a 26 °C. Os brotos que já foram alongados são isolados dos segmentos de hipocótilo

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163/164 e transferidos para MSMESH5. Após 14 dias, os brotos remanescentes que não se alongaram na primeira rodada de cultivo no meio de alongamento de broto são transferidos para o meio de alongamento de broto, MSMESH5. Neste estágio, todos os segmentos de hipocótilo remanescentes que não produzem brotos são descartados.

[00291] Indução da raiz: Após 14 dias de cultivo no meio de alongamento de broto, os brotos isolados são transferidos para o meio MSMEST (MS, 0,5 g/L de MES, 300 mg/L de Timentin™, sacarose a 2%, TC Agar a 0,7%) para indução de raiz em 22 a 26 “C. Todos os brotos que não produzem raízes após a incubação na primeira transferência para o meio MSMEST são transferidos para uma segunda ou terceira rodada de incubação em meio MSMEST até que os brotos desenvolvam raízes.

EXEMPLO 15: dsRNA de prp8 no Maneio de Insetos [00292] Os transgenes de dsRNA de prp8 são combinados com outras moléculas de dsRNA em plantas transgênicas para fornecer efeitos de direcionamento de RNAi redundantes e de RNAi sinérgicos. As plantas transgênicas incluindo, por exemplo, e sem limitação, milho, soja e algodão que expressam o dsRNA que direciona prp8 são úteis para prevenir danos de alimentação por insetos coleópteros. Os transgenes de dsRNA de prp8 também são combinados em plantas com a tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis para representar novos modos de ação nas pirâmides de genes de Gerenciamento de Resistência a Insetos. Quando combinado com outras moléculas de dsRNA que direcionam as pragas de inseto e/ou com proteínas inseticidas em plantas transgênicas, um efeito inseticida sinérgico é observado que também suaviza o desenvolvimento de populações de insetos resistentes.

[00293] Embora a presente divulgação possa ser suscetível a várias modificações e formas alternativas, as modalidades específicas foram

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164/164 descritas a título de exemplo com detalhes neste documento. No entanto, deve ficar entendido que a presente divulgação não se destina a ser limitada pelas formas particulares divulgadas. Em vez disso, a presente divulgação cobre todas as modificações, equivalentes e alternativas que se enquadram no escopo da presente divulgação conforme definido pelas seguintes reivindicações anexas e seus equivalentes legais.

Claims (57)

1. Molécula de ácido nucleico isolada que compreende pelo menos um polinucleotídeo ligado de modo operável a um promotor heterólogo, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em:

SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes que compreende a SEQ ID NO: 12.

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12 e os complementos do anterior.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula é um vetor.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o organismo é selecionado do grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith and Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella;

D. u. undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; e Meligethes aeneus Fabricius (Besouro do Pólen).

5. Molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada pela

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2/11 molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de RNA compreende um polirribonucleotídeo codificado pelo polinucleotídeo.

6. Molécula de RNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a molécula é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA).

7. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o contato da molécula com uma praga de coleópteros inibe a expressão de uma molécula de ácido nucleico endógeno que é especificamente complementar ao polirribonucleotídeo.

8. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da molécula com a praga de coleópteros mata ou inibe o crescimento e/ou a alimentação da praga.

9. Molécula de dsRNA como definida na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro polirribonucleotídeos, em que o primeiro polirribonucleotídeo é codificado pela sequência de nucleotídeos, em que o terceiro polirribonucleotídeo é ligado ao primeiro polirribonucleotídeo pelo segundo polirribonucleotídeo e em que o terceiro polirribonucleotídeo é substancialmente o complemento reverso do primeiro polirribonucleotídeo, de tal modo que o primeiro e o terceiro polirribonucleotídeos hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o dsRNA.

10. Molécula de RNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento único entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.

11. Vetor como definido na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula ve-

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3/11 getal, e em que o vetor é um vetor de transformação da planta.

12. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

13. Célula de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula procariótica.

14. Célula de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.

15. Célula de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula vegetal.

16. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende a célula vegetal como definida na reivindicação 15.

17. Parte da planta como definida na reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a parte da planta compreende a célula vegetal.

18. Parte da planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a parte da planta é uma semente.

19. Produto alimentar ou produto de consumo produzido a partir da planta como definida na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o produto compreende uma quantidade detectável da molécula de ácido nucleico.

20. Planta de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que uma célula da planta compreende uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) codificada pelo polinucleotídeo.

21. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de Zea mays, Brassica sp. ou Poaceae.

22. Planta de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a planta é Zea mays, Brassica sp., ou uma planta da família Poaceae.

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23. Planta de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a molécula de dsRNA inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar ao polirribonucleotídeo quando uma praga de coleópteros ingere uma parte da planta.

24. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos um polinucleotídeo adicional ligado de modo operável a um promotor heterólogo, em que o polinucleotídeo adicional codifica uma molécula de RNA.

25. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal, e em que a molécula é um vetor de transformação da planta.

26. Método para o controle de uma população de praga de inseto, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona após o contato com a praga do inseto para inibir uma função biológica dentro da praga, em que o RNA é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 91 e 92; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91 e 92; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91 e 92; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91 e 92; uma transcrição da SEQ ID NO: 5; e o complemento de uma transcrição da SEQ ID NO: 5.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA).

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracteriza-

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5/11 do pelo fato de que o fornecimento do agente compreende o contato da praga de inseto com uma composição pulverizável compreendendo o agente.

29. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o fornecimento do agente compreende a alimentação de uma célula vegetal compreendendo a molécula de RNA pela praga do inseto.

30. Método para o controle de uma população de praga de coleópteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer um agente que compreende um primeiro e um segundo polirribonucleotídeo que funciona após o contato com a praga de coleópteros para inibir uma função biológica dentro da praga de coleópteros, em que o primeiro polirribonucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo tendo de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência para cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de um polirribonucleotídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 91 e 92, e em que o primeiro polirribonucleotídeo é especificamente hibridado com o segundo polirribonucleotídeo.

31. Método para o controle de uma população de praga de coleópteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer em uma planta hospedeira de uma praga de coleópteros uma célula vegetal que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico (dsRNA) que funciona após o contato com uma praga de coleópteros pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga de coleópteros e resulta em crescimento e/ou sobrevivência diminuídos da praga ou população de praga de coleópteros, em relação ao desenvolvimento das mesmas espécies de praga em uma planta da mesma espécie de planta hospedeira que não compreende o

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6/11 polinucleotídeo.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a população de praga de coleópteros é reduzida em relação a uma população da mesma espécie de praga que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie de planta hospedeira que carece de uma célula vegetal que compreende a molécula de ácido nucleico.

33. Método de controle de uma infestação de praga de coleópteros em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer na dieta de uma praga de coleópteros que infesta a planta uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polirribonucleotídeo selecionado do grupo que consiste em:

SEQ ID NO: 91 e 92;

o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91 e 92;

um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91 e 92;

o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91 e 92;

uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 5;

o complemento de uma transcrição de qualquer uma da SEQ ID NO: 5;

um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 5.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula vegetal que compreende um polinucleotídeo que é transcrito para expressar o polirribonucleotídeo.

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35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA).

36. Método para melhorar o rendimento de uma cultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

cultivar na cultura uma planta que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, para permitir a expressão do polinucleotídeo.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a planta é Zea mays, Brassica sp., ou uma planta da família Poaceae.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a expressão do polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime um gene-alvo em uma praga de coleópteros que colocou em contato uma parte da planta, inibindo assim o desenvolvimento ou o crescimento da praga de coleópteros e perda de rendimento devido à infecção pela praga de coleópteros.

39. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

transformar uma célula vegetal com o vetor de transformação de planta como definido na reivindicação 12;

cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas;

selecionar as células vegetais transformadas que integraram o polinucleotídeo em seus genomas;

submeter à triagem as células vegetais transformadas para expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada pelo polinucleotídeo; e

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8/11 selecionar uma célula vegetal que expressa o RNA.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo.

41. Método para produzir uma planta transgênica resistente a pragas de coleópteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

regenerar uma planta transgênica de uma célula vegetal transgênica compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, em que a expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada pelo polinucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo na praga de coleópteros quando entra em contato com a molécula de RNA.

42. Método para a produção de uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio para fornecer proteção de pragas Diabrotica mediada por prp8 a uma planta;

cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas;

selecionar as células vegetais transformadas que integraram os meios para fornecer proteção de pragas Diabrotica mediada por prp8 a uma planta em seus genomas;

submeter à triagem as células vegetais transformadas para a expressão de um meio para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica; e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica.

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43. Método para a produção de uma planta transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

regenerar uma planta transgênica da célula vegetal transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 42, em que as células vegetais da planta compreendem os meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica é suficiente para modular a expressão de um gene prp8 alvo em uma praga Diabrotica que infesta a planta transgênica.

45. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga Diabrotica.

46. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio para fornecer proteção de pragas de Meligethes mediada por prp8 a uma planta;

cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas;

selecionar células vegetais transformadas que integram os meios para fornecer proteção de pragas de Meligethes mediada por prp8 a uma planta em seus genomas;

submeter à triagem as células vegetais transformadas para a expressão de um meio para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga de Meligethes·, e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios para

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10/11 inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga de Meligethes.

47. Método para produzir uma planta transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 46, em que as células vegetais da planta compreendem os meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga de Meligethes.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga de Meligethes é suficiente para modular a expressão de um gene prp8 alvo em uma praga de Meligethes que infesta a planta transgênica.

49. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende meios para inibir a expressão de um gene prp8 em uma praga de Meligethes.

50. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo inseticida de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp. ou Pseudomonas spp.

51. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo inseticida é selecionado do grupo de polipeptídeos inseticidas de B. thuringiensis consistindo em Cry1B, Cry11, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1AeCyt2C.

52. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo inseticida de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp. ou Pseudomonas spp.

53. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 52, carac-

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11/11 terizada pelo fato de que o polipeptídeo inseticida é selecionado do grupo de polipeptídeos inseticidas de B. thuringiensis que consiste em Cry1B, Cry11, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, CytlAe Cyt2C.

54. Planta de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que uma célula da planta compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo inseticida de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp. ou Pseudomonas spp.

55. Planta de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo inseticida é selecionado do grupo de polipeptídeos inseticidas de B. thuringiensis que consiste em Cry1B, Cry11, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, CytlAe Cyt2C.

56. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo inseticida de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp. ou Pseudomonas spp.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo inseticida é selecionado do grupo de polipeptídeos inseticidas de B. thuringiensis que consiste em Cry1B, Cry11, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, CytlAe Cyt2C.