BRPI1107330B1 - métodos para o controle de uma população de praga coleóptera - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nu- cleicos e a métodos de uso das mesmas para o controle de pragas coleópteras mediante inibição mediada por interferência de rna de sequências codificadoras alvo e não codificadoras transcritas em pra- gas coleópteras. a exposição também se refere a métodos para a pre- paração de plantas transgênicas que expressem moléculas de ácidos nucleicos úteis para o controle de pragas coleópteras e às células ve- getais e plantas assim obtidas.

Description

CAMPO DA EXPOSIÇÃO [001] A presente invenção refere-se genericamente ao controle genético de danos em plantas causados por pragas coleópteras. Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de sequências codificadoras e não codificadoras alvo e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para a repressão ou inibição póstranscricional da expressão de sequências codificadoras e não codificadoras alvo nas células de uma praga coleóptera para conferir um efeito protetor à planta.

ANTECEDENTES [002] O crisomelídeo do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de crisomelídeos do milho mais devastadoras na América do Norte e é particularmente uma preocupação em áreas de cultivo de milho no meio-oeste americano. O crisomelídeo do milho do norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie intimamente relacionada que coabita muito do mesmo território que o WCR. Há várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas na America do Norte: o crisomelídeo do milho mexicano (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; o crisomelídeo do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento Norte-americano de Agricultura estima atualmente que os crisomelídeos do milho causem uma perda de receitas de 1 bilhão de dólares por ano, incluindo 800 milhões de dólares em perdas de rendimentos e 200 milhões de dólares em custos de tratamento.

[003] Tanto o WCR, quanto o NCR são depositados no solo co

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2/146 mo ovos durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante todo o inverno. Os ovos são oblongos, brancos e têm menos de 0,1 mm (0,004 polegada) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou inicio de junho, com o momento preciso da eclosão do ovo variando de ano para ano devido a diferentes de temperatura e localização. As larvas recém-eclodidas são vermes brancos com menos de 3,18 mm (0,125 polegada) de comprimento. Uma vez eclodidas, as larvas começam a se alimentar de raízes de milho. Os crisomelídeos do milho passam por três instares larvais. Depois de se alimentarem por várias semanas, as larvas mudam para o estágio pupal. Elas mudam para pupa no solo e, então, emergem do solo como adultos em julho e agosto. Os crisomelídeos adultos têm cerca de 6,35 mm (0,25 polegada) de comprimento.

[004] Larvas de crisomelídeos do milho completam o desenvolvimento no milho e várias outras espécies de gramíneas. Larvas criadas com capim rabo-de-rapousa amarelo emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula de cabeça menor quando adultas do que larvas criadas com milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:62734. Adultos de WCR se alimentam das barbas do milho, pólen e grãos em espigas expostas. Se adultos de WCR emergirem antes de os tecidos reprodutivos do milho estarem presentes, eles podem se alimentar de tecido de folha, retardando, dessa forma, o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. Entretanto, os adultos rapidamente mudam para as barbas e pólen preferidos quando se tornam disponíveis. Adultos de NCR também se alimentam de tecidos reprodutivos da planta de milho, mas, em contraste, raramente se alimentam de folhas do milho.

[005] A maior parte dos danos por crisomelídeos ao milho é causada pela alimentação larval. Crisomelídeos recém-eclodidos inicialmente se alimentam de pelos finos da raiz do milho e se entocam nas

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3/146 pontas da raiz. Como as larvas crescem de tamanho, alimentam-se de e se entocam em raízes primárias. Quando os crisomelídeos do milho são abundantes, a alimentação larval frequentemente resulta no desbaste das raízes até a base do caule do milho. Lesões graves da raiz interferem com a capacidade da raiz de transportar água e nutrientes para a planta, reduzem o crescimento da planta e resultam em produção reduzida de grãos, frequentemente reduzindo, dessa forma, drasticamente o rendimento global. Lesões graves da raiz frequentemente também resultam na derrubada de plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui ainda mais o rendimento. Além disso, a alimentação dos adultos com tecidos reprodutivos do milho pode resultar na poda das barbas na ponta da espiga. Se esse desbaste das barbas for suficientemente grave durante o espalhamento do pólen, a polinização pode ser rompida.

[006] O controle de crisomelídeos do milho pode ser tentado por rotação de culturas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporos Bacillus thuringiensis) ou uma combinação dos mesmos. A rotação de culturas tem a desvantagem significativa de impor restrições indesejáveis ao uso da terra cultivável. Além disso, a oviposição de algumas espécies de crisomelídeos pode ocorrer em campos de soja, mitigando, dessa forma, a eficácia da rotação de culturas praticada com milho e soja.

[007] Inseticidas químicos são a estratégia mais intensamente usada para se conseguir um controle de crisomelídeos do milho. O uso de inseticidas químicos, todavia, é uma estratégia imperfeita de controle dos crisomelídeos do milho; mais de 1 bilhão de dólares são perdidos nos Estados Unidos a cada ano devido a crisomelídeos do milho quando os custos dos inseticidas químicos são somados aos custos dos danos por crisomelídeos que podem ocorrer, a despeito do uso de inseticidas. Elevadas populações de larvas, chuvas pesadas e aplica

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4/146 ção imprópria de inseticidas podem resultar em um controle inadequado de crisomelídeos do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar cepas de crisomelídeos resistentes a inseticidas, assim como gerar preocupações ambientais significativas devido à toxicidade de muitos deles para espécies não alvo.

[008] Interferência de RNA (RNAi) é um processo que utiliza vias celulares endógenas, em que uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que seja específica para toda ou qualquer parte de tamanho adequado de uma sequência de gene alvo resulta na degradação do mRNA codificado. Em anos recentes, RNAi tem sido usada para realizar o silenciamento de genes em inúmeras espécies e sistemas experimentais; por exemplo, C. elegans, plantas, embriões de insetos e células em culturas de tecidos. Veja, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

[009] A RNAi realiza a degradação de mRNA mediante uma via endógena que inclui o complexo de proteínas DICER. DICER cliva moléculas longas de dsRNA em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, chamados de pequenos RNA de interferência (si RNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de fita simples: a fita passageira e a fita guia. A fita passageira é degradada, e a fita guia é incorporada no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Moléculas de ácido ribonucleico microinibidor (miRNA) também podem ser incorporadas no RISC. O silenciamento de gene pós-transcricional ocorre quando a fita guia se liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz a clivagem por A rgonaute, o componente catalítico do complexo RISC. Sabe-se que esse processo se espalha sistemicamente por todo o organismo, a despeito das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA

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5/146 em alguns eucariotos, como plantas, nematódeos e alguns insetos. [0010] Apenas transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados e, portanto, o silenciamento da expressão de mRNA é específico para a sequência. Em plantas, existem vários grupos funcionais de genes DICER. O efeito de silenciamento de gene da RNAi persiste durante dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio na abundância do transcrito alvo de 90% ou mais, com consequente redução nos níveis da proteína correspondente.

[0011] A patente U.S. n° 7.612.194 e as publicações de patentes

U.S. n° US 2007/0050860, US 2010/0192265 e US 2011/0154545 apresentam uma biblioteca de 9.112 sequências de etiqueta de sequência expressa (EST) isoladas de pupas de D. v. virgifera LeConte. Sugere-se na patente U.S. n° 7.612.194 e na publicação de patente U.S. n° US 2007/0050860 ligar operacionalmente a um promotor uma molécula de ácido nucleico que seja complementar a uma das várias sequências parciais particulares de D. v. virgifera vacuolar-tipo H⁺ATPase (V-ATPase) ali apresentadas para a expressão de RNA antissenso em células vegetais. A publicação de patente U.S. n° US 2010/0192265 sugere a ligação operacional de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que seja complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não exposta (diz-se que a sequência parcial é 58% idêntica ao produto do gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antissenso em células vegetais. A publicação de patente U.S. n° US 2011/0154545 sugere a ligação operacional de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que seja complementar a duas sequências parciais particulares de genes de subunidade beta de coatômero de D. v. virgifera para a expressão de RNA antissenso em células vegetais. Além disso, a patente U.S. n° 7.943.819 apresenta uma biblioteca de 906 sequências de etiqueta de sequência expressa (EST) isoladas de

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6/146 larvas, pupas e filhotes dissecados de D. v. virgifera LeConte e sugere a ligação operacional de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que seja complementar a uma sequência parcial particular de um gene 4b de proteína de corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão de RNA de fita dupla em células vegetais.

[0012] Nenhuma sugestão adicional é apresentada na patente

U.S. n° 7.612.194 e nas publicações de patentes U.S. n° US 2007/0050860, US 2010/0192265 e US 2011/0154545 quanto ao uso de qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências ali relacionadas para interferência de RNA, além das várias sequências parciais particulares de V-ATPase e das sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma das patente U.S. n° 7.612.194 e publicações de patentes U.S. n° US 2007/0050860 e US 2010/0192265 e US 2011/0154545 apresenta qualquer orientação quanto a quais das outras mais de nove mil sequências apresentadas seriam letais ou mesmo de alguma forma úteis em espécies de crisomelídeos do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A patente U.S. n° 7.943.819 não apresenta nenhuma sugestão de usar qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências ali relacionadas para interferência de RNA, além da sequência parcial particular de um gene 4b de proteína de corpo multivesicular com carga. Além disso, a patente U.S. n° 7.943.819 não apresenta nenhuma orientação quanto a quais outras das mais de novecentas sequências apresentadas seriam letais ou mesmo de alguma forma úteis em espécies de crisomelídeos do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA.

[0013] A maioria esmagadora das sequências complementares a

DNAs de crisomelídeos do milho (como as precedentes) são não letais em espécies de crisomelídeos do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007) descrevem os efeitos da

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7/146 inibição de vários genes alvo de WCR por RNAi. Esses autores relataram que os 8 dos 26 genes alvo que eles testaram não foram capazes de apresentar uma mortalidade de pragas coleópteras experimentalmente significativa a uma concentração muito alta de iRNA (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm².

SUMÁRIO DA EXPOSIÇÂO [0014] Apresentam-se aqui moléculas de ácidos nucleicos (por exemplo, genes alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) e seus métodos de uso, para o controle de pragas coleópteras, incluindo, por exemplo, D. v. virgifera LeConte (crisomelídeo do milho ocidental, WCR); D. barberi Smith e Lawrence (crisomelídeo do milho do norte, NCR); D. u. howardi Barber (crisomelídeo do milho do sul, SCR); D. v. zeae Krysan e Smith (crisomelídeo do milho mexicano, MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. Em exemplos particulares, apresentam-se moléculas de ácidos nucleicos exemplificativas que podem ser homólogas a pelo menos uma parte de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos nativas em uma praga coleóptera.

[0015] Nesses e em exemplos adicionais, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido no desenvolvimento larval. Em alguns exemplos, a inibição pós-tradução da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência homóloga a ele pode ser letal em pragas coleópteras, ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzidos. Em exemplos específicos, pelo menos um gene selecionado da lista que consiste em Contig_01_Rho1_1 -191_CDC42; D_vir_c47185_Caf1180;

D_vir_c1229_VatpaseC; e D_vir_c1319_VatpaseH pode ser selecionado como um gene alvo para silenciamento pós-transcricional. Em

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8/146 exemplos particulares, um gene alvo utilizável para inibição póstranscricional é o de uma proteína RHO1 pequena de ligação a GTP compreendendo uma sequência de nucleotídeos aqui mencionada como Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4), ou homólogo da mesma. Moléculas de ácidos nucleicos isoladas compreendendo a sequência de Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4), seu complemento e certos novos fragmentos de qualquer um destes são, portanto, aqui apresentados.

[0016] Também são apresentadas moléculas de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio que seja pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene alvo (por exemplo, o produto de um gene selecionado do grupo que consiste em Co ntig_01_Rho1_1 -191_CDC42; D_vir_c47185_Caf1180;

D_vir_c1229_VatpaseC; e D_vir_c1319_VatpaseH). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio que seja pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um polipeptídio codificado por um gene de proteína RHO1 pequena de ligação a GTP compreendendo uma sequência de nucleotídeos aqui mencionada como Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4), ou homólogo da mesma. Também são apresentadas moléculas de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene alvo.

[0017] Também são apresentadas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que sejam complementares a todo ou parte de um gene alvo de praga coleóptera, por exemplo: Co nPetição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 12/157

9/146 tig_01_Rho1_1 -191_CDC42; D_vir_c47185_Caf1180;

D_vir_c1229_VatpaseC; ou D_vir_c1319_VatpaseH. Em modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, são apresentadas moléculas de cDNA que podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que sejam complementares a Contig_01_Rho1_1191_CDC42, ou certos fragmentos novos desta.

[0018] Também são apresentados meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera e meios para conferir resistência a pragas de coleópteros a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera é uma molécula de RNA de fita simples ou dupla consistindo em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 10, 11, 49, 50, 86, 87, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 127, 128, 129, 130, 131, ou complementos da mesma. Um meio para conferir resistência a pragas de coleópteros a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera operacionalmente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de se integrar no genoma de uma planta de milho.

[0019] Apresentam-se métodos para controlar uma população de uma praga coleóptera, compreendendo o fornecimento a uma praga coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funcione ao ser captada pela praga coleóptera inibindo uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que a molécula de iRNA compreende toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento da SEQ

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ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento da SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento da SEQ ID NO:4; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4; e o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4. [0020] Em exemplos particulares, apresentam-se métodos para o controle de uma população de uma praga coleóptera, compreendendo o fornecimento a uma praga coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funcione ao ser captada pela praga coleóptera inibindo uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que a molécula de iRNA compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: toda ou parte da SEQ ID NO:1; o complemento de toda ou parte da SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento da SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento da SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento da SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:87; o complemento da SEQ ID NO:87; toda ou parte da SEQ ID NO:88; todo ou parte do complemento da SEQ ID NO:88; toda ou parte da SEQ ID NO:89; todo ou parte do complemento da SEQ ID NO:89; toda ou parte da SEQ ID NO:90; todo ou parte do complemento da SEQ ID NO:90; toda ou parte da SEQ ID NO:137;

todo ou parte do complemento da SEQ ID NO:137; toda ou parte da

SEQ ID NO:138; todo ou parte do complemento da SEQ ID NO:138;

toda ou parte de uma sequência codificadora nativa de um organismo

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Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; todo ou parte do complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:1; toda ou parte de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1; e todo ou parte do complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:1.

[0021] Também são aqui apresentados métodos em que dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser fornecidos a uma praga coleóptera em um ensaio baseado em dieta ou em células vegetais geneticamente modificadas que expressem os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nesses e em exemplos adicionais, os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos pelas larvas da praga coleóptera. A ingestão de dsRNAs, siRNA, miRNAs e/ou hpRNAs da invenção pode, então, resultar em RNAi nas larvas, o que, por sua vez, pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga coleóptera, levando, por fima, a mortalidade larval. Assim, apresentam-se métodos em que moléculas de ácidos nucleicos co mpreendendo sequência(s) de ácido(s) nucleico(s) exemplificativa(s) utilizável(eis) para o controle de pragas coleópteras são fornecidas a uma praga coleóptera. Em exemplos particulares, a praga coleóptera controlada com o uso de moléculas de ácidos nucleicos da invenção pode ser WCR ou NCR.

[0022] As características precedentes e outras ficarão mais claras com a Descrição Detalhada a seguir de várias modalidades, que é feita com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÂO DAS FIGURAS [0023] A figura 1 inclui uma representação da estratégia usada para fornecer moldes específicos para a produção de dsRNA.

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12/146 [0024] A figura 2 inclui um gráfico de variabilidade para a inibição do crescimento de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácidos nucleicos exemplificativas.

[0025] A figura 3 inclui um gráfico de variabilidade para a mortalidade de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácidos nucleicos exemplificativas.

[0026] A figura 4 inclui um gráfico de variabilidade adicional para a inibição do crescimento de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácidos nucleicos exemplificativas.

[0027] A figura 5 inclui uma representação gráfica de várias sequências de nucleotídeos que podem estar presentes em certas moléculas de ácidos nucleicos da invenção. Quando iniciado, (sequência), refere-se a uma região da sequência de nucleotídeos representada com qualquer comprimento e sequência particular, por exemplo, e sem limitação, um segmento contíguo de uma das SEQ ID NOs:1-4. Regiões em itálico das sequências de nucleotídeos representadas são opcionais.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [0028] As sequências de ácidos nucleicos relacionadas na listagem de sequência anexa são mostradas usando-se as abreviações de letras padronizadas para bases nucleotídicas, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas entende-se que a fita complementar e a fita complementar reversa estão incluídas por qualquer referência à fita apresentada. Na listagem de sequência anexa:

[0029] A SEQ ID NO:1 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplificativa, mencionada em alguns lugares como D_vir_c47185_Caf1180, ou Caf1-180.

[0030] A SEQ ID NO:2 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplificativa, mencionada em alguns lugares como

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D_vir_c1229_VatpaseC, ou VatpaseC.

[0031] A SEQ ID NO:3 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplificativa, mencionada em alguns lugares como D_vir_c1319_VatpaseH, ou VatpaseH.

[0032] A SEQ ID NO:4 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplificativa, mencionada em alguns lugares como Co ntig_01_Rho1_1-191_CDC42, ou Rho1.

[0033] As SEQ ID NOs:5-8 mostram fragmentos não contíguos exemplificativos de um cDNA de subunidade C de ATPase vacuolar de Diabrotica.

[0034] As SEQ ID NOs:9-11 mostram fragmentos não contíguos exemplificativos de um cDNA de subunidade H de ATPase vacuolar de Diabrotica.

[0035] A SEQ ID NO:12 mostra uma sequência de promotor de fago T7.

[0036] As SEQ ID NOs:13-38 mostram iniciadores usados para amplificar partes de regiões codificadoras de genes alvo exemplificativos por PCR.

[0037] As SEQ ID NOs:39-48 mostram iniciadores usados para amplificar regiões do gene de Caf1-180 e VatpaseC para síntese de RNA em grampo.

[0038] A SEQ ID NO:49 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo Caf1-180 contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 1 que contenha uma sequência de consenso de milho.

[0039] A SEQ ID NO:50 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo VatpaseC contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão de hpRNA versão 1 que contenha uma sequência de consenso de milho.

[0040] A SEQ ID NO:51 mostra uma sequência de DNA da região

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14/146 da anexina.

[0041] A SEQ ID NO:52 mostra uma sequência de DNA da região da anexina.

[0042] A SEQ ID NO:53 mostra uma sequência de DNA da região da beta espectrina 2.

[0043] A SEQ ID NO:54 mostra uma sequência de DNA da região da beta espectrina 2.

[0044] A SEQ ID NO:55 mostra uma sequência de DNA da região da mtRP-L4.

[0045] A SEQ ID NO:56 mostra uma sequência de DNA da região da mtRP-L4.

[0046] A SEQ ID NO:57 mostra uma sequência de DNA que codifica uma YFP.

[0047] As SEQ ID NOs:58-85 mostram iniciadores usados para amplificar regiões do gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para síntese de dsRNA.

[0048] A SEQ ID NO:86 mostra um fragmento amplificado de 260 pb exemplificativo de um cDNA D_vir_c47185_Caf1-180 que foi usado como um molde para a síntese de uma molécula de dsRNA.

[0049] As SEQ ID NOs:87-90 mostram fragmentos não contíguos exemplificativos de um cDNA Rho1 de Diabrotica.

[0050] A SEQ ID NO:91 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo Caf1-180 exemplificativa contendo um íntron STLS1 (SEQ ID NO:136), incluindo um sítio de clonagem opcional flanqueando o íntron, para um vetor de expressão versão 1 que contenha uma sequência de consenso de milho.

[0051] A SEQ ID NO:92 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo Caf1-180 exemplificativa contendo um íntron STLS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 2 que não contenha a sequência de consenso de milho.

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15/146 [0052] A SEQ ID NO:93 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo VatpaseC exemplificativa contendo um íntron STLS1 (SEQ ID NO:136), incluindo um sítio de clonagem opcional flanqueando o íntron, para um vetor de expressão de hpRNA versão 1 que contenha uma sequência de consenso de milho.

[0053] A SEQ ID NO:94 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo VatpaseC exemplificativa contendo um íntron STLS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão hpRNA versão 2 que não contenha a sequência de consenso de milho.

[0054] A SEQ ID NO:95 mostra um segmento exemplificativo de uma fita em senso de DNA Caf1-180 contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 3.

[0055] A SEQ ID NO:96 mostra um segmento exemplificativo de uma fita antissenso de DNA Caf1-180 para um vetor de expressão versão 3.

[0056] A SEQ ID NO:97 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo Caf1-180 exemplificativa contendo um íntron STLS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 3.

[0057] A SEQ ID NO:98 mostra um segmento exemplificativo de uma fita em senso de DNA VatpaseC contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 3.

[0058] A SEQ ID NO:99 mostra um segmento exemplificativo de uma fita antissenso de DNA VatpaseC para um vetor de expressão versão 3.

[0059] A SEQ ID NO:100 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo VatpaseC exemplificativa contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 3.

[0060] A SEQ ID NO:101 mostra um segmento exemplificativo de uma fita em senso de DNA VatpaseC contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 4.

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16/146 [0061] A SEQ ID NO:102 mostra um segmento exemplificativo de uma fita antissenso de DNA VatpaseC para um vetor de expressão versão 4.

[0062] A SEQ ID NO:103 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo VatpaseC exemplificativa contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 4.

[0063] A SEQ ID NO:104 mostra um segmento exemplificativo de uma fita em senso de DNA VatpaseH contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 1.

[0064] A SEQ ID NO:105 mostra um segmento exemplificativo de uma fita antissenso de DNA VatpaseH para um vetor de expressão versão 1.

[0065] A SEQ ID NO:106 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo VatpaseH exemplificativa contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 1.

[0066] A SEQ ID NO:107 mostra um segmento exemplificativo de uma fita em senso de DNA Rho1 contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 1.

[0067] A SEQ ID NO:108 mostra um segmento exemplificativo de uma fita antissenso de DNA Rho1 para um vetor de expressão versão 1.

[0068] A SEQ ID NO:109 mostra uma sequência de DNA formadora de RNA em grampo Rho1 exemplificativa contendo um íntron STLS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 1.

[0069] A SEQ ID NO:110 mostra um segmento exemplificativo de um DNA Caf-180 usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0070] A SEQ ID NO:111 mostra um segmento exemplificativo de um DNA VatpaseC região 1 usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

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17/146 [0071] A SEQ ID NO:112 mostra um segmento exemplificativo de um DNA VatpaseC região 1 (curto) usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0072] A SEQ ID NO:113 mostra um segmento exemplificativo de um DNA VatpaseC região 2 usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0073] A SEQ ID NO:114 mostra um segmento exemplificativo de um DNA VatpaseH região 1 usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0074] A SEQ ID NO:115 mostra um segmento exemplificativo de um DNA VatpaseH região 2 usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0075] A SEQ ID NO:116 mostra um segmento exemplificativo de um DNA Rho1 usado para fornecer um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0076] A SEQ ID NO:117 mostra uma fita em senso de RNA VatpaseC exemplificativa (VatpaseC5'-15) usada como um dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0077] A SEQ ID NO:118 mostra uma fita em senso de RNA VatpaseC exemplificativa adicional (VatpaseC5'-25) usada como um dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0078] A SEQ ID NO:119 mostra uma fita em senso de RNA VatpaseC exemplificativa adicional (VatpaseC3'-15) usada como um dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0079] A SEQ ID NO:120 mostra uma fita em senso de RNA VatpaseC exemplificativa adicional (VatpaseC3'-25) usada como um dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0080] As SEQ ID NOs:121-126 mostram iniciadores usados para amplificar partes de um gene de VatpaseC de Diabrotica como moldes para síntese de dsRNA.

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18/146 [0081] A SEQ ID NO:127 mostra uma fita em senso de VatpaseC exemplificativa (VatpaseC5'-50) usada como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0082] A SEQ ID NO:128 mostra uma fita em senso de VatpaseC exemplificativa (VatpaseC5'-100) usada como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0083] A SEQ ID NO:129 mostra uma fita em senso de VatpaseC exemplificativa (VatpaseC-174) usada como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0084] A SEQ ID NO:130 mostra uma fita em senso de VatpaseC exemplificativa (VatpaseC3'-50) usada como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0085] A SEQ ID NO:131 mostra uma fita em senso de VatpaseC exemplificativa (VatpaseC3'-100) usada como um dsRNA em bioensaios de alimentação por dieta.

[0086] As SEQ ID NOs:132-135 mostram iniciadores usados para análises moleculares de milho transgênico.

[0087] A SEQ ID NO:136 mostra um íntron ST-LS1 que pode ser útil em algumas modalidades para formar um RNA em grampo.

[0088] As SEQ ID NOs:137-138 mostram fragmentos não contíguos exemplificativos de um cDNA Rho1 de Diabrotica:

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Visão geral de várias modalidades [0089] Apresentam-se aqui métodos e composições para controle genético de infestações por praga coleóptera. Também se apresentam métodos para a identificação de um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga coleóptera para uso como um gene alvo para controle mediado por RNAi de uma população de praga coleóptera. Vetores de DNA plasmídico codificando moléculas de dsRNA podem ser projetados para suprimir um ou mais genes alvo essenciais

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19/146 para o crescimento, sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Em algumas modalidades, apresentam-se métodos para a repressão pós-transcricional da expressão ou inibição de um gene alvo mediante moléculas de ácidos nucleicos que sejam complementares a uma sequência codificadora ou não codificadora do gene alvo em uma praga coleóptera. Nessas e em outras modalidades, a praga coleóptera pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA transcritas de toda ou parte da molécula de ácido nucleico que seja complementar a uma sequência codificadora ou não codificadora de um gene alvo, gerando, dessa forma, um efeito protetor para a planta. [0090] Assim, algumas modalidades envolvem a inibição específica para sequência da expressão de produtos do gene alvo, usando dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA que seja complementar a sequências codificadoras e/ou não codificadoras do(s) gene(s) alvo para atingir um controle pelo menos parcial de uma praga coleóptera. Apresenta-se um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendendo uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, conforme apresentado em uma das SEQ ID NOs:1-4, 87-90, 137 e 138. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressadas por essas sequências, seus fragmentos ou um gene compreendendo uma dessas sequências, para o silenciamento pós-transcricional ou inibição de um gene alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendem a SEQ ID NO:4 e/ou toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138.

[0091] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula vegetal) com, em seu genoma, pelo menos uma sequência de DNA recombinante que codifique pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a(s) molécula(s) de dsRNA pode(m) ser expressa

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20/146 da(s) quando ingerida(s) por uma praga coleóptera para silenciar póstranscricionalmente ou inibir a expressão de um gene alvo na praga coleóptera. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4, 87-90, 137 e 138, fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4, 87-90, 137 e 138, ou uma sequência parcial de um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs:1-4, 87-90, 137 e 138, ou seus complementos.

[0092] Modalidades particulares envolvem uma célula hospedeira recombinante com, em seu genoma, uma sequência de DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo a SEQ ID NO:4 e/ou toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138. Quando ingerida(s) por uma praga coleóptera, a(s) molécula(s) de iRNA pode(m) silecionar ou inibir a expressão de um gene alvo de proteína RHO1 pequena de ligação a GTP compreendendo as SEQ ID NOs:4, 87-90, 137 e 138 na praga coleóptera e, dessa forma, resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na praga coleóptera.

[0093] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante com, em seu genoma, pelo menos uma sequência de DNA recombinante que codifique pelo menos uma molécula de dsRNA pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo essa célula vegetal transformada. Além dessas plantas transgênicas, apresentam-se plantas descendentes de qualquer geração da planta transgênica, sementes transgênicas e produtos da planta transgênica, cada um compreendendo sequência(s) de DNA recombinante. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressada em uma célula vegetal transgênica. Consequentemente, nessas e em o utras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada de uma célula vegetal transgênica. Em modalidades particulares,

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21/146 a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo que compreende milho (Zea mays), soja (Glycine max) e plantas da família Poaceae.

[0094] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga coleóptera. Nessas e em outras modalidades, pode-se fornecer uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de dsRNA pode ser operacionalmente ligada a um promotor e também pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de término de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga coleóptera pode compreender: (a) a transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de dsRNA; (b) o cultivo da célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) a seleção de uma célula vegetal transformada que tenha integrado o vetor em seu genoma; e (d) a determinação de se a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeos do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula vegetal que tenha o vetor integrado em seu genoma e compreenda a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeos do vetor.

[0095] Assim, também se apresenta uma planta transgênica compreendendo um vetor com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeos do vetor. Em modalidades particulares, a ex

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22/146 pressão de uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula da praga coleóptera que contate a planta ou célula vegetal transformada, por exemplo, ao se alimentar da planta transformada, de uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal. As plantas transgênicas aqui expostas podem apresentar resistência e/ou tolerância aumentada a infestações por pragas coleópteras. Plantas transgênicas particulares podem apresentar resistência e/ou tolerância aumentada a uma ou mais pragas coleópteras selecionadas do grupo que consiste em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

[0096] Também são aqui apresentados métodos para a distribuição de agentes de controle, como uma molécula de iRNA, à praga coleóptera. Esses agentes de controle podem causar, direta ou indiretamente, um prejuízo na capacidade da praga coleóptera de se alimentar, crescer ou de outra forma causar danos a um hospedeiro. Em algumas modalidades, apresenta-se um método que compreende a distribuição de uma molécula de dsRNA estabilizada à praga coleóptera para suprimir pelo menos um gene alvo na praga coleóptera, reduzindo ou eliminando, dessa forma, danos à planta pela praga coleóptera. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera pode resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na praga coleóptera. Em algumas modalidades, o método pode resultar, por fim, na morte da praga coleóptera.

[0097] Em algumas modalidades, apresentam-se composições (por exemplo, uma composição tópica) que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da invenção para uso em plantas, animais e/ou no ambiente da planta ou animal para se obter a eliminação ou redução da infestação pela praga coleóptera. Em modalidades

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23/146 particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser dado à praga coleóptera. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou fonte de alimento disponível à praga coleóptera. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na captação das moléculas por uma ou mais células da praga coleóptera, o que, por sua vez, pode resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene alvo em células da praga coleóptera. A ingestão de ou o dano a uma planta ou célula vegetal pela praga coleóptera pode ser limitado ou eliminado em qualquer tecido hospedeiro ou ambiente em que a praga coleóptera esteja presente ao se fornecer uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção ao hospedeiro da praga coleóptera.

[0098] As composições e métodos aqui apresentados podem ser usados em combinações com outros métodos e composições para o controle de danos por pragas coleópteras. Por exemplo, uma molécula de iRNA conforme aqui descrita para a proteção de plantas contra pragas coleópteras pode ser usada em um método compreendendo o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra a praga coleóptera, biopesticidas eficazes contra a praga coleóptera, rotação de culturas ou técnicas genéticas recombinantes que exibam características diferentes das características do métodos mediados por RNAi e composições de RNAi da invenção (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que sejam prejudiciais à praga coleóptera (por exemplo, toxinas B)).

II. Abreviações dsRNA: ácido ribonucleico de fita dupla

GI : inibição do crescimento

NCBI : Centro Nacional de Informações Sobre Biotecnologia gDNA : DNA genômico

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24/146 iRNA : ácido ribonucleico inibidor

ORF : quadro de leitura aberta

RNAi : interferência de ácido ribonucleico miRNA: microácido ribonucleico inibidor siRNA : pequeno ácido ribonucleico inibidor hpRNA: ácido ribonucleico em grampo

UTR : região não traduzida

WCR : crisomelídeo do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)

NCR : crisomelídeo do milho do norte (Diabrotica barberi Smith e

Lawrence)

MCR : Crisomelídeo do milho mexicano (Diabrotica virgifera zeae

Krysan e Smith)

PCR : reação em cadeia de polimerase

RISC : Complexo de Silenciamento Induzido por RNA

SCR : crisomelídeo do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)

III. Termos [0099] Na descrição e tabelas a seguir, são usados inúmeros termos. Para proporcionar uma compreensão clara e consistente do relatório e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a esses termos, são apresentadas as seguintes definições:

[00100] Praga coleóptera: Conforme aqui usado, o termo praga coleóptera se refere a insetos do gênero Diabrotica que se alimentam de milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, a praga coleóptera é selecionada da lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

[00101] Contato (com um organismo): Conforme aqui usado, o terPetição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 28/157

25/146 mo contato com ou captação por um organismo (por exemplo, a praga coleóptera), com relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo e sem limitação: a ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, por alimentação); contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e o encharcamento dos organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.

[00102] Contig: Conforme aqui usado, o termo contig se refere a uma sequência de DNA que seja reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA superpostos derivados de uma única fonte genética.

[00103] Planta de milho: Conforme aqui usado, o termo planta de milho se refere a uma planta da espécie Zea mays (milho).

[00104] Expressão: Conforme aqui usado, expressão de uma sequência codificadora (por exemplo, um gene ou um transgene) referese ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumente o diminua a expressão do gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer ponto na via de DNA a RNA a proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, mediante controle que agem na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, como mRNA, ou mediante ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas depois de terem sido formadas, ou por combinações desses. A expres

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26/146 são do gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot ou ensaios de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[00105] Material genético: Conforme aqui usado, o termo material genético inclui todos os genes e moléculas de ácidos nucleicos, como DNA e RNA.

[00106] Inibição: Conforme aqui usado, o termo inibição, quando usado para descrever um efeito sobre uma sequência codificadora (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir da sequência codificadora e/ou produto peptídico, polipeptídico ou proteico da sequência codificadora. Em alguns exemplos, a expressão de uma sequência codificadora pode ser inibida de modo que a expressão seja aproximadamente eliminada. Inibição específica se refere à inibição da sequência codificadora alvo sem, consequentemente, afetar a expressão de outras sequências codificadoras (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada.

[00107] Isolado: Um componente biológico isolado (como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, apartado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, isto é, outros DNAs e RNAs cromossômicos e extracromossômicos e proteínas. Moléculas de ácidos nucleicos e proteínas que tenham sido isoladas incluem moléculas de ácidos nucleicos e proteínas purificadas por métodos de purificação padronizados. O termo também engloba ácidos nucleicos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como moléculas de ácidos nucleicos, proteínas e peptídios quimicamente sintetizados.

[00108] Molécula de ácido nucleico: Conforme aqui usado, o termo

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27/146 molécula de ácido nucleico pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir tanto fitas em senso, quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou a uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico, conforme aqui usado, é sinônimo de ácido nucleico e polinucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico normalmente tem pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que especificado de outra forma. A sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' para a 3' da molécula por convenção. O complemento de uma sequência de nucleotídeos se refere à sequência, de 5' para 3', das nucleobases que formam pares de bases com as nucleobases da sequência de nucleotídeos (isto é, A-T/U, e G-C). O complemento inverso da sequência de ácido nucleico se refere à sequência, de 3' para 5', das nucleobases que formam pares de bases com as nucleobases da sequência de nucleotídeos.

[00109] Moléculas de ácidos nucleicos incluem formas de fita simples e dupla de DNA; formas de fita simples de RNA e formas de fita dupla de RNA (dsRNA). O termo sequência de nucleotídeos ou sequência de ácido nucleico se refere tanto às fitas em senso, quanto antissenso de um ácido nucleico como qualquer fita simples individual ou no dúplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) inclui iRNA (RNA inibidor), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (pequeno RNA de interferência), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA em grampo), tRNA (RNA de transferência), quer com a carga ou sem a carga do aminoácido acilado correspondente, e cRNA (RNA complementar). O termo ácido desoxirribonucleico (DNA) inclui cDNA, DNA genômico, e híbridos de DNA-RNA. Os termos segmento de ácido nucleico e segmento de sequência de nucleotídeos ou, mais generi

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28/146 camente, segmento deve ser entendido por aqueles versados na técnica como um termo funcional que inclui tanto sequências genômicas, sequências de RNA ribossomal, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de óperon e sequências de nucleotídeos manipuladas menores que codifiquem ou possam ser adaptadas para codificar peptídios, polipeptídios ou proteínas.

[00110] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero curto de ácido nucleico. Oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos de ácidos nucleicos mais longos ou por polimerização de precursores nucleotídicos individuais. Sintetizadores automatizados permite a síntese de oligonucleotídeos com até várias centenas de pares de bases de comprimento. Como os oligonucleotídeos podem se ligar a sequências de nucleotídeos complementares, eles podem ser usados como sondas para a detecção de DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos por DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA e RNA (para transcrição reversa em um cDNA). Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente chamado deiniciador, que permite que a DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.

[00111] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um ou tanto nucleotídeos de ocorrência natural, quanto modificados, ligados entre si por ligações nucleotídicas de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. Moléculas de ácidos nucleicos podem ser química ou bioquimicamente modificadas ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou derivatizadas, como será prontamente percebido por aqueles versados na técnica. Essas modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações inter

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29/146 nucleotídicas (por exemplo, ligações sem carga: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações com carga: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídios; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo molécula de ácido nucleico também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações em fita simples, fita dupla, parcialmente em dúplex, tríplex, em grampo, circular e em cadeado.

[00112] Conforme aqui usado com relação ao DNA, o termo sequência codificadora, sequência de nucleotídeos estrutural ou molécula de ácido nucleico estrutural se refere a uma sequência de nucleotídeos que é, por fim, traduzida em um polipeptídio, mediante transcrição e mRNA, quando posta sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Com relação ao RNA, o termo sequência codificadora se refere a uma sequência de nucleotídeos que é traduzida em um peptídio, polipeptídio ou proteína. Os limites de uma sequência codificadora são determinados por um códon de início de tradução na terminação 5' e um códon de parada de tradução na terminação 3'. Sequências codificadoras incluem, mas não se limitam a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeos recombinantes.

[00113] Genoma: Conforme aqui usado, o termo genoma se refere a DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula e também se refere a DNA de organela encontrado dentro de componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal de modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da célula vegetal. Nessas e em outras modalidades, a molécula de DNA pode ser integrada no DNA nuclear da célula vegetal ou integrado no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo genoma, con

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30/146 forme se aplica a bactérias, refere-se tanto o cromossomo, quanto aos plasmídios dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria, de modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nessas e em outras modalidades, a molécula de DNA pode ser cromossomicamente integrada ou se localizar como ou em um plasmídio estável.

[00114] Identidade de sequência: O termo identidade de sequência ou identidade, conforme aqui usado no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídios, refere-se aos resíduos nas duas sequências que sejam iguais quando alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.

[00115] Conforme aqui usado, o termo porcentagem de identidade de sequência pode-se referir ao valor determinado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos) em uma janela de comparação, em que a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, vãos) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que o resíduo idêntico de nucleotídeo ou aminoácido ocorre em ambas as sequências para fornecer o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de co mparação, e multiplicando-se o resultado por 100 para fornecer a porcentagem de identidade de sequência. Diz-se que uma sequência que seja idêntica em todas as posições em comparação com uma sequência de referência é 100% idêntica à sequência de referência e vice-versa.

[00116] Métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinha

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31/146 mento são descritos, por exemplo, em: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequências e cálculos de homologia pode ser encontrada, por exemplo, em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[00117] A Ferramenta Local Básica de Busca de Alinhamento (BLAST™; Altschul et al. (1990)) do Centro Nacional de Info rmações Sobre Biotecnologia (NCBI) está disponível em inúmeras fontes, incluindo o Centro Nacional de Informações Sobre Biotecnologia (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conjunto com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando esse programa está disponível na internet na seção de ajuda do BLAST™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, pode-se empregar a função Blast 2 sequences do programa BLAST™ (Blastn) usando a matriz padrão BLOSUM62 com parâmetros padrão. Sequências de ácidos nucleicos com similaridade ainda maior com as sequências de referência mostraram porcentagens de identidade crescentes quando avaliadas por esse método.

[00118] Especificamente hibridizável/especificamente complementar: Conforme aqui usado, os termos especificamente hibridizável e especificamente complementar são termos que indicam um grau suficiente de complementariedade para que ocorra ligação estável e específica entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácidos nucleicos envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as sequên

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32/146 cias de ácidos nucleicos das duas moléculas de ácidos nucleicos. As duas moléculas são, então, capazes de formar pontes de hidrogênio com bases correspondentes na fita oposta para formar uma molécula dúplex que, se for suficientemente estável, é detectável usando-se métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Entretanto, a quantidade de complementariedade de sequência que tem de existir para que a hibridização seja específica é função das condições de hibridização usadas.

[00119] Condições de hibridização que resultem em graus particulares de adstringência podem variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e comprimento das sequências de ácidos nucleicos de hibridização. Genericamente, a temperatura de hibridização e a força iônica (particularmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização determinarão a adstringência da hibridização, embora os tempos de lavagem e as composições dos tampões de lavagem também influenciem a adstringência. Cálculos referentes às condições de hibridização requeridos para se atingirem graus particulares de adstringência são conhecidos por aqueles versados na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções e orientações detalhadas adicionais com relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, em Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2,

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Greene Publishing e Wiley-Interscience, NY, 1995.

[00120] Conforme aqui usado, condições adstringentes englobam condições sob as quais a hibridização só ocorrerá se houver menos de 80% de não correspondência entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico alvo. Condições adstringentes também incluem níveis particulares de adstringência. Assim, conforme aqui usado, condições de adstringência moderada são aquelas sob as quais moléculas com mais de 20% de não correspondência de sequência não se hibridizarão; condições de alta adstringência são aquelas sob as quais sequências com mais de 10% de não correspondênci a não se hibridizarão; e condições de adstringência muito alta são aquelas sob as quais sequências com mais de 5% de não correspondência não se hibridizarão.

[00121] A seguir estão condições de hibridização representativas e não limitativas.

[00122] Condição de alta adstringência (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em 5x tampão SSC a 65°C durante 16 horas; lavar duas vezes em 2x tampão SSC à temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em 0,5x tampão SSC a 65°C durante 20 minutos cada.

[00123] Condição de adstringência moderada (detecta sequências que compartilham pelo menos 20% de identidade de sequência): Hibridização em 5x-6x tampão SSC a 65-70°C durante 16-20 horas; lavar duas vezes em 2x tampão SSC à temperatura ambiente durante 520 minutos cada; e lavar duas vezes em 1x tampão SSC a 55-70°C durante 30 minutos cada.

[00124] Condição de controle não adstringentes (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência se hibridizam): Hibridização em 6x tampão SSC à temperatura ambiente to

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55°C durante 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes em 2x-3x tampão SSC da temperatura ambiente a 55°C durante 20-30 minutos cada.

[00125] Conforme aqui usado, o termo substancialmente homóloga ou homologia substancial, com relação a uma sequência contígua de ácido nucleico, refere-se a sequências contíguas de nucleotídeos que hibridizam sob condições adstringentes à sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, sequências de ácidos nucleicos que sejam substancialmente homólogas à sequência de ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-7 são as sequências de ácidos nucleicos que hibridizam sob condições adstringentes (por exemplo, as condições de adstringência moderada acima apresentadas) à sequência de ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-7. Sequências substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, sequências substancialmente homólogas podem ter de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada à hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complementariedade para evitar ligação não específica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições em que a ligação específica seja desejada, por exemplo, sob condições de hibridização adstringentes.

[00126] Conforme aqui usado, o termo ortólogo se refere a um gene em duas ou mais espécies que tenha evoluído de uma sequência

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35/146 de nucleotídeos ancestral comum e possa reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00127] Conforme aqui usado, diz-se que duas moléculas de sequências de ácidos nucleicos exibem complementariedade completa quando cada nucleotídeo da sequência lida na direção 5' para 3' é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3' para 5'. Uma sequência de nucleotídeos que seja complementar à sequência de nucleotídeos de referência exibirá uma sequência idêntica à sequência de complemento inverso da sequência de nucleotídeos de referência. Esses termos e descrições estão bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles versados na técnica.

[00128] Operacionalmente ligada: Uma primeira sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Quando produzidas de maneira recombinante, sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas são, em geral, contíguas, e, quando é necessário unir duas regiões codificadoras de proteína, estão no mesmo quadro de leitura (por exemplo, em um ORF policistrônico). Entretanto, os ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para estarem operacionalmente ligados.

[00129] O termo operacionalmente ligada, quando usado com referência a uma sequência reguladora e uma sequência codificadora, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência codificadora ligada. Sequências reguladoras, ou elementos de controle, referem-se a sequências de nucleotídeos que influenciam o momento e nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de

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36/146 tradução; íntrons; intensificadores; estruturas de haste-alça; sequências de ligação a repressor; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência codificadora operacionalmente ligada a ela. Da mesma fo rma, sequências reguladoras particulares operacionalmente ligadas a uma sequência codificadora podem estar localizadas na fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. [00130] Promotor: Conforme aqui usado, o termo promotor se refere a uma região do DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência codificadora para expressão em uma célula, ou um promotor pode estar operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal que pode estar operacionalmente ligada a uma sequência codificadora para expressão em uma célula. Um promotor de planta pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição preferencialmente em certos tecidos, como folhas, raízes, sementes, vaso do xilema, traqueídes ou esclerênquima. Esses promotores são chamados de preferidos por tecidos. Promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são chamados de específicos para tecidos. Um promotor específico para um tipo de célula ativa a expressão primariamente em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor induzível pode ser um promotor que possa estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de

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37/146 luz. Promotores específicos para tecidos, preferidos por tecidos, específicos para tipos de células e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que pode estar ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de células ou tecidos.

[00131] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Veja Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Promotores induzíveis exemplificativos incluem, mas não se limitam a: Promotores do sistema ACEI que respondem a cobre; o gene In2 do milho que responde a protetores contra herbicidas de benzenossulfonamida; o repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glicocorticosteroide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).

[00132] Promotores constitutivos exemplificativos incluem, mas não se limitam a: Promotores de vírus de plantas, como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotores de genes da actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da H3 histona do milho; e o promotor ALS, fragmento 5' Xba1/NcoI do gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma sequência de nucleotídeos similar ao dito fragmento Xba1/NcoI) (Publicação PCT Internacional n° WO 96/30530).

[00133] Além disso, qualquer promotor específico para tecido ou preferido por tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificadora operacionalmente ligada a um promotor específico para tecido podem produzir o produto da sequência codificadora exclusivamente, ou de preferência, em um tecido específico. Promotores específicos para tecidos ou preferidos por teci

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38/146 dos exemplificativos incluem, mas não se limitam a: Um promotor preferido pela raiz, como o do gene da faseolina; um promotor específico para folhas e induzido pela luz, como o de cab ou rubisco; um promotor específico para antera, como o de LAT52; um promotor específico para pólen, como o de Zm13; e um a promotor preferido por microsporo, como o de apg.

[00134] Transformação: Conforme aqui usado, o termo transformação ou transdução se refere à transferência de uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos para uma célula. Uma célula é transformada por uma molécula de ácido nucleico transduzida para a célula quando a molécula de ácido nucleico se torna replicada de maneira estável pela célula, por incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular ou por replicação epissômica. Conforme aqui usado, o termo transformação engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida nessa célula. Exemplos incluem, mas não se limitam a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmídicos; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:57985); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); captação direta de DNA; e bombardeamento com microprojéteis (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00135] Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser a sequência que codifica uma ou ambas as fitas de uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que seja complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga coleóptera. Em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de ácido nucleico antissenso, em que a expressão da sequência de ácido nu

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39/146 cleico antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Em ainda outros exemplos, um transgene podem ser uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência a herbicida), um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil ou um gene que codifica um traço agrícola desejável. Nesses e em outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras operacionalmente ligadas a uma sequência codificadora do transgene (por exemplo, um promotor).

[00136] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico conforme introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucleicos que permitam sua replicação na célula hospedeira, como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não se limitam a: um plasmídio; cosmídio; bacteriófago; ou vírus que carreie o DNA exógeno para uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, sequências antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo, dessa forma, com que a célula expresse as moléculas de ácidos nucleicos e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui opcionalmente materiais que o ajudem a conseguir a entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossomo, revestimento proteico, etc.).

[00137] Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou mais com relação ao rendimento de variedades de controle no mesmo local de crescimento, na mesma ocasião e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, melhor rendimento ou melhora de rendimento significa um cultivar com um rendimento estabilizado de 105% a 115% ou mais com relação às variedades de controle no mesmo local de cultivo, contendo densidades significativas de pragas coleópteras que sejam lesivas para a colheita crescendo na mesPetição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 43/157

40/146 ma ocasião e sob as mesmas condições.

[00138] A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos um, uma e o/a significam pelo menos um conforme aqui usado.

[00139] A menos que especificamente explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta exposição pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology e Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens estão em peso, e todas as proporções das misturas solventes estão em volume, a menos que indicado de outra forma. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.

IV. Moléculas de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de praga coleóptera

A. Visão geral [00140] Descrevem-se aqui moléculas de ácidos nucleicos úteis para o controle de pragas coleópteras. As moléculas de ácidos nucleicos descritas incluem sequências alvo (por exemplo, genes nativos, e sequências não codificadoras), dsRNAs, siRNAs, hpRNAs, e miRNAs. Por exemplo, são descritas moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a toda ou parte de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos nativas em uma praga coleóptera. Nessas e em outras modalidades, a(s) sequência(s) de ácido(s) nucleico(s) pode(s) ser um ou mais genes alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limi

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41/146 tação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido no desenvolvimento larval. As moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico nativa à qual as moléculas de ácidos nucleicos sejam especificamente complementares podem iniciar RNAi na célula e, consequentemente, reduzir ou eliminar a expressão da(s) sequência(s) de ácido(s) nucleico(s). Em alguns exemplos, a redução ou a eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência especificamente complementar a ela pode ser letal em pragas coleópteras, ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzidos.

[00141] Em algumas modalidades, pode-se selecionar pelo menos um gene alvo em uma praga coleóptera, em que o gene alvo compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada da lista que compreende D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1);

D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); e Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4). Em exemplos particulares, seleciona-se um gene alvo em uma praga coleóptera, em que o gene alvo codifica uma proteína RHO1 pequena de ligação a GTP e compreende a SEQ ID NO:4.

[00142] Em algumas modalidades, o gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua que seja pelo menos 85% idêntica (por exemplo, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica) à sequência de aminoácidos do produto de proteína de um de D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); e Con

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42/146 tig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4). O gene alvo pode ser qualquer sequência de ácido nucleico em uma praga coleóptera, cuja inibição pós-transcricional tenha um efeito deletério sobre a praga coleóptera, ou confira um benefício protetor contra a praga coleóptera para a planta. Em exemplos particulares, o gene alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína RHO1 pequena de ligação a GTP compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua que seja pelo menos 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do produto de proteína da SEQ ID NO:4.

[00143] Apresentam-se, de acordo com a invenção, sequências de nucleotídeos cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a toda ou a parte de uma molécula de RNA nativa que seja codificada por uma sequência codificadora em uma praga coleóptera. Em algumas modalidades, após a ingestão da molécula de RNA expressada pela praga coleóptera, pode-se obter a regulação para baixo da sequência codificadora em células da praga coleóptera. Em modalidades particulares, a regulação para baixo da sequência codificadora em células da praga coleóptera pode resultar em um efeito deletério sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera.

[00144] Em algumas modalidades, as sequências alvo incluem sequências de RNA não codificadoras transcritas, como 5'UTRs; 3'UTRs; sequências líder unidas; sequências de íntron; sequências de outron (por exemplo, RNA 5'UTR subsequentemente modificado em união trans); sequências de donatron (por exemplo, RNA não codificador requerido para fornecer sequências doadoras para união trans); e outros

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RNA não codificadores transcritos dos genes alvo da praga coleóptera. Essas sequências podem ser derivadas tanto de genes monocistrônicos, quanto de policistrônicos.

[00145] Assim, também se descrevem aqui, com relação a algumas modalidades, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a toda ou a parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera. Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA pode compreender sequências de nucleotídeos que sejam complementares a toda ou a parte de uma pluralidade de sequências alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sequências alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, como uma planta ou bactéria. Também são apresentadas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, miRNA e/ou moléculas de hpRNA que sejam especificamente complementares a toda ou a parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera. Também se descrevem construtos de DNA recombinante usados para se co nseguir uma transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA dos construtos de DNA recombinante. Consequentemente, também se descreve um vetor de transformação de plantas compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão das sequências de nucleotídeos resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a toda ou a parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera.

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44/146 [00146] Em algumas modalidades, moléculas de ácidos nucleicos úteis para o controle de pragas coleópteras podem incluir: a sequência de ácido nucleico nativa isolada de Diabrotica, D Contig_01_Rho1_1191_CDC42 (SEQ ID NO:4); sequências de nucleotídeos que, quando expressadas, resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a uma molécula de RNA nativa que é codificada por Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4); sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, miRNA e/ou moléculas de hpRNA que sejam especificamente complementares a Contig_01_Rho1_1191_CDC42 (SEQ ID NO:4); e construtos de DNA recombinante usados para se conseguir uma transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que o alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos precedentes.

[00147] Nessas e em outras modalidades, moléculas de ácidos nucleicos úteis para o controle de pragas coleópteras podem incluir: um fragmento de uma proteína RHO1 pequena de ligação a GTP de Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; sequências de nucleotídeos que, quando expressadas, resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a uma molécula de RNA nativa de Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a toda ou a parte de qualquer uma das

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SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, miRNA e/ou moléculas de hpRNA que sejam especificamente complementares a toda ou a parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; e construtos de DNA recombinante usados para se conseguir uma transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que o alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos precedentes.

[00148] Nessas e em outras modalidades, moléculas de ácidos nucleicos adicionais úteis para o controle de pragas coleópteras podem incluir: D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1);

D_vir_c1229_VatpaseC (subunidade C da ATPase vacuolar) (SEQ ID NO:2); e D_vir_c1319_VatpaseH (subunidade H da ATPase vacuolar) (SEQ ID NO:3); sequências de nucleotídeos que, quando expressadas, resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a uma molécula de RNA nativa que é codificada por D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); ou D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que co mpreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); ou D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, miRNA e/ou moléculas de hpRNA que sejam especificamente complementares a D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); ou D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); e construtos de DNA recombinante usados para se conseguir uma transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que o alvo hospedeiro

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46/146 transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos precedentes.

B. Moléculas de ácidos nucleicos [00149] A presente invenção apresenta, entre outras coisas, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que inibem a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera; e moléculas de DNA capazes de ser expressadas como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera.

[00150] Algumas modalidades da invenção apresentam uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:4; o complemento da SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:87; o complemento da SEQ ID NO:87; SEQ ID NO:88; o complemento da SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; o complemento da SEQ ID NO:89; SEQ ID NO:90; o complemento da SEQ ID NO:90; SEQ ID NO:137; o complemento da SEQ ID NO:137; SEQ ID NO:138; o complemento da SEQ ID NO:138; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:4, 87-90, 137 e 138; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:4, 87-90, 137 e 138; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:4, 87

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90, 137 e 138; o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:4, 8790, 137 e 138; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138; e o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138. Em modalidades particulares, o contato com ou a captação pela praga coleóptera da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera.

[00151] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção também pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: toda ou parte da SEQ ID NO:1; todo ou parte do complemento da SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento da SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento da SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID

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NOs:1-3; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um o rganismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:13; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; e o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um o rganismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3. Em modalidades particulares, o contato com ou a captação pela praga coleóptera da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera.

[00152] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de DNA capaz(es) de ser expressada(s) como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão

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49/146 da praga coleóptera. Essa(s) sequência(s) de DNA pode(m) estar operacionalmente ligada(s) a uma sequência promotora que funcione em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou intensificar a transcrição da(s) molécula(s) de dsRNA codificada(s). Em uma modalidade, a pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência de DNA pode ser derivada da SEQ ID NO:4. Derivados da SEQ ID NO:4 incluem fragmentos de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, um fragmento de SEQ ID NO:4 pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138, ou um complemento de qualquer uma das precedentes. Assim, um fragmento de SEQ ID NO:4 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:4, ou seu complemento, e compreender toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138, ou seu complemento. Nessas e em outras modalidades, um fragmento de SEQ ID NO:4 pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:4, ou seu complemento. Assim, um fragmento de SEQ ID NO:4 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, cerca de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), cerca de 30, cerca de 40 (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais nucleotídeos contíguos da uma ou mais das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138, ou complemento do mesmo.

[00153] Em modalidades particulares, pelo menos uma sequência de DNA capaz de ser expressada como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera também pode

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50/146 compreender sequências de DNA que sejam derivadas de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que compreende as SEQ ID NOs:1-3. Derivados de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que compreende as SEQ ID NOs:1-3 incluem fragmentos de uma ou mais das SEQ ID NOs:1-3. Em algumas modalidades, um fragmento de uma ou mais das SEQ ID NOs:1-3 pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3, ou seu complemento. Assim, um fragmento de uma ou mais das SEQ ID NOs:1-3 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências nas SEQ ID NOs:1-3, ou seu complemento. Nessas e em outras modalidades, um fragmento de uma ou mais das SEQ ID NOs:1-3 pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3, ou seu complemento. Assim, um fragmento de uma ou mais das SEQ ID NOs:1-3 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, cerca de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), cerca de 30, cerca de 40 (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3, ou complemento do mesmo.

[00154] Algumas modalidades compreendem a introdução de moléculas de dsRNA parcial ou completamente estabilizadas na praga coleóptera para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera. Quando expressadas como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, e hpRNA) e captadas pela praga coleóptera, as sequências de ácidos nucleicos com

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51/146 preendendo um ou mais fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4 podem causar uma ou mais dentre morte, inibição do crescimento, alteração da proporção entre os sexos, redução no tamanho da ninhada, cessação da infecção e/ou cessação da alimentação pela praga coleóptera. Por exemplo, em algumas modalidades, apresentase uma molécula de dsRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos incluindo de cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que seja substancialmente homóloga a uma sequência de gene alvo da praga coleóptera e compreendendo a SEQ ID NO:4 ou toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138. Exemplos específicos de moléculas de dsRNA compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos que seja substancialmente homóloga a uma sequência de gene alvo da praga coleóptera e compreendendo a SEQ ID NO:4 ou toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138 podem ter, sem limitação, pelo menos 19, 20, 21, cerca de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), cerca de 30, cerca de 40 (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais nucleotídeos de comprimento. Essas moléculas de dsRNA também podem compreender um ou mais fragmentos de SEQ ID NOs:1-3. A expressão dessa molécula de dsRNA pode, por exemplo, levar a mortalidade em uma praga coleóptera que capte a molécula de dsRNA.

[00155] Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA apresentadas pela invenção compreendem sequências de nucleotídeos complementares a um gene alvo compreendendo a SEQ ID NO:4 e/ou sequências de nucleotídeos complementares a toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, cuja inibição do gene alvo em uma praga

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52/146 coleóptera resulta na redução ou remoção de uma proteína ou agente de sequência de nucleotídeos que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga coleóptera. A sequência de nucleotídeos selecionada pode exibir de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO:4; um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:4 compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; ou o complemento de qualquer uma das precedentes. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos selecionada pode exibir cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO:4; um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:4 compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; ou o complemento de qualquer uma das precedentes. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA apresentada pela invenção também pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeos complementares a um gene alvo compreendendo uma das SEQ ID NOs:1-3, cuja inibição do gene alvo em uma praga coleóptera resulta na redução ou remoção de uma proteína ou agente de sequência de nucleotídeos que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga coleóptera.

[00156] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressada como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene alvo pode compreender uma única sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a toda ou a parte da sequência de ácido nucleico nativa en

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53/146 corrtrada em uma ou mais espécies alvo de praga coleóptera, ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade dessas sequências especificamente complementares.

[00157] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda sequências de nucleotídeos separadas por uma sequência espaçadora. Uma sequência espaçadora pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação de estrutura secundária entre a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos, onde for desejado. Em uma modalidade, a sequência espaçadora é parte de uma sequência codificadora em senso ou antissenso para mRNA. A sequência espaçadora pode alternativamente compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que possam ser covalentemente ligados a uma molécula de ácido nucleico.

[00158] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifique uma ou mais moléculas de RNA diferentes, em que cada uma das moléculas de RNA diferentes compreende uma primeira sequência de nucleotídeos e uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são complementares entre si. A primeira e a segunda sequências de nucleotídeos podem estar conectadas dentro de uma molécula de RNA por uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode fazer parte da primeira sequência de nucleotídeos ou da segunda sequência de nucleotídeos. A expressão de uma molécula de RNA compreendendo a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos pode levar à formação de uma molécula de dsRNA da presente invenção, por hibridização específica das primeira e segunda sequências de nucleotídeos. A primeira sequência de nucleotídeos ou a segunda sequência de nucleotídeos pode ser substancialmente idêntica à sequência de ácido nu

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54/146 cleico nativa à praga coleóptera (por exemplo, um gene alvo ou sequência não codificadora transcrita), derivado da mesma ou sequência complementar a ela.

[00159] Moléculas de ácidos nucleicos de dsRNA compreendem fitas duplas de sequências de ribonucleotídeos polimerizadas e podem incluir modificações na estrutura principal de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. Modificações na estrutura do RNA podem ser ajustadas para permitir uma inibição específica. Em uma modalidade, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas mediante um processo enzimático ubíquo, de modo que se possam gerar moléculas de siRNA. Esse processo enzimático pode utilizar uma enzima RNAse III, como DICER em eucariotos, in vitro ou in vivo. Veja Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2. DICER ou enzimas RNAse III funcionalmente equivalentes clivam fitas maiores de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um com cerca de 19-25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por essas enzimas têm 2 a 3 nucleotídeos 3' pendentes e terminações 5' fosfato e 3' hidroxila. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RNAse III são desenroladas e separadas em RNA de fita simples na célula. As moléculas de siRNA, então, se hibridizam especificamente com sequências de RNA transcritas de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo celular inerente de degradação de RNA. Esse processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz da sequência RNA codificada pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento póstranscricional do gene alvo. Em algumas modalidades, moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAse III endógenas de moléculas de ácidos nucleicos heterólogas podem mediar eficientemente a regulação para baixo de genes alvo em pragas coleópteras.

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55/146 [00160] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir pelo menos uma sequência de nucleotídeos de ocorrência não natural que possa ser transcrita em uma molécula de RNA de fita simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo mediante hibridização intermolecular. Essas sequências de dsRNA tipicamente se automontam e podem ser fornecidas na fonte de nutrição da praga coleóptera para conseguir a inibição póstranscricional de um gene alvo. Nessas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender duas sequências de nucleotídeos de ocorrência não natural diferentes, cada uma especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga coleóptera. Quando essa molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA à praga coleóptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes na praga coleóptera.

C. Obtenção de moléculas de ácidos nucleicos [00161] Várias sequências nativas em pragas coleópteras podem ser usadas como sequências alvo para projetar moléculas de ácidos nucleicos da invenção, como iRNAs e moléculas de DNA que codificam iRNAs. A seleção de sequências nativas não é, entretanto, um processo direto. Apenas um pequeno número de sequências nativas nas pragas coleópteras serão alvos eficazes. Por exemplo, não se pode prever com certeza se uma sequência nativa particular pode ser eficazmente regulada para baixo por moléculas de ácidos nucleicos da invenção, ou se a regulação para baixo da sequência nativa particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera. A grande maioria das sequências nativas de pragas coleópteras, como ESTs isoladas delas (por exemplo, conforme relacionado na patente U.S. n° 7.612.194 e na patente U.S. n° 7.943.819), não têm um efeito prejudicial sobre o cresciPetição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 59/157

56/146 mento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera, como WCR ou NCR. Nem é previsível quais das sequências nativas que podem ter um efeito prejudicial sobre a praga coleóptera podem ser usadas em técnicas recombinantes para a expressão de moléculas de ácidos nucleicos complementares a essas sequências nativas em uma planta hospedeira e apresentar o efeito prejudicial sobre a praga coleóptera ao se alimentar sem causar danos à planta hospedeira.

[00162] Em algumas modalidades, moléculas de ácidos nucleicos da invenção (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira da praga coleóptera) são selecionadas como sequências alvo de cDNA que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para a sobrevivência da praga coleóptera, como sequências de aminoácidos envolvidas em vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão, parasitismo e outras. Conforme aqui descrito, a ingestão de composições por um organismo alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento deles sendo especificamente complementar a pelo menos um segmento de RNA substancialmente idêntico produzido nas células do patógeno alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Uma sequência de nucleotídeos, DNA ou RNA, derivada da praga coleóptera pode ser usada para construir células vegetais resistentes à infestação pelas pragas coleópteras. A planta hospedeira da praga coleóptera (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das sequências de nucleotídeos derivadas da praga coleóptera conforme aqui apresentado. A sequência de nucleotídeos transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que formam uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando, dessa forma, o dsRNA disponível se/quando a praga coleóptera forma uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isso

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57/146 pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga coleóptera e, finalmente, na morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

[00163] Assim, em algumas modalidades, toma-se como alvo um gene que esteja essencialmente envolvimento no crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga coleóptera. Outros genes alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham importantes papéis na viabilidade, movimentação, migração, crescimento, desenvolvimento, infectividade, estabelecimento de sítios de alimentação e reprodução da praga coleóptera. Um gene alvo pode, consequentemente, ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Além disso, uma sequência de nucleotídeos nativa da praga coleóptera para uso na presente invenção também pode ser derivada de um homólogo (por exemplo, um ortólogo) de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função seja conhecida por aqueles versados na técnica, e cuja sequência de nucleotídeos seja especificamente hibridizável com um gene alvo no genoma da praga coleóptera alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeos conhecida por hibridização são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00164] Em algumas modalidades, a invenção apresenta métodos para a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos para a produção de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA). Uma dessas modalidades compreende: (a) a análise de um ou mais genes alvo quanto a sua expressão, função e fenótipo por supressão de gene mediada por dsRNA em uma praga coleóptera; (b) a sondagem de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos ou seu homólogo de uma praga coleóptera alvo que apresente um fenótipo de crescimento

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58/146 ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) a identificação de um clone de DNA que hibridize especificamente com a sonda; (d) o isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) o sequenciamento do fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada transcreve toda ou uma parte substancial da sequência de RNA ou seu homólogo; e (f) a síntese química de toda ou uma parte substancial de uma sequência de gene, ou um siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA. [00165] Em modalidades adicionais, um método para a obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos para a produção de uma parte substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) inclui: (a) a síntese de primeiro e de segundo iniciadores oligonucleotídicos especificamente complementares a uma parte de uma sequência de nucleotídeos nativa da praga coleóptera alvo; e (b) a amplificação de um enxerto de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando os primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada transcreve uma parte substancial de uma molécula de siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00166] Ácidos nucleicos da invenção podem ser isolados, amplificados ou produzidos por inúmeras abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) pode ser obtida por amplificação por PCR da sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, um gene alvo ou uma sequência não codificadora transcrita alvo) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou partes dela. DNA ou RNA pode ser extraído de um organismo alvo, e bibliotecas de ácidos nucleicos podem ser preparadas com ele usandose métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e as bibliote

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59/146 cas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo alvo podem ser usadas para amplificação por PCR e sequenciamento de genes alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser usado como um molde para transcrição in vitro para gerar RNA em senso e antissenso com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácidos nucleicos podem ser sintetizadas por qualquer uma de inúmeras técnicas (Veja, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 54195423), incluindo o uso de um sintetizador de DNA automatizado (por exemplo, um Sintetizador de DNA/RNA da P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) modelo 392 ou 394), usando química padrão, como química de fosforamidita. Veja, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; patentes U.S. n° 4.980.460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Químicas alternativas que resultam em grupos de estrutural principal não naturais, como fosforotioato, fosforamidato e outros, também podem ser empregadas.

[00167] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser química ou enzimaticamente produzida por aqueles versados na técnica mediante reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA. RNA também pode ser produzido por síntese orgânica parcial ou total- qualquer ribonucleotídeo modificado por ser introduzido por síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, T3 RNA polimerase, T7 RNA polimerase, e SP6 RNA polimerase). Construtos de expressão úteis para a clonagem e expressão de sequências de nucleotídeos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Publicação PCT Internacional n° WO 97/32016 e as patentes

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U.S. n° 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. Moléculas de RNA que sejam quimicamente sintetizadas ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação desses. Alternativamente, moléculas de RNA que sejam quimicamente sintetizadas ou por síntese enzimática in vitro podem ser usadas sem nenhuma ou um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar perdas devidas ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secadas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o anelamento e/ou estabilização das fitas dúplex da molécula de dsRNA.

[00168] Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma única fita de RNA autocomplementar ou por duas fitas de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição das uma ou duas fitas de RNA in vivo, ou se pode usar RNA polimerase clonada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga coleóptera pode ser direcionada pelo hospedeiro por transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico para tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que seja sensível a infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos) e/ou manipulação da transcrição em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, usando promotor específico para um estágio do desenvolvimento). Fitas de RNA que formam uma molécula de dsRNA, transcrita in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadeniladas e podem ou não ser traduzidas

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61/146 em um polipeptídio pelo aparato de tradução de uma célula.

D. Vetores recombinantes e transformação da célula hospedeira [00169] Em algumas modalidades, a invenção também apresenta uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeos que, com a expressão em RNA e ingestão pela praga coleóptera, consegue a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera. Assim, algumas modalidades apresentam uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de ser expressada como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) em uma célula vegetal para inibir a expressão do gene alvo em uma praga coleóptera. Para iniciar ou intensificar a expressão, essas moléculas de ácidos nucleicos recombinantes podem compreender uma ou mais sequências reguladoras, essas sequências reguladoras podendo estar operacionalmente ligadas à sequência de ácido nucleico capaz de ser expressada como um iRNA. Métodos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos e podem ser usados para expressar uma sequência de nucleotídeos da presente invenção. Veja, por exemplo, a Publicação PCT Internacional n° WO06073727 e a publicação de patente U.S. n° 2006/0200878 Al) [00170] Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA. Essas moléculas de DNA recombinantes podem codificar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de gene(s) alvo endógeno(s) em uma célula de praga coleóptera com a ingestão. Em muitas modalidades, uma molécula de dsRNA transcrita pode ser fornecida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura em grampo e de haste-alça.

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62/146 [00171] Nessas e em outras modalidades, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeos que seja substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:4; o complemento da SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:87; o complemento da SEQ ID NO:87; SEQ ID NO:88; o complemento da SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; o complemento da SEQ ID NO:89; SEQ ID NO:90; o complemento da SEQ ID NO:90; SEQ ID NO:137; o complemento da SEQ ID NO:137; SEQ ID NO:138; o complemento da SEQ ID NO:138; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:4, 87-90, 137 e 138; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 87-90, 137 e 138; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 87-90, 137 e 138; o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa co mpreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 87-90, 137 e 138; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88

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90, 137 e 138; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138; e o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um o rganismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa co mpreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-90, 137 e 138.

[00172] Uma fita de uma molécula de dsRNA também pode ser formada por transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeos que seja substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento da SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento da SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:13; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento do frag

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64/146 mento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; e o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3.

[00173] Em modalidades particulares, a molécula de DNA recombinante que codifica uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos duas sequências de nucleotídeos com uma sequência codificadora disposta de modo que uma sequência de nucleotídeos esteja em uma orientação senso, e a outra sequência de nucleotídeos esteja em uma orientação antissenso, com relação a pelo menos um promotor, em que a sequência de nucleotídeos em senso e a sequência de nucleotídeos antissenso estão ligadas ou conectadas por uma sequência espaçadora de cerca de cinco (~5) a cerca de mil (~1.000) nucleotídeos. A sequência espaçadora pode formar uma alça entre as sequências em senso e antissenso. A sequência de nucleotídeos em senso ou a sequência de nucleotídeos antissenso pode ser substancialmente homóloga à sequência de nucleotídeos de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs:1-4) ou fragmento da mesma. Em algumas modalidades, entretanto, a molécula de DNA recombinante pode codificar uma molécula de dsRNA sem a sequência espaçadora. Em algumas modalidades, uma sequência codificadora em senso e uma sequência codificadora antissenso podem ter diferentes comprimentos.

[00174] Sequências identificadas como possuindo um efeito preju

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65/146 dicial para pragas coleópteras ou um efeito protetor para plantas com relação a pragas coleópteras podem ser prontamente incorporadas em moléculas de dsRNA expressadas mediante a criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, essas sequências podem ser expressadas como uma estrutura em grampo com haste e alça tomandose um primeiro segmento que corresponda a uma sequência de gene alvo (por exemplo, SEQ ID NO:4 e sequências compreendendo toda ou parte de uma das SEQ ID NOs:88-90); ligando-se essa sequência a um segundo segmento de região espaçadora que não seja homólogo ou complementar ao primeiro segmento, e ligando-se este a um terceiro segmento, em que pelo menos uma parte do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Esse construto forma uma estrutura de haste e alça por hibridização do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça se forma compreendendo o segundo segmento. Veja, por exemplo, as publicações de patentes U.S. n° US 2002/0048814 e US 2003/0018993; e as Publicações PCT Internacionais n° WO94/01550 e WO98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura em fita dupla, como uma estrutura de haste-alça (por exemplo, em grampo), pelo que a produção de siRNA direcionado para uma sequência nativa da praga coleóptera é intensificada por coexpressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo, em um cassete expressável em plantas adicional, que leva a uma produção aumentada de siRNA ou reduz a metilação para evitar silenciamento transcricional de gene do promotor em grampo de dsRNA.

[00175] Modalidades da invenção incluem a introdução da molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para se atingirem níveis inibidores para a praga coleóptera da expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. A molé

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66/146 cula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, como plasmídio linear ou circular fechado. O sistema vetor pode ser um único vetor ou plasmídio ou dois ou mais vetores ou plasmídios que contenham juntos o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, o vetor pode ser um vetor de expressão. Sequências de ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funcione em um ou mais hospedeiros para ativar a expressão de uma sequência codificadora ou outra sequência de DNA ligada. Há muitos vetores disponíveis para essa finalidade, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo de sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira particular com a qual é compatível.

[00176] Para conferir resistência a pragas coleópteras a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forme uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência de nucleotídeos que seja substancialmente homóloga e especificamente hibridizável à sequência de nucleotídeos transcrita correspondente dentro uma praga coleóptera que possa se alimentar da espécie da planta hospedeira. A praga coleóptera pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, por ingestão de células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendam a molécula de iRNA. Assim, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de pragas coleópteras que infestem a planta hospedeira transgênica.

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Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene alvo na praga coleóptera alvo pode resultar na planta sendo resistente à praga.

[00177] Para permitir a distribuição de moléculas de iRNA à praga coleóptera em uma relação nutricional com uma célula vegetal que tenha sido transformada com a molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, é requerida a expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula vegetal. Assim, a molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeos da invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras, como uma sequência promotora heteróloga que funcione em uma célula hospedeira, como uma célula bacteriana, em que a molécula de ácido nucleico deva ser amplificada ou em uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deva ser expressada.

[00178] Promotores adequados para uso em moléculas de ácidos nucleicos da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos descrevendo esses promotores incluem as patentes U.S. n° 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor35S); 6.433.252 (promotor da L3 oleosina do milho); 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz e íntron da actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sais); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e pedido de patente U.S. n° de série 09/757.089 (promotor da aldolase de cloroplasto de milho). PromotoPetição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 71/157

68/146 res adicionais incluem o promotor da nopalina sintetase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9) e o promotor da octopina sintetase (OCS) (ambos portados em plasmídios indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovírus, como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); o promotor da sacarose sintetase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor do complexo de gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação a clorofila a/b; CaMV35S (patentes U.S. n° 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV35S (patentes

U.S. n° 6.051.753 e 5.378.619); um promotor PC1SV (patente U.S. n° 5.850.019); o promotor SCP1 (patente U.S. n° 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (GenBank Accession No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00179] Em modalidades particulares, as moléculas de ácidos nucleicos da invenção compreendem um promotor específico para tecido, como um promotor específico para raiz. Promotores específicos para raízes ativam a expressão de sequências operacionalmente ligadas exclusiva ou preferencialmente em tecido de raiz. Exemplos de promotores específicos para raízes são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as patentes U.S. n° 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos ou fragmento para controle de praga coleóptera de acordo com a invenção pode ser clonada entre dois promotores específicos para raízes, que sejam operacionais em uma célula vegetal transgêni

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69/146 ca e expressados nela para produzir moléculas de RNA na célula de planta transgênica que pode subsequentemente formar moléculas de dsRNA, conforme acima descrito. As moléculas de iRNA expressadas em tecidos vegetais podem ser ingeridas pela praga coleóptera de modo a se conseguir a supressão da expressão do gene alvo.

[00180] Sequências reguladoras adicionais que podem opcionalmente estar operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse incluem 5' UTRs localizadas entre uma sequência promotora e uma sequência codificadora que funcione como uma sequência líder de tradução. A sequência líder de tradução está presente no mRNA completamente processado, e pode afetar o processamento do transcrito primário e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líder de tradução incluem os líderes da proteína do choque térmico do milho e da petúnia (patente U.S. n° 5.362.865), líderes da proteína do revestimento de vírus de plantas, líderos de Rubisco de plantas e outros. Veja, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitativos de 5' UTRs incluem GmHsp (patente U.S. n° 5.659.122); PhDnaK (patente U.S. n° 5.362.865); AtAnt1; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:15907); e AGRtunos (n° de acesso no GenBank V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00181] Sequências reguladoras adicionais que podem opcionalmente estar operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem sequências 3' não traduzidas, regiões de término de transcrição 3' ou regiões de poliadenilação. Esses são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeos e incluem polinucleotídeos que forneçam um sinal de poliadenilação e/ou outros sinais capazes de afetar a transcrição ou processamento do mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas causando a adição de nucleotídeos poliadenilato à extremidade 3' do

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70/146 precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de vários genes de plantas ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitativo de uma região de término de transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintetase (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de diferentes regiões 3' não traduzidas é apresentado em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:67180. Exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank Accession No. E01312).

[00182] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transfo rmação de plantas que compreenda uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos uma das sequências reguladoras acima descritas operacionalmente ligadas a uma ou mais sequências de nucleotídeos da presente invenção. Quando expressada, a uma ou mais sequências de nucleotídeos resulta em um ou mais moléculas de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar a toda ou a parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga coleóptera. Assim, a(s) sequência(s) de nucleotídeo(s) pode(m) compreender um segmento que codifique toda ou parte de uma sequência de ribonucleotídeos presente dentro de um transcrito de RNA da praga coleóptera alvo e pode compreender repetições invertidas de todo ou de uma parte de um transcrito da praga coleóptera alvo. Um vetor de transformação de plantas pode conter sequências especificamente complementares a mais de uma sequência alvo, permitindo, dessa forma, a produção de mais de um dsRNA para inibição da expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pragas coleópteras alvo. Segmentos de sequências de nucleotídeos especificamente complementares a sequências de nucleotídeos presentes em diferentes ge

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71/146 nes podem ser combinados em uma única molécula compósita de ácido nucleico para expressão em uma planta transgênica. Esses segmentos podem ser contíguos ou estar separados por uma sequência espaçadora.

[00183] Em algumas modalidades, um plasmídio da presente invenção já contendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de sequências de nucleotídeos adicionais no mesmo plasmídio, em que a(s) sequência(s) de nucleotídeo(s) adicional(ais) está(ão) operacionalmente ligada(s) aos mesmos elementos reguladores que a pelo menos uma sequência de nucleotídeo original. Em algumas modalidades, pode-se projetar uma molécula de ácido nucleico para a inibição de múltiplos genes alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de praga coleóptera, o que pode intensificar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em o utras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas coleópteras, o que pode ampliar a gama de pragas coleópteras contra as quais o(s) agente(s) é(são) eficaz(es). Quando múltiplos genes são alvo de supressão ou de uma combinação de expressão e supressão, pode-se fabricar um elemento de DNA policistrônico.

[00184] A molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confira um fenótipo selecionável a uma célula transformada, como uma célula vegetal. Marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendam molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina e outros) ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não se limitam a: um

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72/146 gene neo que codifica a resistência a canamicina e pode ser selecionado usando-se canamicina, G418 e outros; um gene bar que codifica a resistência a bialafos; um gene de EPSP sintetase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência à bromoxinila; um gene de acetolactato sintetase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolínio ou sulfonilureia; e um gene DHFR resistente a metotrexato. Há múltiplos marcadores selecionáveis disponíveis que conferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina e outros. Exemplos desses marcadores selecionáveis são ilustrados, por exemplo, nas patentes U.S. n° 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[00185] A molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção também pode incluir um marcador de triagem. Marcadores de triagem podem ser usados para monitorizar a expressão. Marcadores de triagem exemplificativos incluem um gene de βglucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual se conhecem vários substratos cromogênicos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. Em 18^th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson e R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual se conhecem vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogêni

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73/146 cos (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tiroxina em DOPA e dopaquinona que, por sua vez, se condensa em melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma α-galactosidase.

[00186] Em algumas modalidades, moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, conforme acima descrito, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibam suscetibilidade reduzida a pragas coleópteras. Vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, por inserção de moléculas de ácidos nucleicos que codifiquem moléculas de iRNA em vetores de transformação de plantas e introdução desses em plantas.

[00187] Métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual DNA possa ser introduzido em uma célula, como por transformação de protoplastos (Veja, por exemplo, a patente U.S. n° 5.508.184), por captação de DNA mediada por dessecação/inibição (Veja, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), por eletroporação (Veja, por exemplo, a patente U.S. n° 5.384.253), por agitação com fibras de carboneto de silício (Veja, por exemplo, as patentes U.S. n° 5.302.523 e 5.464.765), por transformação mediada por Agrobacterium (Veja, por exemplo, as patentes U.S. n° 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877;

5.981.840 e 6.384.301) e por aceleração de partículas revestidas com DNA (Veja, por exemplo, as patentes U.S. n° 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 e 6.403.865), e outras. Técnicas que são particularmente úteis para a transformação de milho são descritas, por exemplo, nas patentes U.S. n° 7.060.876 e 5.591.616; e na Publicação PCT Internacional WO 95/06722. Mediante aplicação de técni

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74/146 cas como essas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser transformadas de maneira estável. Em algumas modalidades, o DNA de transformação é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codifiquem uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00188] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para planta que transformam geneticamente células vegetais. Os plasmídios Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, são portadores de genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídios Ti (indutores de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídio Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é margeada por repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram deletados, e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA estranho margeado pelas sequências de borda de T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para uma recuperação eficiente de plantas e células transgênicas, e um sítio de clonagem múltipla para a inserção de sequências para transferência, como um ácido nucleico que codifique dsRNA.

[00189] Assim, em algumas modalidades, o vetor de transformação de plantas é derivada de um plasmídio Ti de A. tumefaciens (Veja, por exemplo, as patentes U.S. n° 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e

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5.501.967; e a patente europeia EP 0 122 791) ou de um plasmídio Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, aqueles descritos por HerreraEstrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na patente europeia EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos precedentes. Outras bactérias, como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium, que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de gene para inúmeras o utras plantas. Essas bactérias simbióticas associadas a plantas podem ser tornadas competentes para transferência de genes por aquisição tanto de um plasmídio Ti desarmado, quando de um vetor binário adequado.

[00190] Depois de fornecer o DNA exógeno a células receptoras, as células transformadas em geral são identificadas por cultivo adicional e regeneração da planta. Para melhorar a capacidade de identificar células transformadas, pode ser desejável empregar um gene de marcador selecionável ou de triagem, conforme anteriormente exposto, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso de se usar um marcador selecionável, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas por exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso de se usar um marcador de triagem, as células podem ser triadas quanto ao traço de gene marcador desejado.

[00191] Células que sobrevivam à exposição ao agente seletivo, ou células que tenham sido marcadas como positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que sustentem a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado por inclusão de substâncias adicionais, como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com regu

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76/146 ladores do crescimento até que haja tecido suficiente disponível para iniciar os esforços de regeneração de plantas, ou após rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então, transferido para meios que conduzam à formação de rebentos. As culturas são periodicamente transferidas até que tenha ocorrido uma formação de rebentos suficiente. Uma vez formados os rebentos, eles são transferidos para meios que conduzam à formação de raízes. Uma vez formadas raízes suficientes, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento adicional e maturação.

[00192] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA que codifique uma ou mais moléculas de iRNA que inibam a expressão do gene alvo em uma praga coleóptera) nas plantas regeneradas, podem-se realizar vários ensaios. Esses ensaios incluem, por exemplo: ensaios de biologia molecular, como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou por função enzimática; ensaios em partes de plantas, como ensaios de folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

[00193] Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, por amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores oligonucleotídicos específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. Entende-se que a genotipagem por PCR inclui, mas não se limita a, amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) de DNA genômico derivado de tecido de calo isolado da planta hospedeira que se postula que contenha uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido por clonagem padrão e análise de sequência dos produtos de amplificação de PCR. Métodos de genotipa

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77/146 gem por PCR já foram descritos (por exemplo, Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados a DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas celulares.

[00194] Uma planta transgênica formada usando-se métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma única sequência de DNA recombinante inserida em um cromossomo. A sequência de DNA recombinante única é chamada de evento transgênico ou evento de integração. Essas plantas transgênicas são hemizigóticas para a sequência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigótica com relação a um transgene pode ser obtida por cruzamento sexuado (autopolinização) de uma planta transgênica segregante independente que contenha uma única sequência de gene exógena a si mesma, por exemplo, uma planta F0, para produzir uma semente Fl. Um quarto das sementes Fl produzidas será homozigótico com relação ao transgene. A germinação das sementes Fl resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tiicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permita a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).

[00195] Em modalidades particulares, produzem-se pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes em uma célula vegetal que têm um efeito inibidor de praga coleóptera. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressadas a partir de múltiplas sequências de ácidos nucleicos introduzidas em diferentes eventos de transformação, ou a partir de uma única sequência de ácido nucleico introduzida em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressadas sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são

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78/146 expressadas sob o controle de múltiplos promotores. Podem-se expressar moléculas únicas de iRNA que compreendem múltiplas sequências de ácidos nucleicos que sejam homólogas a diferentes loci dentro de uma ou mais pragas coleópteras (por exemplo, os loci definidos pela SEQ ID NO:4 e uma ou mais das SEQ ID NOs:1-3), tanto em diferentes populações da mesma espécie de praga coleóptera, quanto em diferentes espécies de pragas coleópteras.

[00196] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma primeira planta com pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta desprovida desse evento. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que seja suscetível a transformação para produzir uma planta transgênica, essa planta transgênica podendo ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introgressar a sequência de nucleotídeos que codifica a molécula de iRNA no fundo genético da segunda linhagem de planta.

[00197] Algumas modalidades da invenção também incluem mercadorias contendo uma ou mais das sequências da presente invenção que sejam produzidas pela planta recombinante ou sementes contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção. Uma mercadoria contendo uma ou mais das sequências da presente invenção pretende incluir, mas não se limita a, farelos, óleos, grãos triturados ou inteiros ou sementes de uma planta, ou qualquer produto alimentar compreendendo qualquer farelo, óleo ou grão triturado ou inteiro da planta recombinante ou semente contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em uma ou mais mercado

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79/146 rias ou produtos de consumo aqui considerado é, de fato, prova de que a mercadoria ou produto de consumo é composto por uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção para fins de controle de uma doença de planta usando métodos de supressão de gene mediada por dsRNA.

[00198] Em alguns aspectos, estão incluídas sementes e produtos de consumo produzidos por plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas, em que as sementes ou produtos de consumo compreende uma quantidade detectável da sequência de ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, esses produtos de consumo podem ser produzidos, por exemplo, por obtenção de plantas transgênicas e preparação de alimentos ou rações com elas. Produtos de consumo compreendendo uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: farelos, óleos, grãos triturados ou inteiros ou sementes de uma planta, e qualquer produto alimentar compreendendo qualquer farelo, óleo ou grão triturado ou inteiro da planta ou semente recombinante compreendendo uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos da invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da invenção em uma ou mais mercadorias ou produtos de consumo é, de fato, prova de que a mercadoria ou produto de consumo é composto por uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para fins de controle de pragas coleópteras.

[00199] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico em seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico do qual seja transcrita uma molécula de iRNA que tenha como alvo um locus em uma praga coleóptera diferente dos definidos pelas SEQ ID

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NOs:1-4; um evento transgênico do qual seja transcrita uma molécula de iRNA que tenha como alvo um gene em um organismo diferente da praga coleóptera (por exemplo, um nematódeo parasita de plantas); um gene que codifique uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene que confira tolerância a glifosato); e um gene que contribua para um fenótipo desejável na planta transgênica, como maior rendimento, metabolismo de ácidos graxos alterado ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática. Em modalidades particulares, sequências que codificam moléculas de iRNA da invenção podem ser combinadas com traços de controle de doenças e o utros traços de controle de insetos em uma planta para se o bterem traços desejados para um maior controle de doenças de plantas e danos por insetos. A combinação de traços de controle de insetos que empreguem modos de ação distintos pode fornecer plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior a plantas portadoras de um único traço de controle, por exemplo, por causa da probabilidade reduzida de que a resistência ao(s) traço(s) se desenvolva no campo.

V. Supressão de gene alvo em uma praga coleóptera

A. Visão geral [00200] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser fornecida a uma praga coleóptera, em que a molécula de ácido nucleico leva ao silenciamento de gene mediado por RNAi na praga coleóptera. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, e hpRNA) pode ser fornecida ao hospedeiro coleóptero. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser fornecida a uma praga coleóptera por contato da molécula de ácido nucleico com a praga coleóptera. Nessas e em outras modalidades,

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81/146 uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser fornecida em um substrato de alimentação da praga coleóptera, por exemplo, uma composição nutricional. Nessas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser fornecida mediante a ingestão de material da planta compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerido pela praga coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente em material da planta mediante expressão da sequência de ácido nucleico recombinante introduzida no material de planta, por exemplo, por transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico recombinante e regeneração de um material da planta ou da planta inteira a partir da célula vegetal transformada.

B. Supressão de gene alvo mediada por RNAi [00201] Em algumas modalidades, a invenção apresenta moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, e hpRNA) que podem ser projetadas para ter como alvo sequências de nucleotídeos nativas essenciais (por exemplo, genes essenciais) no genoma e/ou uma biblioteca de cDNA da praga coleóptera (por exemplo, WCR ou NCR), por exemplo, projetando-se uma molécula de iRNA que compreenda pelo menos uma fita compreendendo uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente complementar à sequência alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim projetada pode ser idêntica à sequência alvo, ou pode incorporar faltas de correspondências que não impeçam a hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência alvo.

[00202] Moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para supressão de gene em uma praga coleóptera, reduzindo, dessa forma, o nível ou a incidência dos danos causados pela praga em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida co m

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82/146 preendendo uma molécula de iRNA). Conforme aqui usado, o termo supressão de gene se refere a qualquer um dos métodos bem conhecidos para reduzir os níveis de proteína produzida como resultado da transcrição do gene em mRNA e subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução da expressão de proteína de um gene ou uma sequência codificadora que inclua inibição pós-transcricional da expressão e supressão transcricional. A inibição pós-transcricional é mediada por homologia específica entre todo ou parte de um mRNA transcrito de um um gene ou sequência codificadora alvo de supressão e a correspondente molécula de iRNA usada para supressão. E inibição póstranscricional se refere à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomos. [00203] Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima DICER em moléculas curtas de siRNA (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de fita dupla gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de fita simples; a fita passageira e a fita guia. A fita passageira pode ser degradada, e a fita guia pode ser incorporada em RISC. A inibição pós-transcricional ocorre por hibridização específica da fita guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA e clivagem subsequente pela enzima Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).

[00204] Em modalidades da invenção, pode-se usar qualquer forma de molécula iRNA. Aqueles versados na técnica compreenderão que moléculas de dsRNA são tipicamente mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de fornecimento da molécula de iRNA a uma célula do que moléculas de RNA de fita simples, e também são tipicamente mais estáveis em uma célula. Assim, embora moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em al

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83/146 gumas modalidades, pode-se escolher uma molécula de dsRNA devido a sua estabilidade.

[00205] Em modalidades particulares, fornece-se uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos, essa sequência de nucleotídeos podendo ser expressada in vitro para produzir uma molécula de iRNA que seja substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por uma sequência de nucleotídeos dentro do genoma da praga coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de haste-alça. Após a praga coleóptera contatar a molécula de iRNA transcrita in vitro, pode ocorrer a inibição pós-transcricional de um gene alvo na praga coleóptera (por exemplo, um gene essencial).

[00206] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga coleóptera, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:4; o complemento da SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:4; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:4; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO:4; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:4; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:4; o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos

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84/146 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:4; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa co mpreendendo a SEQ ID NO:4; e o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO:4. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende toda ou parte de uma ou mais das SEQ ID NOs:87-90, 137 e 138 (por exemplo, toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:88-90, 137 e 138). Em certas modalidades, pode-se usar a expressão de uma molécula de ácido nucleico que seja pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) a qualquer uma das precedentes. Nessas e em outras modalidades, pode-se expressar uma molécula de ácido nucleico que se hibridize especificamente a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula da praga coleóptera.

[00207] Nessas e em outras modalidades, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico adicional compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos pode ser usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga coleóptera, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o

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85/146 complemento da SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento da SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento da SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento da uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento da uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3; e o complemento do fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificadora nativa de um organismo Diabrotica que seja transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1-3. Em certas modalidades, pode-se usar a expressão de uma molécula de ácido nucleico que seja pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cer

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86/146 ca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) a qualquer uma das precedentes. Nessas e em outras modalidades, pode-se expressar uma molécula de ácido nucleico que se hibridize especificamente a uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula da praga coleóptera.

[00208] É uma característica importante de algumas modalidades da invenção que o sistema de inibição pós-transcricional RNAi seja capaz de tolerar as variações de sequência entre os genes alvo que se poderia esperar devido a mutação genética, polimorfismo de cepa ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucleico introduzida não precisa ser absolutamente homóloga a um produto de transcrição primário ou a um mRNA completamente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável a um produto de transcrição primário ou a um mRNA completamente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida não precisa ser de comprimento total com relação a um produto de transcrição primário ou a um mRNA completamente processado do gene alvo.

[00209] A inibição de um gene alvo usando a tecnologia iRNA da presente invenção é específica para sequência; isto é, sequências de nucleotídeos substancialmente homólogas à(s) molécula(s) de iRNA são alvos de inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos idêntica a uma parte de uma sequência do gene alvo pode ser usada para inibição. Nessas e em outras modalidades, pode-se usar uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos com uma ou mais inserções, deleções e/ou mutações pontuais com relação a uma sequência de gene alvo. Em modalidades particulares, uma molécula

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87/146 de iRNA e uma parte de um gene alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de

97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 100% e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região de dúplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma parte de um transcrito de gene alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência de comprimento menor que o total exibindo uma maior homologia compensa uma sequência mais longa e menos homóloga. O comprimento da sequência de nucleotídeos de uma região de dúplex de uma molécula de dsRNA que seja idêntica a uma parte de um transcrito de gene alvo pode ter pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos cerca de 1.000 bases. Em algumas modalidades, pode-se usar uma sequência de mais de 20-100 nucleotídeos. Em modalidades particulares, pode-se usar uma sequência de mais de cerca de 200-300 nucleotídeos. Em modalidades particulares, pode-se usar uma sequência de mais de cerca de 500-1000 nucleotídeos, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00210] Em certas modalidades, a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga coleóptera, de modo que ocorra uma inibição significativa. Inibição significativa se refere a uma inibição acima de um limiar que resulte em um fenótipo detectável (por exemplo, cessação do cresciPetição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 91/157

88/146 mento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento e mortalidade do inseto e outros), ou uma diminuição detectável no RNA e/ou produto de gene correspondente ao gene alvo que está sendo inibido. Embora em certas modalidades da invenção a inibição ocorra em substancialmente todas as células da praga coleóptera, em outras modalidades, a inibição ocorre apenas em um subconjunto de células que expressam o gene alvo.

[00211] Em algumas modalidades, a supressão transcricional é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA que exibe identidade de sequência substancial a uma sequência DNA promotora ou seus complementos para efetuar o que se chama de trans-supressão de promotor. A supressão de gene pode ser eficaz contra genes alvo em uma praga coleóptera que possa ingerir ou co ntatar essas moléculas de dsRNA, por exemplo, por ingestão de ou contato com material da planta contendo as moléculas de dsRNA. Moléculas de dsRNA para uso na trans-supressão de promotor podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da praga coleóptera. A supressão pós-transcricional de um gene por RNA orientado em antissenso ou senso para regular a expressão do gene em células vegetais é apresentada nas patentes U.S. n° 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184; e 5.231.020.

C. Expressão de moléculas de iRNA fornecidas à praga coleóptera [00212] A expressão de moléculas de iRNA para inibição de gene mediada por RNAi em uma praga coleóptera pode ser realizada em qualquer um dos muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem ser, então, fornecidas à praga coleóptera, por exemplo, por contato das moléculas de iRNA com a praga, ou fazendo com que a praga ingira ou de outra forma internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiras trans

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89/146 formadas de pragas coleópteras, células vegetais transformadas e a descendência de plantas transformadas. As células vegetais transformadas e as plantas transformadas podem ser manipuladas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para conferir um efeito protetor contra pragas. Assim, quando uma planta transgênica ou célula vegetal é consumida pela praga coleóptera durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressadas nas plantas ou células transgênicas. As sequências de nucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidas em uma ampla variedade de micro-organismos hospedeiros procarióticos e eucarióticos para produzir moléculas de iRNA. O termo micro-organismo inclui espécies procarióticas e eucarióticas, como bactérias e fungos.

[00213] A modulação da expressão do gene pode incluir a supressão parcial ou completa dessa expressão. Em outra modalidade, um método para a supressão da expressão do gene em uma praga coleóptera compreende o fornecimento no tecido do hospedeiro da praga de uma quantidade supressora de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA transcrita de uma sequência de nucleotídeos conforme aqui descrita, pelo menos um segmento dela sendo complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da praga coleóptera. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada como uma molécula de siRNA, miRNA ou hpRNA, ingerida por micro-organismo patogênico de acordo com a invenção pode ser pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-4. Consequentemente, apresentam-se moléculas de ácidos nucleicos isoladas e substancialmente purificadas

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90/146 incluindo, mas não limitadas a, sequências de nucleotídeos de ocorrência não natural e construtos de DNA recombinante para transcrição de moléculas de dsRNA da presente invenção, que suprimem ou inibem a expressão de uma sequência codificadora endógena ou sequência codificadora alvo na praga coleóptera quando introduzidas nela.

[00214] Modalidades particulares apresentam um sistema de distribuição para a distribuição de moléculas de iRNA para a inibição póstranscricional de um ou mais genes alvo em uma praga coleóptera parasita de plantas e controle de uma população da praga coleóptera parasita de plantas. Em algumas modalidades, o sistema de distribuição compreende a ingestão de uma célula vegetal transgênica hospedeira ou do conteúdo da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nessas e em outras modalidades, cria-se uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica que contém um construto de DNA recombinante que transcreve uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células vegetais transgênicas e plantas transgênicas compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codifiquem uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando-se tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de plantas compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifique uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar a célula vegetal transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00215] Para conferir resistência a pragas coleópteras a uma planta transgênica, a molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA ou uma molécula

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91/146 de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir da molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Essa molécula de dsRNA pode ser composta em parte por uma sequência de nucleotídeos que seja idêntica a uma sequência de nucleotídeos correspondente transcrita de uma sequência de DNA dentro de uma praga coleóptera de um tipo que possa parasitar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro da praga coleóptera é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão da expressão do gene alvo na praga coleóptera resulta em a planta transgênica ser resistente à praga coleóptera. Os efeitos moduladores de moléculas de dsRNA se mostraram aplicáveis a vários genes expressados em pragas, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutenção; fatores de transcrição; genes relacionados à muda; e outros genes que codifiquem polipeptídios envolvidos em metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.

[00216] Para transcrição a partir de um transgene in vivo ou construto de expressão, pode-se usar uma região reguladora (por exemplo, promotor, intensificador, silenciado, e sinal de poliadenilação) em algumas modalidades para transcrever a fita (ou fitas) de RNA. Consequentemente, em algumas modalidades, conforme acima exposto, uma sequência de nucleotídeos para uso na produção de moléculas de iRNA pode estar operacionalmente ligada a uma ou mais sequências promotoras funcionais em uma célula hospedeira da planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. A sequência de nucleotídeos da presente invenção, sob o controle de uma sequência promotora operacionalmente ligada, também pode ser flanqueada por sequências adicionais que vantajosamente afetem sua transcrição e/ou a estabilidade de um

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92/146 transcrito resultante. Essas sequências podem estar localizadas a montante do promotor operacionalmente ligado, a jusante da extremidade 3' do construto de expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor, quanto a jusante da extremidade 3' do construto de expressão.

[00217] Algumas modalidades apresentam métodos para reduzir os danos a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causados pela praga coleóptera que se alimenta da planta, em que o método compreende o fornecimento na planta hospedeira de uma célula vegetal transformada que expresse pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) funciona(m) ao ser(em) captada(s) pela praga coleóptera para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera, essa inibição da expressão resultando em mortalidade, crescimento reduzido e/ou reprodução reduzida da praga coleóptera, reduzindo, dessa forma, os danos à planta hospedeira causados pela praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) compreende(m) moléculas de dsRNA. Nessas e em outras modalidades, a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) co mpreende(m) moléculas de dsRNA que compreendem, cada uma, mais de uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) consiste(m) em uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga coleóptera.

[00218] Em algumas modalidades, apresenta-se um método para aumentar o rendimento de uma colheita de milho, em que o método compreende a introdução em uma planta de milho de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; o cultivo da planta de milho

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93/146 para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico inibe danos por e/ou o crescimento da praga coleóptera, reduzindo ou eliminando, dessa forma, uma perda de rendimento devido a uma infestação por praga coleóptera. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em outras modalidades, a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) compreende(m) moléculas de dsRNA que compreendem, cada uma, mais de uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) consiste(m) em uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga coleóptera.

[00219] Em algumas modalidades, apresenta-se um método para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera, o método compreendendo: a transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifique pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a um promotor e uma sequência de término de transcrição; o cultivo da célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais incluindo uma pluralidade de células vegetais transformadas; a seleção de células vegetais transformadas que tenham integrado a molécula de ácido nucleico em seus genomas; a triagem das células vegetais transformadas quanto à expressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada; a seleção de uma célula vegetal transgênica que expresse a molécula de iRNA; e a alimentação da célula vegetal

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94/146 transgênica selecionada à praga coleóptera. Plantas também podem ser regeneradas a partir de células vegetais transformadas que expressem uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em outras modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos compreendem moléculas de dsRNA que compreendem, cada uma, mais de uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) consiste(m) em uma sequência de nucleotídeos que seja especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga coleóptera.

[00220] Moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro de ou sobre as sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), como um produto de expressão de um gene recombinante incorporado no genoma das células vegetais ou incorporadas em um revestimento ou tratamento de semente que seja aplicado à semente antes do plantio. Uma célula vegetal compreendendo um gene recombinante é considerada como sendo um evento transgênico. Também estão incluídos sistemas de distribuição para a distribuição de moléculas de iRNA a pragas coleópteras. Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células da praga coleóptera. Métodos para a introdução podem incluir a misturação direta de iRNA com tecido vegetal de um hospedeiro para a praga coleóptera, assim como a aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção ao tecido da planta hospedeira. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a superfície da planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressada por um micro-organismo, e o micro-organismo pode ser apli

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95/146 cado à superfície da planta ou introduzido em uma raiz ou caule por meios físicos, como uma injeção. Conforme acima discutido, uma planta transgênica também pode ser geneticamente manipulada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas coleópteras que sabidamente infestem a planta. Moléculas de iRNA produzidas por síntese química ou enzimática também podem ser formuladas de uma maneira consistente com práticas agrícolas comuns e usadas como produtos pulverizáveis para o controle de doenças de plantas. As formulações podem incluir os fixadores e umectantes apropriados requeridos para uma cobertura foliar eficiente, assim como protetores contra UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) contra danos por UV. Esses aditivos são comumente usados na indústria de bioinseticidas e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Essas aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticidas por pulverização (de base biológica ou outra) para intensificar a proteção da planta contra pragas coleópteras.

[00221] Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados são aqui incorporados por referência, na medida em que não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos desta exposição, e são incorporados na mesma medida em que se cada referência fosse individual e especificamente indicada para incorporação por referência e fosse aqui apresentada em sua inteireza. As referências aqui discutidas são apresentadas apenas por sua exposição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser tomado como uma admissão de que os inventores não estão autorizados a anteceder essa exposição em virtude de invenção anterior.

[00222] Os Exemplos a seguir são apresentados para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Esses Exemplos não devem

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96/146 ser tomados como limitando a exposição às características ou aspectos particulares descritos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Materiais e Métodos Preparação da amostra e bioensaios.

[00223] Inúmeras moléculas de dsRNA (incluindo Cafl-180; região 1 da subunidade C da ATPase vacuolar (v-ATPase); região 2 da subunidade C da v-ATPase; região 1 da subunidade H da v-ATPase; região 2 da subunidade H da v-ATPase; e Rho1) foram sintetizadas e purificadas usando-se kit de RNAi MEGAscript® (AMBION, Foster City, CA). As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão TE, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle consistindo nesse tampão, que serviu de verificação de fundo da mortalidade ou inibição do crescimento de WCR. As concentrações das moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando-se um espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

[00224] As amostras foram testadas quanto à atividade dos insetos em bioensaios conduzidos com larvas de insetos recém-nascidas em uma dieta para insetos artificial. Os ovos de WCR foram obtidos na Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN).

[00225] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 poços especificamente projetadas para bioensaios com insetos (C-D International, Pitman, NJ). Cada poço continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta projetada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL de amostra de proteína foi distribuída por uma pipeta sobre a superfície de dieta de 1,5 cm² de cada poço (40 pL/cm²). As concentrações da amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm²) de área de superfície no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em

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97/146 uma coifa até que o líquido na superfície da dieta evaporasse ou fosse absorvido na dieta.

[00226] Algumas horas após a eclosão, larvas individuais foram recolhidas com um pincel de pelo de camelo umedecido e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por poço). Os poços infestados das bandejas de plástico de 128 poços foram, então, fechados com folhas adesivas de plástico claro e ventilados para permitir a troca de gases. As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28°C, ~40% de umidade relativa, 16:8 [Luz:Escuro]) durante 9 dias, após os quais o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados. A porcentagem de mortalidade, pesos médios vivos e inibição do crescimento foram calculados para cada tratamento. Definiu-se interrupção do desenvolvimento como uma diminuição nos pesos médios vivos. A inibição do crescimento (GI) foi calculada da seguinte maneira:

GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] [00227] em que [00228] TWIT é o peso total dos insetos vivos no tratamento;

[00229] TNIT é o número total de insetos no tratamento;

[00230] TWIBC é o peso total dos insetos vivos na verificação de fundo (tampão de controle); e [00231] TNIBC é o número total de insetos na verificação de fundo (tampão de controle).

[00232] A GI50 é determinada como sendo a concentração de amostra na dieta em que o valor de GI é de 50%. A LC50 (50% da concentração letal) é registrada como a concentração de amostra na dieta em que 50% dos insetos de teste são mortos. A análise estatística foi feita usando-se o software JMP™(SAS, Cary, NC).

[00233] Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de

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98/146 amostras resulta em uma mortalidade e inibição do crescimento surpreendentes e inesperadas de larvas de crisomelídeos do milho. Exemplo 2: Identificação de genes alvo candidatos [00234] Larvas de WCR no primeiro instar foram selecionadas para análise de transcriptoma, porque o controle nesse estágio do crescimento por tecnologia transgênica de resistência a insetos seria vantajoso.

[00235] RNA total foi isolado de cerca de 0,9 g de larvas inteiras de WCR no primeiro instar (Diabrotica virgifera virgifera LeConte; 4 a 5 dias após eclodirem, mantidas a 16°C) e purificado usando-se o seguinte método à base de fenol/TRI REAGENT® (Molecular Research Center, Cincinnati, OH; Cat. No. TR 118):

[00236] As larvas foram homogeneizadas à temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até se obter uma suspensão homogênea. Após 5 min de incubação à temperatura ambiente, o homogeneizado foi distribuído em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi vigorosamente agitada durante 15 segundos. Depois de deixar a extração em repouso à temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12.000 x g a 4°C. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de 1,5 mL estéril, e um volume igual (0,6 mL) de isopropanol à temperatura ambiente foi adicionado. Após incubação à temperatura ambiente durante 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min a 12.000 x g (4°C ou 25°C).

[00237] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, e o pélete de RNA foi lavado duas vezes com um vórtice com etanol a 75%, com recuperação por centrifugação durante 5 min a 7.500 x g (4°C ou 25°C) após cada lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o pélete foi deixado secar ao ar durante 3 a 5 min e, então, foi

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99/146 dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada medindo-se a absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas forneceu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260/A280 de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80°C até ser adicionalmente processado.

[00238] A qualidade do RNA foi determinada passando-se uma alíquota através de um gel de agarose a 1%. A solução de gel de agarose foi preparada usando-se 10 X tampão TAE autoclavado (Trisacetato EDTA, 1 X a concentração é 0,04 M de Tris-acetato, 1 mM de EDTA (sal sódico do ácido etilenodiamina tetra-acético, pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente autoclavado. Usou-se 1 X TAE como o tampão de passagem. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente formador de poços foram limpados com RNAseAway™ (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Dois μΙ_ de amostra de RNA foram misturados com 8 μΙ_ de tampão TE (10 mM de Tris HCl pH 7,0; 1 mM de EDTA) e 10 μΙ_ de tampão de amostra de RNA (Novagen® Catálogo n° 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70°C durante 3 min, resfriada à temperatura ambiente, e foram carregados 5 μΙ_ por poço (contendo de 1 μg a 2 μg de RNA). Marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente passados em poços separados para comparação do tamanho molecular. O gel foi operado a 60 v durante 2 h.

[00239] Uma biblioteca de cDNA normalizado foi preparada a partir do RNA total larval por um fornecedor de serviços comercial (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL), usando iniciadores aleatórios.

[00240] A biblioteca de cDNA larval normalizado foi sequenciada a uma escala de 1/2 placa por química da série GS FLX 454 Titanium™ na Eurofins MWG Operon, o que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 pb. 350.000 leituras fo

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100/146 ram montadas em mais de 50.000 contigs. Tanto as leituras não montadas, quanto os contigs foram convertidos em bases de dados para BLAST usando o programa de domínio público FORMATDB (disponível no Centro Nacional Para Informações Biológicas (NCBI)).

[00241] Genes candidatos a alvo de RNAi foram selecionados usando-se informações referentes aos efeitos letais de RNAi de genes particulares em outros insetos, como Drosophila e Tribolium. Postulouse que esses genes fossem essenciais para a sobrevivência e crescimento em insetos coleópteros. Homólogos do gene alvo selecionado foram identificados na base de dados de sequências de transcriptoma conforme descrito abaixo. Sequências de comprimento total ou parcial dos genes alvo foram amplificadas por PCR para preparar moldes para a produção de RNA de fita dupla (dsRNA).

[00242] Buscas TBLASTN usando sequências codificadoras de proteínas candidatas foram feitas em bases de dados para BLAST co ntendo as leituras de sequências de Diabrotica não montadas ou os contigs montados. Acertos significativos para uma sequência de Diabrotica (definido como mais de e^-20 para homologias de contigs e mais de e^-10 para homologias de leituras de sequências não montadas) foram configurados usando-se BLASTX contra a base de dados não redundante do NCBI. Os resultados dessa busca BLASTX confirmaram que as sequências de genes candidatos homólogos de Diabrotica identificados na busca TBLASTN de fato compreendiam genes de Diabrotica ou eram o melhor acerto disponível nas sequências de Diabrotica para a sequência de gene candidato não Diabrotica. Na maioria dos casos, genes candidatos de Tribolium que foram anotados como codificando uma proteína deram uma homologia de sequência inequívoca a uma sequência ou sequências nas sequências de transcriptoma de Diabrotica. Em alguns poucos casos, estava claro que alguns dos contigs de Diabrotica ou leituras de sequências não montadas se

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101/146 lecionadas por homologia a um gene candidato não Diabrotica se superpunham, e que a montagem dos contigs tinha falhado em unir essas superposições. Nesses casos, usou-se o Sequencher™ v4.9 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) para montar as sequências em contigs mais longos.

[00243] Uma pluralidade de genes alvo candidatos foram identificados como genes que poderiam levar a mortalidade da praga coleóptera ou inibição do crescimento, desenvolvimento ou reprodução em WCR, incluindo as SEQ ID NOs:1-4. Clones de comprimento total ou parcial das sequências de homólogos de genes candidatos de Diabrotica foram usados para gerar amplicons de PCR para síntese de ds RNA.

[00244] A SEQ ID NO:1 corresponde a D_vir_c47185, que é um homólogo de Caf1-180, e é aqui chamado de Caf1-180. Demonstrou que Caf1-180 de Drosophila funciona distribuindo histonas a DNA recém-sintetizado, e Caf1-180. Demonstrou-se que mutações de perda de função em Caf1-180 de Drosophila causam a interrupção do crescimento e desenvolvimento larval e mortalidade larval (Klapholz et al. (2009) Chromosoma 118(2):235-48; Tyler et al. (2001) Mol. Cell Biol. 21(19):6574-84; Song et al. (2007) Dev. Biol. 311(1):213-22).

[00245] A SEQ ID NO:2 corresponde a D_vir_c1229, que é um homólogo da subunidade C da ATPase vacuolar, e é aqui chamado de VatpaseC. As SEQ ID NOs:5-8 são fragmentos de sequência não contíguos de VatpaseC.

[00246] A SEQ ID NO:3 corresponde a D_vir_c1319, que é um homólogo de subunidade H da ATPase vacuolar, e é aqui chamado de VatpaseH. SEQ ID NOs:9-11 são fragmentos de sequência não contíguos de VatpaseH.

[00247] A ATPase vacuolar de Drosophila é um transportador de prótons de múltiplas subunidades envolvido na sinalização Notch (Va

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102/146 ccari et al. (2010) Development 137(11):1825-32). Demonstrou-se que mutações de perda de função em subunidades da ATPase vacuolar de Drosophila são recessivas letais (Allan et al. (2005) Physiol. Genomics 22(2):128-38; e Davies et al. (1996) J. Biol. Chem. 271(48):30677-84). VATPaseC (Vha44) e VATPaseH (VhaSFD) são duas das subunidades da ATPase vacuolar de Drosophila.

[00248] A SEQ ID NO:4 é Contig_01_Rho1_1-191_CDC42, aqui chamada de Rho1. A Rho1 de Drosophila funciona regulando a montagem e desmontagem de filamentos de actina, e mutações de perda de função na Rho1 de Drosophila têm um impacto significativo sobre o movimento de componentes celulares, remodelagem de sinapses, desenvolvimento larval e resposta ao estresse (Fox et al. (2005) Development 132(21):4819-31; Kadandale et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(23):10502-7; Rosales-Nieves et al. (2006) Nat. Cell Biol. 8(4):367-76; Magie e Parkhurst (2005) Dev. Biol. 278(1):144-54; e Xu et al. (2008) Dev. Biol. 321(1):88-100).

Exemplo 3: Amplificação de genes alvo [00249] Projetaram-se iniciadores para amplificar partes de regiões codificadoras de cada gene alvo por PCR. Veja a Tabela 1. Quando apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA (SEQ ID NO:12)) foi incorporada na extremidade 5' das fitas em senso ou antissenso amplificadas. Veja a Tabela 1. Extraiu-se DNA genômico de WCR, e os iniciadores de PCR foram usados para amplificar toda ou parte da sequência de gene alvo nativo do DNA genômico mediante uma reação de PCR.

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Tabela 1. Sequências e pareamentos de iniciadores de PCR usados para preparar moldes para produção de dsRNA.

	Gene (Região)	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
Par 1	Caf1-180 (1)	Caf-FT7	SEQ ID NO:13	TTAATACGACTCACTATA GGGAGATTCGGAAGCTT CATA 1 1 1AAAAGATC
Caf1-180 (1)	Caf-R	SEQ ID NO:14	TATCTTCAGCCAAAGGTT TTCTTG
Par 2	Caf1-180 (1)	Caf-F	SEQ ID NO:15	TTCGGAAGCTTCATATTT AAAAGATC
Caf1-180 (1)	Caf-RT7	SEQ ID NO:16	TTAATACGACTCACTATA GGGAGATATCTTCAGCC AAAGG1 III CTTG
Par 3	VatpaseC (1)	Atp.CF1T7	SEQ ID NO:17	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGAAGAAATGA CTGAGTATTGG
VatpaseC (1)	Atp.C-R1	SEQ ID NO:18	CTGAAGACTTCC T T T CAA GT
Par 4	VatpaseC (1)	Atp.C-F1	SEQ ID NO:19	AGAAGAAATGACTGAGT ATTGG
VatpaseC (1)	Atp.C- R1T7	SEQ ID NO:20	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACTGAAGACTTC CTTTCAAGT
Par 5	VatpaseC (1)	Atp.C-F1	SEQ ID NO:19	AGAAGAAATGACTGAGT ATTGG
VatpaseC (1)	Atp.CR1shortT7	SEQ ID NO:21	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAGATGGGATATT TGGCGATGTCCCA
Par 6	VatpaseC (1)	Atp.C- F1T7	SEQ ID NO:17	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGAAGAAATGA CTGAGTATTGG
VatpaseC (1)	Atp.C- R1short	SEQ ID NO:22	GATGGGATA T T T GGCGA TGTCCCA

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	Gene (Região)	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
Par 7	VatpaseC (2)	Atp.C- F2T7	SEQ ID NO:23	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGAAACAGACA GGAAGTTTACT
VatpaseC (2)	Atp.C-R2	SEQ ID NO:24	GGATTAAAATAGCTTGGA AATTGAC
Par 8	VatpaseC (2)	Atp.C-F2	SEQ ID NO:25	AGAAACAGACAGGAAGT TTACT
VatpaseC (2)	Atp.C- R2T7	SEQ ID NO:26	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAGGATTAAAATA GCTTGGAAATTGAC
Par 9	VatpaseH (1)	Atp.H- F1T7	SEQ ID NO:27	TTAATACGACTCACTATA GGGAGA TCATGATTGTTCCAGATA TGTTGG
VatpaseH (1)	Atp.H-R1	SEQ ID NO:28	AGTGTCTGCGACCAACA AGC
Par 10	VatpaseH (1)	Atp.H-F1	SEQ ID NO:29	TCATGATTGTTCCAGATA TGTTGG
VatpaseH (1)	Atp.H- R1T7	SEQ ID NO:30	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGTGTCTGCGA CCAACAAGC
Par 11	VatpaseH (2)	Atp.H- F2T7	SEQ ID NO:31	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGAACATTGTA TAGCTATGGTG
VatpaseH (2)	Atp.H-R2	SEQ ID NO:32	ATTTACGCCTTGCCTGC GAC
Par 12	VatpaseH (2)	Atp.H-F2	SEQ ID NO:33	AGAACATTGTATAGCTAT GGTG
VatpaseH (2)	Atp.H- R2T7	SEQ ID NO:34	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAATTTACGCCTT GCCTGCGAC
Par 13	Rho1 (1)	Rho1-FT7	SEQ ID NO:35	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACAGGTCCGATG GCTGCAATAAG

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	Gene (Região)	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
	Rho1 (1)	Rho1-R	SEQ ID NO:36	GACTTGCAGTGCAGCTC GGG
Par 14	Rho1 (1)	Rho1-F	SEQ ID NO:37	CAGGTCCGATGGCTGCA ATAAG
Rho1 (1)	Rho1-RT7	SEQ ID NO:38	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAGACTTGCAGTG CAGCTCGGG

Exemplo 4: Construtos de RNAi

Preparação de molde por PCR e síntese de dsRNA.

[00250] A estratégia usada para fornecer moldes específicos para produção in vitro de dsRNA é mostrada na figura 1. DNAs de molde destinados a uso na síntese de dsRNA foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como molde de PCR) cDNA de primeira fita preparado a partir do RNA total isolado de larvas de WCR no primeiro instar. Para cada região de gene alvo selecionada, realizaram-se duas amplificações por PCR separadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência promotora T7 na extremidade 5' das fitas em senso amplificadas. A segunda reação inco rporou a sequência promotora T7 na extremidade 5's das fitas antissenso. Os dois fragmentos amplificados por PCR de cada região dos genes alvo foram, então, misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para a produção de dsRNA. Figura 1. RNA de fita dupla foi sintetizado e purificado usando um kit de RNAi Ambion® MEGAscript® de acordo com as instruções do fabricante (Foster City, CA). As sequências dos moldes de dsRNA amplificados com os iniciadores particulares eram: SEQ ID NO:86 (Caf1-180); SEQ ID NOs:7 e 8 (VatpaseC); SEQ ID NOs:10 e 11 (VatpaseH); e SEQ ID NO:87 (Rho1). As concentrações dos dsRNAs foram medidas usando-se um espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

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Construção de vetores de transformação de plantas - Método 1 [00251] Métodos de clonagem padrão Multi-site Gateway® (Invitrogen) foram usados para construir vetores de expressão de RNA em grampo (hpRNA) para transformação de células de milho mediada por WHISKERS™. Foram construídos vetores de entrada separados para os dois genes marcadores utilizados para triagem/seleção de células de milho após a transformação; um gene de proteína fluorescente amarela (YFP, Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50) e um gene de tolerância a herbicida (fosfinotricina acetil transferase (PAT), Wehrmann et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14(10):1274-8). A expressão de cada um desses foi controlada por uma cópia de um promotor actin1 do arroz (OsAct1, patente U.S. n° 5.641.876). Um fragmento compreendendo a região 3' não traduzida de um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3' UTR v2, patente U.S. n° 6.699.984) foi usado para terminar a transcrição dos genes.

[00252] Um terceiro tipo de vetor de entrada, projetado para produção de hpRNA, também foi construído utilizando-se fragmentos do gene de Caf1-180 ou do gene de VatpaseC. Regiões de gene alvo para Caf1-180 e VatpaseC foram amplificadas para síntese de grampo usando os iniciadores mostrados na Tabela 2. A formação de grampo intramolecular por transcritos primários de RNA foi facilitada pelo arranjo (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias do fragmento de gene alvo em orientação oposta entre si, os dois fragmentos estando separados por uma sequência de íntron ST-LS1 (Vancanneyt et al.(1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). A produção do transcrito primário de mRNA foi ativada por uma cópia do promotor da ubiquitina 1 do milho (patente U.S. n° 5.510.474). Assim, o transcrito primário de mRNA contém as duas sequências de fragmento de gene como grandes repetições invertidas uma do outra, separadas pela sequência de íntron. Um fragmento compreendendo a região 3' não

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107/146 traduzida de um gene da lipase do milho (ZmLip 3' UTR, patente U.S. n° 7.179.902) foi usado para terminar a transcrição dos genes.

Tabela 2. Sequências e pareamentos de iniciadores usados para preparar construtos em grampo para transformação de milho.

	Gene	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
Par 15	Caf1-180	hpCaf-F	SEQ ID NO:39	GAGAGGTACCTCGGAAG CTTCATATTTAAAAGATCT GTC
Caf1-180	hpCaf-R	SEQ ID NO:40	CTCTGGATCCAAAATGTT TTTTATCTTCAGCCAAAG GTTTTC
Par 16	Caf1-180	hp-invCafF	SEQ ID NO: 41	AGAGCCATGGAAAATGTT TTTTATCTTCAGCCAAAG GTTTTC
Caf1-180	hp-invCafR	SEQ ID NO:42	CTCTGAGCTCTCGGAAG CTTCATATTTAAAAGATCT GTC
Par 17	ST-SL1	ST-LS1-F	SEQ ID NO:43	AGAGGGATCCAGGCCTA GGTATGTTTCTGCTTCTA CCTTTGAT
ST-SL1	ST-LS1-R	SEQ ID NO:44	CTCTCCATGGACCGGTAT TTAAATACCTGCACATCA CCATGIIIIGG
Par 18	VatpaseC	hpATPase C-F	SEQ ID NO:45	AGAGGGTACCAGAAGAA ATGACTGAGTATTGGTTG ATATC
VatpaseC	hpATPase C-R	SEQ ID NO:46	CTCTGGATCCGATGGGA TATTTGGCGATGTCC
Par 19	VatpaseC	hpinvATPaseC-F	SEQ ID NO:47	AGAGCCATGGGATGGGA TATTTGGCGATGTCC
VatpaseC	hpinvATPaseC-R	SEQ ID NO:48	GCTGAGCTCAGAAGAAA TGACTGAGTATTGGTTGA TATC

[00253] A SEQ ID NO:49 apresenta uma sequência formadora de grampo de Caf1-180, e a SEQ ID NO:50 apresenta uma sequência formadora de grampo de VatpaseC.

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108/146 [00254] Duas versões de vetores de entrada para expressão de hpRNA foram construídas para cada uma de Caf1-180 e VatpaseC. Em uma primeira versão dos vetores de entrada, sequência de contexto de início de tradução de consenso do milho estava presente na sequência líder não traduzida 5' de mRNA, adjacente à extremidade 5' da primeira sequência de fragmento de gene alvo, que estava presente na orientação direta (isto é, na orientação em senso com relação ao promotor). A sequência de início de tradução de consenso do milho foi omitida em uma segunda versão.

[00255] Realizou-se uma reação de recombinação padrão GATEWAY® com 3 vetores de entrada e um vetor de destino (pDAB104124) usando LR CLONASE II PLUS™ da Invitrogen. Em um vetor de expressão de hpRNA completado, o cassete de hpRNA era flanqueado pelos cassetes de expressão de gene YFP e PAT.

[00256] A purificação de fragmento para transformação mediada por WHISKERS™ foi realizada em uma escala preparatória por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) depois de os DNAs do vetor de expressão YFP/hpRNA/PAT terem sido digeridos com Bcl I (para construtos de Caf1-180) ou Bbs I mais Afe I (para construtos de VatpaseC) para remover o gene de resistência a espectinomicina bacteriano presente na estrutura principal do vetor.

[00257] Construção de vetores de transformação de plantas - Método 2 [00258] Vetor de destino WHISKERS™: Usou-se metodologia de clonagem no local padrão GATEWAY® (INVITROGEN) para construir um vetor de expressão de RNA em grampo (hpRNA) para transformação de células de milho mediada por WHISKERS™. Dois genes ma rcadores foram incorporados em um vetor de destino (chamado de pDAB108916) e foram utilizados para triagem e seleção de células de milho após a transformação. Um gene de proteína fluorescente amare

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109/146 la (YFP, Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50) foi usado para triagem visual, e um gene de tolerância a herbicida (fosfinotricina acetil transferase (PAT), Wehrmann et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14(10):1274-8) foi usado para seleção de transformantes. A expressão de cada um dos dois genes marcadores foi controlada por cópias separadas de um promotor de badnavírus baciliforme de cana-de-açúcar (SCBV) (patente U.S. n° 6.489.462) compreendendo uma sequência 5'UTR quimérica montada a partir de uma parte da 5'UTR do gene da proteína de revestimento do vírus do raiado fino do milho (Acesso GENBANK X01633) e do íntron1 de um gene da álcool desidrogenase 1 do milho (Acesso GENBANK X04049). Um fragmento compreendendo a 3'UTR de um gene da lipase do milho (ZmLip 3' UTR; patente U.S. n° 7.179.902) e um fragmento compreendendo a 3'UTR StPinlI 3'UTR da batata (Solanum tuberosum) (An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122) foram usados para terminar a transcrição dos genes YFP e PA, respectivamente.

[00259] Um primeiro vetor de entrada projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos de DNA portando uma sequência de Caf1-180 v3 em senso (+íntron ST-LS1) (SEQ ID NO:95) e fragmentos portando uma de Caf1-180 v3 antissenso (SEQ ID NO:96). Esses fragmentos foram separadamente sintetizados por estabelecimento comercial (DNA2.0; Menlo Park, CA). Os pedaços sintéticos foram unidos na orientação apropriada por métodos de clonagem padronizados para formar o construto formador de grampo de SEQ ID NO:97, e o construto foi clonado entre um promotor e a sequência de 3'UTR no vetor de entrada. A produção do transcrito primário de mRNA foi ativada por uma cópia do promotor da ubiquitina 1 do milho (patente U.S. n° 5.510.474), ao passo que a sequência compreendendo a região 3' não traduzida de um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3' UTR v2, patente U.S. n° 6.699.984) foi usado para terminar

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110/146 a transcrição do fragmento de gene alvo. A formação de grampo intramolecular por transcritos primários de RNA foi facilitada pelo arranjo (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias do fragmento de gene alvo em orientação oposta entre si, os dois fragmentos estando separados por uma sequência de íntron ST-LS1 (Vancanneyt et al.(1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Assim, o transcrito primário de mRNA contém as duas sequências de fragmento de gene como grandes repetições invertidas uma do outra, separadas pela sequência de íntron.

[00260] A reação de recombinação padrão GATEWAY^® foi realizada com o vetor de entrada de Caf-180 v3 em grampo construído e o vetor de destino pDAB108916, usando LR CLONASE II PLUS™ da Invitrogen. Em um vetor de expressão de hpRNA de Caf-180 v3 completado (pDAB109830), o cassete de expressão do gene YFP era flanqueado pelo hpRNA e cassete de expressão do gene PAT.

[00261] De maneira similar, métodos de clonagem no local padronizados GATEWAY^® foram usados para construir outros vetores de expressão de RNA em grampo (hpRNA) para transformação de células de milho mediada por WHISKERS™. Esses vetores adiciona is compreendiam construtos de hpRNA para VatpaseC v3, VatpaseC v4, VatpaseH v1 e Rho1 v1.

[00262] Um segundo vetor de entrada projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos que compreendiam uma sequência de VatpaseC v3 em senso (+íntron ST-LS1) (SEQ ID NO:98) e uma sequência de VatpaseC v3 antissenso (SEQ ID NO:99), unidas na orientação apropriada (SEQ ID NO:100) por métodos de clonagem padronizados. O vetor de entrada VaptaseC v3 foi usado para clonagem GATEWAY^® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão de hpRNA de VatpaseC v3 pDAB109828.

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111/146 [00263] Um terceiro vetor de entrada projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos que compreendiam uma sequência de VatpaseC v4 em senso (+íntron ST-LS1) (SEQ ID NO:101) e uma sequência de VatpaseC v4 antissenso (SEQ ID NO:102), unidas na orientação apropriada (SEQ ID NO: 103) por métodos de clonagem padronizados. O vetor de entrada VatpaseC v4foi usado para clonagem GATEWAY^® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão hpRNA de VatpaseC v4 pDAB109838.

[00264] Um quarto vetor de entrada projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos que compreendiam uma sequência de VatpaseH v1 em senso (+íntron ST-LS1) (SEQ ID NO:104) e uma sequência de Vatpase H v1 antissenso (SEQ ID NO:105), unidas na orientação apropriada (SEQ ID NO: 106) por métodos de clonagem padronizados. O vetor de entrada VatpaseH v1 foi usado para clonagem GATEWAY^® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão de hpRNA de VatpaseH v1 pDAB109829.

[00265] Um quinto vetor de entrada projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos que compreendiam uma sequência de Rho1 v1 em senso (+íntron ST-LS1) (SEQ ID NO:107) e uma sequência de Rho1 v1 antissenso (SEQ ID NO:108), unidas na orientação apropriada (SEQ ID NO:109) por métodos de clonagem padronizados. O vetor de entrada Rho1 v1 foi usado para clonagem GATEWAY® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão de hpRNA de Rho1 v1 pDAB109834.

[00266] A transformação mediada por WHISKERS™ foi realizada usando-se DNA plasmídico circular purificado. EXEMPLO 9.

[00267] Vetor de destino de Agrobacterium: Métodos de clonagem padronizados GATEWAY® (INVITROGEN) foram usados para constru

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112/146 ir vetores de expressão de RNA em grampo (hpRNA) para transformação de embrião de milho mediada por Agrobacterium. Os vetores de entrada acima preparados para a produção de hpRNAs para Caf-180 v3, VatpaseC v3, VatpaseH v1 e Rho1 v1 foram usados para clonagem GATEWAY® com um vetor de destino (pDAB108915) construído como um vetor binário para transformação de plantas por Agrobacterium. Entre as sequências repetidas de borda de T-DNA esquerda e direita incluiu-se um marcador selecionável de planta/gene de tolerância a herbicida compreendendo a sequência codificadora para a proteína AAD1 (patente U.S. n° 7.838.733) sob o controle transcricional do promotor SCBV conforme acima descrito. O término da transcrição e a poliadenilação dos mRNAs aad1 foram determinados por uma 3'UTR de lipase do milho, essencialmente conforme exposto como bases 921 a 1.277 do GENBANK™ N° de Acesso gb|L35913.1|MZELIPASE e na patente U.S. n° 7.179.902. Os vetores de expressão binários de hpRNA resultantes foram chamados de pDAB109817 (para Caf -180 v3), pDAB109815 (para VatpaseC v3), pDAB109816 (para VatpaseH v1) e pDAB109821 (para Rho1 v1).

[00268] Para a transformação de milho, os vetores de expressão binários de hpRNA foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens desarmado cepa DAt13192, conforme descrito no Pedido Internacional PCT n° PCT/US11/046028 depositado em 29 de julho de 2011, que é aqui incorporado em sua inteireza.

Exemplo 5: T riagem de genes alvo candidatos [00269] dsRNA sintético projetado para inibir algumas, mas não todas, sequências de gene alvo identificadas no Exemplo 2 causou mortalidade e inibição do crescimento quando administrado a WCR em ensaios baseados em dieta. Observeou-se que Cafl-180; VatpaseC; VatpaseH; e Rho1 exibiam uma eficácia grandemente aumentada nesse ensaio com relação a outros dsRNAs da triagem.

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113/146 [00270] Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de construtos transcritos em dsRNA de Cafl-180 (SEQ ID NO:110); dsRNA de região 1 de VatpaseC (SEQ ID NO:111); dsRNA de região 1 curta de VatpaseC (SEQ ID NO:112); dsRNA de região 2 de VatpaseC (SEQ ID NO:113); dsRNA de região 1 de VatpaseH (SEQ ID NO:114); dsRNA de região 2 de VatpaseH (SEQ ID NO:115); e dsRNA de Rho1 (SEQ ID NO:116) resultou em mortalidade e inibição do crescimento de larvas de crisomelídeo do milho ocidental surpreendentemente robustas. As Tabelas 3 e 4 mostram os resultados de bioensaios de alimentação baseados em dieta de larvas de WCR após uma exposição de 9 dias a esses dsRNAs. As figuras 2-4 mostram gráficos de variabilidade para a mortalidade e inibição do crescimento de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácidos nucleicos exemplificativas.

Tabela 3. Resultados de bioensaios de alimentação com dieta de crisomelídeo do milho ocidental (após 9 dias de alimentação).

Nome da Amostra	LC50	Faixa de LC50	LC80	Faixa de LCs0	GI50	Faixa de GI50	GIs0	Faixa de GI80
Cafl-180	106*	38-308	ND**	ND	22	6-79	558	72- 1000+
Região 1 de VatpaseC	9	0,14-83	ND	ND	1,8	0,4-9,3	20	1,2- 344
Região 1 curta de VatpaseC	13,4	3,6-45	ND	ND	<1,0		33	2-250+
Região 2 de VatpaseC	2,7	0,18- 11,5	>1000	ND	5,1	0,4-68,4	87	0,531000+
Região 1 de VatpaseH	2	0,5-4,6	357	91- 1000+	1,7	0,9-3,0	11	4,0-30
Região 2 de VatpaseH	0,70	0,04- 2,83	168	40- 1000+	3,2	1,3-7,7	13,9	2,6- 72,7

*As unidades de dose estão em ng/cm² **ND = não determinado

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Tabela 4. Resultados de bioensaios de alimentação com dieta de crisomelídeo do milho ocidental (após 9 dias de alimentação).

Nome da Amostra	Dose (ng/cm2)	% Média de Mortalidade	GI Média
Rho1	1000	84*	0,824
Tampão TE	0	29,5	0
Água	0	31	0
	LC50	Faixa de LC50	GI50
Rho1	302	92-1000+	<4,0

*Contagens de mortalidade por Rho1 significativamente diferentes de contagens de tampão TE ou água (razão de probabilidade P<0,0001) [00271] Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para controle de insetos mediado por RNAi. Veja a publicação de patente U.S. n° 2007/0124836, que apresenta 906 sequências, e a patente U.S. n° 7.614.924, que apresenta 9.112 sequências. Entretanto, foi determinado que muitos genes sugeridos como úteis para controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Também foi determinado que Cafl180, VatpaseC, VatpaseH e Rho1 proporcionam um controle surpreendente e inesperadamente superior de Diabrotica, em comparação com outros genes sugeridos como úteis para controle de insetos mediado por RNAi.

[00272] Anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram sugeridas na patente U.S. n° 7.614.924 como eficazes no controle de insetos mediado por RNAi. A SEQ ID NO:51 é a sequência de DNA da região 1 da anexina, e a SEQ ID NO:52 é a sequência de DNA da região 2 da anexina. A SEQ ID NO:53 é a sequência de DNA da região 1 da beta espectrina 2, e a SEQ ID NO:54 é a sequência de DNA da região 2 da beta espectrina 2. A SEQ ID NO:55 é a sequência de DNA da região 1 da mtRP-L4, e a SEQ ID NO:56 é a sequência de DNA da região 2 da mtRP-L4. A sequência YFP (SEQ ID NO:57) também foi usada para

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115/146 produzir dsRNA como um controle negativo.

[00273] Cada uma dessas sequências foi usada para produzir dsRNA pelos métodos do Exemplo 4, e os dsRNAs foram testados nos mesmos métodos de bioensaio baseado em dieta acima descritos. A Tabela 5 relaciona as sequências dos iniciadores usados para produzir as moléculas de dsRNA de anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4. A Tabela 6 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação baseados em dieta de larvas de WCR após uma exposição de 9 dias a essas moléculas de dsRNA. Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão desses dsRNAs não resultou em nenhuma mortalidade ou inibição do crescimento de larvas de crisomelídeo do milho ocidental acima da vista com amostras de controle de tampão TE, YFP ou água. Tabela 5. Sequências e pareamentos de iniciadores usados para amplificar regiões do gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para síntese de dsRNA.]

	Gene (Região)	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
Par 20	Anexina (1)	Ann-F1T7	SEQ ID NO:58	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAGCTCCAACAGT GGTTCCTTATC
Anexina (1)	Ann-R1	SEQ ID NO:59	CTAATAATTCI 1 III IAAT GTTCCTGAGG
Par 21	Anexina (1)	Ann-F1	SEQ ID NO:60	GCTCCAACAGTGGTTCCT TATC
Anexina (1)	Ann-R1T7	SEQ ID NO:61	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACTAATAATTCTT TTTTAATGTTCCTGAGG
Par 22	Anexina (2)	Ann-F2T7	SEQ ID NO:62	TTAATACGACTCACTATA GGGAGATTGTTACAAGC TGGAGAACTTCTC
Anexina (2)	Ann-R2	SEQ ID NO:63	CTTAACCAACAACGGCTA ATAAGG

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	Gene (Região)	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
Par 23	Anexina (2)	Ann-F2	SEQ ID NO:64	TTGTTACAAGCTGGAGAA CTTCTC
Anexina (2)	Ann-R2T7	SEQ ID NO:65	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACTTAACCAACA ACGGCTAATAAGG
Par 24	B-spect2 (1)	Betasp2F1T7	SEQ ID NO:66	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGATGTTGGCT GCATCTAGAGAA
B-spect2 (1)	Betasp2R1	SEQ ID NO:67	GTCCATTCGTCCATCCAC TGCA
Par 25	B-spect2 (1)	Betasp2F1	SEQ ID NO:68	AGATGTTGGCTGCATCTA GAGAA
B-spect2 (1)	Betasp2R1T7	SEQ ID NO:69	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAGTCCATTCGTC CATCCACTGCA
Par 26	B-spect2 (2)	Betasp2F2T7	SEQ ID NO:70	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAGCAGATGAACA CCAGCGAGAAA
B-spect2 (2)	Betasp2R2	SEQ ID NO:71	CTGGGCAGCTTCTTGTTT CCTC
Par 27	B-spect2 (2)	Betasp2F2	SEQ ID NO:72	GCAGATGAACACCAGCG AGAAA
B-spect2 (2)	Betasp2R2T7	SEQ ID NO:73	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACTGGGCAGCTT CTTG111CCTC
Par 28	mtRP-L4 (1)	L4-F1T7	SEQ ID NO:74	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGTGAAATGTT AGCAAATATAACATCC
mtRP-L4 (1)	L4-R1	SEQ ID NO:75	ACCTCTCACTTCAAATCT TGACTTTG
Par 29	mtRP-L4 (1)	L4-F1	SEQ ID NO:76	AGTGAAATGTTAGCAAAT ATAACATCC

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	Gene (Região)	ID do Iniciador	SEQ ID NO:	Sequência
	mtRP-L4 (1)	L4-R1T7	SEQ ID NO:77	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAACCTCTCACTT CAAATCTTGACIIIG
Par 30	mtRP-L4 (2)	L4-F2T7	SEQ ID NO:78	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACAAAGTCAAGA TTTGAAGTGAGAGGT
mtRP-L4 (2)	L4-R2	SEQ ID NO:79	CTACAAATAAAACAAGAA GGACCCC
Par 31	mtRP-L4 (2)	L4-F2	SEQ ID NO:80	CAAAGTCAAGA T T T GAAG TGAGAGGT
mtRP-L4 (2)	L4-R2T7	SEQ ID NO:81	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACTACAAATAAAA CAAGAAGGACCCC
Par 32	YFP	YFP-FT7	SEQ ID NO:82	TTAATACGACTCACTATA GGGAGACACCATGGGCT CCAGCGGCGCCC
YFP	YFP-R	SEQ ID NO:83	AGATCTTGAAGGCGCTCT TCAGG
Par 33	YFP	YFP-F	SEQ ID NO:84	CACCATGGGCTCCAGCG GCGCCC
YFP	YFP-RT7	SEQ ID NO:85	TTAATACGACTCACTATA GGGAGAAGATCTTGAAG GCGCTCTTCAGG
Tabela	3. Resultad	os de bioensaios de alimentação com dieta de

dsRNA de larvas de crisomelídeo do milho ocidental (após 9 dias de alimentação).

NOME DO GE- NE	DOSE (NG/CM2)	PESO MÉDIO POR INSETO (MG)	% MÉDIA DE MORTALIDADE	INIBIÇÃO MÉDIA DO CRESCIMENTO
Região 1 da Anexina	1000	0,545	0	-0,262
Região 2 da Anexina	1000	0,565	0	-0,301

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NOME DO GE- NE	DOSE (NG/CM2)	PESO MÉDIO POR INSETO (MG)	% MÉDIA DE MORTALIDADE	INIBIÇÃO MÉDIA DO CRESCIMENTO
Região 1 da Beta espectrina 2	1000	0,340	12	-0,014
Região 2 da Be- ta espectrina 2	1000	0,465	18	-0,367
região 1 da mtRP-L4	1000	0,305	4	-0,168
região 2 da mtRP-L4	1000	0,305	7	-0,180
Tampão TE	0	0,430	13	0,000
Água	0	0,535	12	0,000
YFP	1000	0,480	9	-0,386

Exemplo 6: Efeitos do comprimento da sequência sobre a eficácia do dsRNA de VatpaseC [00274] dsRNAs da subunidade C da ATPase vacuolar (VatpaseC) variando em tamanho de 349 a 500 pb eram ativos em ensaios de alimentação com dieta contra larvas de crisomelídeo do milho ocidental. Tabela 3. Para determinar a dependência do comprimento da eficácia de moléculas de dsRNA, os comprimentos de dsRNAs de Vatpase C foram variados e testados. As sequências foram escolhidas para representar as 15, 25, 50 e 100 bases 5' terminais e as 100, 50, 25 e 15 bases 3' terminais de um segmento de 174 pares de bases da sequência codificadora de VatpaseC (SEQ ID NO:2).

[00275] Fragmentos de dsRNA representando as sequências de VatpaseC 5' e 3' de 15 pb e 25 pb foram sintetizados em um estabelecimento comercial (INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES; Coralville, IA). Tabela 7. Os fragmentos de dsRNA 5' e 3' de 50 pb e 100 pb e o fragmento de dsRNA de comprimento total de 174 pb foram gerados a partir dos moldes de DNA amplificados por PCR usando T7 RNA polimerase de acordo com as instruções de um kit de RNAi MEGAscript™

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119/146 (AMBION®, Foster City, CA) usando os iniciadores relacionados na Tabela 8. As combinações de iniciadores usados para amplificar os vários comprimentos de moldes de DNA estão relacionados na Tabela 9.

Tabela 7. RNAs sintéticos projetados para servir de dsRNAs de VatpaseC de 15 pb e 25 pb (extremidade não reativa).

Nome do dsRNA	Sequência da fita em senso (5' para 3')	Identificador da sequência
VatpaseC5'-15	AUGACUGAGUAUUGG	SEQ ID NO:117
VatpaseC5'-25	AUGACUGAGUAUUGGUUGAUAUCUG	SEQ ID NO:118
VatpaseC3'-15	CUUUCUGAUGAUCUG	SEQ ID NO:119
VatpaseC3'-25	GUUAGUAGGACUUUCUGAUGAUCUG	SEQ ID NO:120

Tabela 8. Iniciadores de PCR usados para gerar vários comprimentos de moldes de DNA de VatpaseC compreendendo a sequência promotora T7 (sublinhada) para síntese de dsRNA.

Nome do Iniciador	Sequência do Iniciador	SEQ ID NO.	Fita
VatpaseC-FT7	TTAATACGACTCACTATAGGG	SEQ ID NO:121	em sensoe
AGAATGACTGAGTATTGGTTG ATATCTGC
VatpaseCR50T7	TTAATACGACTCACTATAGGG	SEQ ID NO:122	antissenso
AGATGTTGACAGGTCTTATCC CCT
VatpaseCR100T7	TTAATACGACTCACTATAGGG	SEQ ID NO:123	antissenso
AGATTGACAAATTATTCTG 1 1 1 ACTTGTCATAT
VatpaseCRT7	TTAATACGACTCACTATAGGG	SEQ ID NO:124	antissenso
AGACAGATCATCAGAAAGTCC TACTAACTG

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Nome do Iniciador	Sequência do Iniciador	SEQ ID NO.	Fita
VatpaseCF50T7	TTAATACGACTCACTATAGGG	SEQ ID NO:125	em sensoe
AGAGACTTGAAAGTTGGTACT CTGGAT
VatpaseCF100T7	TTAATACGACTCACTATAGGG	SEQ ID NO:126	em sensoe
AGAGACAAGTAAACAGAATAA TTTGTCAACC

Tabela 9. Combinações de iniciadores usados em PCR para gerar moldes de DNA de VatpaseC para síntese de vários comprimentos de dsRNA.

Nome do dsRNA	Par de Iniciadores	Comprimento do Amplicon (pb)*	Comprimento do dsRNA (pb)**	Ponto de partida para o comprimento
VatpaseC5'- 50	VatpaseC-FT7 e VatpaseCR50T7	50 + 48 = 98	50 + 12 = 62	extremidade 5'
VatpaseC5'- 100	VatpaseC-FT7 e VatpaseCR100T7	100 + 48 = 148	100 + 12 = 112	extremidade 5'
VatpaseC- 174	VatpaseC-FT7 e VatpaseCRT7	174 + 48 = 222	174 + 12 = 186	extremidade 5'
VatpaseC3'- 50	VatpaseCF50T7 e VatpaseC-RT7	51 + 48 = 99	51 + 12 = 63	extremidade 3'
VatpaseC3'- 100	VatpaseCF100T7 e atpaseC-RT7	100 + 48 = 148	100 + 12 = 112	extremidade 3'

* sequência promotora T7 (24 pb) adicionada na extremidade 5' de ambos os iniciadores, resultando na adição de 48 pb aos amplicons.

** GGGAGA da sequência promotora T7 é adicionada na extremidade 5' de ambas as fitas de dsRNA durante a transcrição, resultando na adição de 12 pb aos transcritos.

[00276] dsRNAs de VatpaseC (isto é, VatpaseC 5'-15, VatpaseC 5'Petição 870190064498, de 10/07/2019, pág. 124/157

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25, VatpaseC 5'-50, VatpaseC 5'-100, VatpaseC 3'-15, VatpaseC 3'-25, VatpaseC 3'-50, VatpaseC 3'-100, e VatpaseC-174) foram testados a uma única dose (1.000 ng/cm²) quanto à atividade (letalidade) usando ensaios de alimentação com dieta com larvas de crisomelídeo do milho ocidental. Conforme mostrado na Tabela 10, as atividades dessas amostras de dsRNA (conforme medidas pela porcentagem de mortalidade larval no dia 9 da alimentação) são diferentes. A alimentação com as amostras de dsRNA de VatpaseC de 15 pb e 25 pb (tanto 5', quanto 3') não induz uma mortalidade larval significativa, que é um resultado similar ao controle negativo que usa dsRNA de YFP. Entretanto, tanto os dsRNAs de 5'- e 3'-VaptaseC de 100 pb, quanto os dsRNAs de 5'- e 3'-VaptaseC de 174 pb resultaram em alta mortalidade larval igualmente inesperada. As duas amostras de dsRNA de 50 pb mostraram diferentes resultados nos ensaios de alimentação: a amostra de dsRNA de VatpaseC5'-50 não resultou em mortalidade larval significativa, mas mostrou significativa interrupção do desenvolvimento, ao passo que a amostra de dsRNA de VaptaseC3'-50 causou quase 60% de mortalidade, que é um nível quase tão alto quanto os valores obtidos com as amostras de dsRNAs de 100 pb e 174 pb. Tabela 10.

[00277] Além disso, as atividades dos dsRNAs de VatpaseC foram determinadas em seis doses de teste (1,0, 3,9, 62,5, 250 e 1.000 ng/cm²) para se obterem valores de LC50 e GI50 relativos. Tabela 11. O valor de LC50 obtido com a amostra de VatpaseC 3'-100 foi de 3,01 ng/cm², que foi o menor valor observado (isto é, a potência mais alta). Digno de nota é o valor de LC50 de 9,81 ng/cm² obtido com a amostra de VatpaseC-174. O construto projetado para produzir uma VatpaseC v4 em grampo em plantas de milho mostrou atividade quando testado com plantas cultivadas em estufa. Exemplo 10; Tabela 18. Esse fragmento de sequência de VaptaseC v4 (166 pb) é quase idêntico à se

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122/146 quência de VatpaseC-174 aqui descrita; a sequência de VatpaseC-174 aqui descrita não possui apenas 8 pb (ATGACTGA) na extremidade 5' do fragmento de sequência de VaptaseC v4 de 166 pb.

Tabela 10. Resultados de bioensaios de alimentação com dieta de dsRNA de larvas de crisomelídeo do milho ocidental (após 9 dias de alimentação) utilizando diferentes comprimentos de dsRNA de VatpaseC a 1.000 ng/cm².

Amostra	Replicados	% Média de Mortalidade	% Média de Inibição do crescimento (GI)
VatpaseC 3'-15	4	12,33 B*	10,28 BC**
VatpaseC 3'-25	4	6,07 B	-28,85 C
VatpaseC 3'-50	4	59,38 A	83,60 A
VatpaseC 3'-100	4	69,76 A	84,43 A
VatpaseC-174	2	67,65 A	84,70 A
VatpaseC 5'-15	4	2,94 B	11,50 BC
VatpaseC 5'-25	4	5,00 B	6,90 BC
VatpaseC 5'-50	4	19,12 B	54,75 AB
VatpaseC 5'-100	4	73,53 A	88,75 A
VatpaseC-174	4	71,60 A	83,00 A
YFP (controle negativo)	6	10,12 B	0,09 BC
* Valores de % média d	e mortalidade seguidos pela mesma letra não

são significativamente diferentes entre si ao nível de P = 0,05 (conforme calculado por comparação de médias ANOVA/Tukey). Os valores de mortalidade para controles negativos sem dsRNA (tampão TE e água) foram menores que 20% e não são mostrados.

** Valores de % média de GI seguidos pela(s) mesma(s) letra(s) não são significativamente diferentes entre si ao nível de P = 0,05 (conforme calculado por comparação de médias ANOVA/Tukey). O peso larval das larvas alimentadas com dsRNA de YFP de controle negativo foi usado como a base para o cálculo de GI.

Tabela 11. Valores de LC50 e GI50 para diferentes comprimentos de

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123/146 dsRNA de VatpaseC fornecido a 1,0, 3,9, 62,5, 250 e 1.000 ng/cm² a larvas de crisomelídeo do milho ocidental (após 9 dias de alimentação).

Amostra	Replicados	LC50 (ng/cm2)	GI50 (ng/cm2)
VatpaseC3'-50	4	144,88	9,56
VatpaseC3'-100	4	3,01	0,25
VatpaseC5'-100	4	17,49	0,85
VatpaseC-174	4	9,81	0,23

Exemplo 7: Efeitos da variação de sequência de dsRNA sobre a eficácia do dsRNA de VatpaseC [00278] Moléculas de dsRNA que não sejam perfeitamente complementares a uma sequência alvo (por exemplo, com apenas 95% de identidade ao mRNA alvo) são eficazes para controlar pragas coleópteras. Bases não complementares foram introduzidas na fita em senso ou na fita antissenso de dsRNAs de VatpaseC, resultando em faltas de correspondência entre as fitas em senso e antissenso do dsRNA (e, consequentemente, resultando em faltas de correspondência entre os dsRNA e o mRNA alvo in vivo). Os efeitos sobre a atividade inseticida dos dsRNAs imperfeitamente correspondentes contra larvas de crisomelídeo do milho ocidental foram medidos em bioensaios com dieta.

[00279] Apenas uma das duas fitas de DNA que codifica um dsRNA de VatpaseC sofreu mutação de cada vez, e um único nucleotídeo não complementar foi artificialmente introduzido em cada sítio de mutação. Os sítios de mutação foram arbitrariamente posicionados a intervalos de 20 nucleotídeos ao longo de todo o comprimento da fita com mutação de um DNA que codifica um dsRNA de VatpaseC. A identidade do nucleotídeo escolhido para substituir o nativo se baseou nos nucleotídeos proximais de cada lado do sítio de mutação que não complementaram o nucleotídeo na fita sem mutação oposta ao sítio de mutação. No caso de três ou mais nucleotídeos serem iguais em uma dada localização, o nucleotídeo diferente mais próximo era selecionado para

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124/146 substituir o nativo.

[00280] Dois dsRNAs imperfeitamente complementares e substancialmente homólogos de VatpaseC (v4) (isto é, v4.1 e v4.2) foram projetados, gerados e testados quanto à atividade inseticida. Ambos dsRNAs compreendiam 166 pb de uma sequência de VatpaseC v4, mais seis nucleotídeos (GGGAGA) na extremidade 5' de cada fita de RNA que são artefatos de transcrição pelo promotor T. Assim, o comprimento total de cada dsRNA era de 178 pb.

[00281] O dsRNA de VatpaseC v4.1 substancialmente homólogo foi projetado e gerado com bases não complementares introduzidas na fita antissenso. Esse dsRNA foi conseguido pelas seguintes etapas: (1) uma sequência de fita antissenso foi projetada para ter uma mutação introduzida a cada 20 nucleotídeos; (2) fragmentos de DNA compreendendo a sequência de DNA da fita antissenso com mutação ou de uma sequência de DNA de fita em senso nativa (isto é, sem mutações) foram quimicamente sintetizados (IDT); (3) oligonucleotídeos de DNA compreendendo a fita antissenso com mutação e oligonucleotídeos compreendendo a fita em senso foram anelados para formar moléculas de fita dupla; (3) usou-se amplificação por PCR empregando iniciadores que compreendiam sequências promotoras T7 5' terminais para incorporar a sequência promotora T7 nas extremidades 5' de ambas as fitas, fornecendo, dessa forma, um molde suficiente para síntese de dsRNA; e (4) a síntese de dsRNA foi realizada usando T7 RNA polimerase e um kit de RNAi AMBION® MEGAscript™, de acordo com as instruções do fornecedor.

[00282] O dsRNA de VatpaseC v4.2 substancialmente homólogo, com mutações introduzidas a intervalos de 20 bases na sequência de fita em senso (com com uma sequência de fita antissenso nativa), foi obtido por modificações apropriadas dos métodos acima. Além disso, um dsRNA de VatpaseC v4 compreendendo a sequência nativa (isto

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125/146 é, com fitas em senso e antissenso perfeitamente complementares) foi construído e usado como um controle para comparação de eficácia com os dsRNAs de VatpaseC v4.1 e v4.2 substancialmente homólogos em ensaios de alimentação baseados em dieta contra larvas de crisomelídeo do milho ocidental (conduzidos com os métodos anteriormente descritos).

[00283] Sete doses desses dsRNAs (0,2, 1,0, 3,9, 15,6, 62,5, 250 e 1.000 ng/cm²) foram testadas em bioensaios de alimentação com larvas de crisomelídeo do milho ocidental no primeiro instar para obter valores de LC50 e GI50. Os ensaios foram independentemente conduzidos duas vezes, e cada experimento teve dois replicados.

[00284] O LC50 calculado para o dsRNA substancialmente homólogo de VatpaseC v4.1 (falta de correspondência na fita antissenso) foi de 780,9 ng/cm², que é 7,9 vezes maior que o LC50 obtido para o dsRNA nativo (isto é, sem mutação) de VatpaseC v4. Tabela 12. Esse resultado indica que, mesmo que a fita antissenso de 178 bases do dsRNA de VatpaseC v4.1 contivesse 8 bases com mutação, existia homologia suficiente à fita de mRNA alvo da praga coleóptera para induzir um efeito letal após a ingestão do dsRNA. O valor de LC50 calculado para o dsRNA substancialmente homólogo de VatpaseC v4.2 (falta de correspondência na fita em senso) foi de 868,6 ng/cm², que é similar ao valor obtido com o VatpaseC v4.1 e 8,8 vezes maior que o obtido nesses ensaios para o dsRNA de VatpaseC v4. Esses resultados demonstram que dsRNAs substancialmente homólogos compreendendo faltas de correspondência na fita em senso do dsRNA retêm homologia suficiente à fita de mRNA alvo da praga coleóptera para induzir um efeito letal após a ingestão do dsRNA. Também se descobriu que nesses ensaios de alimentação os dsRNAs de VatpaseC v4.1 e v4.2 tinham valores de GI50 que eram maiores que o valor calculado para o dsRNA nativo (isto é, sem mutação) de VatpaseC v4. Tabela

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12. Consequentemente, observa-se que dsRNAs de VatpaseC v4.1 e 4.2 são capazes de induzir tanto melhor inibição do crescimento, quanto melhor mortalidade após ingestão pela praga coleóptera.

Tabela 12. Atividade inseticida de dsRNAs de VatpaseC substancialmente homólogos (v4.1 e v4.2) e dsRNA de VatpaseC v4 nativo contra larvas de crisomelídeo do milho ocidental.

dsRNA	Replicados	LC50 (ng/cm2)	Aumento de LC50 (vezes)	GI50 (ng/cm2)	Aumento de GI50 (vezes)
VatpaseC v4	8	98,5	NA	0,16	NA
VatpaseC v4.1	4	780,9	7,9	7,50	47,7
VatpaseC v4.2	4	868,6	8,8	0,84	5,4

Exemplo 8: Produção de tecidos de milho transgênico mediada por

Agrobacterium compreendendo dsRNAs em grampo inseticidas [00285] Esterilização da espiga e isolamento do embrião: Embriões de milho imaturos foram obtidos de plantas de Zea mays linhagem endogâmica B104 cultivadas em estufa e auto- ou subpolinizadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 9 a 12 dias após a polinização. No dia do experimento, as espigas foram s uperficialmente esterilizadas por imersão em uma solução a 20% de hipoclorito de sódio (6,15%) e agitadas durante 20 a 30 min, seguido por três enxágues em água estéril. Após a esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5 a 2,4 mm) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo Meio de Inoculação líquido (2,2 g/L de sais MS (Frame et al., 2011, supra); 1X ISU Vitaminas MS Modificadas (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos, em Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe e E. C. Yeung, (Eds.), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC., pp 327-341); 68,4 g/L de sacarose; 36

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127/146 g/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; e 200 μΜ de acetossiringona (preparada em DMSO); a pH 5,4). Para um dado conjunto de experimentos, embriões de espigas reunidas foram usados para cada transformação.

[00286] Iniciação da Cultura de Agrobacterium: Estoques em glicerol de Agrobacterium cepa DAt13192 contendo os transformação vetores binários acima descritos no Exemplo 4 foram espalhados em placas de meio mínimo AB (Watson et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255-64) contendo antibióticos apropriados e foram cultivados a 20°C durante 3 a 4 dias. Retirou-se uma única colônia de cada placa, que foi espalhada em placas YEP (10 g/L de extrato de levedura; 10 g/L de Peptona; e 5 g/L de NaCl) contendo os antibióticos apropriados e incubada a 20°C durante 1-2 dias.

[00287] Cultura de Agrobacterium e Cocultivo. Colônias de Agrobacterium foram tiradas de uma placa YEP, postas em suspensão em 10 mL de Meio de Inoculação em um tubo descartável de 50 mL, e a densidade de células foi ajustada a uma OD550 (Densidade Óptica medida a 550 nm) de 0,2 a 0,4 usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium foram incubadas em um agitador rotativo a 125 rpm (temperatura ambiente) enquanto a dissecção do embrião era realizada. Embriões zigóticos imaturos (previamente isolados dos grãos de milho esterilizados e colocados em 1 mL de Meio de Inoculação) foram lavados uma vez em Meio de Inoculação. 2 mL da suspensão de Agrobacterium foram adicionados a cada tubo de embriões, e os tubos foram colocados na plataforma do agitador entre 10 e 15 minutos. Os embriões foram transferidos para Meio de Cocultivo (4,33 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba (ácido 3,6-dicloro-oanísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico) em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L

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128/146 de AgNOa; 100 μΜ de acetossiringona em DMSO; e 3 g/L DE GELZAN™ (SIGMA-ALDRICH®); a pH 5,8), orientados com o escutelo voltado para cima e incubados a 25°C, sob 24 horas de luz a 50 μEm^-2 s^-1 de intensidade de luz durante 3 dias.

[00288] Seleção de Calo e Regeneração de Supostos Eventos: Após o período de cocultivo, os embriões foram transferidos para Meio de Repouso (4,33 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNOs; 0,5 g/L de MES (ácido 2-(Nmorfolino)etanossulfônico mono-hidratado; PHYTOTECHNOLOGIES LABORATORIES®, Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenicilina; e 2,3 g/L de GELZAN™; a pH 5,8), e incubados sob 24 horas de luz a 50 μEm’ ²s^-1 de intensidade de luz e a 25°C durante 3 dias.

[00289] Os embriões foram transferidos para Meio de Seleção 1 (que consiste no Meio de Repouso (acima) com 100 nM de RHaloxyfop ácido (0,0362 mg/L)), e incubados no escuro ou sob 24 horas de luz a 50 μEm²s¹ de intensidade de luz durante 7 a 14 dias a 28°C. Os calos embriogênicos em proliferação foram transferidos para Meio de Seleção 2 (que consiste em Meio de Repouso (acima) com 500 nM de ácido R-Haloxifop (0,1810 mg/L)), e foram incubados em 24 horas de luz a 50 μEm²s¹ de intensidade de luz durante 14 a 21 dias a 28°C. Essa etapa de seleção permitiu que o calo transgênico proliferasse e diferenciasse ainda mais.

[00290] Calos embriogênicos em proliferação foram transferidos para Meio de Pré-regeneração (4,33 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 45 g/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 g/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6

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129/146 benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 g/L de GELZAN™; e 500 nM de R-Haloxyfop ácido; a pH 5,8), e cultivados sob 24 horas de luz a 50 pEm^-2s^-1 de intensidade de luz durante 7 dias a 28°C.

[00291] Calos embriogênicos com brotos do tipo rebento foram transferidos para Meio de Regeneração I (4,33 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 60 g/L de sacarose; 100 mg/L de mioinositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3,0 g/L de GELZAN™; e 500 nM de R-Haloxyfop ácido; a pH 5,8), e cultivados sob 24 horas de luz a 50 pEm^-2 s^-1 de intensidade de luz durante 7 dias.

[00292] Pequenos rebentos com raízes primárias foram transferidos para Meio de Rebento/Raiz (4,33 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 3,5 g/L de GELZAN™; a pH 5,8) em PHYTATRAYS™ (PHYTOTECHNOLOGIES LABORATORIES®), e foram incubados sob 16,8 h de luz:escuro com 140 a 190 pEm^-2 s^-1 de intensidade de luz durante 7 dias a 27°C. As supostas plantículas transgênicas foram analisadas quanto ao número de cópias de transgene e transferidas para o solo.

[00293] Produção de sementes: As plantas foram transplantadas para meio de cultivo sem solo METRO-MIX™ 360 (SUN GRO HORTICULTURE; Bellevue, WA), e fortalecidas em um sal de crescimento. As plantas foram, então, transplantadas para mistura de solo SUNSHINE CUSTOM BLEND™ 160 e cultivadas até o florescimento na estufa. Foram conduzidas polinizações controladas para a produção de sementes.

[00294] Bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em plantas cultivadas em estufa foram conduzidos pelos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas com uma classificação de raiz de 0,75 ou mais foram transplantadas imediatamente para vasos de 19 litros (5 galões) para produção de sementes. As transplantas foram tratadas com inseticida para evitar danos adicionais pelo crisomelídeo liberação de inse

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130/146 tos nas estufas. Plantas B104 foram cruzadas com plantas B104 não transgênicas (doadores de pólen) plantas para produção de sementes. As sementes por essas plantas são guardadas para avaliação na geração T1 e subsequentes das plantas.

[00295] Agrobacterium cepa DAt13192 compreendendo um construto expressável em planta que codifica um dsRNA em grampo de Caf1-180 v3 (Exemplo 4; construto no plasmídio pDAB109817) foi ussado para produzir plantas de milho transgênico B104. Bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental nessas plantas cultivadas em estufa foram conduzidos pelos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas transformadas com um plasmídio similar (pDAB101556), que contém um gene para produção de YFP, mas que não co ntém um gene para a produção de dsRNA, foram usadas como controles negativos. Os resultados desses bioensaios são mostrados na Tabela 13.

Tabela 13. Resultados de bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em eventos de milho transgênico B104 que expressam dsRNA em grampo de Caf1-180 v3.

Descrição do Evento	N° T otal de Plantas Testadas	N° de Plantas com Classificação de Raiz <0,5 (%)*	N° de Plantas com Classificação de Raiz <0,75 (%)
dsRNA de Caf1-180 v3 hp (pDAB109817)	16	1 (6,3)	4 (25)
YFP (pDAB101556)	14	1 (7,1)	1 (7,1)
B104 não transgênica	16	2 (12,5)	3 (18,8)

* Escala de classificação dos danos à raiz do milho: 0 - 1,0 [00296] Agrobacterium cepa DAt13192 compreendendo um construto expressável em plantas que codifica um dsRNA em grampo de VatpaseC v3 (Exemplo 4; construto no plasmídio pDAB109815) foi usado para produzir plantas de milho transgênico B104. Os bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental com essas plantas transgênicas cultivadas em estufa foram conduzidos pelos métodos descritos no

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Exemplo 12. Plantas transformadas com um plasmídio similar (pDAB101556), que contém um gene para a produção de YFP, mas não contém um gene para a produção de dsRNA, foram usadas como controles negativos. Os resultados desses bioensaios são mostrados na Tabela 14.

Tabela 14. Resultados de bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em eventos de milho transgênico B104 que expressam dsRNA em grampo de VatpaseC v3.

Descrição do Evento	N° T otal de Plantas Testadas	N° de Plantas com Classificação de Raiz <0,5 (%)*	N° de Plantas com Classificação de Raiz <0,75 (%)
dsRNA de VatpaseC v3 Hp (pDAB109815)	10	6 (60)	7 (70)
YFP (pDAB101556)	14	1 (7,1)	1 (7,1)
B104 não transgênica	16	2 (12,5)	3 (18,8)

* Escala de classificação dos danos à raiz do milho: 0 - 1,0 [00297] Agrobacterium cepa DAt13192 compreendendo um construto expressável em plantas que codifica um dsRNA em grampo de VatpaseH v1 (Exemplo 4; construto no plasmídio pDAB109816) foi usado para produzir plantas de milho transgênico B104. Os bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental com essas plantas cultivadas em estufa foram conduzidos pelos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas transformadas com um plasmídio similar (pDAB101556), que contém um gene para a produção de YFP, mas não contém um gene para a produção de dsRNA, foram usadas como controles negativos. Os resultados desses bioensaios são mostrados na Tabela 15.

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Tabela 15. Resultados de bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em eventos de milho transgênico B104 que expressam um dsRNA em grampo VatpaseH v1.

Descrição do Evento	N° T otal de Plantas Testadas	N° de Plantas com Classificação de Raiz <0,5 (%)*	N° de Plantas com Classificação de Raiz <0,75 (%)
dsRNA de VatpaseH v1 hp (pDAB109816)	18	8 (44,4)	14 (77,8)
YFP (pDAB101556)	14	1 (7,1)	1 (7,1)
B104 não transgênica	16	2 (12,5)	3 (18,8)
*Escala de classificação dos danos à raiz do milho: 0 - 1	,0

Exemplo 9: Produção mediada por WHISKERS de tecidos de milho transgênico compreendendo dsRNAs em grampo de Caf1-180 v3 inseticidas [00298] Plantas que produzem uma ou mais moléculas inseticidas de dsRNA (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que tenha como alvo um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs:1-4) mediante expressão de um gene quimérico integrado de maneira estável no genoma da planta foram produzidas. Moléculas de DNA para transformação de plantas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 4, e foram distribuídas a células de milho em culturas de células em suspensão Hi-II por transformação mediada por WHISKERS (essencialmente conforme descrito nas patentes U.S. n° 5.302.523 e 5.464.765; na publicação de patente U.S. n° 2008/0182332; e Petolino e Arnold (2009) M. Paul Scott (ed.) Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, Vol. 526, Humana Press, NY, pp 59-67), que são aqui incorporados por referência em sua inteireza.

[00299] Transformação e seleção de células vegetais: Todos os procedimentos para transformação mediada por WHISKERS foram realizados usando-se técnicas assépticas padronizadas e seguiram

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133/146 genericamente os métodos descritos por Petolino e Arnold (2009), acima. Suspensões de células embriogênicas de Zea mays HiII (Armstrong et al. (1991) Maize Genet. Coop. Newslett. 65:92-3) foram subcultivadas por transferência de 30 mL células em suspensão sedimentadas, mais 70 mL de meio condicionado (isto é, o meio em que as células haviam sido cultivadas), para 200 mL de meio H9CP fresco (4,33 g/L de Sais Basais MS (PHYTOTECHNOLOGIES LABORATORIES, Cat. n° M524); 30,0 g/L de Sacarose; 100,0 mg/L de Mio-inositol; 200 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 2,0 mg/L de ácido 2,4diclorofenóxi acético; 2,0 mg/L de Ácido naftalenoacético; 691 mg/L de L-Prolina; 2,0 mg/L de Glicina; 0,5 mg/L de Tiamina HCl; 0,5 mg/L de de Piridoxina HCl; 0,05 mg/L de Ácido nicotínico; a pH 6,0) contendo 5% de água de coco (SIGMA ALDRICH, St. Louis, MO; Catálogo n° C5915) em um tubo de centrífuga de fundo cônico descartável de 175 mL NALGENE™ (THERMO FISHER SCIENTIFIC; Catálogo n° 31450175). As células diluídas foram, então, incubadas em um balão de cultura celular descartável estéril de 1 L no escuro a 28°C sobre um agitador giro-rotativfo com um raio de percurso de 2,54 cm (uma polegada) a 120 rpm, e as células foram subcultivadas a cada 3,5 dias conforme acima descrito.

[00300] Um dia após a subcultura, e 18 a 24 h antes do procedimento de transfecção, 50 mL de meio H9CP contendo 30 mL de células sedimentadas foram adicionados a 150 mL de meio GN6 fresco (3,99 g/L de Sais Basais Chu N6 com vitaminas (PHYTOTECHNOLOGIES LABORATORIES, Cat. n° C167); 30 g/L de Sacarose; 100 mg/L de Mio-Inositol; 2 mg/L de ácido 2,4-diclorofenóxi acético; a pH 6,0) em um balão estéril de 1 L, e a cultura foi incubada sobre um agitador giro-rotativo conforme acima descrito.

[00301] Após 18 a 24 h de incubação em meio GN6, a suspensão de células inteira foi transferida para um tubo de centrífuga de fundo

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134/146 cônico descartável estéril de 175 mL, e se deixou que as células sedimentassem durante 1-3 min, fornecendo um volume de células de cerca de 40 mL. O meio gasto foi cuidadosamente decantado, e o líquido residual foi removido por uma pipeta para produzir uma massa de células úmida. As células foram ressuspendidas em cerca de 180 mL de meio altamente osmótico (GN6-SM; meio GN6 suplementado com 45 g/L de sorbitol e 45 g/L de manitol) no tubo de centrífuga, e a cultura foi colocada em um agitador oscilante de mesa à temperatura ambiente (23°C a 25°C) durante cerca de 30 minutos, mas não mais que 45 minutos. Após o tratamento osmótico de 30 minutos, deixou-se que as células sedimentassem no tubo de centrífuga durante 3-5 minutos. Então, o líquido foi cuidadosamente removido até a marca de 50 mL do tubo de centrífuga mediante uma pipeta, tomando-se cuidado para não perturbar as células.

[00302] Para a distribuição de DNA plasmídico às células de milho em cultura de suspensão, 5 mL de uma suspensão a 5% em p/p de fios de carboneto de silício BIOGRADE™ SC-9 (ADVANCED COMPOSITE MATERIAIS, Greer, SC; lote 981011-101) foram preparados por adição de quantidade apropriada de meio GN6-SM aos fios secos esterilizados (autoclavados). Uma quantidade apropriada de DNA de pDAB 109830 (Exemplo 4) foi adicionada ao tubo de centrífuga (tipicamente 80 pg/50 mL de suspensão de 40 mL de células), a tampa foi firmemente fechada, e o tubo foi suavemente virado para misturar o conteúdo. O tubo de centrífuga foi firmemente preso em um misturador de tinta comercial (RED DEVIL™ Modelo 5400; Minneapolis, MN) modificado para prender reter firmemente o tubo e agitado durante 10-20 segundos. Após a diluição para reduzir a osmolaridade do meio com cerca de 150 mL de meio fresco (GN6-SM:GN6; 2:1 v/v) a um volume final de cerca de 200 mL, as células foram incubadas sobre um agitador oscilante de mesa à T.A. durante cerca de 1 hora.

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135/146 [00303] As células transfectadas foram, então, transferidas por uma pipeta em alíquotas de cerca de 8,3 mL para um papel de filtro estéril de 70 mm WHATMAN™ n° 4 (THERMO FISHER SCIENTIFIC), tomando-se o cuidado de distribuir uniformemente as células sobre o papel de filtro. Os filtros foram colocados em um meio de ágar GN6 em placas de plástico de 100 x 20 mm e, então, incubados em caixas de plástico no escuro a 28°C durante 7 dias.

[00304] Uma semana após a transformação, os papéis de filtro com as células foram transferidos para placas frescas de meio de ágar sólido GN6-1H (meio GN6 suplementado com 2,5 g/L de GELZAN™) co ntendo 1,0 mg/L de BIALAPHOS em placas de 100 x 20 mm e incubados no escuro a 28°C. BIALAPHOS foi fornecido como HERBIACE® (20% ai) (MEIJI SEIKA KAISHA LTD.; Tóquio, JP).

[00305] Uma semana depois, as células foram incrustadas em ágar macio raspando-se o conteúdo de células de cada papel de filtro para um tubo de centrífuga descartável estéril de 50 mL contendo 15 mL de meio de agarose macia GN6 (meio GN6 com 7,0 g/L de Agarose SEAPLAQUE™; LONZA, Rockland, ME) de 37°C a 40°C, agitando-se vigorosamente o tubo tampado e, então, vertendo-se o conteúdo do tubo uniformemente sobre quatro placas de plástico de 100 x 25 mm contendo meio de ágar sólido GN61H. Cada placa foi agitada para revestir a superfície com uma camada uniforme da suspensão de células e, com a solidificação, as placas foram incubadas a 28°C no escuro.

[00306] Após seis a 10 semanas de incubação, colônias emergentes de bom crescimento foram transferidas para placas frescas co ntendo meio de ágar GN61H. Essas colônias transformadas candidatas foram deixadas crescer durante 2-4 semanas no Meio de Seleção para estabelecer eventos estáveis com uma massa de cerca de 50 a 200 mg de tecido, que foram, então, submetidos a análise molecular.

[00307] Amostras de 0,1 mL de células de calo compactadas de

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136/146 eventos candidatos foram amostradas e colocadas em tubos aglomeradores de polipropileno de 1,2 mL COSTAR™ (CORNING, INC.; Corning NY) e congeladas a -80°C.

[00308] Análises moleculares: Eventos de células de calo foram analisados quanto à expressão relativa do transcrito de comprimento total por PCR quantitativa em tempo real da 3'UTR Per 5, e o número de cópias foi estimado por comparação com um gene interno do milho (proteína do tipo TIP41). O RNA foi isolado usando-se o kit RNeasy™ 96 (QIAGEN, Valencia, CA). Depois da primeira lavagem (RW1), as colunas foram tratadas com DNase livre de Rnase QIAGEN em tampão RDD (de acordo com o protocolo alternativo sugerido no kit). O cDNA de primeira fita foi preparado usando-se um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi ligeiramente modificado para incluir a adição de 10 pL de oligonucleotídeo T20VN a 100 μΜ (IDT) no tubo de mistura de estoque de iniciador aleatório de 1 mL, para preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.

[00309] Após a síntese de cDNA, as amostras foram diluídas a 1:3 com água livre de nuclease e armazenadas a -20°C até o ensaio. A PCR em tempo real foi realizada em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em um volume de reação de 10 μL. Todos os ensaios incluíram controles negativos sem molde (apenas mistura). Para as curvas padronizadas, também se incluiu um branco (água no poço fonte) na placa fonte para verificar contaminação cruzada das amostras. As reações foram realizadas com a ROCHE UNIVERSAL PROBE™ a 0,5 μΜ e os iniciadores para os genes alvo e de referência a 10 μΜ. As sequências de iniciador são apresentadas na Tabela 16. As condições das reações de PCR foram as se

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137/146 guintes: (1) ativação do alvo a 95°C durante 10 min; (2) 43 ciclos de (desnaturar a 95°C durante 10 s e extensão a 60°C); (3) adquirir a 72°C durante 1 s; e (4) resfriar a 40°C durante 10 s.

Tabela 16. Sequências de iniciadores usados para análises moleculares de milho transgênico.

Iniciador	Alvo	SEQ ID NO.	Sequência do Iniciador
MZTIPU67F	TIP41*	SEQ ID NO:132	AGCCAAGCCAGTGGTACTTC
MZTIPU67R	TIP41	SEQ ID NO:133	TCGCAGACAAAGTAGCAAATGT
P5U76S (F)	3'UTR de Per5	SEQ ID NO:134	TTGTGATGTTGGTGGCGTAT
P5U76A (R)	3'UTR de Per5	SEQ ID NO:135	TGTTAAATAAAACCCCAAAGATCG

*Proteína do tipo TIP41; homólogo no milho de AT4G34270 por tBLASTx (74% de identidade) [00310] Análise de Dados: Os dados foram analisados usando-se o Software LIGHTCYCLER™ v1.5 por quantificação relativa usando um algoritmo de máximo de segunda derivada para cálculo de valores de Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para análises de expressão, os valores de expressão foram calculados usando-se o método ACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que se baseia na comparação de diferenças de valores de Cq entre dois alvos, com o valor de base 2 sendo selecionado sob a hipótese de que, para reações de PCR otimizadas, o produto dobra a cada ciclo.

[00311] Regeneração de planta transgênica: Alguns eventos transformados de maneira estável foram regenerados em plantas para bioensaios de insetos na planta.

[00312] Após o processo de seleção, as culturas de calo foram transferidas para Meio de Pré-regeneração 28 (4,33 g/L Meio Basal MS com Vitaminas; 30,0 g/L de Sacarose; 5 mg/L de 6

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Benzilaminopurina; 25 pg/L de ácido 2,4-Diclorfenoxiacético; 2,5 g/L de GELZAN™; e 1,0 mg/L DE BIALAPHOS). As culturas de calo transferências foram incubadas durante 7 dias a 28°C sob luz fluorescente branca contínua (aproximadamente 50 pEm^-2s^-1).

[00313] Para a regeneração, as culturas foram transferidas para Meio de Regeneração 36 (4,33 g/L de Meio Basal MS com Vitaminas; 30 g/L de Sacarose; 2,5 g/L de GELZAN™; e 1,0 mg/L DE BIALAPHOS), e se deixou que as plantículas fossem geradas e crescessem a 28°C sob luz fluorescente branca contínua durante até 3 semanas. Quando as plantículas atingiram um estágio de crescimento adequado, foram excisadas com um fórceps e bisturi, transferidas para um tubo de ensaio de 20 x 100 mm contendo ágar, e colocadas na luz durante 2 dias.

[00314] As plantas transgênicas receberam identificadores únicos e foram transferidas para uma câmara de ambiente controlado (~28°C de temperatura de dia; 24°C de temperatura de noite; com um fotoperíodo de iluminação suplementar de 16:8). As plantas transgênicas foram transplantadas dos tubos para vasos de 8,9 cm (3,5 polegadas) e devolvidas à câmara de ambiente controlado durante 1-2 semanas para ajudar a aclimatar as plantas. As plantas transgênicas foram, então, transferidas para a estufa e transplantadas dos pequenos vasos para ROOTRAINERS™ (estilo TINUS™ 350-4; SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES; Acheson, Alberta, Canadá), a uma planta por evento por ROOTRAINER™, para bioensaios de alimentação de insetos. Apro ximadamente quatro dias após o transplante para os ROOTTRAINERS™, as plantas T0 estavam prontas para o bioensaio de alimentação de insetos. Os bioensaios de alimentação de insetos foram conduzidos pelos métodos descritos no Exemplo 12.

[00315] A presença e a expressão de um transgene que produza dsRNA em grampo resulta em uma redução no desbaste de raízes por

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WCR, conforme era evidente nas plantas que exibiam altos níveis de expressão do transcrito de dsRNA (conforme medido pela contagem de PCR relativa da 3'UTR de Per5). Os resultados dos bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental com os eventos que contêm um RNAi em grampo compreendendo a SEQ ID NO:97, e que têm um nível de expressão relativa 16 vezes maior que o gene de referência interno do tipo TIP41, são mostrados na Tabela 17. Os resultados indicam o resultado surpreendente de que 36% das plantas transgênicas de RNAi demonstraram danos reduzidos por WCR, em comparação com apenas 3% das plantas de controle não transgênicas testadas. Embora a resposta biológica seja variável nas plantas transgênicas de milho To, as plantas transgênicas mostraram redução apreciável do desbaste por WCR em comparação com as plantas de controle não transgênicas.

Tabela 17. Resultados de bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em eventos de milho transgênico Hi-II que expressam um dsRNA em grampo de Caf1-180.

Evento	N° de plantas com classificação de raiz < 0,75	N° total de plantas por evento	% de plantas com classificação de raiz < 0,75
109830[2]-001	4	9	44
109830[2]-002	1	4	25
109830[2]-004	4	7	57
109830[2]-025	0	7	0
109830[4]-005	3	6	50
T ransgênicos T otais	12	33	36
Plantas de Controle Hi-II	1	30	3

Exemplo 10: Produção mediada por WHISKERS de tecidos de milho transgênico compreendendo dsRNAs em grampo de VatpaseC v3 e VatpaseC v4 inseticidas [00316] Os métodos de transformação descritos no Exemplo 9 fo

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140/146 ram usados para fornecer plantas transgênicas de milho Hill que expressam dsRNA em grampo de VatpaseC v3 ou dsRNA em grampo de VatpaseC v4, por transformação com os plasmídios pDAB109828 e pDAB109838 (Exemplo 4). A triagem molecular foi realizada de acordo com os métodos de triagem descritos no Exemplo 9, e os bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental foram realizados de acordo com os métodos de bioensaio descritos no Exemplo 12.

[00317] A presença e a expressão de um transgene que produz dsRNA em grampo resulta em uma redução no desbaste de raiz por WCR, como era evidente nas plantas que exibem altos níveis de expressão do transcrito de dsRNA (conforme medido pela contagem de PRC relativa da 3'UTR de Per5). Os resultados dos bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental com esses eventos que contêm um RNAi em grampo compreendendo a SEQ ID NO:100 (VatpaseC v3) ou SEQ ID NO:103 (VatpaseC v4), e que têm um nível de expressão relativa 20 vezes maior que o gene de referência interno do tipo TIP41, são mostrados na Tabela 18. Os resultados indicam o resultado surpreendente de que 43% das plantas transgênicas de RNAi demonstraram danos reduzidos por WCR, em comparação com 0% das plantas de controle não transgênicas testadas. Embora a resposta biológica seja variável nas plantas transgênicas de milho T0, apenas as plantas transgênicas mostraram redução apreciável do desbaste por WCR.

Tabela 18. Resultados de bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em eventos de milho transgênico Hi-II que expressam um dsRNA em grampo de VatpaseC v3 ou v4.

Evento	N° de plantas com classificação de raiz < 0,5	N° total de plantas por evento	% de plantas com classificação de raiz < 0,5
109828[4]-011	5	10	50
109828[4]-016	1	5	20
109828[4]-006	2	6	33

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Evento	N° de plantas com classificação de raiz < 0,5	N° total de plantas por evento	% de plantas com classificação de raiz < 0,5
109838[3]-003	2	2	100
109838[3]-002	5	10	50
109838[3]-001	2	2	100
109838[4]-020	1	5	20
109838[3]-006	0	2	0
T ransgênicos T otais	18	42	43
Plantas de Controle Hi-II	0	26	0

Exemplo 11: Produção mediada por WHISKERS de tecidos de milho transgênico compreendendo dsRNAs em grampo de VatpaseH v1 inseticidas [00318] Os métodos de transformação descritos no Exemplo 9 foram usados para fornecer plantas transgênicas de milho HiII que expressam dsRNA em grampo de VatpaseH v1, por transformação com os plasmídio pDAB109829 (Exemplo 4). A triagem molecular foi realizada de acordo com os métodos de triagem descritos no Exemplo 9, e os bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental foram realizados de acordo com os métodos de bioensaio descritos no Exemplo 12.

[00319] A presença e a expressão de um transgene que produz dsRNA em grampo resulta em uma redução no desbaste de raiz por WCR, como era evidente nas plantas que exibem altos níveis de expressão do transcrito de dsRNA (conforme medido pela contagem de PRC relativa da 3'UTR de Per5). Os resultados dos bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental com esses eventos que contêm um RNAi em grampo compreendendo a SEQ ID NO:106, e que têm um nível de expressão relativa 18 vezes maior que o gene de referência interno do tipo TIP41, são mostrados na Tabela 19. Os resultados indicam o resultado surpreendente de que 60% das plantas transgênicas de RNAi demonstraram danos reduzidos por WCR, em comparação com 0%

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142/146 das plantas de controle não transgênicas testadas. Embora a resposta biológica seja variável nas plantas transgênicas de milho To, apenas as plantas transgênicas mostraram redução apreciável do desbaste por WCR.

Tabela 19. Resultados de bioensaios de crisomelídeo do milho ocidental em um evento transgênico de milho Hi-II que expressa um dsRNA em grampo de VatpaseH.

Evento	N° de plantas com classificação de raiz < 0,5	N° total de plantas por evento	% de plantas com classificação de raiz < 0,5
109829[1]-005	3	5	60%
Plantas de Controle Hi-II	0	30	0%

Exemplo 12: Bioensaio de insetos de milho transgênico [00320] Ovos de crisomelídeo do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos no solo da Crop Characteristics (Farmington, MN). Os ovos foram incubados a 28°C durante 1011 dias. Os ovos foram lavados do solo, colocados em uma solução de ágar a 0,15%, e a concentração foi ajustada a aproximadamente 75100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Preparou-se uma placa de eclosão em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovos para monitorizar as taxas de eclosão.

[00321] O solo em torno das plantas de milho foi infestado com 150200 ovos de WCR. Deixou-se que os insetos se alimentassem durante 2 semanas, após as quais se deu uma Classificação de Raiz para cada planta. Utilizou-se uma Escala de Lesão a Nós para a classificação. Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98(1):1-8.

[00322] Plantas com uma classificação de raiz de 0,75 ou mais foram imediatamente transplantadas para vasos de 19 litros (5 galões) para produção de sementes. As transplantas foram tratadas com inseticida para evitar danos adicionais pelo crisomelídeo liberação de insetos nas estufas. Plantas Hill foram cruzadas com a linhagem de milho

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143/146 endogâmica 5XH751 (doadores de pólen) para produção de sementes. As sementes produzidas por essas plantas são guardadas para avaliação na geração T1 e subsequentes das plantas.

Exemplo 13: Zea mays transgênico compreendendo sequências de praga coleóptera [00323] Dez a 20 plantas de Zea mays To transgênicas são geradas conforme descrito nos Exemplos 8 e 9. Mais 10-20 linhagens independentes de Zea mays T1 que expressam dsRNA em grampo para um construto de RNAi conforme exposto nas SEQ ID NOs:1-4 são obtidas para desafio com crisomelídeos do milho. Essas são confirmadas mediante RT-PCR. O RNA total das linhagens T1 independentes selecionadas é opcionalmente usado para RT-PCR com iniciadores projetados para se ligarem no íntron pdk do cassete em grampo em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para produção de siRNA em plantas. A amplificação das bandas desejadas para gene alvo confirma a expressão do RNA em grampo em cada Zea mays transgênica. Subsequentemente, o processamento do dsRNA em grampo dos genes alvo em siRNA é opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações por transferência de RNA.

Comparação fenotípica de linhagens transgênicas de RNAi e Zea mays de tipo selvagem.

[00324] Genes ou sequências alvo da praga coleóptera selecionados para a criação de dsRNA em grampo não têm nenhuma similaridade com qualquer gene ou sequência de planta conhecido. Portanto, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos que tenham como alvo esses genes ou sequências tenha qualquer efeito prejudicial para plantas transgênicas. Entretanto, ca

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144/146 racterísticas de desenvolvimento e morfológicas de linhagens transgênicas são comparadas com plantas do tipo selvagem, assim como as de linhagens transgênicas transformadas com um vetor em grampo vazio. Comparam-se a raiz, rebento, folhagem e características de reprodução da planta. Não há nenhuma diferença observável no comprimento da raiz e nos padrões de crescimento de plantas transgênicas e de tipo selvagem. As características do rebento da planta, como altura, número e tamanho das folhas, tempo de florescimento, tamanho e aparência da flor são similares. Em geral, não há nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem a expressão de moléculas alvo de iRNA quando cultivadas in vitro e no solo em estufa.

Exemplo 14: Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de praga coleóptera e construtos de RNAi adicionais [00325] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificadora heteróloga em seu genoma, que é transcrito em uma molécula de iRNA que tem como alvo um organismo diferente da praga coleóptera é transformada mediante transformação mediada por Agrobacterium ou por WHISKERS™ para produzir uma ou mais moléculas inseticidas de dsRNA (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que tenha como alvo um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs:1-4). Preparações de moléculas de DNA para transformação de plantas preparadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 4 são distribuídas a culturas celulares em suspensão de milho Hi-II obtidas a partir de uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificadora heteróloga em seu genoma, que é transcrito em uma molécula de iRNA que tem como alvo um organismo diferente da praga coleóptera.

Exemplo 15: Plantas transgênicas resistentes a pragas coleópteras

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145/146 [00326] A distribuição na planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondendo a genes alvo e a subsequente captação por pragas coleópteras através da alimentação resulta em regulação para baixo dos genes alvo mediante silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante, o crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga coleóptera são afetados e, no caso de pelo menos uma dentre WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva à incapacidade de parasitar com sucesso, de se alimentar, de se desenvolver e/ou de se reproduzir ou leva à morte da praga coleóptera em um ou mais estágios do desenvolvimento. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi é, então, usada para controlar pragas coleópteras. Cinco a dez replicados de 10-20 linhagens transgênicas de Z. mays Ti independentes para cada construto de RNAi são desafiadas com as espécies de crisomelídeos do milho. O desafio é duplicado para cada espécie de crisomelídeos do milho. Sementes T1 de linhagens RNAi são germinadas, e plantas resistentes são transferidas para meio de Knop modificado 10-15 dias após a germinação. Sementes de Z. mays de tipo selvagem de controle são germinadas ao mesmo tempo e usadas para infecção por crisomelídeos do milho.

[00327] Há significativamente mais (> 50%) crisomelídeos do milho sobreviventes em controles do que nas linhagens de Z. mays transgênicas portadoras de um ou mais construtos de RNAi. A abundância de iRNA é medida em crisomelídeos do milho que se alimentam de raízes de plantas de tipo selvagem e transgênicas usando RT-PCR quantitativa em tempo real. Há significativamente mais moléculas de iRNA encontradas em linhagens de Z. mays transgênicas portadoras de um ou mais construtos de RNAi do que em plantas de controle. Esses resultados indicam que as linhagens transgênicas processam siRNAs co rrespondentes a genes alvo, e que esses siRNAs estão disponíveis pa

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146/146 ra captação pela alimentação de crisomelídeos do milho. De maneira mais importante, os resultados indicam que a inibição mediada por RNAi de todos os genes alvo afeta o crescimento, desenvolvimento e viabilidade do crisomelídeo do milho alvo. Além disso, moléculas de RNAi com sequências com faltas de correspondências com mais de 80% de identidade de sequência a genes alvo afetam crisomelídeos do milho de maneira similar às sequências de tipo selvagem. O pareamento da sequência com falta de correspondências com sequências nativas para formar um dsRNA em grampo no mesmo construto de RNAi fornece siRNAs processados por plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade das pragas coleópteras que se alimentarem.

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para o controle de uma população de praga coleóptera, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de membros de uma população de praga coleóptera com um agente que compreenda uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) inibitória expressa a partir de um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 109.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA inibitória é expressa a partir do polinucleotídeo em uma célula vegetal.
3. 3. Método para o controle de uma população de praga coleóptera, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, em uma planta hospedeira de uma praga coleóptera, de uma célula vegetal transformada compreendendo o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 109 que é transcrito para produzir uma molécula de RNA inibitória, em que a molécula de RNA inibitória funciona em contato com uma praga coleóptera pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência alvo na praga coleóptera.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA inibitória é expressa a partir do polinucleotídeo em uma célula vegetal.
5. 5. Método para o controle de uma população de praga coleóptera, caracterizado pelo fato de que compreende: o fornecimento , em uma planta hospedeira de uma praga coleóptera, de uma célula vegetal transformada compreendendo um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 109.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA inibitória é expressa a partir do polinucleotídeo em uma célula vegetal.
7. 7. Método para o controle de uma população de praga co

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   2/2 leóptera, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de um agente de controle de peste, que compreende uma molécula de RNA inibitória expressa a partir do polinucleotídeo de SEQ ID NO: 109, à população de praga coleóptera, em que o agente é uma composição tópica ou uma composição nutricional.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA inibitória é expressa a partir do polinucleotídeo em uma célula vegetal.