BR102016023726A2

BR102016023726A2 - Wupa nucleic acid molecules confering resistance to coleopter and hemippter pests

Info

Publication number: BR102016023726A2
Application number: BR102016023726A
Authority: BR
Inventors: Fishilevich Elane; Narva Kenneth; L Frey Meghan; Rangasamy Murugesan; Gandra Premchand; E Worden Sarah; Lo Wendy
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2017-05-02
Also published as: WO2017066041A2; CA3001162A1; UY36941A; EP3362552A2; US10344298B2; EP3362552A4; TW201720838A; AU2016337355A1; AU2016337355B2; CN108431207A; US20170101651A1; WO2017066041A3; AR106320A1

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico e a métodos de uso das mesmas para o controle de pragas de coleópteros e por hemípteros através de inibição mediada por interferência de rna, de sequências codificantes alvo e não codificantes transcritas em pragas de coleópteros e hemípteros. a presente invenção também se refere a métodos para a produção de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de coleópteros e hemípteros, e as células de plantas e plantas obtidas desse modo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO WUPA QUE CONFEREM RESISTÊNCIA A PRAGAS DE COLEÓPTEROS E HEMÍPTEROS".

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S, No. de Série 62/240.227 depositado em 12 de outubro de 2015, cuja revelação integral é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio desta referência.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se, de modo geral, a controle genético de dano das plantas causado por pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de sequências codificantes e não codificantes alvo, e à utilização de tecnologias de DNA recombinante para reprimir pós-transcricionalmente ou inibir a expressão de sequências codificantes e não codificantes alvo nas células de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para proporcionar um efeito de proteção das plantas. ANTECEDENTES

[0003] A broca da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgi-fera virgifera LeConte, é uma das espécies de broca da raiz do milho mais devastadoras na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de cultivo de milho no centro-oeste dos Estados Unido. A broca da raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie intimamente relacionada que co-habita grande parte da mesma faixa que a WCR. Existem várias outras su-bespécies de Diabrotica relacionadas que são pragas importantes nas Américas: a broca da raiz do milho mexicana (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a broca da raiz do sul (SCR), D. undecimpunctata ho-wardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departa- mento de Agricultura dos Estados Unidos atualmente estima que as brocas da raiz do milho provocam 1 bilhão de dólares em perda de receita a cada ano, inclusive 800 milhões de dólares em perda de produção e 200 milhões de dólares em custos de tratamento.

[0004] Tanto os ovos de WCR quanto de NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permancem no estágio de ovo por todo o iinverno. Os ovos são oblongos, brancos, e têm menos de 0,004 polegadas (0,010 cm) de comprimento. As larvas ecolhem no final de maio ou no início de junho, com o momento preciso da eclosão dos ovos variando de ano para ano devido a diferenças de temperatura e localização. As larvas recém-eclodidas são vermes brancos que têm menos de 0,125 polegadas (0,3175 cm) de comprimento. Uma vez eclodidas, as larvas começam a se alimentar sobre as raízes do milho. As brocas da raiz do milho passam através de três estágios larvais (instars). Depois de alimentação por várias semanas, as larvas mudam para o estágio de pupa. Elas formam ninfas no solo, e em seguida emergem do solo como adultos em julho e agosto. As brocas da raiz adultas têm cerca de 0,25 polegadas (0,635 cm) de comprimento.

[0005] As larvas da broca da raiz do milho completam o desenvolvimento sobre o milho e sobre várias outras espécies de gramíneas. As larvas criadas sobre rabo de raposa amarelo emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula da cabeça menor como adultos do que as larvas criadas sobre o milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634. Adultos de WCR se alimentam sobre a seda, o pólen, e grãos do milho sobre as pontas de espigas expostas. Se WCR adultos emergem antes de tecidos reprodutivos do milho estarem presentes, podem se alimentar sobre o tecido da folha, desse modo tornando mais lento o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos vão rapidamente se deslocar para sedas e pólen preferenciais quando estes se tornarem disponíveis. NCR adultos também se alimentam sobre os tecidos reprodutivos da planta de milho, porém em contraste raramente se alimentam sobre as folhas do milho.

[0006] A maior parte do dano da broca da raiz no milho é causada por alimentação das larvas. Brocas da raiz recém-eclodidas inicialmente alimentadas sobre os finos cabelos da raiz do milho e penetram dentro das pontas das raízes. À medida que as larvas crescem mais, elas se alimentam sobre e penetram dentro das raízes primárias. Quando as brocas da raiz do milho são abundantes, a alimentação das larvas frequentemente resulta nas podas das raízes todo o caminho até a base do talo de milho. Grave lesão das raízes interfere com a capazidade das raízes para transportar água e nutrientes para dentro da planta, reduz o crescimento da planta, e resulta em redução da produção de grãos, desse modo frequentemente reduzindo drasticamente a produção total. Grave lesão das raízes também frequentemente resulta em lodging das plantas de milho, o qual torna a colheita mais difícil e diminui mais a produção. Além disso, a alimentação por adultos sobre os tecidos reprodutivos do milho pode resultar em poda das sementes na ponta de espiga. Se este "corte da seda" for suficientemente severo durante a derrama do pólen, a polinização pode ser interrompida.

[0007] O controle de brocas da raiz do milho pode ser tentado por rotação de colheitas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thuringiensis), plantas transgênicas que expressam toxinas do Bt, ou uma combinação das mesmas. A rotação de colheitas sofre da desvantagem de impor restrições indesejadas sobre a utilização dos terrenos agrícolas. Além disso, pode ocorrer a oviposição de algumas espécies de broca da raiz em campos de colheitas diferentes de milho ou diapausa estendida resulta em eclosão dos ovgos durante múltiplos anos, desse modo mitigando a eficácia da rotação de colheitas praticada com milho e soja.

[0008] Os inseticidas químicos são a estratégia mais mais fortemente confiável para obter o controle da broca da raiz do milho. No entanto, o uso de inseticidas químicos é uma estratégia de controle da broca da raiz do milho imperfeita; mais de 1 bilhão de dólares podem ser perdidos nos Estados Unidos a cada devido à broca da raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são acrescentados aos custos do dano causado pela broca da raiz que pode ocorrer apesar da utilização dos inseticidas. Populações elevadas de larvas, chuvas pesadas, e a aplicação inadequada do(s) inseticida(s) podem todas resultar em controle inadequado da broca da raiz do milho. Além disso, a utilização contínua de inseticidas pode selecionar cepas de broca da raiz resistentes a inseticida, bem como aumentar preocupações ambientais significativas devido à toxicidade para espécies não alvo.

[0009] Percevejos e outros insetos hemípteros (heteroptera) são outro complexo de pragas agrícolas importantes. No mundo inteiro, são conhecidas mais de 50 espécies de percevejos intimamente relacionadas que causam dano para as colheitas. McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico, CRC Press. Insetos hemípteros estão presentes em um grande número de colheitas importantes, inclusive milho, soja, frutos, legumes, verduras, e cereais.

[0010] Os percevejos passam através de múltiplos estágios de ninfas antes de atingirem o estágio adulto. O tempo para se desenvolverem de ovos até adultos é de cerca de 30 a 40 dias. Tanto as ninfas quanto os adultos se alimentam sobre a seiva de tecidos moles na qual também injetam enzimas digestivas causando digestão de oral extra e necrose. O material da planta digerido e os nutrientes são em seguida ingeridos. A depleção de água e nutrientes do sistema vascu- lar da planta resulta em dano dos tecidos da planta. O dano para os grãos em desenvolvimento e as sementes é o mais significativo uma vez que a produção e a germinação são significativamente reduzidas. Múltiplas gerações ocorrem em climas quentes resultando em significativa pressão de insetos. O manejo corrente de percevejos se baseia em tratamento inseticida em uma base de campo individual. Portanto, estratégias alternativas de manejo são urgentemente necessárias de modo a minimizar as perdas de colheita em curso.

[0011] Interferência de RNA (RNAi) é um processo utilizando caminhos celulares endógenos, por meio dos quais uma molécula de RNA interferente (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para toda, ou qualquer porção de tamanho adequado, de uma sequência de gene alvo resulta na degradação do mRNA codificado desse modo. Nos últimos anos, RNAi tem sido usado para realizar "knockdown" genético em uma série de espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, embriões de insetos, e células em cultura de tecido. Vide, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McManus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747.

[0012] O RNAi realiza a degradação do mRNA através de um caminho endógeno incluindo o complexo de proteínas DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominados pequeno RNA interferente (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de filamento único: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado, e o filamento guia é incorporado no complexo de silencia-mento induzido por RNA (RISC). Moléculas de ácido microrribonuclei-co (miRNA) podem ser incorporadas de modo similar no RISC. Ocorre silenciamento genético pós-transcricional quando o filamento guia liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz a clivagem por Argonauta, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido por espalhar sistemica-mente por toda parte alguns organismos eucarióticos apesar de concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA tais como plantas, nematódeos, e alguns insetos.

[0013] Somente transcriptos complementares ao siRNA e/ou ao miRNA são clivados e degradados, e deste modo o knock-down da expressão de mRNA é sequência-específica. Nas plantas, existem vários grupos funcionais de genes DICER. O efeito de silenciamento genético do RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio na abundância do transcripto alvo de 90% ou mais, com consequente redução nos níveis da proteína correspondente. Em insetos, existem no mínimo dois genes DICER, onde DICER1 facilita a degradação por Argonauta 1 acionada pelo miRNA. Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81. DICER2 facilita a degradação por Argonauta 2 acionada pelo siRNA.

[0014] A Patente U.S. No. US 7.612.194 e a Publicação de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 revelam uma biblioteca de 9112 sequências de etiqueta de sequência expressada (EST, em inglês, expressed sequence tag) isoladas a partir de popas de D. v. virgifera LeConte. Foi sugerido na Patente U.S. No. US 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 ligar operacionalmente a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma de várias sequências parciais particulares de H+-ATPase do tipo vacuolar (V-ATPase) de D. v. virgifera reveladas nas mesmas para a expressão de RNA antissenso em células de plantas. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não revelada (a sequência parcial é declarada como sendo 58% idêntica ao produto genético C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antissenso em células de plantas. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes da subunidade beta de coatomer de D. v. virgifera para a expressão de RNA antissenso em células de plantas. Além disso, a Patente U.S. No. US 7.943.819 revela uma biblioteca de 906 sequências de etiqueta de sequência expressada (EST) isoladas a partir de larvas, pupas, e me-sentérios dissecados de D. v. virgifera LeConte, e sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de proteína do corpo multivesicular carregada 4b de D. v. virgifera para a expressão de RNA de filamento duplo em células de plantas.

[0015] Não é proporcionada nenhuma sugestão adicional na Patente U.S. No. US 7.612.194, e na Publicação de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para usar qualquer sequência em particular das mais de nove mil sequências listadas nas mesmas para interferência de RNA, diferentes das várias sequências parciais particulares de V-ATPase e das sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma da Patente U.S. No. US 7.612.194, e da Publicação de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 proporciona qualquer orientação quanto a quais outras das mais de nove mil sequências proporcionadas seriam letais ou mesmo úteis de modo diverso, em espécies de broca da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. No. US 7.943.819 não proporciona nenhuma sugestão para usar qualquer sequência em particular das mais de no-vecentas sequências listadas na mesma para interferência de RNA, diferente da sequência parcial particular de um gene de proteína do corpo multivesicular carregada 4b. Além disso, a Patente U.S. No. US 7.943.819 não proporciona nenhuma orientação quanto a quais outras das mais de novecentas sequências proporcionadas seriam letais, ou mesmo úteis de modo diverso, em espécies de broca da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2013/040173 e a Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada a partir de um gene Snf7 de Diabrotica virgifera para interferência de RNA em milho. (Também revelado em Bolognesi et al. (2012) PLOS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534).

[0016] A esmagadora maioria das sequências complementares aos DNAs da broca da raiz do milho (tais como os precedentes) não são letais em espécies de broca da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007, Nature Biotechnology 25:1322-1326), descrevem os efeitos da inibição de vários genes alvo de WCR por RNAi. Estes autores reportaram que os 8 de 26 genes alvo que eles testaram não foram capazes de proporcionar mortalidade de pragas de coleópteros experimentalmente significativa em uma concentração de iRNA (por exemplo, dsRNA) muito elevada de mais de 520 ng/cm2.

[0017] Os autores da Patente U.S. No. US 7.612.194 e da Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 produziram o primeiro relatório de RNAi in planta em plantas de milho visando a broca da raiz do milho ocidental. Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Estes autores descrevem um sistema de RNAi alimentar in vivo de alta produtividade para triar genes alvo potenciais para o desenvolimento de milho RNAi transgênico. De um conjunto de genes inicial de 290 alvos, somente 14 apresentaram potencial de controle larval. Um dos RNAs de filamento duplo mais eficazes (dsRNA) visada um gene codificando a subunidade A da ATPase vacuolar (V-ATPase), resultando em uma rápida supressão do mRNA endógeno correspondente e acionando uma resposta de RNAi específica com baixas concentrações de dsRNA. Deste modo, estes autores documentaram pela primeira vez o potencial para RNAi in planta como uma possível ferramento de manejo de pragas, enquanto simultaneamente demonstrando que os alvos efetivos não podem ser precisamente identificados a priori, mesmo a partir de uma série relativamente pequena de genes candidatos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0018] São reveladas aqui, neste pedido de patente, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs, e hpRNAs), e métodos de utilização das mesmas, para o controle de pragas de coleópteros, incluindo, por exemplo, D. v. virgifera LeConte (broca da raiz do milho ocidental, "WCR"); D. barberi Smith e Lawrence (broca da raiz do milho setentrional, "NCR"); D. u. howardi Barber (broca da raiz do milho meridional, "SCR"); D. v. zeae Krysan e Smith (broca da raiz do milho mexicana, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim e pragas de hemípteros, incluindo, por exemplo, Euschis-tus heros (Fabr.) (percevejo marrom neotropical (Neotropical Brown Stink Bug), “BSB”), Nezara viridula (L.) (percevejo verde do sul (Southern Green Stink Bug)), Piezodorus guildinii (Westwood) (percevejo de faixa vermelha (Red-banded Stink Bug)), Halyomorpha halys (Stàl) (percevejo marmorado marrom (Brown Marmorated Stink Bug)), Chinavia hilare (Say) (percevejo verde (Green Stink Bug)), Euschistus servus (Say) (percevejo marrom (Brown Stink Bug)), Dichelops mela-canthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (percevejo vermelho neotropical (Neotropical Red Shouldered Stink Bug)), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (bicho do algodão (Cotton Bug)), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomega-lotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (besouro da folha manchada ocidental (Western Tarnished Plant Bug), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois). Em exemplos particulares, são reveladas moléculas de ácido nucleico de exemplo que podem ser homólogas a no mínimo uma porção de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0019] Nestes exemplos e em exemplos adicionais, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene alvo, cujo produto pode ser, por exemplo e sem limitação: envolvido em um processo metabó-lico ou envolvido no desenvolvimento de larvas / ninfas. Em alguns exemplos, a inibição pós-translacional da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência homóloga à mesma pode ser letal em pragas de coleópteros e/ou he-mípteros, ou pode resultar em redução do crescimento e/ou desenvolvimento. Em exemplos específicos, um gene codificando a proteína Troponina I (Barbas et al., 1991; Barbas et al., 1993) (referida aqui, neste pedido de patente, como wings up A ou wupA) pode ser selecionado como um gene alvo para silenciamento pós-transcricional. Em exemplos particulares, um gene alvo útil para inibição pós-transcricional é o novo gene referido aqui, neste pedido de patente, como wupA. Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos de wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79); o complemento de wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79); e fragmentos de qualquer uma das precedentes é portanto revelada aqui, neste pedido de patente.

[0020] Também são reveladas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipep- tídeo que é no mínimo 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto genético alvo (por exemplo, o produto de um gene referido como WUPA). Por exemplo, uma molécula de ácido nu-cleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo que é no mínimo 85% idêntico a SEQ ID NO: 2 (WU-PA-1 DE D. virgifera), SEQ ID NO: 4 (WUPA-2 DE D. virgifera), SEQ ID NO: 6 (WUPA-3 DE D. virgifera), ou SEQ ID NO: 80 (proteína WUPA de E. heros); e/ou uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de D. virgifera wupA-1, D. virgifera wupA-2, D. virgifera wupA-3, ou E. heros wupA. Adicionalmente são reveladas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo no mínimo 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto genético alvo.

[0021] Também são revelados polinucleotídeos de cDNA que podem ser usados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene alvo da praga de coleópteros e/ou hemípte-ros, por exemplo: wupA. Em modalidades particulares, dsRNAs, siR-NAs, shRNA, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou uma bactéria. Em exemplos particulares, são reveladas moléculas de cDNA que podem ser usadas de modo a produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte do gene wupA (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79), por exemplo, um gene wupA de WCR (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 5) ou um gene wupA de BSB (por exemplo, SEQ ID NO: 79).

[0022] Adicionalmente são revelados meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros, e meios para proporcionar proteção contra pragas de coleópteros a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros é uma molécula de RNA de filamento único ou de filamento duplo consistindo de um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 89 a 97; e os complementos do mesmo. Equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros incluem moléculas de RNA de filamento único ou de filamento duplo que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de wupA de coleópteros compreendendo SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, e/ou SEQ ID NO: 12. Um meio para proporcionar proteção contra pragas de coleópteros a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo um polinucleotídeo codificando um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros ligado operacionalmente a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0023] Além disso são revelados meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros, e meios para proporcionar proteção contra pragas de hemípteros a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros é uma molécula de RNA de filamento único ou de filamento duplo consistindo de um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 98 a 101; e os complementos do mesmo. Equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros incluem moléculas de RNA de filamento único ou de filamento duplo que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene wupA de hemípteros compreendendo SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e/ou SEQ ID NO: 83. Um meio para proporcionar proteção contra pragas de hemípteros a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo um polinucleo- tídeo codificando um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros ligado operacionalmente a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no geno-ma de uma planta.

[0024] Adicionalmente são revelados métodos para controlar uma população de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, compreendendo proporcionando a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que funciona depois de ser absorvida pela praga de coleópteros e/ou hemípteros para inibir uma função biológica dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0025] Em algumas modalidades, métodos para controlar uma população de uma praga de coleópteros compreendem proporcionar à praga de coleópteros uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 89; o complemento de SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; o complemento de SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; o complemento de SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; o complemento de SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; o complemento de SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; o complemento de SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; o complemento de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; o complemento de SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; o complemento de SEQ ID NO: 97; um polinucleo-tídeo que hibridiza a um polinucleotídeo wupA nativo de uma praga de coleópteros (por exemplo, WCR); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo wupA nativo de uma praga de coleópteros; um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo co-dificante nativo de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 7 a 12; o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 7 a 12.

[0026] Em outras modalidades, métodos para controlar uma população de uma praga de hemípteros compreendem proporcionar à praga de hemípteros uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 98; o complemento de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; o complemento de SEQ ID NO: 99; SEQ ID NO: 100; o complemento de SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 101; o complemento de SEQ ID NO: 101; um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo wu-pA nativo de uma praga de hemípteros (por exemplo, BSB); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo wupA nativo de uma praga de hemípteros; um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 79 e 81 a 83; e o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de hemíptero compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 79 e 81 a 83.

[0027] Em modalidades particulares, um iRNA que funciona depois de ser absorvido por uma praga de insetos para inibir uma função biológica dentro da praga é transcrito a partir de um DNA compreendendo todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83; o complemento de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83; uma sequência codificante nati- va de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) ou de um organismo de hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica ou de um organismo de hemíptero compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83; uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabro-tica ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83; e o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica ou de um organismo de hemípterano que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83.

[0028] Também são revelados aqui, neste pedido de patente, métodos em que dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser proporcionados para uma praga de coleópteros e/ou hemípte-ros em um teste à base de dieta, ou em células de plantas modificadas geneticamente expressando os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs. Nestes exemplos e em exemplos adicionais, os dsR- NAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas de pragas de coleópteros e/ou ninfas de pragas de hemípte-ros. A ingestão de dsRNAs, siRNA, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs da invenção pode em seguida resultar em RNAi nas larvas, o qual por sua vez pode resultar em silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga de coleópteros e/ou hemípteros e levando em última análise a mortalidade das larvas. Deste modo, são revelados métodos em que moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico exemplares úteis para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros são proporcionadas para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos particulares, a praga de coleópteros e/ou hemípteros controlada por utilização de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR, NCR, SCR, MCR, Euschistus heros, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops me-lacanthus, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e/ou Lygus lineolaris.

[0029] As características precedentes e outras se tornarão mais evidentes a partir da Descrição Detalhada de várias modalidades que se segue, a qual prossegue com referência às FIGs. 1 a 2 anexadas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0030] A FIG. 1 é uma representação pictórica de uma estratégia para a produção de dsRNA a partir de um único modelo de transcrição com um único par de iniciadores.

[0031] A FIG. 2 é uma representação pictórica de uma estratégia para a produção de dsRNA a partir de dois modelos de transcrição. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0032] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequências anexada são mostradas usando abreviações de letras pa- dronizadas para bases de nucleotídeos, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. as sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listadas definem moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) tendo os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos arranjados na maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listadas também definem cada um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeos e de aminoácidos arranjados na maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, será entendido que uma sequência de nucleotídeos incluindo uma sequência codificante também descreve o gênero de polinucleotídeos codificando o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo consistindo da sequência de referência. Será adicionalmente entendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero de ORFs de polinucleotídeo codificando aquele polipeptí-deo.

[0033] Somente é mostrado um filamento de cada sequência de ácido nucleico, mas o filamento complementar é entendido como incluído por qualquer referência ao filamento apresentado. Como o complemento e o complemento reverso de uma sequência de ácido nuclei-co primária são necessariamente reveladas pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de uma sequência de ácido nucleico são incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a menos que seja explicitamente declarado que é de modo diverso (ou seja evidente que é de modo diverso a partir do contexto no qual a sequência aparece). Além disso, conforme é entendido na arte que a sequência de nucleotídeos de um filamento de RNA é determinada pela sequência do DNA a partir do qual foi transcrita (mas para a substituição de nucleobases de uracila (U) por timina (T)), uma sequência de RNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de sequênci- as anexada: [0034] A SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de DNA compreendendo wupA-1 de Diabrotica virgifera.

[0035] A SEQ ID NO: 2 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína WUPA-1 de Diabrotica virgifera.

[0036] A SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA compreendendo wupA-2 de Diabrotica virgifera.

[0037] A SEQ ID NO: 4 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína WUPA-2 de Diabrotica virgifera.

[0038] A SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA compreendendo wupA-3 de Diabrotica virgifera.

[0039] A SEQ ID NO: 6 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína WUPA-3 de Diabrotica virgifera.

[0040] A SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de DNA de wupA-1 reg1 (região 1) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0041] A SEQ ID NO: 8 mostra uma sequência de DNA de wupA-2 reg2 (região 2) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0042] A SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de complemento reverso de DNA de wupA-3 reg3 (região 3) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0043] A SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de complemento reverso de DNA de wupA-1 reg4 (região 4) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0044] A SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência de DNA de wupA- 3 v1 (versão 1) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0045] A SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência de DNA de wupA-3 v2 (versão 2) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0046] A SEQ ID NO: 13 mostra uma sequência de DNA de um promotor de fago T7.

[0047] A SEQ ID NO: 14 mostra uma sequência de DNA de um segmento de região codificante YFP que foi usado para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0048] A SEQ ID NOS: 15 a 22 mostram iniciadores usadas para amplificar porções de uma sequência de subunidade wupA de Diabrotica virgifera compreendendo wupA-3 reg3, wupA-1 reg4, wupA-3 v1, e wupA-3 v2 .

[0049] A SEQ ID NO: 23 mostra uma sequência de DNA de Anexi-na região 1.

[0050] A SEQ ID NO: 24 mostra uma sequência de DNA de Anexi-na região 2.

[0051] A SEQ ID NO: 25 mostra uma sequência de DNA de Beta espectrina 2 região 1.

[0052] A SEQ ID NO: 26 mostra uma sequência de DNA de Beta espectrina 2 região 2.

[0053] A SEQ ID NO: 27 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 1.

[0054] A SEQ ID NO: 28 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 2.

[0055] A SEQ ID NOs: 29 a 56 mostram iniciadores usados para amplificar regiões genéticas de YFP, Anexina, Beta espectrina 2, e mtRP-L4 para síntese de dsRNA.

[0056] A SEQ ID NO: 57 mostra uma sequência de DNA de milho codificando uma proteína semelhante a TIP41.

[0057] A SEQ ID NO: 58 mostra uma sequência de DNA de oligo-nucleotídeo T20NV.

[0058] A SEQ ID NOs: 59 a 63 mostram sequências de iniciadores e sondas usadas para medir os níveis de transcriptos do milho.

[0059] A SEQ ID NO: 64 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região codificante SpecR usada para detecção da espinha dorsal de vetores binários.

[0060] A SEQ ID NO: 65 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região codificante AAD1 usada para análise do número de cópias genômicas.

[0061] A SEQ ID NO: 66 mostra uma sequência de DNA de um gene de invertase do milho.

[0062] A SEQ ID NOs: 67 a 75 mostram sequências de iniciadores e sondas usadas para análises do número de cópias genômicas.

[0063] A SEQ ID NOs: 76 a 78 mostram sequências de iniciadores e sondas usadas para análises de expressão em milho.

[0064] A SEQ ID NO: 79 mostra um exemplo de sequência de DNA de transcripto BSB wupA de um percevejo marrom neotropical (em inglês, Neotropical Brown Stink Bug (Euschistus heros).

[0065] A SEQ ID NO: 80 mostra uma sequência de aminoácidos de uma de proteína WUPA de Euschistus heros.

[0066] A SEQ ID NO: 81 mostra uma sequência de DNA de BSB_wupA reg1 (região 1) de Euschistus heros que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0067] A SEQ ID NO: 82 mostra uma sequência de DNA de BSB_wupA v1 (versão 1) de Euschistus heros que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0068] A SEQ ID NO: 83 mostra uma sequência de DNA de BSB_wupA v2 (versão 2) de Euschistus heros que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotores T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).

[0069] A SEQ ID NO: 84 a 85 mostram iniciadores usados para amplificar porções de uma sequência wupA de Euschistus heros compreendendo BSB_wupA v1.

[0070] A SEQ ID NO: 86 é o filamento de senso de dsRNA direcionado para YFP: YFPv2 [0071] A SEQ ID NOs: 87 a 88 mostram iniciadores usados para amplificar porções de um dsRNA direcionado para YFP: YFPv2 [0072] A SEQ ID NOs: 89 a 101 mostram exemplos de RNAs transcritos a partir de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotí-deos wupA e fragmentos dos mesmos.

[0073] A SEQ ID NO: 102 mostra um exemplo de polinucleotídeo encadeador, o qual forma uma “alça (loop)” quando transcrito em um transcripto de RNA para formar uma estrutura de grampo (hairpin).

[0074] A SEQ ID NO: 103 mostra uma IDT Custom Oligo sonda wupA PRB Set1, mascada com FAM e duplamente extinta com su-pressores Zen e Iowa Black DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral de várias modalidades [0075] Foi desenvolvida interferência de RNA (RNAi) como uma ferramenta para o manejo de pragas de insetos, usando uma das espécies de pragas alvo mais prováveis para plantas transgênicas que expressam dsRNA; a broca da raiz do milho ocidental. Até o momento, a maioria dos genes propostos como alvos para RNAi em larvas da broca da raiz na verdade não obtém seu propósito. Aqui, neste pedido de patente, foi descrito knockdown de wupA mediado por RNAi nas pragas de insetos de exemplo, broca da raiz do milho ocidental e percevejo marrom neotropical, o qual foi demonstrado que tem um fenóti-po letal quando, por exemplo, moléculas de iRNA são liberadas através de dsRNA de wupA ingerido ou injetado. Em modalidades aqui, neste pedido de patente, a capacidade para liberar dsRNA de wupA por alimentação aos insetos confere um efeito de RNAi que é muito útil para o manejo de pragas por insetos (por exemplo, coleópteros e he-mípteros). Combinando RNAi mediado por wupA com outros alvos de RNAi úteis, o potencial para afetar múltiplas sequências alvo, por exemplo, em brocas da raiz larvais, pode aumentar as oportunidades para desenvolver abordagens sustentáveis para o manejo de pragas de insetos envolvendo tecnologias de RNAi larval.

[0076] São revelados aqui, neste pedido de patente, métodos e composições para o controle genético de infestações por pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Também são proporcionados métodos para a identificação de um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para uso como um gene alvo para o controle de uma população de praga de coleópteros e/ou hemípteros mediado por RNAi. Vetores de plasmídeo de DNA codificando uma ou mais moléculas de dsRNA podem ser projetados para suprimir um ou mais genes alvo essenciais para o crescimento, a sobrevida, o desenvolvimento, e/ou a reprodução. Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para a repressão pós-transcricional da expressão ou da inibição de um gene alvo através de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência codificante ou não codificante do gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e/ou hpR-NA transcritas a partir de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência codificante ou não codificante de um gene alvo, desse modo proporcionando um efeito de proteção de plantas.

[0077] Deste modo, algumas modalidades envolvem inibição se-quência-específica da expressão de produtos genéticos alvo, usando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a sequências codificantes e/ou não codificantes do um ou mais genes alvo de modo a obter no mínimo controle parcial de uma praga de co-leópteros e/ou hemípteros. É revelada uma série de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, conforme estipulado em qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e SEQ ID NO: 83, e fragmentos da mesma. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressada a partir desta sequência, fragmentos da mesma, ou um gene compreendendo uma destas sequências, para o silenciamento pós-transcricional ou para a inibição de um gene alvo. Em determinadas modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO: 3. Em ainda modalidades adicionais, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO: 5. Em outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO: 7. Em ainda outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83.

[0078] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira re-combinante (por exemplo, uma célula de planta) tendo em seu geno-ma no mínimo uma sequência de DNA recombinante codificando no mínimo uma ou mais moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a uma ou mais moléculas de dsRNA podem ser produzidas quando ingeridas por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros para silenciar pós-transcricionalmente ou inibir a expressão de um gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, uma ou mais de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83; fragmentos de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83; ou uma sequência parcial de um gene compreendendo uma ou mais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83; ou complementos das mesmas.

[0079] Modalidades particulares envolvem uma célula hospedeira recombinante que tem em seu genoma uma sequência de DNA re-combinante codificando no mínimo uma ou mais moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo toda ou parte da SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, ou SEQ ID NO: 98 (por exemplo, no mínimo um polinucleotídeo selecionado entre um grupo compreendendo SEQ ID NOs: 92 a 97 e 99 a 101), ou o complemento da mes- ma. Quando ingeridas por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, as moléculas de iRNA podem silenciar ou inibir a expressão de um DNA de wupA do gene alvo (por exemplo, um DNA compreendendo todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e/ou SEQ ID NO: 79), na praga de coleópteros e/ou hemípteros, e desse modo resultar em cessação do crescimento, do desenvolvimento, da viabilidade, e/ou da alimentação na praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0080] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombi-nante que tem em seu genoma no mínimo uma sequência de DNA re-combinante codificando no mínimo uma molécula de dsRNA pode ser uma célula de planta transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo uma célula de planta transformada semelhante. Além das plantas transgênicas referidas, plantas da progênie de qualquer geração de plantas transgênicas, sementes transgênicas, e produtos de plantas transgênicas, são todos proporcionados, cada um dos quais compreende uma ou mais sequências de DNA recombinante. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressada em uma célula de planta transgênica. Portanto, nestas e em outras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada a partir de uma célula de planta transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada entre o grupo compreendendo milho (Zea mays), soja (Glycine max), e plantas da família Poaceae.

[0081] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas e em outras modalidades, pode ser proporcionada uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotídeos codificando uma molécula de dsRNA pode ser ligada operacionalmente a um promotor, e também pode ser ligada operacionalmente a uma sequência de terminação de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros pode compreender: (a) transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de plantas compreendendo uma pluralidade de células de plantas transformadas; (c) selecionar para uma célula de planta transformada que tenha integrado o vetor em seu genoma; e (d) determinar que a célula de planta transformada selecionada compreenda a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeos do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula de planta que tenha o vetor integrado em seu genoma e compreenda a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeos do vetor.

[0082] Deste modo, também é revelada uma planta transgênica compreendendo um vetor tendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeos do vetor. Em modalidades particulares, a expressão de uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que contacta a planta transformada ou a célula da planta transformada, por exemplo, por alimentação sobre a planta transformada, sobre uma parte da planta (por exemplo, a raiz) ou sobre a célula da planta. As plantas transgênicas reveladas aqui, neste pedido de patente, podem apresentar resistência e/ou tolerância aumentada a infestações por pragas de coleópteros e/ou hemípteros.

Plantas transgênicas particulares podem apresentar resistência e/ou tolerância aumentada a uma ou mais pragas de coleópteros e/ou he-mípteros selecionadas entre o grupo que consiste em: WCR, NCR, SCR, MCR, Euschistus heros, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyo-morpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, C. marginatum, Diche-lops melacanthus, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomega-lotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e/ou Lygus lineolaris.

[0083] Também são revelados aqui, neste pedido de patente, métodos para a liberação de agentes de controle, tais como uma molécula de iRNA, a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Os agentes de controle referidos podem causar, direta ou indiretamente, uma diminuição na capacidade da praga de coleópteros e/ou hemípteros para se alimentar, crescer ou causar dano de modo diverso em um hospedeiro. Em algumas modalidades, é proporcionado um método que compreende a liberação de uma molécula de dsRNA estabilizada a uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de modo a suprimir no mínimo um gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros, desse modo reduzindo ou eliminando o dano da planta por uma praga de co-leópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar na cessação do crescimento, do desenvolvimento, da viabilidade, e/ou da alimentação na praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, o método eventualmente pode resultar na destruição da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0084] Em algumas modalidades, são proporcionadas composições (por exemplo, uma composição tópica) que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da invenção para uso em plantas, animais, e/ou no meio ambiente de uma planta ou de um animal de modo a realizar a eliminação ou a redução de uma infestação por pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou uma fonte de alimento a ser alimentada à praga de coleópteros e/ou hemípteros. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou a fonte de alimento disponível para a praga de coleópteros e/ou hemípteros. A ingestão de uma composição que compreende moléculas de iRNA pode resultar na captação das moléculas por uma ou mais células da praga de coleópteros e/ou hemípteros, a qual por sua vez pode resultar na inibição da expressão de no mínimo um gene alvo na uma ou mais células da praga de coleópteros e/ou hemípteros. A ingestão de ou o dano a uma planta ou a uma célula de planta por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser limitada ou eliminada em ou sobre qualquer tecido do hospedeiro ou meio ambiente no qual a praga de coleópteros e/ou hemípteros esteja presente proporcionando uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção no hospedeiro da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[0085] São formadas iscas de RNAi quando o dsRNA é misturado com alimento ou um agente de atração ou ambos. Quando as pragas comem a isca, também consomem o dsRNA. As iscas podem tomar a forma de grânulos, géis, pós escoáveis, líquidos, ou sólidos. Em outra modalidade, wupA pode ser incorporado em uma formulação de isca tal como a descrita na Patente U.S.No. US 8.530.440 a qual é por este incorporada por meio de referência. De modo geral, com iscas, as iscas são colocadas no meio ambiente ou em torno do meio ambiente da praga de insetos, por exemplo, WCR pode entrar em contato com, e/ou ser atraído para a isca.

[0086] As composições e os métodos revelados aqui, neste pedido de patente, podem ser usados juntos em combinações com outros mé- todos e composições para controlar o dano por pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, uma molécula de iRNA conforme descrito aqui, neste pedido de patente, para a proteção de plantas contra pragas de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada em um método que compreende a utilização adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, bio-pesticidas eficazes contra uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, rotação de colheitas, ou técnicas genéticas recombinantes que apresentam características diferentes das características dos métodos mediados por RNAi e das composições de RNAi da invenção (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudiciais para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, toxinas do Bt)). II. Abreviações dsRNA ácido ribonucleico de filamento duplo GI inibição do crescimento NCBI National Center for Biotechnology Information gDNA ácido desoxirribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibidor ORF frame de leitura aberta RNAi ácido ribonucleico interferente miRNA ácido micro ribonucleico shRNA pequeno ácido ribonucleico de hairpin siRNA pequeno ácido ribonucleico inibidor hpRNA ácido ribonucleico de hairpin UTR região não traduzida WCR broca da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgife-ra LeConte) NCR broca da raiz do milho setentrional (Diabrotica barberi Smith e Lawrence) MCR Broca da raiz do milho mexicana (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith) PCR Reação de cadeia polimerase RISC Complexo de Silenciamento induzido por RNA SCR Broca da raiz do milho meridional (Diabrotica undecimpunc- tata howardi Barber) BSB Percevejo marrom neotropical (Euschistus heros Fabricius) YFP Proteína fluorescente amarela SEM Erro padrão da média III. Termos [0087] Na descrição e nas tabelas as quais se seguem, são usados uma série de termos. De modo a proporcionar um entendimento claro e consistente da especificação e das reivindicações, incluindo do âmbito a ser dado a semelhantes termos, são proporcionadas as seguintes definições: [0088] Praga de coleópteros: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "praga de coleópteros" se refere a insetos do gênero Diabrotica, os quias se alimentam sobre o milho e outras gramí-neas verdadeias. Em exemplos particulares, uma praga de coleópteros é selecionada entre a lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

[0089] Contato (com um organismo): Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "contato com" ou "captação por" um organismo (por exemplo, uma praga de coleópteros e/ou hemípteros), com respeito a uma molécula de ácido nucleico, inclui internalização da molécula de ácido nucleico dentro do organismo, por exemplo e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, por alimentação); contato do organismo com uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico; e embebimento dos organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.

[0090] Contig: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "contig" se refere a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de uma série de segmentos de DNA de sobreposição derivados a partir de uma única fonte genética.

[0091] Planta de milho: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "planta de milho" se refere a uma planta da espécie, Zea mays (milho).

[0092] Codificando um dsRNA: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "codificando um dsRNA" inclui um gene cujo produto de transcrição de RNA é capaz de formar uma estrutura de dsRNA intramolecular (por exemplo, uma hairpin) ou estrutura de dsRNA intermolecular (por exemplo, por hibridização a uma molécula de RNA alvo).

[0093] Expressão: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "expressão" de uma sequência codificante (por exemplo, um gene ou um transgene) se refere ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de ácido nucleico transcricional (incluindo, por exemplo, cDNA ou DNA genômico) é convertida para uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão genética pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, de um tecido, ou de um organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão genética. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer lugar no caminho de DNA para RNA para proteína. A regulação da expressão genética ocorre, por exemplo, através de controles que agem sobre a transcrição, a translação, o transporte e o processamento de RNA, a degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através de ativação, inativação, comparti- mentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas depois de terem sido produzidas, ou por combinações dos mesmos. A expressão genética pode ser medida no nível do RNA ou no nível da proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, northern (RNA) blot, RT-PCR, western (imuno-) blot, ou en-saio(s) in vitro, in situ, ou in vivo da atividade de proteínas.

[0094] Material genético: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "material genético" inclui todos os genes e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.

[0095] Praga de hemípteros: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "praga de hemípteros" se refere a insetos da família Pentatomidae, os quais se alimentam sobre uma ampla gama de plantas hospedeiras e têm partes de boca de perfuração e de sucção. Em exemplos particulares, uma praga de hemípteros é selecionada entre a lista que compreende, Euschistus heros (Fabr.) (percevejo marrom neotropical (Neotropical Brown Stink Bug), “BSB”), Nezara viridula (L.) (percevejo verde do sul (Southern Green Stink Bug)), Pie-zodorus guildinii (Westwood) (percevejo de faixa vermelha (Red-banded Stink Bug)), Halyomorpha halys (Stàl) (percevejo marmorado marrom (Brown Marmorated Stink Bug)), Chinavia hilare (Say) (percevejo verde (Green Stink Bug)), Euschistus servus (Say) (percevejo marrom (Brown Stink Bug)), Dichelops melacanthus (Dallas), Diche-lops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (percevejo vermelho neotropical (Neotropical Red Shouldered Stink Bug)), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (bicho do algodão (Cotton Bug)), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (besouro da folha manchada ocidental (Western Tarnished Plant Bug)), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).

[0096] Inibição: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "inibição", quando usado para descrever um efeito sobre uma sequência codificante (por exemplo, um gene), se refere a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir da sequência codificante e/ou do peptíeo, do polipeptídeo, ou do produto de proteína da sequência codificante. Em alguns exemplos, a expressão de uma sequência codificante pode ser inibida de tal modo que expressão é aproximadamente eliminada. "Inibição específica" se refere à inibição de uma sequência codificante alvo sem afetar consequentemente a expressão de outras sequências codificantes (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada.

[0097] Inseto: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, com respeito a pragas, o termo “praga de insetos” especificamente inclui pragas de insetos coleópteros. Em alguns exemplos, o termo “praga de insetos” especificamente se refere a uma praga de coleópteros no gênero Diabrotica selecionada entre uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar. Em algumas modalidades, o termo também inclui algumas outras pragas de insetos; por exemplo, pragas de insetos hemípteros.

[0098] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou uma proteína) foi substancialmente separado, produzido além de, ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (isto é, DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos diversos, e proteínas). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que tenham sido "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação de rotina. O termo também engloba ácidos nu-cleicos e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas, e peptídeos quimicamente sintetizados.

[0099] Molécula de ácido nucleico: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “molécula de ácido nucleico” também se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos, a qual pode incluir tanto filamentos de senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genô-mico, e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotí-deo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de um ou outro tipo de nucleotídeo. Uma “molécula de ácido nucleico” conforme usado aqui, neste pedido de patente, é sinônima com “ácido nucleico” e “polinucleotídeo.” Uma molécula de ácido nucleico de modo geral tem no mínimo 10 bases de comprimento, a menos que especificado de modo diverso. Por convenção, a sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' para a extremidade 3' da molécula. O “complemento” de uma sequência de nucleotídeos se refere à sequência, de 5' para 3', cujas nucleobases formam pares de bases com as nucleobases da sequência de nucleotídeos (isto é, A-T/U, e G-C). O “complemento reverso” de uma sequência de ácido nucleico se refere à sequência, de 3' para 5', cujas nucleobases formam pares de bases com as nucleobases da sequência de nucleotídeos.

[00100] Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos compreendendo um modelo de DNA que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação de 5’ para 3’, de tal modo que a RNA polimerase (a qual transcreve o DNA na direção de 5’ para 3’) vai transcrever um ácido nucleico a partir do complemento que pode hibri-dizar à molécula de mRNA. A menos que explicitamente declarado de modo diverso, ou que seja evidente que seja de modo diverso a partir do contexto, o termo “complemento” portanto se refere a um polinucle-otídeo que tem nucleobases, de 5’ para 3’, que podem formar pares de bases com s nucleobases de um referência ácido nucleico. De modo similar, a menos que seja explicitamente declarado que seja de modo diverso (ou que seja evidente que seja de modo diverso a partir do contexto), o "complemento reverso" de um ácido nucleico se refere ao complemento em orientação reversa. O precedente é demonstrado na seguinte ilustração: ATGATGATG polinucleotídeo TACTACTAC “complemento” do polinucleotídeo CATCATCAT “complemento reverso” do polinucleotídeo Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi formadoras de RNA de hairpin. Nestas moléculas de RNAi, tanto o complemento de um ácido nucleico a ser visado por interferência de RNA quanto o complemento reverso podem ser encontrados na mesma molécula, de tal modo que a molécula de RNA de filamento único pode “dobrar” e hibridizar a si mesmo sobre a região que compreende os polinucleotídeos complementares e complementares reversos.

[00101] "Moléculas de ácido nucleico" incluem formas de DNA de filamento único e de filamento duplo; formsa de RNA de filamento único; e formas de RNA de filamento duplo (dsRNA). O termo "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de ácido nucleico" se refere tanto aos filamentos de senso quanto antissenso de um ácido nucleico como ou filamentos únicos individuais ou no duplex. O termo "ácido ribonuclei-co" (RNA) é inclusivo de iRNA (RNA inibidor), dsRNA (RNA de filamento duplo), siRNA (pequeno RNA interferente), mRNA (RNA mensageiro), shRNA (pequeno RNA de hairpin), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA de hairpin), tRNA (RNA de transferência, quer carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido desoxirribonucleico" (DNA) é inclusivo de cDNA, DNA genômico, e híbridos de DNA-RNA. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" e "fragmentos" dos mesmos, ou de modo mais geral "segmento", será entendido na técnica como um termo funcional que inclui tanto sequências genômicas, sequências de RNA ribossômico, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon, e menores sequências de nucleotídeos manipuladas que codificam ou podem ser adaptadas para codificar, peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas.

[00102] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Oligonucleotídeos podem ser formados por cliva-gem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por polimeriza-ção de precursores de nucleotídeos individuais. Sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas bases de comprimento. Como os oligonucleotídeos podem ligar a uma sequência de nucleotídeos complementar, podem ser usados como sondas para detecção de DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA e RNA (transcritas reversas em um cDNA). Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador", o qual permite que uma DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique o filamento complementar.

[00103] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um ou ambos os nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeos que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeos não naturais ou derivadas, conforme será prontamente reconhecido pelas pessoas versadas na técnica. As modificações referidas incluem, por exemplo, etiquetas, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeos (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; que-ladores; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nu-cleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, de filamento duplo, parcialmente duplexadas, triplexadas, de hairpin, circulares, e trancadas (padlocked).

[00104] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, com respeito a DNA, o termo "sequência codificante", "sequência de nucleotídeos estrutural", ou "molécula de ácido nucleico estrutural" se refere a uma sequência de nucleotídeos que é em última análise traduzida para um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Com respeito a RNA, o termo "polinucleotídeo codificante" se refere a um polinucleotídeo que é traduzido para um peptídeo, um polipeptídeo, ou uma proteína. Os limiares de uma sequência codificante são determinados por um codon de partida de translação no 5'-término e um codon de parada de translação no 3'-término. Polinucleotídeos codificantes incluem, mas não estão limitados a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeos recombinantes.

[00105] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "polinucleo-tídeo não codificante transcrito" se refere a segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR e segmentos de íntrons que não são traduzidos em um peptídeo, em um polipeptídeo, ou em uma proteína. Além disso, "polinucleotídeo não codificante transcrito" se refere a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) conforme exemplificado por 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, e 28S rRNA, e semelhantes); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5, U6, e semelhantes. Poli-nucleotídeos não codificantes transcritos também incluem, por exemplo e sem limitação, RNAs pequenos (sRNA), cujo termo é frequentemente usado para descreve pequenos RNAs não codificantes bacteri-anos; pequenos RNAs nucleolares (snoRNA); microRNAs (miRNA); pequenos RNAs interferentes (siRNA); RNAs de de interação com Piwi (piRNA); e longos RNAs não codificantes. Ainda adicionalmente, "poli-nucleotídeo não codificante transcrito" se refere a um polinucleotídeo que pode existir nativamente como um "encadeador" intragênico em um ácido nucleico e o qual é transcrito em uma molécula de RNA.

[00106] Interferência de RNA letal: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “interferência de RNA letal” se refere a interferência de RNA que resulta em morte ou em uma redução da viabilidade do indivíduo em questão ao qual, por exemplo, um dsRNA, um miRNA, um siRNA, um shRNA, e/ou um hpRNA é liberado.

[00107] Genoma: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "genoma" se refere a DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e também se refere a organela de DNA encontrada dentro de componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida dentro de uma célula de planta de tal modo que a molécula de DNA é integrada dentro do genoma da célula da planta. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou integrada no DNA nuclear da célula da planta, ou integrada no DNA do cloro-plasto ou da mitocôndria da célula da planta. O termo "genoma" conforme se aplica a bactérias se refere tanto ao cromossoma quanto aos plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de tal modo que a molécula de DNA é integrada dentro do genoma da bactéria. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou integrada cromossomicamente ou localizada como ou em um plasmídeo estável.

[00108] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", conforme usado aqui, neste pedido de patente, no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou de polipeptídeos, se refere aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhadas para máxima correspondência durante uma janela de comparação especificada.

[00109] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "percentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado comparando duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de polipeptí-deos) sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, intervalos) em comparação com a sequência de referência (a qual não compreende adições ou eliminações) para ótimo alinhamento das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais o nucleotídeo ou resíduo ami-noácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em toda posição em comparação com uma sequência de referência é considerada como sendo 100% idêntica à sequência de referência, e vice-versa.

[00110] Métodos para alinhamento de sequências para comparação são de conhecimento geral na técnica. Vários programos e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo: em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homolo-gia pode ser encontrada, por exemplo, em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.

[00111] A ferramenta BLAST™ do (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1990)) do NCBI (National Center for Biotechnology Information) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o próprio National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na internet sob a seção "help" for BLAST™. Para comparaçãos de sequências de ácido nu-cleico, a função "Blast 2 sequences" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando a matriz BLOSUM62 default ajustada para parâmetros default. Sequências de ácido nucleico com mesmo maior similaridade com as sequências de referência vão apresentar percentagem de identidade crescente quando avaliadas por este método.

[00112] Especificamente hibridizável / Especificamente complementar: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os termos "Especificamente hibridizável" e "Especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade de tal modo que ocorre ligação estável e específica entre a molécula de ácido nu-cleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. Hibridização entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento anti-paralelo entre as sequências de ácido nucleico das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes sobre o filamento oposto para formar uma molécula duplex que, se for suficientemente estável, é detectável usando métodos de conhecimento geral na técnica. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para a hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.

[00113] As condições de hibridização resultantes em graus particulares de rigor vão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e do comprimento das sequências de ácido nucleico hibridizantes. De modo geral, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) da hibridização vão determinar o rigor da hibridização. A força iônica do tampão de lavagem e a temperatura de lavagem também influenciam o rigor. Os cálculos referentes às condições de hibridização requeridas para atingir graus particulares de rigor são de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11, e atualizações; e Ha-mes e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções detalhadas adicionais e orientação com respeito à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995, e atualizações.

[00114] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "condições rigorosas" engloba condições sob as quais vai ocorrer hibridização somente se houver mais de 80% de correspondência de sequência entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico alvo. "Condições rigorosas" incluem níveis particulares de rigor adicionais. Deste modo, conforme usado aqui, neste pedido de patente, condições de "moderado rigor" são as condições sob as quais moléculas com mais de 80% de correspondência de sequência (isto é, tendo menos de 20% de não correspondência) vão hibridizar; condições de "alto rigor" são a quelas sob as quais sequências com mais de 90% de correspondência (isto é, tendo menos de 10% de não correspondência) vão hibridizar; e condições de "rigor muito elevado" são aquelas sob as quais sequências com mais de 95% de correspondência (isto é, tendo menos de 5% de não correspondência) vão hibridizar.

[00115] A seguir estão condições de hibridização não limitantes típicas.

[00116] Condição de alto rigor (detecta sequências que partilham no mínimo 90% de identidade de sequência): Hibridização em 5x tampão SSC a 65°3 por 16 horas; lavagem por duas vezes em 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavagem por duas vezes em 0,5x tampão SSC a 65°C por 20 minutos cada.

[00117] Condição de moderado rigor (detecta sequências que partilham no mínimo 80% de identidade de sequência): Hibridização em 5x a 6x tampão SSC a 65 a 70°C por 16 a 20 horas; lavagem por duas vezes em 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada; e lavagem por duas vezes em 1x tampão SSC a 55 a 70°C por 30 minutos cada.

[00118] Condição de controle não rigorosa (sequências que partilham no mínimo 50% de identidade de sequência vão hibridizar): Hi-bridização em 6x tampão SSC em temperatura ambiente até 55°C por 16 a 20 horas; lavagem por no mínimo duas vezes em 2x a 3x tampão SSC em temperatura ambiente até 55°C por 20 a 30 mi nutos cada.

[00119] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "substancialmente homólogo" ou "substancial homologia", com respeito a uma sequência de ácido nucleico contígua, se refere a sequências de nucleotídeos contíguas que são transportadas por moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições rigorosas a uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico que têm sequências que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácido nucleico de referência de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 80 são as moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições rigorosas (por exemplo, as condições de Moderado rigor estipuladas, acima) ao ácido nucleico de referência. Sequências substancialmente homólogas podem ter no mínimo 80% de identidade de sequência. Por exemplo, polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter a partir de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tais como 79%; 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94%; cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98.5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de substancial homologia é intimamente relacionada com hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de áci- do nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade de modo a evitar ligação inespecífica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições onde se deseja ligação específica, por exemplo, sob condições rigorosas de hibridiza-ção.

[00120] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "or-tólogo" se refere a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu a partir de uma sequência de nucleotídeos ancestral comum, e pode conservar a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00121] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, diz-se que duas moléculas de sequências de ácido nucleico apresentam "completa complementaridaade" quando todo nucleotídeo de uma sequência lida na direção de 5' para 3' é complementar a todo nucleotídeo da outra sequência quando liga na direção de 3' para 5'. Uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de referência vai apresentar uma sequência idêntica à sequência de complemento reverso da sequência de nucleotídeos de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente entendidos por aqueles com conhecimento regular na técnica.

[00122] Operacionalmente ligada: Uma primeira sequência de nu-cleotídeos é operacionalmente ligada com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Quando produzido de modo recombinante, sequências de ácido nu-cleico ligadas operacionalmente são geralmente contíguas, e, caso necessário, duas regiões codificantes de proteínas podem ser unidas no mesmo frame de leitura (por exemplo, em um ORF translacional-mente fundido). No entanto, os ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para serem ligados operacionalmente.

[00123] O termo, "ligada operacionalmente ", quando usado em re- ferência a uma sequência reguladora e uma sequência codificante, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência codificante ligada. "Sequências reguladoras", ou "elementos de controle", se referem a sequências de nucleotídeos que influenciam o momento e o nível / a quantidade de transcrição, o processamento ou a estabilidade de RNA, ou a translação da sequência codificante associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de translação; íntrons; reforçadores; estruturas de stem-loop; sequências de ligação de repressor; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência codificante ligada operacionalmente a estas. Além disso, sequências reguladoras particularas ligadas operacionalmente a uma sequência codificante podem estar localizadas sobre o filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.

[00124] Promotor: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "promotor" se refere a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição, e que pode estar envolvidas no reconhecimento e na ligação da RNA polimerase e de outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser ligado operacionalmente a uma sequência codificante para expressão em uma célula, ou um promotor pode ser ligado operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de sinal a qual pode ser ligada operacionalmente a uma sequência codificante para expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de plantas. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em determinados tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídas, ou escle- rênquima. Os promotores referidos são referidos como "tecido-prefe-rencial". Promotores os quais iniciam a transcrição somente em determinados tecidos são referidos como "tecido-específicos". Um promotor "tipo celular-específico" essencialmente aciona a expressão em determinados tipos celulares em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ou nas folhas. Um promotor "indutível" pode ser um promotor o qual pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores tecido-específicos, tecido-preferenciais, tipo celular específicos, e induíveis constituem a classe de promotores "não constitutivo". Um promotor "constitutivo" é um promotor o qual pode estar ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecidos ou células.

[00125] Qualquer promotor indutível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Vide Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor indutível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Exemplos de promotores in-dutíveis incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que responda a cobre; gene In2 do milho que responde a fitopro-tetores de herbicidas de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor indutível de um gene de hormônios esteróides, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glicocorticoste-róide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1042110425).

[00126] Exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados a: Promotores de vírus de plantas, tais como o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV); promotores de genes da actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; e o promotor ALS, fragmento Xba1/NcoI 5' para o gene estrutural de Brassica napus ALS3 (ou uma sequência de nucleotídeos similar ao fragmento Xba1/NcoI referido) (Patente U.S. No. US 5.659.026).

[00127] Adicionalmente, qualquer promotor tecido-específico ou te-cido-preferencial pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificante ligada operacionalmente a um promotor tecido-específico pode produzir o produto da sequência codificante exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico. Exemplos de promotores tecido-específicos ou preferenciais para tecidos incluem, mas não estão limitados a: Um promotor preferencial para sementes, tal como o do gene de faseolina; um promotor de folha-específico e induzido pela luz tal como o de cab ou rubisco; um promotor antera-específica tal como o de LAT52; um promotor pólen-específico tal como o de Zm13; e um promotor preferencial para mi-crosporo tal como o de apg.

[00128] Planta de soja: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "planta de soja" se refere a uma planta da espécie Glycine; por exemplo, Glycine max.

[00129] Transformação: Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "transformação" ou "transdução" se refere à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico em uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzi-da na célula quando a molécula de ácido nucleico se torna replicada de modo estável pela célula, quer por incorporação da molécula de ácido nucleico dentro do genoma celular, ou por replicação epissômi-ca. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "transformação" engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida dentro de uma célula semelhante. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com veto- res virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417); microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-585); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807); captação direta de DNA; e bombardeamento de microprojéteis (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00130] Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um ou ambos os filamentos de uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de ácido nucleico antisense, em que a expressão da sequência de ácido nucleico antisense inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Em ainda exemplos adicoinais, um transgene pode ser uma sequência genética (por exemplo, um gene de tolerância a herbicida), um gene codificando um composto útil industrialmente ou farmaceuticamente, ou um gene codificando um traço agricola desejável. Nestes e em outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras ligadas operacionalmente a uma sequência codificante do transgene (por exemplo, um promotor).

[00131] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico conforme introduzida em uma célula, por exemplo, de modo a produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem que replique na célula hospedeira, tais como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; um cosmídeo; um bacteriófago; ou vírus que carrega DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode ser uma molécula de RNA. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, se- quências antissenso, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, desse modo fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para ajudar a realizar a entrada da molécula de ácido nucleico dentro da célula (por exemplo, um lipossoma, um revestimento de proteína, etc.).

[00132] Produção: Uma produção estabilizada de cerca de 100% ou mais em relação à produção de variedades de verificações na mesma localização de crescimento crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, "produção aprimorada" ou "aprimoramento da produção" significa um cultivar que tem uma produção estabilizada de 105% a 115% ou mais em relação à produção de variedades de verificações na mesma localização de crescimento contendo densidades significativas de pragas de coleóp-teros e/ou hemípteros que são prejudiciais para a colheita crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições.

[00133] A menos que especificamente indicado ou implícito, os termos "um", "uma", e "o", "a" significam "no mínimo um" conforme usado aqui, neste pedido de patente.

[00134] A menos que especificamente explicado de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles com conhecimento ordinário na técnica à qual pertence esta invenção. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnol-ogy: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as percentagens são por peso e todas as proporções de misturas de solventes são por volume a menos que mencionado de modo diverso. Todas as temperaturas são em graus Celsius. IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Sequência de Praga de Coleópteros e/ou de Hemípteros A. Visão geral [00135] São descritas aqui, neste pedido de patente, moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Em alguns exemplos, a praga de insetos é uma praga de insetos coleópteros (por exemplo, espécies do gênero Diabrotica) ou hemípteros (por exemplo, espécies do gênero Euschistus). Moléculas de ácido nucleico descritas incluem sequências alvo (por exemplo, genes nativos, e sequências não codificantes), dsRNAs, siRNAs, hpR-NAs, shRNA, e miRNAs. Por exemplo, são descritas moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a toda ou parte de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, a uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas podem ser um ou mais genes alvo, cujo produto pode estar, por exemplo e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido no desenvolvimento larval. As moléculas de ácido nucleico descritas aqui, neste pedido de patente, quando introduzidas em uma célula compreendendo no mínimo uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas às quais as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão da uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas. Em alguns exemplos, a redução ou a eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência especificamente complementare a esta pode ser letal em pragas de coleópteros e/ou hemípteros, ou resultar em redução do crescimento, do desenvolvimento, e/ou da alimentação.

[00136] Em algumas modalidades, no mínimo um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo wupA. Em alguns exemplos, é selecionado um gene alvo em uma praga de coleópteros, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo selecionado de entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 79. Em exemplos particulares, um gene alvo em uma praga de coleópteros no gênero Diabrotica é selecionado, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo selecionado de entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 7 a 12. Em alguns exemplos, um gene alvo em uma praga de hemípteros é selecionado, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo selecionado de entre SEQ ID NOs: 79 e 81 a 83.

[00137] Em algumas modalidades, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido reverso in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua que é no mínimo cerca de 85% idêntica (por exemplo, no mínimo 84%, 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica) à sequência de aminoácidos de um produto de proteína de wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79). Um gene alvo pode ser qualquer polinucleotídeo wupA em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, cuja inibição pós-transcricional tem um efeito prejudicial sobre a praga de coleópteros e/ou hemípteros, ou proporciona um efeito protetor contra a praga de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta. Em exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucleico compre- endendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido reverso in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua que é no mínimo cerca de 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79.

[00138] São proporcionadas de acordo com a invenção sequências de nucleotídeos, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma sequência codificante em uma praga de coleóp-teros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, depois de ingestão da molécula de RNA expressada por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, pode ser obtida a hipo-regulação da sequência codificante em células da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, a hipo-regulação da sequência codificante em células da praga de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar em um efeito prejudicial sobre o crescimento, a viabilidade, a proliferação, e/ou a alimentação da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00139] Em algumas modalidades, sequências alvo incluem sequências de RNA não codificante transcritas, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; sequências lider emendadas; sequências de íntron; sequências de outron (por exemplo, RNA 5'UTR modificado subsequentemente em emenda trans (trans splicing)); sequências de donatron (por exemplo, RNA não codificante requerido para proporcionar sequências doadoras para emenda trans); e outro RNA transcrito não codificante de genes de pragas de coleópteros e/ou hemípteros alvo. As sequências referidas podem ser derivadas tanto a partir de genes mono-cistrônicos quanto poli- cistrônicos.

[00140] Deste modo, também são descritas aqui, neste pedido de patente, em conexão com algumas modalidades, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs e hpRNAs) que compreendem no mínimo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades uma molécula de iRNA pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeos que são complementares a toda ou parte de uma pluralidade de sequências alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sequências alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tais como uma planta ou por uma bactéria. Também são reveladas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Também são descritos construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos de hospedeiros particulares. Alvos de hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA dos construtos de DNA recombinante. Portanto, também é descrito um vetor de transformação de planta compreendendo no mínimo uma sequência de nucleotídeos ligado operacionalmente a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, em que a expressão da uma ou mais sequências de nucleotídeos resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00141] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros podem incluir: toda ou parte de uma sequência de ácido nucleico nativa isolada a partir de Diabrotica ou um hemíptero compreendendo wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79); sequências de nucleotídeos que quando expressadas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs e hpRNAs) que compreendem no mínimo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79); sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79); e construtos de DNA recombinante para uso na realização de transformação estável de alvos de hospedeiros particulares, em que um alvo de hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico precedentes. B. Moléculas de ácido nucleico [00142] A presente invenção proporciona, entre outros, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que inibem a expressão genética alvo em uma célula, em um tecido, ou em um órgão de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros; e moléculas de DNA capazes de serem expressadas como uma molécula de iRNA em uma célula ou em um micro-organismo para inibir a expressão genética alvo em uma célula, em um tecido, ou em um órgão de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00143] Algumas modalidades da invenção proporcionam uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende no mínimo uma (por exemplo, uma, dois, três, ou mais) ou mais sequências de nucleotí-deos selecionadas entre o grupo que consiste em : SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 79; o complemento de SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos (por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos contíguos) de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; uma sequência codi-ficante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero (por exemplo, WCR e BSB) compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; uma sequência não codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de coleóptero ou de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79. Em modalidades particulares, o contato com ou a captação por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, o desenvolvimento, a reprodução e/ou a alimentação da praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00144] Em modalidades particulares, o contato com ou a captação poar uma praga de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) de um iRNA transcrito a partir do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, o desenvolvimento, e/ou a alimentação da praga. Em algumas modalidades, ocorre o contato com ou a captação pelo inseto através de alimentação sobre o material da planta compreendendo o iRNA. Em algumas modalidades, ocorre o contato com ou a captação pelo inseto através de pulverização de uma planta compreendendo o inseto com uma composição que compreende o iRNA.

[00145] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender no mínimo um ou mais (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeos selecionados entre o grupo que consiste em : SEQ ID NO: 89; o complemento de SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; o complemento de SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; o complemento de SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 98; o complemento de SEQ ID NO: 98; um fragmento de no mínimo 15 nucleotí-deos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 92 a 97 e 99 a 101; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 92 a 97 e 99 a 101; um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 92 a 97; o complemento de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 92 a 97; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 92 a 97; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 92 a 97; um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 99 a 101; o complemento de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de hemíptero compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 99 a 101; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de hemíptero compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 99 a 101; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo de hemíptero compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 99 a 101.

[00146] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender no mínimo uma (por exemplo, uma, dois, três, ou mais) ou mais sequências de DNA capazes de serem expressadas como uma molécula de iRNA em uma célula ou em um micro-organismo para inibir a expressão genética alvo em uma célula, em um tecido, ou em um órgão de uma praga de coleópteros e/ou he-mípteros. Uma ou mais as referidas sequências de DNA podem ser ligadas operacionalmente a uma sequência de promotor que funciona em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou reforçar a transcrição do RNA codificado capaz de formar uma ou mais moléculas de dsRNA. Em uma modalidade, a no mínimo uma (por exemplo, uma, dois, três, ou mais) ou mais sequências de DNA podem ser derivadas a partir de um ou mais polinucleotídeos selecionados entre o grupo que consiste em : SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 79. Derivados de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79 incluem fragmentos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, um fragmento semelhante pode compreender, por exemplo, no mínimo cerca de 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, ou um complemento do mesmo. Deste modo, um fragmento semelhante pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, ou um complemento do mesmo. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, um fragmento semelhante pode compreender, por exemplo, mais de cerca de 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, ou um complemento do mesmo. Deste modo, um fragmento de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79 may comprise, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, cerca de 25,(por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), cerca de 30, cerca de 40, (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 79, ou um complemento do mesmo.

[00147] Algumas modalidades compreendem a introdução de moléculas de dsRNA parcialmente ou totalmente estabilizadas em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de modo a inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, em um tecido, ou em um órgão da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Quando expressadas como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpR-NA) e absorvidas por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, as sequências de ácido nucleico compreendendo um ou mais fragmentos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79 podem provocar um ou mais entre morte, inibição do crescimento, mudança na proporção do sexo, redução no tamanho da ninhada, cessação de infecção, e/ou cessação de alimentação por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, em algumas modalidades, é proporcionada uma molécula de dsRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos incluindo cerca de 15 até cerca de 300 ou cerca de 19 até cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogas a uma sequência de gene alvo de praga de coleópteros e/ou hemípteros e compreendendo um ou mais fragmentos de uma sequência de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79. A expressão de uma molécula de dsRNA semelhante pode levar, por exemplo, a mortalidade e/ou inibição do crescimento em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que absorve a molécula de dsRNA.

[00148] Em determinadas modalidades, as moléculas de dsRNA proporcionadas pela invenção compreendem sequências de nucleotí-deos complementares a um gene alvo compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79 e/ou sequências de nucleotídeos complementarer a um fragmento de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, cuja inibição do gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros resulta na redução ou na remoção de um agente de proteína ou de sequência de nucleotídeos que é essencial para o crescimento, o desenvolvimento, ou outra função biológica da praga de coleópteros e/ou hemípteros. Uma sequência de nucleotídeos selecionada pode exibir a partir de cerca de 80% até cerca de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeos estipulada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, ou o complemento de qualquer um dos precedentes. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos selecionada pode exibir cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94%; cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98.5%; cerca de 99%; cerca de 99.5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeos estipulada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, ou o complemento de um ou outro dos precedentes.

[00149] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressada como uma molécula de iRNA em uma célula ou em um micro-organismo para inibir a expressão genética alvo pode compreender uma única sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência de ácido nucleico nativa encontrada em uma ou mais espécies de praga de coleópteros e/ou hemípteros, ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera de uma pluralidade de semelhantes sequências especificamente complementares.

[00150] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda sequência de nucleo-tídeos separada por uma "sequência de espaçador". Uma sequência de espaçador pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação estrutura secundária entre a primeira e a segunda sequência de nucleotídeos, onde isto é desejado. Em uma modalidade, a sequência de espaçador é parte de uma sequência codificante de senso ou antissenso para mRNA. A sequência de espaçador alternativamente pode compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou homólogos dosmesmos que sejam capazes de serem ligados de modo covalente a uma molécula de ácido nu-cleico.

[00151] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma sequência de nucleotídeos codificando para uma ou mais moléculas de RNA diferentes, em que cada uma das diferentes moléculas de RNA compreende uma primeira sequência de nucleotídeos e uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são complementares uma à outra. a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos podem ser conectadas dentro de uma molécula de RNA por uma sequência de espaçador. A sequência de espaçador pode constituir parte da primeira sequência de nucleotídeos ou da segunda sequência de nucleotídeos. Expressão de uma molécula de RNA com- preendendo a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos pode levar à formação de uma molécula de dsRNA da presente invenção, por pareamento de bases específico da primeira e segunda sequências de nucleotídeos. A primeira sequência de nucleotídeos ou a segunda sequência de nucleotídeos pode ser substancialmente idêntica a uma sequência de ácido nucleico nativa para uma praga de coleóp-teros e/ou hemípteros (por exemplo, um gene alvo, ou uma sequência não codificante transcrita), um derivado da mesma, ou uma sequência complementar a esta.

[00152] Moléculas de ácido nucleico dsRNA compreendem filamentos duplos de sequências de ribonucleotídeos polimerizadas, e podem incluir e modificações para ou a espinha dorsal de açúcar de fosfato ou para o nucleosídeo. Modificações na estrutura do RNA podem ser adequadas para permitir inibição específica. Em uma modalidade, moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo en-zimático ubíquo de modo que moléculas de siRNA podem ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNase III, tal como DICER em eucariotas, quer in vitro ou in vivo. Vide Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952. Enzimas DICER ou RNase III funcionalmente equivalentes clivam maiores filamentos de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cda uma das quais tem cerca de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas têm saliências de 2 a 3 nucleotídeos 3', e términos 5' fosfato e 3' hidroxila. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RNase III são desenroladas e separadas em RNA de filamento único na célula. As moléculas de siRNA em seguida hibridizam especificamente com sequências de RNA transcritas a partir de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são em seguida degradadas por um mecanismo de degradação de de RNA celular inerent. Este processo pode resultar na eficaz degradação ou remoção da sequência de RNA codificada pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento pós-transcricionaL do gene visado. Em algumas modalidades, as moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNase III endógenas a partir de moléculas de ácido nu-cleico heterólogas podem mediar de modo eficaz a hipo-regulação de genes alvo em pragas de coleópteros e/ou hemípteros.

[00153] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir no mínimo uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de filamento único capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através de hibridização intermolecular. As sequências de dsRNA referidas tipicamente automontam, e podem ser proporcionadas na fonte de nutrição de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de modo a realizar a inibição pós-transcricional de um gene alvo. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nu-cleico da invenção pode compreender duas sequências de nucleotí-deos que não ocorrem naturalmente diferentes, cada uma das quais é especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Quando uma molécula de ácido nucleico semelhante é proporcionada como uma molécula de dsRNA para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, a molécula de dsRNA inibe a expressão de no mínimo dois genes alvo diferentes na praga de coleópteros e/ou hemípteros. C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico [00154] Uma variedade de sequências nativas em pragas de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada como sequências alvo para o projeto de moléculas de ácido nucleico da invenção, tais como moléculas de iRNAs e de DNA codificando iRNAs. No entanto, a seleção de sequências nativas não é um processo direto. Somente um pequeno número de sequências nativas na praga de coleópteros e/ou hemípte-ros serão alvos eficazes. Por exemplo, não pode ser previsto com cer-tea se uma sequência nativa em particular pode ser hipo-regulada de modo eficaz por moléculas de ácido nucleico da invenção, ou se a hi-po-regulação de uma sequência particular nativa em particular vai ter um efeito prejudicial sobre o crescimento, a viabilidade, a proliferação, e/ou a reprodução da praga de coleópteros e/ou hemípteros. A vasta maioria de sequências de pragas de coleópteros e/ou hemípteros nativas, tais como ESTs isoladsa a partir das mesmas (por exemplo, conforme listado na Patente U.S. No. US 7.612.194 e na Patente U.S. No. US 7.943.819), não têm um efeito prejudicial sobre o crescimento, a viabilidade, a proliferação, e/ou a reprodução da praga de coleópteros e/ou hemípteros, tais como WCR, NCR, SCR, BSB, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacanthus, Dichelops furcatus, Edessa medita-bunda, Thyanta perditor, Chinavia marginatum, Horcias nobilellus, Ta-edia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Lep-toglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e Lygus lineola-ris.

[00155] Também não é previsível quais das sequências nativas as quais podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga de coleópteros e/ou hemípteros são capazes de serem usados em técnicas recombi-nantes para expressar moléculas de ácido nucleico complementares a semelhantes sequências nativas em uma planta hospedeira e proporcionar o efeito prejudicial sobre a praga de coleópteros e/ou hemípteros depois de alimentação sem causar prejuízo à planta hospedeira.

[00156] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico da invenção (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem proporcionadas na planta hospedeira de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros) são selecionadas para sequências alvo de cDNA que codificam proteí- nas ou partes de proteínas essenciais para a sobrevida de pragas de coleópteros e/ou hemípteros, tais como sequências de aminoácidos envolvidas em caminhos metabólicos ou catabólicos bioquímicos, na divisão celular, na reprodução, no metabolismo de energia, na digestão, no reconhecimento da planta hospedeira, e semelhantes. Conforme descrito aqui, neste pedido de patente, a ingestão das composições por um organismo alvo contendo um ou mais dsRNAs, do qual no mínimo um segmento é especificamente complementar a no mínimo um segmento de RNA substancialmente idêntico produzido nas células do organismo da praga alvo, pode resultar na morte ou em inibição diversa do alvo. Uma sequência de nucleotídeos, quer DNA ou RNA, derivada a partir de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada para construir células de plantas resistenttes a infestação pelas pragas de coleópteros e/ou hemípteros. A planta hospedeira da praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das sequências de nucleotídeos derivadas a partir da praga de coleópteros e/ou hemípteros conforme proporcionado aqui, neste pedido de patente. A sequência de nucleotídeos transformada dentro do hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que formam dentro de uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformada, deste modo tornando o dsRNA disponível se / quando a praga de coleópteros e/ou hemípteros forma uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga de coleópteros e/ou hemípteros, e em última análise em morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

[00157] Deste modo, em algumas modalidades, é visado um gene que está essencialmente envolvido no crescimento, no desenvolvimento e na reprodução de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Ou- tros genes alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, os genes alvo que têm um papel importante na viabilidade, no movimento, na migração, no crescimento, no desenvolvimento, na infectividade, no estabelecimento de sítios de alimentação e na reprodução de pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Um gene alvo portanto pode ser um gene housekeeping ou um fator de transcrição. Adicionalmente, uma sequência de nucleotídeos de praga de coleópteros e/ou hemípteros nativa para uso na presente invenção também pode ser derivada a partir de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica, e cuja sequência de nucleotídeos é especificamente hibridizável com um gene alvo no genoma da praga de coleópteros e/ou hemípteros alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nu-cleotídeos conhecida por hibridização são de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica.

[00158] Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para obter uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA). Uma modalidade semelhante compreende: (a) análise de um ou mais genes alvo para sua expressão, função, e fenótipo depois de supressão genética mediada por dsRNA em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros; (b) sondagem de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo toda ou uma porção de uma sequência de nucleotídeos ou um homólogo da mesma de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros alvo que apresenta um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificação de um clone de DNA que hibridi-za especificamente com a sonda; (d) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciamento do fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende toda ou uma porção substancial da sequência de RNA ou um homólogo da mesma; e (f) sintetizando quimicamente toda ou uma porção substancial de uma sequência genética, ou um siRNA ou miRNA ou shRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00159] Em modalidades adicionais, um método para obter um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleo-tídeos para produzir uma porção substancial de uma molécula de iR-NA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) inclui: (a) síntese de primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo especificamente complementares a uma porção de uma sequência de nucle-otídeos nativa de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros alvo; e (b) amplificação de um inserto de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando o primeiro e o segundo iniciadores de oligo-nucleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA ou shRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00160] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser isolados, amplificados, ou produzidos por uma série de abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) pode ser obtida por amplificação por PCR de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, um gene alvo ou uma sequência não codificante transcrita alvo) derivada a partir de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou porções da mesma. DNA ou RNA pode ser extraído a partir de um organismo alvo, e bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir do mesmo usando métodos de conhecimento geral daqueles ordinariamente versados na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA gerada a partir de um organismo alvo podem ser usadas para amplificação por PCR e sequenciamento de genes alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser usado como um modelo para transcrição in vitro para gerar RNA de senso e antissenso com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer uma de uma série de técnicas (Vide, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 54195423), incluindo o uso de um sintetizador de DNA automatizado (por exemplo, um sintetizador P. E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) modelo 392 ou 394 DNA/RNA Synthesizer), usando químicas de rotina, tais como química de fosforamidita. Vide, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; vide a Patente U.S.Nos. 4.415.732, 4.458.066, 4.725.677, 4.973.679, e 4.980.460. Também podem ser empregadas químicas alternativas resultando em grupos de espinha dorsal não natural, tais como fosforotioato, fosforamidato, e semelhantes.

[00161] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por uma pessoa versada na técnica através de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA. RNA também pode ser produzido por síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou por uma RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, T3 RNA polimerase, T7 RNA polimerase, e SP6 RNA polimerase). Construtos de expressão úteis para a clonagem e a expressão de sequências de nucleotídeos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.593.874, 5.693.512, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214, e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes de introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura por extração com um solvente ou com uma resina, por precipitação, por eletroforese, por cromatografia, ou por uma combinação das mesmas. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser usadas com nenhuma ou um mínimo de purificação, por exemplo, de modo a evitar perdas devido ao processamento das amostras. As moléculas de RNA podem ser secadas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover recozimento, e/ou estabilização de filamentos duplex de moléculas de dsRNA.

[00162] Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por um único filamento de RNA auto-complementar ou de dois filamentos de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas quer in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição do um ou dos dois filamentos de RNA in vivo, ou RNA polimerase clonada pode ser usada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser direcionada pelo hospedeiro por transcrição específica em um órgão, em um tecido, ou um tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor de específico específico); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor indutível que é responsivo a infecção, stress, temperatura, e/ou indutores químicos); e/ou engenharia de transcrição em um estágio de desenvolvimento ou em uma idade do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico de um estágio do desenvolvimento). Filamentos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, quer transcritos in vitro ou in vivo, podem ser ou não poliadenilados, e podem ser ou não capazes de serem traduzidos em um polipeptídeo por um aparelho translacional da célula. D. Vetores Recombinantes e Transformação de Células Hospedeiras [00163] Em algumas modalidades, a invenção também proporciona uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou uma célula de planta), em que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucle-otídeos que, depois de expressão para RNA e ingestão por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, obtém a supressão de um gene alvo em uma célula, em um tecido, ou em um órgão da praga de coleópte-ros e/ou hemípteros. Deste modo, algumas modalidades proporcionam uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de ser expressada como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) em uma célula de planta para inibir a expressão genética alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. De modo a iniciar ou reforçar a expressão, as moléculas de ácido nucleico recombinantes referidas podem compreender uma ou mais sequências reguladoras, cujas sequências reguladoras podem ser ligadas operacionalmente à sequência de ácido nucleico capaz de ser expressada como um iRNA. Os métodos para a expressão de uma molécula de supressão genética em plantas são conhecidos, e podem ser usados para expressar uma sequência de nucleotídeos da presente invenção. Vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO06/073727; e a Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2006/0200878 A1).

[00164] Em modalidades específicas, uma molécula de DNA re-combinante da invenção pode compreender uma sequência de ácido nucleico codificando uma molécula de dsRNA. As moléculas de DNA recombinantes referidas podem codificar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de um ou mais genes alvo endógenos em uma célua de praga de coleópteros e/ou hemípteros depois da ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser proporcionada em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura de grampo (hairpin) e haste (stem) e alça (loop).

[00165] Nestas modalidades e em modalidades adicionais, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado por transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeos a qual é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeos consistindo de SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1,3, ou 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência co-dificante nativa de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, 3, ou 5; um fragmento de no mínimo 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO: 1, 3, ou 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1, 3, ou 5; um fragmento de no mínimo 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codifican-te nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, 3, ou 5; e o complemento de um fragmento de no mínimo 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1,3, ou 5.

[00166] Em algumas modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado por transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeos a qual é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeos consistindo de SEQ ID NO: 79; o complemento de SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíp-tero compreendendo SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79.

[00167] Em modalidades particulares, uma molécula de DNA codificando uma molécula de dsRNA recombinante pode compreender no mínimo dois segmentos de sequência de nucleotídeos dentro de uma sequência transcrita, as sequências referidas arranjadas de tal modo que a sequência transcrita compreende um primeiro segmento de sequência de nucleotídeos em uma orientação de senso, e um segundo segmento de sequência de nucleotídeos (compreendendo o complemento de a primeira segmento de sequência de nucleotídeos) está em uma orientação antissenso, em relação a no mínimo um promotor, em que o segmento de sequência de nucleotídeos de senso e o segmento de sequência de nucleotídeos antissenso são ligados ou conectados por um segmento de sequência de espaçador de a partir de cerca de cinco (~5) até cerca de mil (~1000) nucleotídeos.. O segmento de sequência de espaçador pode formar uma alça entre os segmentos de sequências de senso e antissenso. O segmento de sequência de nu-cleotídeos de senso ou o segmento de sequência de nucleotídeos an-tissenso podem ser substancialmente homólogos à sequência de nucleotídeos de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79) ou fragmento da mesma. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codidficar uma molécula de dsRNA sem uma sequência de espaçador. Em modalidades, uma sequência codificante de senso e uma sequência codificante antissenso podem ter comprimentos diferentes.

[00168] Polinucleotídeos identificados como twendo um efeito prejudicial sobre pragas de coleópteros e/ou hemípteros ou um efeito de proteção de plantas com respeito a pragas de coleópteros e/ou hemíp- teros podem ser prontamente incorporados em moléculas de dsRNA expressadas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, as sequências referidas podem ser expressadas como uma estrutura de hairpin com haste (stem) e alça (loop) tomando um primeiro segmento correspondent a um gene alvo sequência (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 79, e fragmentos das mesmas); ligando esta sequência a uma região de espaçador de segundo segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando isto a um terceiro segmento, em que no mínimo uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Um construto semelhante forma uma estrutura de haste (stem) e alça (loop) por pareamento de bases intramoleculares do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça (loop) forma e compreende o segundo segmento. VIde, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e a Publicação de Patente Internacional Nos. WO94/01550 e WO98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, sob a forma de uma estrutura de filamento duplo tal como uma estrutura de haste e alça (stem-loop) (por exemplo, hairpin), por meio da qual a produção de siRNA direcionada para uma sequência de praga de coleópteros e/ou hemípteros nativa é reforçada por co-expressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo sobre um cassete expressível em planta adicional, que leva a aumento da produção de siRNA, ou reduz a metilação para prevenir o silenciamento genético transcricional do promotor de hairpin de dsRNA.

[00169] Determinadas modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) de modo a obter níveis inibitórios de pragas de coleópteros e/ou hemípteros de expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode ser, por exemplo, um vetor, tal como um plasmídeo linear ou um circular fechado. O sistema vetorial pode ser um único vetor ou plas-mídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. As sequências de ácido nu-cleico da invenção podem ser, por exemplo, inseridas convenientemente em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para acionar a expressão de uma sequência codificante ligada ou de outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este fim, e a seleção do vetor apropriado vai depender essencialmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira em particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo de sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira em particular com a qual é compatível.

[00170] De modo a conferir resistência a pragas de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode ser, por exemplo, transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência de nucleotídeos que é substancialmente homóloga e especificamente hibridizável a uma sequência de nucleotídeos transcrita correspondente dentro de uma praga de co-leópteros e/ou hemípteros que pode causar dano à espécie da planta hospedeira. A praga de coleópteros e/ou hemípteros pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita nas células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, ingerindo células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Deste modo, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iR- NA dentro das pragas de coleópteros e/ou hemípteros que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros alvo pode resultar na planta ser resistente a ataque pela praga.

[00171] De modo a permitir a liberação de moléculas de iRNA para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros em uma relação nutricional com uma célula de planta que tenha sido transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, é requerida a expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula da planta. Deste modo, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeos da invenção ligada operacionalmente a uma ou mais sequências reguladoras, tais como uma sequência de promotor heterólogo que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula de planta em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressada.

[00172] Promotores adequados para uso em moléculas de ácido nucleico da invenção incluem os que são induíveis, virais, sintéticos , ou constitutivos, todos os quais são de conhecimento geral na técnica. Exemplos não limitantes descrevendo os promotores referidos incluem as Patentes U.S. Nos. 6.437.217 (o promotor RS81 do milho); 5.641.876 (o promotor da actina do arroz); 6.426.446 (o promotor RS324 do milho); 6.429.362 (o promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (o promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (o promotor 35S do CaMV); 6.433.252 (o promotor da L3 oleosina do milho); 6.429.357 (o promotor da actina 2 do arroz, e o íntron da actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores indu-tíveis leves); 6.140.078 (promotores indutíveis do sal); 6.252.138 (promotores indutíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores indutíveis por deficiência de fósforo ); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor de gama-coixina); e a Publicação de Patente U.S. No. 2009/757.089 (o promotor da cloroplasto aldolase do milho). Promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-5749) e os promotores da octopina sintase (OCS) (os quais são carregados sobre plasmídeos de indução tumoral de Agrobacterium tumefaciens); os promotores do caulimovírus tais como o promotor do 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324); o promotor 35S do CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148); o promotor do complexo genético R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183); o promotor do gene de proteína de ligação de clorofila a/b; CaMV 35S (Patentes U.S. Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV 35S (Patente U.S. Nos. 5.378.619 e 6.051.753); um promotor PC1SV (Patente U.S. No. US 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. No. US 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (GenBank™ Acesso No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187).

[00173] Em modalidades particulares, as moléculas de ácido nu-cleico da invenção compreendem um promotor tecido-específico, tal como um promotor específico para raízes. Os promotores específicos para raízes acionam a expressão de sequências codificantes ligadas operacionalmente exclusivamente ou preferencialmente em tecido das raízes. Exemplos de promotores específicos para raízes são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, a Patente U.S. Nos. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalida- des, uma sequência de nucleotídeos ou fragmento para o controle de pragas de coleópteros de acordo com a invenção pode ser clonada entre dois promotores específicos para raízes orientados em direções transcricionais opostas em relação à sequência de nucleotídeos ou ao fragmento, e os quais são operáveis em uma célula de planta transgê-nica e expressados na mesma de modo a produzir moléculas de RNA na célula de planta transgênica que subsequentemente pode formar moléculas de dsRNA, conforme descrito acima. As moléculas de iRNA expressadas em tecidos das plantas podem ser ingeridas por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de modo a que a supressão da expressão genética alvo seja realizada.

[00174] Sequências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmente ligadas operacionalmente a uma molécula de ácido nucleico de interesse incluem 5'UTRs que funcionam como uma sequência lider de translação localizada entre uma sequência de promotor e uma sequência codificante. A sequência lider de translação está presente no mRNA totalmente processado, e pode afetar o processamento do transcripto primário, e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líderes de translação incluem líderes de proteínas do choque térmico do milho e da petúnia (Patente U.S.No. US 5.362.865), líderes de proteínas da capa viral da planta, líderes de rubisco da planta, e outras. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. No. US 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. No. US 5.362.865); AtAnt1; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtu-nos (GenBank™ Acesso No. V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00175] Sequências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmente ligadas operacionalmente a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem sequências não traduzidas 3', regiões de terminação de transcrição 3', ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nu-cleotídeos, e incluem polinucleotídeos que proporcionam sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou o processamento do mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas provocando a adição de nucleotídeos poliadenilados ao término 3' do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada a partir de uma variedade de genes de plantas, ou a partir de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo da utilização de diferentes regiões não traduzidas 3' é proporcionado em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não li-mitantes de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank™ Acesso No. E01312).

[00176] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo no mínimo uma das sequências reguladoras descritas acima ligada operacionalmente a uma ou mais sequências de nucleotídeos da presente invenção. Quando expressadas, a uma ou mais sequências de nucleotídeos resultan em uma ou mais moléculas de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Deste modo, a uma ou mais sequências de nucleotídeos podem compreender um segmento codificando toda ou parte de uma sequência de ri-bonucleotídeos presente dentro de um transcripto de RNA da praga de coleópteros e/ou hemípteros alvo, e pode compreender repetições invertidas de todo ou uma parte de um transcripto de praga de coleópte- ros e/ou hemípteros alvo. Um vetor de transformação de planta pode conter sequências especificamente complementares a mais de uma sequência alvo, deste modo permitindo a produção de mais de um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pragas de coleópteros e/ou hemípteros alvo. Segmentos de sequência de nucleotídeos especificamente complementares a sequências de nucleotídeos presentes em diferentes genes podem ser combinados em um único composto de molécula de ácido nucleico para expressão em uma planta transgêni-ca. Os segmentos referidos podem ser contíguos ou separados por uma sequência de espaçador.

[00177] Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção já contendo no mínimo uma ou mais sequências de nucleotí-deos da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de uma ou mais sequências de nucleotídeos adicionais no mesmo plas-mídeo, em que a uma ou mais sequências de nucleotídeos adicionais são ligadas operacionalmente aos mesmos elementos reguladores que a no mínimo uma ou mais sequências de nucleotídeos originais. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser projetada para a inibição de múltiplos genes alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos a partir da mesma espécie de praga de coleópteros e/ou hemípteros, o que pode reforçar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados a partir de diferentes pragas de coleópteros e/ou hemípteros, o que pode ampliar a gama de pragas de coleópteros e/ou hemípteros contra as quais o um ou mais agentes são eficazes. Quando múltiplos genes são visados para supressão ou uma combinação de expressão e supressão, pode ser fabricado um elemento de DNA policistrônico.

[00178] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável sobre uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar para plantas ou células de plantas que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocidas, resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, Geneticin (G418), bleomicina, higromicina, etc.), ou tolerância a herbicidas (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo o qual codifica para resistência a canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina, G418, etc.; um gene bar o qual codifica para resistência a bialafos; um gene de EPSP sin-tase mutante o qual codifica para tolerância ao glifosato; um gene de nitrilase o qual confere resistência a bromoxinil; um gene de acetolac-tato sintase mutante (ALS) o qual confere tolerância a imidazolinona ou sulfoniluréia; e um gene de DHFR resistente ao metotrexato. Estão disponíveis múltiplos marcadores selecionáveis os quais conferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e semelhantes. Exemplos de semelhantes marcadores selecionáveis são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[00179] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção também pode incluir um marcador triável. Marcadores triáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Exemplos de marcadores triáveis incluem um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS) o qual codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene do locus R, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) nos tecidos das plantas (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Sym-posium, P. Gustafson e R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 26382); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); um gene o qual codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma cate-col dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicas (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tirosinase o qual codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona a qual por sua vez condensa para melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma α-galactosidase.

[00180] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinante, conforme descrito acima, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nu-cleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que apresentam reduzida suscetibilidade para pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Vetores de transformação de planta podem ser preparados, por exemplo, inserindo moléculas de ácido nucleico codificando moléculas de iRNA em vetores de transformação de planta e introduzindo estes nas plantas.

[00181] Métodos para transformação de células hospedeiras adequados incluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como por transformação de protoplastos (Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.508.184), por captação de DNA mediada por dessecação / inibição (Vide, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), por eletroporação (Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. US 5.384.253), por agitação com fibras de carboneto de silício (Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.302.523 e 5.464.765), por transformação mediada por Agrobacterium (Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; e 6.384.301) e por aceleração de partículas revestidas com DNA (Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861, e 6.403.865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para a transformação do milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.591.616, 7.060.876 e 7.939.3281. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de virtualmente quaisquer espécies podem ser transformadas de modo estável. Em algumas modalidades, DNA transfor-mante é integrado dentro do genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, células transgênicas podem ser regeneradas dentro de um organismo transgênico. Qualquer uma destas técnicas pode ser usada de modo a produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00182] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de várias espécies de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para as plantas as quais transformam geneticamente as células das plantas. Os plasmí-deos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis por transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (de indução tumoral) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, o qual é transferido para as plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável por transferência de T-DNA. A região T-DNA é limitada por repetições de terminais. Em vetores binários modificados, os genes de indução tumoral foram eliminados, e as funções da região Vir são utilizadas para a transferência de DNA estranho limitado pelas sequências de limite de T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficaz de células e plantas transgênicas, e um sítio de clonagem múltipla para a inserção de sequências para transferência tal como um ácido nucleico codificante de dsRNA.

[00183] Em modalidades particulares, um vetor de transformação de planta é derivado a partir de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (VIde, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, e 5.501.967; e a Patente Europeia No. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, os descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e os derivados a partir de qualquer uma das precedentes. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhi-zobium, e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas de modo a mediar a transferência genética para uma série de plantas diversas. Estas bactérias simbióticas associadas com plantas podem ser tornadas competentes para transferência genética por aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de um vetor binário adequado.

[00184] Depois de proporcionar o DNA exógeno para as células receptores, as células transformadas geralmente são identificadas para posterior cultura e regeneração da planta. De modo a aprimorar a capacidade para identificar as células transformadas, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou triável, conforme previamente estipulado, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso em que se usa um marcador selecionável, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas expondo as células a um agente ou agentes seletivos. No caso em que se usa um marcador triável, as células podem ser triadas para o traço genético do marcador desejado.

[00185] As células que sobrevivemà exposição ao seletivo agente, ou as células que tenham sido marcadas positivas em um teste de triagem, podem ser cultivadas em meio que supporta a regeneração das plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado incluindo substâncias adicionais, tais como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido sobre um meio básico com reguladores do crescimento até tecido suficiente estar dispon ível para iniciar os esforços de regeneração da planta, ou depois de repetidas rodadas de seleção manual, até a morfologia do tecido ser adequada para regeneração (por exemplo, tipicamente cerca de 2 semanas), e em seguida transferido para meio favorável para a formação de rebentos. As culturas são transferidas periodicamente até ter ocorrido suficiente formação de rebentos. Assim que os rebentos são formados, são transferidos para meio favorável para a formação de raízes. Assim que suficientes raízes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturação posteriores.

[00186] De modo a confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA codificando uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão genética alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros) nas plantas em regeneração, pode ser realizada uma variedade de testes. Os testes referidos incluem, por exemplo: testes de biologia molecular, tais como Southern e northern blotting, PCR, e sequenciamento de ácido nuclei-co; testes bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ensaio ELISA e/ou imuno blots) ou por função enzimática; testes de partes das plantas, tais como testes de folhas ou de raízes; e análise do fenótipo de toda a planta regenerada.

[00187] Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, por amplificação de PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonu-cleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem por PCR é entendida como incluindo, mas não limitada a, amplificação por reação de cadeia polimerase (PCR) de DNA genômico derivado a partir de tecido do calo da planta hospedeira isolada previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada dentro do genoma, seguida por clonagem de rotina e análise de sequência dos produtos de amplificação por PCR. Métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados a DNA genômico derivado a partir de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas celulares.

[00188] Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma única sequência de DNA recombinante inserida dentro de um cromossoma. A única sequência de DNA recombinante é referida como um "evento transgênico" ou "evento de integração". As plantas transgêni-cas referidas são hemizigotos para a sequência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigoto com respeito a um transgene pode ser obtida por acasalamento sexual (auto-polinização) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência genética exógena consigo mesma, por exemplo uma planta T0, de modo a produzir semente Ti. Um quarto da semente T1 produzida vai ser homozigoto com respeito ao transgene. A germinação da semente T1 resulta em plantas que podem ser testadas para heterozigosidade, tipicamente usando um teste SNP ou teste de uma amplificação térmica que possibilita a distinção entre heterozi-gotos e homozigotos (isto é, um teste de zigosidade).

[00189] Em modalidades particulares, são produzidas no mínimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes que tenham um efeitro inibidor de pragas de coleópteros e/ou hemípteros em uma célula de planta. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressadas a partir de múltiplas sequências de ácido nucleico introduzidas em diferentes eventos de transformação, ou a partir de uma única sequência de ácido nucleico introduzida em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressadas sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressadas sob o controle de múltiplos promotores. Podem ser expressadas moléculas de iRNA únicas que compreendem múltiplas sequências de ácido nucleico que são cada uma homóloga a diferentes loci dentro de uma ou mais pragas de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, o locus definido pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79), tanto em populações diferentes da mesma espécie de praga de coleópteros e/ou hemípteros, ou em diferentes espécies de pragas de coleópteros e/ou hemípteros.

[00190] Além de transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma primeira planta que tem no mínimo um evento transgênico com uma segunda planta que carece de um evento semelhante. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombi-nante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida dentro de uma primeira linhagem de planta que é sauscetível a transformação de modo a produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruza- da com uma segunda linhagem de planta a fim de introgressão da sequência de nucleotídeos que codifica a molécula de iRNA dentro da segunda linhagem de planta.

[00191] A invenção também inclui produtos de base contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. Modalidades particulares incluem produtos de base produzidos a partir de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências de nu-cleotídeos da presente invenção. Um produto de base contendo uma ou mais das sequências da presente invenção se destina a incluir, mas não está limitado a, farinhas, óleos, grãos ou sementes triturados ou inteiros de uma planta, ou qualquer alimento ou produto de ração animal compreendendo qualquer farinha, óleo, ou grão triturado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em um ou mais commodities ou produtos de base contemplados aqui, neste pedido de patente, é de fato evidência de que a commodity ou o produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção para os fins de controlar pragas de plantas de coleópteros e/ou hemípteros usando métodos de supressão genética mediada por dsRNA.

[00192] Em alguns aspectos, são incluídos sementes e produtos de base produzidos por plantas transgênicas derivadas a partir de células de plantas transformadas, em que as sementes ou produtos de base compreendem uma quantidade detectável de uma sequência de ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, os produtos de base referidos podem ser produzidos, por exemplo, obtendo plantas transgênicas e preparando alimento ou ração a partir das mesmas. Produtos de base compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico da invenção incluem, por exemplo e sem limitação: farinhas, óleos, grãos ou sementes triturados ou inteiros de uma planta, e qualquer produto alimentar compreendendo qualquer farinha, óleo, ou grão triturado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico da invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da invenção em um ou mais commodities ou produtos de base é de fato evidência de que a commodity ou o produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o fim de controlar pragas de coleópteros e/ou hemípteros.

[00193] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgê-nica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender no mínimo um outro evento transgênico em seu genoma, incluindo sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA visando um locus em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros diferente do locus definido por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 79, tais como, por exemplo, um ou mais loci selecionados entre o grupo que consiste em Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2013/0097730), ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 14/577.811), RNA polimerase I1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/133.214), RNA polimerase II140 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 14/577.854), RNA polimerase II215 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/133.202), RNA polimerase II33 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/133.210), ncm (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/095487), Dre4 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 14/705.807), COPI alpha (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/063.199), COPI beta (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/063.203), COPI gama (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/063.192), COPI delta (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 62/063.216); um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA visando um gene em um organismo diferente de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um nematódeo parasitário da planta); um gene codificando uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, tais como, por exemplo, Cry34Ab1 (Patentes U.S. Nos. US 6.127.180, 6.340.593, e 6.624.145), Cry35Ab1 (Patentes U.S. Nos. US 6.083.499, 6.340.593, e 6.548.291), uma combinação “Cry34/35Ab1” em um único evento (por exemplo, evento DAS-59122-7 do milho; Patente U.S. No. US 7.323.556), Cry3A (por exemplo, Patente U.S. No. US 7.230.167), Cry3B (por exemplo, Patente U.S. No. US 8.101.826), Cry6A (por exemplo, Patente U.S. No. US 6.831.062), e combinações das mesmas (por exemplo, Pedido de Patente U.S. Nos. 2013/0167268, 2013/0167269, e 2013/0180016); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene proporcionando tolerância a glifosato, glufosinato, dicamba ou 2,4-D (por exemplo, Patente U.S. No. US 7.838.733)); e um gene contribuindo para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como aumento da produção, alteração do metabolismo de ácidos graxos, ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática. Em modalidades particulares, sequências codificando moléculas de iRNA da invenção podem ser combinadas com outros traços de controle de insetos ou com traços de resistência a doença em uma planta de modo a obter traços desejados para reforço do controle de dano por insetos e de doença das plantas. A combinação de traços de controle de insetos que empregam modos de ação distintos pode proporcionar plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior em relação a plantas que abrigam um único traço de controle, por exemplo, devido à reduzida probabilidade de que venha a se desenvolver no campo resistência ao um ou mais traços. V. Supressão de Gene Alvo em uma Praga de Coleópteros e/ou Hemípteros A. Visão Geral [00194] Em algumas modalidades da invenção, no mínimo uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros pode ser proporcionada para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a molécula de ácido nucleico leva a si-lenciamento genético mediado por RNAi na praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) pode ser proporcionada para a praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros pode ser proporcionada para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros contatando a molécula de ácido nucleico com a praga de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nu-cleico útil para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros pode ser proporcionada em uma alimentação de substrato da praga de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros pode ser proporcionada através de ingestão de material da planta compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em determinadas modali- dades, a molécula de ácido nucleico está presente no material da planta através de expressão de uma sequência de ácido nucleico recombi-nante introduzida no material da planta, por exemplo, por transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico recombinante e regeneração de um material da planta ou da planta inteira da célula de planta transformada. B. Supressão de Gene Alvo mediada por RNAi [00195] Em modalidades, a invenção proporciona moléculas de iR-NA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) que podem ser projetadas para ter por alvo sequências de nucleotídeos nativos essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata, D. u. tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunc-tata, BSB, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacanthus, Dichelops furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Chinavia margina-tum, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Ne-omegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e Lygus lineolaris), por exemplo projetando uma molécula de iRNA que compreende no mínimo um filamento compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é especificamente complementar à sequência alvo. A sequência de uma molécula de iRNA projetada deste modo pode ser idêntica à sequência alvo, ou pode incorporar incompatibilidades que não evitam hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência alvo.

[00196] As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para supressão de gene em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, desse modo reduzindo o nível ou a incidência de dano causado pela praga sobre uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "supressão de gene" refere-se a qualquer um dos métodos de conhecimento geral para reduir os níveis de proteína produzida como um resultado da transcrição genética para mRNA e subsequente translação do mRNA, incluindo a redução da expressão de proteína de um gene ou uma sequência codificante incluindo inibição pós-transcricional de expressão e supressão transcricional. A inibição pós-transcricional é mediada por homologia específica entre todo ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene visado para supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para supressão. Adicionalmente, inibição pós-transcricional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomas.

[00197] Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em curtas moléculas de siRNA (aproximadamente 20 nucleo-tídeos de comprimento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada por atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de filamento único; o "filamento passageiro" e o "filamento guia". O filamento passageiro pode ser degradado, e o filamento guia pode ser incorporado em RISC. Ocorre inibição pós-transcricional por hibridização específica do filamento guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e subsequente clivagem pela enzima, Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).

[00198] Em modalidades da invenção, pode ser usada qualquer forma de molécula de iRNA. Os versados na técnica vão entender que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis do que são as moléculas de RNA de filamento único, durante a preparação e durante a etapa de proporcionar a molécula de iRNA para uma célula, e também são tipicamente mais estáveis em uma célula. Deste modo, en- quanto as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, podem ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsR-NA pode ser escolhida devido a sua estabilidade.

[00199] Em modalidades particulares, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotí-deos, cuja sequência de nucleotídeos pode ser expressada in vitro de modo a produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por uma sequência de nucleotídeos dentro do genoma de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em determinadas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de haste e alça (stem-loop). Depois de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros contatar a molécula de iRNA transcrita in vitro, pode ocorrer a inibição pós-transcricional de um gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um gene essencial).

[00200] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo no mínimo 15 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos é usada em um método para inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabroti-ca (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência codificante na- tiva de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5. Em determinadas modalidades, pode ser usada a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é no mínimo 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer uma das precedentes. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, pode ser expressada uma molécula de ácido nucleico que hibridiza especificamente a uma molécula de RNA presente em no mínimo uma célula de uma praga de coleópteros.

[00201] Em determinadas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo no mínimo 15 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de hemípteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 79; o complemento de SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79. Em determinadas modalidades, pode ser usada a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é no mínimo 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer uma das precedentes. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, pode ser expressada uma molécula de ácido nucleico que hibridiza especificamente a uma molécula de RNA presente em no mínimo uma célula de uma praga de hemípteros.

[00202] Em algumas modalidades, a expressão de no mínimo uma molécula de ácido nucleico compreendendo no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos pode ser usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de coleópteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabroti-ca (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) compreen- dendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotí-deos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5. Em determinadas modalidades, pode ser usada a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é no mínimo 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer uma das precedentes. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, pode ser expressada uma molécula de ácido nucleico que hibridiza especificamente a uma molécula de RNA presente em no mínimo uma célula de uma praga de coleópteros. Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico semelhante pode compreender uma sequência de nu-cleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5.

[00203] Em modalidades particulares da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo no mínimo 15 nu-cleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de hemípteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 79; o complemento de SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo de hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO: 79. Em determinadas modalidades, pode ser usada a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é no mínimo 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer uma das precedentes. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, pode ser expressada uma molécula de ácido nucleico que hibridiza especificamente a uma molécula de RNA presente em no mínimo uma célula de uma praga de hemípteros. Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico semelhante pode compreender uma sequência de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 79.

[00204] É uma característica importante de algumas modalidades da invenção que o sistema de inibição pós-transcricional de RNAi é capaz de tolerar variações de sequência entre genes alvo que podem ser esperdas devido a mutação genética, polimorfismo de cepas, ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não precisar ser absolutamente homóloga ou a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável ou a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não precisar ser de comprimento total, em relação ou a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado do gene alvo.

[00205] A inibição de um gene alvo usando a tecnologia de iRNA da presente invenção é sequência-específica; isto é, sequências de nu-cleotídeos substancialmente homólogas às moléculas de iRNA são visadas para inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos idêntica a uma porção de um gene alvo sequência pode ser usada para inibição. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, pode ser usada uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleo-tídeos com uma ou mais mutações de inserção, de eliminação, e/ou de ponto em relação a um gene alvo sequência. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene alvo podem compartilhar, por exemplo, no mínimo a partir de cerca de 80%, no mínimo a partir de cerca de 81%, no mínimo a partir de cerca de 82%, no mínimo a partir de cerca de 83%, no mínimo a partir de cerca de 84%, no mínimo a partir de cerca de 85%, no mínimo a partir de cerca de 86%, no mínimo a partir de cerca de 87%, no mínimo a partir de cerca de 88%, no mínimo a partir de cerca de 89%, no mínimo a partir de cerca de 90%, no mínimo a partir de cerca de 91%, no mínimo a partir de cerca de 92%, no mínimo a partir de cerca de 93%, no mínimo a partir de cerca de 94%, no mínimo a partir de cerca de 95%, no mínimo a partir de cerca de 96%, no mínimo a partir de cerca de 97%, no mínimo a partir de cerca de 98%, no mínimo a partir de cerca de 99%, no mínimo a partir de cerca de 100%, e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região duplex de uma molécula de dsR-NA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de um gene alvo transcripto. Em moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência de comprimento menor do que total apresentando uma maior homologia compensa para uma sequência mais longa e menos homóloga. O comprimento da sequência de nucleotídeos de uma regi- ão duplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um gene alvo transcripto pode ser de no mínimo cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou no mínimo cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, pode ser usada uma sequência de mais de 15 a 100 nucleotídeos. Em modalidades particulares, pode ser usada uma sequência de mais de cerca de 200 a 300 nucleotídeos. Em modalidades particulares, pode ser usada uma sequência de mais de cerca de 500 a 1000 nucleotídeos, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00206] Em determinadas modalidades, a expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser inibida por no mínimo 10%; no mínimo 33%; no mínimo 50%; ou no mínimo 80% dentro de uma célula de a praga de coleópteros e/ou hemípteros, de tal modo que ocorre uma significativa inibição. Significativa inibição refere-se à inibição acima de um limiar que resulta em um fenótipo de-tectável (por exemplo, cessação do crescimento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento, indução de mortalidade, etc.), ou uma diminuição detectável no RNA e/ou no produto genético correspondente ao gene alvo sendo inibido. Embora em determinadas modalidades da invenção ocorra inibição em substancialmente todas as células da praga de coleópteros e/ou hemípteros, em outras modalidades ocorre inibição somente em um subgrupo de células expressando o gene alvo.

[00207] Em algumas modalidades, a supressão transcricional em uma célula é mediada pela presença de uma molécula de dsRNA apresentando substancial identidade de sequência com um sequência de DNA de promotor ou o complemento da mesma, para realizar o que é referido como "supressão trans de promotor ". A supressão genética pode ser eficaz contra genes alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que poden ingerir ou contatar as moléculas de dsRNA re- feridas, por exemplo, por ingestão ou contato do material da planta contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para uso em supressão trans de promotor podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da praga de coleópteros e/ou hemípteros. A supressão genética pós-transcricional por RNA de orientação antissenso ou de senso para regular a expressão genética em células de plantas é revelada nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.107.065, 5.231.020, 5.283.184, e 5.759.829. C. Expressão de Moléculas de iRNA Proporcionadas para uma Praga de Coleópteros e/ou Hemípteros [00208] A expressão de moléculas de iRNA para inibição genética mediada por RNAi em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros pode ser realizada em qualquer um de vários formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem ser então proporcionadas para uma praga de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo, pondo em contato as moléculas de iRNA com a praga, ou fazendo com que a praga ingira ou internalize de modo diverso as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiras de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros transformadas, células de plantas transformadas, e a progênie de plantas transformadas. As células de plantas transformadas e as plantas transformadas podem ser manipuladas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para proporcionar um efeito de proteção contra pragas. Deste modo, quando uma planta transgênica ou uma célula de planta transgênica é consumida por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressadas nas plantas transgênicas ou células transgênicas. As sequências de nucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidas em uma ampla variedade de hos- pedeiros de micro-organismos procarióticos e eucarióticos de modo a produzir moléculas de iRNA. O termo "micro-organismo" inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.

[00209] A modulação da expressão genética pode incluir supressão parcial ou completa da expressão referida. Em outra modalidade, um método para a supressão da expressão genética em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros compreende proporcionar no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade de supressão genética de no mínimo uma molécula de dsRNA formada depois de transcrição de uma sequência de nucleotídeos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, da qual no mínimo um segmento é complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da praga de coleópte-ros e/ou hemípteros. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA, ingerida por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de acordo com a invenção, pode ser no mínimo a partir de cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 79. São, portanto, proporcionadas moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitadas a, sequências de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente e construtos de DNA recombinantes para proporcionar moléculas de dsRNA da presente invenção, as quais suprimem ou inibem a expressão de uma sequência codificante endóge-na ou uma sequência codificante alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros quando introduzidas nas mesmas.

[00210] Modalidades particulares proporcionam um sistema de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes alvo em uma praga de plantas de coleópteros e/ou hemípteros e para o controle de uma população da praga de plantas de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula de planta transgênica hospedeira ou o conteúdo da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, é criada uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênica que contém um cons-truto de DNA recombinante proporcionando uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células de plantas transgênicas e plantas transgênicas compreendendo sequências de ácido nucleico codificando uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são de conhecimento geral na técnica) para construir um vetor de transformação de planta compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula de planta ou uma planta; e para gerar a célula de planta transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00211] De modo a conferir resistência a praga de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombi-nante pode ser, por exemplo, transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma mo- lécula de dsRNA semelhante pode ser compreendida em parte de uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a uma sequência de nucleo-tídeos correspondente transcrita a partir de uma sequência de DNA dentro de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros é suprimida pela molécula de dsRNA ingerida, e a supressão da expressão do gene alvo na praga de coleópteros e/ou hemípteros resulta, por exemplo, em cessação da alimentação pela praga de coleópteros e/ou hemípteros, com um resultado final sendo, por exemplo, que a planta transgênica é protegida contra dano posterior pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. Foi demonstrado que os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA são aplicáveis uma variedade de genes expressados em pragas, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou pela transformação celular, incluindo genes hou-se-keeping; fatores de transcrição; genes relacionados com muda (molting); e outros genes os quais codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou no crescimento e desenvolvimento normais.

[00212] Para transcrição a partir de um transgene in vivo ou um construto de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor, reforçador, silenciador, e sinal de poliadenilação) pode ser usada em algumas modalidades para transcrever o filamento (ou filamentos) de RNA. Portanto, em algumas modalidades, conforme estipulado, acima, uma sequência de nucleotídeos para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser ligada operacionalmente a uma ou mais sequências de promotores funcionais em uma célula hospedeira de planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. A sequência de nucleotídeos da presente invenção, sob o controle de uma sequência de promotor ligada operacionalmente, pode ser adicionalmente flanqueada por sequências adicionais que afetam com vantagem sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcripto resultante. As sequências referidas podem estar localizadas a montante do promotor ligado operacionalmente, a jusante da extremidade 3' do construto de expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor quanto a jusante da extremidade 3' do construto de expressão.

[00213] Algumas modalidades proporcionam métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causado por uma praga de coleópteros e/ou hemípteros que se alimenta sobre a planta, em que o método compreende proporcionar na planta hospedeira uma célula de planta transformada expressando no mínimo uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a uma ou mais moléculas de ácido nucleico funciona depois de ser absorvida pela praga de coleópteros e/ou hemípteros para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga de coleópteros e/ou hemípteros, cuja inibição da expressão resulta em mortalidade, redução do crescimento, e/ou redução da reprodução da praga de coleópteros e/ou he-mípteros, desse modo reduzindo o dano para a planta hospedeira causado pela praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência de nucleotídeos que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico consistem de uma sequência de nucleotídeos que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00214] Em outras modalidades, é proporcionado um método para aumentar a produção de uma colheita de milho, em que o método compreende introduzir em uma planta de milho no mínimo uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivar a planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico inibe o crescimento de praga de coleópteros e/ou hemípteros e/ou o dano de praga de coleópteros e/ou hemípteros, desse modo reduzindo ou eliminando uma perda de produção devido a infestação por pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência de nucleotídeos que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico consistem de uma sequência de nucleotí-deos que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nu-cleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemíp-teros.

[00215] Em modalidades alternativas, é proporcionado um método para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de coleóp-teros e/ou hemípteros, o método compreendendo: transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando no mínimo uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a sequência de nucleotídeos é ligada operacionalmente a um promotor e uma sequência de terminação de transcrição; cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de plantas incluindo uma pluralidade de células de plantas transformadas; selecionar para células de plantas transformadas que tenham integrado a molécula de ácido nucleico em seus genomas; triar as células de plantas transformadas para expressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada; selecionar uma célula de planta transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentar com a célula de planta transgênica selecionada a praga de coleópteros e/ou hemípteros. As plantas também podem ser regeneradas a partir de células de plantas transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência de nucleotídeos que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico consiste em uma sequência de nucleotídeos que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00216] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), quer como um produto de expressão a partir de um gene recombinan-te incorporado em um genoma das células de plantas, ou conforme incorporado em um revestimento ou tratamento de sementes que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula de planta compreendendo um gene recombinante é considerada como sendo um evento transgênico. Também são incluídos em modalidades da invenção sistemas de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Os métodos para introdução podem incluir mistura direta de iRNA com tecido de planta de um hospedeiro para a praga de coleópteros e/ou hemípteros, bem como a aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção ao tecido da planta hospedeira. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a superfície de uma planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressada por um mi-cro-organismo, e o micro-organismo pode ser aplizado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule por um meio físico tal como uma injeção. Conforme discutido acima, uma planta transgê-nica também pode ser manipulada geneticamente para expressar no mínimo uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para destruir as pragas de coleópteros e/ou hemípteros conhecidas por infestar a planta. Moléculas de iRNA produzidas por síntese química ou enzimática também podem ser formuladas em uma maneira consistente com práticas agrícolas comuns, e usadas como pulverização sobre produtos para o controle de dano das plantas por uma praga de co-leópteros e/ou hemípteros. As formulações podem incluir os adesivos e umedecedores apropriados requeridos para cobertura foliar eficiente, bem como protetores UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) contra dano por UV. Os aditivos referidos são comumente usados na indústria de bioinseticidas, e são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. As aplicações referidas podem ser combinadas com outras aplicações inseticidas para pulverização (de base biológica ou de modo diverso) para reforçar a proteção da planta contra pragas de coleópteros e/ou hemípteros.

[00217] Todas as referências, incluindo publicações, patentes, e requerimentos de patente, citadas aqui, neste requerimento de patente, são por este incorporadas por meio de referência na medida em que não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos desta desco- berta, e portanto são incorporados na mesma extensão como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por meio de referência e fosse estipulada em sua totalidade aqui, neste requerimento de patente. As referências discutidas aqui, neste requerimento de patente, são proporcionadas somente para sua revelação antes da data de registro do presente requerimento. Nada aqui, neste requerimento de patente, deve ser considerado como uma admissão de que os inventores não estão intitulados a preceder a revelação referida em virtude de invenção anterior.

[00218] Os EXEMPLOS que se seguem são proporcionados para ilustrar algumas características e/ou aspectos particulares. Estes EXEMPLOS não devem ser considerados como limitantes da dscober-ta às características ou aos aspectos particulares descritos. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Bioensaios de Dietas de Insetos [00219] Preparação e bioensaios de amostra Uma série de moléculas de dsRNA (incluindo as correspondentes a wupA-1 reg1 (SEQ ID NO: 7), wupA-2 reg2 (SEQ ID NO: 8), wupA-3 reg3 (SEQ ID NO: 9), wupA-1 reg4 (SEQ ID NO: 10), wupA-3 ver1 (SEQ ID NO: 11), wupA-3 ver2 (SEQ ID NO: 13), e foram sintetizadas e purificadas usando um kit de RNAi MEGASCRIPT® (AMBION, LIFE TECHNOLOGIES, Grand Island, NY) ou HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit (NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA). As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão de TE, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle consistindo deste tampão, o qual serviu como uma verificação de plano de fundo para mortalidade ou inibição do crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão do bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THER- MO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00220] As amostrras foram testadas para a atividade de insetos nos bioensaios conduzidos com larvas de insetos neonatos sobre dieta para insetos artificial. Foram obtidos ovos de WCR da CROP CHA-RACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00221] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 cavidades especificamente projetadas para bioensaios de insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada cavidade continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta artificial projetada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 μL de amostra de dsRNA foi liberada por pipeta sobre a superfície da dieta de cada cavidade (40 μL/cm2). As concentrações das amostras de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área da superfície (1,5 cm2) na cavidade. As bandejas tratadas foram mantidas em uma coifa até o líquido sobre a superfície da dieta ter evaporado ou ter sido absorvido na dieta.

[00222] Dentro de umas poucas horas da eclosão, as larvas individuais foram selecionadas com uma escova de cabelo de camelo ume-decida e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por cavidade). As cavidades infestadas das bandejas de plástico de 128 cavidades foram em seguida seladas com folhas adesivas de plástico transparente, e ventiladas de modo a permitir a troca de gases. As bandejas dos bioensaios foram mantidas sob condições ambientais controladas (28°3, ~40% de Umidade Relativa, 16:8 (Iluminação: Escuridão)) por 9 dias, depois de cujo tempo foram registrados o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos, e o peso dos insetos sobreviventes. A percentagem média de mortalidade e a inibição média do crescimento foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (GI) foi calculada como se segue: GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] onde TWIT é o Peso Total de Insetos vivos no Tratamento; TNIT é o número total de Insetos no Tratamento; TWIBC é o Peso Total de Insetos vivos na Verificação do Pano de Fundo (controle de Tampão); e TNIBC é o número total de Insetos na Verificação do Pano de Fundo (controle de Tampão).

[00223] Foi realizada uma análise estatística usando o software JMP™ (SAS, Cary, NC).

[00224] A LC50 (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% dos insetos do teste são mortos. A GI50 (Inibição do Crescimento) é definida como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos do teste é 50% do valor médio visto nas amostras da Verificação do Pano de Fundo.

[00225] Bioensaios em replicata demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma surpreendente e inesperada mortalidade e inibição do crescimento de larvas da broca da raiz do milho. EXEMPLO 2 Identificação de Genes Alvo Candidatos [00226] Múltiplos estágios de desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise de conjuntos de transcriptoma de modo a proporcionar sequências de gene alvo candidato para o controle por tecnologia de resistência a insetos de plantas transgênicas por RNAi.

[00227] Em um exemplo, o RNA total foi isolado a partir de cerca de 0,9 g de larvas inteiras de WCR do primeiro instar; (4 a 5 dias pós eclosão; mantidas a 16°C), e purificadas usando o método à base de fenol/TRI REAGENT® que se segue (MOLECULAR RESEARCH CEN-TER, Cincinnati, OH): [00228] As larvas foram homogeneizadas em temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até ser obtida uma suspensão homogênea. Depois de 5 min. de incubação em temperatura ambiente, o homogenado foi dispensado dentro de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foi adicionado, e a mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos. Depois de deixar a extração descansar em temperatura ambiente por 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12.000 x g at 4°C. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para dentro de outro tubo estéril de 1,5 mL, e um volume igual de isopropanol em temperatura ambiente foi adicionado. Depois de incubação em temperatura ambiente por 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada por 8 min a 12.000 x g (4°C ou 25°C).

[00229] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, e o pélete de RNA foi lavado duas vezes por turbilhonamento com 75% de etanol, com recuperação por centrifugação por 5 min a 7.500 x g (4°C ou 25°C) depois de cada lavagem. O etanol fo i cuidadosamente removido, o pélete foi deixado para secar ao ar por 3 a 5 min, e em seguida foi dissolvido em água estéril sem nuclease. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorvência (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica a partir de cerca de 0,9 g de larvas produziu mais de 1 mg de RNA total, com uma proporção de A260/A280 de 1,9. O RNA extraído deste modo foi armazenado a -80°C até ser processado posteriormente.

[00230] A qualidade do RNA foi determinada passando uma alíquota através de um gel agarose a 1%. A solução do gel agarose foi produzida usando tampão autoclavado 10x TAE (Tris-acetato EDTA; a concentração a 1x é 0,04 M de Tris-acetato, 1 mM de EDTA (sal de sódio de ácido tetraacético de diamina de etileno), pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato) em um recipiente auto- clavado. 1x TAE foi usado como o tampão da operação. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente de formação de cavidades foram limpos com RNAseAway™ (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, Grand Island, NY). Dois pL de amostra de RNA foram misturados com 8 pL de tampão de TE (10 mM de Tris HCl pH 7,0; 1 mM de EDTA) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catalog No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70°C por 3 min, arrefecida até a temperatura ambiente, e 5 pL (contendo 1 pg a 2 pg de RNA) foram carregados por cavidade. Marcadores do peso molecular de RNA disponíveis comercialmente foram simultaneamente passados em cavidades separadas para comparação do tamanho molecular. O gel foi passado a 60 volts por 2 horas.

[00231] Uma biblioteca de cDNA normalizado foi preparada a partir o RNA total larval por um provedor de serviço comercial (EUROFINS GENOMICS, Huntsville, AL), usando priming aleatório. A biblioteca de cDNA larval normalizado foi sequenciada em escala de 1/2 placa pela s'serie química GS FLX 454 Titanium™ em EUROFINS MWG Operon, a qual resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 pb. 350.000 leituras foram montadas em cima de 50.000 contigs. Tanto as leituras não montadas quanto os contigs foram convertidos em bancos de dados BLASTable usando o programa disponível publicamente, FORMATDB (disponível na NCBI).

[00232] Bibliotecas de RNA total e de cDNA normalizado foram preparadas de modo similar a partir de materiais colhidas em outros estágios de desenvolvimento do WCR. Uma biblioteca de transcripto-ma reunido para triagem de gene alvo foi construída combinando membros de bibliotecas de cDNA representando os vários estágios de desenvolvimento.

[00233] Genes candidatos para direcionamento do RNAi foram selecionados usando informação referente a efeitos sobre o RNAi letais de genes particulares em outros insetos tais como Drosophila e Tribo-lium. Foi sugerida a hipótese de que estes genes eram essenciais para a sobrevida e o crescimento em insetos coleópteros. Foram identificados homólogos de genes alvo selecionados no banco de dados de sequências de transcriptom conforme descrito abaixo. Sequências inteiras ou parciais dos genes alvo foram amplificadas por PCR para preparar modelos para a produção de RNA de filamento duplo (dsRNA).

[00234] Pesquisas de TBLASTN usando sequências codificantes de proteínas candidatas foram realizadas contra bancos de dados BLAS-Table contendo as leituras de sequências de Diabrotica não montadas ou os contigs montados. Acertos significativos para uma sequência de Diabrotica (definidos como melhor do que e-20 para homologias de con-tigs e melhor do que e-10 para homologias de leituras de sequências não montadas) foram confirmados usando BLASTX contra o banco de dados não redundante NCBI. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências genéticas candidatas homólogas a Diabrotica identificadas na pesquisa TBLASTN na verdade compreenderam genes de Diabrotica, ou foram o melhor acerto para a sequência genética candidata não Diabrotica presente nas sequências de Diabrotica. Na maioria dos casos, genes candidatos de Tribolium os quais foram anotados como codificando uma proteína proporcionaram uma homologia de sequência inequívoca com uma sequência ou sequências nas sequências de transcriptoma de Diabrotica. Em uns poucos casos, foi evidente que alguns dos contigs de Diabrotica ou leituras de sequências não montadas selecionadas por homologia com um gene candidato não Diabrotica se sobrepuseram, e que a montagem dos contigs falhou em unir estas sobreposições. Naqueles casos, Se-quencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, MI) foi usado para montar as sequências em contigs mais longos.

[00235] Um gene alvo candidato codificando wupA de Diabrotica (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 5) foi identificado como um gene que pode levar a mortalidade, inibição do crescimento, inibição do desenvolvimento, ou inibição da reprodução da praga de co-leópteros em WCR.

[00236] As sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 5 são novas. A sequência não é proporcionada em bancos de dados públicos e não é revelada na Publicação do Requerimento de Patente Internacional No. WO/2011/025860; na Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 20070124836; na Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 20090306189; na Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 20070050860; na Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 20100192265; ou na Patente dos Estados Unidos No. US 7.612.194. A sequência wupA-1 de Diabrotica (SEQ ID NO: 1) é um tanto relacionada com um fragmento de uma sequência de Tribolium castaneum (GENBANK Acesso No. XM_008194295.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de Diabrotica WUPA-1 (SEQ ID NO: 2) é uma proteína de Tribolium castaneum que tem no GENBANK Acesso No. XP_008192517.1 (99% similar; 97% idêntica sobre a região de homologia). A sequência de Diabrotica wupA-2 (SEQ ID NO: 3) é um tanto relacionada com um fragmento curto de uma sequência de Tribolium castaneum (GENBANK Acesso No. XM_008194291.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de Diabrotica WUPA-2 (SEQ ID NO: 4) é uma proteína de Tribolium castaneum que tem no GENBANK Acesso No. XP_008192513.1 (98% similar; 94% idêntica sobre a região de homologia). A sequência de Diabrotica wupA-3 (SEQ ID NO: 5) é um tanto relacionada com um fragmento curto de uma sequência de Pediculus humanus corporis (GENBANK Acesso No. XM_002430857.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de Diabrotica WUPA-3 (SEQ ID NO: 6) é uma proteína de Musca domestica que tem no GENBANK Acesso No. XP_005179219.1 (92% similar; 87% idêntica sobre a região de homo-logia).

[00237] Os transgenes de dsRNA wupA podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA de modo a proporcionar direcionamento de RNAi redundante e efeitos de RNAi sinérgicos. Eventos de milho transgênico expressando dsRNA que visa wupA são úteis para prevenir danos das raízes por alimentação pela broca da raiz do milho. Os transgenes de dsRNA wupA representam novos modos de ação para combinar com tecnologia de proteínas inseticidas de Bacillus thu-ringiensis em pirâmides genéticas de manejo de resistência a insetos para mitigar contra o desenvolvimento de populações de broca da raiz resistentes a qualquer uma destas tecnologias de controle de broca da raiz.

[00238] Clones de sequências de comprimento total ou parcial de um gene candidato de Diabrotica, aqui, neste requerimento de patente, referido como wupA, foram usados para gerar amplicons por PCR para síntese de dsRNA.

[00239] A SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de DNA de 1077 pb de Diabrotica wupA-1.

[00240] A SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA de 1077 pb de Diabrotica wupA-2.

[00241] A SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA de 355 pb de Diabrotica wupA-3.

[00242] A SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de DNA de 499 pb de wupA-1 reg1.

[00243] A SEQ ID NO: 8 mostra uma sequência de DNA de 498 pb de wupA-2 reg2.

[00244] A SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de DNA de 353 pb de wupA-3 reg3.

[00245] A SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de DNA de 254 pb de wupA-1 reg4.

[00246] A SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência de DNA de 130 pb de wupA-3 v1.

[00247] A SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência de DNA de 133 pb de wupA-3 v2. EXEMPLO 3 Amplificação de Genes Alvo de modo a produzir dsRNA

[00248] Iniciadores foram designados para amplificar porções de regiões codificantes de cada gene alvo por PCR. Vide a Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência de promotor de fato T7 (TTAATACGA-CTCACTATAGGGAGA; SEQ ID NO: 13) foi incorporada nas extremidades 5' dos filamentos amplificados de senso ou antissenso. Vide a Tabela 1. O RNA total foi extraído do WCR, e cDNA de filamento único foi usado como modelo para reações de PCR usando iniciadores opostos posicionados para amplificar toda ou parte da sequência do gene alvo nativo. O dsRNA também foi amplificado a partir de um clone de DNA compreendendo a região codificante para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 14; Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50). EXEMPLO 4 Construtos de RNAi [00249] Preparação de modelo por PCR e síntese de dsRNA.

[00250] Uma estratégia usada para proporcionar modelos específicos para produção de dsRNA wupA e YFP é mostrada na Figura 1. Os DNAs de modelo pretendidos para uso em síntese de dsRNA wupA foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como modelo de PCR) cDNA de filamento único preparado a partir de RNA total isolado a partir de larvas do primeiro instar de WCR. Para cada região genética alvo wupA e YFP selecionada, amplificações por PCR introduziram uma sequência de promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos de senso e antissenso amplificados (o segmento YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região codi-ficante de YFP). Os produtos de PCR tendo uma sequência de promotor T7 em suas extremidades 5’ de ambos os filamentos de senso e antisssenso foram usados como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Vide a Figura 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificadas com os pares de iniciadores particulares foram: SEQ ID NO: 7 (wupA-1 regí), SEQ ID NO: 8 (wupA-2 reg2), SEQ ID NO: 9 (wu-pA-3 reg3), SEQ ID NO: 10 (wupA-1 reg4), SEQ ID NO: 11 (wupA-3 ví), SEQ ID NO: 12 (wupA-3 v2), e YFP (SEQ ID NO: 14). RNA de filamento duplo para bioensaio de insetos foi sintetizado e purificado usando um kit de RNAi AMBION® MEGASCRIPT® seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES) ou o kit de síntese de RNA de alta produtividade HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

Construção de vetores de transformação de planta [00251] Vetores de entrada abrigando um construto genético alvo para formação de hairpin compreendendo segmentos de wupA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5) são montados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular de rotina. A formação de hairpin intramolecular por transcriptos primários de RNA é facilitada arranjando (dentro de uma única unidade de transcrição) duas cópias de um segmento de uma sequência do gene alvo wupA um em orientação oposta ao outro, os dois segmentos sendo separados por um polinucleotídeo encadeador (por exemplo, uma alça (loop) (tal como SEQ ID NO: 102) ou um íntron ST-LS1; Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Deste modo, o transcripto de mRNA primário contém as duas sequências de segmentos do gene wupA como grandes repetições invertidas uma da outra, separadas pela sequência de encadeador. Uma cópia de um promotor (por exemplo, ubiquitina 1 do milho, Patente dos Estados Unidos No. US 5.510.474; 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV); promotor do badna-vírus baciliforme da cana de açúcar (ScBV); promotores de genes da actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; promotor ALS; promotor do gene da faseolina; cab; rubisco; LAT52; Zm13; e/ou apg) é usada para dirigir a produção do transcripto de hairpin de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' (por exemplo, um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3'UTR v2; Patente dos Estados Unidos 6.699.984), AtUbi10, AtEf1, ou StPinII) é usado para terminar a transcrição do gene que expressa RNA de hairpin.

[00252] Vetores de entrada são usados em reações de recombina-ção GATEWAY® de rotina com um vetor de destinação binária típico de modo a produzir vetores de expressão de RNA de hairpin wupA de transformação para transformações de embriões de milho mediadas por Agrobacterium.

[00253] Um vetor de destinação binária compreende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente dos Estados Unidos No. US 7838733 (B2), e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação de um promotor operável em planta (por exemplo, promotor do badnavírus baciliforme da cana de açúcar (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) ou ZmUbi1 (Patente dos Estados Unidos No. 5.510.474)). Uma 5'UTR e encadeador são posicionados entre a extremidade 3' do segmento do promotor e do codon de partida da região codificante AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' de um gene da lipase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente dos Estados Unidos No. 7.179.902) é usado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.

[00254] Um vetor binário de controle negativo, o qual compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® de rotina com um vetor de destinação binária típico e um vetor de entrada. O vetor de destinação binária compreende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (conforme acima) sob a regulação da expressão de um promotor de ubiquitina 1 do milho (conforme acima) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' de um gene da lipase do milho (ZmLip 3'UTR; conforme acima). O vetor de entrada compreende uma região codificante YFP sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 1 do milho (conforme acima) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' de um gene de peroxidase 5 do milho (conforme acima). EXEMPLO 5 Triagem de Genes Alvo Candidatos [00255] dsRNA sintético projetado para inibir sequências genéticas alvo identificadas no EXEMPLO 2 provocou mortalidade e/ou inibição do crescimento quando administrado a WCR em testes à base de dieta. Observou-se que wupA-1 reg4, wupA-3 reg3, e wupA-3 v1 apresentam eficácia bastante aumentada neste teste em relação aos dsR-NAs de YFP e aos controles triados.

[00256] Bioensaios em replicata demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivado a partir de wupA-1 reg4, wupA-3 reg3, e wupA-3 v1, cada uma resultou em mortalidade e/ou inibição do crescimento de larvas da broca da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados de bioensaios de alimentação à base de dieta de larvas de WCR depois de 9 dias de exposição a estes dsRNAs, bem como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparado a partir de uma região codifi-cante de proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 14).

Tabela 2. Resultados de testes de alimentação com dieta de dsRNA de wupA obtidos com larvas da broca da raiz do milho ocidental depois de 9 dias de alimentação. Análise ANOVA encontrou diferenças de significância na % Média de Mortalidade e na % Média de Inibição do Crescimento (GI). As Médias foram separadas usando o teste de Tukey-Kramer. *SEM = Erro padrão da média. As letras entre parênteses designam os níveis estatísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (P<0,05). **TE = Tris HCl (1 mM) mais tampão de EDTA (1 mM), pH 7,2. ***YFP = Proteína fluorescente amarela Tabela 3. Sumário da potência oral de dsRNA de wupA sobre larvas de WCR (ng/cm2).

[00257] Foi previamente sugerido que alguns genes da espécie Di-abrotica podem ser explorados para o controle de insetos mediado por RNAi. Vide a Publicação de Patente dos Estados Unidos No. US 2007/0124836, a qual revela 906 sequências, e a Patente dos Estados Unidos No. US 7.612.194, a qual revela 9.112 sequências. No entanto, foi determinado que muitos genes sugeridos como tendo utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle da Diabrotica. Também se determinou que cada uma das sequências wupA-1 reg4, wupA-3 reg3, e wupA-3 v1 proporciona controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, comparadas com outros genes sugeridos como tendo utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi.

[00258] Por exemplo, Anexina, Beta espectrina 2, e mtRP-L4 foram cada uma sugeridas na Patente dos Estados Unidos No. US 7.612.194 como sendo eficazes no controle de insetos mediado por RNAi. A SEQ ID NO: 23 é a sequência de DNA de Anexina região 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA de Anexina região 2 (Reg 2). a SEQ ID NO: 25 é a sequência de DNA de Beta espectrina 2 região 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO: 26 é a sequência de DNA de Beta espectrina 2 região 2 (Reg2). A SEQ ID NO: 27 é a sequência de DNA de mtRP-L4 região 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO: 28 é a sequência de DNA de mtRP-L4 região 2 (Reg 2). Também foi usada uma sequência de YFP (SEQ ID NO: 14) de modo a produzir dsRNA como um controle negati- vo.

[00259] Cada uma das sequências mencionadas acima foi usada de modo a produzir dsRNA por meio dos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia usada para proporcionar modelos específicos para produção de dsRNA é mostrada na Figura 2. Modelos de DNAs pretendidos para uso em síntese de dsRNA foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 4 e (como modelos de PCR) cDNA de filamento único preparado a partir de RNA total isolado a partir de larvas do primeiro instar de WCR. (YFP foi amplificada a partir de um clone de DNA.) Para cada região do gene alvo selecionada, foram realizadas duas amplificações por PCR separadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência de promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos de senso amplificados. A segunda reação incorporou a sequência de promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos de antissenso. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes alvo foram em seguida misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como modelo de transcrição para produção de dsRNA. Vide a Figura 2. RNA de filamento duplo foi sintetizado e purificado usando um kit de RNAi AMBI-ON® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCI-ENTIFIC, Wilmington, DE). e os dsRNAs foram cada um testados pelos mesmos métodos de bioensaio à base de dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores usados de modo a produzir as moléculas de dsRNA de YFP, Anexina Reg1, Anexina Reg2, Beta espectrina 2 Reg1, Beta espectrina 2 Reg2, mtRP-L4 Reg1, e mtRP-L4 Reg2. Sequências de iniciador de YFP para uso no método representado na Figura 2 também são listadas na Tabela 4. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação à base de di- eta de larvas de WCR depois de 9 dias de exposição a estas moléculas de dsRNA. Bioensaios em replicata demonstraram que a ingestão destes dsRNAs resultou em nenhuma mortalidade ou inibição do crescimento de larvas da broca da raiz do milho ocidental acima da vista com amostras de controle de tampão de TE, água, ou proteína YFP. 142/245 143/245 EXEMPLO 6 Produção de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs de Hairnin Inseticidas [00260] Transformação mediada por Agrobacterium. Células, tecidos, e plantas de milho transgênico que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, no mínimo uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA visando um gene compreendendo wupA-1 (SEQ ID NO: 1); wupA-2 (SEQ ID NO: 3); wupA-3 (SEQ ID NO: 5); wupA-1 reg1 (SEQ ID NO: 7); wupA-2 reg2 (SEQ ID NO: 8); wupA-3 reg3 (SEQ ID NO: 9); wupA-1 reg4 (SEQ ID NO: 10); wupA-3 v1 (SEQ ID NO: 11); wupA-3 v2 (SEQ ID NO: 12); BSB_wupA (SEQ ID NO: 79); BSB_wupA reg1 (SEQ ID NO: 81); BSB_wupA v1 (SEQ ID NO: 82); ou BSB_wupA v2 (SEQ ID NO: 83); através da expressão de um gene quimérico integrado de modo estável dentro do genoma da planta foram produzidas depois de transformação mediada por Agrobacterium. Métodos de transformação de milho empregando vetores superbinários ou binários de transformação são conhecidos na técnica, conforme descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. US 8.304.604, a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Tecidos transformados foram selecionados por sua capacidade para crescer sobre meio contendo Haloxyfop e foram triados para produção de dsRNA, conforme apropriado. Porções de semelhantes culturas de tecido transformadas foram apresentadas a larvas neonatas da broca da raiz do milho para bioensaio, essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 1.

[00261] Iniciação de Cultura de Agrobacterium. Estoques de glicerol de células de Agrobacterium cepa DAt13192 (Requerimento de Patente Internacional No. WO 2012/016222A2) abrigando um vetor binário de transformação descrito acima (EXEMPLO 4) foram riscados sobre okacas de meio mínimo AB (Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo antibióticos apropriados e foram cultivadas a 20 °C por 3 dias. As culturas foram em seguida riscadas sobre placas de YEP (g/L: extrato de levedura, 10; Peptona, 10; NaCl 5) contendo os mesmos antibióticos e incubadas a 20 °C por 1 dia.

[00262] Cultura de Agrobacterium. No dia de um experimento, uma solução de estoque e Meio de Inoculação e acetosiringona foi preparada em um volume apropriado para o número de construtos no experimento e pipetada para dentro de um frasco de 250 mL, estéril e descartável. O Meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341) continha: 2,2 g/L de sais de MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas (Frame et al., ibid.) 68,4 g/L de sacarose; 36 g/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; em pH 5,4.) Acetosiringona foi adicionado ao frasco contendo Meio de Inoculação até uma concentração final de 200 μM de uma solução de estoque a 1 M em 100% de dimetil sulfóxido e a solução foi completamente misturada.

[00263] Para cada construto, 1 ou 2 loops-full inoculantes de Agrobacterium da placa de YEP foram suspendidos em 15 mL da solução de estoque de Meio Inoculação / acetosiringona em um tubo de centrífuga de 50 mL estéril e descartável, e a densidade ótical da solução a 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi em seguida diluída até uma OD550 de 0,3 a 0,4 usando mistura adicional de Meio de Inoculação / acetosiringona. O tubo da suspensão de Agrobacterium foi em seguida colocado horizontalmente sobre um agitador de plataforma ajustado a cerca de 75 rpm em temperatura ambiente e agitado por 1 a 4 horas enquanto foi realizada a dissecção de embriões.

[00264] Esterilização de espiga e isolamento de embriões. Embriões imaturos de milho foram obtidos a partir da linhagem endogâmica B104 de plantas de Zea mays (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406) cultivadas na estufa e auto- ou sib-polinizadas de modo a produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 10 a 12 dias pós-polinização. No dia do experimento, espigas de-debulha-das foram esterilizadas superficialmente por imersão em uma solução a 20% de alvejante comercial (Alvejante Germicida ULTRA CLO-ROX®, 6,15% de hipoclorito de sódio; com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas por 20 a 30 min, seguido por três enxagues em água desio-nizada estéril em uma capela de fluxo laminar. Embriões zigóticos imaturos (de 1,8 a 2,2 mm de comprimento) foram dissecados assetica-mente de cada espiga e aleatoriamente distribuídos dentro de tubos de microcentrífuga contendo 2,0 mL de uma suspensão de células de Agrobacterium apropriadas em Meio de Inoculação líquido com 200 μΜ de acetosiringona, no qual foi adicionado 2 μΐ de tensoativo a 10% BREAK-THRU® S233 (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Alemanha). Para um determinado conjunto de experimentos, os embriões de espigas reunidas foram usados para cada transformação.

[00265] Cocultura de Agrobacterium. Depois de isolamento, os embriões foram colocados sobre uma plataforma oscilante por 5 minutes. O conteúdo do tubo foi em seguida vertido sobre uma placa de Meio de Cocultura, o qual continha 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas (em inglês, ISU Modified MS Vitamins); 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 200 μM de acetosiringona em DMSO; e 3 g/L de GELZAN™, em pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium foi re- movida com uma pipeta de transferência estéril e descartável. Os embriões foram em seguida orientados com o escutelo virado para cima usando forceps estéril com o auxílio de um microscópio. A placa foi fechada, selada com esparadrapo 3M™ MICROPORE™, e colocada em uma incubadora a 25°C com luz contínua a aproxim adamente 60 μmol m-2s-1 de Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR, em inglês, Photosynthetically Active Radiation).

[00266] Seleção de Calos e Regeneração de Eventos Transgêni-cos. Depois do período de Cocultura, os embriões foram transferidos para Meio de Repouso (em inglês, Resting Medium), o qual foi composto de 4,33 g/L de sais de MS; 1X de ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimáti-co de Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 0,5 g/L de monohidrato de ácido (2-(N-morfolino)etanossulfônico MES; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenicilina; e 2,3 g/L de GEL-ZAN™; em pH 5,8. Não mais de 36 embriões foram movidos para cada placa. As placas foram colocadas em uma caixa de plástico transparente e incubadas a 27°C com luz contínua em aproximadamente 50 μmol m-2s-1 de PAR por 7 a 10 dias. Os embriões que formaram calos foram em seguida transferidos (<18/ placa) sobre Meio de Seleção I (em inglês, Selection Medium I), o qual consistiu no Meio de Repouso (acima) com 100 nM de ácido R-Haloxyfop (0,0362 mg/L; para seleção de calos abrigando o gene AAD-1). As placas foram retornadas para caixas limpas e incubadas a 27°C com luz contínua a aproximadamente 50 μmol m-2s-1 de PAR por 7 dias. Os embriões que formaram calos foram em seguida transferidos (<12/ placa) para Meio de Seleção II, o qual consistiu de Meio de Repouso (acima) com 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0,181 mg/L). As placas foram retornadas para caixas limpas e incubadas a 27°C com luz contínua a aproximad amente 50 μmol m-2s-1 de PAR por 14 dias. Esta etapa de seleção permitiu que calo transgênico proliferasse e diferenciasse mais.

[00267] Calos embriogênicos proliferantes foram transferidos (<9/ placa) para Meio Pré-Regeneração. O Meio Pré-Regeneração continha 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas MS Modificadas; 45 g/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 g/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 g/L de GELZAN™; e 0,181 mg/L de ácido Haloxyfop; em pH 5,8. As placas foram armazenadas em caixas transparente e incubadas a 27°C com luz contínua a aproximadamente 50 μmol m-2s-1 de PAR por 7 dias. Calos em regeneração foram em seguida transferidos (<6/ placa) para Meio em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28°C com 16 horas de luz /8 horas de escuridão por dia (a aproximadamente 160 μmol m-2s-1 de PAR) por 14 dias ou até se desenvolverem brotos e raízes. O Meio de Regeneração continha 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas MS Modificadas; 60 g/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3 g/L de goma GELLAN™; e 0,181 mg/L de ácido R-Haloxyfop; em pH 5,8. Brotos pequenos com raízes primárias foram em seguida isolados e transferidos para Meio de Alongamento (em inglês, Elongation Medium) sem seleção. O Meio de Alongamento continha 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; e 3,5 g/L de GELRITE™: em pH 5,8.

[00268] Brotos de plantas transformadas selecionados por sua capacidade para crescerem sobre meio contendo Haloxyfop foram transplantados de PHYTATRAYS™ para potes pequenos preenchidos com meio de cultura (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), cobertos com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e em se- guida hardened-off em uma câmara de crescimento CONVIRON (27°3 de dia/24°C à noite, fotoperíodo de 16 horas, 50 a 70% de umidade ambiente, 200 μmol m-2s-1 de PAR). Em alguns casos, plântulas trans-gênicas putativas foram analisadas para número de cópias relativo de transgenes por ensaios por PCR em tempo real quantitativo usando iniciadores designados para detectar o gene de tolerância a herbicida AAD1 integrado dentro do genoma do milho. Adicionalmente, testes de qPCR foram usados para detectar a presença da sequência de enca-deador e/ou a sequência alvo em transformantes putativos. Plântulas transformadas selecionadas foram em seguida movidas para dentro de uma estufa para crescimento e teste adicionais.

[00269] Transferência e estabelecimento de plantas Tn na estufa para bioensaio e produção de semente. Quando as plantas atingiram o estágio V3-V4, foram transplantadas para mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e cultivadas até a floração na estufa (Tipo de Exposição a Luz: Foto ou Assimilação; Alto Limite Iluminação: 1200 PAR; duração do dia de 16 horas; 27°C de dia/ 24°C à noite).

[00270] As plantas usadas para bioensaios de insetos foram transplantadas de potes pequenos para TINUS™ 350-4 ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canadá;) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias depois da transplantação para ROOTRAINERS®, as plantas foram infestadas para bioensaio.

[00271] As plantas da geração T1 foram obtidas por polinização das sedas de plantas transgênicas T0 com pólen coletado a partir de plantas da linhagem endogâmica não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados, e plantando as sementes resultantes. Quando possível foram realizados cruzamentos recíprocos. EXEMPLO 7 Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transgênico [00272] Foram realizadas análises moleculares (por exemplo, RT-qPCR) de tecidos de milho sobre amostras de folhas coletadas a partir de plantas cultivadas em estufa nos mesmos dias em que foram avaliados os danos das raízes por alimentação.

[00273] Os resultados dos ensaios de RT-qPCR para a Per5 3'UTR foram usados para validar a expressão dos transgenes. Resultados de ensaios de RT-qPCR para a sequência de encadeador (a qual é integral à formação de moléculas de hairpin de dsRNA) em RNAs expressados também podem ser usados para validar a presença de trans-criptos de hairpin. Os níveis de expressão de RNA dos transgenes foram medidos em relação aos níveis de RNA de um gene de milho en-dógeno.

[00274] Análises por qPCR de DNA para detectar uma porção da região codificante de AAD1 em DNA genômico foram usadas para estimar o número de cópias de inserção de transgene. As amostras destas análises foram coletadas a partir de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados foram comparados com os resultados de qPCR de DNA de ensaios projetados para detectar uma porção de um gene nativo de cópia única, e eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes wupA) foram avançados para estudos adicionais na estufa.

[00275] Adicionalmente, ensaios de qPCR projetados para detectar uma porção do gene de resistência a espectinomicina (SpecR; abrigado sobre os plasmídeos de vetores binários fora do T-DNA) foram usados para determinar se as plantas transgênicas continham sequências de espinhas dorsais de plasmídeos integradas estranhas.

[00276] Nível de expressão de transcripto de RNA de hairpin: qPCR alvo Eventos celulares de calos ou plantas transgênicas foram anali- sados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) da sequência alvo para determinar o nível de expressão relativo do transcripto de hairpin de comprimento total, em comparação com o nível de transcripto de um gene de milho interno (SEQ ID NO: 57; GENBANK Acesso No. BT069734), o qual codifica uma proteína semelhante a TIP41 (isto é, um homólogo do milho de GENBANK Acesso No. AT4G34270; tendo um escore tBLASTX de 74% de identidade). O RNA foi isolado usando um kit de isolamento de RNA total Norgen BioTek Total RNA Isolation Kit (Norgen, Thorold, ON). O RNA total foi submetido a um tratamento On Column DNaseI de acordo com o protocolo sugerido no kit. O RNA foi em seguida quantificado sobre um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração foi normalizada para 50 ng/pL. O primeiro filamento de cDNA foi preparado usando um kit de síntese de cDNA de alta capacidade HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 pL de 100 μΜ de oligonucleotí-deo T20VN (IDT) (SEQ ID NO: 58; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C, ou G, e N é A, C, G, ou T/U) dentro do tubo de 1 mL de mistura de estoque de iniciador aleatórios, de modo a preparar um estoque de trabalho de iniciador aleatórios combinados e oligo dT.

[00277] Depois da síntese de cDNA, as amostras foram diluídas a 1:3 com água sem nuclease, e armazenadas a -20°C até serem testadas.

[00278] Ensaios de PCR em tempo real separados para o gene alvo e transcripto semelhante a TIP41 (TIP41-like) foram realizados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volumes de reação de 10 μL. Para o teste do gene alvo, as reações foram realizadas com Iniciadores wupA (F) (SEQ ID NO: 59) e wupA (R) (SEQ ID NO: 60), e uma IDT Custom Oligo sonda wupA PRB Set1, marcada com FAM e duplamente extintas com supressores Zen e Iowa Black (SEQ ID NO: 103). Para o teste do gene de referência semelhante a TIP41, foram usados os iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO: 61) e TIPmxR (SEQ ID NO: 62), e sonda Probe HXTIP (SEQ ID NO: 63) marcada com HEX (hexaclorofluoresceína).

[00279] Todos os testes incluíram controles negativos sem modelo (somente mistura). Para as curvas padrão, também foi incluído um branco (água em cavidade de origem (source well)) na placa de origem para verificar a contaminação cruzada das amostras. As sequências de iniciador e sonda são estipuladas na Tabela 6. As receitas dos componentes da reação para detecção dos vários transcriptos são reveladas na Tabela 7, e as condições das reações de PCR estão resumidas na Tabela 8. A porção do fluorescente de FAM (6-Carbóxi Fluoresceína Amidita) foi excitada a 465 nm e a fluorescência foi medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção de fluorescente de HEX (hexaclorofluoresceína) foram de 533 nm e 580 nm. Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeos para análises moleculares dos níveis de transcripto em milho transgênico.

Tabela 7. Receitas das reações de PCR para detecção de transcripto.

Tabela 8. Condições do termociclador para qPCR de RNA.

[00280] Os dados foram analisados usando o Software LIGHTCYCLER™ v1.5 por quantificação relativa usando um segundo algoritmo máx derivado para o cálculo dos valores de Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para análises de expressão, os valores de expressão foram calculados usando o método ΔΔΦ (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), o qual se baseia na comparação de diferenças dos valores de Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado segundo a hipótese de que, para reações de PCR otimizadas, o produto dobra a cada ciclo.

[00281 ] Tamanho e integridade do transcripto de hairnir. Ensaio por Northern Blot Em alguns casos, adicional foi obtida caracterização molecular das plantas transgênicas pela utilização de análise Northern Blot (blot de RNA) para determinar o tamanho do RNA de hairpin de wupA em plantas transgênicas expressando um dsRNA de wupA.

[00282] Todos os materiais e o equipamento foram tratados com RNAZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) foram coletadas em tubos SAFELOCK EPPEN-DORF de 2 mL, interrompidas com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) com três contas de tungstênio em 1 mL de TRIZOL (INVITROGEN) por 5 min, e em seguida incubadas em temperatura ambiente (RT) por 10 min. Opcionalmente, as amostras foram centrifugadas por 10 min a 4°C a 11.000 rpm e o sobrenadante foi transferido para dentro de um tubo SAFE-LOCK EPPENDORF de 2 mL fresco. Depois de 200 pL de clorofórmio ser adicionado ao homogenado, o tubo foi misturado por inversão por 2 a 5 min, incubado em temperatura ambiente por 10 minutos, e centrifugado a 12.000 x g por 15 min a 4°C. A fase superi or foi transferida para dentro de um tubo estéril EPPENDORF de 1,5 mL, 600 pL de isopropanol a 100% são adicionados, seguidos por incubação em temperatura ambiente por 10 min até 2 horas, e em seguida centrifugados a 12.000 x g por 10 min a 4°até 25°C. O sobr enadante foi descartado e o pélete de RNA foi lavado duas vezes com 1 mL de etanol a 70%, com centrifugação a 7.500 x g por 10 min a 4° até 25°C entre as lavagens. O etanol foi descartado e o pélete foi brevemente secado ao ar por 3 a 5 min antes de ressuspender em 50 pL de água sem nuclease.

[00283] O RNA total foi quantificado usando o NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) e as amostras foram normalizadas para 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) foram em seguida adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura de marcador padrão de RNA DIG (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) foram dispensados e adicionados a um volume igual de glioxal. As amostras e RNAs marcadores foram desnaturados a 50Ό por 45 min e armazenados sobre gelo até carregar sobre um gel a 1,25% de agarose SEAKEM GOLD (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de operação de 10 X glioxal NORTHERNMAX (AMBION/INVITROGEN). Os RNAs foram separados por eletroforese a 65 volts/30 mA por 2 horas e 15 minutos.

[00284] Depois de eletroforese, o gel foi enxaguado em 2X SSC por 5 min e foi realizado o estudo por imagem sobre uma estação GEL DOC (BIORAD, Hercules, CA), em seguida o RNA foi transferido passivamente para uma membrana de nylon (MILLIPORE) de um dia para o outro em temperatura ambiente, usando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste em 3 M de cloreto de sódio e 300 mM de citrato trissódico, pH 7,0). Depois da transferência, a membrana foi enxaguada em 2X SSC por 5 minutos, o RNA foi reticulado por UV à membrana (AGILENT/STRATAGENE), e a membrana foi deixada para secar em temperatura ambiente por até 2 dias.

[00285] A membrana foi pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB (AMBION/INVITROGEN) por 1 a 2 horas. A sonda consistiu de um produto amplificado de PCR contendo a sequência de interesse, marcada com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridização em tampão recomendado foi de um dia para o outro em uma temperatura de 60°C em tubos de hibridização. Depois de hibridização, o blot foi submetido a lavagens com DIG, embrulhado, exposto a filme por 1 a 30 minutos, em seguida o filme foi desenvolvido, tudo por métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.

Determinação do número de cópias de transgene [00286] Pedaços de folhas de milho aproximadamente equivalentes a 2 perfuradores de folha foram coletados em placas de coleta de 96 cavidades (QIAGEN). Foi realizada disrupção do tecido com um pulve- rizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (suprido com um kit BIOS-PRINT96 PLANT KIT; QIAGEN) com uma conta de aço inoxidável. Depois de maceração do tecido, o DNA genômico (gDNA) foi isolado em formato de alta produtividade usando um kit BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô de extração BIOSPRINT96. O DNA genômico foi diluído a 1:3 de DNA: água antes de configurar a reação de qPCR.

[00287] Análise por qPCR Foi realizada a detecção de transgene por teste de sonda de hidrólise por PCR em tempo real usando um sistema LIGHTCYCLER®480. Os oligonucleotídeos usados nos testes de sonda de hidrólise para detectar o gene alvo, a sequência de encade-ador (por exemplo, a alça (loop)), e/ou para detectar uma porção do gene SpecR (isto é, o gene de resistência a espectinomicina transportado sobre os plasmídeos de vetores binários; SEQ ID NO: 64; oligonucleotídeos SPC1 na Tabela 9), foram designados usando o programa LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Além disso, os oligonucleotídeos usados nos testes de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância a herbicida AAD-1 (SEQ ID NO: 65; oligonucleotídeos GAAD1 na Tabela 9) foram designados usando o software PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e das sondas. Os testes foram multiplexados com reagentes para um gene cromossômico de milho endógeno (Invertase (SEQ ID NO: 66; GENBANK Acesso No: U16123; referido aqui, neste requerimento de patente, como IVR1), o qual serviu como uma sequência de referência interna para assegurar que o gDNA estava presente em cada ensaio. Para amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) foi preparada a 1x de concentração final em uma reação multiplex de 10 μL de volume contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 10). Foi realizada uma reação de amplifi- cação de duas etapas conforme resumido na Tabela 11. A ativação e a emissão de fluoróforo para as sondas marcadas com FAM e com HEX foram conforme descrito acima; os conjugados de CY5 são excitados maximamente a 650 nm e fluorescência maximamente a 670 nm.

[00288] Os escores de Cp (o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limiar do plano de fundo) foram determinados a partir dos dados do PCR em tempo real usando o algoritmo de pontos de ajuste (LIGHTCYCLER® SOFTWARE release 1.5) e o módulo Relative Quant (com base no método DDCt). Os dados foram manuseados conforme descrito previamente (acima; qPCR de RNA).

Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) para determinação do número de cópias genômicas e detecção da espinha dorsal de plasmídeos de vetores binários. *CY5 = Cianina-5 Tabela 10. Componentes da reação para análises do número de cópias genômicas e detecção da espinha dorsal de plasmídeos. *NA = Não Aplicável **ND = Não Determinado Tabela 11. Condições do termociclador para qPCR de DNA EXEMPLO 8 Bioensaio de Milho Transgênico [00289] Bioensaios de Insetos In vitro A bioatividade do dsRNA da invenção em questão produzido em células de plantas é demonstrada por métodos de bioensaio. Vide, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. É possível demonstrar eficácia, por exemplo, por meio da alimentação de vários tecidos de plantas ou pedaços de tecido derivados a partir de uma planta produtora de um dsRNA inseticida para insetos alvo em um meio ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados a partir de vários tecidos de plantas derivados a partir de uma planta produtora do dsRNA inseticida e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados por cima das dietas artificiais para bioensaios conforme previamente descrito aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de semelhantes testes de alimentação são comparados com bioensaios conduzidos de modo similar que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida, ou com outras amostras de controle.

[00290] Bioensaios de Insetos com Eventos de Milho Transgênico Duas larvas da broca da raiz do milho ocidental (com 1 a 3 dias de idade) eclodidas a partir de ovos lavados são selecionados e colocadas dentro de cada cavidade da bandeja do bioensaio. Em seguida as cavidades são cobertas com uma cobertura de aba "PULL N’ PEEL" (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocadas em uma incubadora a 28°} com um ciclo de 18 horas / 6 horas de luz / escuridão. Nove dias depois da infestação inicial, as larvas são avaliadas para mortalidade, a qual é calculada como a percentagem de insetos mortos para o número total de insetos em cada tratamento. As amostras de insetos são congeladas a -20Ό por dois dias, em seguida as larvas de insetos de cada tratamento são reunidas e pesadas. A percentagem de inibição do crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pela média do peso médio dos tratamentos de duas cavidades de controle. Os dados são expressados como uma Percentagem de Inibição do Crescimento (dos Controles Negativos). Os pesos médios que excedem o peso médio de controle são normalizados para zero.

[00291] Bioensaios de Insetos na estufa. Ovos de broca da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos em solo de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Ovos de WCR foram incubados a 28°^ por 10 a 11 dias. Os ovos fo- ram lavados do solo, colocados dentro de uma solução de ágar a 0,15%, e a concentração foi ajustada até aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa de eclosão foi montada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovos para monitorar as taxas de eclosão.

[00292] O solo em torno das plantas de milho cultivadas em ROO-TRAINERS® foi infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos foram deixados para alimentar por 2 semanas, depois de cujo tempo foi dada uma "Classificação de Raízes" a cada planta. Uma Escala de Lesão de Nodo (em inglês, Node-Injury Scale) foi utilizada para graduação essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005, J. Econ. En-tomol. 98:1-8). As plantas que passaram por este bioensaio foram transplantadas para potes de 5 galões para produção de sementes. Os transplantes foram tratados com inseticida para prevenir dano por broca da raiz adicional e liberação de insetos nas estufas. As plantas foram polinizadas para produção de sementes. As sementes produzidas por estas plantas foram preservadas para avaliação nas gerações de plantas T1 e subsequentes.

[00293] Plantas de controle negativo transgênicas foram geradas por transformação com vetores abrigando genes projetados de modo a produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP). Bioensaios foram conduzidos com controles negativos incluídos em cada série de materiais das plantas.

Tabela 12. Bioensaio de estufa e resultados de análises moleculares de plantas de milho expressando wupA e plantas de controle de YFP. EXEMPLO 9 Zea mays Transgênico Compreendendo Sequências de Pragas de co-leópteros [PROPHETIC] [00294] Dez a 20 plantas de Zea mays T0 transgênicas são geradas conforme descrito no EXEMPLO 6. Algumas 10 a 20 linhagens independentes de Zea mays Ti adicionais expressando dsRNA de hairpin para um construto de RNAi são obtidas para estímulo da broca da raiz do milho. O dsRNA de hairpin pode ser derivado compreendendo toda ou parte da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 5. dsRNAs de hairpin adicionais podem ser derivados, por exemplo, a partir de sequências de pragas de coleópteros tais como, por exemplo, Cafl-180 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2013/0097730), ROP (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 14/577.811), RNA po-limerase II140 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 14/577.854), RNA polimerase I1 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/133.214), RNA polimerase II-215 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/133,202), RNA polimerase 33 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/133.210), ncm (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/095487), Dre4 (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 14/705.807), COPI alfa (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/063.199), COPI beta (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/063,203), COPI gama (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/063.192), COPI delta (Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 62/063.216). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. Preparações de RNA total de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com inicia-dores designados para ligar no encadeador do cassete de expressão de hairpin em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, iniciado-res específicos para cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA in planta. A am- plificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA de hairpin em cada planta de Zea mays transgênica. Em seguida o processamento do dsRNA hairpin dos genes alvo em siRNA é opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[00295] Além disso, moléculas de RNAi que têm sequências de incompatibilidade com mais de 80% de identidade de sequência com os genes alvo afetam as brocas da raiz do milho em um modo similar ao visto com as moléculas de RNAi que têm 100% de identidade de sequência com os genes alvo. O pareamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA de hairpin no mesmo construto de RNAi libera siRNAs processados na planta capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento e a viabilidade da alimentação das pragas de coleópteros.

[00296] Liberação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondentes aos genes alvo e a captação subsequente por pragas de coleópteros através de alimentação resulta em hiporregulação dos genes alvo na praga de coleópteros através de silenciamento genético mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento, e a reprodução da praga de coleópteros é afetada, e no caso de no um de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenel-la, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva a fracasso para infestar, alimentar, desenvolver, e/ou reproduzir com sucesso, ou leva à morte da praga de coleópteros. A escolha de genes alvo e a aplicação de RNAi com sucesso é em seguida usada para controlar as pragas de coleópteros.

[0001 ] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays não transformadas. Genes da praga de coleópteros alvo ou sequências selecionadas para criar dsRNA de hairpin não têm simi- laridade com qualquer sequência genética da planta conhecida. Portanto não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos visando estes genes ou sequências da praga de co-leópteros venha a ter qualquer efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características mor-fológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformada, bem como com plantas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo gene expressando hairpin. [00332] As características das raízes, do broto, das follhagens e de reprodução da planta são comparadas. As características dos brotos das plantas tais como altura, números e tamanhos das folhas, tempo de floração, tamanho floral e aparência são gravados. Em geral, não existem diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e as sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e em solo na estufa. EXEMPLO 10 Zea mays Transgênica Compreendendo uma Sequência de Praga de coleópteros e Construtos de RNAi Adicionais [0002] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que visa um organismo diferente de uma praga de coleópteros é transformada secundariamente através de metodologias de Agrobacterium ou de WHISKERS™ (vide Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) de modo a produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, no mínimo uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA visando um gene compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5). Vetores de plasmídeos de transformação de plantas preparados essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 4 são liberados através de métodos de transformação mediada por Agrobacterium ou WHIS- KERS™ em células de suspensão de milho ou em embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta de Zea mays Hi II ou B104 transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que visa um organismo diferente de uma praga de coleópteros. EXEMPLO 11 Zea mays Transgênica Compreendendo um Construto de RNAi e Sequências de Controle de Pragas de coleópteros Adicionais [0003] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que visa um organismo de praga de coleópte-ros (por exemplo, no mínimo uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA visando um gene compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5) é secundariamente transformada através de metodologias de Agrobacterium ou de WHISKERS™ (vide Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) de modo a produzir uma ou mais moléculas de proteínas inseticidas, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3 ou Cry34/Cry35Ab1. Vetores de plasmídeos de transformação de plantas preparados essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 4 são liberados através de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ em suspensão de células de milho ou embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta de Zea mays B104 transgênica compreendendo uma sequência codificante heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que visa um organismo de praga de coleópteros. São obtidas plantas duplamente transformadas que produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de pragas de coleópteros. EXEMPLO 12 Mortalidade de percevejo marrom neotropical (Euschistus heros) depois de injeção de RNAi de wupA

[0004] Colônia de percevejo marrom neotropical (BSB; Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora a 27°C, a 65 % de umidade relativa, com ciclo de 16: 8 horas de iluminação: escuridão. Um grama de ovos coletados durante 2 a 3 dias foram semeados em recipientes de 5 L com discos de papel filtro no fundo; os recipientes foram cobertos com malha para ventilação no. 18. Cada recipiente de criação produziu aproximadamente 300 a 400 BSB adultos. Em todos os estágios, os insetos foram alimentados com vagens frescos três vezes por semana, um sachê de mistura de sementes que continha sementes de girassol, sojas, e amendoins (3:1:1 por proporção de peso) foi substituído semanalmente. Água foi suplementada em frascos pequenos com tampões de algodão como pavios. Depois das duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para novo recipiente semanalmente.

[0005] Dieta artificial de BSB. Dieta artificial de BSB preparada como se segue (usada dentro de duas semanas da preparação). Vagens liofilizadas foram combinadas até um pó fino em um liquidificador MAGIC BULLET® enquanto amendoins crus (orgânicos) foram misturados em um liquidificador MAGIC BULLET® separado. Os ingredientes a seco misturados foram combinados (percentagens em peso: vagens, 35%; amendoins, 35%; sacarose, 5%; Complexo de vitaminas (por exemplo, mistura de vitaminas Vanderzant (em inglês, Vanderzant Vitamin Mixture) para insetos, SIGMA-ALDRICH, Catálogo No. V1007), 0.9%); em um grande liquidificador MAGIC BULLET®, o qual foi tampado e bem agitado para misturar os ingredientes. Os ingredientes a seco misturados foram em seguida adicionados a uma bacia de mistura. Em um recipiente separado, água e agente antifúngico de benomil (50 ppm; 25 μL de uma solução a 20.000 ppm /50 mL de solução de dieta) foram bem misturados e em seguida adicionados à mistura de ingredientes a seco. Todos os ingredientes foram misturados manualmente até a solução ser totalmente misturada. A dieta foi mo- delada nos tamanhos desejados, embrulhada frouxamente em folha de alumínio, aquecida por 4 horas a 60°C, em seguida a rrefecida e armazenada a 4°C.

[0006] Montagem de transcriptoma de BSB. Seis estágios de desenvolvimento de BSB foram selecionados para preparação de biblioteca de mRNA. O RNA total foi extraído a partir de insetos congelados a -70°C e homogeneizados em 10 volumes de tampão de Lise / Ligação em tubos Lysing MATRIX A de 2 mL (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) em um Instrumento FastPrep®-24 (MP BIOMEDICALS). O mRNA total foi extraído usando um kit de isolamento de miRNA mir-Vana™ (em inglês, mirVana™ miRNA Isolation Kit, AMBION; INVI-TROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. Sequenciamento de RNA usando um sistema illumina® HiSeq™ (San Diego, CA) proporcionou sequências de gene alvo candidato para uso em tecnologia de controle de insetos de RNAi. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra usando o software montador TRINITY (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). Os trans-criptos montados foram combinados para gerar um transcriptoma reunido. Este transcriptoma reunido de BSB contém 378.457 sequências.

[0007] Identificação de ortólogos de wupA de BSB. Uma pesquisa tBLASTn do transcriptoma reunido de BSB foi realizada usando como query a isoforma A de proteína wupA de Drosophila via sequências M: GENBANK Acesso Nos. NP_523398, NP_728137, NP_728138, NP_728139, NP_728140, NP_728141, NP_728142, NP_001245734, NP_001245732, e NP_001245733. wupA de BSB (SEQ ID NO: 79) foi identificado como um produto genético alvo candidato de Euschistus heros com sequência de peptídeo prevista SEQ ID NO: 80.

[0008] Preparação de modelo e síntese de dsRNA. cDNA foi preparado a partir de RNA de BSB total extraído a partir de um único inse- to adulto jovem (cerca de 90 mg) usando o Reagente TRIzol® (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizadas em temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 200 μL de TRIzol® usando um pilão de pélete (FISHERBRAND Catalog No. 12-141363) e Pestle Motor Mixer (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Depois de homogeneização, foi acrescentado um adicional de 800 μL de TRIzol®, o homogenado foi turbilhonado, e em seguida incubado em temperatura ambiente por cinco minutos. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Seguindo o protocolo de extração TRIzol® recomendado pelo fabricante por 1 mL de TRIzol®, o pélete de RNA foi secado em temperatura ambiente e ressuspendido em 200 μL de tampão Tris de um kit GFX PCR DNA AND GEL EXTRACTION KIT (Illustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) usando tampão de elutriação tipo 4 (em inglês, Elution Buffer Type 4) (isto é, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0). A concentração de RNA foi determinada usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[0009] Amplificação de cDNA. cDNA foi transcrito reverso a partir de 5 μg de modelo de RNA total de BSB e iniciador oligo dT usando um sistema SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ para RT-PCR (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. O volume final da reação de transcrição foi taizdo para 100 μL com água sem nuclease.

[0010] Os iniciadores BSB_ wupA_reg1-For (SEQ ID NO: 84) e BSB_ wupA_ reg1-Rev (SEQ ID NO: 85) foram usados para amplificar a BSB_wupA região 1, também referido como modelo de BSB_wupA reg1. O modelo de DNA foi amplificado por PCR de touch-down (temperatura de recozimento reduzida de 60°C par a50°C em uma redução de 1°C/ ciclo) com 1 μL de cDNA (acima) como o modelo. Um fragmento compreendendo um segmento de 349 pb de BSB_wupA reg1 (SEQ ID NO: 81) foi gerado durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima também foi usado para amplificar um modelo de controle negativo de 301 pb YFPv2 (SEQ ID NO: 86) usando os iniciadores YFPv2-F (SEQ ID NO: 87) e YFPv2-R (SEQ ID NO: 88). Os iniciadores BSB_ wupA reg1 e YFPv2 continham uma sequência de promotor de fago T7 (SEQ ID NO: 13) em suas extremidades 5', e deste modo permitiu a utilização dos fragmentos de DNA YFPv2 e BSB_ wupA reg1 para transcrição de dsRNA.

[0011] Síntese de dsRNA. O dsRNA foi sintetizado usando 2 pL de produto de PCR (acima) como o modelo com um kit de RNAi MEGAs-cript™ (AMBION) usado de acordo com as instruções do fabricante. (Vide a FIGURA 1). O dsRNA foi quantificado em um espectrofotôme-tro NANODROP™ 8000 e diluído a 500 ng/pL em 0,1X tampão de TE sem nuclease (1 mM de Tris HCL, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4).

[0012] Injeção de dsRNA em hemoceol de BSB. BSB foram cultivados sobre uma dieta de vagem e sementes, como a colônia, em uma incubadora a 27°C a 65% de umidade relativa e fotoperíodo de 16:8 horas de iluminação: escuridão. Ninfas do segundo instar (cada uma pesando 1 a 1,5 mg) foram manipuladas delicadamente com uma escova pequena de modo a prevenir lesão e foram colocadas em uma placa de Petri sobre gelo para congelar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de uma 500 ng/pL de solução de dsRNA (isto é, 27,6 ng de dsRNA; dosagem de 18,4 a 27,6 pg/g de peso corporal). Foram realizadas injeções usando um injetor NANOJECT™ II (DRUMMOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA) equipado com uma agulha de injeção extraída de um capilar de vidro Drummond de 3,5 polegadas (8,89 cm) no. 3-000-203-G/X. A ponta da agulha foi rompida e o capilar foi preenchido com óleo leve, em seguida preenchido com 2 a 3 pL de dsRNA. O dsRNA foi injetado dentro do abdômen das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por teste), e os testes foram repetidos em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por cavidade) foram transferidos para bandejas de 32 cavidades (Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo um pélete de dieta de BSB artificial e cobertas com abas Pull-N- Peel™ (BIO-CV-4; BIO-SERV). Foi suprida umidade por meio de 1,25 mL de água em um tubo de microcentrí-fuga de 1,5 mL com um chumaço de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5°C, 60% de umidade e um fotoperíodo de iluminação: escuridão de 16: 8 horas. Contagens de viabilidade e os pesos foram tirados no dia 7 depois das injeções.

[0013] Injeções identificaram wupA de BSB como um alvo de dsRNA letal. O dsRNA que visa o segmento YFP da região codificante, YFPv2 foi usado como um controle negativo em experimentos de injeção de BSB. Conforme resumido na Tabela 14, 27,6 ng de dsRNA de BSB_wupA reg1 injetado dentro do hemoceol de ninfas de BSB do 2o instar produziram alta mortalidade dentro de sete dias. A mortalidade causada por dsRNA de BSB_wupA reg1 foi significativamente diferente da mortalidade vista com a mesma quantidade de dsRNA de YFPv2 injetado (controle negativo), com p = 0,00263 (í-teste de Student). Tabela 14 Resultados de injeção de dsRNA BSB_wupA reg1 dentro do hemoceol de ninfas de Percevejo marrom do 2o instar sete dias depois de injeção. *Dez insetos injetados por teste para cada dsRNA. fSEM- Erro padrão da média EXEMPLO 13 Zea mays Transgênica Compreendendo Sequências de Pragas de hemípteros [0014] Dez a 20 plantas de Zea mays T0 transgênicas abrigando vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e/ou SEQ ID NO: 83 são geradas conforme descrito no EXEMPLO 6. Algumas 10 a 20 linhagens independentes de Zea mays T1 adicionais expressando dsRNA de hairpin para um construto de RNAi são obtidas para estímulo de BSB. dsRNA de hairpin pode ser derivado conforme estipulado em SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, ou de modo diverso compreendendo adicionalmente SEQ ID NO: 79. Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. Preparações de RNA total de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para ligar no encadeador do cassete de expressão de hairpin em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA de hairpin em cada planta de Zea mays transgênica. O processamento do hairpin de dsRNA dos genes alvo em siRNA é em seguida opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[0015] Além disso, as moléculas de RNAi tendo sequências de incompatibilidade com mais de 80% de identidade de sequência com os genes alvo afetam brocas da raiz do milho em um modo similar ao visto com moléculas de RNAi tendo 100% de identidade de sequência com os genes alvo. O pareamento de sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA de hairpin no mesmo construto de RNAi libera siRNAs processados em planta capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento e a viabilidade dae alimenta- ção de pragas de hemípteros.

[0016] A liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miRNA correspondente aos genes alvo e a subsequente captação por pragas de hemípteros através de alimentação resulta em hiporregulação dos genes alvo na praga de hemípteros através de silenciamento genético mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento, e a reprodução da praga de hemípteros é afetada, e no caso de no mínimo um entre Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyo-morpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus ser-vus leva ao fracasso para infestar, alimentar, desenvolver, e/ou reproduzir com sucesso, ou leva à destruição da praga de hemípteros. A escolha dos genes alvo e a aplicação de RNAi com sucesso é em seguida usada para controlar as pragas de hemípteros.

[0017] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays não transformada Genes de pragas de hemípteros alvo ou sequências selecionadas para criar dsRNA de hairpin não têm nenhuma similaridade com qualquer sequência genética de planta conhecida. Portanto não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos visando estes genes ou sequências de pragas de hemípteros venham a ter qualquer efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas de linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, bem como as de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo gene expressando hairpin. As características das raízes, do broto, das follhagens e de reprodução das plantas são comparadas. Não existe nenhuma diferença observável no comprimento das raízes e nos padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características dos brotos de plantas tais como altura, números e tamanhos das folhas, tempo de floração, tamanho floral e aspecto são similares. Em geral, não existem diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e as sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e em solo na estufa. EXEMPLO 14 Glycine max Transgênica Compreendendo Sequências de Pragas de hemípteros [0018] Dez a 20 plantas de Glycine max T0 transgênicas abrigando vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NO79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e/ou SEQ ID NO: 83 são gerados conforme é de conhecimento geral na técnica, incluindo por exemplo transformação mediada por Agrobacterium, como se segue. Sementes de soja (Glycine max) madura são esterilizadas de um dia para o outro com gás de cloro por dezesseis horas. Depois de esterilização com gás de cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma capela de fluxo LAMINAR™ para dissipar o gás de cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas são embebidas com água estéril por dezesseis horas no escuro usando uma caixa preta a 24°C.

[0019] Preparação de grãos de soja de semente dividida. Os grãos de soja divididos compreendendo uma porção de um protocolo de eixo embrionário necessitaram da preparação de material de semente de soja a qual é cortada longitudinalmente, usando uma lâmina no. 10 afixada a um bisturi, ao longo do hilo da semente para separar e remover a casca da semente, e dividir a semente em duas seções de cotilédone. Cuidadosa atenção é dada de modo a remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 a 1/3 do eixo de embriões permanece anexado à extremidade nodal do cotilédone.

[0020] Inoculação. As sementes de soja partidas compreendendo uma porção parcial do eixo embrionário são em seguida imersas por cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo plasmídeo binário compreendendo SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, e/ou SEQ ID NO: 83. A solução de Agrobacterium tumefaciens é diluída até uma concentração final de λ=0,6 OD650 antes da imersão dos cotilédones compreendendo o eixo de embriões.

[0021] Cocultura. Depois de inoculação, a semente de soja partida é deixada para cocultura com a cepa de Agrobacterium tumefaciens por 5 dias sobre meio de cocultura (Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel filtro.

[0022] Indução de broto. Depois de 5 dias de cocultura, as sementes de soja partidas são lavadas em meio de Indução de Broto (SI, Shoot Induction) líquido consistindo de sais de B5, vitaminas B5, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefo-taxime, e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7). As sementes de soja partidas são em seguida cultivadas sobre meio de Indução de Broto I (SI I) consistindo de sais de B5, vitaminas B5, 7 g/L de ágar Noble, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 50 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefo-taxime, 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7), com o lado liso do cotilédo-ne virado para cima e a extremidade nodal do cotilédone embutida no meio. Depois de 2 semanas de cultura, os explantes das sementes de soja partidas transformadas são transferidos para o meio de Indução de Broto II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glu-fosinato (LIBERTY®).

[0023] Alongamento do broto. Depois de 2 semanas de cultura sobre meio SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e um bloco de broto jateado contendo o eixo embrionário são excisados fazendo um corte na base do cotilédone. O bloco de broto isolado a par- tir do cotilédone é transferido para meio de Alongamento de Broto (SE, Shoot Elongation). O meio SE consiste em sais de MS, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 0,1 mg/L de IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de ribosídeo zeatina, 50 mg/L de TI-MENTIN™, 200 mg/L de cefotaxime, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato, 7 g/L de ágar Noble, (pH 5,7). As culturas são transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas são cultivadas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24° C com um foto-período de 18 h e, uma intensidade da luz de 80 a 90 pmol/m2sec.

[0024] Enraizamento. Brotos alongados os quais se desenvolveram a partir do bloco de broto de cotilédone são isolados cortando o broto alongado na base do bloco de broto de cotilédone, e mergulhando o broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido indol 3-butírico) por 1 a 3 minutos para promover o enraizamento. Em seguida, os brotos alongados são transferidos para meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 7 g/L de ágar Noble, pH 5,6) em bandejas phyta.

[0025] Cultura. Depois de cultura em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24° C, fotoperíodo de 18 h, por 1 a 2 semanas, os brotos os quais desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de sundae coberto e colocados em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dia longo (16 horas de iluminação /8 horas de escuridão) em uma intensidade luminosa de 120 a 150 pmol/m2seg sob temperatura (22°C) e umidade constantes (40 a 50%) para aclimatação das plântulas. As plântulas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes de serem transferidas para a estufa para aclimatação posterior e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[0026] Algumas 10 a 20 linhagens independentes de Glycine max T adicionais expressando dsRNA de hairpin para um construto de RNAi são obtidas para estímulo de BSB. dsRNA de hairpin pode ser derivado conforme estipulado em SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, ou de modo diverso compreendendo adicionalmente SEQ ID NO: 79. Estas são confirmadas através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. Preparações de RNA total de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para ligar no encadeador do cassete de expressão de hairpin em cada um dos construtos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA de hairpin em cada planta de Glycine max transgênica. Em seguida o processamento do hairpin de dsRNA dos genes alvo em siRNA é opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[0027] Além disso, moléculas de RNAi tendo sequências de incompatibilidade com mais de 80% de identidade de sequência com genes alvo afetam brocas da raiz do milho em um modo similar ao visto com moléculas de RNAi tendo 100% de identidade de sequência com os genes alvo. O pareamento de sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA de hairpin no mesmo construto de RNAi libera siRNAs processadas em planta capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento e a viabilidade da alimentação de pragas de hemípteros.

[0028] A liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miRNA correspondente aos genes alvo e a subsequente captação por pragas de hemípteros através de alimentação resulta em hiporregulação dos genes alvo na praga de hemípteros através de silenciamento genético mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento, e a reprodução da praga de hemípteros é afetada, e no caso de no mínimo um entre Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyo-morpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus ser-vus leva a insucesso para infestar, alimentar, desenvolver, e/ou reproduzir com êxito, ou leva à destruição da praga de hemípteros. A escolha de genes alvo e o sucesso da aplicação de RNAi é em seguida usado para controlar as pragas de hemípteros.

[0029] Comparação fenotípica de linhagens transgênicas de RNAi e Glycine max não transformada Genes ou sequências de pragas de hemípteros alvo selecionados para a criação de dsRNA de hairpin não têm similaridade com qualquer sequência genética de planta conhecida. Portanto não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos visando estes genes ou sequências de pragas de hemípteros venham a ter qualquer efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. No entanto, as características de desenvolvimento e morfológicas de linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformada, bem como as de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene expressando hairpin. As características das raízes, dos brotos, da follhagem e de reprodução das plantas são comparadas. Não existe nenhuma diferença observável no comprimento das raízes e nos padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. Características de brotos de plantes tais como altura, números e tamanhos de folhas, tempo de floração, tamanho floral e aspecto são similares. Em geral, não existem diferenças morfológicas observáveis entre linha- gens transgênico e as sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e em solo na estufa. Apesar da presente invenção poder ser suscetível a vários modificações e formas alternativas, modalidades específicas que foram descritas a título de exemplo em detalhes aqui, neste requerimento de patente. No entanto, deve ser entendido que a presente invenção não se destina a ser limitada às formas particulares reveladas. Ao invés, a presente invenção deve cobrir todas as modificações, os equivalentes, e as alternativas abrangidos pelo âmbito da presente invenção conforme definido pelas reivindicações anexadas que se seguem e seus equivalentes legais. EXEMPLO 15 Bioensaios de E. heros sobre dieta artificial [0030] Em testes de alimentação de dsRNA sobre dieta artificial, bandejas de 32 cavidades são configuradas com um pélete de ~18 mg de dieta artificial e água, como para experimentos de injeção (EXEMPLO 12). dsRNA em uma concentração de 200 ng/pl é adicionado ao pélete da amostra de alimento e água, 100 pl a cada uma de duas cavidades. Cinco ninfas de E. heros do 2o. instar são introduzidas dentro de cada cavidade. Amostras de água e dsRNA que visa transcripto de YFP são usadas como controles negativps. Os experimentos são repetidos em três dias diferentes. Os insetos sobreviventes são pesados e as taxas de mortalidade são determinadas depois de 8 dias de tratamento. EXEMPLO 16 Arabidopsis thaliana Transgênica Compreendendo Sequências de Praga de hemípteros [0031] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo um construto do gene alvo para formação de hairpin compreendendo segmentos de wupA (SEQ ID NO: 79) são gerados usando métodos moleculares de rotina similares ao EXEMPLO 4. É realizada transfor- mação por Arabidopsis usando procedimento à base de Agrobacterium de rotina. Sementes T são selecionadas com marcador selecionável de tolerância a glufosinato. Plantas de Arabidopsis T transgênicas são geradas e plantas transgênicas T2 homozigotos de cópia simples são geradas para estudos de insetos. São realizados bioensaios sobre plantas de Arabidopsis em crescimento com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados sobre cada planta e monitorados para so-brevida dentro de 14 dias.

[0032] Construção de vetores de transformação de Arabidopsis. Clones de entrada à base de um vetor de entrada abrigando um cons-truto de gene alvo para formação de hairpin compreendendo um segmento de wupA (SEQ ID NO: 79) são montados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizazdos (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular de rotina. Formação de hairpin intramolecular por transcriptos primários de RNA é facilitada arranjando (dentro de uma única unidade de transcrição) duas cópias de um segmento de gene alvo em orientações opostas, os dois segmentos sendo separados por uma sequência de encadeador (por exemplo, uma alça (loop) (tal como SEQ ID NO: 102) ou um íntron ST-LS1; Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Deste modo, o transcripto de mRNA primário contém as duas sequências de segmento genético wupA como grandes repetições invertidas uma da outra, separadas pela sequência de encadeador. Uma cópia de um promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493) é usada para acionar a produção do transcripto de hairpin de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' do Frame de Leitura Aberta 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; Patente dos Estados Unidos No. US 5.428.147) é usado para terminar a transcrição do gene de expressão de RNA de hairpin.

[0033] O clone de hairpin dentro de um vetor de entrada descrito acima é usado em reação de recombinação GATEWAY® de rotina com um vetor de destinação binário típico de modo a produzir vetores de transformação de expressão de RNA de hairpin para transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium.

[0034] O vetor de destinação binário compreende um gene de tolerância a herbicida, DSM-2v2 (Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2011/0107455), sob a regulação de um promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV Promotor v2, Patente dos Estados Unidos No. US 7601885; Verdaguer et al, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139). Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' do Frame de Leitura Aberta 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6; Huang et al, (1990) J. Bacteri-ol, 172:1814-1822) é usado para terminar a transcrição do mRNA de DSM2v2.

[0035] Um construto binário de controle negativo, o qual compreende um gene que expressa um RNA de hairpin de YFP, é construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® de rotina com um típico vetor de destinação binário e um vetor de entrada. O construto de entrada compreende uma sequência de hairpin de YFP sob o controle de expressão de um promotor de Ubiquitina de Arabidopsis 10 (conforme acima) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' de ORF23 de Agrobacterium tumefaciens (conforme acima).

[0036] Produção de Arabidopsis transgênico compreendendo RNAs de hairpin inseticida: transformação mediada por Agrobacterium. Plasmí-deos binários contendo sequências de hairpin são eletroporados em Agrobacterium cepa GV3101 (pMP90RK). Os clones de Agrobacterium recombinante são confirmados por análise de restrição de preparações de plasmídeos das colônias de Agrobacterium recombinante. Um kit Qiagen Plasmide Max Kit (Qiagen, Cat No. 12162) é usado para extrair plasmídeos a partir de culturas de Agrobacterium depois do protocolo recomendado pelo fabricante.

[0037] Transformação por Arabidopsis e Seleção de T1. Doze a quinze plantas de Arabidopsis (c.v. Columbia) são cultivadas dentro de potes de 4 polegadas ()10,16 cm) na estufa com intensidade da luz de 250 pmol/m2, a 2513, e condições de 18:6 horas de iluminação: escuridão. As hastes de flores primárias são aparadas uma semana antes da transformação. Os inóculos de Agrobacterium são preparados incubando 10 pL de estoque de glicerol de Agrobacterium recombinante em 100 ml de caldo LB (Sigma, L3022) +100 mg/L de Espectinomicina + 50 mg/L de Canamicina a 280 e agitação a 225 rpm por 72 horas. As células de Agrobacterium são colhidas e suspendidas em 5% de sacarose + 0,04% de Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat no. VIS-02) +10 pg/L de solução de benzamino purina (BA) até OD600 0,8 ~ 1,0 antes de imersão floral. As partes da planta acima do solo são mergulhadas na solução de Agrobacterium por 5 a 10 minutos, com delicada agitação. As plantas são em seguida transferidas para a estufa para crescimento normal com irrigação regular e fertilização até as sementes endurecerem. EXEMPLO 17 Crescimento e bioensaios de Arabidopsis transgênica.

[0038] Seleção de Arabidopsis T transformada com construtos de RNAi de hairpin. Até 200 mg de sementes T1 de cada transformação é estratificado em solução agarose a 0,1%. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (10,5 polegadas (26,67 cm) x 21 polegadas (53,34 cm) x 1 polegada (2,54 cm); T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN.) com meio sunshine no. 5. Os transformantes são selecionados para tolerância a Ignite® (glufosinato) a 280 g/ha em 6 e 9 dias depois do plantio. Eventos selecionados são transplantados para dentro de potes de 4 polegadas (10,16 cm) de diâmetro. É realizada análise de cópias de inserção dentro de uma semana de transplantação através de PCR Real-Time quantitativo por hidrólise (qPCR) usando Roche LightCycler480. Os iniciadores de PCR e as sondas de hidrólise são projetados contra o marcador selecionável DSM2v2 usando o programa LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche). As plantas são mantidas a 24°C, com um fotoperíodo de iluminação: escuridão de 16:8 horas sob luzes fluorescentes e incandescentes em intensidade de 100 a 150 mE/m2*s.

[0039] Bioensaio de alimentação de plantas E. heros. No mínimo quatro eventos de baixo número de cópias (1 a 2 inserções), quatro de número médio de cópias (2 a 3 inserções), e quatro de alto número de cópias (>4 inserções) são selecionados para cada construto. As plantas são cultivadas até um estágio de floração (as plantas contendo flores e vagens). A superfície do solo é coberta com um volume de ~ 50 ml de areia branca para fácil identificação dos insetos. São introduzidas cinco a dez ninfas do 2°. instar de E. heros sobre cada planta. As plantas são cobertas com tubos de plástico que têm 3 polegadas (7,62 cm) de diâmetro, 16 polegadas (40,64 cm) de altura, e com espessura da parede de 0,03 polegadas (0,08 cm) (Item No. 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de nylon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob condições normais de temperatura, luz, e rega em um conviron. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; são calculadas a percentagem de mortalidade bem como a inibição do crescimento (1 - tratamento de peso / controle de peso). As plantas expressando hairpin de YFP são usadas como controles.

[0040] Produção de sementes de Arabidopsis T? e bioensaios de T2. Semente T2 é produzida a partir de selecionado eventos de baixo número de cópias (1 a 2 inserções) para cada construto. Plantas (ho-mozigotos e/ou heterozigotos) são submetidas a bioensaio de alimentação de E. heros, conforme descrito acima. Semente T3 é colhida a partir de homozigotos e armazenadas para análise futura. EXEMPLO 18 Transformação de Espécies de Colheitas Adicionais [0041] Algodão é transformada com wupA (com ou sem um chlo-roplast transit peptide) de modo a proporcionar o controle de insetos hemípteros utilizando um método de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas previamente descritas no EXEMPLO 14 da Patente dos Estados Unidos No. US 7.838.733, ou no Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482. EXEMPLO 19 dsRNA WupA no Manejo de Insetos [0042] Os transgenes de dsRNA WupA são combinados com outras moléculas de dsRNA em plantas transgênicas de modo a proporcionar direcionamento de RNAi redundante e efeitos de RNAi sinérgi-cos. As plantas transgênicas incluindo, por exemplo, e sem limitação, milho, soja, e algodão expressando dsRNA que têm por alvo wupA são úteis para prevenir danos por alimentação por insetos coleópteros e hemípteros. Os transgenes de dsRNA WupA também são combinados em plantas com tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thurin-giensis para representar novos modos de ação em pirâmides genéticas de Manejo de Resistência a Insetos (N.T.: em inglês, Insect Resistance Management). Quando combinados com outras moléculas de dsRNA que têm por alvo pragas de insetos, e/ou com Bacillus thurin-giensis proteínas inseticidas, em uma plantas transgênicas, é observado um efeito inseticida sinérgico o qual também mitiga o desenvolvimento de populações de insetos resistentes.

[0043] Apesar da presente invenção poder ser suscetível a várias modificações e formas alternativas, foram descritas modalidades específicas a título de exemplo em detalhes aqui, neste requerimento de patente. No entanto, deve ser entendido que a presente invenção não se destina a ser limitada às formas particulares reveladas. Ao contrário, a presente invenção deve cobrir todas as modificações, equivalentes, e alternativas que estejam dentro do âmbito da presente invenção conforme definido pelas reivindicações anexadas que se seguem e seus equivalentes legais.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Ácido nucleico isolado compreendendo no mínimo um polinucleotídeo ligado operacionalmente a um promotor heterólogo, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 10; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 10; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 10; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 8; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 8; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 8; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência co- dificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 79; o complemento de SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 79; uma sequência codificante nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nu-cleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12.

3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, é caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e os complementos de qualquer uma das precedentes.

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado entre o grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar, e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

5. Vetor de transformação de planta caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA) caracterizada pelo fato de ser transcrita a partir do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

7. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo caracterizada pelo fato de ser produzida a partir da expressão do polinucleo-tídeo como definido na reivindicação 1.

8. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência de polinucleotídeos com um inseto coleóptero ou hemíp-tero inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeos endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.

9. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato da referida molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero destrói ou inibe o crescimento, a viabilidade, e/ou a alimentação do inseto.

10. Ácido ribonucleico (RNA) de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmentos de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA é ligado ao primeiro segmento de RNA pela segunda sequência de polinucleotídeos, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, de tal modo que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridizam quando transcritos em um ácido ribonucleico de modo a formar o RNA de filamento duplo.

11. Ácido ribonucleico (RNA) de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser selecionado entre o grupo que consiste em uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo e uma molécula de ácido ribonucleico de filamento único de entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.

12. Vetor de transformação de planta compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula de planta.

13. Célula caracterizada pelo fato de ser transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

14. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula procariótica.

15. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.

16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de planta.

17. Planta caracterizada pelo fato de ser transformada com o polinucleotídeo como deifnido na reivindicação 1.

18. Semente da planta como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o polinucleotí-deo.

19. Produto de base produzido a partir da planta como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto de base compreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo.

20. Planta de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato de que o no mínimo um polinucleotídeo é expressado na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

21. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de Zea mays.

22. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta é Zea mays.

23. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o no mínimo um polinucleotídeo é expressado na planta como uma molécula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar ao no mínimo um polinucleotídeo quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.

24. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende no mínimo um polinucleotídeo adicional que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene de inseto endógeno.

25. Vetor de transformação de planta caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 24, em que o um ou mais polinucleotídeos adicionais são, cada um, ligados operacionalmente a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta.

26. Método para controlar uma população de praga de co-leópteros ou de hemípteros, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona depois de contato com a praga para inibir uma função biológica dentro da praga, em que o RNA é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 101; o complemento de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 101; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 101; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 101; um transcripto de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 a 12, 79, e 81 a 83; o complemento de um transcripto de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 a 12, 79, e 81 a 83; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 a 12, 79, e 81 a 83; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 a 12, 79, e 81 a 83.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o RNA do agente é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 89 a 91; o complemento de SEQ ID NO: 91 a 93; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 89 a 91; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 89 a 91; um transcripto de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de um transcripto de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um trans-cripto de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de filamento duplo.

29. Método para controlar uma população de praga de co-leópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequências de polinucleotídeos que funcionam depois de contato com a praga de coleópteros para inibir uma função biológica dentro da praga de coleópteros, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma região que apresenta a partir de cerca de 90% até cerca de 100% de identidade de sequência até a partir de cerca de 15 até cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 97, e em que a primeira sequência de polinucleotídeos é especificamente hibridizada à segunda sequência de polinucleotídeos.

30. Método para controlar uma população de praga de he-mípteros, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequências de polinucleotídeos que funcionam depois de contato com a praga de hemípteros para inibir uma função biológica dentro da praga de hemípteros, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma região que apresenta a partir de cerca de 90% até cerca de 100% de identidade de sequência até a partir de cerca de 15 até cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 101, e em que a primeira sequência de polinucleotídeos é especificamente hibridizada à segunda sequência de polinucleotídeos.

31. Método para controlar uma população de praga de co-leópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar em uma planta hospedeira de uma praga de coleópteros uma célula de planta transformada compreendendo o poli-nucleotídeo como definido na reivindicação 2, em que o polinucleotí-deo é expressado de modo a produzir uma molécula de ácido ribonu-cleico que funciona depois de contato com uma praga de coleópteros pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga de coleópteros e resulta em reduzido crescimento e/ou sobrevida da praga de coleópteros ou população de pragas, em relação à reprodução da mesma espécie de praga sobre uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o poli-nucleotídeo.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a população de praga de coleópteros é reduzida em relação a uma população da mesma espécie de praga que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie da planta hospedeira que carece da célula de planta transformada.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população de praga de coleópteros é reduzida em relação a uma população de praga de coleópteros que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie que carece da célula de planta transformada.

35. Método de controlar infestação por pragas de coleópte-ros em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar na dieta de uma praga de coleópteros um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 89 a 97; o complemento de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 97; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 97; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleo-tídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 89 a 97; um transcripto de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um transcripto de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula de planta transformada para expressar o polinucleotídeo.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável é compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

38. Método de controlar infestação por pragas de hemípte-ros em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma praga de hemípteros com um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 98 a 101; o complemento de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 98 a 101; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 98 a 101; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma entre SEQ ID NOs: 98 a 101; um transcripto de SEQ ID NO: 79; o complemento de um transcripto de SEQ ID NO: 79; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de SEQ ID NO: 79; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de um transcripto de SEQ ID NO: 79.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o contato da praga de hemípteros com o RNA compreende pulverizar a planta com uma composição que compreende o RNA.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável é compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

41. Método para aprimorar a produção de uma colheita, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir o ácido nucleico como definido na reivindicação 1, em uma planta da colheita de modo a produzir uma planta da colheita transgênica; e cultivar a planta da colheita de modo a permitir a expressão do no mínimo um polinucleotídeo; em que a expressão do no mínimo um polinucleotídeo inibe a reprodução ou o crescimento da praga de insetos e a perda de produção devido à infecção por pragas de insetos, em que a planta da colheita é milho, soja, ou algodão.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a expressão do no mínimo um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime no mínimo um primeiro gene alvo em uma praga de insetos que tenha contatado uma porção da planta da colheita.

43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e os complementos de qualquer uma das precedentes.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a expressão do no mínimo um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime no mínimo um primeiro gene alvo em uma praga de insetos coleópteros que tenha contatado uma porção da planta de milho.

45. Método para produzir uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 1; cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de plantas compreendendo uma pluralidade de células de plantas transformadas; selecionar para células de plantas transformadas que tenham integrado o no mínimo um polinucleotídeo em seus genomas; triar as células de plantas transformadas para expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada pelo no mínimo um polinucleotídeo; e selecionar uma célula de planta que expressa o RNA.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado entre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nu-cleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12; um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12; e o complemento de um fragmento de no mínimo 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo de Diabrotica compreendendo qualquer uma entre SEQ ID NOs: 7 a 12.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo.

48. Método para produzir planta transgênica protegida contra uma praga de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar a célula de planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 46; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada pelo no mínimo um polinucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros que contata a planta transformada.

49. Método para produzir uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo um meio para proporcionar proteção contra pragas de coleópte-ros a uma planta; cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de plantas compreendendo uma pluralidade de células de plantas transformadas; selecionar para células de plantas transformadas que tenham integrado os meios para proporcionar proteção contra pragas de coleópteros a uma planta em seus genomas; triar as células de plantas transformadas para expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros; e selecionar uma célula de planta que expressa os meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros.

50. Método para produzir uma planta transgênica protegida contra uma praga de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar a célula de planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 49; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de coleópteros que contata a planta transformada.

51. Método para produzir uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo um meio para proporcionar proteção contra pragas de hemípte-ros a uma planta; cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de plantas compreendendo uma pluralidade de células de plantas transformadas; selecionar para células de plantas transformadas que tenham integrado os meios para proporcionar proteção contra pragas de hemípteros a uma planta em seus genomas; triar as células de plantas transformadas para expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros; e selecionar uma célula de planta que expressa os meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípte-ros.

52. Método para produzir uma planta transgênica protegida contra uma praga de hemípteros, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar a célula de planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 51; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de hemípteros que contata a planta transformada.

53. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende um polinucleotí-deo codificando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um poli-peptídeo PIP-1.

54. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado entre um grupo compreendendo Cry3, Cry34, e Cry35.

55. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1.

56. Célula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado entre um grupo compreendendo Cry3, Cry34, e Cry35.

57. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1.

58. Planta de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado entre um grupo compreendendo Cry3, Cry34, e Cry35.

59. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula de planta transformada compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado entre um grupo compreendendo Cry3, Cry34, e Cry35.