BR112017007085B1 - Moléculas de ácido nucleico subunidade copi coatomer gama que confere resistência a pragas de coleóptero e hemípteros - Google Patents

Abstract

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO SUBUNIDADE COPI COATOMER GAMA QUE CONFERE RESISTÊNCIA A PRAGAS DE COLEÓPTERO E HEMÍPTEROS. Esta divulgação se refere a moléculas de ácido nucleico e a métodos de utilização das mesmas para o controle de pragas de insetos através de inibição mediada por RNA interferente de sequências codificadoras de alvo e não codificadas transcritas em pragas de insetos, incluindo pragas de coleópteros e/ou hemipteros. A divulgação também diz respeito a mpetodos para fabricar plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos, e as celulas vegetais e plantas obtidas deste modo.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] Este pedido reivindica o benefício da data do depósito do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano Serial No. US 62/063192, depositado em 13 de outubro de 2014, para “COPI Coatomer Gama Subunit Nucleic Acid Molecules that Confer Resistance to Coleópteran and Hemipteran Pests”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se refere, de uma forma geral, ao controle genético de danos nas plantas causados por pragas de insetos (por exemplo, pragas de coleópteros e pragas de hemípteros). Em concretizações particulares, a presente invenção se refere à identificação de polinucleotídeos codificantes e não codificantes de alvos e, o uso de tecnologias de DNA recombinante para pós- transcricionalmente reprimir ou inibir a expressão de polinucleotídeos codificantes e não-codificantes de alvos nas células de uma praga de insetos a proporcionar um efeito protetor para a planta.

ANTECEDENTES DA INCENÇÃO

[0003] O verme da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera LeConte, é uma das espécies de larva de besouro mais devastadores na América do Norte e é uma preocupação especial em áreas produtoras de milho do Meio- Oeste dos Estados Unidos. O verme da raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica Barberi Smith And Lawrence, é uma espécie estreitamente relacionada que co-habita a maior parte da mesma área do WCR. Existem várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: o verme da raiz do milho mexicano (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; o verme da raiz do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. tenella undecimpunctata; D. speciosa Germar; e D. L. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos estima que vermes da raiz do milho causam US $ 1 bilhão em receitas perdidas a cada ano, incluindo US $ 800 milhões em perda de produtividade e US $ 200 milhões em custos de tratamento.

[0004] Ambos WCR e NCR são depositados no solo como ovos durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante o inverno. Os ovos são oblongos, brancos, e menores que 0,004 polegadas em comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou início de junho, com a data precisa de eclosão do ovo que varia de ano para ano devido a diferenças de temperatura e localização. As larvas recém-nascidas são vermes brancos que são menos do que 0,125 polegadas de comprimento. Uma vez eclodidas, as larvas começam a se alimentar de raízes de milho. Vermes da raiz do milho passam por três estágios larvais. Após alimentação durante várias semanas, as larvas mudam para a fase de pupa. Elas tornam-se pupa no solo, e então elas emergem do solo como adultos em julho e agosto. Vermes da raiz adultos são cerca de 0,25 polegadas de comprimento.

[0005] O desenvolvimento completo da larva do verme da raiz no milho e várias outras espécies de gramíneas. Larvas criadas em foxtail amarelo surgem mais tarde e têm um tamanho da cápsula cabeça menor que os adultos do que larvas criadas em milho (Ellsbury et al (2005) Environ Entomol 34: 627-634). Os adultos WCR alimentam de seda de milho, pólen e grãos em pontas da espiga expostas. Se os adultos WCR surgem antes dos tecidos reprodutivo do milho estarem presentes, eles podem alimentar-se do tecido foliar, atrasando, assim, o crescimento da planta e, ocasionalmente, matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos vão mudar rapidamente para sedas preferenciais e pólen quando eles se tornam disponíveis. Os adultos NCR também se alimentam de tecidos reprodutivos da planta de milho, mas em contraste raramente se alimentam de folhas de milho.

[0006] A maioria dos danos da raiz do milho pelo verme é causada pela alimentação das larvas. Verme da raiz recém- nascidos inicialmente alimentam-se de pêlos radiculares finos de milho e enterram-se na ponta da raiz. Como as larvas crescem, eles se alimentam e se enterram nas raízes primárias. Quando larvas da raiz do milho são abundantes, a alimentação das larvas muitas vezes resulta na poda de todas as raízes ao caminho até à base da haste do milho. Grave lesão da raiz interfere com a capacidade das raízes para o transporte de água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento das plantas, e resulta na produção reduzida de grãos, assim, muitas vezes, reduzindo drasticamente o rendimento global. A lesão grave da raiz também muitas vezes resulta na produção reduzida de grãos, o que torna a colheita mais difícil e diminui ainda mais o rendimento. Além disso, a alimentação de adultos sobre os tecidos reprodutivos de milho pode resultar na poda das sedas na ponta da espiga. Se este “corte de seda” é grave o suficiente durante a vertente do pólen, a polinização pode ser interrompida.

[0007] O controle das larvas da raiz do milho pode ser tentado por rotação de culturas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, bactéria gram-positiva formadoras de esporos, Bacillus thuringiensis (Bt)), plantas transgênicas que expressam toxinas Bt, ou uma combinação dos mesmos. A rotação de culturas sofre da desvantagem significativa de colocar restrições indesejáveis sobre o uso de terras agrícolas. Além disso, a oviposição de algumas espécies de vermes da raiz pode ocorrer em outras culturas do que a do milho ou diapausas estendidas resultam na eclosão de ovos sob vários anos, mitigando, assim, a eficácia da rotação de culturas de campos de cultivo praticado com milho e soja.

[0008] Os inseticidas químicos são os mais fortemente invocados para estratégia para alcançar o controle do verme da raiz do milho. O uso de inseticidas químicos, porém, é uma estratégia de controle de larva de besouro imperfeita; US $ 1 bilhão podem ser perdidos nos Estados Unidos a cada ano devido ao verme da raiz do milho, quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos dos danos do verme da raiz que podem ocorrer não obstante a utilização de inseticidas. As populações elevadas de larvas, as fortes chuvas e aplicação indevida do inseticida (s) podem todos resultar no controle de larva de verme da raiz do milho inadequado. Além disso, a utilização contínua de inseticidas pode selecionar cepas de vermes de raiz resistentes a inseticida, bem como suscitar preocupações ambientais significativas, devido à toxicidade de muitos deles para espécies não alvo.

[0009] Percevejos e outros insetos hemípteros (Heteroptera) compreendem um outro complexo de praga agrícola importante. Em todo o mundo mais de 50 espécies estreitamente relacionadas de percevejos são conhecidas por causar danos às culturas. McPherson & McPherson (2000) Percevejos de importância econômica na América do Norte do México, CRC Press. Esses insetos estão presentes em um grande número de culturas importantes, incluindo o milho, a soja, frutas, legumes e cereais.

[0010] os percevejos passam por várias fases de ninfa antes de atingir a fase adulta. O tempo para se desenvolver a partir de ovos para adultos é de cerca de 30 - 40 dias. Ambas as ninfas e adultos se alimentam de seiva de tecidos moles na qual eles também injetam enzimas digestivas que causam digestão do tecido extra-oral e necrose. O material vegetal digerido e os nutrientes são em seguida ingeridos. Depleção de água e nutrientes a partir do sistema vascular da planta resulta em danos nos tecidos da planta. Danos para o desenvolvimento de sementes e grãos é o mais significativo, conforme a produção e germinação são significativamente reduzidos. Várias gerações ocorrem em climas quentes resultando em uma pressão significativa de inseto. A gestão atual dos percevejos depende do tratamento do inseticida em uma base individual de campo. Portanto, estratégias de gestão alternativa são urgentemente necessárias para minimizar as perdas de culturas em curso.

[0011] RNA interferente (RNAi) é um processo que utiliza vias celulares endógenas, em que uma molécula de RNA interferente (iRNA) (por exemplo, uma molécula de RNA de cadeia dupla (dsRNA)) que é específica para todos, ou qualquer porção de tamanho adequado de uma sequência de gene alvo resulta na degradação do RNAm codificado desse modo. Nos últimos anos, RNAi foi usado para executar gene “knockdown” em um certo número de espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, insetos, embriões e células em cultura de tecidos. Ver, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806 - 811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563 - 574; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737 - 747.

[0012] RNAi realiza a degradação do RNAm por meio de uma via endógena incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de cerca de 20 nucleotídeos, denominadas pequenos RNA interferente (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de cadeia única: a cadeia de passagem e a cadeia guia. A cadeia de passagem é degradada, e a cadeia de guia está incorporada no complexo de silenciamento (RISC) induzido por RNA.

[0013] A Patente US 7,612,194 e a Publicação dos pedidos de Patente US Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 divulgam uma biblioteca de 9112 sequências expressas de sequência de marcador (EST) isolada a partir de pupa de D. v. Virgifera LeConte. É sugerido na Patente US 7,612,194 e publicação do pedido de Patente US No. 2007/0050860 para operativamente ligar a um promotor de uma molécula de ácido nucleico que é complementar de uma das várias sequências parciais determinadas de D. v. Virgifera de tipo vacuolar H + -ATPase (V-ATPase) nela divulgado para a expressão de RNA anti-sentido em células vegetais. A Publicação do pedido Patente dos Estados Unidos No. 2010/0192265 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. Virgifera de função desconhecida e não revelado (a sequência parcial é indicado para ser 58% idêntica ao produto do gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA anti-sentido em células vegetais. A Publicação do pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2011/0154545 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes de D. v. Virgifera de subunidade coatomer gama para a expressão de RNA anti-sentido em células vegetais. Além disso, a patente US 7,943,819 divulga uma biblioteca de 906 sequência de sequencias de marcador expressas isoladas de D. v. Virgifera LeConte, larvas, pupas e intestino médio foram dissecados e sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma determinada a sequência parcial de um D. v. virgifera carregado pela proteína corporal multivesicular gene 4b para a expressão de RNA de cadeia dupla em células vegetais.

[0014] Nenhuma outra sugestão é fornecida na Patente US 7,612,194, e Publicação do pedido de Patente US Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 para uso de qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências neles e enumeradas para RNA interferente, outras que as várias sequências parciais determinadas de V-ATPase e as sequências parciais de genes específicos de função desconhecida. Além disso, nenhuma das Patentes US 7,612194, e das publicações dos pedidos de Patente US Nos. 2007/0050860 e 2010/0192265, e 2011/0154545 fornece qualquer orientação a respeito de que outro das mais de nove mil sequências proporcionadas seria letal, ou mesmo de outra forma útil nas espécies de vermes das raízes do milho quando usado como RNAds ou RNAsi. A Patente norte-americana US 7,943,819 não fornece qualquer sugestão de utilizar qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências nele enumeradas por RNA interferente, com exceção da sequência parcial particular de um gene 4b da proteína corporal multivesicular. Além disso, a patente US 7,943,819 não fornece nenhuma orientação quanto ao qual outra das mais de novecentas sequências proporcionadas seria letal, ou mesmo de outra forma útil, em espécies do verme da raiz do milho quando usado como dsRNA ou siRNA. A Publicação do Pedido de Patente US No. US 2013/040173 e a publicação do pedido PCT N° WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada de um gene Snf7 de Diabrotica virgifera para RNA interferente em relação ao milho. (Também divulgado na Bolognesi et al (2012) PLOS ONE 7 (10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534).

[0015] A esmagadora maioria das sequências complementares ao DNAs do verme da raiz de milho (tal como o anterior) não fornecem um efeito protetor da planta a partir de espécies de vermes das raízes do milho quando usado como RNAsd ou RNAsi. Por exemplo, Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322 - 1326 descreve os efeitos de inibição de vários genes alvos WCR por RNAi. Estes autores relataram que 8 dos 26 genes-alvo que eles testaram não foram capazes de fornecer experimentalmente mortalidade significativa a praga de coleópteros a uma concentração de iRNA muito alta (por exemplo, RNAds) de mais do que 520 ng/cm2.

[0016] Os autores da Patente US 7,612,194 e publicação do pedido de Patente norte-americano US 2007/0050860 feito o primeiro relatório de RNAi in planta nas plantas de milho alvejando a larva da raiz de milho ocidental. Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Estes autores descrevem uma alta taxa de transferência in vivo em sistema de RNAi dietéticos para rastrear genes alvos potenciais para o desenvolvimento de milho RNAi transgênico. De um grupo de gene iniciais de 290 alvos, apenas 14 apresentaram potencial de controle larval. Um dos RNAs dupla-fita mais eficazes (dsRNA) tem como alvo um gene que codifica subunidade A da ATPase vacuolar (V-ATPase), resultando em uma rápida supressão do RNAm endógeno correspondente e desencadeando uma resposta específica de RNAi com baixas concentrações de RNAds. Assim, estes autores documentaram pela primeira vez que o potencial de RNAi in planta como uma possível ferramenta de gestão de pragas, enquanto demonstraram simultaneamente que os alvos eficazes não puderam ser identificados de forma precisa, a priori, mesmo a partir de um conjunto relativamente pequeno de genes candidatos. SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[0017] São aqui reveladas moléculas de ácido nucleico (p. e., genes alvo, DNA, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs), e métodos de utilização das mesmas para o controle de pragas de insetos, incluindo, por exemplo, pragas de coleópteros, tais como D. v virgifera LeConte (verme da raiz do milho ocidental, “WCR.”); D. barberi Smith e Lawrence (verme da raiz do milho do norte, “NCR”); D. L. howardi Barber (verme da raiz do milho do sul, “SCR”); D. v. zeae Krysan e Smith (verme da raiz do milho mexicano, “MCR”); D. balteata LeConte; D. L. tenella; D. speciosa Germar; D. L. undecimpunctata Mannerheim e pragas hemípteros, como Euschistus heros (Fabr.) (percevejo marrom neotropical “BSB”); E. servus (Say) (percevejo marrom); Nezara viridula (L.) (percevejo verde); Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo-verde-pequeno-da-soja); Halyomorpha halys SStâl) (percevejo marrom); Chinavia hilare (Say) (percevejo verde); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.) (percevejo pardo); Horcias nobilellus (Berg) (percevejo do algodão); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guerin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Western Tarnished Plant Bug); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois). Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico exemplificativas são divulgadas que podem ser homólogas a, pelo menos uma porção de um ou mais ácidos nucleicos nativos de uma praga de insetos.

[0018] Nestes e em outros exemplos, o ácido nucleico nativo pode ser um gene alvo, o produto do qual pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento larval / ninfa. Em alguns exemplos, a inibição pós-tradução da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo homólogo do mesmo, pode ser letal em coleópteros e hemípteros ou pragas, ou resultar em crescimento e ou a redução do desenvolvimento da mesma. Em exemplos específicos, um gene que consiste na subunidade gama do complexo de proteína de revestimento (aqui referida como subunidade COPI gama e COPI gama) podem ser selecionados como um gene alvo para silenciamento pós-transcricional. Em exemplos particulares, um gene alvo útil para a inibição pós- transcricional é o novo gene aqui referidos como COPI gama. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos de COPI gama (SEQ ID NO: l e SEQ ID NO: 87); o complemento de COPI gama (SEQ ID NO: l e SEQ ID NO: 87); e fragmentos de qualquer um dos anteriores está, por conseguinte, aqui revelado.

[0019] Também são reveladas moléculas de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto do gene-alvo (por exemplo, o produto de um gene conhecido como COPI gama). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 88 (proteína COPI gama). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de COPI gama. São ainda reveladas moléculas de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo que é o complemento reverso de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto do gene alvo.

[0020] Também são descritos os polinucleotídeos de cDNA que podem ser utilizados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, RNAsd, siRNA, miRNA, shRNA, e RNAhp) que são complementares a todo ou parte de um gene alvo de praga de coleópteros e/ou hemíptero, por exemplo: COPI gama. Em concretizações particulares, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, as moléculas de cDNA que são divulgadas podem ser utilizadas para produzir moléculas de iRNA que sejam complementares a todos ou parte dos COPI gama (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 87).

[0021] São ainda revelados meios para a inibição da expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemíptero, e meios para proporcionar resistência às pragas de coleópteros e/ou hemíptero a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemíptero é uma molécula de RNA de cadeia simples ou cadeia dupla que consiste em, pelo menos, uma de SEQ ID NO: 3 (região 1 da COPI gama de Diabrotica, é aqui por vezes referida como COPI gama reg 1) ou SEQ ID NO: 4 (região 2 da COPI gama de Diabrotica, aqui por vezes referida como COPI gama reg 2), ou SEQ ID NO: 5 (região 3 da COPI gama de Diabrotica, é aqui por vezes referida como COPI gama reg 3), ou SEQ ID NO: 75 (versão 1 da COPI gama de Diabrotica, é aqui por vezes referido como COPI gama ver1), ou SEQ ID NO: 76 (versão 2 da COPI gama de Diabrotica, aqui por vezes referida como COPI gama ver2), ou SEQ ID NO : 77 (versão 3 da COPI gama de Diabrotica, é aqui por vezes referida como COPI gama ver3), ou SEQ ID NO: 78 (versão 4 da COPI gama de Diabrotica, é aqui por vezes referida como COPI gama ver4), ou SEQ ID NO: 89 (versão 2 da COPI gama de Euschistus heros, aqui por vezes referida como BSB_COPI gama-2), ou o seu complemento. Os equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleóptero e/ou hemíptero incluem moléculas de RNA de cadeia simples ou cadeia dupla que são substancialmente homólogos a todo ou parte de um gene WCR ou BSB compreendendo SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87. Um meio para proporcionar resistência às pragas de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros operativamente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta de milho ou de soja. São revelados métodos para controlar uma população de uma praga de insetos (por exemplo, pragas de coleópteros e hemípteros), compreendendo o fornecimento de uma praga de insetos (por exemplo, um coleópteros ou pragas hemíptero) um iRNA (por exemplo, RNAcd, RNAsi, RNAsh, miRNA, e RNAhp) molécula que funciona mediante a ser absorvido pela praga para inibir uma função biológica na pragas, em que a molécula de iRNA compreende a totalidade ou parte de uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 89; o complemento de SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 89; uma sequência nativa de codificação de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) ou organismo hemíptero (por exemplo BSB) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 89; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75 , SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 89; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativo compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID N °: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 89; e o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativo compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 89.

[0022] Também são aqui descritos métodos em que o RNAsd, siRNAs, miRNAs, shRNAs e/ou hpRNAs pode ser fornecido a uma praga de coleópteros e/ou hemíptero em um ensaio à base de dieta, ou em células vegetais geneticamente modificadas que expressam os dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e/ou hpRNAs. Nestes e em outros exemplos, os sRNAds's, siRNAs, miRNAs, shRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas de pragas de Coleóptera e/ou ninfa de hemíptero. Ingestão de dsRNAs, siRNA, miRNAs, shRNAs e/ou hpRNAs da invenção podem, em seguida, resultar em RNAi nas larvas/ninfa, que por sua vez pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade de coleópteros e/ou pragas hemíptero e levando finalmente, a larval mortalidade/ninfa. Assim, os métodos são descritos em que as moléculas de ácido nucleico compreendendo sequência de ácido nucleico exemplificativa (s) úteis para o controle de pragas de coleópteros e/ou hemípteros são fornecidos a uma praga de coleópteros e/ou hemíptero. Em exemplos particulares, as pragas de coleóptero e/ou pragas hemíptero controlam através da utilização de moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata, D. L. tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, Euschistus heros, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia Hilare, C. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobitellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e/ou Lygus lineolaris.

[0023] O acima exposto e outras características irão tornar-se mais evidentes a partir da descrição detalhada seguinte de diversas concretizações, que prossegue com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] A FIG. 1 inclui uma descrição da estratégia utilizada para gerar RNAds a partir de dois modelos de transcrição com um único par de iniciadores.

[0025] A FIG. 2 inclui uma descrição da estratégia utilizada para gerar RNAsd a partir de dois modelos de transcrição.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0026] As sequências de ácidos nucleicos listadas na Listagem de sequência em acompanhamento são mostradas usando abreviaturas padrão de letras para bases de nucleotídeos, tal como definido no 37 CFR § 1.822. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listados definem moléculas (isto é, os polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) com os monômeros de nucleotídeos e de aminoácidos arranjados da maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listados também definem cada um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeos e de aminoácidos arranjados da maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, deverá entender-se que uma sequência de nucleotídeos, incluindo uma sequência de codificação também descreve o género de polinucleotídeos que codificam o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Será ainda entendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero de ORFs polinucleotídeo que codifica esse polipeptídeo.

[0027] Apenas uma cadeia de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a cadeia complementar é compreendida como incluída por qualquer referência à cadeia exibida. Como o complemento e complemento inverso de uma sequência de ácido nucleico primária são necessariamente reveladas pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de uma sequência de ácido nucleico são incluídos por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a menos que seja explicitamente indicado para ser de outra forma (ou, é claro de ser de outro modo a partir do contexto em que aparece a sequência). Além disso, tal como é entendido no estado da técnica que a sequência de nucleotídeos de uma cadeia de RNA é determinada pela sequência do DNA a partir do qual foi transcrito (mas, para a substituição de nucleobases de uracila (U) para a timina (T)), uma sequência de RNA está incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de Sequências em anexo: SEQ ID NO: l mostra uma sequência de DNA compreendendo a subunidade COPI gama de Diabrotica virgifera.

[0028] A SEQ ID NO: 2 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína COPI gama de Diabrotica virgifera.

[0029] A SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA de COPI gama reg1 (região 1) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extremidades 5' e 3' não são mostradas).

[0030] A SEQ ID NO: 4 mostra uma sequência de DNA de COPI gama reg2 (região 2) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extreminadas 5' e 3' não são mostradas).

[0031] A SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA de COPI gama reg3 (região 3) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extreminadas 5’ e 3’ não são mostradas).

[0032] A SEQ ID NO: 6 mostra uma sequência de DNA de um promotor T7 de fago.

[0033] A SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de DNA de um segmento de região de codificação YFP que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extreminadas 5’ e 3’ não são mostradas).

[0034] SEQ ID Nos: 8 a 13 ilustram os iniciadores utilizados para amplificar porções de uma sequência da subunidade COPI gama de Diabrotica virgifera compreendendo COPI gama reg1, COPI gama reg2, e COPI gama reg3.

[0035] A SEQ ID NO: 14 apresenta uma sequência de formação-RNA-V3 grampo (hairpin) COPI gama de Diabrotica virgifera como encontrada no pDAB117221. As bases maiúsculas são cadeias COPI senso, as bases minúsculas compreendem um íntron ST-LS 1, as bases minúsculas não sublinhadas são cadeias COPI gama anti-senso.CGACCTCCTCCGGTGTCTAGAGAAGAAAACTTCGCCGAAAAACTTAGTAACGTTCCGGGTAT ACAACAGTTAGGACCTTTGTTCAAAACTTCCGACGTCGTTGAACTCACgactagtaccggtt gggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtag taatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgctttt ctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatgg tgatgtgcaggttgatccgcggttagtgagttcaacgacgtcggaagttttgaacaaaggtc ctaactgttgtatacccggaacgttactaagtttttcggcgaagttttcttctctagacacc ggaggaggtcg

[0036] A SEQ ID NO: 15 apresenta uma sequência COPI hairpin gama V4-RNA-formação de Diabrotica virgifera como encontrado no AOR 117222. As bases maiúsculas são cadeias COPI gama senso, as bases minúsculas sublinhadas compreendem um intron ST-LS 1, as bases minúsculas não-sublinhadas são cadeias COPI gama anti-senso.AGTTGCACTATAACGAAACCGGTACCACATATGTAGTAGTTAAGTTGCCTGATGATGATCT CCCCAACTCTGTTGGTACGTGTGGAGCCGTGTTGAAGTTCTTAGTGAAAGATTGTGATCCA TCAACGGGAATACCAGATTCTGATGAGGGTTACGATGATGAATATACACTGGAAGACATCG AAATAACATTAGGGGAC gactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttg atatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaa aataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaa tttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttagt cccctaatgttatttcgatgtcttccagtgtatattcatcatcgtaaccctcatcagaatc tggtattcccgttgatggatcacaatctttcactaagaacttcaacacggctccacacgta ccaacagagttggggagatcatcatcaggcaacttaactactacatatgtggtaccggttt cgttatagtgcaact

[0037] A SEQ ID NO: 16 mostra uma sequência V2 de formação-RNA-grampo de YFP como encontrado no pDAB110853. As bases maiúsculas são cadeias senso YFP, as bases sublinhadas compreendem um intron ST-LS1, as bases minúsculas não sublinhadas são cadeias anti-senso YFP.ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAA TGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGg actagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattat cactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatat agctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatat gaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttactttcccactgaggcatctccgta gcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaag gaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat.

[0038] A SEQ ID NO: 17 mostra uma sequência compreendendo um íntron ST-LS 1.

[0039] A SEQ ID NO: 18 mostra uma proteína de sequência de codificação de YFP como encontrado em pDAB101556.

[0040] A SEQ ID NO: 19 mostra uma sequência de DNA da região Anexina 1.

[0041] A SEQ ID NO: 20 mostra uma sequência de DNA da região Anexina 2.

[0042] A SEQ ID NO: 21 mostra uma sequência de DNA da região Beta espectrina 21.

[0043] A SEQ ID NO: 22 mostra uma sequência de DNA da região Beta espectrina 22.

[0044] A SEQ ID NO: 23 mostra uma sequência de DNA da região 1 mtRP-1-4.

[0045] A SEQ ID NO: 24 mostra uma sequência de DNA da região 2 mtRP-1-4.

[0046] A SEQ ID NOs: 25 a 52 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as regiões do gene de YFP, anexina, Beta 2 espectrina, e PGM-L4 para a síntese de RNAcd.

[0047] A SEQ ID NO: 53 mostra uma sequência de DNA de milho que codifica uma proteína TIP41 semelhante.

[0048] A SEQ ID NO: 54 mostra uma sequência de DNA de oligonucleotídeo T20NV.

[0049] As SEQ ID NOs: 55 e 59 mostram sequências de primers e sondas utilizadas para medir os níveis de transcrição de milho.

[0050] A SEQ ID NO: 60 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região de codificação SpecR utilizada para a detecção vetor da estrutura binária.

[0051] A SEQ ID NO: 61 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região de codificação AAD1 utilizada para análise de número de cópia genômica.

[0052] SEQ ID NO: 62 mostra uma sequência de DNA de um gene de invertase de milho.

[0053] SEQ ID NOs: 63 e 71 mostra as sequências de demonstração de primers e sondas utilizados para o número de cópias do gene analiso.

[0054] SEQ ID NOs: 72 a 74 mostram as sequências de iniciadores e sondas utilizados para análise de expressão de milho.

[0055] A SEQ ID NO: 75 mostra uma sequência de DNA de COPI gama ver1 (versão 1) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não são mostradas).

[0056] A SEQ ID NO: 76 mostra uma sequência de DNA de COPI gama ver2 (versão 2) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não são mostradas).

[0057] A SEQ ID NO: 77 mostra uma sequência de DNA de COPI gama ver3 (versão 3) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não são mostradas).

[0058] A SEQ ID NO: 78 mostra uma sequência de DNA de COPI gama vers4 (versão 4) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não são mostradas).

[0059] As SEQ IDs NO: 79 - 86 mostram iniciadores utilizados para amplificar porções de uma sequência COPI gama de Diabrotica virgifera compreendendo COPI gama ver1, COPI gama ver2, COPI gama ver3 e COPI gama ver4.

[0060] A SEQ ID NO: 87 mostra uma sequência de DNA exemplificativa da transcrição BSN COPI gama de um percevejo marrom neotropical (Euschistus Heros).

[0061] A SEQ ID NO: 88 mostra uma sequência de aminoácidos de uma proteína COPI gama de Euschistus heros.

[0062] A SEQ ID NO: 89 mostra uma sequência de DNA de BSB_COPI gama-2 de Euschistus heros que foi utilizada para a síntese in vitro de dsRNA (sequências do promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não são mostradas).

[0063] As SEQ IDs NO: 90 - 91 mostram iniciadores utilizados para amplificar as porções de uma sequência COPI gama de Euschistus heros compreendendo BSB_COPI gama-2.

[0064] A SEQ ID NO: 92 é a cadeia senso de dsRNA YFP- alvejado: YFPv2.

[0065] As SEQ IDs NO: 93 - 94 mostram iniciadores utilizados para amplificar porções de um sdRNA-YFP-alvejado: YFPv2.

[0066] A SEQ ID NO: 95 apresenta sequência grampo-YFP (YFP V2-l). As bases maiúsculas são cadeia senso YFP, as bases minúsculas sublinhadas compreendem um íntron RTM1, as bases minúsculas não sublinhadas são cadeias anti-senso YFP.ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAA TGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGt ccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttct ccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataa cttaatatgtgatttggacccagcagatagagctcattactttcccactgaggcatctccgt agcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaa ggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral das várias concretizações

[0067] São aqui descritos métodos e composições para controle genético de infestações por pragas de insetos (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptero). Os métodos para identificar um ou mais gene (s) essencial para o ciclo de vida de uma praga de insetos para utilização como um gene alvo para o controle de RNAi-mediada de uma população de pragas de insetos também são fornecidos. Os vetores plasmídicos de DNA que codificam para uma molécula de RNA podem ser concebidos para suprimir um ou mais gene (s) alvo essencial para o crescimento, a sobrevivência e/ou desenvolvimento. Em algumas concretizações, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas concretizações são proporcionados métodos para a repressão transcricional de pós-expressão ou a inibição de um gene alvo por meio de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma codificação ou uma sequência não codificante do gene alvo em uma praga de insetos. Nestas e outras concretizações, uma praga pode ingerir uma ou mais moléculas de sdRNA, RNAsi, RNAsh, miRNA, e/ou RNAhp transcrito a partir de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma codificação ou uma sequência não codificante de um gene alvo, proporcionando, assim, um efeito fitossanitário.

[0068] Assim, algumas concretizações envolvem a inibição sequência-específica de expressão de produtos de genes alvo, utilizando iRNA (por exemplo, RNAsd, RNAsi, RNAsh, miRNA e/ou RNAhp) que seja complementar a codificação e/ou sequências não-codificantes de gene (s) alvo a atingir, pelo menos, o controle parcial de um inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero) de pragas. Descreve-se um conjunto de moléculas de ácido nucleico isolada e purificada compreendendo um polinucleotídeo, por exemplo, como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 e seus fragmentos. Em algumas concretizações, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir desta sequência, os seus fragmentos, ou um gene compreendendo uma destas sequências para o silenciamento pós-transcricional ou inibição de um gene alvo. Em certas concretizações, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: l. Em outras concretizações, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 3. Em ainda outras concretizações, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 4. Em outras concretizações, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 5. Em ainda outras concretizações, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, ou SEQ ID NO: 89.

[0069] Algumas concretizações envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula vegetal) que tem no seu genoma, pelo menos um DNA recombinante codificando, pelo menos, uma molécula (s) de iRNA (por exemplo, sdRNA). Em concretizações particulares, a molécula (s) de sdRNA pode ser produzida quando ingerida por uma praga de coleóptero e/ou de hemíptero pós-transcricionalmente silencia ou inibe a expressão de um gene alvo na praga. O DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, ou SEQ ID NO: 89; fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, ou SEQ ID NO: 89; ou uma sequência parcial de um gene que compreende um ou mais das SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 87, ou SEQ ID NO: 89 ou os seus complementos.

[0070] Algumas concretizações envolvem uma célula hospedeira recombinante que tem no seu genoma um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula (s) de iRNA (por exemplo, sdRNA) que compreende a totalidade ou parte de um RNA codificado pela SEQ ID NO: l e/ou ID SEQ NO: 87 e/ou os seus complementos. Quando ingerida por um inseto (por exemplo, praga de Coleóptera e/ou hemíptero), a molécula (s) de iRNA pode silenciar ou inibir a expressão de um gene-alvo que compreende a SEQ ID NO: l e/ou ID SEQ NO: 87, nas pragas de coleópteros e/ou hemípteros, e, assim, resultar na parada do crescimento, desenvolvimento, e/ou a alimentação nas pragas de coleópteros e/ou hemíptero.

[0071] Em algumas concretizações, uma célula hospedeira recombinante que tem no seu genoma, pelo menos, um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de sdRNA pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas concretizações envolvem plantas transgênicas compreendendo uma tal célula vegetal transformada. Em adição a tais plantas transgênicas, as progênies de plantas de qualquer geração transgênica da planta, sementes transgênicas, e produtos vegetais transgênicos são fornecidos, cada um dos quais compreende DNA recombinante (s). Em concretizações particulares, uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de sdRNA pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Por conseguinte, nestas concretizações e outras, uma molécula de sdRNA pode ser isolado a partir de uma célula vegetal transgênica. Em concretizações particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada a partir do grupo que compreende o milho (Zea mays), soja (Glycine max), e plantas da família das Poaceae.

[0072] Algumas concretizações envolvem um processo para a modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero). Nestas e em outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em concretizações particulares, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser operativamente ligada a um promotor, e podem também ser operativamente ligado a uma sequência de terminação da transcrição. Em concretizações particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga de insetos pode compreender: (a) transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais que compreende uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) selecionar uma célula vegetal transformada que tenha integrado o vetor no seu genoma; e (d) determinar que a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificado pelo polinucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula vegetal que tem o vetor integrado no seu genoma e compreender a molécula de dsRNA codificado pelo polinucleotídeo do vetor.

[0073] Assim, é também divulgada uma planta transgênica que compreende um vetor tendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrado no seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificado pelo polinucleotídeo do vetor. Em concretizações particulares, a expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e hemípteros) que entra em contato a célula vegetal ou planta transformada (por exemplo, alimentando-se da planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal), de tal modo que o crescimento e/ou sobrevivência da praga é inibida. As plantas transgênicas aqui divulgadas podem apresentar resistência e/ou a tolerância melhorada para infestações de pragas de insetos. Plantas transgênicas específicas podem exibir resistência e/ou de proteção reforçada a partir de um ou mais praga (s) de coleópteros e/ou hemíptero selecionado a partir do grupo que consiste em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; D. u. undecimpunctata Mannerheim; Euschistus heros; Piezodorus guildinii; Halyomorpha halys; Nezara viridula; Chinavia hilare; Euschistus servus; Dichelops melacanthus; Dichelops furcatus; Edessa meditabunda; Thyanta perditor; Chinavia marginatum; Horcias nobilellus; Taedia stigmosa; Dysdercus peruvianus; Neomegalotomus parvus; Leptoglossus zonatus; Niesthrea sidae; Lygus hesperus e Lygus lineolaris.

[0074] Também são aqui divulgados métodos para a entrega de agentes de controle, tais como uma molécula de iRNA para pragas de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero). Tais agentes de controle podem causar, direta ou indiretamente, uma deficiência na capacidade de uma população de pragas de insetos para se alimentar, crescer ou causar danos em um hospedeiro. Em algumas concretizações, é proporcionado um método de liberação compreendendo uma molécula de dsRNA estabilizada a uma praga de insetos para suprimir, pelo menos, um gene alvo na praga, fazendo, assim, com que RNAi e reduzir ou eliminar danos nas plantas de pragas em um hospedeiro. Em algumas concretizações, um método de inibição da expressão de um gene alvo na praga de insetos pode resultar na parada do crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento na praga.

[0075] Em algumas concretizações, as composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidas que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, RNAcd) para uso com plantas, animais e/ou o meio ambiente de uma planta ou animal para conseguir a eliminação ou redução de uma infestação de pragas de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptero). Em concretizações particulares, a composição pode ser uma fonte de alimento ou composição nutricional para ser oferecida como alimento para a praga de insetos. Algumas concretizações compreendem tonar a composição alimentícia ou fonte nutricional disponível para a praga. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas de uma ou mais células da praga, o que por sua vez pode resultar na inibição da expressão de, pelo menos, um gene alvo na célula (s) da praga. A ingestão ou dano de uma célula vegetal ou planta por uma infestação de pragas de insetos pode ser limitado ou eliminado ou em qualquer tecido do hospedeiro ou ambiente no qual a praga está presente, proporcionando uma ou mais composições que compreendem uma molécula de iRNA no hospedeiro da praga.

[0076] As composições e métodos aqui divulgados podem ser utilizados em conjunto em combinação com outras moléculas iRNA para diferentes alvos (por exemplo, RAS frente ou ROP (publicação do Pedido de Patente US No. 20150176025) e RNAPII (Publicação do Pedido de Patente US No. 20150176009). O potencial para afetar várias sequências alvo em uma praga, por exemplo, em larvas pode aumentar a eficácia e também melhorar as abordagens sustentáveis para gestão de pragas de insetos envolvendo tecnologias com iRNA. As composições e métodos aqui descritos podem também ser utilizados em conjunto em combinação com outros métodos e composições para o controle de danos por pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Por exemplo, uma molécula de iRNA, tal como aqui descrita para a proteção de plantas contra pragas de insetos pode ser utilizada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de insetos, biopesticidas eficaz contra essa praga, a rotação de culturas, técnicas genéticas recombinantes que exibem características diferentes das características dos métodos de RNAi-mediadas e composições de RNAi (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudiciais para uma praga de insetos (por exemplo, toxinas Bt)).

II. Abreviaturas

[0077] BSB Percevejo marrom neotropical (Euschistus heros)

[0078] dsRNA ácido ribonucleico de cadeia dupla

[0079] EST Sequência tag expressada

[0080] GI inibição do crescimento

[0081] NCBI National Center for Biotechnology Information

[0082] DNAg DNA genômico

[0083] iRNA ácido ribonucleico inibitório

[0084] ORF quadro de leitura aberta

[0085] RNAi ácido ribonucleico interferente

[0086] miRNA micro ácido ribonucleico

[0087] siRNA Pequeno ácido ribonucleico inibitório

[0088] shRNA ácido ribonucleico de gancho curto

[0089] RNAhp gancho de ácido ribonucleico

[0090] UTR região não traduzida

[0091] WCR verme da raiz do milho occidental (Diabrotica virgifera LeConte)

[0092] NCR verme da raiz do milho do norte (Diabrotica Barberi Smith ANC Lawrence)

[0093] MCR verme da raiz do milho Mexicana (Diabrotica virgifera zeae e Smith)

[0094] PCR Reação em cadeia Polimerase

[0095] qPCR Reação em cadeia polymerase quantitativa

[0096] RISC Complexo de silenciamento induzido por RNA

[0097] SCR verme da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata Howard Barber)

[0098] SEM Desvio padrão da media

[0099] YFP Proteína fluorescente amarela

III. Termos

[00100] Na descrição e tabelas que se seguem, vários termos são utilizados. A fim de proporcionar uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a esses termos, as seguintes definições são fornecidas:

[00101] Praga de Coleópteros: Tal como aqui utilizado, o termo “praga de coleópteros” se refere a insetos da ordem dos Coleóptera, incluindo pragas de insetos do gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agrícolas e produtos vegetais, incluindo milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma praga coleóptera é selecionada a partir de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; and D. u. undecimpunctata Mannerheim.

[00102] Contato (com um organismo): Tal como aqui utilizado, o termo “contato com” ou “absorção por” um organismo (por exemplo, uma praga de coleóptero ou hemíptero), no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo e sem limitação: a ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, por alimentação); contatar o organismo com uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico; e imersão de organismos com uma solução que compreende a molécula de ácido nucleico.

[00103] Contiguo: Tal como aqui utilizado, o termo “contiguo” refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos sobrepostos de DNA derivados a partir de uma única fonte genética.

[00104] Planta de milho: Tal como aqui utilizado, o termo “planta de milho” refere-se a uma planta da espécie, Zea mays (milho).

[00105] Expressão: Tal como aqui utilizado, “expressão” de um polinucleotídeo de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNAg ou DNAc) é convertido em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, muitas vezes incluindo a síntese de uma proteína. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, a exposição de uma célula, tecido, organismo ou a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte do percurso a partir de DNA para RNA para a proteína. Regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através do controle que atuam sobre a transcrição, a tradução, o transporte de RNA e o processamento, degradação de moléculas intermediárias, tais como RNAm, ou por meio de ativação, desativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específica, após terem sido feitas, ou por combinações dos mesmos. A expressão gênica pode ser medida ao nível do RNA ou o nível de proteína por qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, western blot, ou in vitro, in situ, ou no (s) ensaio (s) de atividade da proteína in vivo.

[00106] Material genético: Tal como aqui utilizado, o termo “material genético” inclui todos os genes e moléculas de ácidos nucleicos, tais como DNA e RNA.

[00107] Pragas de hemípteros: Tal como aqui utilizado, o termo “praga de hemíptero” refere-se a insetos da ordem Hemiptera, incluindo, por exemplo e sem limitação, os insetos nas famílias Pentatomidae, Miridae, Pyrrhocoridae, Coreidae, Alydidae e Rhopalidae, que se alimentam de uma vasta gama de plantas hospedeiras e ter penetração e sugação em partes da boca. Em exemplos particulares, uma praga de hemíptero é selecionado da lista compreendendo, Euschistus heros (Fabr.) (percevejo-marrom neo-tropical), Nezara viridula (L.) (percevejo verde), Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo verde pequeno da soja), Halyomorpha halys (Stâl) (percevejo marrom marmorizado), Chinavia hilare (Say) (Percevejo verde), Euschistus servus (Say) (Percevejo marrom), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Percevejo Neotropical de arca vermelha), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do algodão), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Western Tarnished Plant Bug), and Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).

[00108] Inibição: Tal como aqui utilizado, o termo “inibição”, quando utilizado para descrever um efeito sobre um polinucleotídeo de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de RNAm transcrito a partir do polinucleotídeo de codificação e/ou peptídeo, o produto polipeptídeo, proteína ou do polinucleotídeo de codificação. Em alguns exemplos, a expressão de um polinucleotídeo de codificação pode ser inibida de modo a que a expressão seja aproximadamente eliminada. “A inibição específica” refere-se à inibição de um polinucleotídeo que codifica alvo sem afetar, consequentemente, a expressão de outros polinucleotídeos que codificam (por exemplo, genes) na célula, em que a inibição específica está a ser realizado.

[00109] Inseto: Tal como aqui usado em relação a pragas, o termo “praga de insetos” inclui especificamente as pragas de insetos coleópteros e as pragas de insetos hemípteros. Em algumas concretizações, o termo também inclui algumas outras pragas de insetos.

[00110] Isolado: Um componente biológico “isolado” (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido fora do, ou purificado a partir de outros componentes biológicos na célula do organismo, em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA extra- cromossomal ou cromossomal e RNA, e proteínas), enquanto que de uma alteração funcional química ou no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado a partir de um cromossoma, quebrando as ligações químicas que ligam o ácido nucleico para o DNA restante no cromossoma). As moléculas de ácidos nucleicos e proteínas que tenham sido “isoladas” inclui moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como, moléculas de ácidos nucleicos quimicamente sintetizadas, proteínas e peptídeos.

[00111] Molécula de ácido nucleico: Tal como aqui utilizado, o termo “molécula de ácido nucleico” pode referir- se a uma forma polimérica de nucleotídeos, o qual pode incluir tanto em uma cadeia senso e anti-senso de RNA, DNAc, DNAg, e formas sintéticas e polímeros mistos do acima. Um nucleotídeo ou nucleobases pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma “molécula de ácido nucleico”, tal como aqui usado é sinônimo de “ácido nucleico” e “polinucleotídeo”. Uma molécula de ácido nucleico é geralmente pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que especificado de outra forma. Por convenção, a sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico é lida a partir da extremidade 5' para a extremidade 3' da molécula. O “complemento” de uma molécula de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases que podem formar pares de bases com as nucleobases da molécula de ácido nucleico (T / U e G-C).

[00112] Algumas concretizações incluem ácidos nucleicos que compreendem um DNA molde que é transcrito para uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de RNAm. Nestas concretizações, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de RNAm está presente na orientação 5' para 3', de tal modo que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção de 5' para 3') vai transcrever um ácido nucleico a partir do complemento que pode hibridizar com a molécula de RNAm. A menos que expressamente indicado de outra forma, ou que seja óbvio para ser de outro modo pelo contexto, o termo “complemento” refere-se, por conseguinte, a um polinucleotídeo tendo nucleobases, de 5' para 3', que pode formar pares de bases com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. De modo semelhante, a menos que seja explicitamente indicado de outra maneira a ser (ou, é claro de ser de outro modo a partir do contexto), o “complemento inverso” de um ácido nucleico refere-se ao complemento na orientação inversa. O precedente é demonstrado na ilustração a seguir: 5 'ATGATGATG 3' polinucleotídeo 5 'TACTACTAC 3' “complemento” do polinucleotídeo 5 'CATCATCAT 3' “complemento inverso” do polinucleotídeo

[00113] Algumas concretizações da invenção incluem moléculas iRNA formando ganchos de RNA. Nestes iRNAs, tanto o complemento de um ácido nucleico a ser alvo de RNA interferente e o complemento inverso pode ser encontrado na mesma molécula, de tal modo que a molécula de RNA de cadeia simples pode “dobrar” e hibridizar com si sobre a região que compreende o complemento e reverter os polinucleotídeos complementares, como demonstrado na ilustração a seguir: 5’ AUGAUGAUG - ligante de polinucleotídeo - CAUCAUCAU 3’, O qual hibridiza para formar:

[00114] “Moléculas de ácido nucleico” inclui todos os polinucleotídeos, por exemplo: formas de DNA de fita simples e dupla; formas de RNA de fita simples; e formas de RNA de fita dupla (dsRNA). O termo “sequência de nucleotídeos” ou “sequência de ácido nucleico” refere-se a ambas as cadeias senso e anti-senso de um ácido nucleico, quer como cadeias simples ou em cadeia dupla. O termo “ácido ribonucleico” (RNA) é incluído de iRNA (RNA inibitório), RNAds (RNA de cadeia dupla), siRNA (pequeno RNA interferente), RNAm (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), shRNA (RNA em gancho pequeno), RNAhp (gancho de RNA), RNAt (RNA de transferência, seja carregado ou descarregado com um aminoácido acilado), e RNAc (RNA complementar). O termo “ácido desoxirribonucleico” (DNA) é incluído de DNAc, DNAg, e híbridos de DNA-RNA. Os termos “polinucleotídeo”, “ácido nucleico”, “segmentos” dos mesmos, e “fragmentos” dos mesmos será entendido pelos técnicos versados no assunto a incluírem, por exemplo, gDNAs; RNAs ribossomais; RNAs de transferência; RNAs; RNAs mensageiros; operons; polinucleotídeos menores modificados que codificam ou podem ser adaptados para codificar peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas; e elementos estruturais e/ou funcionais dentro de uma molécula de ácido nucleico que são delineados pela sua sequência de nucleotídeos correspondente.

[00115] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero curto de ácido nucleico. Os oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por polimerização de precursores de nucleotídeos individuais. Sintetizadores automáticos permitem que a síntese de oligonucleotídeos de até várias centenas de bases de comprimento. Uma vez que os oligonucleotídeos podem ligar- se a um ácido nucleico complementar, estes podem ser utilizados como sondas para a detecção de DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos por DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser utilizados em PCR, uma técnica para a amplificação de DNA e RNA (transcrição reversa em sequências de cDNA). No PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um “iniciador”, que permite que uma DNA-polimerase estenda o oligonucleotídeo e a cadeia complementar se replicar.

[00116] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou ambos os nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados entre si por ligações nucleotídicas que ocorre naturalmente e/ou que não ocorre naturalmente. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou derivadas, tal como será prontamente apreciado pelos técnicos versados no assunto. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídicas (por exemplo, ligações sem carga: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméicos, etc.). O termo “molécula de ácido nucleico” também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, fita dupla, parcialmente frente e verso, triplexada, em U, circular, e conformações cadeadas.

[00117] Tal como aqui utilizado no que diz respeito ao DNA, o termo “sequência codificadora”, “sequência nucleotídica estrutural”, ou “molécula de ácido nucleico estrutural” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é em última análise, traduzida em um polipeptídeo, através de transcrição e de RNAm, quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. No que diz respeito ao RNA, o termo “sequência de codificação” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é traduzida em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de iniciação da tradução no 5'-terminal e um códon de paragem da tradução no 3'-terminal. As sequências de codificação incluem, mas não estão limitadas a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeos recombinantes.

[00118] Genoma: Tal como aqui utilizado, o termo “genoma” refere-se ao DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e também se refere a DNA de organelas encontradas dentro de componentes subcelulares dentro da célula. Em algumas concretizações da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal de modo a que a molécula de DNA seja integrada no genoma da célula vegetal. Nestas e outras concretizações, a molécula de DNA pode ser quer integrado no DNA nuclear da célula vegetal, ou integrado no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo “genoma” como se aplica às bactérias refere- se tanto no cromossoma e os plasmídeos no interior da célula bacteriana. Em algumas concretizações da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de tal forma que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nestas e outras concretizações, a molécula de DNA pode ser cromossomicamente integrada ou localizada, como um plasmídeo ou estável.

[00119] A identidade de sequência: O termo “identidade de sequência” ou “identidade”, tal como aqui utilizado no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídicas, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para uma correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada.

[00120] Conforme aqui utilizado, o termo “percentagem de identidade de sequência” pode referir-se o valor determinado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas) ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência no janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas), em relação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo de nucleotídeos ou de aminoácidos idêntico ocorre em ambas as sequências para obter o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em todas as posições, em comparação com uma sequência de referência é dita para ser 100% idêntica à sequência de referência, e vice-versa.

[00121] Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento encontram-se descritos em, por exemplo: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, p.e., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.

[00122] O National Center for Biotechnology Information (NCBI) possui o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al (1990)) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (Bethesda, MD), e sobre a internet, para uso em conexão com programas de análise de várias sequências. Uma descrição de como para determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na internet na seção “ajuda” para BLAST™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, a função de “Blast 2 sequências” do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregado utilizando a matriz BLOSUM62 padrão definida para os parâmetros predefinidos. As sequências de ácidos nucleicos com ainda maior semelhança com as sequências de referência irão mostrar percentagem de identidade aumentado quando avaliados por este método.

[00123] Especificamente hibridável/Especificamente complementares: Tal como aqui utilizados, os termos “Especificamente hibridizável” e “Especificamente complementar” são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade, tal que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e de uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácidos nucleicos envolve a formação de um alinhamento anti-paralelo entre as sequências de ácidos nucleicos das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondente na cadeia oposta para formar uma molécula duplex que, se for suficientemente estável, é detectável utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridável. No entanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para hibridização a ser específico é uma função das condições de hibridização utilizada.

[00124] As condições de hibridização, resultando em graus específicos de rigor irão variar dependendo da natureza da escolha do método de hibridização e da composição e do comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) da hibridização irá determinar o rigor da hibridização. A força iônica do tampão de lavagem e a temperatura de lavagem também influenciam o rigor. Os cálculos relativos necessários para as condições de hibridização para alcançar graus particulares de restringência são conhecidos dos técnicos versados no assunto, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed, vol. 1 - 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989, capítulos 9 e 11, e atualizações; Hames e Higgins e (eds.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução mais detalhada e orientação no que diz respeito à hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrada, por exemplo, em Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995 e atualizações.

[00125] Conforme aqui se utiliza, “condições rigorosas” abrangem as condições sob as quais a hibridização irá ocorrer apenas se houver mais de 80% de compatibilidade das sequências entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga na molécula de ácido nucleico alvo. “Condições rigorosas” incluir outros níveis particulares de rigor. Assim, tal como aqui utilizado, condições de “rigor moderado” são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 80% de compatibilidade de sequência (isto é, tendo menos de 20% incompatibilidade) irá hibridizar; condições de “severidade elevada” são aquelas em que as sequências com mais do que 90% de compatibilidade (isto é, tendo menos de 10% de incompatibilidade) irá hibridizar; e as condições de “muito elevado rigor” são aqueles em que as sequências com mais de 95 % de compatibilidade (ou seja, tendo menos de 5% incompatibilidade) irão hibridizar.

[00126] As condições de hibridização a seguir são representativas, não limitativas.

[00127] Condição de elevado rigor (detecta sequências que compartilham identidade de sequência de pelo menos 90%):A hibridização em tampão 5x SSC a 65 ° C durante 16 horas: lavar duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente durante 15 minutos cada: e lava-se duas vezes em tampão SSC 0,5 x a 65 ° C durante 20 minutos cada.

[00128] Condição de rigor moderado (detecta sequências que compartilham identidade de sequência de pelo menos 80%): Hibridização em tampão 5x-6x SSC a 65-70 ° C durante 16-20 horas: lavar duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente durante 5 - 20 minutos cada; e lava-se duas vezes em tampão SSC lx a 55 - 70° C durante 30 minutos cada.

[00129] Condição de controle não rigoroso (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência irá hibridizar): A hibridização em tampão 6x SSC à temperatura ambiente a 55 ° C durante 16 - 20 horas: lavar pelo menos duas vezes em tampão de 2x-3x SSC à temperatura ambiente a 55 ° C durante 20 - 30 minutos cada.

[00130] Conforme aqui utilizado, o termo “substancialmente homólogo” ou “homologia substancial”, no que diz respeito a um ácido nucleico, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases contíguas que hibridizam sob condições rigorosas com o ácido nucleico de referência. Por exemplo, ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos a um ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NO: l são os ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas (por exemplo, as condições de rigor moderado estabelecidos, supra) para o ácido nucleico de referência de qualquer da SEQ ID NO: l. Os polinucleotídeos substancialmente homólogos pode ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como cerca de 79%; cerca de 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94%, cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com a hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico a polinucleotídeos não-alvo em condições em que é desejada a ligação específica, por exemplo, sob condições de hibridização rigorosas.

[00131] Conforme aqui utilizado, o termo “ortólogo” refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu a partir de um ácido nucleico ancestral comum, e podem reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00132] Tal como aqui utilizado, duas moléculas de ácido nucleico são referidas como apresentam “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de um polinucleotídeo lido na direção de 5' para 3' é complementar de cada nucleotídeo do outro polinucleotídeo, quando lida em 3' de 5'. Um polinucleotídeo que é complementar a um polinucleotídeo de referência irá apresentar uma sequência idêntica à do complemento reverso do polinucleotídeo de referência. Estes termos e descrições são bem definidas no estado da técnica e são facilmente compreendidos pelos técnicos versados no assunto.

[00133] Ligados operacionalmente: um primeiro polinucleotídeo é operacionalmente ligado com um segundo polinucleotídeo, quando o primeiro polinucleotídeo está em uma relação funcional com o segundo polinucleotídeo. Quando produzidos de forma recombinante, os polinucleotídeos operativamente ligados são geralmente contíguos, e, quando necessário para unir duas regiões codificantes de proteínas, no mesmo quadro de leitura (por exemplo, em uma ORF translacionalmente fundida). No entanto, os ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para serem operacionalmente ligados.

[00134] O termo “ligado operacionalmente”, quando utilizado em referência a um elemento regulador genético e um polinucleotídeo de codificação, quer dizer que o elemento regulador afeta a expressão do polinucleotídeo de codificação ligado. “Elementos reguladores”, ou “elementos de controle”, referem-se a polinucleotídeos que influenciam o momento e o nível / quantidade de transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou tradução do polinucleotídeo de codificação associada. Os elementos reguladores podem incluir promotores; líderes de tradução; íntrons; potenciadores; estruturas de haste-laçada; polinucleotídeos de ligação do repressor; polinucleotídeos com uma sequência de terminação; polinucleotídeos com uma sequência de reconhecimento de poliadenilação; etc. elementos reguladores em particular podem ser localizados a montante e/ou a jusante de um polinucleotídeo de codificação operativamente ligado ao mesmo. Além disso, determinados elementos reguladores operacionalmente ligados a um polinucleotídeo de codificação podem estar localizados na cadeia complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla.

[00135] Promotor: Tal como aqui utilizado, o termo “promotor” refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição, e que podem estar envolvidos no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser operativamente ligado a um polinucleotídeo que codifica para a expressão em uma célula, ou um promotor pode ser operativamente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal, que pode ser operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica para a expressão em uma célula. Um “promotor vegetal” pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição preferencialmente em determinados tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídeos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como “preferida por tecido”. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como “tecido-específico”. Um promotor “específico de células-tipo” dirige a expressão, principalmente em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou as folhas. Um promotor “induzível” pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbias e a presença de luz. -Tecido específico, preferido por tecido, tipo de célula específico, e promotores induzíveis constituem a classe de promotores “constitutivos” não. Um promotor “não constitutivo” é um promotor que pode ser ativo na maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecidos ou de células.

[00136] Qualquer promotor indutível pode ser utilizado em algumas concretizações da invenção. Ver Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366. Com um promotor indutivel, a taxa de aumenta a transcrição em resposta a um agente indutor. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a: promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde a herbicidas fitoprotetores benzenossulfonamida; repressor tet de Tn10; e o promotor indutivel de um gene de hormônio esteróide, a atividade de transcrição dos quais pode ser induzida por um hormônio glucocorticosteróide (Schena et al (1991) Proc Natl Acad Sci EUA 88:0421).

[00137] Exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados a: promotores de vírus vegetais, tais como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotores de genes da actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 de milho; e o promotor do ALS, fragmento XbaI / NcoI 5' relativamente ao gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou um polinucleotídeo semelhante ao referido fragmento XbaI / NcoI) (Publicação International PCT N° WO 96 / 30530).

[00138] Para além disso, qualquer promotor específico de tecido ou preferível em tecidos pode ser utilizado em algumas concretizações da invenção. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo de codificação operativamente ligado a um promotor específico de tecidos pode produzir o produto do polinucleotídeo de codificação exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico. Os promotores específicos de tecidos exemplificativos ou preferível em tecidos incluem, mas não estão limitados a: um promotor sementes-preferido, tal como do gene da faseolina; um promotor folha-específica e promotor induzida pela luz, como que a partir de cab ou rubisco; um promotor específico de antera - tal como a de LAT52; um promotor específico de pólen- tal como a de Zml3; e um promotor preferido-micrósporos, tal como a de apg.

[00139] Planta de soja: Tal como aqui utilizado, o termo “planta de soja” refere-se a uma planta da espécie Glycine sp.; por exemplo, G. max.

[00140] Transformação: Tal como aqui utilizado, o termo “transformação” ou “transdução” refere-se à transferência de uma ou mais molécula de ácido nucleico (s) para uma célula. Uma célula é “transformada” por uma molécula de ácido nucleico transduzido na célula quando a molécula de ácido nucleico se torna replicada de forma estável pelas células, quer por incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou pela replicação epissomal. Tal como aqui utilizado, o termo “transformação” engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma tal célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: a transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmídicos; eletroporação (Fromm et al (1986) Nature 319: 791-3); lipofecção (Feigner et al (1987) Proc Natl Acad Sei EUA 84: 7413-7); microinjeção (Mueller et al (1978) Cell 15: 579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al (1983) Proc Natl Acad Sei EUA 80: 4803-7); absorção direta de DNA; e bombardeamento de microprojéteis (Klein et al (1987) Nature 327:70).

[00141] Transgene: Um ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um DNA que codifica um ou ambas fitas (S) de um RNA capaz de formar uma molécula de RNAsd que compreende um polinucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga de coleóptero e/ou hemíptero. Em outros exemplos, um transgene pode ser um gene (por exemplo, um gene de tolerância a herbicida, um gene que codifica um composto farmaceuticamente ou industrialmente útil ou um gene que codifica um traço desejável agrícola). Nestes e em outros exemplos, um transgene pode conter elementos reguladores operacionalmente ligados a um polinucleotídeo de codificação de transgene (por exemplo, um promotor).

[00142] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico, tal como introduzido em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir elementos genéticos que permitem a sua replicação na célula hospedeira, tais como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta o DNA exógeno em uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, incluindo os que produzem moléculas anti-senso, e/ou genes de marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos no estado da técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, fazendo, assim, com que a célula possa expressar as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui, opcionalmente materiais para auxiliar na obtenção de entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, proteína de revestimento, etc).

[00143] Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou maior em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento crescendo ao mesmo tempo e nas mesmas condições. Em concretizações particulares, “rendimento melhorado” ou “melhorar o rendimento” significa um cultivar de ter um rendimento estabilizado de 105% ou maior em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento contendo densidades significativas das pragas de coleópteros e/ou hemíptero que são prejudiciais para a cultura em desenvolvimento que, ao mesmo tempo e nas mesmas condições, que são pragas alvo das composições e métodos aqui descritos.

[00144] A menos que especificamente indicado ou implícita, os termos “um”, “uma”, e “a” significa “pelo menos um”, tal como aqui utilizado.

[00145] A menos que de outra forma especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como normalmente entendido pelos técnicos versados no assunto à qual pertence esta divulgação. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, de Lewin Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 0763766321 10); Krebs et al. (eds.), enciclopédia de Biologia Molecular, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers RA (ed.), Biologia Molecular e Biotecnologia: A Secretária Comprehensive Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as percentagens são em peso e todas as proporções das misturas de solventes são em volume a menos que indicado de outra maneira. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.

IV. Moléculas de Ácido Nucleico compreendendo um Polinucleotídeo de Pragas de Insetos A. Visão Geral

[00146] Moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos são aqui descritas. Em alguns exemplos, a praga de insetos é uma praga de insetos de coleóptero ou hemíptero. As moléculas de ácido nucleico descritas incluem polinucleotídeos-alvo (por exemplo, genes nativos, e polinucleotídeos não codificantes), dsRNAs, siRNAs, shRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, as moléculas de RNAcd, siRNA, miRNA, shRNA, e/ou RNAhp são descritos em algumas concretizações que podem ser especificamente complementares a todo ou parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos de pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas e outras concretizações, o ácido nucleico nativo (s) pode ser um ou mais gene (s) alvo, o produto do qual pode ser, por exemplo e sem limitação: envolvido no desenvolvimento de larvas / ninfas. As moléculas de ácido nucleico aqui descritas, quando introduzidas em uma célula, compreendendo, pelo menos, um ácido nucleico nativo (s) aos quais as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, pode iniciar RNAi na célula, e consequentemente, reduzir ou eliminar a expressão do ácido nucleico nativo (s). Em alguns exemplos, a redução ou eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico especificamente aos mesmos complementar pode resultar na redução ou cessação do crescimento, desenvolvimento e/ou a alimentação da praga.

[00147] Em algumas concretizações, pelo menos um gene- alvo em uma praga de insetos pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende uma COPI gama (SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87). Em exemplos particulares, um gene alvo em pragas de coleópteros e/ou hemípteros é selecionado, em que o gene alvo compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende uma nova COPI gama (SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87).

[00148] Em algumas concretizações, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência contígua de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85% idêntica (por exemplo, pelo menos 84%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica) à sequência de aminoácidos de um produto de proteína de COPI gama (SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87). Um gene alvo pode ser qualquer ácido nucleico de uma praga de insetos, a inibição pós-transcricional dos quais tem um efeito prejudicial no crescimento e/ou sobrevivência da praga, por exemplo, para fornecer um benefício de proteção contra a praga para uma planta. Em exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser inversamente traduzido in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência contígua de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85% idênticas, cerca de 90% idênticas, cerca de 95% idênticas, cerca de 96% idênticas, cerca de 97% idênticas, cerca de 98% idênticas, cerca de 99% idêntico, a cerca de 100% idêntica ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de um produto de proteína de nova sequência nucleotídica SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 87.

[00149] É fornecido em algumas concretizações DNAs, a expressão da qual resulta em uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de uma molécula de RNA nativo que é codificado por um polinucleotídeo de codificação de uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero). Em algumas concretizações, após a ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de insetos, podem ser obtidos a regulação negativa do polinucleotídeo de codificação em células da praga. Em concretizações particulares, a sub- regulação da sequência de codificação em células de praga de insetos pode resultar em um efeito prejudicial sobre o crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevivência da praga.

[00150] Em algumas concretizações, os polinucleotídeos alvo incluem transcrito de RNA não codificantes, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; líderes emendado; íntrons; outrons (por exemplo, RNA 5'UTR subsequentemente modificado no trans splicing); donatrons (por exemplo, RNA não codificador necessária para fornecer sequências doadoras de trans splicing); e outros não-codificante RNA transcrito de genes de pragas de insetos alvo. Tais polinucleotídeos podem ser derivados de ambos os genes mono-cistrônico e poli- cistrônico.

[00151] Deste modo, também são aqui descritas em relação com algumas concretizações, moléculas iRNA (por exemplo, sdRNA, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero). Em algumas concretizações, uma molécula de iRNA pode compreender polinucleotídeo (s) que são complementares à totalidade ou a parte de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ácidos nucleicos alvo. Em concretizações particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Também são revelados os DNAc que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas shRNA, e/ou moléculas que são especificamente RNAhp complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo de uma praga de insetos. Além disso são descritas construções de DNA recombinante para utilização em alcançar a transformação estável de alvos particulares hospedeiras. Alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de sdRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e/ou a partir de RNAhp as construções de DNA recombinante. Portanto, também é descrito um vetor de transformação de plantas compreendendo pelo menos um polinucleotídeo ligado operacionalmente a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão do polinucleotídeo (s) resulta em uma molécula de RNA que compreende uma sequência de nucleobases contíguas que é especificamente complementar a totalidade ou parte de um ácido nucleico alvo de uma praga de insetos.

[00152] Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de insetos (por exemplo, pragas de coleópteros e/ou hemípteros podem incluir: a totalidade ou parte de um ácido nucleico nativo isolado a partir de Diabrotica ou organismo hemíptero que compreende COPI gama (SEQ ID NO : l ou SEQ ID NO: 87); sequências de nucleotídeos que, quando expressa resultam em uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de uma molécula de RNA nativo que é codificada por COPI gama (SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87); moléculas iRNA (por exemplo, sdRNA, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de COPI gama (SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87); sequências de DNAc que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas shRNA, e/ou moléculas RNAhp que são especificamente complementar a todo ou parte de COPI gama (SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87); e construções de DNA recombinante para utilização em alcançar a transformação estável de alvos particulares do hospedeiro, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico que precedem.

B. Moléculas de Ácido Nucleico

[00153] A presente invenção proporciona, inter alia, moléculas iRNA (por exemplo, RNAcd, siRNA, miRNA, shRNA e RNAhp) que inibem a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma de praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero); e moléculas de DNA capaz de serem expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou um microorganismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de insetos.

[00154] Algumas concretizações da invenção proporcionam uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo (s) selecionados a partir do grupo que consiste em: qualquer uma das SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87; o complemento de qualquer uma de SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87; um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; ; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87. Em concretizações particulares, contato ou absorção por uma praga de coleóptero e/ou hemíptero do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, desenvolvimento e/ou a alimentação da praga.

[00155] Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) DNA (s) capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA em uma célula ou um microorganismo para inibir alvejar a expressão do gene em uma célula, tecido ou órgão de pragas coleópteros e/ou hemíptero. Tal DNA (s) pode ser operativamente ligado a um promotor que funciona em uma célula, compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou aumentar a transcrição do RNA codificado capaz de formar uma molécula (s) de sdRNA. Em uma concretização, o DNA (s) de pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) pode ser derivado a partir de um polinucleotídeo selecionado a partir de um grupo compreendendo SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87. Os derivados de SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87 incluem fragmentos de SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87. Em algumas concretizações, um tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, ou um complemento do mesmo. Assim, um tal fragmento pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 87, ou um complemento do mesmo. Em alguns exemplos, um tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87 ou um complemento do mesmo. Assim, um fragmento de SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87 pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, cerca de 25, (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), cerca de 30, cerca de 40, (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 87 ou um complemento do mesmo.

[00156] Algumas concretizações compreendem a introdução parcialmente ou completamente de moléculas estabilizada de dsRNA em uma praga de coleóptero e/ou hemíptero para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido, órgão ou das pragas de coleópteros e/ou hemípteros. Quando expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, sdRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e RNAhp) e recolhido por uma praga de coleópteros e/ou hemíptero, polinucleotídeos compreendendo um ou mais fragmentos de qualquer uma de SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO : 87 e respectivos complementos, pode causar uma ou mais de morte, repressão do desenvolvimento, inibição de crescimento, alterações na proporção entre sexos, a redução no tamanho de ninhada, cessação de infecção, e/ou interrupção da alimentação por uma praga de coleópteros e/ou hemíptero. Por exemplo, em algumas concretizações, uma molécula de sdRNA que compreende uma sequência de nucleotídeos, incluindo cerca de 15 a cerca de 300 ou cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogas a uma sequência de gene alvo de pragas de coleópteros e/ou hemíptero e que compreendem um ou mais fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que compreende a SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87 é fornecido. A expressão de uma tal molécula de sdRNA pode, por exemplo, conduzir a mortalidade e/ou inibição do crescimento de uma praga coleóptera e/ou hemíptera que leva-se a molécula de RNAdc.

[00157] Em certas concretizações, as moléculas de dsRNA fornecidos pela invenção compreendem os polinucleotídeos complementares a um transcrito de um gene-alvo que compreende a SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87 e/ou sequências de nucleotídeos complementares a um fragmento da SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, cuja inibição do gene alvo em uma praga de inseto resulta na redução ou remoção de um polipeptídeo ou polinucleotídeo que é essencial para o crescimento da praga, o desenvolvimento, ou outra função biológica. Um polinucleotídeo selecionado pode apresentar entre cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeos apresentado na SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, ou o complemento de qualquer um dos anteriores. Por exemplo, um polinucleotídeo selecionado pode apresentar 79%; cerca de 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94%, cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou identidade de sequência de cerca de 100% com qualquer uma das SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, ou o complemento de qualquer uma de a acima expostos.

[00158] Em algumas concretizações, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou um microorganismo para inibir a expressão do gene alvo pode compreender um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um polinucleotídeo nativo encontrado em um ou mais espécies alvos de pragas de insetos (por exemplo, espécies de pragas de coleópteros e hemípteros) ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera de uma pluralidade de tais polinucleotídeos complementares especificamente.

[00159] Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um primeiro e um segundo polinucleotídeo separados por um “espaçador”. Um espaçador pode ser uma região que compreende qualquer sequência de nucleotídeos que facilita a formação da estrutura secundária entre o primeiro e segundo polinucleotídeo, onde isso for desejado. Em uma concretização, o espaçador é parte de um polinucleotídeo anti-senso ou sentido para o RNAm de codificação. O espaçador pode, alternativamente, compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de serem ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico. Em alguns exemplos, o espaçador pode ser um íntron (por exemplo, um íntron ST-LS1 ou um íntron RTM1).

[00160] Por exemplo, em algumas concretizações, a molécula de DNA pode compreender um polinucleotídeo que codifica para uma ou mais moléculas de iRNA diferentes, em que cada uma das diferentes moléculas de iRNA compreende um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo, em que o primeiro e segundo polinucleotídeos são complementares uns com os outros. O primeiro e segundo polinucleotídeo podem ser ligados dentro de uma molécula de RNA por um espaçador. O espaçador pode constituir parte do primeiro polinucleotídeo ou do segundo polinucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA que compreende o primeiro e segundo polinucleotídeo de nucleotídeos pode levar à formação de uma molécula de sdRNA, por emparelhamento de bases intramolecular específica do primeiro e segundo polinucleotídeos de nucleotídeos. O primeiro polinucleotídeo ou o segundo polinucleotídeo pode ser substancialmente idêntico ao de um polinucleotídeo (por exemplo, um gene alvo, ou transcrito polinucleotídeo não codificante) nativo para uma praga de insetos (por exemplo, pragas de coleópteros e hemípteros), um derivado do mesmo, ou uma polinucleotídeo complementar ao mesmo.

[00161] As moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem cadeias duplas de ribonucleotídeos polimerizadas, e podem incluir modificações, quer ao esqueleto de fosfato- açúcar ou o nucleosídeo. Modificações na estrutura do RNA podem ser adaptadas para permitir a inibição específica. Em uma concretização, as moléculas de sdRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo, de modo que podem ser geradas moléculas de siRNA. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNAase III, tal como DICER em eucariotas, quer in vitro ou in vivo. Ver Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286 (5441):950-2. DICER ou enzimas de RNAase ni funcionalmente equivalentes clivam maiores cadeias de dsRNA e/ou moléculas RNAhp em oligonucleotídeos mais pequenos (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais é de cerca de 19 - 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidos por estas enzimas têm 2 a 3 nucleotídeos 3', saliências e fosfato 5' e 3' terminais hidroxila. As moléculas de siRNA geradas pelas enzimas de RNAase ni são desenroladas e separados em RNA de cadeia única na célula. As moléculas de siRNA em seguida hibridizam especificamente com transcritos de RNA a partir de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo de RNA- degradantes celular inerente. Este processo pode resultar na degradação ou a remoção eficaz de RNA codificado pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento pós transcricional do gene alvo. Em algumas concretizações, as moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAase ni endógena a partir de moléculas de ácido nucleico heteróloga pode mediar eficientemente a sub-regulação de genes alvo em pragas de coleópteros e/ou hemípteros.

[00162] Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode incluir, pelo menos, um polinucleotídeo de ocorrência não natural que pode ser transcrito em uma molécula de RNA de cadeia única capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através da hibridização intermolecular. Tais sdRNA tipicamente auto-montagem, e pode ser fornecido na fonte de alimentação de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros e hemípteros) para alcançar a inibição pós- transcricional de um gene alvo. Nestas e outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode compreender dois polinucleotídeos de ocorrência não natural diferentes, cada uma das quais é especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga de insetos. Quando uma tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de sdRNA para, por exemplo, uma praga de coleópteros e/ou hemíptero, a molécula de sdRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes na praga.

C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico

[00163] Uma variedade de polinucleotídeos em pragas de insetos (por exemplo, Coleóptera e hemíptero) pode ser utilizada como alvos para a concepção de moléculas de ácido nucleico, tal como moléculas de iRNAs e moléculas de DNA que codificam iRNAs. Seleção de polinucleotídeos nativos não é, contudo, um processo simples. Por exemplo, apenas um pequeno número de polinucleotídeos nativos em pragas de coleópteros e hemípteross serão alvos eficazes. Ele não pode ser previsto com certeza se um polinucleotídeo nativo particular, podem ser eficazmente regulados negativamente por moléculas de ácido nucleico da presente invenção, ou se a sub-regulação de um polinucleotídeo nativo particular irá ter um efeito prejudicial sobre o crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevivência de uma praga de insetos. A grande maioria dos polinucleotídeos nativos das pragas de coleópteros e hemípteros, tais como ESTs isolados dos mesmos (por exemplo, os polinucleotídeos de pragas de coleópteros enumerados na Patente US 7,612,194), não tem um efeito prejudicial sobre o crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevivência da praga. Também não é previsível que os polinucleotídeos nativos que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga de insetos seja capaz de ser utilizada em técnicas recombinantes para a expressão de moléculas de ácido nucleico complementares a tais polinucleotídeos nativos em uma planta hospedeira e para permitir um efeito prejudicial sobre a praga sobre alimentação sem causar danos à planta hospedeira.

[00164] Em algumas concretizações, as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de dsRNA para ser fornecida na planta hospedeira de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e hemípteros)) são selecionadas para atingir os DNAc que codificam para proteínas ou partes de proteínas essenciais para o desenvolvimento de pragas, tais como polipeptídeos envolvidos em vias metabólicas ou bioquímicos catabólicos, divisão celular, metabolismo de energia, a digestão, o reconhecimento da planta hospedeira e semelhantes. Tal como aqui descrito, a ingestão de composições por um organismo alvo de pragas que contenha um ou vários RNAds, pelo menos, um segmento do qual é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido em células do organismo nocivo alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Um polinucleotídeo, DNA ou RNA, derivado de uma praga de insetos pode ser utilizada para construir as células vegetais resistentes à infestação pelas pragas. A planta hospedeira da praga de coleópteros e/ou hemíptero (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter um ou mais polinucleotídeos derivados de pragas de coleópteros e/ou hemíptero, tal como aqui proporcionada. O polinucleotídeo transformado no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que formam uma estrutura em dsRNA em células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando, assim, disponível o sdRNA quando a praga forma uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga, e, finalmente, morte ou inibição do seu crescimento ou desenvolvimento.

[00165] Deste modo, em algumas concretizações, um gene que é essencialmente envolvido no crescimento e desenvolvimento de uma praga de insetos (por exemplo, coleópteros e hemípteross) é um alvo. Outros genes alvos para utilização na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes no movimento de pragas, migração, crescimento, desenvolvimento, a infecciosidade e criação de locais de alimentação. Um gene alvo pode, portanto, ser um gene de manutenção ou de um fator de transcrição. Além disso, um polinucleotídeo de pragas de insetos nativo para utilização na presente invenção pode também ser derivado de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de uma planta, o gene virai, bacteriano ou de insetos, cuja função é conhecida dos especialistas na arte, e o polinucleotídeo que é especificamente hibridizar com um gene alvo no genoma da praga alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeos conhecida por hibridização são conhecidos dos peritos na arte.

[00166] Em algumas concretizações, a invenção proporciona métodos para a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e RNAhp). Uma tal concretização compreende: (a) análise de um ou mais gene (s) alvo para a sua expressão, a função e fenótipo mediante supressão de genes mediada por RNAds em pragas de inseto (por exemplo, coleópteros e hemípteros); (b) a sondagem de uma biblioteca de DNAc ou DNAg com uma sonda compreendendo a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo ou um homólogo do mesmo a partir de uma praga alvo que exibe uma alteração (por exemplo, reduzida) ou fenótipo de crescimento ou desenvolvimento de uma análise de supressão mediada dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que hibrida especificamente com a sonda; (d) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciar o fragmento de DNAc ou DNAg que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciado compreende toda ou uma porção substancial do RNA ou um homólogo da mesma; e (f) quimicamente sintetizar toda ou uma porção substancial de um gene, ou de um siRNA, miRNA, RNAhp, RNAm, shRNA ou dsRNA.

[00167] De acordo com outras concretizações, um método para a obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e RNAhp) inclui: (a) a síntese de um primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídeos especificamente complementares a uma porção de um polinucleotídeo nativo a partir de uma praga de inseto alvo (por exemplo, coleópteros e hemípteros); e (b) amplificar um inserto de DNAc ou DNAg presente em um vetor de clonagem utilizando os primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA, miRNA, RNAhp, RNAm, shRNA, ou dsRNA.

[00168] Os ácidos nucleicos podem ser isolados, amplificados ou produzidos por uma série de abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, RNAcd, siRNA, miRNA, shRNA, e RNAhp) pode ser obtida por amplificação por PCR de um polinucleotídeo alvo (por exemplo, um gene alvo ou de um transcrito de polinucleotídeo alvo não codificante) derivado de um DNAg ou biblioteca de cDNA, ou partes dos mesmos. DNA ou RNA pode ser extraído a partir de um organismo alvo, e as bibliotecas de ácidos nucleicos pode ser preparado a partir dele através de métodos conhecidos dos técnicos versados no assunto. As bibliotecas de DNAc ou DNAg geradas a partir de um organismo alvo podem ser utilizadas para amplificação de PCR e sequenciamento de genes alvos. Um produto de PCR confirmou que pode ser usado como molde para a transcrição in vitro para gerar RNA senso e anti-senso com promotores mínimos. Alternativamente, moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer um de uma série de técnicas (Ver, por exemplo, Ozaki et al (1992) Nucleic Acids Research, 20:5205-5214; e Agrawal et al (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo a utilização de um sintetizador automático de DNA (por exemplo, um PE Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) modelo 392 ou 394 DNA/RNA synthesizer), usando químicas convencionais, tais como a química do fosforamidito. Ver, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48:2223-2311; Patentes US 4,980,460, 4,725,677, 4,415,732, 4,458,066, e 4,973,679. Químicas alternativas resultantes em grupos esqueleto não- naturais, tais como fosforotioato, fosforamidato e semelhantes podem também ser empregadas.

[00169] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou RNAhp da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por um técnico versado no assunto, através de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou RNAhp. O RNA também pode ser produzido por síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese orgânica ou enzimática in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA- polimerase de bacteriófago (por exemplo, RNA polimerase de T3, RNA polimerase T7, e a RNA-polimerase de SP6). Construções de expressão útil para a clonagem e expressão de polinucleotídeos são conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Publicação Internacional PCT n° WO97 / 32016; e Patentes US 5,593,874; 5,698,425; 5,712,135; 5,789,214 e 5,804,693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser utilizadas sem ou com um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar as perdas devidas ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o anelamento, e/ou estabilização da dupla fita da molécula de RNAds.

[00170] Em concretizações, uma molécula de RNAds pode ser formada por uma única cadeia de RNA auto-complementar ou duas cadeias de RNA complementares. As moléculas de RNAds pode ser sintetizado quer in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena celular pode mediar a transcrição de uma ou duas cadeias de RNA in vivo, ou RNA polimerase clonada pode ser usada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição da pós transcrição de um gene alvo em uma praga de insetos pode ser hospedeiro-alvo por transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico de tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, utilizando um promotor indutível, o qual é sensível à infecção, estresse, temperatura, e/ou indutores químicos); e/ou a transcrição de engenharia em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico para estágio de desenvolvimento). As cadeias de RNA que formam uma molécula de RNAds, se transcritas in vitro ou in vivo podem ou não ser poliadeniladas e podem ou não ser capazes de serem traduzidas em um polipeptídeo por um aparelho de translação da célula. D. Vetores Recombinante e Transformação Celular do Hospedeiro

[00171] Em algumas concretizações, a invenção também fornece uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende um polinucleotídeo que, após a expressão do RNA e ingestão por uma praga de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) alcança a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga. Assim, algumas concretizações proporcionam uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e RNAhp) em uma célula vegetal para inibir a expressão do gene alvo em uma praga de insetos. De modo a iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinante podem compreender um ou mais elementos reguladores, os quais podem ser elementos reguladores ligados operacionalmente ao polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA. Os métodos para expressar uma molécula de supressão de genes em plantas são conhecidos, e podem ser usados para expressar um polinucleotídeo da presente invenção. Ver, por exemplo, a publicação do pedido de Patente Internacional PCT N ° WO06/073727; e Publicação de pedido de Patente US N° 2006/0200878 Al)

[00172] Em concretizações específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender um polinucleotídeo que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinante podem codificar RNA que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de gene (s) alvo endógeno em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e ou hemíptero) após a ingestão. Em muitas concretizações, um transcrito de RNA, pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada, por exemplo, como uma estrutura hairpin e haste e de loop.

[00173] Em algumas concretizações, uma cadeia de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição a partir de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1.

[00174] Em algumas concretizações, uma cadeia de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição a partir de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo à de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 87; o complemento da SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 87; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito no RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito no RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito no RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrito no RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87.

[00175] Em concretizações particulares, uma molécula de DNA recombinante que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA pode compreender uma região de codificação, em que pelo menos dois polinucleotídeos são dispostos de tal modo que um polinucleotídeo está em uma orientação senso, e o outro polinucleotídeo está em uma orientação anti-senso, relativamente a, pelo menos, um promotor, em que o polinucleotídeo senso e o polinucleotídeo anti-senso estão ligados ou ligados por um espaçador de, por exemplo, desde cerca de cinco (~5) para cerca de um mil (~1000) nucleotídeos. O espaçador pode formar uma volta entre os polinucleotídeos senso e anti-senso. O polinucleotídeo senso ou polinucleotídeo anti-senso pode ser substancialmente homólogo a um gene-alvo (por exemplo, um gene compreendendo a SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87) ou um seu fragmento. Em algumas concretizações, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA sem um espaçador. Em concretizações, um polinucleotídeo de codificação senso e um polinucleotídeo de codificação anti-senso podem ser de diferentes comprimentos.

[00176] Os polinucleotídeos identificados como tendo um efeito deletério sobre uma praga de insetos ou a um efeito- protetor sobre uma planta no que diz respeito à praga podem ser prontamente incorporados em moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção. Por exemplo, esses polinucleotídeos podem ser expressos como uma estrutura de gancho com a haste e laço, tendo um primeiro segmento que corresponde a um polinucleotídeo do gene alvo (por exemplo, SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87 e seus fragmentos); ligando este polinucleotídeo para um segundo segmento de região espaçadora que não é homólogo ou complementar ao primeiro segmento; e ligando este a um terceiro segmento, em que pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Uma tal construção forma uma estrutura de haste e laço intramolecular por emparelhamento de bases do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que as formas de estrutura laço compreendendo o segundo segmento. Ver, por exemplo, a Publicação do pedido de Patente US n° 2002/0048814 e 2003/0018993.; e Publicação Internacional PCT Nos. WO94/01550 e WO98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, sob a forma de uma estrutura de cadeia dupla, como uma estrutura de haste-laçada (por exemplo, hairpin), através do qual a produção de siRNA alvejada para um polinucleotídeo de praga de inseto nativo (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero) é aumentada pela co-expressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo, na planta de uma cassete expressável adicional, que conduz à produção aumentada de siRNA, ou reduz a metilação para impedir o silenciamento de genes transcricionais do promotor hairpin dsRNA.

[00177] As concretizações da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para atingir pragas de insetos (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero) em níveis de inibição da expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo circular fechado ou linear. O sistema vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. Os ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado, o qual funciona em um ou mais hospedeiros para conduzir a expressão de um polinucleotídeo de codificação ligado ou de outro elemento de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este fim, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, a amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira particular com a qual é compatível.

[00178] Para conferir proteção contra as pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) de uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo e especificamente hibridizar com um polinucleotídeo transcrito correspondente dentro de uma praga de insetos que pode causar danos às espécies de plantas hospedeiras. A praga pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, células de ingestão ou fluidos da planta hospedeira transgênico que compõem a molécula de iRNA. Assim, em exemplos particulares, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de pragas de coleópteros e/ou hemíptero que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas concretizações, a supressão da expressão do gene alvo em uma praga alvo de coleóptero e/ou hemíptero pode resultar na planta a ser protegida do ataque pela praga.

[00179] A fim de permitir a entrega de moléculas de iRNA para uma praga de insetos em uma relação nutricional com uma célula vegetal que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção, a expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula vegetal é necessária. Assim, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender um polinucleotídeo da invenção, operacionalmente ligado a um ou mais elementos reguladores, tais como um elemento promotor heterólogo que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana, em que a molécula de ácido nucleico é para ser amplificada e uma célula vegetal, em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressada.

[00180] Os promotores adequados para utilização em moléculas de ácido nucleico da presente invenção incluem aqueles que são indutíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos no estado da técnica. Os exemplos não-limitativos descrevem tais promotores incluem as Patentes norte-americanas 6,437,217 (promotor RS81 de milho); 5,641,876 (promotor da actina do arroz); 6,426,446 (promotor RS324 de milho); 6,429,362 (promotor PPV-1 de milho); 6,232,526 (promotor A3 de milho); 6,177,611 (promotores constitutivos de milho); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, e 5,530,196 (promotor 35S de CaMV); 6,433,252 (promotor L3 de oleosina de milho); 6,429,357 (promotor 2 de actina de arroz, e intron 2 da actina do arroz); 6,294,714 (promotores indutíveis de luz); 6,140,078 (promotores induzíveis ao sal); 6,252,138 (promotores induzíveis a patógeno); 6,175,060 (Promotores indutíveis de deficiência de fósforo); 6,388,170 (promotores bidirecionais); 6,635,806 (promotor gama-coixin); e publicação de pedido de Patente Norte-Americano No. US 2009/757089 (promotor aldolase de cloroplasto do milho). Outros promotores incluem o promotor da nopalina-sintase (NOS) (Ebert et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84(16):5745- 9) e promotores de sintase de octopina (OCS) (os quais são transportados em plasmídeos de indução-tumoral de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovirus, tais como o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) promotor 19S; (Lawton et al (1987) Plant Mol Biol. 9:315-24); o promotor CaMV 35S (Odell et al (1985) Nature 313:810-2; o vírus do mosaico da escrofulária 35S-promotor (Walker et al (1987) Proc Natl Acad Sci EUA 84 (19):6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc Natl Acad Sei EUA 87:4144 - 8); o promotor do complexo de genes R (Chandler et al (1989) Plant Cell 1:1175-1183 ); o promotor do gene da proteína da ligação a clorofila a/b; CaMV 35S (Patentes US 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, e 5,530,196); FMV 35S (patentes norte-americanas 6,051,753 e 5,378,619), um promotor PC1SV (Patente US 5,850,019); o promotor SCP1 (Patente US 6,677,503); e promotores AGRtu.nos™ (GenBank N° de Acesso V00087; Depicker et al (1982) J. Mol Appl Genet 1: 561 - 73; Bevan et al (1983) Nature 304:184-7).

[00181] Em concretizações particulares, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção compreendem um promotor específico para tecidos, tal como um promotor específico das raízes. Os promotores específicos de raiz da unidade de expressão de polinucleotídeos codificantes operativamente ligados exclusivamente ou preferencialmente em tecidos de raiz. Exemplos de promotores específicos de raiz são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, as Patentes US 5,110,732; 5,459,252 e 5,837,848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas concretizações, um polinucleotídeo ou um seu fragmento para controle de pragas de coleópteros e/ou hemíptero de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos de raiz orientados em sentidos de transcrição opostos, relativamente ao polinucleotídeo ou um seu fragmento, e que são operável em uma célula vegetal transgênica e aí expressos para produzir moléculas de RNA na célula vegetal transgênica que, subsequentemente, possam formar moléculas de dsRNA, como supra descrito. As moléculas de iRNA expressas em tecidos de plantas podem ser ingeridas por uma praga de insetos, de modo que a supressão da expressão do gene alvo seja conseguida.

[00182] Os elementos reguladores adicionais que opcionalmente podem ser operacionalmente ligadas a um ácido nucleico incluem 5'UTRs localizados entre um elemento promotor e um polinucleotídeo de codificação que funciona como um elemento líder de tradução. O elemento líder de tradução está presente no mRNA totalmente processado, e que podem afetar o processamento do transcrito primário e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de elementos líder de tradução incluem líderes proteína do choque térmico do milho e petúnia (Patente dos EUA 5.362.865), líderes de proteína de revestimento do vírus da planta, líderes da planta rubisco, e outros. Ver, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente US 5,659,122); PhDnaK (Patente US 5,362,865); AtAntl; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank N° de Acesso V00087™; e Bevan et al (1983) Nature 304:184-7).

[00183] Os elementos reguladores adicionais que opcionalmente podem ser operacionalmente ligados a um ácido nucleico que incluem elementos não-traduzido 3', regiões de terminação da transcrição 3’ ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de um polinucleotídeo, e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou a transcrição. O sinal de poliadenilação atua nas plantas causando a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do precursor de mRNA. O elemento de poliadenilação pode ser derivado de uma variedade de genes de plantas, ou a partir de genes de T-DNA. Um exemplo não limitativo de uma região 3' de terminação da transcrição é a sintase de nopalina região 3' (NOS 3'; Fraley et al (1983) Proc Natl Acad Sei EUA 80:4803 -7). Um exemplo da utilização de diferentes regiões não traduzidas 3' é fornecido em Ingelbrecht et al, (1989) Plant celular. 1:671-80. Exemplos de sinais de poliadenilação não limitativos incluem uma a partir de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRTU.nos (GenBank N ° de Acesso™ E01312).

[00184] Algumas concretizações podem incluir um vetor de transformação de plantas que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo, pelo menos, um dos elementos de regulação acima descritas operativamente ligados a um ou mais polinucleotídeos da presente invenção. Quando expressados, os um ou mais polinucleotídeos resultam em uma ou mais molécula (s) de iRNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero). Assim, o polinucleotídeo (s) pode compreender um segmento que codifica a totalidade ou parte de um polirribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA de praga alvo de coleóptero e/ou hemíptero, e podem compreender repetições invertidas de toda ou uma parte de um transcrito de pragas alvo. Um vetor de transformação de plantas pode conter polinucleotídeos complementares especificamente para mais do que um polinucleotídeo alvo, permitindo, assim, a produção de mais do que um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes nas células de uma ou mais populações ou espécies de pragas de insetos alvos. Os segmentos de polinucleotídeos complementares aos polinucleotídeos especificamente presentes em diferentes genes podem ser combinados em um único compósito de molécula de ácido nucleico para a expressão em uma planta transgênica. Esses segmentos podem ser contíguos ou separados por um espaçador.

[00185] Em algumas concretizações, um plasmídeo da presente invenção que já contém pelo menos um polinucleotídeo (s) da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de polinucleotídeo (s) adicionais no mesmo plasmídeo, em que o polinucleotídeo (s) adicionais são operacionalmente ligados aos mesmos elementos reguladores que o original, pelo menos, um polinucleotídeo (s). Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode ser concebida para a inibição de múltiplos genes alvos. Em algumas concretizações, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos a partir do mesmo inseto (por exemplo, espécies de pragas de coleópteros ou hemípteros), o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras concretizações, os genes podem ser derivados a partir de diferentes pragas de insetos, que podem ampliar a gama de pragas contra o qual o agente (s) é/são eficazes. Quando vários genes são alvejados para a supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser concebido.

[00186] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor da presente invenção podem compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis também podem ser utilizados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência aos antibióticos (por exemplo, canamicina, geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.), ou tolerância a herbicidas (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica para a resistência a canamicina e pode ser selecionado para utilizar canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica para a resistência bialafos; um gene da sintase de EPSP mutante que codifica a tolerância ao glifosato; um gene da nitrilase que confere resistência ao bromoxinil; um gene da acetolactato-sintase mutante (ALS) que confere tolerância a imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato. Vários marcadores selecionáveis estão disponíveis que conferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e semelhantes. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados em, por exemplo, as Patentes US 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 e 6,118,047.

[00187] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor da presente invenção também podem incluir um marcador detectável. Marcadores detectáveis podem ser utilizados para monitorar a expressão. Marcadores detectáveis exemplificativos incluem um β-glucuronidase ou gene uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos diversos substratos cromogênicos (Jefferson et al (1987) Plant Mol Biol Rep. 5:387-405); um gene R-locus, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianinas (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) “Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.” In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene β-lactamase (Sutcliffe et al (1978) Proc Natl Acad Sci EUA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual são conhecidos diversos substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow et al (1986) Science 234:856-9.); um gene xylE que codifica uma dioxigenase de catecol que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al (1983) Gene 46 (2-3):247-55); um gene de amilase; (Ikatu et al (1990) Bio/Technol 8 241-2.), um gene da tirosinase, que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que condensa, por sua vez a melanina:; (Katz et ai (1983) J. Gen. Microbiol 129 2703-14.) e uma α-galactosidase.

[00188] Em algumas concretizações, as moléculas de ácido nucleico recombinante, como supra descrito podem ser utilizadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que apresentam uma reduzida sensibilidade às pragas de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero). Os vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, através da inserção de moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de iRNA em vetores de transformação de plantas e introduzindo-os em plantas.

[00189] Os métodos apropriados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como por transformação de protoplastos (ver, p.e., Patente US 5,508,184), por dessecação/inibição mediada por incorporação de DNA (Ver, por exemplo, Potrykus et al (1985) Mol Gen. Genet 199:183-8), por eletroporação (ver, p.e., Patente US 5,384,253), por agitação com fibras de carboneto de silício (ver, por exemplo, as Patentes US 5,302,523 e 5,464,765 ), por transformação mediada por Agrobacterium (ver, p.e., Patentes US 5,563,055; 5,591,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; e 6,384,301) e por aceleração de partículas revestidas com DNA (ver, por exemplo, as Patentes US 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; e 6,403,865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para a transformação de milho estão descritas, por exemplo, nas Patentes US 7,060,876 e 5,591,616; e Publicação de pedido de Patente Internacional PCT WO95/06722. Através da aplicação de técnicas, tais como estas, as células de praticamente qualquer espécie podem ser transformadas de forma estável. Em algumas concretizações, o DNA transformador é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer destas técnicas pode ser utilizada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00190] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas a planta que transformam geneticamente células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, são portadores de genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmidios Ti (indutores de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região de T-DNA é delimitada por repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes indutores de tumores foram suprimidos e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA estranho delimitada pelos elementos de fronteira de T-DNA. A T-região também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente de células e plantas transgênicas, e um local de clonagem múltiplo para inserção de polinucleotídeos de transferência, tais como um ácido nucleico que codifica dsRNA.

[00191] Deste modo, em algumas concretizações, um vetor de transformação de plantas é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Ver, por exemplo, as Patentes US 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, e 5,501,967; e Patente Europeia n° EP 0 122 791) ou de um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Os vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, os descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio / Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia N° EP 0 120 516, e os que derivam de qualquer um dos precedentes. Outras bactérias, tais como Sinorhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium e que interagem com plantas naturalmente pode ser modificada para mediar a transferência de genes para um certo número de diversas plantas. Estas bactérias simbióticas associadas a plantas podem ser tornadas competentes para a transferência de genes mediante incorporação de tanto um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário adequado.

[00192] Depois de fornecer DNA exógeno para células receptoras, células transformadas são geralmente identificadas para posterior cultura e regeneração de plantas. A fim de melhorar a capacidade para identificar as células transformadas, pode ser desejável empregar um gene marcador selecionável ou detectável, tal como anteriormente definido, com o vetor de transformação utilizado para gerar o transformante. No caso de um marcador selecionável seja utilizado, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas expondo as células a um agente ou agentes seletivos. No caso de um marcador detectável seja usado, as células podem ser rastreadas para a característica do gene marcador desejado.

[00193] As células que sobreviveram à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de seleção podem ser cultivadas em meios que apoiam a regeneração das plantas. Em algumas concretizações, qualquer meio de cultura de tecido de planta apropriado (por exemplo, meios MS e N6) podem ser modificados pela inclusão de outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. Tecido pode ser mantido em um meio básico com os reguladores de crescimento até que o tecido disponível seja suficiente para iniciar os esforços de regeneração de plantas, ou na sequência de ciclos repetidos de seleção manuais, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos, 2 semanas), seguido transferido para meio conducente à formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que tenha ocorrido a formação de brotos suficiente. Uma vez que brotos são formados, eles são transferidos para meio de formação de raízes conducentes. Uma vez que as raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para posterior crescimento e maturação.

[00194] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, um DNA que codifica uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão do gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemíptero) nas plantas de regeneração, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting, PCR, e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou Western blotting) ou por função enzimática; ensaios de parte da planta, tais como ensaios de folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta inteira regenerada.

[00195] Os eventos de integração podem ser analisados,por exemplo, por amplificação por PCR, utilizando, por exemplo, iniciadores oligonucleotídicos específico para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem de PCR é entendida como incluindo, mas não se limitam a, amplificação em reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNAg derivado de isolado de acolhimento do tecido vegetal de calo previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida de clonagem padrão e sequência da análise de produtos de amplificação por PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al (2002) Plant J. 32:243-53) e pode ser aplicado a DNAg derivada de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G max.) ou tipo de tecido, incluindo culturas de células.

[00196] Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação Agrobacterium-dependentes contém tipicamente um único DNA recombinante inserido em um cromossoma. O polinucleotídeo de DNA recombinante único é referido como um “acontecimento transgênico” ou “evento de integração”. Tais plantas transgênicas são heterozigóticas para o polinucleotídeo exógeno inserido. Em algumas concretizações, uma planta transgênica homozigótica no que diz respeito a um transgene pode ser sexualmente obtida por acasalamento (autopolinização) uma planta transgênica segregante independente que contenha um só gene exógeno para si mesmo, por exemplo, uma planta T0, para produzir sementes de T1. Um quarto da semente T1 produzida será homozigótica no que respeita ao transgene. Germinação de sementes T resulta em plantas que podem ser testadas quanto a heterozigocidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre os heterozigotos e homozigotos (ou seja, um ensaio de zigosidade).

[00197] Em modalidades particulares, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula vegetal que tem um efeito inibitório em praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero). As moléculas iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) pode ser expressa a partir de vários ácidos nucleicos introduzidos em diferentes eventos de transformação ou a partir de um único ácido nucleico introduzido em um único evento de transformação. Em algumas concretizações, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressos sob o controle de um único promotor. Em outras concretizações, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressos sob o controle de vários promotores. As moléculas individuais iRNA podem ser expressas que compreendem múltiplos polinucleotídeos que são cada homólogo de loci diferentes dentro de um ou mais pragas de insetos (por exemplo, os loci definido pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 87), tanto em populações diferentes da mesma espécie de praga, ou em diferentes espécies de pragas de insetos.

[00198] Em adição a transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas por cruzamento de uma primeira planta que possui, pelo menos, uma modificação genética com uma segunda planta faltando tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzido em uma primeira linhagem de planta que é receptiva à transformação para produzir uma planta transgênica, o qual planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta a introduzindo o polinucleotídeo que codifica a molécula de iRNA para a segunda linhagem de planta.

[00199] A invenção também inclui produtos de base, contendo um ou mais das sequências da presente invenção. Concretizações particulares incluem produtos de base produzido a partir de uma planta recombinante ou sementes contendo um ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção. Um produto de base, contendo um ou mais das sequências da presente invenção destina-se a incluir, mas não se limitam a, refeições, óleos, grãos esmagados ou inteiros ou sementes de uma planta, ou qualquer produto alimentar ou animal, que compreende qualquer refeição, óleo, ou esmagado ou o grão inteiro de uma planta recombinante ou sementes contendo um ou mais das sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em um ou mais commodity ou produtos de base aqui contemplada é a evidência, de fato, que o produto de base, ou uma commodity é produzida a partir de uma planta transgênica concebida para expressar uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção para a finalidade de controlar pragas de coleópteros e/ou hemípteros nas plantas utilizando dsRNA mediada por métodos de supressão de gene.

[00200] Em alguns aspectos, as sementes e produtos de base produzidos por plantas transgênicas derivadas a partir de células vegetais transformadas são incluídas, em que as sementes ou produtos de base compreendem uma quantidade detectável de um ácido nucleico da invenção. Em algumas concretizações, tais produtos de base podem ser produzidos, por exemplo, mediante a obtenção de plantas transgênicas e preparar o alimento ou ração para animais a partir deles. Os produtos de base compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção inclui, por exemplo e sem limitação: refeições, óleos, grãos esmagados ou inteiros ou sementes de uma planta, e qualquer produto alimentar que compreende qualquer refeição, óleo, ou graõs triturados ou grão inteiros de uma planta recombinante ou semente compreendendo um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção. A detecção de um ou mais dos polinucleotídeos da invenção em uma ou mais das commodity ou produtos de base produtos é evidência, de facto, que o produto de base, ou uma commodity é produzida a partir de uma planta transgênica concebido para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para a finalidade de controlar pragas de insetos (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero).

[00201] Em algumas concretizações, uma planta transgênica ou semente que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro acontecimento transgênico no seu genoma, incluindo, sem limitação: uma modificação genética a partir da qual é transcrita uma molécula de iRNA alvejando um locus de em uma praga de insetos que não aquele definido pela SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87, tal como, por exemplo, um ou mais loci selecionado a partir do grupo que consiste caf1-180 (publicação do Pedido de Patente US N° 2012/0174258), VatpaseC (publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0174259), Rhol (publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0174260), VatpaseH (publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0198586), PPI-87B (publicação do Pedido de Patente US No. 2013/0091600), RPA70 (publicação do Pedido de Patente US No. 2013/0091601), e RPS6 (publicação do Pedido de Patente US No. 2013/0097730); uma modificação genética a partir da qual é transcrita uma molécula de iRNA alvejando um gene de um organismo diferente de uma praga de coleópteros e/ou hemíptero (por exemplo, um nematodo parasitas de plantas); um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, um Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp (por exemplo, o publicação do Pedido de Patente US No. 2014/0033361) ou Pseudomonas spp (por exemplo, Publicação do Pedido PCT No. WO 2015038734) proteína inseticida); um gene de tolerância a herbicidas (por exemplo, um gene que confere tolerância ao glifosato); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como aumento do rendimento, o metabolismo dos ácidos graxos alterado, ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática). Em concretizações particulares, os polinucleotídeos que codificam moléculas iRNA da invenção podem ser combinados com outras características de controle de insetos e doenças em uma planta para alcançar características desejadas para um melhor controle de doenças de plantas e danos causados por insetos. Combinar os traços de controle de insetos que utilizam os modos-de-ação distintos podem fornecer plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior sobre plantas portadoras de uma única característica de controle, por exemplo, por causa da reduzida probabilidade de que a resistência ao traço (s) irá desenvolver-se no campo.

V. Supressão de Gene Alvo em uma Praga de Coleóptero e/ou Hemíptero. A. Visão Geral

[00202] Em algumas concretizações da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de Coleóptera e/ou hemípteros pode ser fornecida a praga de coleópteros e/ou hemípteros, em que a molécula de ácido nucleico leva ao silenciamento do gene mediado por RNAi na praga (s). Em concretizações particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e RNAhp) pode ser fornecida para o coleóptero e hemíptero ou hospedeiro. Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de coleópteros e hemípteross ou pode ser fornecida a uma praga, contatando a molécula de ácido nucleico com a praga. Nestas e outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de coleópteros e hemípteross pode ser proporcionado em um substrato de alimentação da praga, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de uma praga de coleópteros e/ou hemíptero pode ser fornecida através da ingestão de material vegetal que compreende a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga. Em certas concretizações, a molécula de ácido nucleico está presente no material de planta através da expressão de um ácido nucleico recombinante introduzido no material de planta, por exemplo, por transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico recombinante e a regeneração de um material vegetal ou planta completa a partir da célula vegetal transformada.

B. Supressão do gene alvo mediado por RNAi.

[00203] Em concretizações, a invenção proporciona moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e RNAhp) que podem ser concebidas para dirigir polinucleotídeos nativas essenciais (por exemplo, genes essenciais) do transcriptoma de uma praga de insetos (por exemplo, uma praga de coleópteros (por exemplo, WCR ou NCR) ou hemíptero (por exemplo, BSB)), por exemplo, através da concepção de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos uma cadeia que compreende um polinucleotídeo que é complementar especificamente com o polinucleotídeo alvo. A sequência de uma molécula de iRNA concebido de tal forma pode ser idêntica ao do polinucleotídeo alvo ou podem incorporar desemparelhamentos que não impedem a hibridização específica entre a molécula de iRNA e seu polinucleotídeo alvo.

[00204] As moléculas de iRNA da invenção podem ser utilizadas em métodos para a supressão de gene em uma praga de insetos (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero), reduzindo, assim, o nível ou a incidência de danos causados pela praga de uma planta (por exemplo, uma planta transformada compreendendo uma molécula protegida por iRNA). Tal como aqui utilizado, o termo “supressão do gene” refere- se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para a redução dos níveis de proteína produzida como resultado de transcrição de genes para RNAm e a subsequente tradução do RNAm, incluindo a redução da expressão da proteína a partir de um gene ou uma codificação de polinucleotídeo incluindo a inibição da pós transcrição de expressão e supressão da transcrição. A inibição pós transcricional é mediada por homologia específica entre a totalidade ou uma parte de um RNAm transcrito a partir de um gene alvo para a supressão e a molécula de iRNA correspondente utilizada para a supressão. Além disso, a inibição pós-transcricional refere-se a uma redução substancial e mensurável da quantidade de RNAm disponível na célula para a ligação pelos ribossomas.

[00205] Em concretizações em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (cerca de 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de cadeia dupla gerada por atividade DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em duas siRNAs de cadeia única; a “cadeia passageira” e do “cadeia guia”. A cadeia passageira pode ser reduzida, e a cadeia guia pode ser incorporada dentro do RISC. A inibição pós-transcricional ocorre através de hibridização específica da cadeia de guia com um polinucleotídeo complementar especificamente de uma molécula de mRNA, e subsequente clivagem pela enzima, Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).

[00206] Em concretizações da invenção, pode ser utilizada qualquer tipo de molécula de iRNA. Os técnicos versados no assunto irão entender que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de proporcionar a molécula de iRNA para uma célula que são moléculas de RNA de cadeia única, e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Assim, enquanto que as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, podem ser igualmente eficazes em algumas concretizações, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilidade.

[00207] Em concretizações particulares, uma molécula de ácido nucleico é fornecida, que compreende um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo pode ser expresso in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homólogo a uma molécula de ácido nucleico codificada por um polinucleotídeo no interior do genoma de uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero). Em certas concretizações, o transcrito da molécula de iRNA in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura em alça-laço. Depois de uma praga de inseto contatar o transcrito da molécula de iRNA in vitro, inibição pós transcricional de um gene alvo na praga (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

[00208] Em algumas concretizações da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos) de um polinucleotídeo que são utilizados em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero), em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 1; complemento de SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; o complemento de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 1; um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; complemento de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 1; o complemento de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificante nativo de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: l. Em certas concretizações, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80% idêntica (por exemplo, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86 %, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) pode ser usado com qualquer um dos anteriores.

[00209] Em certas concretizações da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos é utilizada em um método para a inibição pós- transcricional de um gene alvo em uma praga hemípteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 87; o complemento de SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 87; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87. Em certas concretizações, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) pode ser utilizada com qualquer um dos anteriores. Nestas e outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa, que especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptero) de praga.

[00210] Em algumas concretizações, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos pode ser utilizada em um método para a inibição pós- transcricional de um gene alvo em uma praga coleópteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento de SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1; uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 1. Em certas concretizações, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) pode ser usado com qualquer um dos precedentes. Nestas e outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa, que especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga coleópteros. Em exemplos particulares, uma tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que compreende a SEQ ID NO: 1.

[00211] Em concretizações particulares da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos é utilizada em um método para a inibição pós- transcricional de um gene alvo em uma praga hemípteros, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 87; o complemento de SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 87; uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero de SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificante nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 87; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência não codificante nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em RNA de uma molécula nativa que compreende a SEQ ID NO: 87. Em determinadas concretizações, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) pode ser usado com qualquer um dos precedentes. Nestas e outras concretizações, uma molécula de ácido nucleico que pode ser expresso especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga hemíptero. Em exemplos particulares, uma tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que compreende a SEQ ID NO: 87.

[00212] É uma característica importante de algumas concretizações da invenção que o sistema de inibição de RNAi pós-transcricional é capaz de tolerar variações de sequência entre os genes-alvo que pode ser esperado devido a mutação genética, polimorfismo de cepa ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser absolutamente homóloga, quer um produto de transcrição primário ou um RNAm totalmente processado de um gene alvo, desde que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizada, quer um produto de transcrição primário ou um RNAm totalmente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser de comprimento total, em relação, quer um produto de transcrição primário ou um RNAm totalmente processado do gene alvo.

[00213] A inibição de um gene alvo, utilizando a tecnologia iRNA da presente invenção é sequência-específica; ou seja, os polinucleotídeos substancialmente homólogos à molécula (s) de iRNA são dirigidos para a inibição genética. Em algumas concretizações, uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é idêntica à de uma porção de um gene alvo pode ser utilizada para a inibição. Nestas e outras concretizações, pode ser utilizada uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção, e/ou mutações pontuais em relação a um polinucleotídeo alvo. Em concretizações particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene alvo pode dividir, por exemplo, pelo menos de cerca de 80%, pelo menos de cerca de 81%, pelo menos de cerca de 82%, pelo menos de cerca de 83%, pelo menos desde cerca de 84%, pelo menos de cerca de 85%, pelo menos de cerca de 86%, pelo menos de cerca de 87%, pelo menos de cerca de 88%, pelo menos de cerca de 89%, pelo menos de cerca de 90%, pelo menos a partir de cerca de 91%, pelo menos de cerca de 92%, pelo menos de cerca de 93%, pelo menos de cerca de 94%, pelo menos de cerca de 95%, pelo menos de cerca de 96%, pelo menos de cerca de 97%, pelo menos de cerca de 98%, pelo menos de cerca de 99%, pelo menos de cerca de 100%, e 100% de identidade de sequência. Em alternativa, a região de dúplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizada com uma porção de um transcrito do gene alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, menos do que o comprimento completo do polinucleotídeo exibe uma maior homologia maior para compensar uma homologia menor do polinucleotídeo. O comprimento do polinucleotídeo de uma região dúplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um transcrito do gene alvo pode ser, pelo menos, cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos cerca de 1.000 bases. Em algumas concretizações, pode ser usado um polinucleotídeo maior do que 20 - 100 nucleotídeos. Em concretizações particulares, pode ser utilizado um polinucleotídeo maior do que cerca de 200 - 300 nucleotídeos. Em concretizações particulares, pode ser utilizado um polinucleotídeo maior do que cerca de 500 - 1000 nucleotídeos, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00214] Em certas concretizações, a expressão de um gene alvo em uma praga (por exemplo, coleópteros e hemípteros) pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga, de modo a que uma inibição significativa ocorre. Refere-se a uma inibição relativamente significativa de inibição a um limite que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, interrupção do crescimento, a cessação da alimentação, a interrupção do desenvolvimento, a mortalidade induzida, etc.), ou uma redução detectável no RNA e/ou produto do gene correspondente ao gene alvo a ser inibido. Embora, em certas concretizações da invenção, a inibição ocorra em substancialmente todas as células da praga, em outras concretizações a inibição ocorre apenas em um subconjunto das células que expressam o gene alvo.

[00215] Em algumas concretizações, a supressão da transcrição é mediada pela presença na célula de uma molécula de um dsRNA que exibe substancial identidade de sequência com DNA de um promotor ou o seu complemento para efetuar o que é referido como “promotor de trans supressão”. A supressão de genes pode ser eficaz contra genes alvo em uma praga de insetos que podem ingerir ou em contato com tais moléculas de dsRNA, por exemplo, por ingestão ou o contato do material de plantas contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para uso no promotor trans supressão pode ser especificamente concebida para inibir ou suprimir a expressão de um ou mais polinucleotídeos homólogos ou complementares nas células da praga de insetos. A supressão do gene pós-transcricional por orientação de RNA senso ou anti-senso para regular a expressão do gene em células vegetais são divulgadas nas Patentes US 5,107,065; 5,759,829; 5,283,184; e 5,231,020. C. Expressão de Moléculas RNAi fornecidas a uma praga de inseto

[00216] A expressão de moléculas de iRNA para a inibição do gene mediada por iRNA em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptero) pode ser efetuada em qualquer um dos muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA pode então ser fornecida a uma praga de insetos, por exemplo, por contato das moléculas iRNA com a praga, ou fazendo com que a praga venha a ingerir ou de outra forma internalizar as moléculas de iRNA. Algumas concretizações incluem plantas transformadas hospedeiras de uma praga de coleópteros e/ou hemíptero, células de plantas transformadas, e progênie de plantas transformadas. As células vegetais transformadas e plantas transformadas podem ser manipuladas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para proporcionar um efeito protetor de pragas. Assim, quando uma célula vegetal ou planta transgênica é consumida por uma praga de insetos durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas transgênicas ou células. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidos em uma larga variedade de hospedeiros de microrganismos procarióticos e eucarióticos para a produção de moléculas de iRNA. O termo “microrganismo” inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.

[00217] A modulação da expressão do gene pode incluir a supressão parcial ou completa da referida expressão. Em uma outra concretização, um método para a supressão da expressão de genes em uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero) compreende proporcionar no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade gene supressor de pelo menos uma molécula de dsRNA formado na sequência de transcrição de um polinucleotídeo, tal como aqui descrito, pelo menos, um segmento da qual é complementar a um mRNA dentro das células da praga de insetos. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada, tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA ou RNAhp, ingerida por uma praga de insetos pode ser pelo menos de cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula que compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende a SEQ ID NO: l ou SEQ ID NO: 87. Moléculas isoladas e substancialmente purificada de ácido nucleico, incluindo, mas não se limitando a, polinucleotídeos de ocorrência não natural e construções de DNA recombinantes para proporcionar moléculas de dsRNA, portanto, são fornecidas, que suprimem ou inibem a expressão de um polinucleotídeo de codificação endógena ou um polinucleotídeo de codificação de alvo em uma praga de inseto quando introduzido ao mesmo.

[00218] As concretizações particulares proporcionam um sistema de entrega para a entrega de moléculas iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais gene (s) alvo em uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero) de plantas e de controle de uma população de a praga das plantas. Em algumas concretizações, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula vegetal transgênica hospedeira ou conteúdo da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas e outras concretizações, uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica é criada contendo uma construção de DNA recombinante fornecendo uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. As células de plantas transgênicas e plantas transgênicas que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma molécula de iRNA em particular pode ser produzido através do emprego de tecnologias de DNA recombinante (tecnologias de base são bem conhecidos no estado da técnica) para construir um vetor de transformação de plantas que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar a célula de planta transgênica ou planta transgênica da que contém a molécula transcrita de iRNA.

[00219] Para conferir proteção contra as pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) de uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA ou uma molécula de RNAhp. Em algumas concretizações, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA no interior dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma tal molécula de dsRNA pode ser constituída em parte por um polinucleotídeo que é idêntico a um polinucleotídeo correspondente ao transcrito a partir de um DNA dentro de uma praga de insetos, de um tipo que podem infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro da praga é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão da expressão do gene alvo resulta a praga na planta transgênica a ser resistente à praga. Os efeitos moduladores de moléculas de dsRNA foram mostrados para ser aplicável a uma variedade de genes expressos em pragas, incluindo, por exemplo, os genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutenção ao habitat; fatores de transcrição; genes relacionados com a muda; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou o crescimento e desenvolvimento normais.

[00220] Para a transcrição a partir de um transgene in vivo ou uma construção de expressão, uma região de regulação (por exemplo, promotor, estimulador, silenciador, e o sinal de poliadenilação) pode ser utilizado em algumas concretizações para transcrever a cadeia de RNA (ou fita). Portanto, em algumas concretizações, como supra apresentado, um polinucleotídeo para utilização na produção de moléculas de iRNA pode ser operacionalmente ligado a um ou mais elementos de promotor funcional em uma célula hospedeira de planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. O polinucleotídeo da presente invenção, sob o controle de um elemento promotor operativamente ligado, pode ainda ser flanqueado por elementos adicionais que afetam vantajosamente a sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais elementos podem estar localizados a montante do promotor operativamente ligado, a jusante da extremidade 3' da construção de expressão, e pode ocorrer a montante do promotor e a jusante da extremidade 3' da construção de expressão.

[00221] Algumas concretizações proporcionam métodos para reduzir os danos para uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causada por uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero) que se alimenta da planta, em que o método compreende o fornecimento na planta hospedeira planta de uma célula vegetal transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, em que a molécula de ácido nucleico (s) funciona mediante a ser absorvido pela praga (s) para inibir a expressão de um polinucleotídeo alvo dentro da praga (s), que a inibição da expressão resulta em mortalidade e/ou redução do crescimento da praga (s), reduzindo, assim, os danos para a planta hospedeira causados pela praga (s). Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico (s) compreende moléculas de dsRNA. Nestas e outras concretizações, a molécula (s) de ácido nucleico que compreende moléculas de dsRNA que compreendem cada um mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de coleóptero e/ou de hemíptero. Em algumas concretizações, a molécula (s) de ácido nucleico constituída por um polinucleotídeo é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressada na célula uma praga de insetos.

[00222] Em algumas concretizações, um método para aumentar o rendimento de uma colheita de milho é fornecido, em que o método compreende introduzir em uma planta de milho, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivando a planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA que compreende o ácido nucleico inibe danos causados por pragas/ou crescimento das pragas de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptero), reduzindo, assim, ou eliminando um perda de rendimento devido à infestação de pragas. Em algumas concretizações, a molécula iRNA é uma molécula dsRNA. Nestas e outras concretizações, a molécula (s) de ácido nucleico que compreendem moléculas de dsRNA que compreendem cada um mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressado na célula de uma praga de insetos. Em alguns exemplos, a molécula (s) ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de pragas coleópteros e/ou hemípteros.

[00223] Em algumas concretizações, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de inseto (por exemplo, Coleóptera e/ou hemíptero) é fornecido, em que o método compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de iRNA da invenção, em que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor e um elemento de terminação de transcrição; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais que inclui uma pluralidade de células de plantas transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram o polinucleotídeo nos seus genomas; pesquisar as células de plantas transformadas para a expressão de uma molécula de iRNA codificado pelo polinucleotídeo integrado; selecionar uma célula vegetal transgênica que expressa a molécula de iRNA; e fornecer a célula vegetal transgênica selecionada para a praga de insetos. As plantas também podem ser regeneradas a partir de células de plantas transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificado pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas concretizações, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras concretizações, a molécula (s) de ácido nucleico que compreendem moléculas de dsRNA que compreendem cada um mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressada na célula de uma praga de insetos. Em alguns exemplos, a molécula (s) de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressada em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemípteros.

[00224] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), quer como um produto de expressão de um gene recombinante incorporado em um genoma das células das plantas, ou como incorporadas em um revestimento ou tratamento de sementes, que é aplicado à semente antes da plantação. Uma célula vegetal compreendendo um gene recombinante é considerada como sendo uma modificação genética. Também incluídos em concretizações da invenção são sistemas de entrega para a entrega de moléculas iRNA as pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de um organismo nocivo (s). Os métodos para a introdução podem incluir a mistura direta de iRNA com tecido de plantas a partir de um hospedeiro para a praga (s) de insetos, bem como a aplicação de composições que compreendem moléculas de iRNA da invenção para receber tecido de planta. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre uma superfície da planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microrganismo, e o microrganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule por meios físicos, tais como uma injeção. Tal como supra discutido, uma planta transgênica pode também ser geneticamente manipulada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas de insetos conhecidas por infestar a planta. Moléculas de iRNA produzidas por síntese química ou enzimática, também podem ser formuladas de uma forma consistente com as práticas agrícolas comuns, e utilizado como spray de produtos para o controle de danos da planta por uma praga de insetos. As formulações podem incluir os adjuvantes apropriados (por exemplo, marcadores e umidificadores) necessários para a cobertura foliar eficiente, assim como, protetores de UV para proteger moléculas iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) dos danos UV. Tais aditivos são comumente utilizados na indústria de bioinseticida, e são bem conhecidos dos técnicos versados no assunto. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações em spray inseticida (biologicamente baseados ou não) para melhorar a proteção das plantas às pragas.

[00225] Todas as referências, incluindo as publicações, patentes e pedidos de patentes, aqui citadas são aqui incorporadas por referência na medida em que não sejam incompatíveis com os pormenores concretos desta divulgação, e são por isso incorporada na mesma medida como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foram estabelecidos na íntegra aqui. As referências aqui discutidas são fornecidas exclusivamente para a sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar esta divulgação em virtude dos antecedentes da invenção.

[00226] Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitando a divulgação das características específicas ou aspectos descritos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Bioensaios de Dieta do Inseto

[00227] Preparação das amostras e os bioensaios: Um número de moléculas de dsRNA (incluindo os correspondentes à COPI gama reg1 (SEQ ID NO: 3), COPI gama reg2(SEQ ID NO: 4), COPI gama reg3 (SEQ ID NO: 5), COPI gama verl (SEQ ID NO: 75), COPI gama ver2 (SEQ ID NO: 76), COPI gama ver3 (SEQ ID NO: 77), e COPI gama ver4 (SEQ ID NO: 78) foram sintetizadas e purificadas utilizando um kit MEGAscript® de RNAi. As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão TE, e todos os bioensaios continha um tratamento de controle constituído por este tampão, que serviu como uma verificação de antecedentes para a inibição da mortalidade ou do crescimento da WCR (Diabrotica virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00228] As amostras foram testadas para a atividade de insetos em bioensaios realizados com larvas de insetos recém- nascida na dieta artificial do inseto. Os ovos de WCR foram obtidos a partir de CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00229] Os bioensaios foram realizados em bandejas de plástico de 128 poços projetados especificamente para bioensaios de insetos (C-D INTERNACIONAIS, Pitman, NJ). Cada poço continha aproximadamente 1,0 ml de uma dieta artificial concebida para o crescimento de insetos de coleópteros. Uma alíquota de 60 μL de amostra de dsRNA foi administrada com uma pipeta sobre a superfície da dieta de cada poço (40 μL/cm2). As concentrações de amostras de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área superficial (1,5 cm) no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em um exaustor até que o líquido na superfície da dieta tenha sido evaporado ou foi absorvido na dieta.

[00230] Dentro de algumas horas de eclosão, as larvas individuais foram capturadas com uma escova de pêlo de camelo umedecido e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por poço). Os poços infestados das bandejas de plástico de 128 poços foram então selados com folhas adesivas de plástico transparente, e ventilado para permitir a troca de gás. As bandejas de bioensaios foram mantidas em condições ambientais controladas (28 ° C, ~40% de umidade relativa, 16: 8 (luz:escuro)) durante 9 dias, tempo após o qual o número total de insetos expostos a cada amostra, foram registrados o número de insetos mortos, e o peso de insetos sobreviventes. A percentagem de mortalidade média e inibição média de crescimento foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (GI) foi calculada como se segue: GI = [1 - (TWRR/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] onde TWIT é o peso total de insetos vivos no tratamento; TNrr é o número total de insetos no tratamento; TWIBC é o peso total dos insetos ao vivo no checagem anterior (tampão de controle); e TNIBC é o total número de insetos na verificação do fundo (tampão de controle).

[00231] A análise estatística foi feita usando software JMP™ (SAS, Cary, NC).

[00232] LC50 (concentração letal) é definida como a dose à qual 50% dos insetos de teste são mortos. GI50 (Inibição do Crescimento) é definida como a dosagem para a qual o crescimento significativo (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é de 50% do valor médio visto nas amostras de Verificação.

[00233] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade e inibição do crescimento surpreendente e inesperada de larvas de verme da raiz do milho.

EXEMPLO 2 Identificação de genes alvo candidatos

[00234] Foram selecionados vários estágios de desenvolvimento da WCR (Diabrotica virgifera LeConte) para análise de transcriptoma agrupado para fornecer sequências de genes alvo candidatos para o controle pela tecnologia de RNAi de resistência de planta transgênica a insetos.

[00235] Em uma exemplificação, o RNA total foi isolado a partir de cerca de 0,9 gm total de larvas WCR de primeiro instar; (4 a 5 dias após a eclosão, realizado a 16° C), e purificou-se utilizando o seguinte método com base a fenol / TRI REAGENT® (Molecular Research Center, Cincinnati, OH):

[00236] As larvas foram homogeneizadas à temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT ® até ser obtida uma suspensão homogênea. Seguindo 5 min. incubação à temperatura ambiente, o homogeneizado foi distribuído por tubos de 1,5 mL de microcentrífuga (1 mL por tubo), 200 μL de clorofórmio foi adicionado e a mistura foi agitada vigorosamente durante 15 segundos. Depois de deixar a extração em repouso à temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12.000 x g a 4 ° C. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de 1,5 mL esterilizado, e foi adicionado um volume igual de isopropanol a temperatura ambiente. Após incubação à temperatura ambiente durante 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min a 12000 x g (4° C ou 25° C).

[00237] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e rejeitado e o sedimento de RNA foi lavado duas vezes com vortex com 75% de etanol, com a recuperação por centrifugação durante 5 min a 7500 x g (4° C ou 25° C) depois de cada lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o sedimento foi deixado para secar ao ar durante 3 a 5 minutos, e, em seguida, foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas rendeu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260 / A280 de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80 ° C até ser adicionalmente processado.

[00238] A qualidade do RNA foi determinada executando uma alíquota através de um gel de agarose a 1%. A solução de gel de agarose foi realizado utilizando tampão 10x TAE autoclavado (Tris-acetato de EDTA; concentração lx é de 0,04 M de Tris-acetato, 1 mM de EDTA (ácido etilenodiamino tetra- acético), pH 8,0) diluída com DEPC (dietilpirocarbonato) - água tratada em um recipiente autoclavado, lx TAE foi utilizado como tampão de corrida. Antes da utilização, o tanque de eletroforese e o pente de formação de poços foram limpos com RNaseAway™ (Invitrogen INC., Carlsbad, CA). Duas das amostras de RNA foram misturadas com 8 de tampão TE (10 mM Tris HCl pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 de tampão de amostra de RNA (Novagen ® catálogo n° 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70 ° C durante 3 min, resfriada até à temperatura ambiente, e 5 μL (contendo 1 μg a 2 μg de RNA) foram carregadas por cavidade. Marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente corridos em poços separados para comparação do tamanho molecular. O gel foi operado a 60 V durante 2 horas.

[00239] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total de larvas por um prestador de serviços comerciais (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), usando projeção ao acaso. A biblioteca de cDNA de larvas normalizada foi sequenciada em escala de placa 1/2 por GS FLX 454 série química Titanium™ na EUROFINS MWG Operon, o que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento médio de leitura de 348 pb. 350.000 leituras foram reunidas em mais de 50.000 contigs. Tanto a leitura desmontada quanto os contigs foram convertidos em bases de dados utilizando o programa compatível com BLAST disponível publicamente, FORMATDB (disponível a partir de NCBI).

[00240] O RNA total e bibliotecas de cDNA normalizada foram preparados de modo semelhante a partir de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento da WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupada para o rastreio do gene alvo foi construído através da combinação de membros da biblioteca de DNAc que representam as diferentes fases de desenvolvimento.

[00241] Os genes candidatos para alvejamento de RNAi foram selecionados por meio de informações sobre os efeitos letais de RNAi de genes específicos em outros insetos, como Drosophila e Tribolium. Estes genes foram hipotetizados a ser essencial para a sobrevivência e crescimento em insetos de coleópteros. Os homólogos do gene alvo selecionados foram identificados na base de dados de sequência transcriptoma como descrito abaixo. O comprimento-total ou sequências parciais de genes alvo foram amplificados por PCR para preparar moldes de produção de RNA de dupla-fita (dsRNA).

[00242] Pesquisas TBLASTN utilizando sequências codificadoras de proteínas candidato foram executados em bancos de dados compatível com BLAST contendo a sequência de Diabrotica de leitura desmontada ou os contigs montados. Sucessos significativos para uma sequência de Diabrotica (definida como melhor do que e-20 para contigs homólogos e melhor do que e-10 para a sequência de leitura desmontada homóloga) foram confirmados usando BLASTX contra o banco de dados NCBI não-redundante. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências Diabrotica do gene homólogo de candidatos identificados na pesquisa TBLASTN, de fato compreendem genes de Diabrotica, ou foram o melhor sucesso para a sequência do gene candidato não Diabrotica presente nas sequências de Diabrotica. Na maioria dos casos, os genes candidatos que Tribolium foram anotados como codificando uma proteína dando uma homologia de sequência não ambígua de uma sequência ou sequências nas sequências transcriptoma de Diabrotica. Em alguns casos, era evidente que alguns dos contigs Diabrotica ou sequência de leituras desmontadas selecionadas por homologia com um gene candidato não Diabrotica sobrepostas, e que a montagem dos contigs não tinha conseguido juntar a estas sobreposições. Nesses casos, Sequencher™ v4.9 (gene codifica CORPORATION, Ann Arbor, MI) foi utilizado para montar as sequências em sequências contíguas mais longas.

[00243] Um gene alvo candidato codificando COPI gama de Diabrotica (SEQ ID NO: l) foi identificado como um gene que pode conduzir a mortalidade das pragas de coleópteros, a inibição do crescimento, a inibição do desenvolvimento, ou a inibição da reprodução em WCR.

Genes com homologia com COPI gama de WCR

[00244] COPI refere-se ao complexo de proteína específico de revestimento que inibe o processo de brotamento na membrana cis-Golgi (Nickel, et ai. 2002. Journal of Cell Science 115, 3235-3240). O complexo coatomer COPI é composto por sete subunidades. COPI coatomer gama é uma das subunidades. A função do complexo é o transporte de vesículas a partir da extremidade-cis do complexo de Golgi de volta para o retículo endoplasmático rugoso, onde eles foram originalmente sintetizados. Outras proteínas de Diabrotica virgifera que também contêm este domínio podem compartilhar propriedades estruturais e/ou funcionais, e, assim, um gene que codifica uma destas proteínas pode compreender um gene alvo candidato que pode levar a mortalidade das pragas de coleópteros, a inibição do crescimento, a inibição do desenvolvimento, ou a inibição da reprodução em WCR.

[00245] A sequência da SEQ ID NO: 1 é nova. A sequência não é fornecida em bases de dados públicas e não é divulgado no WO/2011/025860; Pedido de Patente dos EUA No. 20070124836; Pedido de Patente dos EUA No. 20090306189; Pedido de Patente dos EUA No. US20070050860; Pedido de Patente US No.20100192265; ou Patente US No.7,612,194. A sequência de COPI gama de Diabrotica (SEQ ID NO: l) é um tanto relacionado com um fragmento de uma sequência a partir do nematodo, Trichinella spiralis (número de acesso GenBank XM_003381124.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido COPI gama de Diabrotica (SEQ ID NO: 2) é uma proteína de Tribolium casetaenum tendo número de acesso GenBank XP_973414.1 (90% semelhante, 81% idêntica sobre a região de homologia).

[00246] Transgenes dsRNA COPI gama podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para fornecer alvejamento redundante de RNAi e efeitos sinérgicos de RNAi. Os eventos de milho transgênicos expressando dsRNA que tem como alvo COPI gama são úteis para a prevenção de danos de alimentação raiz, com o verme da raiz. Os transgenes COPI gama de dsRNA representam novos modos de ação para combinar com tecnologia de proteína inseticida por Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp. ou Pseudomonas spp. em Pirâmides de Genes de Manejo da Resistência a Insetos para mitigar o desenvolvimento das populações de vermes da raiz resistentes a qualquer uma destas tecnologias de controle de verme da raiz.

[00247] Clones de comprimento completo ou clones parciais de sequências de um gene candidato de Diabrotica, aqui referido como COPI gama foram usados para gerar produtos de amplificação de PCR para a síntese de dsRNA.

[00248] A SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de DNA de 2840 pb COPI gama de Diabrotica.

[00249] A SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA de 303 pb de COPI gama reg1.

[00250] A SEQ ID NO: 4 mostra uma sequência de DNA de 332 pb de COPI gama reg2.

[00251] A SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA de 350 pb de COPI gama reg3.

[00252] A SEQ ID NO: 75 mostra uma sequência de DNA de 108 pb de COPI gama verl.

[00253] A SEQ ID NO: 76 mostra uma sequência de DNA de 140 pb de COPI gama ver2.

[00254] A SEQ ID NO: 77 mostra uma sequência de DNA de 110 pb de COPI gama ver3.

[00255] A SEQ ID NO: 78 mostra uma sequência de DNA de 200 pb de COPI gama ver4.

EXEMPLO 3 Amplificação de genes-alvo para produzir dsRNA

[00256] Os iniciadores foram concebidos para amplificar porções de regiões codificadoras de cada um dos genes alvo por PCR. Ver Tabela 1. Se for caso disso, uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; SEQ ID NO: 6), foi incorporado a extremidades 5' das cadeias senso ou antisenso amplificados. Ver a Tabela 1. O RNA total foi extraído a partir de WCR, e a primeira cadeia de cDNA foi utilizada como modelo para reações de PCR utilizando os iniciadores opostos posicionados para amplificar a totalidade ou parte da sequência do gene alvo nativo. dsRNA foi também amplificado a partir de um clone de DNA que compreende a região que codifica para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO:. 7; Shagin et al (2004) Mol Biol Evol 21 (5):841 - 50).Tabela 1. Os iniciadores e pares de iniciadores utilizados para amplificar porções de regiões de codificação do gene alvo COPI gama exemplificativo e gene de controle negativo YFP.

EXEMPLO 4 Construções de RNAi

[00257] Preparação de modelo por síntese de PCR e dsRNA.

[00258] Uma estratégia usada para fornecer modelos específicos para a produção de COPI gama e YFP dsRNA é mostrado na Figura 1. Os DNAs molde destinados a serem utilizados na síntese de dsRNA COPI gama foram preparados por PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como molde de PCR) DNAc de primeira cadeia preparado a partir de RNA total isolado a partir larvas de primeiro instar de WCR. Para cada COPI gama selecionado e região do gene alvo YFP, amplificações de PCR introduzida uma sequência promotora de T7 na extremidade 5' das cadeias senso e anti-senso amplificado (o segmento YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região codificante de YFP). Os produtos de PCR possuindo uma sequência de promotor de T7 em suas extremidades 5' de ambas as cadeias senso e anti-senso foram utilizados como molde para a transcrição para a produção de dsRNA. Ver Figura 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificados com os pares de iniciadores determinados foram: SEQ ID NO: 3 (COPI gama reg1), SEQ ID NO: 4 (COPI gama reg2), SEQ ID NO: 5 (COPI gama reg3), SEQ ID NO: 75 (COPI gama ver1), SEQ ID NO: 76 (COPI gema ver2), SEQ ID NO: 77 (COPI gama ver3), SEQ ID NO: 78 (COPI gama ver4) e YFP (SEQ ID NO: 7). RNA de cadeia dupla para o bioensaio de insetos foi sintetizado e purificado utilizando um kit de RNAi Ambion® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen). As concentrações de dsRNA foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

[00259] Construção de vetores de transformação de plantas.

[00260] Os vetores de entrada (pDAB117215 e pDAB117216) portadores de uma construção de um gene alvo por formação de hairpin que compreende segmentos de COPI gama (SEQ ID NO: l) foram montados utilizando uma combinação de fragmentos sintetizados quimicamente (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação intramolecular grampo (hairpin) por transcritos primários de RNA foi facilitada por providenciar (dentro de uma única unidade de transcrição) duas cópias de um segmento da sequência do gene alvo COPI gama em orientação oposta uma à outra, os dois segmentos separados por uma sequência de ST-LS1 íntron (SEQ ID NO: 17; Vancanneyt et al (1990) Mol Gen. Genet 220 (2): 245-50). Deste modo, a transcrição de RNAm primário contém as duas sequências de segmento de gene COPI gama como grandes repetições invertidas um do outro, separados por a sequência de íntron. Uma cópia de um promotor de ubiquitina de milho 1 (Patente US N ° 5510474) foi utilizado para dirigir a produção do transcrito de RNAm primário em grampo, e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene de milho peroxidase 5 (ZmPer5 3'UTR V2; US Patente N ° 6699984) foi utilizado para terminar a transcrição do gene expressando RNA-hairpin.

[00261] O vetor de entrada pDABl17215 compreende uma construção v3-RNA hairpin COPI gama (SEQ ID NO: 14) que compreende um segmento de COPI gama (SEQ ID NO: 1)

[00262] O vetor de entrada pDABl17216 compreende uma construção v4-RNA hairpin COPI gama (SEQ ID NO: 15) que compreende um segmento de COPI gama (SEQ ID NO: l) distinta da encontrada no pDABl 17215.

[00263] Os vetores de entrada pDAB117215 e pDAB117216 descrito acima foram usados em reações padrão de recombinação Gateway® com um vetor de destino binário típico (AOR 109805) para produzir vetores de transformação de expressão do RNA COPI hairpin gama para transformações de embrião de milho mediado por Agrobacterium (AOR 117221 e AOR 117222, respectivamente).

[00264] Um controle de vetor binário negativo, pDAB110853, que compreende um gene que expressa uma YFP hairpin dsRNA, foi construído por meio de reações convencionais de recombinação Gateway® com um vetor binário (típicos destino AOR 109805) e vetor de entrada pDAB101670. O vetor de Entrada pDAB101670 compreende uma sequência de hairpin YFP (SEQ ID NO: 16) sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene 5 de peroxidase de milho (como acima).

[00265] O vetor de destino binário pDAB109805 compreende um gene de resistência a herbicida (dioxigenase ariloxialcanoato; AAD-1 V3) (Patente US No. 7,838,733 (B2), e Wright et al (2010) Proc Natl Acad Sci EUA 107: 20240 - 5) sob a regulação de um promotor badnavirus bacilliform de cana (ScBV) (Schenk et al (1999). Plant Moles Biol 39:1221 - 1230). Uma sequência 5'UTR sintética, constituída por sequências de um gene 5’UTR da proteína de revestimento do Maize Streak Virus (MSV) e o íntron 6 a partir do gene da álcool desidrogenase 1 de milho (ADH1), está posicionada entre a extremidade 3' do segmento promotor SCBV e o códon de iniciação da região de codificação de AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR; Patente US N ° 7,179,902) foi utilizada para terminar a transcrição do RNAm de AAD-1.

[00266] Um vetor binário de controle negativo adicional, pDAB101556, o qual compreende um gene que expressa uma proteína de YFP, foi construído por meio de reações de recombinação convencionais Gateway® com um vetor de destino binário típico (pDAB9989) e vetor de entrada pDAB100287. O vetor de destino Binário pDAB9989 compreende um gene de resistência a herbicida (dioxigenase ariloxialcanoato; AAD-1 V3) (como acima), sob a regulação de expressão um promotor de ubiquitina de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR, como acima). O vetor de Entrada pDAB100287 compreende uma região de codificação YFP (SEQ ID NO: 18) sob o controle de um promotor de ubiquitina 1 do milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene 5 de peroxidase de milho (como acima) a expressão.

[00267] A SEQ ID NO: 14 apresenta uma sequência formando v3-RNA-hairpin COPI gama como encontrado em pDAB117221.

[00268] A SEQ ID NO: 14 apresenta uma sequência formando v4-RNA-hairpin COPI gama como encontrado em como encontrado em pDAB117222.

EXEMPLO 5 Triagem de candidatos a genes alvo

[00269] dsRNA sintético concebido para inibir sequências de genes alvo identificados no EXEMPLO 2 causou inibição do crescimento e da mortalidade, quando administrado a WCR em ensaios à base de dieta. COPI gama reg1, COPI gama reg2, COPI gama reg3, COPI gama verl, COPI gama ver2, COPI gama ver3, e COPI gama ver4 foram observados para expor eficácia muito maior neste ensaio sobre outros dsRNAs selecionados.

[00270] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivados de COPI gama reg1, COPI gama reg2, COPI gama reg3, COPI gama verl, COPI gama ver2, COPI gama ver3, e COPI gama ver4 cada um resultaram em mortalidade e/ou inibição do crescimento de larvas de verme da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados de bioensaios de alimentação à base de dieta de larvas de WCR, após a exposição de 9 dias para estes dsRNA, bem como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo preparada a partir de dsRNA de uma região de codificação da proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 7).Tabela 2. Resultados dos ensaios de alimentação de dieta de COPI gama dsRNA obtidos com larvas de vermes de raiz do milho ocidentais após 9 dias de alimentação. A análise de ANOVA encontrou diferenças de significância na % de mortalidade média e na percentagem media de inibição do crescimento (IG). Os meios foram separados utilizando o teste de Tukey-Kramer. * EP = Erro padrão da média. Letras entre parênteses designam níveis estatísticos. Níveis que não estão ligados da mesma letra são significativamente diferentes (P < 0,05). ** = Tampão Tris HC1 (1 mM) mais EDTA (1 mM), pH 7,2. *** = YFP - Proteína Fluorescente Amarela Tabela 3. Resumo da potência oral do dsRNA de COPI gama na larva de WCR (ng/cm2).

[00271] Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para controle de insetos RNAi-mediado. Ver Publicação de Patente Norte-Americana No. 2007/0124836, a qual divulga 906 sequências, e Patente US N° 7,612,194, que divulga 9.112 sequências. No entanto, foi determinado que muitos genes sugeridos como tendo utilidade para o controle de insetos RNAi-mediado não são eficazes no controle de Diabrotica. Também foi determinado que as sequências COPI gama reg1, COPI gama reg2, COPI gama reg3, COPI gama verl, COPI gama ver2, COPI gama ver3, e COPI gama ver4 cada uma fornecem controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, em comparação com outros genes sugeridos tendo utilidade para controle de insetos RNAi- mediada.

[00272] Por exemplo, anexina, Beta 2 espectrina, e mtRP- L4 foram uma sugerida na Patente US N° 7,612,194 para ser eficaz no controle de insetos RNAi-mediada. A SEQ ID NO: 19 é a sequência de DNA da região Anexina 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO: 20 é a sequência de DNA da região Anexina 2 (Reg 2). A SEQ ID NO: 21 é a sequência de DNA da beta 2 espectrina região 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA da beta espectrina 2 Região 2 (REG2). A SEQ ID NO: 23 é a sequência de DNA da mtRP-L4 região 1 (Reg 1), e a SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA da mtRP-L4 região 2 (Reg 2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO: 7) também foi utilizada para produzir dsRNA como um controle negativo.

[00273] Cada uma das sequências acima mencionadas foi usada para produzir dsRNA pelos métodos do Exemplo 3. A estratégia utilizada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA é mostrado na Figura 2. Os DNAs moldes destinados a serem utilizados na síntese de dsRNA foram preparados por PCR utilizando pares de iniciadores na Tabela 4 e de DNAc (como molde de PCR) de primeira cadeia preparado a partir de RNA total isolado a partir de larvas de WCR de primeiro instar. (YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA.) Para cada região do gene alvo selecionado, foram realizadas duas amplificações de PCR separadas. A primeira amplificação PCR introduziu uma sequência promotora de T7 na extremidade 5' das cadeias senso amplificadas. A segunda reação incorporou a sequência do promotor de T7 nas extremidades 5' das cadeias anti-senso. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada uma das regiões dos genes alvo foram depois misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para a produção de dsRNA. Ver Figura 2. O RNA de cadeia dupla foi sintetizado e purificado utilizando um kit de RNAi Ambion® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen). As concentrações de dsRNA foram medidos usando um espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE), e os dsRNAs foram cada um testado pelos mesmos métodos de ensaio biológico à base de dieta supra descritos. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores utilizados para produzir as moléculas de dsRNA de YFP, anexina reg1, anexina reg2, Beta espectrina 2 reg1, Beta espectrina 2 reg2, mtRP-L4 reg 1 e moléculas mtRP-L4 reg 2 dsRNA. Sequências iniciadoras YFP para utilização no método descrito na Figura 2, também são listados na Tabela 4. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação à base de dieta de larvas de WCR, após a exposição de 9 dias para estas moléculas de dsRNA. Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsRNA não resultou em nenhuma mortalidade ou inibição do crescimento de larvas de verme da raiz do milho ocidental acima que a observada com amostras de tampão TE, água, ou proteína de controle YFP.Tabela 4. Os iniciadores e pares de iniciadores utilizados para amplificar porções de regiões de codificação de genes. Tabela 5. Resultados de testes de dieta alimentar obtida com larvas de verme da raiz do milho ocidental após 9 dias* TE = Tampão Tris HCl (10 mM) mais EDTA (1 mM), pH 8.

EXEMPLO 6 Produção de Tecidos Transgênicos de Milho, compreendendo inseticidas Hairpin dsRNAs

[00274] Transformação mediada por Agrobacterium: Células, tecidos e plantas transgênicos de milho que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA como inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo COPI gama; SEQ ID NO: l), através da expressão de um gene quimérico integrado de forma estável no genoma da planta foram produzidas seguindo a transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação do milho que utilizam vetores de transformação binários ou superbinários são conhecidos no estado da técnica, como descrito, por exemplo, na Patente US N° 8,304,604, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os tecidos transformados foram selecionados pela sua capacidade para crescer em meio contendo Haloxifope e foram selecionados para a produção de dsRNA, como apropriado. Porções de tais culturas de tecidos transformadas podem ser apresentadas a larvas de verme da raiz do milho neonato para bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 1.

[00275] Iniciação de cultura de Agrobacterium: Estoques glicéricos de células de Agrobacterium cepa DAtl3192 (WO 2012/016222 A2) ancorando um vetor de transformação binário pDABl14515, pDAB115770, pDAB110853 ou pDAB101556 descrito acima (Exemplo 4) foram semeados em placas de meio AB (mínimo de Watson, et al, (1975) J. Bacteriol 123:255 - 264) contendo os antibióticos adequados e foram cultivadas a 20 ° C durante 3 dias. As culturas foram então semeadas em placas de YEP (g/L: extrato de levedura, 10; peptona, 10; NaCl 5) que contêm os mesmos antibióticos e foram incubadas a 20 ° C durante 1 dia.

[00276] Cultura de Agrobacterium: No dia do experimento, uma solução estoque de meio de Inoculação e acetosiringona foi preparado de um volume adequado para a série de construções no experimento e pipetou-se para um balão de 250 ml estéril, descartável. O meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327 - 341) continha: 2,2 mg/L de sais MS; vitaminas MS modificadas IX ISU (Frame et al, ibid.). 68,4 mg/L de sacarose; 36 mg/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio- inositol; a pH 5,4.) A acetosiringona foi adicionada ao frasco contendo o meio de Inoculação até uma concentração final de 200 μM a partir de uma solução estoque de 1 M em 100% de dimetil sulfóxido e a solução foi muito bem misturada.

[00277] Para cada construção, um ou dois ciclos completos de Agrobacterium da placa de YEP foram suspensas em 15 mL de meio de inoculação/solução estoque de acetosiringona, em um tubo de centrífuga de 50 mL estéril e descartável, e a densidade ótica da solução a 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi, em seguida, diluída a OD550 de 0,3 a 0,4 utilizando uma mistura adicional de meio de inoculação/ acetosiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium foi então colocado horizontalmente sobre um conjunto de plataforma de agitação a cerca de 75 rpm à temperatura ambiente e agitou-se durante 1 a 4 horas, enquanto a dissecação de embriões foi realizada.

[00278] Esterilização da espiga e isolamento do embrião: Embriões imaturos de milho foram obtidos a partir de plantas de Zea mays de linhagem pura B104 (Hallauer et al (1997) Crop Science 37:1405 - 1406) cultivadas na estufa e auto- ou sib- polinizadas para produzir espiga. As espigas foram colhidas cerca de 10 a 12 dias após a polinização. No dia experimental, as espigas descascadas foram esterilizadas à superfície por imersão em uma solução de 20% de lixívia comercial (ULTRA Clorox® germicida Bleach, 6,15% de hipoclorito de sódio, com duas gotas de Tween 20) e agitou-se durante 20 a 30 min, seguido por três lavagens em água deionizada estéril em uma câmara de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo 2,0 ml de uma suspensão de células de Agrobacterium adequados no líquido do meio de inoculação com 200 μM de acetosiringona, dentro do qual 2 μL de 10% de surfactante THRU® S233 (Evonik Industries; Essen, Alemanha) foram adicionados. Para um dado conjunto de experimentos, os embriões de espiga agrupados foram utilizados para cada transformação.

[00279] Co-cultivo de Agrobacterium: Após o isolamento, os embriões foram colocados sobre uma plataforma oscilante durante 5 minutos. O conteúdo do tubo foi então vertido sobre uma placa de meio de co-cultura, o qual continha 4,33 mg/L de sais MS; vitaminas MS modificada IX ISU; 30 mg/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6- dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de caseína enzimática hidrolisada; 15 mg/L de AgN03; 200 μM de acetosiringona em DMSO; e 3g/L de GELZAN™, a pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium foi removida com uma solução estéril em pipeta de transferência descartável. Os embriões foram então orientados com o escutelo virado para cima usando fórceps estéreis, com o auxílio de um microscópio. A placa foi fechada, selada com fita adesiva médica MICROPORE™ 3M™, e colocada em uma incubadora a 25 ° C com luz contínua em cerca de 60 μmol m-2s-1 de radiação fotossinteticamente ativa (PAR).

[00280] Seleção do calo e Regeneração de eventos transgênicos: Seguindo o período de co-cultura, os embriões foram transferidos para meio de repouso, que era composto de 4,33 mg/l de sais; Vitaminas MS modificada IX ISU; 30 mg/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de KOH em dicamba; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de caseína enzimática hidrolisada; 15 mg/L de AgN03; 0,5g/L de MES (ácido 2- (N- morfolino) etano-sulfônico monohidrato; FITOTECNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de carbenicilina; e 2,3g/L de GELZAN ™; a pH 5,8. Não mais do que 36 embriões foram transferidos para cada placa. As placas foram colocadas em uma caixa de plástico clara e incubadas a 27° C com luz contínua a cerca de 50 μmol m-2 s-1 PAR durante 7 a 10 dias. Embriões calosos foram então transferidas (<18 / placa) para meio de seleção I, o qual era composto de médio de repouso (acima) com 100 nM de ácido de R-Haloxifop (0,0362 mg/L; para a seleção de calos que alberga o gene AAD-1). As placas foram devolvidas para boxes limpos e incubou-se a 27 ° C com luz contínua a cerca de 50 m μmol m-2 s-1 PAR durante 7 dias. Os embriões calusados foram então transferidos (<12 / placa) para meio de seleção II, que é composto de meio de repouso (acima) com 500 nM de ácido R-Haloxifop (0,181 mg/L). As placas foram devolvidas para boxes limpos e incubou-se a 27 ° C com luz contínua a cerca de 50 m μmol m-2 s-1 PAR durante 14 dias. Esta etapa de seleção permitiu ao calo transgênico a proliferar e diferenciar ainda mais.

[00281] Calus embriogênicos em proliferação foram transferidos (<9/placa) de meio de pré-regeneração. O meio de pré-regeneração continha 4,33 mg/L de sais MS; Vitaminas MS Modificada IX ISU; 45 mg/L de sacarose; 350 mg/L de L- prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de caseína enzimática hidrolisado; 1,0 mg/L de AgN03; 0,25 mg/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L de carbenicilina; 2,5g/L GELZAN™; e 0,181 mg/L de ácido Haloxifope; a pH 5,8. As placas foram armazenadas em boxes limpos e incubou-se a 27°C com luz contínua a cerca de 50 m μmol m-2s-1 PAR durante 7 dias. Calos em regeneração foram transferidos, em seguida, (<6/placa) para meio de regeneração em PHYTATRAYS™ (Sigma-Aldrich) e incubou-se a 28 ° C com 16 horas de luz / 8 horas de escuridão por dia (aproximadamente 160 μmol m-2s-1PAR) durante 14 dias ou até que os brotos e raízes tenham desenvolvidos. O meio de regeneração continha 4,33 mg/L de sais MS; vitaminas MS Modificada IX ISU; 60 mg/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de carbenicilina; 3 mg/L de goma GELANA™; e 0,181 mg/L de ácido R-Haloxifope; a pH 5,8. Pequenos brotos com raízes primárias foram então isolados e transferidos para meio de alongamento sem seleção. O Meio de alongamento continha 4,33 mg/L de sais MS; vitaminas MS Modificada IX ISU; 30 mg/L de sacarose; e 3,5 mg/L de GELRITE ™: a pH 5,8.

[00282] Brotos de planta transformada selecionados pela sua capacidade para crescer em meio contendo Haloxifope foram transplantados a partir de PHYTATRAYS™ para pequenos vasos com substrato (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), coberto com copos ou HUMI-Domes (ARCO plásticos) então endurecido em uma câmara de crescimento CONVIRON (27°C dia / 24°C à noite, fotoperíodo de 16 horas, 50-70% RH, 200 μmol m-2s-1 PAR). Em alguns casos, os brotos transgênicos putativos foram analisados para o número de cópia do transgene relativo por ensaios de PCR quantitativa em tempo real utilizando iniciadores concebidos para detectar o gene de tolerância ao herbicida AADL integrado no genoma do milho. Além disso, ensaios de RNA qPCR foram usados para detectar a presença do ST-LS 1 de sequência íntron em RNAcd expresso de transformantes putativos. Plântulas transformadas selecionadas foram então transferidas para uma estufa para um maior crescimento e testes.

[00283] Transferência e estabelecimento de plantas To na estufa para bioensaios e produção de sementes: Quando plantas atingiram o estágio V3-V4, elas foram transplantadas para uma mistura de solo dentro de um misturador personalizado IE (PROFILE / METRO MIX 160) e cresceu para a floração na estufa (luz Tipo de exposição: Foto ou assimilação; Limite de alta luz: 1200 PAR; a duração do dia de 16 horas, 27°C dia/24°C à noite).

[00284] As plantas a ser utilizada para bioensaios de insetos foram transplantadas de pequenos potes para tinus™ 350-4 ROOTR AINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, canada;) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após o transplante para ROOTRAINERS®, as plantas foram infestadas por bioensaio.

[00285] Plantas da geração T1 foram obtidas por polinização das sedas de plantas transgênicas T0 com pólen coletados de plantas de não-transgênico linhagem elite B 104 ou outros doadores de pólen apropriados e plantando as sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos foram realizadas quando possível.

EXEMPLO 7 Análise molecular de tecidos de milho

[00286] A análise molecular (por exemplo, RNA qPCR) de tecidos de milho foram realizados em amostras de folhas e raízes que foram coletadas de plantas de estufa que cresceram nos mesmos dias que os danos de alimentação radicular foi avaliado.

[00287] Os resultados dos ensaios de RNA qPCR para o Per5 3'UTR foram utilizados para validar a expressão de transgenes em hairpin. (Um baixo nível de detecção Per5 3'UTR é esperado em plantas de milho não transformadas, uma vez que normalmente há expressão do gene endógeno Per5 em tecidos de milho.) Os resultados dos ensaios de RNA qPCR para a sequência ST-LS de um íntron (o que é essencial para a formação de moléculas de dsRNA hairpin RNAs expressos em) foram utilizados para validar a presença de transcritos de hairpin. Os níveis de expressão de RNA de transgene foram medidos em relação aos níveis de RNA de um gene do milho endógena.

[00288] Análises DNA qPCR para detectar uma porção da região de codificação do AAD1 no DNA genômico foram utilizadas para estimar o número de cópia de inserção do transgene. As amostras para as análises foram coletadas de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados foram comparados com os resultados de DNA de qPCR de ensaios concebidos para detectar uma porção de um gene nativo de cópia única, e eventos simples (com uma ou duas cópias de transgenes gama COPI) foram avançados para estudos posteriores na estufa.

[00289] Além disso, os ensaios de qPCR concebidos para detectar uma porção do gene de resistência à espectinomicina- (SpecR; ancorado nos plasmídeos vetoriais binários fora do T- DNA) foram utilizados para determinar se as plantas transgênicas continham sequências estranhas principais do plasmídeo integrado.

[00290] Nível de expressão do transcrito de hairpin de RNA: Prr 5 3'UTR qPCR: Eventos celulares de calos ou de plantas transgênicas foram analisados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) da sequência 3'UTR por 5 para determinar o nível de expressão relativa do hairpin de comprimento completo transcrição, em comparação com o nível de transcrição de um gene do milho interno (SEQ ID NO: 53; No. de Acesso GenBank BT069734), que codifica uma proteína TIP41 semelhante (isto é, um homólogo de milho de número de acesso GenBank AT4G34270; tendo uma pontuação tBLASTX de 74% de identidade). O RNA foi isolado utilizando um kit RNAeasy™ 96 (Qiagen, Valencia, CA). Após eluição, o RNA total foi submetido a DNAsel em um tratamento de acordo com o protocolo sugerido pelo kit. O RNA foi então quantificado em um espectrofotômetro NanoDrop 8000 (Thermo Scientific) e a concentração foi normalizada a 25 ng/μE. O DNAc da primeira cadeia foi preparado utilizando uma elevada capacidade de síntese de DNAc kit (Invitrogen) em um volume de 10 reação com 5 de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi ligeiramente modificado para incluir a adição de 10 μl de 100 μM T20VN oligonucleotídeo (IDT) (SEQ ID NO: 54; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C, ou G, e N é A, C, G ou T/U) para dentro do tubo de 1 mL de iniciador aleatório da mistura, a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.

[00291] Após a síntese de DNAc, as amostras foram diluídas 1:3 com água isenta de nuclease, e armazenadas a - 20°C até serem ensaiadas.

[00292] Os ensaios de PCR em tempo real separados para a Per5 3' UTR e transcrito semelhante a TIP41 foram realizados em um LightCycler™ 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) em 10 μl de volume de reação. Para o ensaio de Per5 3'UTR, as reações foram realizadas com iniciadores P5U76S (F) (SEQ ID NO: 55) e P5U76A (R) (SEQ ID NO: 56), e uma sonda ROCHE UNIVERSAL™ (UPL76; Catalog No. 4889960001; marcada com FAM). Para o ensaio de gene de referência semelhante a TIP41, os iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO: 57) e TIPmxR (SEQ ID NO: 58), e sonda HXTIP (SEQ ID NO: 59) marcada com HEX (hexaclorofluoresceína) foram usadas.

[00293] Todos os ensaios incluíram controles negativos da não-template (mistura apenas). Para as curvas padrão, um espaço em branco (água em fonte) também foi incluído na placa de origem para verificar a existência de contaminação cruzada da amostra. As sequências dos iniciadores e das sondas estão apresentadas na Tabela 6. As receitas dos componentes da reação para a detecção dos vários transcritos são reveladas na Tabela 7, e as condições de reações de PCR estão resumidas na Tabela 8. A porção fluorescente FAM (6-carboxi fluoresceína amidite) foi animado em 465 nm e a fluorescência foi medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) eram 533 nm e 580 nm.Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeos utilizados para análises moleculares de níveis de transcrição de milho transgênico. * TIP41-como proteína. ** NAV - Sequencia não está disponível a partir do fornecedor. Tabela 7. Receitas de reação de PCR para a detecção de transcrição. Tabela 8. Condições do termociclador durante RNA qPCR.

[00294] Os dados foram analisados usando Software vl.5 LightCycler™ para quantificação relativa utilizando um segundo algoritmo max derivado para o cálculo dos valores Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para as análises de expressão, os valores de expressão foram calculados usando o método AACT (isto é, 2- (Cq ALVO - Cq REF)), que se baseia na comparação de diferenças de valores Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 a ser selecionado sob o pressuposto de que, para reações de PCR otimizadas, o produto duplicado em cada ciclo.

[00295] Tamanho do transcrito hairpin e integridade: Análise por Northern Blot: Em alguns casos, a caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida através da utilização de análise de Northern blot (RNA blot) para determinar o tamanho molecular do RNA COPI hairpin gama em plantas transgênicas expressando um hairpin COPI gama dsRNA.

[00296] Todos os materiais e equipamentos são tratados com RNAZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são recolhidas em tubos SAFELOCK EPPENDORF de 2 mL, interrompido com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA), com três esferas de tungstênio em 1 mL de TRIZOL (Invitrogen) durante 5 min, em seguida, incubada à temperatura ambiente (TA) durante 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas durante 10 min a 4°C a 11.000 rpm e o sobrenadante é transferido para um novo tubo SAFELOCK EPPENDORF de 2 ml. Depois 2 00 μl de clorofórmio são adicionados ao homogenato, o tubo é misturado por inversão durante 2 a 5 min, incubou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos, e centrifugado a 12.000 x g durante 15 min a 4°C. A fase superior é transferida para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml esterilizado, 600 μl de isopropanol a 100% são adicionados, seguido por incubação à temperatura ambiente durante 10 min a 2 h, e em seguida centrifugada a 12.000 x g durante 10 min a 4°C a 25°C. O sobrenadante é rejeitado e o sedimento de RNA é lavado duas vezes com 1 mL de etanol a 70%, com centrifugação a 7500 x g durante 10 min a 4° a 25 °C entre as lavagens. O etanol é eliminado e o sedimento é seco ao ar com brevidade em 3 a 5 minutos antes de ressuspensão em 50 μl de água isenta de nuclease.

[00297] O RNA total foi quantificado usando o NANODROP8000® (Thermo-Fisher) e as amostras são normalizadas para 5 μg/10 μL. 10 μL de glioxal (Ambion / Invitrogen) são então adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura marcador padrão RNA DIG (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) são dispensados e adicionada a um volume igual de glioxal. As amostras e os marcadores RNAs são desnaturados a 50°C durante 45 min e armazenada em gelo até um carregamento em agarose Seakem OURO 1,25% de gel (Lonza, Allendale, NJ) em NORTHERNMAX 10 X tampão de corrida glioxal (Ambion / Invitrogen). RNAs são separados por eletroforese a 65 volts / 30 mA durante 2 h e 15 min.

[00298] A seguir à eletroforese, o gel é lavado em 2X SSC durante 5 min e fotografado em uma estação GEL DOC (BioRad, Hercules, CA), em seguida, o RNA é passivamente transferido para uma membrana de nylon (Millipore) durante a noite à TA, utilizando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste de cloreto de sódio 3 M e citrato trissódico 300 mM, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é lavada em 2X SSC durante 5 minutos, o RNA é UV-reticulado à membrana (Agilent / Stratagene), e a membrana é deixada a secar à temperatura ambiente durante 2 dias.

[00299] A membrana é pré-hibridizada em tampão de ULTRAHYB (Ambion / Invitrogen) durante 1 a 2 horas. A sonda consiste em um produto amplificado por PCR contendo a sequência de interesse, (por exemplo, a porção da sequência anti-senso de SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15, conforme apropriado) marcada com digoxigenina por meio de um procedimento de ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridização em tampão recomendado é a noite a uma temperatura de 60°C em tubos de hibridização. Após a hibridização, a mancha é sujeita a lavagens DIG, embrulhado, exposta a película durante 1 a 30 minutos, em seguida, a película é toda desenvolvida por métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.

[00300] Determinação do número de cópias do transgene. Pedaços de folhas de milho, aproximadamente, equivalente a 2 punções de folha foram recolhidos em placas de coleta de 96- poços (Qiagen). As rupturas do tecido foram realizadas com um pulverizador de tecido Klecko™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão BIOSPRINT96 API lise (fornecido com um BIOSPRINT96 PLANTA Krr; Qiagen) com um cordão de aço inoxidável. Na sequência de maceração dos tecidos, DNA genômico (gDNA) foi isolada em formato de alta taxa de transferência usando um KIT BIOSPRINT96 PLANT e um robô de extração BIOSPRINT96. O DNA genômico foi diluído 2:3 DNA:água antes de configurar a reação qPCR. A análise qPCR de detecção do Transgene por ensaio de sonda de hidrólise foi realizada por PCR em tempo real usando um sistema de LIGHTCYCLER®480. Os oligonucleotídeos a serem utilizados em ensaios de sonda de hidrólise detectam a sequência de intron ST-LS1 (SEQ ID NO: 17), ou detectam uma porção do gene SpecR(ou seja, o gene de resistência à espectinomicina suportados nos plasmídeos de vetor binário; SEQ ID NO: 71; SPC1 oligonucleotídeos na Tabela 9), foram projetados usando LightCycler® SONDA design de software 2.0. Além disso, os oligonucleotídeos a serem utilizados em ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância herbicida AAD-1 (SEQ ID NO: 65; oligonucleotídeos GAAD1 na Tabela 9) foram desenhados usando software Primer Express (Applied Biosystems). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e sondas. Os ensaios foram multiplexados com reagentes para um gene cromossômico endógeno do milho (invertase (SEQ ID NO: 62; N° de acesso GenBank: U16123; aqui referido como rVRl), o qual serviu como uma sequência de referência interna para garantir que DNAg estava presente em cada ensaio. Para amplificação, LIGHTCYCLER®480 SONDAS Master mix (Roche Applied CIÊNCIA) foi preparada em uma concentração final de lx de uma 10 μl de reação multiplex de volume contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação em duas etapas foi realizada como delineado na Tabela 11. A ativação do fluoróforo e o de emissão para as sondas marcadas -FAM e -HEX foram tal como descrito acima. Conjugados Cy5 são excitados no máximo a 650 nm e fluorescência no máximo a 670 nm pontuações Cp (o ponto no qual o sinal de fluorescência ultrapassa o limiar de fundo) foram determinados a partir do tempo real de dados de PCR utilizando o algoritmo de ajuste de pontos (LightCycler® versão de software 1.5) e o módulo Quant Relativa (baseado no método de AACT) os dados foram tratados como descrito anteriormente (acima; RNA qPCR).Tabela 9. As sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) utilizado nas determinações do número de cópia do gene e detecção da estrutura do plasmídeo vetor binário. Tabela 10. Componentes de reação para a análise do número de cópias do gene e detecção da estrutura do plasmídeo. *NA = Não aplicável **ND = Não Determinado Tabela 11. Condições do termociclador durante DNA qPCR

EXEMPLO 8 Bioensaio de milho transgênico

[00301] Bioensaio de insetos in vitro: A bioatividade de dsRNA da presente invenção produzida em células vegetais é demonstrada através de métodos de bioensaio. Ver, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25 (11): 1322- 1326. Um deles é capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, pela alimentação de vários tecidos vegetais ou pedaços de tecido derivados de uma planta produtora de um RNAdc inseticida de inseto-alvo em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados a partir de vários tecidos de planta derivadas de uma planta que produza o inseticida dsRNA e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados em cima de dietas artificiais para bioensaios como anteriormente aqui descrito. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com os bioensaios realizados de forma semelhante, que empregam tecidos de controle adequados a partir de plantas hospedeiras que não produzem um inseticida dsRNA, ou a outras amostras de controle.

[00302] Bioensaios de insetos com eventos de milho transgênico: Duas larvas de verme da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) provenientes de ovos lavados são selecionados e colocados em cada poço da placa de ensaio biológico. Os poços são, em seguida, cobertos com uma tampa guia “PULL N’ PEEL” (BIO-CV-16, BIO-Serv) e colocada em uma incubadora de 28°C com um ciclo de 18 h/6 hr claro/escuro. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, a qual é calculada como a percentagem de insetos mortos em relação ao número total de insetos em cada tratamento. As amostras de inseto são congeladas a -20°C durante dois dias, em seguida, a larvas de inseto a partir de cada tratamento são reunidas e pesadas. A percentagem de inibição de crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pela média do peso médio dos dois tratamentos de controle do poço. Os dados são expressos como uma percentagem de inibição de crescimento (controle negativo). Os pesos médios que excedem o controle do peso médio são normalizados para zero.

[00303] Bioensaios de insetos na estufa: Ovos de verme da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera LeConte) foram recebidos no solo a partir de características da cultura (Farmington, MN). Os ovos de WCR foram incubados a 28°C durante 10 a 11 dias. Os ovos foram lavados a partir do solo, colocados em uma solução de agar a 0,15%, e a concentração foi ajustada a cerca de 75 a 100 ovos por 0,25 mL alíquota. Uma placa portal foi criada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovos para monitorar as taxas de incubação.

[00304] O solo ao redor das plantas de milho que crescem em ROOTRAINERS® foi infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos foram autorizados a alimentar durante 2 semanas, após o que a “Avaliação Root” foi dado a cada planta. Uma escala de lesão no nó foi utilizada para a classificação essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005, J. Econ Entomol 98:1 - 8). As plantas que passaram por esses bioensaios foram transplantadas para vasos de 5 galões para produção de sementes. Transplantes foram tratados com inseticida para evitar mais danos ao verme da raiz e liberação de insetos nas estufas. As plantas eram polinizadas manualmente para produção de sementes. As sementes produzidas por essas plantas foram guardadas para avaliação no T1 e as gerações seguintes de plantas.

[00305] Os bioensaios em estufa incluíram dois tipos de plantas de controle negativo. As plantas de controle negativo transgênicas foram geradas por transformação com vetores que alberga genes concebidos para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP) ou um hairpin YFP dsRNA (ver Exemplo 4). As plantas de controle negativo não transformadas foram cultivadas a partir de sementes de linhagens 7sh382 ou B104. Os bioensaios foram realizados em duas datas separadas, com os controles negativos em cada conjunto de materiais de plantas.

[00306] A Tabela 12 mostra os resultados combinados das análises e ensaios biológicos moleculares para plantas hairpin COPI gama. O exame dos resultados do bioensaio resumidos na Tabela 12 revela a observação surpreendente e inesperada de que a maior parte das plantas de milho transgênicas portadoras de construções que expressam um dsRNA hairpin COPI gama que compreende segmentos de SEQ ID NO: l, por exemplo, tal como exemplificado na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, estão protegidos contra danos da raiz efetuada pela alimentação das larvas de verme da raiz do milho ocidental. Vinte e dois dos 37 eventos classificados teve uma classificação de raiz de 0,5 ou inferior. A Tabela 13 mostra os resultados combinados de análises moleculares e bioensaios para plantas de controle negativo. A maioria das plantas não tinham proteção contra a alimentação de larvas de WCR, embora cinco doa 34 plantas graduadas teve uma classificação de raiz de 0,75 ou inferior. A presença de algumas plantas que têm baixa audiência de pontuações de raiz entre o conjunto de plantas de controle negativo às vezes é observada e reflete a variabilidade e dificuldade de realizar este tipo de ensaio biológico em um ambiente de estufa.Tabela 12. Resultados de Bioensaios de Estufa e análises moleculares de plantas de milho expressando COPI gama-hairpin v4 e COPI gama-hairpin v3. *RTL = Nível de Transcrição Relativo como medido contra níveis de transcrição do gene semelhante a TIP4. ** NG = Sem Classificação devido ao pequeno tamanho da planta. Tabela 13. Resultados dos bioensaios de Estufa e análises moleculares de plantas de controle negativo contend transgênicos e plantas de milho não transformadas. 1 RTL = Nível de Transcrição Relativo medido em relação aos níveis de transcrição do gene semelhante a TTP4. 2 * NG = Sem Classificação devido ao pequeno tamanho da planta. 3 ** ND = não realizado.

EXEMPLO 9 Zea mays transgênica compreendendo sequências de praga de Coleóptero

[00307] Dez a 20 plantas Zea mays transgénicas T0 são gerados tal como descrito no EXEMPLO 6. Uma linhagem adicional independente de 10 - 20 Zea mays T1 que expressam dsRNA hairpin para uma construção RNAi são obtidas para o desafio de verme da raiz do milho. dsRNA hairpin pode ser derivado tal como estabelecido na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou de outra forma, compreendendo ainda a SEQ ID NO: l. dsRNAs hairpin adicionais podem ser derivados, por exemplo, a partir de sequências de pragas de coleópteros, tais como, por exemplo, Cafl-180 (publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0174258), VatpaseC (publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0174259), Rhol (publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente US No. 2012/0198586), PPI-87B (publicação do pedido de Patente US No. 2013/0091600), RPA70 (publicação do Pedido de Patente US No. 2013/0091601), ou RPS6 (publicação do Pedido de Patente US No. 2013/0097730). Estes são confirmados por meio de outros métodos de análise molecular ou RT-PCR. Preparações de RNA total de linhagens independentes T1 selecionados são opcionalmente utilizados para RT-PCR com iniciadores concebidos para se ligarem no íntron ST-LS1 do cassete de expressão hairpin em cada uma das construções de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em uma construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção dos RNAm pré- processados necessários para a produção de siRNA na planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta transgênica Zea mays. Processamento do hairpin dsRNA dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmada em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações RNA blot.

[00308] Além disso, as moléculas de RNAi com sequências de emparelhamentos incorretas com mais de 80% de identidade de sequência com genes alvo afetam larvas da raiz do milho de uma forma semelhante ao observado com as moléculas de RNAi com 100% de identidade de sequência com os genes alvo. A incompatibilidade de emparelhamento de sequência com sequências nativas para formar um hairpin dsRNA na mesma construção RNAi fornece planta-siRNAs transformadas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação de pragas de coleópteros.

[00309] A distribuição in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondentes para alvejar genes e a absorção subsequente por pragas de coleópteros, através de alimentação resulta em sub-regulação dos genes-alvo, em que a praga de coleópteros através de silenciamento de genes mediada por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em uma ou mais fases de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução da praga coleópteros é afetada, e, no caso de pelo menos uma das WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva ao fracasso para sucessivamente infestar, alimentar, desenvolver e/ou reproduzir, ou leva à morte da praga de coleópteros. A escolha de genes-alvo e a aplicação bem-sucedida de RNAi é então utilizada para controlar pragas de coleópteros.

[00310] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays não transformada: Genes alvos de pragas de coleópteros ou sequências selecionadas para a criação de dsRNA hairpin não têm nenhuma semelhança com qualquer sequência de genes de plantas conhecidas. Por isso, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construções de alvejamento destes genes de pragas de coleópteros ou sequências terão qualquer efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como os das linhagens transgênicas transformadas com um vetor “vazio” não tendo qualquer gene que expressa hairpin. Características da raiz da planta, broto, folhagem e reprodução são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento da raiz e crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto da planta como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e sem expressão de moléculas-alvo iRNA quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 10 Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de praga de Coleóptero e Construções adicionais de RNAi

[00311] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita para uma molécula de iRNA que se destina a um organismo que não seja uma praga coleópteros é secundariamente transformada através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59 - 67) para produzir uma ou mais moléculas inseticidas de dsRNA (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo a SEQ ID NO: l). Os vetores plasmídicos de transformação de plantas preparados essencialmente como descrito no Exemplo 4 são entregues via Agrobacterium ou WHISKERS™ mediada por métodos de transformação em células em suspensão de milho ou de embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta Zea mays transgênica B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga, em que o seu genoma é transcrito em uma molécula de iRNA que se destina a um organismo que não seja uma praga de coleópteros.

EXEMPLO 11 Zea mays transgênica compreendendo uma construção de iRNA e sequências controle adicionais de praga de Coleóptero

[00312] Uma planta transgénica de Zea mays, compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita para uma molécula de iRNA que tem como alvo um organismo de praga de coleópteros (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1) é secundariamente transformada através de metodologias Agrobacterium ou WHISKERS™ (veja Petolino e Arnold (2009) Methods Mol Biol 526:59 - 67) para produzir uma ou mais moléculas de proteínas inseticidas, por exemplo, proteínas inseticidas CrylB, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry7A, cry8, Cry9D, Cryl4, Cryl8, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, CytlA, e Cyt2C. Os vetores plasmídicos de transformação de plantas preparado essencialmente como descrito no Exemplo 4 são entregues via Agrobacterium ou WHISKERS™ mediada por métodos de transformação em células em suspensão de milho ou dos embriões de milho imaturos obtidos a partir de um planta Zea mays transgênica B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que tem como alvo um organismo de pragas de coleópteros. As plantas duplamente transformadas são obtidas, que produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para controle de pragas de coleópteros.

EXEMPLO 12 Mortalidade de percevejo marrom (Euschistus heros) após injeção iRNA COPI gama

[00313] Colônia de percevejo marrom neotropical (BSB; Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora a 27° C, a 65% de umidade relativa, com 16: 8 de ciclo claro:escuro. Um grama de ovos recolhidos ao longo de 2 - 3 dias foram semeados em recipientes de 5L com discos de papel de filtro na parte inferior; os recipientes foram cobertos com # 18 mesh para ventilação. Cada recipiente de criação rendeu cerca de 300 - 400 BSB adulto. Em todas as fases, os insetos foram alimentados com feijão verde fresco três vezes por semana, uma saqueta de mistura de sementes que continha as sementes de girassol, soja e amendoim (3:1:1 de proporção em peso) foi substituída uma vez por semana. A água foi suplementada em frascos com tampões de algodão como pavios. Após as duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para novo recipiente uma vez por semana.

[00314] Dieta artificial de BSB. A dieta artificial de BSB foi preparada como se segue (usada no prazo de duas semanas de preparação). Feijões verdes liofilizados foram misturadas até um pó fino em um misturador MAGIC BULLET® enquanto matérias orgânicas (amendoim) foram misturadas em um misturador MAGIC BULLET® separado. Ingredientes misturados a seco foram combinados (percentagens em peso: feijão verde, 35%; amendoins, 35%; sacarose, 5%; vitamina do complexo (por exemplo, mistura de vitamina Vanderzant para insetos, Sigma- Aldrich, Catalog No. V1007), 0,9%); em um grande misturador MAGIC BULLET®, o qual foi fechado e agitado para misturar bem os ingredientes. Os ingredientes misturados a seco foram então adicionados a um recipiente de mistura. Em um recipiente separado, a água e agente anti-fúngico benomil (50 ppm; 25 μl de uma solução de solução de dieta 20000 ppm/50 mL) foram bem misturados e, em seguida, adicionada à mistura de ingredientes secos. Todos os ingredientes foram misturados manualmente até que a solução tenha sido totalmente misturada. A dieta foi moldada em tamanhos desejados, embrulhada em folha de alumínio frouxamente, aquecida durante 4 horas a 60°C, em seguida, resfriada e armazenada a 4°C.

[00315] Montagem do transcriptoma de BSB. Foram selecionados seis estágios de desenvolvimento de BSB para preparação de biblioteca de mRNA. O RNA total foi extraído a partir de insetos congelados a -70°C e homogeneizado em 10 volumes de tampão de lise/obrigatório em 2 tubos de Lise matriz A mL (MP Biomedicals, Santa Ana, CA) em um instrumento FastPrep®-24 (DSL). O RNAm total foi extraído usando um kit de isolamento de miRNA miRvana™ (Ambion; Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequenciamento de RNA utilizando um sistema de HiSeq™ illumina® (San Diego, CA) forneceu sequências de genes alvo candidatos para utilização em tecnologia de RNAi de controle de insetos. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra usando software assembler TRINDADE (Grabherr et al (2011) Nature Biotech 29:644-652). Os transcritos agrupados foram combinados para gerar uma transcriptoma agrupado. Este transcriptoma agrupado de BSB contém 378.457 sequências.

[00316] Identificação COPI gama ortólogo de BSB. Uma busca tBLASTn do transcriptoma agrupado de BSB foi realizada utilizando como consulta as sequências de proteína COPI gama de Drosophila yCOP-PA, yCOP-PB, e yCOP-PC: Acesso do GenBank Nos NP_524608, NP_733432, e NP_001163784, respectivamente. COPI gama de BSB (SEQ ID NO: 87) foi identificada como um produto do gene alvo candidato de Euschistus heros com sequência peptídica prevista na SEQ ID NO: 88.

[00317] Preparação de moldes e síntese dsRNA. cDNA foi preparado a partir de RNA total de BSB extraído de um único inseto adulto jovem (cerca de 90 mg) utilizando reagente TRIzol® (Life Technologies). O inseto foi homogeneizado à temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 200 de TRIzol®, usando um pilão de sedimento (Fisherbrand Catalog No. 12-141-363) e pilão motor da misturadora (Cole- Parmer, Vernon Hills, IL). Na sequência da homogeneização, um adicional de 800 μl foi adicionado de TRIzol®, o homogeneizado foi submetido a vórtice, e depois incubado à temperatura ambiente durante cinco minutos. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Seguindo o protocolo de extração TRIzol® recomendado pelo fabricante durante 1 mL de TRIzol ®, o sedimento de RNA foi seco à temperatura ambiente e ressuspenso em 200 μl de tampão Tris a partir de um DNA de PCR GFX e um kit tipo Gel Extraction (Illustra™; GE Healthcare CIÊNCIAS DA VIDA) utilizando tampão de eluição de 4 (isto é, 10 mM de Tris-HCl pH 8,0). A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro NanoDrop ™ 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

[00318] Amplificação de cDNA. O cDNA foi sujeito a transcrição reversa a partir de 5 μg de modelo de RNA total de BSB e iniciador oligo dT utilizando um sobrescrito ni primeira cadeia Synthesis System™ para RT-PCR (Invitrogen), seguindo o protocolo recomendado pelo fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi levado a 100 μL com água isenta de nuclease.

[00319] Os iniciadores BSB_yCOP-2-for (SEQ ID NO: 90) e BSB_yCOP-2-Rev (SEQ ID NO: 91) foram usados para amplificar a região 2 de COPI gama de BSB, também referida como molde BSB- COPI gama-2. O molde de DNA foi amplificado por PCR touchdown (temperatura de anelamento reduzida de 60°C a 50°C em l°C/ciclo diminuído) com 1 μL de cDNA (acima) como molde. Fragmento compreendendo 495 pb do segmento de BSB _COPI gama- 2 (SEQ ID NO: 89) foi gerado durante 35 ciclos de PCR. O procedimento anterior foi também utilizado para amplificar um modelo de 301 pb de controle negativo YFPv2 (SEQ ID NO: 92) usando iniciadores YFPv2-F (SEQ ID NO: 93) e YFPv2-R (SEQ ID NO: 94). Os iniciadores BSB_COPI gama e YFPv2 continham uma sequência do promotor do fago T7 (SEQ ID NO: 6) nas suas extremidades 5', e, assim, permitiu o uso de fragmentos de DNA YFPv2 e BSB_ COPI gama para a transcrição de dsRNA.

[00320] Síntese dsRNA. dsRNA foi sintetizado utilizando 2 μL de produto de PCR (acima) como o modelo com um kit MEGAscript ™ RNAi (Ambion) utilizado de acordo com as instruções do fabricante. (Ver figura 1). dsRNA foi quantificado em um espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 e diluído para 500 ng/μL em tampão TE 0,1X livre de nuclease (1 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM, pH 7,4).

[00321] Injeção de dsRNA em BSB hemoceol. BSB foram criadas em dieta de feijão verde e sementes, como a colônia, em uma incubadora a 27°C a 65% de umidade relativa e 16:8 de ciclo de fotoperíodo claro: escuro. Segundo ninfas (pesando cada um deles 1 a 1,5 mg) foram suavemente tratadas com uma escova pequena para evitar lesões e foram colocados em uma placa de Petri sobre gelo para relaxar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de uma solução a 500 ng/μl dsRNA (ou seja, 27,6 ng dsRNA; dose de 18,4-27,6 μg/g de peso corporal). As injeções foram realizadas utilizando um injetor Nanoject™ II (DRUMMOND CIENTÍFICA, Broomhall, PA) equipada com uma agulha de injeção puxado a partir de um Drummond de 3,5 polegadas # 3-000-203-G/X capilar de vidro. A ponta da agulha estava quebrada e o capilar foi preenchido com óleo mineral leve, então preenchido com 2-3 μL de dsRNA. O dsRNA foi injetado no abdómen das ninfas (10 insetos injetados com dsRNAdc por ensaio), e os testes foram repetidos em três dias diferentes. Insetos injetados (5 por poço) foram transferidas para bandejas de 32 poços (Bio-RT-32, bandeja de elevação; BIO- Serv, Frenchtown, NJ) contendo um pellet de dieta artificial BSB e coberto com abas Pull-N- Peel™ (BIO -CV-4; BIO-SERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 mL de água em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, com uma mecha de algodão. Os tabuleiros foram incubados a 26,5° C, 60% de umidade e ciclo de fotoperíodo de 16:8 de claro:escuro. As contagens de viabilidade e pesos foram tiradas no dia 7 após as injeções.

[00322] Injeções identificadas de BSB-COPI gama como um alvo dsRNA letal. dsRNA que tem como alvo a região de codificação do segmento de YFP, YFPv2 foi utilizado como um controle negativo em experimentos de injeção de BSB. Tal como resumido na Tabela 14, 27,6 ng de dsRNA BSB-COPI gama-2 injetado no hemoceol de 2o instar de ninfas BSB produziu elevada mortalidade no prazo de sete dias. A mortalidade causada por dsRNA BSB_COPI gama-2 foi significativamente diferente do observado com a mesma quantidade de dsRNA injetado YFPv2 (controle negativo), com p = 0,001935 (teste de t-Student).Tabela 14 - Resultados de injeção dsRNA BSB-COPI gama-2 no hemoceol de ninfas de 2o estágio de percevejo marrom em sete dias após a injeção.*Dez insetos injetados por ensaio para cada dsRNA.

EXEMPLO 13 Zea mays transgênica compreendendo por sequências de pragas de hemípteros

[00323] Dez a 20 plantas transgênica de Zea mays portadoras de vetores de expressão de ácidos nucleicos que compreendem a SEQ ID NO: 87 e/ou SEQ ID NO: 89 são geradas tal como descrito no Exemplo 7. Uma outra linhagem independente T1 de Zea Mays 10-20 expressando dsRNA hairpin para uma construção RNAi são obtidas para desafio BSB. dsRNA hairpin pode ser derivado tal como estabelecido na SEQ ID NO: 89 ou de outro modo que compreende ainda a SEQ ID NO: 87. Estes são confirmadas por meio de outros métodos de análise molecular ou RT-PCR. Preparações de RNA total a partir de linhagens independentes T1 selecionadas são opcionalmente utilizadas para RT-PCR com iniciadores concebidos para se ligarem no íntron de ST-LS1 do cassete de expressão hairpin em cada uma das construções de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em uma construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do RNAm pré-processado necessária para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta transgênica de Zea mays. Processamento do hairpin dsRNA dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmada em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações RNA blot.

[00324] Além disso, as moléculas de RNAi com sequências de emparelhamentos incorretas com mais de 80% de identidade de sequência com genes alvo afetam larvas da raiz do milho de uma forma semelhante ao observado com as moléculas de RNAi com 100% de identidade de sequência com os genes alvo. A incompatibilidade do emparelhamento de sequência com sequências nativas para formar um hairpin dsRNA na mesma construção RNAi fornece siRNAs processados de plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade da alimentação de pragas hemípteros.

[00325] Distribuição in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miRNA correspondentes para alvejar genes e a absorção subsequente por pragas de hemípteros através de alimentação resulta em sub-regulação dos genes-alvo na praga de hemíptero através de silenciamento de genes mediada por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em uma ou mais fases de desenvolvimento, crescimento, desenvolvimento e a reprodução da praga hemíptero é afetada, e, no caso de pelo menos um dos Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare e Euschistus servus leva ao fracasso para sucessivamente infestar, alimentar, desenvolver e/ou reproduzir, ou levar à morte da praga de hemíptero. A escolha de genes-alvo e a aplicação bem-sucedida de RNAi é então utilizada para controlar pragas de hemípteros.

[00326] Comparação fenotípica de linhagens RNAi transgênicas e Zea mays não transformada: genes alvos de pragas de hemípteros ou sequências selecionadas para a criação de dsRNA hairpin não têm nenhuma semelhança com qualquer sequência de genes de plantas conhecidas. Por isso, não se espera que a produção ou a ativação (sistêmica) de RNAi por construções dirigidas a esses genes ou sequências de pragas de hemíptero tenham qualquer efeito deletério sobre plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como os das linhagens transgênicas transformadas com um vetor “vazio” não tendo qualquer gene que expressa hairpin. As características da raiz da planta, broto, folhagem e reprodução são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento da raiz e crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto da planta como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e sem expressão de moléculas-alvo iRNA quando cultivadas in vitro e no solo da estufa.

EXEMPLO 14 Glycine max transgênica compreendendo por sequências de pragas de hemípteros

[00327] Dez a 20 plantas transgênicas de Glicina max abrigando vetores de expressão para ácidos nucleicos que compreende a SEQ ID NO: 87 e/ou SEQ ID NO: 89 são geradas tal como é conhecido no estado da técnica, incluindo, por exemplo, por transformação mediada por Agrobacterium, tal como segue. Sementes maduras de soja (Glycine max) foram durante a noite esterilizadas com gás de cloro durante dezesseis horas. Após esterilização com gás de cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma câmara de fluxo laminar™ para dissipar o gás de cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas são embebidas com H20 esterilizada durante dezesseis horas no escuro usando uma caixa negra a 24°C.

[00328] Preparação de semente de soja dividida. A semente de soja dividida que compreende uma parte de um protocolo de eixo embrionário necessária para a preparação de material de semente de soja, que é cortado longitudinalmente, utilizando uma lâmina de # 10 afixada a um bisturi, ao longo do hilo das sementes para separar e remover o revestimento de semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédones. Atenção especial é feita para remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 - 1/3 do eixo do embrião permanece ligada à extremidade nodal do cotilédone.

[00329] Inoculação. As sementes divididas de soja que compreende uma porção parcial dos eixos embrionários são então imersas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo o plasmídeo binário compreendendo SEQ ID NO: 87 e/ou SEQ ID NO: 89. A solução de Agrobacterium tumefaciens é diluída para uma concentração final de À=0.6 OD650antes de imergir os cotilédones que compreendem o eixo do embrião.

[00330] Co-cultivo. Após a inoculação, a semente dividida de soja é permitida a co-cultivar com a cepa de Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias em meio co-cultivo (Wang, Kan Protocolos Agrobacterium 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.

[00331] Indução dos brotos. Após 5 dias de co-cultivo, as sementes divididas de soja são lavadas em indução de brotos em meio líquido (SI) que consistem em sais B5, vitaminas B5, 28 mg/L ferrosos, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 mg/L de sacarose, 0,6 mg/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L timentina™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7). As sementes divididas de soja são então cultivadas na indução de brotos I em (SI I) meio constituído por sais B5, vitaminas B5, 7 mg/L agar, 28 mg/L de ferrosos, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 mg/L de sacarose, 0,6 mg/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 50 mg/L timentina™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone voltada para cima e a extremidade nodal do cotilédone embutida para o meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes de semente dividida de soja transformadas são transferidas para a indução de brotos π (SI II) em meio contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (Liberty®).

[00332] Alongamento dos brotos. Após 2 semanas de cultura em meio de SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma placa de brotos de descarga que contém os eixos embrionários são excisados, fazendo um corte na base do cotilédone. A placa de brotos isolados dos cotilédones é transferido para meio de Alongamento de broto (SE). O meio SE consiste em sais de MS, 28 mg/L de ferrosos, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 mg/L de sacarose e 0,6 mg/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de L-piroglutâmico, 0,1 mg / g ácido IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de ribosido de zeatina, 50 mg/L timentina ™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato, 7 mg/L de agar Noble, (pH 5.7). As culturas foram transferidas para meio fresco a cada 2 SE semanas. As culturas são crescidas em uma câmara de crescimento Conviron™ a 24° C com um fotoperíodo de 18 h a uma intensidade luminosa de 80 - 90 μmol / m2seg

[00333] Enraizamento. Brotos alongados que se desenvolveram a partir da placa de brotos de cotilédone são isolados por corte do broto alongado na placa de brotos de cotilédone, e mergulhando o broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido 3-butírico indol) durante 1 - 3 minutos para promover o enraizamento. Em seguida, os brotos alongados são transferidos para meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L ferrosos, 38 mg/L de Na2EDTA, 20g/L de sacarose e 0,59g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L L- piroglutâmico ácido 7g/L de agar Noble, pH 5,6) em bandejas Phytá.

[00334] Cultivo: Após a cultura em uma câmara de crescimento Conviron™ a 24 ° C, fotoperíodo de 18 h, durante 1 - 2 semanas, os brotos que se desenvolveram em raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de Sundae coberto e colocado em uma câmara de crescimento Conviron™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuridão) a uma intensidade de luz de 120-150 μmol/m2seg sob temperatura constante (22°C) e umidade (40-50% ) para aclimatação de mudas. As plântulas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes de serem transferidas para a estufa para posterior aclimatização e o estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[00335] Um adicional de 10-20 linhagens independentes T1 de Glycine max que expressam hairpin dsRNA para uma construção RNAi são obtidas para desafio BSB. Hairpin dsRNA pode ser derivado tal como estabelecido na SEQ ID NO: 89 ou de outro modo que compreende ainda a SEQ ID NO: 87. Estes são confirmadas por meio de outros métodos de análise molecular ou RT-PCR. Preparações de RNA total de linhagens independentes T1 selecionadas são opcionalmente utilizadas para RT-PCR com iniciadores concebidos para se ligarem no íntron ST-LS1 do cassete de expressão de hairpin em cada uma das construções de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em uma construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção dos RNAm pré-processados necessários para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta transgênica Glycine max. O processamento de dsRNA hairpin dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmada em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações RNA blot.

[00336] Além disso, as moléculas de RNAi com sequências de emparelhamentos incorretas com mais de 80% de identidade de sequência com genes alvo afetam as larvas da raiz do milho de uma forma semelhante ao observado com as moléculas de RNAi com 100% de identidade de sequência com os genes alvo. A incompatibilidade do emparelhamento de sequência com sequências nativas para formar um hairpin dsRNA na mesma construção RNAi fornece siRNAs processados de plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação de pragas de hemípteros.

[00337] A distribuição in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miRNA correspondentes para alvejar genes e a absorção subsequente por pragas de hemípteros através de alimentação resulta em sub-regulação dos genes-alvo, na praga de hemíptero através de silenciamento de genes mediada por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em uma ou mais fases de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução da praga hemíptero é afetada, e, no caso de pelo menos um dos Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus leva sucessivamente ao fracasso para infestar, alimentar, desenvolver e/ou reproduzir, ou levar à morte da praga de hemíptero. A escolha de genes-alvo e a aplicação bem-sucedida de RNAi é então utilizada para controlar pragas de hemípteros.

[00338] A comparação fenotípica de linhagens transgênicas de RNAi e genes alvos de Glycine max não transformadas de pragas de hemíptero ou sequências selecionadas para a criação de hairpin dsRNA não têm similaridade com qualquer sequência de genes de plantas conhecidas. Por isso, não se espera que a produção ou a ativação (sistêmica) de RNAi por construções dirigidas a esses genes ou sequências de pragas de hemípteros tenha qualquer efeito deletério sobre plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como os das linhagens transgênicas transformadas com um vetor “vazio” não tendo qualquer gene que expressa hairpin. As características da raiz da planta, broto, folhagem e reprodução são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento da raiz e crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto, como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência da planta são semelhantes. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e sem expressão de moléculas-alvo iRNA quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 15 Bioensaios de E. heros em dieta artificial

[00339] Em ensaios de alimentação de dsRNA em dieta artificial, bandejas de 32 poços são configuradas com pelete de dieta artificial ~18 mg e água, como por experimentos de injeção (Exemplo 12). dsRNA na concentração de 200 ng/μL é adicionado à pelete de alimentação e água da amostra, 100 μL para cada um dos dois poços. Cinco ninfas de 2o estágio E. heros são introduzidas em cada poço. As amostras de água e dsRNA que tem como alvo transcrição YFP são usadas como controles negativos. As experiências são repetidas em três dias diferentes. Insetos sobreviventes são pesados e as taxas de mortalidade é determinada após 8 dias de tratamento.

EXEMPLO 16 Arabidopsis thaliana transgênica compreendendo por sequências de pragas de hemípteros

[00340] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo uma construção de genes-alvo para a formação de hairpin que compreende segmentos de COPI gama (SEQ ID NO: 87) são gerados utilizando métodos moleculares convencionais semelhantes aos do Exemplo 4. A transformação de Arabidopsis é realizada utilizando o processo padrão à base de Agrobacterium. Sementes Tl são selecionadas com tolerância ao marcador selecionável glufosinato. As plantas transgênicas de Arabidopsis Tl são geradas e plantas transgênicas cópia simples homozigótica T2 são geradas por estudos de insetos. Os bioensaios são realizadas no crescimento de plantas de Arabidopsis com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados em cada planta e monitorados para a sobrevivência dentro de 14 dias.

[00341] Construção de vetores de transformação de Arabidopsis. Clones de entrada com base no vetor de entrada pDAB3916 que albergam uma construção de genes-alvo para a formação de hairpin que compreende um segmento de COPI gama (SEQ ID NO: 87) são montados utilizando uma combinação de fragmentos sintetizados quimicamente (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação de hairpin intramolecular por RNA transcritos primários é facilitada pela organização (dentro de uma única unidade de transcrição) duas cópias de um segmento do gene-alvo em orientações opostas, os dois segmentos separados por uma sequência de intron ST-LS1 (SEQ ID NO: 17) (Vancanneyt et al (1990) Mol Gen. Genet 220 (2):245 - 50). Deste modo, a transcrição de RNAm primário contém as duas sequências de segmento de gene COPI gama como grandes repetições invertidas um do outro, separados por a sequência de íntron. Uma cópia de um promotor ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (Callis et al (1990) J. Biological Chem 265:12486 - 12493) é usada para dirigir a produção do transcrito de RNAm primário em hairpin, e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida a partir de quadro de leitura aberto 23 de Agrobacterium tumefaciens (VL AtuORF23 UTR 3'; Patente US N ° 5,428,147) é utilizada para terminar a transcrição do gene de expressão de RNA- hairpin.

[00342] O clone de hairpin dentro pDAB3916 vetor de entrada descrito acima é usado na reação de recombinação padrão GATEWAY® com um típico vetor binário de destino pDAB101836 para produzir vetores de transformação de expressão de RNA hairpin para a transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium.

[00343] O vetor Binário de destino pDAB101836 compreende um gene de tolerância a herbicidas, DSM-2v2 (pedido de patente norte-americano n° 2011/0107455.), sob a regulação de um promotor do vírus do mosaico da Mandioca (Promotor CsVMV v2, a patente US n° US 7,601,885; Verdaguer et al, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139). Um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida do quadro de leitura aberta de uma Agrobacterium tumefaciens (AtuORFl UTR 3' V6; Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172:1814-1822) é utilizada para terminar a transcrição do RNAm DSM2v2.

[00344] Uma construção de controle negativo binário, AOR 114507, que compreende um gene que expressa um RNA hairpin YFP, é construído por meio de reações convencionais de recombinação Gateway® com um vetor binário de destino típico (pDAB101836) e vetor de entrada pDAB3916. A construção de entrada AOR 112644 compreende uma sequência de hairpin YFP (HP YFP V2-l, SEQ ID NO: 95) sob o controle da expressão de um promotor da ubiquitina 10 de Arabidopsis (como acima) e um fragmento que compreende uma região não traduzida 3’ ORF23 de Agrobacterium tumefaciens (como acima).

[00345] Produção de Arabidopsis transgênico compreendendo inseticidas RNAs hairpin: transformação mediada por Agrobacterium. Plasmídeos binários contendo sequências sinuosas são eletroporado na cepa GV3101 de Agrobacterium (pMP90RK). Os clones recombinantes de Agrobacterium são confirmados por análise de restrição dos plasmídeos das colônias de preparações de Agrobacterium recombinantes. Um Kit Qiagen Plasmid Max (Qiagen, Cat # 12162) é usado para extrair os plasmídeos a partir de culturas de Agrobacterium seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante.

[00346] Transformação de Arabidopsis e Seleção TI. Doze a quinze plantas de Arabidopsis (cv Columbia) são cultivadas em vasos de 4” em estufa com intensidade de luz de 250 μmol/m2, 25°C, e 18:6 horas de condições claro:escuro. Caules primário florescente são cortados uma semana antes dos inóculos de transformação. Agrobacterium são preparadas por incubação de 10 μl de estoque de glicerol de Agrobacterium recombinante em 100 ml de caldo LB (Sigma L3022) 100 mg/L de espectinomicina + 50 mg/L de canamicina a 28°C e agitação a 225 rpm durante 72 horas. Células de Agrobacterium são colhidas e suspensas em 5% de sacarose + 0,04% Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat # VIS-02) 10 mg/L benzamino purina (BA) solução para OD600 de 0,8 - 1,0 antes de imersão floral. A parte aérea acima da planta são mergulhadas dentro da solução de Agrobacterium durante 5 - 10 minutos, com agitação suave. As plantas são então transferidas para a estufa para o crescimento normal com rega regular e fertilização até conjunto de sementes.

EXEMPLO 17 Crescimento e bioensaios de Arabidopsis transgênica.

[00347] Seleção de Arabidopsis transformada Ti com construções de hairpin RNAi. Até 200 mg de sementes de Ti a partir de cada transformação é estratificada em solução de agarose a 0,i%. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (i0,5” x 2i” x i”; T. O. Plastics Inc., Clearwater, MN). Com # 5 de meio Sunshine. Transformantes são selecionados para tolerância a Ignite® (glufosinato) a 280 g/ha de 6 e 9 dias após o plantio. Os eventos selecionados são transplantados para vasos de 4” de diâmetro. A análise da cópia de inserção é realizada dentro de uma semana do transplante através da hidrólise quantitativa PCR em Tempo Real (QPCR) utilizando Roche LightCycler480. Os iniciadores de PCR e sondas de hidrólise são concebidos contra marcador seleccionável DSM2v2 utilizando Software Design 2,0LightCycler Sonda (Roche). As plantas são mantidas a 24°C, com um fotoperíodo de i6:8 de claro:escuro sob luzes fluorescentes e incandescentes na intensidade da i00- i50mE/m2xs.

[00348] Bioensaio de alimentação planta E. heros. Pelo menos eventos de quatro cópias baixas (i-2 inserções), quatro cópia médias (2-3 inserções) e quatro de cópias elevadas (>>4 inserções) são selecionados para cada construção. As plantas são cultivadas a uma fase de floração (plantas contendo flores e siliques). A superfície do solo é coberta com ~50 ml de volume de areia branca para facilitar a identificação de insetos. Cinco a dez ninfas de E. heros de 2o estágio são introduzidas em cada planta. As plantas são cobertas com tubos de plástico que estão em vasos 3” de diâmetro, i6” de altura, e com espessura de parede de 0,03 “(Item No. 484485,Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de nylon para isolar os insetos das plantas. São mantidos em temperatura normal, luz e condições de rega em um conviron em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; a percentagem de mortalidade, bem como inibição do crescimento (tratamento 1 - controle de peso / peso) são calculados de plantas expressando hairpin YFP que são utilizados como controles.

[00349] Geração de sementes T2 de Arabidopsis e bioensaios T2. Sementes T2 são produzidas a partir de eventos de baixo cópia (1-2 inserções) selecionados para cada construção. Plantas (homozigóticos e/ou heterozigotos) são submetidas a bioensaio de alimentação E. Heros, como descrito acima. Sementes T3 são colhidas de homozigotos e armazenado para análise futura.

[00350] Embora a presente divulgação possa ser susceptível a várias modificações e formas alternativas, concretizações específicas tenham sido descritas por meio de exemplo, em detalhes aqui. No entanto, deve ser entendido que a presente descrição não se destina a ser limitada às formas particulares divulgadas. Em vez disso, a presente revelação é para cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas, que se enquadrem no escopo da presente divulgação, como definido pelas seguintes reivindicações anexas e seus equivalentes legais.

Claims (16)

1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo ligado operacionalmente a um promotor heterólogo, em que o polinucleotídeo consiste na sequência de ácidos nucleicos conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 76 e sequências degeneradas da mesma que codificam a sequência de aminoácidos conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 2.

2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o microrganismo Diabrotica é selecionado a partir do grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith and Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende ainda um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal.

4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que: (a) a molécula de ácido nucleico compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1; e/ou (b) o polinucleotídeo de (a) codifica um polipeptídeo do Bacillus thuringiensis que é selecionado de um grupo que compreende Cry3, Cry34 e Cry35.

5. Vetor de transformação de plantas caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Molécula de ácido ribonucleico de cadeia-dupla (dsRNA) caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido pela reivindicação 1.

7. Molécula de ácido ribonucleico de cadeia dupla, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência polinucleotídea com um inseto coleóptero inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeos endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.

8. Molécula de ácido ribonucleico de cadeia dupla, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da referida molécula com um ribonucleotídeo de um inseto coleóptero mata ou inibe o crescimento e/ou a alimentação do inseto.

9. Célula microbiana caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

10. Método para controlar uma população de inseto coleóptera caracterizado pelo fato de que o método compreende alimentar a população de insetos com um agente compreendendo a molécula de dsRNA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente é uma formulação dispersível ou em que o agente é um material vegetal transgênico que expressa a molécula de dsRNA.

12. Método para aumentar o rendimento de uma cultura caracterizado pelo fato de que o método compreende: cultivar a planta ou semente transgênica compreendendo a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, na cultura, em que o promotor heterólogo é funcional na semente ou na planta, tal que a molécula de dsRNA é expressa.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a planta é Zea Mays.

14. Método para produzir uma célula vegetal transgênica caracterizado pelo fato de que o método compreende: transformar uma célula vegetal com o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou com um vetor compreendendo o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal; e selecionar a célula vegetal transgênica que integrou o polinucleotídeo em seu genona e que expressa a molécula de dsRNA.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: (a) a célula vegetal transformada compreende uma sequência nucleotídea que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1; e/ou (b) em que o polipeptídeo de (a) codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis que é selecionado do grupo compreendendo Cry3, Cry34 e Cry35.

16. Método para produzir uma planta transgênica resistente a insetos coleóptera caracterizado pelo fato de que compreende:regenerar a planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o promotor heterólogo é funcional na célula vegetal.