BR102017002245A2 - Moléculas de ácido nucleico de gawky (gw) para controlar pragas de insetos - Google Patents

Abstract

essa descrição refere-se a moléculas de ácido nucleico e a métodos de uso dessas para o controle de pragas de inseto através da inibição mediada pelo rna de interferência de um alvo codificador e de sequências não codificadoras transcritas em pragas de insetos, incluindo pragas de coleópteros e/ou hemípteros. a descrição também diz respeito a métodos para fazer plantas transgênicas que expressam as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos e células de planta e plantas obtidas dessa maneira.

Description

(54) Título: MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE GAWKY (GW) PARA CONTROLAR PRAGAS DE INSETOS (51) Int. Cl.: C12N 15/12; C12N 15/113; C12N 15/31; C12N 15/82; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 03/02/2016 US 62/290,852 (73) Titular(es): DOW AGROSCIENCES LLC, FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FÕRDERUNG DER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V.

(72) Inventor(es): KENNETH E. NARVA; SARAH E. WORDEN; MEGHAN L. FREY; MURUGESAN RANGASAMY; PREMCHAND GANDRA; WENDY LO; ELANE FISHILEVICH; RAINER FISHER; ANDREAS VILCINSKAS; EILEEN KNORR (74) Procurador(es): DANNEMANN, SIEMSEN, BIGLER & IPANEMA MOREIRA (57) Resumo: Essa descrição refere-se a moléculas de ácido nucleico e a métodos de uso dessas para o controle de pragas de inseto através da inibição mediada pelo RNA de interferência de um alvo codificador e de sequências não codificadoras transcritas em pragas de insetos, incluindo pragas de coleópteros e/ou hemípteros. A descrição também diz respeito a métodos para fazer plantas transgênicas que expressam as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos e células de planta e plantas obtidas dessa maneira.

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE GAWKY (GW) PARA CONTROLAR PRAGAS DE INSETOS.

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE [001] Esse pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N°. de Série 62/290.852, depositado em 3 de fevereiro de 2016, para MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE GAWKY (GW) PARA CONTROLAR PRAGAS DE INSETOS.

CAMPO TÉCNICO [002] A presente invenção refere-se de modo geral ao controle genético do dano de planta causado por pragas de insetos (por exemplo, pragas coleópteras e pragas hemípteras). Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de polinucleotídeos codificadores e não codificadores do alvo e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para a repressão ou a inibição da expressão pós-transcricional dos polinucleotídeos que codificam e não codificam o alvo nas células de uma praga de inseto para fornecer um efeito protetor da planta.

ANTECEDENTES [003] A lagarta da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de lagarta da raiz do milho mais devastadoras na América do Norte e é um problema particular nas áreas de cultivo do milho no meio oeste dos Estados Unidos. A lagarta da raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica barberi Smith and lawrence, é uma espécie intimamente relacionada que coabita muito da mesma área de WCR. Existem várias outras subespécies de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: a lagarta da raiz do milho mexicana (MCR), D. virgifera zeae Krysan and Smith; a lagarta da raiz do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D.

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2/157 undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos avaliou que a lagarta da raiz do milho causa $1 bilhão em perda de receita a cada ano, incluindo $800 milhões em perda de rendimento e $200 milhões em custos com tratamentos.

[004] Ambos os ovos de WCR e NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante o inverno. Os ovos são alongados, brancos e tem menos do que 0,004 polegada de comprimento. A larva sai do ovo no final de maio ou início de junho, com o tempo preciso de eclosão do ovo variando de ano para ano devido a diferenças de temperatura e localização. As larvas recém-eclodidas são vermes brancos que tem menos que 0,125 polegada de comprimento. Uma vez eclodidas, as larvas começam a se alimentar das raízes do milho. As lagartas da raiz do milho passam por três instares larvais. Depois de se alimentarem por várias semanas, as larvas mudam para o estágio de pupa. Elas viram pupa no solo e depois emergem do solo como adultas em julho e agosto. Lagartas da raiz do milho adultas têm cerca de 0,25 polegada de comprimento.

[005] As larvas da lagarta da raiz do milho completam seu desenvolvimento no milho e várias outras espécies de gramíneas. As larvas criadas no foxtail amarelo emergem mais tarde e possuem um tamanho da cápsula da cabeça menor quando adultas do que as larvas criadas no milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. WCR adultas se alimentam da seda do milho, pólen e grãos expostos nas pontas das espigas. Se WCR adultas emergem antes que os tecidos reprodutivos do milho estejam presentes, elas podem se alimentar do tecido da folha, dessa maneira retardando o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. Entretanto, os adultos rapidamente mudarão para a seda e o pólen preferidos quando eles se tornarem disponíveis. NCR adultas também se alimentam de tecidos

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3/157 reprodutores da planta de milho, mas em contraste raramente se alimentam das folhas do milho.

[006] A maior parte do dano da larva da raiz do milho é causada pela alimentação da larva. Lagartas da raiz do milho recém-eclodidas inicialmente se alimentam das finas sedas da raiz do milho e escavam as pontas das raízes. Conforme as larvas se tornam maiores, elas se alimentam e escavam as raízes primárias. Quando as lagartas da raiz do milho se tornam abundantes, a alimentação das larvas geralmente resulta na poda das raízes até a base do caule do milho. O dano severo da raiz interfere com a habilidade da raiz de transportar a água e os nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta e resulta na produção reduzida de grão, reduzindo dessa maneira drasticamente o rendimento global. O dano severo da raiz frequentemente resulta no alojamento da planta de milho o que torna a colheita mais difícil e diminui mais o rendimento. Além disso, a alimentação dos adultos nos tecidos reprodutores do milho pode resultar na poda das sedas na ponta da espiga. Se esse corte da seda é severo o suficiente durante a disseminação do pólen, a polinização pode ser interrompida.

[007] O controle das lagartas da raiz do milho pode ser tentado pela rotação da cultura, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva que forma esporos, Bacillus thuringiensis), plantas transgênicas que expressam toxinas Bt ou uma combinação desses. A rotação da cultura sofre da desvantagem de colocar restrições indesejadas ao uso das terras agrícolas. Além disso, a oviposição de algumas espécies de lagarta da raiz pode ocorrer em campos de soja, diminuído dessa maneira a eficácia da rotação da cultura praticada com o milho e a soja.

[008] Inseticidas químicos são a estratégia mais fortemente utilizada para a obtenção do controle da lagarta da raiz do milho. O uso de inseticida químico, portanto, é uma estratégia imperfeita no controle da

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4/157 lagarta da raiz do milho; mais de $1 bilhão podem ser perdidos nos Estados Unidos a cada ano devido a lagarta da raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano da lagarta da raiz que pode ocorrer apesar do uso de inseticidas. Grandes populações larvares, chuvas torrenciais e a aplicação imprópria dos inseticidas podem resultar, todos, em controle inadequado da lagarta da raiz do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar linhagens de lagarta da raiz resistentes aos inseticidas, assim como fazer surgir problemas ambientais significativos devidos a toxicidade para as espécies não alvos.

[009] Percevejos e outros insetos hemípteros (heteróptera) são outras pragas complexas agricolamente importantes. Em todo o mundo, mais de 50 espécies intimamente relacionadas de percevejos são conhecidas por causar danos as culturas (McPherson & McPherson, R.M. (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico CRC Press). Esses insetos estão presentes em um grande número de culturas importantes incluindo o milho, soja, frutas, vegetais e cereais. [0010] Percevejos passam por múltiplos estágios de ninfa antes de atingirem o estágio adulto. O desenvolvimento desses insetos dos avos até adultos leva cerca de 30 a 40 dias. Ambos, ninfas e adultos se alimentam da seiva de tecidos moles nos quais eles também injetam enzimas digestivas que causam a digestão extra-oral do tecido e a necrose. O material de planta digerido e os nutriente são então ingeridos. A depleção da água e de nutrientes do sistema vascular da planta resulta no dano ao tecido da planta. O dano ao desenvolvimento do grão e das sementes é o mais significativo já que o rendimento e a germinação estão significativamente reduzidos. Mútiplas gerações ocorrem em climas quentes resultando em pressão significativa de insetos. O manuseio atual dos percevejos recai no tratamento com insteicida em uma base individual. Entretanto, estratégias de manuseio alternativas são

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5/157 urgentemente necessárias para minimizar as perdas contínuas das culturas.

[0011] RNA de interferência (RNAi) é um processo que utiliza as vias celulares endógenas, através das quais uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para todas e qualquer porção de tamanho adequado de um gene alvo resulte na degradação do mRNA codificado dessa maneira. RNAi tem sido usado para realizar o knockdown de gene em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, embriões de insetos e células em cultura de tecido. Veja, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

[0012] RNAi realiza a degradação do mRNA através de uma via endógena que inclui o complexo de proteína DICER, DICER cliva longas moléculas de dsRNA em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominados RNA de interferência pequeno (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de fita simples; a fita de passagem e a fita guia. A fita de passagem é degradada e a fita guia é incorporada com complexo de indução do silenciamento de RNA (RISC). Microácidos ribonucleicos (miRNAs) são estruturalmente moléculas muito semelhantes que são clivadas a partir de moléculas precursoras que contêm um laço de polinuclotídeo que conecta as fitas de passagem e guia hibridizadas e elas podem ser similarmente incorporadas a RISC. O silenciamento de gene pós-transcricional ocorre quando a fita guia se liga especificamente a uma molécula de mRNA complementar e induz a clivagem por Argonauta, o componente catalítico do complexo RISC. Esse processo é conhecido por se espalhar sistemicamente através do organismo apesar das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucariotos tais

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6/157 como plantas, nematódeos e alguns insetos.

[0013] A Patente U.S. 7.612.194 e Publicação de Patente U.S. N°^s. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 descrevem uma biblioteca de sequências de 9112 marcadores de sequência expressa (EST) isoladas de pupas de D. v. virgifera LeConte. É sugerida na Patente U.S. 7.612.194 e Publicação de Patente U.S. N°. 2007/0050860 ligar operativamente a um promotor, uma molécula de ácido nucleico que seja complementar a uma de várias sequências parciais particulares de H+-ATPase (V-ATPase) do tipo vacuolar de D. v. virgifera aqui descritas para a expressão de RNA antissenso em células de plantas. A Publicação de Patente U.S. N°. 2010/0192265 sugere ligar operativamente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não descrita (a sequência parcial é determinada ser 58% idêntica ao produto de gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antissenso em células de plantas. A Publicação de Patente U.S. N°. 2011/0154545 sugere a ligação operativa de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais em particular de subunidades beta de genes do coatomer de D. v. virgifera para a expressão de RNA antissenso em células de plantas. Adicionalmente, a Patente U.S. 7.943.819 descreve uma biblioteca de 906 sequências de marcadores de sequências expressas (EST) isoladas de larvas, pupas e intestinos médios dissecados de D. v. virgifera LeConte e sugere a ligação operativa de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a sequência parcial particular de um gene 4b da proteína do corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão de RNA de fita dupla em células de plantas.

[0014] Nenhuma sugestão adicional é fornecida pela Patente U.S. 7.612.194 e Publicação de Patente U.S. N°^s. 2007/0050860,

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2010/0192265 e 2011/0154545 para usar qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências listadas aqui para o RNA de interferência, diferentes das várias sequências parciais particulares de V-ATPase e as sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma das Patente U.S. 7.612.194 e Publicação de Patente U.S. N°^s. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 fornece qualquer orientação quanto a qual das mais de nove mil sequências fornecidas será letal ou até útil de outra maneira em espécies de lagarta da raiz do milho quando usada como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. 7.943.819 não fornece sugestão quanto ao uso de qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências listadas aqui para o RNA de interferência, diferentes da sequência particular de um gene 4b da proteína do corpo multivesicular carregado. Além disso, a Patente U.S. 7.943.819 não fornece orientação sobre qual das mais de novecentas sequências fornecidas será letal ou até útil de outra maneira em espécies de lagarta da raiz do milho quando usada como dsRNA ou siRNA. A Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. U.S. 2013/040173 e a Publicação de Pedido PCT N°. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada do gene Snf7 de Diabrotica virgifera para o RNA de interferência no milho.

[0015] A maioria esmagadora das sequências complementares para os DNAs da lagarta da raiz do milho (tal como as precedentes) não fornece um efeito protetor de planta contra espécies de lagarta da raiz do milho quando usada como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326 descrevem os efeitos da inibição de vários genes-alvo de WCR por RNAi. Esses autores relataram que 8 dos 26 genes-alvo que eles testaram não foram capazes de fornecer mortalidade de praga de coleópteros experimentalmente significativamente em uma concentração de iRNA muito elevada (por exemplo, dsRNA) de mais do que 520 ng/cm².

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8/157 [0016] Os autores da Patente U.S. 7.612.194 e Publicação de Patente U.S. N°. 2007/0050860 fizeram o primeiro relato de RNAi in planta em plantas de milho que atinge a lagarta da raiz do milho ocidental. Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Esses autores descrevem uma alta eficiência do sistema de RNAi dietético in vivo para rastrear genes alvo em potencial para o desenvolvimento de milho com RNAi transgênico. De um pool de gene inicial de 290 alvos, apenas 14 exibiram o potencial de controle de larva. Um dos RNAs de fita dupla (dsRNA) mais eficazes atingiu um gene que codifica a subunidade A da ATPase vacuolar (V-ATPase), resultando em rápida supressão do mRNA endógeno correspondente e desencadeando uma resposta específica de RNAi com baixas concentrações de dsRNA. Portanto, esses autores documentaram pela primeira vez o potencial para o RNAi in planta como uma possível ferramentas para o manuseio de praga, enquanto demonstra simultaneamente que atinge alvos eficazes não são identificados com exatidão a priori, até a partir de um grupo relativamente pequeno de genes candidatos.

DESCRIÇÃO [0017] São descritas aqui moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes-alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) e métodos de uso desses, para o controle de pragas de insetos incluindo, por exemplo, pragas coleópteras tais como D. v. virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho do oeste, WCR); D. barberi Smith e Lawrence (lagarta da raiz do milho do norte, NCR); D. u. howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sul, SCR); D. v. zeae Krysan and Smith (lagarta da raiz do milho mexicano, MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar e pragas hemípteras tais como Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo marrom neotropical, BSB); E. servus (Say) (Percevejo Marrom); Nezara viridula (L.) (Percevejo Verde do Sul); Piezodorus guildinii (Westwood) (PerPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 18/390

9/157 cevejo com Banda Vermelha); Halyomorpha halys (Stâl) (Percevejo Marrom Marmorizado); Chinavia hilare (Say) (Percevejo Verde); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.) (Percevejo Vermelho Neotropical); Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do Algodão); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Percevejo Manchado Ocidental); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois). Em exemplos particulares, são descritas moléculas de ácido nucleico exemplificadoras que podem ser homólogas a pelo menos uma porção de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de inseto.

[0018] Nesses e em exemplos adicionais, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene-alvo cujo produto pode estar, por exemplo e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento da larva/ninfa. Em alguns exemplos, a inibição pós-transcricional da expressão de um gene-alvo pela molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo homólogo a esse, pode ser letal para uma praga de inseto ou resulta em crescimento/viabilidade reduzidas de uma praga de inseto. Em exemplos específicos, a proteína envolvida no silenciamento do mRNA através do da repressão traducional do miRNA, um gene gawky (referido aqui como gw) ou um homólogo ou ortólogo de gw pode ser selecionado como o gene-alvo para o silenciamento pós-transcricional. Em exemplos particulares, um gene-alvo útil para a inibição pós-transcricional é um gene gw selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°:1 ande SEQ ID N°:71. Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende o polinucleotídeo de SEQ ID N°:1; o complemento e/ou o complemento reverso de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:71; o complemento e/ou o complemento reverso de SEQ ID N°:71; e/ou fragmentos que comprePetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 19/390

10/157 endem pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das precedentes (por exemplo, SEQ ID N°^s:3-5 e SEQ ID N°:73) é descrita aqui.

[0019] Também estão descritas moléculas que compreendem um polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene-alvo (por exemplo, o produto do gene gw). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico à SEQ ID N°:2 (GW de D. virgifera GW); SEQ ID N°:72 (GW DE E. heros); e/ou uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de um gene gw. São adicionalmente descritas moléculas de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo que é o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene-alvo.

[0020] Também são descritos polinucleotídeos de cDNA que podem ser usados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene-alvo de praga de inseto, por exemplo, um gene gw. Em modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo pelo organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, as moléculas de cDNA que estão descritas podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte do gene gw (por exemplo, SEQ ID N°:1 ou SEQ ID N°:71).

[0021] Estão descritos meios de gw inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros e meios de gw fornecer proteção contra praga de coleópteros a uma planta. Um meio de gw inibir a

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11/157 expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros inclui uma molécula de RNA de fita simples que consiste em um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s:80-82; e o complemento e complemento reverso desse. Equivalentes funcionais de meios de gw inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleóptero incluem moléculas de RNA de fita simples ou fita dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um RNA transcrito a partir de um gene gw de coleóptero que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s: 3-5. Um meio de gw fornecer proteção contra praga de coleópteros a uma planta inclui uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica um meio de gw inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleóptero operativamente ligado a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0022] Estão descritos ainda meios de gw para inibirem a expressão de um gene essencial em uma praga de hemípteros e meios de gw para fornecerem proteção contra praga hemíptera a uma planta. Um meio de gw para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros inclui uma molécula de RNA de fita simples que consiste em um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s:84; e o complemento e complemento reverso desse. Equivalentes funcionais de meios de gw para inibirem a expressão de um gene essencial em uma praga de hemíptero incluem moléculas de RNA de fita simples ou fita dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um RNA transcrito a partir de um gene gw de hemíptero que compreende a SEQ ID N°: 73. Um meio de gw para fornecer proteção contra praga de hemípteros a uma planta inclui uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica um meio de gw inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemíptero operativamente ligado a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de

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12/157 ser integrada no genoma de uma planta.

[0023] São adicionalmente descritos métodos para controlar uma população de uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleópteros ou hemíptera), compreendendo fornecer a uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleópteros ou hemíptera) uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que funcione depois de ser ingerida pela praga para inibir uma função biológica dentro da praga.

[0024] Em algumas modalidades, um método para controlar uma população de uma praga de coleópteros compreende fornecer à praga de coleópteros uma molécula de iRNA que compreende todo ou um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:79; o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:79, SEQ ID N°:80, o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:80; SEQ ID N°:81, o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:81; SEQ ID N°:82, o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:82; um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo de gw nativo de uma praga de coleópteros (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 3-5; o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo de gw nativo de uma praga de coleópteros que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 3-5; um polinucleotídeo que hibridiza com um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 3-5; e o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo que hibridiza com um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma

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13/157 das SEQ ID N°^s: 1 e 3-5.

[0025] Em algumas modalidades, um método para controlar uma população de uma praga de hemípteros compreende fornecer à praga de hemípteros uma molécula de iRNA que compreende todo ou um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:83; o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:83; SEQ ID N°:84; o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:8 4; um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo de gw nativo de uma praga de hemípteros (por exemplo, BSB) que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou a SEQ ID N°:73; o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo de gw nativo de uma praga de hemípteros que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou a SEQ ID N°:73; o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo que hibridiza com um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou a SEQ ID N°:73.

[0026] Em modalidades particulares, um iRNA que funciona depois de ter sido absorvido por uma praga de inseto para inibir uma função biológica dentro da praga é transcrito a partir de um DNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:1; o complemento ou complemento reverso da

SEQ ID N°:1, SEQ ID N°:3, o complemento ou complemento reverso da

SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4, o complemento ou complemento reverso da

SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5, o complemento ou complemento reverso da

SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:71, o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°: 71; SEQ ID N°:73, o complemento ou complemento reverso da SEQ ID N°:73; o complemento ou complemento reverso de SEQ ID N°:73; um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo

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14/157 de Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 3-5; o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 3-5; um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos de um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 3-5; o complemento ou complemento reverso de um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos de um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 3-5; um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou SEQ ID N°:73; o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou SEQ ID N°:73; um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos de um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou SEQ ID N°:73; e um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos de o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo nativo codificador de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou SEQ ID N°:73.

[0027] Também são descritos métodos nos quais dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser fornecidos a uma praga de inseto em um ensaio baseado na dieta ou em células de planta geneticamente modificadas que expressam os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nesses e em exemplos posteriores, os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos pela praga. A ingestão de dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs da invenção pode resultar então no RNAi na praga, o que por sua vez pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade

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15/157 da praga e levando a mortalidade em última análise. Portanto, são descritos métodos em que as moléculas de ácido nucleico que compreendem os polinucleotídeos exemplificadores úteis para o controle de pragas de inseto são fornecidas a uma praga de inseto. Em exemplos particulares, uma praga de coleópteros e/ou hemíptera controlada pelo uso de moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser WCR, NCR, SCR, MCR, BSB, D. balteata, D. u. tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops melacanthus,

D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus e/ou Lygus lineolaris.

[0028] O precedente e outras características ficarão mais aparentes a partir da seguinte Descrição Detalhada de várias modalidades, o que ocorre com referência as Figuras 1-2 em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0029] Figura 1 inclui uma ilustração de uma estratégia usada para gerar dsRNA a partir de um único modelo de transcrição com um único par de iniciadores.

[0030] Figura 2 inclui uma ilustração de uma estratégia usada para gerar dsRNA a partir de dois modelos de transcrição.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0031] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequências em anexo são mostradas usando as abreviações de letra padronizadas para bases de nucleotídeos como definido em 37 C.F.R. § 1.822. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listadas definem as moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) que possuem os monômeros de nucleotídeo e aminoácido arranjados na maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e

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16/157 aminoácidos listadas também definem cada uma um gênero de polinucleotídeo ou polipeptídeo que compreende os monômeros de nucleotídeo e aminoácido arranjados da maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, será compreendido que uma sequência de nucleotídeos que inclui uma sequência codificadora também descreve o gênero de polinucleotídeos que codificam o mesmo polipeptídeo como o polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Será compreendido posteriormente que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero das ORFs do polinucleotídeo que codifica esse polipeptídeo.

[0032] Apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a fita complementar é compreendida como incluída por qualquer referência à fita exibida. Como o complemento e o complemento reverso de uma sequência de ácido nucleico primária são necessariamente descritos pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de um ácido nucleico estão incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a menos que explicitamente estabelecido de outra maneira (ou fique claro de outra maneira a partir do contexto no qual a sequência aparece). Além disso, como é compreendido na técnica, a sequência de nucleotídeos de uma fita de RNA é determinada pela sequência de DNA a partir do qual ela é transcrito (mas para a substituição de nucleobases de uracil (U) por timina (T), uma sequência de DNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de sequências em anexo:

[0033] SEQ ID N°:1 mostra um contig que contém um DNA de gw de WCR, referido aqui em alguns lugares como WCR gw ou WCR gw-1: [0034] g caccattatcaaag aactatg ggtg aatccacaattttcaaacataacatttg accaaaatgttatccaaaagttaaatttgtattattctggaatttttcttactccagtaatatacattggagatcaaactgtataaataaattgtataaataaatctaaatcaagataattatttcaPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 26/390

17/157 cacatctctctacatatccagttaccttccatctctttctcatgttggaaacaatggagtatctttctctgtgaagctccgcccactttgatatctaaccaatttatcctgcacccaagttgtgatttgtgatggtgtgttcttattctcattctctccatattaatttatcgacgtaaagccaatgtg attttttagtg atattccgttttaatcg catcacatttcg agg atatagatctctggctggccagactgatatggagcactattgaagatgcgcgcccctaccccctccgagccgaagtctacatttcctacctaccaagtgcctcaaaagtcagccatgaggggcagcgcacccccagtacaagttgcagggccatcttgggggggtcgagccgatcccccaagtagtacccgttgcgccgatgaaggcgctctgtctgtgatatccggctcaagttgccgttcaatcgacaactctaatattagaatgcaatctgtgaccgaaaattgtcttctgaactctgttaccgtaccaaatatgcaacgtttagaccatggcatggtcacccacaataatagctttaagttagttagtaagtttggtgctttactccccggacgagacattcccaatcaaaagtctgatgacctcgaactactacgcgatgacctcaatgtactgaattcaactaaatacgatactaaaacactctgcgataacaacgatgaaaaagacgaccatgatgcataccaaatgtcgaacattgaaactcatacctgcacaaataatgacaacagctatcaagagctgtacaagcctttgagacttagagggggaggcgaaagttccctcagcactggtacttctggatggggcacgccaccttctcaatctggtaacaacaatgcaaataagagcaatggccagcaaccacctacctcccaatcaaacaacactggttggggtcaacctggaacgaaaactgcaaataacaatgcaatgccacctaatagtcaacctcctacctctactgctaattctcagaacaacaatggaccaagcaacaataccaaacaacaattggaacaactcaacagtatgagagaagccatttttagccaggatggctggggcggacaacatgtcaatcaagatacaaattgggacattcccagtagccccgagcctcccattaaaatggatggttccggaggtccaccaccatggaaaccggctgtgaataatggtaccgaattatgggaagcgaatcttcgaaacggtggacaacctcctccacaacctcaacagaaaaccccttggggtcacacaccctctacgaacataggcggtacctggggcgaagacgatgacgctgacacttctaatgtttggaccggcgtaccatccaatcaacctcaatggggtggtgcaggtggaaatacgaataatggagccatgtggggcggccctaagaaagaaaacgattggggtacaggtgcaagcaataccggtggctggggtgatccacgtgcagctgatccacgtcaaactggtatggaccctcgagaaatccgcccagaactgagagatatgcgggcaggtaatacagaaaccatgagaattatggatcccagagagaccatgaggcaaatgtctaatagtgatatgagaggagatccgcgcggtattactggaagactaaacggagcaggagctgaagcattttggggccaaggtacacctcatgcagcatctcaaccaatacatcaccacaacaaaatgccagtgcctccaggtaatggtacaggcggttgggaPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 27/390

18/157 agaaccatcaccaccatctcaaagacgtaatatg ccaaattatg atg atg gaacttctttgtg g ggtaatcctcaacaagg ctctcactg gaaagatctg cccacagg g g gaagtatg g g ccgtggaggtaatcctgccggaccacctggtatgaatcaagcacgcggtatgaaacaacctgaaggttcgatgtggggtggacacggacgcaatggatcttgggacgaaacaggaccaggtgcagcctgggacgaacctaattcttgggcgaaacagaaaatgccggatcctttatgggacgaatctgaatggggacacaaacaacagagcaaaccccagcttaccaaggaaatggtttggaactccaaacagtttaggatgttggtcgacatgggacataaaaaagaagacgtcgaaaatgctttacgcttacgcgccatgaacgttgaagaggctctagacctcctcagccctatgcgcaataatcgagcaaacgacgggtggaatacccgtcacgacgatcactacgaacatcccccgttctgtcaacggggattttctaccggtccaggtggccaattgactggtttccaaccaggaaacaatgctccaaatctcttaaacaatatgtcgaatccaggaacaaacaattcacttattaataacattgcccctgctgtcgtacaaaagttgttgacacaacaacaagggggtggatctcaaggttttggtggttcttcggcgaatgcgggaagaaatatccaaccacagtctcagccttcaacgcaacaactacggatgttggtgcaacaaatacagatggcagttcaggcagggtatctcaatcaccagattcttaatcaacctttggcgccacaaacgttggttcttctaaatcaactgttgcaacagatcaagaatttacagcagctcatatcacaacaatcaataactggtacgcctatcaacggaaaacagaataacgcttatatgcagttttcagtactcatcacaaaaacaaaacaatcaattgccaatttacagaatcaaatcgctgctcaacaagcgacttacgttaagcaacaacaacaccaaagcagcatgggtgcctatgactcatttaaaacgaatcccatgcatgattcgataaacgctttacaaaccaattttggtgacttaggcattaacaaagagcctcaaatgaacccacaacaatcacgactcacccagtggataagtaaagataaggatgatggtggagaattcagtagagcacctggttcatcttccaaacctcctaatacctcgcctaatatgaatcctctcgttctcaatccatcagatggaccatggtctactggtagaacaggagatactggttggcctgattcttcagccaatgataactcgaatgatgtgaaagacgcacagtggtcaaccaccactcaaccttccctgactgatcttgtacctgagtttgaacctggaaagccctggaagggtaatcaaataaaaattgaagatgaccccagtattacacctggttcggtggtgcgtagtcccctgtctatagcaacaatcaaagacaatgaacttttcaacatgaatcccagcaaaagtccccctgccactgatggtatacaatcattaagtctcagttcatccacatggagctttaatccatctggtacctctacatcaagtgcgtttactagtcctcctggaaaattgccaacgtctaaagctttaggagatttgaatccctcgactgccgtgacctctgaactttggggagctccaaaatcatccagaggtcctccccctggtttaPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 28/390

19/157 tctgcaaagggaagtggtgctatatcaaatggttggtccgctgttaacactatgccatggggaccaggaggccaaagaacttccggaaattggggaggttcttcccaatggttattgcttcgaaatttgactgctcagattgacggttctacattacgcacattatgtttacaacatggtccgctcttaagtttccatctatacttacaccaagg ctttg cacttg ccaaatattcatcccgtgagg aagctatcaaagctcagaccaccctcaacaactgtgtactcggtaacacaacaatactagccgaaaatccaaccgattgggatgcaaacactttgctccaacaagtagcaagtcaacagagcggctcttccggcgcatggcgaggttcaagcaaacaacccactggggcagacacctggagtaccggctggcccaacaattcaagcagcaccagtttgtgggcagctcctcaactcgacaactcagatcccgctcgtggaaccccatctagtctaaattcttttcttcctaacgacctcttaggtggtgagtccatgtaagttaaggatgaaaccaaaataattccatcttagttacaagtgttgatatctctctctgcgctatttcactataaaagttttattgaatgtttttaatgttttataatattaaatttaacaattg [0035] SEQ ID N°:2 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de GW codificado por um DNA de gw de WCR exemplificador, referido em alguns locais como WCR GW ou WCR GW-1:

[0036] mraptpsepkstfptyqvpqksamrgsappvqvagpswggradppsstrcadegalsvisgsscrsidnsnirmqsvtencllnsvtvpnmqrldhgmvthnnsfklvskfgallpgrdipnqksddlellrddlnvlnstkydtktlcdnndekddhdayqmsniethtctnndnsyqelykplrlrgggesslstgtsgwgtppsqsgnnnanksngqqpptsqsnntgwgqpgtktannnamppnsqpptstansqnnngpsnntkqqleqlnsmreaifsqdgwggqhvnqdtnwdipsspeppikmdgsggpppwkpavnngtelweanlrnggqpppqpqqktpwghtpstniggtwgedddadtsnvwtgvpsnqpqwggaggntnngamwggpkkendwgtgasntggwgdpraadprqtgmdpreirpelrdmragntetmrimdpretmrqmsnsdmrgdprgitgrlgagaeafwgqgtphaasqpihhhnkmpvppgngtggweepsppsqrrnmpnyddgtslwgnpqqgshwkdlptggsmgrggnpagppgmnqarmkqpegsmwgghgrngswdetgpgaawdepnswakqkmpdplwdesewghkqqskpqltkemvwnskqfrmlvdmghkkedvenalrlramnveealdllspmrnnrandgwntrhddhyehppfcqrgfstgpggqltgfqpgnnapnllnnmsnpgtnnslinniapavvqklltqqqgggsqgfggssanagrniqpqsqpstqqlrmlvqqiqmavqagylnhqilnqplapqtlvllnqllqqiknlqqlisqqsitgtpingkqnPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 29/390

20/157 naymqfsvlitktkqsianlqnqiaaqqatvkqqqhqssmgaydsfktnpmhdsinalqtnfgdlginkepqmnpqqsrltqwiskdkddggefsrapgssskppntspnmnplvlnpsdgpwstgrtgdtgwpdssandnsndvkdaqwstttqpsltdlvpefepgkpwkgnqikieddpsitpgsvvrsplsiatikdnelfnmnpsksppatdgiqslslssstwsfnpsgtstssaftsppgklptskalgdlnpstavtselwgapkssrgpppglsakgsgaisngwsavntmpwgpggqrtsgnwggssqwlllrnltaqidgstlrtlclqhgpllsfhlylhqgfalakyssreeaikaqttlnncvlgnttilaenptdwdantllqqvasqqsgssgawrgsskqptgadtwstgwpnnssstslwaapqldnsdpargtpsslnsflpndllggesm [0037] SEQ ID N°:3 mostra um DNA de gw de WCR referido aqui em alguns lugares como WCR gw-1 reg 1 (região 1) que é usado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

[0038] Acgcaacaactacggatgttggtgcaacaaatacagatggcagttcaggcagggtatctcaatcaccagattcttaatcaacctttggcgccacaaacgttggttcttctaaatcaactgttgcaacagatcaagaatttacagcagctcatatcacaacaatcaataactggtacgcctatcaacggaaaacagaataacgcttatatgcagttttcagtactcatcacaaaaacaaaacaatcaattgccaatttacagaatcaaatcgctgctcaacaagcgacttacgttaagcaacaacaacaccaaagcagcatgggtgcctatgactcatttaaaacgaatcccatgcatgattcgataaacgctttacaaaccaattttggtgacttaggcattaacaaagagcctcaaatgaacccacaacaatcacgactcacccagtggataagtaaagataaggatg [0039] SEQ ID N°: 4 mostra um DNA de gw de WCR exemplificador, referido aqui em alguns locais como WCR gw-1 v1 (versão 1), que é usado em alguns exemplos para a produção de dsRNA:

[0040] aaaacgaatcccatgcatgattcgataaacgctttacaaaccaattttggtgacttaggcattaacaaagagcctcaaatgaacccacaacaatcacgactcacccagtggataagtaaagataaggatg [0041] SEQ ID N°: 5 mostra um DNA de gw de WCR exemplificador, referido aqui em alguns locais como WCR gw-1 v2 (versão 2), que é usado em alguns exemplos para a produção de dsRNA:

[0042] Tcaatcaccagattcttaatcaacctttggcgccacaaacgttggttcttctaaatcaactgttgcaacagatcaagaatttacagcagctcatatcacaacaatcaataac

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21/157 [0043] SEQ ID N°:6 mostra a sequência de nucleotídeos do promotor de fago T7.

[0044] SEQ ID N°:7 mostra um fragmento de uma região codificadora de YFP exemplificadora.

[0045] SEQ ID N°^s:8-13 mostram os iniciadores usados para amplificar porções de sequências de WCR gw que compreendem gw-1 regí, gw-1 v1 e gw-1 v2, usados em alguns exemplos para a produção de dsRNA.

[0046] SEQ ID N°:14 mostra um gene de YFP exemplificador.

[0047] SEQ ID N°:15 mostra uma sequência de DNA de anexina e

1.

[0048] SEQ ID N°:16 mostra uma sequência de DNA de anexina região 2.

[0049] SEQ ID N°:17 mostra uma sequência de DNA de beta espectrina 2 região 1.

[0050] SEQ ID N°:18 mostra uma sequência de DNA de beta espectrina 2 região 2.

[0051] SEQ ID N°:19 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 1.

[0052] SEQ ID N°:20 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 2.

[0053] SEQ ID N°^s:21-48 mostram os iniciadores usados para amplificar regiões de gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4, e YFP para a síntese de DNA.

[0054] SEQ ID N°:49 mostra uma sequência de DNA de milho que codifica uma proteína semelhante a TIP41.

[0055] SEQ ID N°:50 mostra a sequência de nucleotídeos do iniciador de oligonucleotídeo T20VN.

[0056] SEQ ID N°^s:51-55 mostra iniciadores e sondas usados para as análises de expressão do transcrito de dsRNA no milho.

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22/157 [0057] SEQ ID N°:56 mostra uma sequência de nucleotídeos de uma porção da região codificadora de SpecR usada para a detecção do arcabouço do vetor binário.

[0058] SEQ ID N°:57 mostra uma sequência de nucleotídeos da região codificadora de AAD1 usada para a análise do número de cópias genômicas.

[0059] SEQ ID N°:58 mostra uma sequência de DNA de um gene de invertase do milho.

[0060] SEQ ID N°^s:59-67 mostra as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos de DNA usados para as determinações do número de cópia de gene e detecção do arcabouço do vetor binário.

[0061] SEQ ID N°^s:68-70 mostra iniciadores e sondas usados para as análises de expressão do transcrito de dsRNA no milho.

[0062] SEQ ID N°:71 mostra um DNA exemplificador do Percevejo Marrom Neotropical (Euschistus heros) gw DNA, referido aqui em alguns lugares como BSB gw-1:

[0063] agtaatggcgtgcaagaaagttttggaagtgtgctatgcttaaattacagattaaaaaaatatagttacattgatgttttgatattaattaagagttcttgtgtgatcaaaaacattagtttttcattttttgtttccccctttcctaaaatacaagtatttgcttcatcttgactgatagtattatcgaactttttggaaagccttgtccaagcttgatcatcacacttgtaaaaaacttttcttaccaacattgagcagacctttcttctttaactcaccaagtgacattggctgtgggacatcctcattctaacaatgactaaaaaatagctcaatctgcatatttatccatcatgtattataaacaaaagttaaactgagcagaagaggattaagtgctgtaaagtatttctttaaagatttctgccacaatgagaaaagcccaagataattaattagtctataagactttggtttttacatattgcctgccaaagacgtactgagagccaatgtttcgaaacaattctagttcaaatgagatttcttctaaaactaatgcctttgtacaaaataaagacgaggaggacaaatctgagagcttgttaagaggtatggcgcagcctcccaagcctacgagtcctactcatcaagtgcctgagaaaagggacgtaatggtggtagatattggggtgagagaagatgatggccccgtcctgactgtgataaccaaccatccgtcccaagcgcccgccaagattttctcatcagaaattggtgaaagtgaatctgacggttcttccaaaatgccactagcagagacacaaggaacgggPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 32/390

23/157 tgctctttgcttagatagcattaagtctattagtgttaatgaatcatttagtgttaaggataaatttatttg cccgagcaagagtttaattctg ccg ccaaacattccaaataccaacg atg ataccgatcaagatgttaaaagctttaaaatctgtgattattatactcggtggggaataccacgaaacttgaaactgttaggaggaggagagagttcacttactacagggactaccggttggggatccccaccttcaaatcaaggtggtagtactggttggaacagtgctaatactactagtggaagtaatagttcttcaggacaaggacaagcaggtactgggcaaagcccagctcctgcctctgctggacaaacttggggtagttcccaaaataataccaacaacagcaatagtaatagtaacaacaataatggatctcgcagttctgttagccagcaaggtggaggtagcacacaacagcaaccaggaggggggccacctagtcagtccacggctccacctgtagcaactgtgtctacatcaactgttacaactgctccagcctcttcagcaacaaatacgtccaatattaacactgctactacatcagcttctcaacaaaatggttcagctagtggcaaccaagtggtaggaagtggttctacctgggcaactgctgttggtaaagggcttcctccgacaagcacagtttcaactccaacttcaagtggaagcacatctactaagcaacaaatggaacagctaaacacaatgagagaagccctttacagtcaagatggatggggtggtcaaaatgttaaccaagatagcaattgggatataccaggttccccagaaccaggcacaaaagatagcaacaatgcagctcctgttcctctttggaaactgcctatcaataatggtactgatctttgggaggctaatctgagaaatggcggtgttcctcctcctgtaagccaacagagtcagaaaacaccttgggttcacactccaagcaccaacattggtggaacatggggtgaagatgatgaaggtgatgcttctaatgtgtggactggtgttcctcaagcacagactggatgcggtcctcaatggccagctcaaccacctcctatttggcctgctactaagaaagaaggagattggggagggcctaactggaatgatcaacgtgacacaagagatcttcgccacagtgatatgagacaaatgatggatgctagagatcatatgagaccaacttctattgatcacagatcaatgggaggcaatgatgttataatgcgaggtgacccacgcggaatcagcggtaggcttaatggcgtaacgagtgaggccatgtggcctggtccaggtcctcatcaccatataccccatcatcaaggaaaattgccttctcaacctaatcaaccagttaatcaatggagcagctctggacccccaatgaaggacatgactggtcttggtggtaaatcaactggttgggaggagccttcacctccagctcaacggaggaatatgcctaattatgatgatggaacatcactttggggcccacagcatcccagacctaccatccaaggtcaaaataaagtttctcattggaaagaaatgccggctcctggaatagggcgaggtggtttacagtgtcccccaggccgtgctaaccctacaatgaaaccagatcaacctttatggcctcatcatcccagaaatgaacggggatgggaaggaggaatggatagtggaccctggggagatgaaaaaccaactcctgctgctgcaccttggatggaccaaggtcPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 33/390

24/157 tagctccttcatcatg gcaaggtg gaccaaaacataaaccagcatg ggatgg atctg atttagatcccacttcttgggttcactcaaaacagccctctaagtccgtttcaaaggaatttatttggacaagcaagcagtttcgtattttgtctgaaatgggtttcaagaaagaagatatagaaagtgcattaagaagttccggaatgagccttgaagatgcattagatcagcttaacacaaataggggactgagtgctggaggtggtagtgagaggtggccacggcatggtgacttagattcagagcatgctgcaattatgaatacatttccttctcctcagcaaacaatctgtcttgctccatttccacagggtggaggtggtggtggaagtggaagtggaccaggaggtggacctaccttagcgactataacaccagctgtaatgcagaaacttcttgcacaacaaccaccacagcaacaaccttttgcccagcaatcttcaagaacacaacaaacccaacaaccatcagctcagcagcttagaatgctggtccagcaaattcaaatggctgttcaaactggttacctcagcccccagattttaaatcaaccattagctccacaaacccttattttattgaaccaactactacaacagataaaaaatcttcaacagcttatgcaacaccacacagtaatgcaagtaaatcctcttggaaaaccaagctcaaatcacttgttacaattatctgtgcagattacaaagaccaagcaacagattacaaatcttcagaatcagattgctgctcagcaagctgtgtatgttaagcatcaacagcatacaccacctacttctgagtttttcaagagttcattacatgaaccaatttctgcacttcatcctaatttttctgatctttctcttaaagatcccccgaccagtggaactagccagcaatcacgattaaatcagtggaagttacctgccctggaaaaagactcagatattgggacaggtgaattttctagagctccaggtacaacagctaagtcagctcaaggctcttcttcacctaatacaaatttattacttgggcaggctgatggtacttggtcttctgtaaatcgtgaatctagttggcctgattcatccggtgatgatgcttctggcaaggattggccaaattccagtcaacctccatctcaagcattctctgatcttgttcctgagtttgaaccaggaaagccttggaagggaaacccactaaaaagcatcgaggatgatccaagccttacacctggttcggttgtgaggtctcctctttctctgccttcaataaaggatacacatatattatcaactagtactggtgctggcaaagcttcacctactaccagttcttctttagatattatcccatctcttggcttgtcatcatctacttggagctttaatccaccaccttcttcatctaacactagtgtgaagctgaattctagtggagctgctggaggtggtagtgggtcaacatcaaataatggtggaggcaaaaatagtacttcaacttgggaaactaattcgtctgaattgtgggctcccaaaagagggcctcctccaggtttaccagctaaacctagtggtggttcaagtggtggacaggctgcaaatggttggggacctttgtctagtagtggccgttggtcaactgggcaaggttggcctggaccgaatcaggcggctgcaactcagccaggttctacttggttgttattgcgaaatcttactcctcagattgacggttcaactttaaaaactctatgtttacaaPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 34/390

25/157 catg g g ccattatcaaatttccatctctaccttaaccatg g catcg ctcttg ctaaatatgcatctcgggaagaagccaataaggcccaaggtgctttaaacaattgtgttcttggtaacactacaatatttg ctgagagtcccagtgag accg atgtgttgtcattacttaatcatcttggtg g acaaggagggaccgccagtggcagctcaggatggcgtggtaaggaagcttggggcaattcccagctttggggagccaatggagcaagctcagctgctgcttctttgtgggcaggagatagtgatcagcatcgtaacactccatcctcaataaattcttatttgccaggtgaccttcttggtggtgagtctatttaggcaaatcttcattcttctctcaaaccttcaccaaattcttctcgatctataaatacgtcaatcaaaactattgaacaaaaaaaatacaaaaaaaccaaaaaaaaacaagtactttgatctcagaaacaccacatgacctttttattataaatatatatgatatgaagtatatg caattaattatttgtaccaggaacgtatatcttattatta [0064] SEQ ID N°:72 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de gw de BSB codificado por um DNA de gw de BSB exemplificador (isto é, gw-1 de BSB):

[0065] mfrnnsssneissktnafvqnkdeedksesllrgmaqppkptspthqvpekrdvmvvdigvreddgpvltvitnhpsqapakifsseigesesdgsskmplaetqgtgalcldsiksisvnesfsvkdkficpskslilppnipntnddtdqdvksfkicdyytrwgiprnlkllgggesslttgttgwgsppsnqggstgwnsanttsgsnsssgqgqagtgqspapasagqtwgssqnntnnsnsnsnnnngsrssvsqqgggstqqqpgggppsqstappvatvststvttapassatntsnintattsasqqngsasgnqvvgsgstwatavgkglpptstvstptssgststkqqmeqlntmrealysqdgwggqnvnqdsnwdipgspepgtkdsnnaapvplwklpinngtdlweanlrnggvpppvsqqsqktpwvhtpstniggtwgeddegdasnvwtgvpqaqtgcgpqwpaqpppiwpatkkegdwggpnwndqrdtrdlrhsdmrqmmdardhmrptsidhrsmggndvimrgdprgisgrlngvtseamwpgpgphhhiphhqgklpsqpnqpvnqwsssgppmkdmtglggkstgweepsppaqrrnmpnyddgtslwgpqhprptiqgqnkvshwkempapgigrgglqcppgranptmkpdqplwphhprnergweggmdsgpwgdekptpaaapwmdqglapsswqggpkhkpawdgsdldptswvhskqpsksvskefiwtskqfrilsemgfkkediesalrssgmsledaldqlntnrglsagggserwprhgdldsehaaimntfpspqqticlapfpqggggggsgsgpgggptlatitpavmqkllaqqppqqqpfaqqssrtqqtqqpsaqqlrmlvqqiqmavqtgylspqilnqplapqtlillnqllqqiknlqqlmqhhtvmqvnplgkpssnhllqlsvqitktkqqitnlqnPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 35/390

26/157 qiaaqqavyvkhqqhtpptseffksslhepisalhpnfsdlslkdpptsgtsqqsrlnqwklpalekdsdigtgefsrapgttaksaqgssspntnlllgqadgtwssvnresswpdssgddasgkdwpnssqppsqafsdlvpefepgkpwkgnplksieddpsltpgsvvrsplslpsikdthilststgagkaspttsssldiipslglssstwsfnpppsssntsvklnssgaagggsgstsnngggknststwetnsselwapkrgpppglp mfrnnsssneissktnafvqnkdeedksesllrgmaqppkptspthqvpekrdvmvvdigvreddgpvltvitnhpsqapakifsseigesesdgsskmplaetqgtgalcldsiksisvnesfsvkdkficpskslilppnipntnddtdqdvksfkicdyytrwgiprnlkllgggesslttgttgwgsppsnqggstgwnsanttsgsnsssgqgqagtgqspapasagqtwgssqnntnnsnsnsnnnngsrssvsqqgggstqqqpgggppsqstappvatvststvttapassatntsnintattsasqqngsasgnqvvgsgstwatavgkglpptstvstptssgststkqqmeqlntmrealysqdgwggqnvnqdsnwdipgspepgtkdsnnaapvplwklpinngtdlweanlrnggvpppvsqqsqktpwvhtpstniggtwgeddegdasnvwtgvpqaqtgcgpqwpaqpppiwpatkkegdwggpnwndqrdtrdlrhsdmrqmmdardhmrptsidhrsmggndvimrgdprgisgrlngvtseamwpgpgphhhiphhqgklpsqpnqpvnqwsssgppmkdmtglggkstgweepsppaqrrnmpnyddgtslwgpqhprptiqgqnkvshwkempapgigrgglqcppgranptmkpdqplwphhprnergweggmdsgpwgdekptpaaapwmdqglapsswqggpkhkpawdgsdldptswvhskqpsksvskefiwtskqfrilsemgfkkediesalrssgmsledaldqlntnrglsagggserwprhgdldsehaaimntfpspqqticlapfpqggggggsgsgpgggptlatitpavmqkllaqqppqqqpfaqqssrtqqtqqpsaqqlrmlvqqiqmavqtgylspqilnqplapqtlillnqllqqiknlqqlmqhhtvmqvnplgkpssnhllqlsvqitktkqqitnlqnqiaaqqavyvkhqqhtpptseffksslhepisalhpnfsdlslkdpptsgtsqqsrlnqwklpalekdsdigtgefsrapgttaksaqgssspntnlllgqadgtwssvnresswpdssgddasgkdwpnssqppsqafsdlvpefepgkpwkgnplksieddpsltpgsvvrsplslpsikdthilststgagkaspttsssldiipslglssstwsfnpppsssntsvklnssgaagggsgstsnngggknststwetnsselwapkrgpppglpakpsggssggqaangwgplsssgrwstgqgwpgpnqaaatqpgstwlllrnltpqidgstlktlclqhgplsnfhlylnhgialakyasreeankaqgalnncvlgnttifaespsetdvlsllnhlggqggtasgssgwrgkeawgnsqlwgangassaaaslwagdsdqhrntpssinsylpgdllggesi

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27/157 [0066] SEQ ID N°:73 mostra um DNA exemplificador de gw de BSB referido aqui em alguns locais como BSB_gw-1 reg1 (região 1), que é usado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:

[0067] gtatgttaagcatcaacagcatacaccacctacttctgagtttttcaagagttcattacatgaaccaatttctgcacttcatcctaatttttctgatctttctcttaaagatcccccgaccagtggaactagccagcaatcacgattaaatcagtggaagttacctgccctggaaaaagactcagatattgggacaggtgaattttctagagctccaggtacaacagctaagtcagctcaaggctcttcttcacctaatacaaatttattacttgggcaggctgatggtacttggtcttctgtaaatcgtgaatctagttggcctgattcatccggtgatgatgcttctggcaaggattggccaaattccagtcaacctccatctcaagcattctctgatcttgttcctgagtttgaaccaggaaagccttggaagggaaacccactaaaaagcatcgaggatgatccaagccttacacctggttcggttgtg [0068] SEQ ID N°^s:74-75 mostra iniciadores usados para amplificar porções de sequências de gw de BSB exemplificadoras que compreendem gw-1 reg1 usado em alguns exemplos para a produção de dsRNA.

[0069] SEQ ID N°:76 mostra um DNA exemplificador de YFP v2, que é usado em alguns exemplos para a produção toda fita senso de um dsRNA.

[0070] SEQ ID N°^s:77-78 mostra iniciadores usados para a amplificação por PCR da sequência YFP v2 de YFP, usado em alguns exemplos para a produção de dsRNA.

[0071] SEQ ID N°^s:79-84 mostra RNAs exemplificadores transcritos a partir de ácidos nucleicos que compreendem polinucleotídeos de gw exemplificadores e seus fragmentos.

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MODO(S) PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Visão geral de várias modalidades [0072] Desenvolveu-se um RNA de interferência (RNAi) como uma ferramenta para o manuseio de praga de inseto, usando uma das mais prováveis espécies alvo de praga de inseto para plantas transgênicas que expressam dsRNA: lagarta da raiz do milho ocidental. Até agora, a maioria dos genes propostos como alvos para o RNAi nas larvas da lagarta da raiz não atinge realmente seus propósitos. Aqui, descreveu-se o knockdown de gw mediado por RNAi nas pragas de insetos exemplificadoras, lagarta da raiz do milho ocidental e o percevejo marrom neotropical, que é mostrado ter um fenótipo letal quando, por exemplo, as moléculas de iRNA são liberadas através do dsRNA de gw ingerido ou injetado. Em modalidades, a habilidade para liberar o dsRNA de gw pela alimentação de insetos confere um efeito ao RNAi que é muito útil para o manuseio de praga de inseto (por exemplo, coleóptero e hemíptero). Pela combinação do RNAi mediado por gw com outros alvos úteis de RNAi (por exemplo e sem limitação, alvos de RNAi de ROP, como descritos no Pedido de Patente U.S. N°. 14/577.811, alvos de RNAi de RNA polimerase, como descritos no Pedido de Patente U.S. N°. 62/133.214, alvos de RNAi de RNA polimerase II140, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 14/577.854, alvos de RNAi de RNA polimerase II215, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/133.202, alvos de alvos de RNAi de RNA polimerase II33, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/133,210), alvos de RNAi de ncm (Pedido de Patente U.S. N°. 62/095487), dre4 (Pedido de Patente U.S. N°. 61/989843), alvos de RNAi de snap25 (Pedido de Patente U.S. N°. 62/193502), alvos de RNAi do fator de alongamento da transcrição spt5, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/168613) e alvos de RNAi do fator de alongamento da transcrição spt6, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/168606), o potencial para afetar múltiplas

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29/157 sequências-alvos, por exemplo, com múltiplos modos de ação, pode aumentar as oportunidades para desenvolver abordagens sustentáveis para o manuseio de praga de inseto que envolvam tecnologias com RNAi.

[0073] São descritos aqui métodos e composições para o controle genético de infestações por pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Também são fornecidos métodos para a identificação de um ou mais genes essenciais ao ciclo de vida de uma praga de inseto para uso como um gene-alvo para o controle mediado por RNAi de uma população de praga de inseto. Vetores de plasmídeo de DNA que codificam uma molécula de RNA podem ser designados para suprimir um ou mais genes-alvo essenciais para o crescimento, sobrevida e/ou desenvolvimento. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para a repressão pós-transcricional da expressão ou inibição de um gene-alvo através de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência codificadora ou não codificadora do gene-alvo de uma praga de inseto. Nessas e em outras modalidades, uma praga pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA transcritas a partir de toda ou de uma porção de uma molécula de ácido nucleico que seja complementar a uma sequência codificadora ou não codificadora do gene-alvo, fornecendo dessa maneira um efeito protetor para a planta.

[0074] Portanto, algumas modalidades envolvem a inibição específica da sequência de expressão de produtos do gene-alvo, usando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que sejam complementares a uma sequência codificadora ou não codificadora dos genes-alvo para obter pelo menos o controle parcial de uma praga de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). É descrito um grupo de moléPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 39/390

30/157 culas de ácido nucleico isoladas e purificadas que compreendem um polinucleotídeo, por exemplo, como descrito em uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71; e fragmentos de pelos menos 15 nucleotídeos contíguos dessas. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir desses polinucleotídeos, seus fragmentos ou um gene que compreende um desses polinucleotídeos, para o silenciamento ou inibição pós-transcricional do gene-alvo. Em certas modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de cada uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71 (por exemplo, SEQ ID N°^s: 3-5 e 73) e/ou um complemento ou complemento reverso dessas.

[0075] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula de planta) que possui em seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser fornecida quando ingerida por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) para silenciar ou inibir pós-transcricionalmente a expressão de um gene-alvo na praga. O DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID N°^s:1, 3-5, 71 e 73; fragmentos de pelos menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1, 3-5, 71 e 73; e um polinucleotídeo que consiste em uma sequência parcial de um gene que compreende um das SEQ ID N°^s:1,3-5, 71 e 73; e/ou complementos ou complementos reversos dessas.

[0076] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante que possui em seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) que compreende todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 79 e 83 (por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo que compreende as

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SEQ ID N°^s:80-82 e 84) ou o complemento ou complemento reverso dessas. Quando ingeridas por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero), as moléculas de iRNA podem silenciar ou inibir a expressão de um DNA de gw alvo (por exemplo, um DNA que compreenda pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 1, 3-5, 71 e 73) na praga e dessa maneira resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, viabilidade e/ou alimentação da praga.

[0077] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante que possui em seu genoma pelo menos um DNS recombinante que codifica pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA, pode ser uma célula de planta transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas que compreendem tal célula de planta transformada. Em adição a tais plantas transgênicas, plantas da progênie de qualquer geração da planta transgênica, sementes transgênicas e produtos de planta transgênica são fornecidos, cada um dos quais compreende os DNAs recombinantes. Em modalidades particulares, uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser expressa em uma célula de planta transgênica. Portanto, nessas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser isolada de uma célula de planta transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo que compreende o milho (Zea mays), soja (Glycine max), algodão e plantas da família Poaceae.

[0078] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero). Nessas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em moPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 41/390

32/157 dalidades particulares, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser operativamente ligado a um promotor e também pode ser operativamente ligado a uma sequência de terminação da transcrição. Em modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto pode compreender: (a) transformar uma célula de planta com um vetor que compreenda um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta que compreende uma pluralidade de células de planta transformadas; (c) selecionar uma célula de planta transformada que tem o vetor integrado em seu genoma; e (d) determinar que a célula de planta selecionada transformada compreenda a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula de planta que tem o vetor integrado em seu genoma e compreenda a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor.

[0079] Portanto, também é descrita uma planta transgênica que compreende um vetor que possui um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Em modalidades particulares, a expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) que contate a planta ou célula de planta transformada (por exemplo, pela alimentação com a planta transformada, parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula da planta), tal que o crescimento e/ou a sobrevida da praga é inibida. As plantas

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33/157 transgênicas aqui descritas podem exibir proteção e/ou proteção intensificada às infestações de praga de inseto. Plantas transgênicas particulares podem exibir proteção e/ou proteção intensificada contra uma ou mais pragas coleópteras e/ou hemípteras selecionadas do grupo que consiste em: WCR; BSB; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; E. servus (Say); Nezara viridula (L.); Piezodorus guildinii (Westwood); Halyomorpha halys (Stãl); Chinavia hilare (Say); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.); Horcias nobilellus (Berg); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois).

[0080] Também estão descritos aqui métodos para a liberação de agentes de controle, tais como uma molécula de iRNA, contra uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero). Tais agentes de controle podem causar, diretamente ou indiretamente, um dano na habilidade de uma população de praga de inseto de se alimentar, crescer ou causar de outra maneira um dano ao hospedeiro. Em algumas modalidades, é fornecido um método que compreende liberar uma molécula de dsRNA estabilizada para uma praga de inseto para suprimir pelo menos um gene-alvo na praga, dessa maneira induzindo um RNAi e reduzindo ou eliminando o dano da planta em um hospedeiro da praga. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene-alvo na praga de inseto pode resultar na cessação do crescimento, sobrevida e/ou desenvolvimento da praga.

[0081] Em algumas modalidades, composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidas que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) para uso em plantas, animais e/ou no

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34/157 ambiente de uma planta ou animal para obter a eliminação ou a redução de uma infestação por praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero). Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou uma fonte de alimento para ser fornecida à praga de inseto. Uma composição nutricional ou fonte de alimento para ser fornecida à praga de inseto pode ser, por exemplo e sem limitação, uma isco de RNAi ou uma célula ou tecido de planta que compreenda uma molécula de iRNA. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou fonte de alimento disponíveis para a praga. A ingestão de uma composição que compreende moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da praga, o que por sua vez pode resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene alvo nas células da praga. A ingestão de ou o dano a uma planta ou célula de planta por uma infestação de praga de inseto pode ser limitada ou eliminada em ou sobre o tecido ou ambiente do hospedeiro no qual a praga está presente, pelo fornecimento de uma ou mais composições que compreendem uma molécula de iRNA no hospedeiro da praga.

[0082] Iscas de RNAi são formadas quando dsRNA é misturado com alimento ou um atraente ou ambos. Quando as pragas comem a isca, elas também consomem o dsRNA. As iscas podem ter a forma de grânulos, géis, pós fluxíveis, líquidos ou sólidos. Em outra modalidade, gw pode ser incorporado em uma formulação para isca tal como descrito na Patente U.S. N°. 8.530.440, que está incorporada aqui por referência. De modo geral, com as iscas, as iscas são colocadas dentro ou em volta do ambiente da praga de inseto, por exemplo, WCR pode entrar em contato com e/ou ser atraído pela isca.

[0083] As composições e os métodos descritos podem ser usados juntos em combinações com outros métodos e composições para o controle de danos de pragas de insetos (por exemplo, coleóptero ou

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35/157 hemíptero). Por exemplo, uma molécula de iRNA como aqui descrita para proteger as plantas contra pragas de inseto pode ser usada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de inseto, biopesticidas eficazes contra tal praga, rotação de cultura, expressão recombinante de outras moléculas de iRNA e/ou técnicas genéticas recombinantes que exibem características diferentes das características dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são nocivas para uma praga de inseto (por exemplo, toxinas Bt, polipeptídeos PIP-1 (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N°. US 2014/0007292 A1) e/ou polipeptídeos AflP (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N°. US 2014/0033361 A1)).

[0084] II. Abreviações

BSB percevejo marrom neotropical (Euchistus heros) dsRNA ácido ribonucleico de fita dupla

GI inibição do crescimento

NCBI National Center for Biotechnology Information gDNA ácido desoxirribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibitório

ORF fase de leitura aberta

RNAi ácido ribonucleico de interferência miRNA micro ácido ribonucleico shRNA ácido ribonucleico de hairpin curto siRNA ácido ribonucleico inibitório pequeno hpRNA ácido ribonucleico hairpin

UTR região não traduzida

WCR lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera LeConte)

NCR lagarta da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi Smith

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36/157 and Lawrence)

MCR lagarta da raiz do milho mexicana (Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith)

PCR reação em cadeia da polimerase qPCR reação em cadeia da polimerase quantitativa

RISC Complexo de Silenciamento induzido por RNA

SCR lagarta da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)

SEM desvio padrão da média

YFP proteína amarela fluorescente [0085] III. Termos [0086] Na descrição e tabelas a seguir, vários termos são usados. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do pedido e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as definições a seguir são fornecidas:

[0087] Praga de coleópteros: como usada aqui, a expressão praga de coleópteros se refere a pragas de insetos da ordem dos Coleópteros, incluindo pragas de insetos do gênero Diabrotica, que se alimentam nas culturas agrícolas e nos produtos da cultura, incluindo o milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma praga de coleópteros é selecionada de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar.

[0088] Contato (com um organismo): Como usada aqui, a expressão contato com ou absorção pelo organismo (por exemplo, uma praga de coleópteros ou hemíptera), com relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, pela alimentação); contato do organismo com

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37/157 uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico; e imersão de organismos em uma solução que compreende a molécula de ácido nucleico.

[0089] Contig: Como usada aqui, a expressão contig se refere a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um grupo de segmentos de DNA superpostos derivados de uma única fonte genética. [0090] Planta de milho: Como usada aqui, a expressão planta de milho se refere a uma planta da espécie Zea mays (milho).

[0091] Expressão: Como usado aqui, expressão de um polinucleotídeo codificador (por exemplo, um gene ou um transgene) se refere ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, gDNA ou cDNA) é convertida em uma parte da célula operacional, não operacional ou estrutural, geralmente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão de gene pode ser influenciada pelos sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a uma agente que aumente ou diminua a expressão do gene. A expressão do gene também pode ser regulada em qualquer parte da via de DNA para RNA para proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam sobre a transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas específicas de proteína depois delas terem sido feitas ou pelas combinações desses. A expressão de gene pode ser medida pelo nível de RNA ou pelo nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo sem limitação, Northern blot, RT-PCR, western blot ou ensaios de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[0092] Material genético: Como usada aqui, a expressão material genético inclui todos os genes e moléculas de ácido nucleico tais como

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DNA e RNA.

[0093] Praga de hemípteros: Como usada aqui, a expressão praga de hemípteros se refere a pragas de insetos da ordem dos Hemípteros que inclui, por exemplo e sem limitação, insetos das famílias Pentatomidae, Miridae, Pyrrhocoridae, Coreidae, Alydidae e Rhopalidae, que se alimentam de uma ampla faixa de plantas hospedeiras e possuem partes bucais perfurantes e sugadoras. Em exemplos particulares, uma praga de hemípteros é selecionada da lista que compreende Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo marrom neotropical), Nezara viridula (L.) (Percevejo verde do sul), Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo com banda vermelha), Halyomorpha halys (Stàl) (Percevejo marrom marmorizado), Chinavia hilare (Say) (Percevejo verde), Euschistus servus (Say) (Percevejo marrom), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Percevejo vermelho neotropical), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do algodão), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Percevejo manchado ocidental) e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).

[0094] Inibição: Como usada aqui, a expressão inibição quando usada para descrever um efeito sobre um polipeptídeo codificador (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir do polipeptídeo codificador e/ou peptídeo, polipeptídeo ou produto de proteína do polinucleotídeo codificador. Em alguns exemplos, a expressão de um polinucleotídeo codificador pode ser inibida tal que a expressão é aproximadamente eliminada. Inibição específica refere-se à inibição de um polinucleotídeo codificador alvo sem afetar, consequentemente, a expressão de outros polinucleotídeos codificadores (por exemplo, genes) na célula em que a

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39/157 inibição específica está sendo obtida.

[0095] Inseto: Como usada aqui em relação às pragas, a expressão praga de inseto refere-se especificamente a uma praga de coleópteros no gênero Diabrotica selecionada de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar. Em algumas modalidades, a expressão também inclui algumas outras pragas de inseto; por exemplo, pragas de insetos hemípteros.

[0096] Isolado: Um componente biológico isolado (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido em adição a ou purificado sem outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos e proteínas), enquanto efetua uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo pelo rompimento químico de ligações que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que tenham sido isolados incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas pelos métodos de purificação padronizados. A expressão também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparadas pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos.

[0097] Molécula de ácido nucleico: Como usada aqui, a expressão molécula de ácido nucleico pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir ambas as fitas de senso e antissenso de RNA, cDNA, gDNA e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo ou nucleobase pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico como usada aqui é siPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 49/390

40/157 nônimo de ácido nucleico e polinucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico tem geralmente pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que especificado de outra maneira. Por convenção, a sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' para a 3' da molécula. O complemento de uma molécula de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo que possui nucleobases que podem formar pares de bases com as nucleobases da molécula de ácido nucleico (isto é, A-T/U e G-C).

[0098] Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos que compreendem um DNA de modelo que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nessas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação 5' para 3', tal que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção 5' para 3') transcreverá um ácido nucleico do complemento que pode hibridizar com a molécula de mRNA. A menos que explicitamente estabelecido de outra maneira ou esclarecido de outra maneira a partir do contexto, a expressão complemento refere-se, portanto, a um polinucleotídeo que possui núcleobases, de 5' para 3', que podem formar pares de base com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. Similarmente, a menos que explicitamente estabelecido de outra maneira (ou esclarecido de outra maneira a partir do contexto), o complemento reverso de um ácido nucleico se refere ao complemento na orientação reversa. O precedente é demonstrado pela seguinte ilustração:

ATGATGATGpolinucleotídeo

TACTACTAC complemento do polinucleotídeo

CATCATCAT complemento reverso do polinucleotídeo [0099] Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi que formam RNA hairpin. Nessas moléculas de RNAi, o complemento do ácido nucleico a ser atingido pelo RNA de interferência e o

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41/157 complemento reverso podem ser encontrados na mesma molécula, tal que a molécula de RNA de fita simples pode se enovelar e hibridizar com ela mesma sobre a região que compreende os polinucleotídeos complementar e complementar reverso.

[00100] Moléculas de ácido nucleico incluem todos os polinucleotídeos, por exemplo: formas de fita simples e de fita dupla de DNA; formas de fita simples de RNA; e formas de fita dupla de RNA (dsRNA). O termo sequência de nucleotídeos ou sequência de ácido nucleico refere-se a ambas as fitas de senso e antissenso de um ácido nucleico como fitas únicas individuais ou no duplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) é inclusivo de iRNA (RNA inibitório), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (RNA pequeno de interferência), shRNA (RNA pequeno hairpin), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA hairpin), tRNA (RNAs de transferência, carregados ou descarregados com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar). O termo ácido desoxirribonucleico (DNA) é inclusivo de cDNA, gDNA e híbridos de DNA-RNA. Os termos polinucleotídeo e ácido nucleico e seus fragmentos serão compreendidos por aqueles versados na técnica como um termo que inclui ambos gDNAs, RNAs ribossômicos, RNAs de transferência, RNAs mensageiros, operons e polinucleotídeos menores manipulados que codificam ou podem ser adaptados para codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[00101] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero curto de ácido nucleico. Oligonucleotídeos podem ser formados pela clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos ou pela polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas em comprimento. Como os oligonucleotídeos podem se ligar a um ácido nucleico complementar, eles podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (olidoPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 51/390

42/157 desoxirribonucleotídeos) podem ser usados na PCR, uma técnica para a amplificação de DNAs. Na PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um iniciador, que permite que uma DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.

[00102] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou ambos nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados juntos pelas ligações de nucleotídeo que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente. Moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será facilmente apreciado por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptideos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoralen, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo molécula de ácido nucleico também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, fita dupla, parcialmente duplicada, triplicada, em hairpin, circular e fechada.

[00103] Como usado aqui com relação ao DNA, o termo polinucleotídeo codificador, polinucleotídeo estrutural ou molécula de ácido nucleico estrutural se refere a um polinucleotídeo que é traduzido, em última análise, em um polipeptídeo, através da transcrição e mRNA, quando colocado sob o controle de elementos reguladores apropriados. Com relação ao RNA, o termo polinucleotídeo codificador refere-se a um polinucleotídeo que é traduzido em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de um polinucleotídeo codificador são determinados

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43/157 por um códon de partida da tradução na terminação 5' e um códon de parada da tradução na terminação 3'. Polinucleotídeos codificadores incluem, mas não são limitados a: gDNA; cDNA; EST e polinucleotídeos recombinantes.

[00104] Como usado aqui, polinucleotídeo não codificador transcrito se refere a segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR e segmentos de íntron que não são traduzidos em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Adicionalmente, um polinucleotídeo não codificador transcrito se refere a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) como exemplificado por 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA e 28S rRNA e semelhantes); RNA de transferência (tRNA) e snRNAs tais como U4, U5, U6 e semelhantes. Polinucleotídeos não codificadores transcritos também incluem, por exemplo, e sem limitação, RNAs pequenos (sRNA), cujo termo é geralmente usado para descrever RNAs não codificadores bacterianos pequenos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs; RNAs pequenos de interferência (siRNA); RNAs que interagem com Piwi (piRNA) e RNAs longos não codificadores. Adicionalmente ainda, polinucleotídeo não codificador transcrito refere-se a um polinucleotídeo que pode existir naturalmente como um espaçador intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito em uma molécula de RNA.

[00105] RNA letal de interferência: Como usado aqui, o termo RNA letal de interferência refere-se a um RNA de interferência que resulta na morte ou na redução da viabilidade do indivíduo no qual, por exemplo, um dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA e/ou hpRNA é liberado.

[00106] Genoma: Como usado aqui, o termo genoma refere-se a um DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula e também se refere a uma organela de DNA encontrada dentro de

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44/157 componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula de planta, tal que a molécula de DNA é integrada no genoma da célula de planta. Nessas e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode estar integrada no DNA nuclear da célula de planta ou integrado no DNA do cloroplasto ou da mitocôndria da célula de planta. O termo genoma, conforme se aplica a bactérias, refere-se ao cromossomo e aos plasmídeos dentro de uma célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria tal que a molécula de DNA é introduzida no genoma da bactéria. Nessas e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode estar integrada no cromossomo ou localizada como ou em um plasmídeo estável. [00107] Identidade de sequência: o termo identidade de sequência ou identidade como usado aqui no contexto de dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se aos resíduos nas sequências das duas moléculas que são iguais quando alinhadas para a correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[00108] Como usado aqui, o termo percentual de identidade de sequência pode se referir ao valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de polipeptídeo) de uma molécula sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) quando comparadas com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O percentual é calculado pela determinação do número de posições nas quais o resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idênticos ocorre em ambas as sequências para fornecer o número de posições combinadas, dividindo o número de posições que combinam pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o rePetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 54/390

45/157 sultado por 100 para fornecer o percentual de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em cada posição em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência e vice-versa.

[00109] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento estão descritos em, por exemplo: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[00110] National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) e na internet, para uso em conjunto com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando esse programa está disponível na internet na seção de ajuda para BLAST™. Para as comparações das sequências de ácido nucleico, a função sequências Blast 2 do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando o conjunto de matriz BLOSUM62 para os parâmetros padronizados. Os ácidos nucleicos com similaridade de sequência ainda maior com as sequências dos polinucleotídeos de referência mostrarão um percentual de identidade crescente quando avaliadas por

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46/157 esse método.

[00111] Especificamente hibridizável/especificamente complementar: Como usados aqui, os termos especificamente hibridizável e especificamente complementar são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que a ligação estável e específica entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as nucleobases das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com as bases correspondentes sobre a fita oposta para formar uma molécula dupla que, se ela for suficientemente estável, é detectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Um polinucleotídeo não necessita ser 100% complementar ao seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Entretanto, a quantidade de complementaridade que deve existir para a hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.

[00112] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento dos ácidos nucleicos a serem hibridizados. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização determinarão a estringência da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciam a estringência. Os cálculos com relação às condições de hibridização necessárias para a obtenção de graus particulares de estringência são conhecidos daqueles versados na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid

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Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções e normas mais detalhadas adicionais com relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, OverView of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

[00113] Como usadas aqui, condições estringentes abrangem condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos do que 20% de não pareamento entre a sequência da molécula de hibridização e um polinucleotídeo homólogo dentro da molécula de ácido nucleico-alvo. Condições estringentes incluem níveis particulares adicionais de estringência. Portanto, como usadas aqui, condições de estringência moderada são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 20% de não pareamento de sequência não hibridizarão; condições de alta estringência são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10% de não pareamento não hibridizarão; e condições de estringência muito alta são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 5% de não pareamento não hibridizarão. [00114] A seguir estão condições de hibridização representativas, não limitantes.

[00115] Condição de Alta Estringência (detecta polinucleotídeos que partilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em 5x tampão SSC a 65°C por 16 horas; lavar duas vezes com 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavar duas vezes em 0,5x tampão SSC a 65°C por 20 minutos cada.

[00116] Condição de Estringência Moderada (detecta polinucleotídeos que partilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em 5x-6x tampão SSC a 65-70°C por 16-20 horas; lavar duas

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48/157 vezes com 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 5-20 minutos cada; e lavar duas vezes em 1x tampão SSC a 55-70°C por 30 minutos cada.

[00117] Condição de controle não estringente: (polinucleotídeos que partilham pelo menos 50% de identidade de sequência hibridizarão): Hibridização em 6x tampão SSC em temperatura ambiente a 55°C por 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes com 2x-3x tampão SSC em temperatura ambiente até 55°C por 20-30 minutos cad a.

[00118] Como usado aqui, o termo substancialmente homólogo ou homologia substancial, com relação a um ácido nucleico, refere-se a um polinucleotídeo que possui nucleobases contíguas que hibridizam sob condições estringentes com o ácido nucleico de referência. Por exemplo, ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos a um ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71 são aqueles ácidos nucleicos que hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, as condições de Estringência Moderada descritas acima) com o ácido nucleico de referência. Polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter entre cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como 79%; 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98.5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com a hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando houver um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico a polinucleotídeos não alvos sob condições onde a liPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 58/390

49/157 gação específica é desejada, por exemplo, sob condições estringentes de hibridização.

[00119] Como usado aqui, o termo ortólogo refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluíram de um ácido nucleico ancestral comum e pode reter a mesma função em duas ou mais espécies. [00120] Como usado aqui, duas moléculas de ácido nucleico são ditas exibir complementaridade completa quando cada nucleotídeo de um polinucleotídeo lido na direção 5' para 3' é complementar a cada nucleotídeo do outro polinucleotídeo quando lido na direção 3' para 5'. Um polinucleotídeo que é complementar a um polinucleotídeo de referência exibirá uma sequência idêntica ao complemento reverso do polinucleotídeo de referência. Esses termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles versados na técnica.

[00121] Operativamente ligado: Um primeiro polinucleotídeo está operativamente ligado a um segundo polinucleotídeo quando o primeiro polinucleotídeo está em um relacionamento funcional com o segundo polinucleotídeo. Quando produzidos recombinantemente, polinucleotídeos operativamente ligados são geralmente contíguos e, quando necessário unir duas regiões codificadoras de proteína, na mesma fase de leitura (por exemplo, em uma ORF fundida traducionalmente). Entretanto, ácidos nucleicos não necessitam ser contíguos para estarem operativamente ligados.

[00122] O termo operativamente ligado quando usado em referência a um elemento genético regulatório e um polinucleotídeo codificador, significa que o elemento regulador afeta a expressão do polinucleotídeo codificador ligado. Elementos reguladores ou elementos de controle referem-se a polinucleotídeos que influenciam o momento e o nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou a tradução do polinucleotídeo codificador associado. Elementos

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50/157 reguladores podem incluir promotores; líderes da tradução; íntrons; intensificadores; estruturas de stem-loop; polinucleotídeos que se ligam ao repressor; polinucleotídeos com uma sequência de terminação; polinucleotídeos com uma sequência de reconhecimento da poliadenilação; etc. Elementos reguladores particulares podem estar localizados a montante e/ou a jusante de um polinucleotídeo codificador operativamente ligado a eles. Elementos reguladores particulares operativamente ligados a um polinucleotídeo codificador também podem estar localizados sobre a fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.

[00123] Promotor: Como usado aqui, o termo promotor refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição e que pode estar envolvido no reconhecimento e na ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar operativamente ligado a um polinucleotídeo codificador para expressão em uma célula ou um promotor pode estar operativamente ligado a um polinucleotídeo codificador que codifica um peptídeo de sinal que pode estar operativamente ligado a um polinucleotídeo codificador para expressão em uma célula. Um promotor de planta pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta. Exemplos de promotores sob o controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídeos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como preferidos para o tecido. Promotores que inicial a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como específicos para o tecido. Um promotor específico para o tipo celular dirige primariamente a expressão em certos tipos celulares em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ou folhas. Um promotor induzível pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de

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51/157 condições ambientais que podem iniciar a transcrição pelos promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores específicos para o tecido, preferidos para o tecido, específicos para o tipo celular e promotores induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que pode estar ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tecidos e tipos celulares.

[00124] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Veja Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Promotores induzíveis exemplificadores incluem, mas não estão limitados a: promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde aos herbicidas fitoprotetores de benzenosulfonamida; repressor Tet de Tn10; e um promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glicocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421). [00125] Promotores constitutivos exemplificadores incluem, mas não estão limitados a: promotores de vírus de planta, tais como o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV); promotores dos genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; e o promotor ALS, fragmento Xba1/Ncol 5' ao gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou um polinucleotídeo similar ao dito fragmento Xba1/Ncol) (Publicação PCT Internacional No. WO96/30530).

[00126] Adicionalmente, qualquer promotor específico para o tecido ou preferido para o tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificador operativamente ligado a um promotor específico para o tecido pode produzir o produto

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52/157 do polinucleotídeo codificador exclusivamente ou preferencialmente em um tecido específico. Promotores específicos para o tecido ou preferidos para o tecido exemplificadores incluem, mas não são limitados a: um promotor preferido para a semente, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico para a folha e induzido pela luz tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico para a antera tal como aquele de LAT52; um promotor específico para o pólen tal como aquele de Zm13; e um promotor preferido para o micrósporo tal como aquele de apg.

[00127] Planta de soja: Como usada aqui, o termo planta de soja refere-se a uma planta da espécie Glycine; por exemplo, Glycine max. [00128] Transformação: Como usado aqui, o termo transformação ou transdução refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico em uma célula. Uma célula é transformada por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, pela incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular ou pela replicação epissomal. Como usado aqui, o termo transformação abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); absorção direta de DNA; e o bombardeio com microprojéteis (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00129] Transgene: Um ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um DNA que codifica uma ou ambas as fitas de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que comPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 62/390

53/157 preende um polinucleotídeo que seja complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga de coleópteros e/ou hemíptera. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um polinucleotídeo antissenso, em que a expressão do polinucleotídeo antissenso inibe a expressão de um ácido nucleico alvo, produzindo dessa maneira um fenótipo de RNAi. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um gene estrutural (por exemplo, um gene de tolerância ao herbicida, um gene que codifica um composto industrialmente ou agricolamente útil ou um gene que codifica um traço agrícola desejável). Nesses e em outros exemplos, um transgene pode conter elementos reguladores operativamente ligados a um polinucleotídeo codificador do transgene (por exemplo, um promotor).

[00130] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico como introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir elementos genéticos que permitem que ele replique na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que carregue um DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, incluindo aqueles que produzem moléculas antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo com que a célula expresse dessa maneira as moléculas de ácido nucleico e/ou as proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui, opcionalmente, materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossomo, revestimento de proteína, etc.). [00131] Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou mais em relação ao rendimento de variedades de controle na mesma localização de cultivo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, rendimento melhorado ou melhorar o

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54/157 rendimento significa um cultivar que possui um rendimento estabilizado de 105% ou mais em relação ao rendimento de variedades de controle na mesma localização de cultivo que contém densidades significativas de pragas de coleópteros e/ou hemípteros que são prejudiciais para aquela cultura que está se desenvolvendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições, que são atingidos pelas composições e métodos desse.

[00132] A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos um/uma e o/a significam pelo menos um como usados aqui. [00133] A menos que especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem o mesmo significado como comumente compreendidos por aqueles versados na técnica a qual essa descrição pertence. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todos os percentuais são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que observado de outra maneira. Todas as temperaturas são em graus Celsius.

IV. Moléculas de Ácido Nucleico que Compreendem uma Sequência de

Praga de Inseto

Visão Geral [00134] São descritas aqui moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de inseto. Em alguns exemplos, a praga de inseto é uma praga de inseto coleóptero (por exemplo, espécies do gênero Diabrotica) ou hemíptera (por exemplo espécies do gênero Euschistus). As moléculas de ácido nucleico descritas incluem polinucleotídeos alvos (por exemplo, genes nativos e polinucleotídeos não codificadores),

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55/157 dsRNAs, siRNAs, shRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, as moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA que são descritas em algumas modalidades podem ser especificamente complementares a todos ou parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de coleópteros e/ou hemíptera. Nessas e em modalidades adicionais, os cácidos nucleicos nativos podem ser um ou mais dos genes-alvo, o produto do qual pode estar, por exemplo e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento da larva/ninfa. As moléculas de ácido nucleico aqui descritas, quando introduzidas em uma célula que compreende pelo menos um ácido nucleico nativo ao qual as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar o RNAi na célula e, consequentemente, reduzir ou eliminar o termo dos ácidos nucleicos nativos. Em alguns exemplos, a redução ou eliminação da termo de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico especificamente complementar a ele pode resultar na redução ou cessação do crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação de uma praga.

[00135] Em algumas modalidades, pelo menos um gene alvo em uma praga de inseto pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo de gw. Em exemplos particulares, um gene-alvo em uma praga de coleópteros é selecionado, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo selecionado entre as SEQ ID NOs: 1 e 3-5. Em exemplos particulares, um gene-alvo em uma praga de hemípteros é selecionado, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo selecionado da SEQ ID N°: 71 e/ou o polinucleotídeos da SEQ ID N°:73.

[00136] Em algumas modalidades, um gene-alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que pode ser traduzido inversamente in silico em um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos contígua que é pelo mePetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 65/390

56/157 nos cerca de 85% idêntica (por exemplo, pelo menos 84%, 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica) à sequência de aminoácidos de um produto de proteína de um polinucleotídeo de gw. Um gene-alvo pode ser qualquer polinucleotídeo de gw em uma praga de inseto, a inibição pós-transcricional do qual tem um efeito deletério sobre o crescimento, sobrevida e/ou viabilidade de uma praga, por exemplo, para fornecer um benefício protetor contra a praga para uma planta. Em exemplos particulares, um gene-alvo é uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que pode ser traduzido inversamente in silico em um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos contígua que é pelo menos cerca de 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 ou SEQ ID N°:72.

[00137] De acordo com a invenção são fornecidos DNAs, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativo que é codificada por um polinucleotídeo codificador em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Em algumas modalidades, depois da ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de inseto, a regulação negativa do polinucleotídeo codificador nas células da praga pode ser obtida. Em modalidades particulares, a regulação negativa do polinucleotídeo codificador nas células da praga de inseto pode resultar em um efeito deletério sobre o crescimento e/ou desenvolvimento da praga.

[00138] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos-alvos incluem RNAs não codificadores transcritos, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; líderes unidas; íntrons; outros (por exemplo, 5'UTR RNA subsequenPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 66/390

57/157 temente modificado em trans-splicing); donatrons (por exemplo RNA não codificado necessário para fornecer as sequências doadoras para o trans splicing); e outros RNA transcritos não codificadores de genes -alvo de praga de inseto. Tais polinucleotídeos podem ser derivados de ambos os genes monocistrônicos e policistrônicos.

[00139] Portanto, também estão descritos aqui em conexão com algumas modalidades, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico-alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA pode compreender polinucleotídeos que são complementares a toda ou parte de uma pluralidade de ácidos nucleicos-alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ácidos nucleicos-alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo pelo organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Também são descritos cDNAs que podem ser usados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de um ácido nucleico-alvo em uma praga de inseto. São descritos ainda construtos de DNA recombinante para uso na obtenção da transformação estável de alvos hospedeiros em particular. Alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e/ou hpRNA a partir de construtos de DNA recombinate. Portanto, também é descrito um vetor de transformação de planta que compreende pelo menos um polinucleotídeo operativamente ligado a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, em que a expressão do polinucleotídeo resulta em uma molécula de RNA que compreende uma fileira de nucleobases contíguas que é especificaPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 67/390

58/157 mente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto.

[00140] Em exemplos particulares, moléculas de ácido nucleico úteis para controlar pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) podem incluir: todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico nativo isolado de Diabrotica que compreende um polinucleotídeo de gw (por exemplo, SEQ ID N°:1); DNAs que quando expressos em uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma molécula de RNA que é codificada por gw de Diabrotica; moléculas de iRNA (por exemplo,dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de gw de Diabrotica; cDNAs que podem ser usados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de gw de Diabrotica; todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico nativo isolado de Euschistus heros que compreende um polinucleotídeo de gw (por exemplo, SEQ ID N°:71); DNAs que quando expressos em uma molécula de RNA que compreende a polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma molécula de RNA que é codificada por gw de E. heros; moléculas de iRNA que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de gw de E. heros; cDNAs que podem ser usados na produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todos ou pelo menos 15

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59/157 nucleotídeos contíguos de gw de E. heros; e construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros em partícula, em que o alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico precedentes.

B. Moléculas de Ácido Nucleico [00141] Modalidades incluem, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA ) que inibem a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera); e moléculas de DNA capazes de serem expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou microrganismo para inibir a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto.

[00142] Algumas modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:1; o complemento ou o complemento reverso de SEQ ID N°:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5); o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de

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Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5.

[00143] Algumas modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:71; o complemento ou o complemento reverso de SEQ ID N°:71; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:71 (por exemplo, SEQ ID N°:73); o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:71; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) que compreende a SEQ ID N°:73; o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:73; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:73; and o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:73.

[00144] Em modalidades particulares, o contato com ou a ingestão por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) de um iRNA transcrito a partir do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, desenvolvimento e/ou a alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato com ou a absorção pelo inseto ocorre através da alimentação sobre um material de planta ou isca que compreende o iRNA (isca de iRNA). Em algumas modalidades, o contato com ou a absorção pelo inseto ocorre através da pulverização de uma planta que compreende o inseto com uma composição que compreende o iRNA. [00145] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que conPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 70/390

61/157 siste em: SEQ ID N°:79; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:79; SEQ ID N°:80; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:80; SEQ ID N°:81; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:81; SEQ ID N°:82; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:82; SEQ ID N°:83; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:83; SEQ ID N°:84; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:84; um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79-84; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79-84; um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:80-82; o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:80-82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:80-82; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:80-82; um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:84; o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:84; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:84; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo nativo que codifica um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:84.

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62/157 [00146] Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA fornecidas pela invenção compreendem polinucleotídeos complementares a um transcrito de um gene-alvo que compreende a SEQ ID N°:1 e a SEQ ID N°:71 e fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dessas, cuja inibição do gene alvo em uma praga de inseto resulta na redução ou remoção de um agente de polipeptídeo ou polinucleotídeo que é essencial para o desenvolvimento, crescimento ou outra função biológica da praga. Um polinucleotídeo selecionado pode exibir entre cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71; e o complemento reverso de qualquer uma das precedentes. Por exemplo, um polinucleotídeo selecionado pode exibir 79%; 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98.5%; cerca de 99%; cerca de 99.5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71 (por exemplo, SEQ ID N°^s:3-5 e 73); e o complemento reverso de qualquer uma das precedentes.

[00147] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microrganismo para inibir a expressão de um gene alvo pode compreender um único polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um polinucleotídeo nativo encontrado em uma ou mais espécies de praga de inseto alvo (por exemplo, uma espécie de praga de coleópteros e/ou hemíptera) ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade de tais polinucleotídeos

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63/157 especificamente complementares.

[00148] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um primeiro e um segundo polinucleotídeo separados por um espaçador. Um espaçador pode ser uma região que compreende qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação da estrutura secundária entre o primeiro e o segundo polinucleotídeos, quando isso for desejado. Em uma modalidade, o espaçador é parte de um polinucleotídeo codificador de senso ou antissenso para o mRNA. O espaçador pode compreender alternativamente qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de ser ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico. Em alguns exemplos, o espaçador pode ser um íntron (por exemplo, como o íntron ST-S1).

[00149] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender um polinucleotídeo que codifica uma ou mais moléculas diferentes de iRNA, em que cada uma das moléculas de iRNA diferentes compreende um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo, em que o primeiro e o segundo polinucleotídeos são complementares um com o outro. O primeiro e o segundo polinucleotídeos podem ser conectados dentro de uma molécula de RNA por um espaçador. O espaçador pode constituir parte do primeiro polinucleotídeo ou do segundo polinucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA que compreenda o primeiro e o segundo polinucleotídeos do nucleotídeo pode levar a formação de uma molécula de dsRNA, pelo pareamento de base intramolecular específico do primeiro e segundo polinucleotídeos do nucleotídeo. O primeiro polinucleotídeo ou o segundo polinucleotídeo podem ser substancialmente idênticos a um polinucleotídeo (por exemplo, um gene alvo ou um polinucleotídeo não codificador transcrito) nativo para uma praga de inseto (por exemplo, uma praga, coleóptera e/ou hemíptera), um derivado desse ou um polinuPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 73/390

64/157 cleotídeo complementar a ele.

[00150] Moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem fitas duplas de ribonucleotídeo polimerizados e podem incluir modificações no arcabouço de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. As modificações na estrutura do RNA podem ser designadas para permitir uma inibição específica. Em uma modalidade, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo, tal que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Esse processo enzimático pode utilizar uma enzima RNase III, tal como DICER em eucariotos., in vitro ou in vivo. Veja Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2. DICER ou enzimas RNase III funcionalmente equivalentes clivam fitas maiores de dsRNA e /ou moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais tem cerca de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por essas enzimas possuem projeções a 3' de 2 a 3 nucleotídeos, terminações 5' fosfato e 3' hidroxila. As moléculas de siRNA geradas pelas enzimas RNase III são desenoveladas e separadas em RNA de fita simples na célula. As moléculas de siRNA hibridizam especificamente com RNAs transcritos a partir de um gene-alvo e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradas por um mecanismo inerente de degradação celular de RNA. Esse processo pode resultar na degradação eficaz ou na remoção do RNA codificado pelo gene-alvo no organismo-alvo. O resultado é o silenciamento pós-transcricional do gene atingido. Em algumas modalidades, as moléculas de siRNA produzidas pelas enzimas RNase III endógenas a partir de moléculas de ácido nucleico heterólogo podem mediar eficientemente a regulação negativa de genes-alvo em pragas de insetos.

[00151] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que não ocorre naturalPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 74/390

65/157 mente que pode ser transcrito em uma molécula de RNA de fita simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através da hibridização intermolecular. Tais dsRNAs tipicamente se auto-montam e podem ser fornecidos na fonte de nutrição de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) para obter a inibição pós-transcricional de um gene alvo. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode compreender dois polinucleotídeos diferentes que não ocorrem naturalmente, cada um dos quais é especificamente complementar a um gene-alvo diferente de uma praga de inseto. Quando tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA, por exemplo, para uma praga de coleópteros e/ou hemíptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes-alvo diferentes na praga.

C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico [00152] Uma variedade de polinucleotídeos em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) pode ser usada como alvo para o desenho de moléculas de ácido nucleico, tais como iRNAs e moléculas de DNA que codificam iRNAs. A seleção de polinucleotídeos nativos não é, entretanto, um processo direto. Por exemplo, apenas um pequeno número de polinucleotídeos nativos em uma praga de coleópteros ou hemíptera serão alvos eficazes. Não pode ser predito com certeza se um polinucleotídeo nativo particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, alimentação e/ou sobrevida de uma praga de inseto. A grande maioria dos polinucleotídeos nativos de pragas coleópteras ou hemípteras, tais como ESTs isolados deles (por exemplo, os polinucleotídeos de pragas coleópteras listadas na Patente U.S. 7.612.194), não possui um efeito prejudicial sobre o crescimento e/ou a viabilidade da praga. Nem é previsível qual dos polinucleotídeos nativos que pode ter um efeito prejudicial sobre uma praga de inseto é capaz de ser usado em técnicas recombinantes para expressar moléPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 75/390

66/157 culas de ácido nucleico complementares a tais polinucleotídeos nativos em uma planta hospedeira e fornecer o efeito prejudicial sobre a praga depois da alimentação sem causar dano a planta hospedeira.

[00153] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira de um inseto (por exemplo, uma praga de coleópteros ou hemíptera) são selecionadas para atingir cDNAs que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais ao desenvolvimento da praga, tais como os polipeptídeos envolvidos em vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, metabolismo da energia, digestão, reconhecimento da planta hospedeira e semelhantes. Como aqui descrito, a ingestão das composições pelo organismo da praga-alvo, que contêm um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento dos quais é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo da praga-alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Um polinucleotídeo, DNA ou RNA, derivado de uma praga de inseto pode ser usado para construir células de planta protegidas contra a infestação pelas pragas. A planta hospedeira da praga de coleópteros e/ou hemíptera (por exemplo, Z. mays, G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter um ou mais polinucleotídeos derivados da praga de coleópteros e/ou hemíptera como fornecido aqui. O polinucleotídeo transformado no hospedeiro ode codificar um ou mais RNAs que formam a estrutura de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando assim o dsRNA disponível se/quando a praga formar um relacionamento nutricional com o hospedeiro transgênico. Isso pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga e finalmente na morte ou na inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

[00154] Em modalidades particulares, um gene que é atingido está

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67/157 essencialmente envolvido no crescimento e desenvolvimento de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Outros genes-alvo para uso na presente invenção podem inclui, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes na viabilidade da praga, movimentação, migração, crescimento, desenvolvimento, capacidade de infecção e estabelecimento de sítios de alimentação. Portanto, um gene alvo pode ser um gene nativo ou um fator de transcrição. Adicionalmente, um polinucleotídeo nativo da praga de inseto para uso na presente invenção também pode ser derivado de um gene homólogo (por exemplo, um ortólogo) de uma planta, vírus, bactéria ou inseto, cuja função é conhecida por aquele versado na técnica e cujo polinucleotídeo é especificamente hibridizável com um gene-alvo no genoma da praga alvo. Métodos para identificar um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeos conhecida pela hibridização são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00155] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para obter uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo para a produção de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA). Uma de tais modalidades compreende: (a) analisar um ou mais genes-alvo quanto a sua expressão, função e fenótipo depois da supressão mediada por gene de dsRNA em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera); (b) sondar uma biblioteca de cDNA ou gDN com uma sonda que compreende todo ou uma porção de um polinucleotídeo ou seu homólogo a partir de uma praga de inseto que apresente um fenótipo alterado (por exemplo, reduzido) de crescimento ou desenvolvimento em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que hibridize especificamente com a sonda; (d) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciar o fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido

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68/157 nucleico sequenciada compreenda todo ou uma porção substancial do RNA ou seu homólogo; e (f) sintetizar quimicamente toda ou uma porção substancial de um gene ou um siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA ou dsRNA.

[00156] Em modalidades adicionais, um método para a obtenção de um fragmento de ácido nucleico que compreenda um polinucleotídeo para a produção de uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) inclui: (a) sintetizar primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeos especificamente complementares a uma porção do polinucleotídeo nativo de uma praga de inseto-alvo (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero); e (b) amplificar um inserto de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando o primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porão substancial de uma molécula de siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, ou dsRNA.

[00157] Ácidos nucleicos podem ser isolados, amplificados ou produzidos por várias abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, um iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser obtida pela amplificação por PCR de um polinucleotídeo alvo (por exemplo, um gene-alvo ou um polinucleotídeo não codificador alvo transcrito) derivado de uma biblioteca de gDNA ou cDNA ou porções dessas. DNA ou RNA pode ser extraído de um organismo-alvo e bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir delas usando métodos conhecidos daqueles versados na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo alvo podem ser usadas como modelos para a transcrição in vitro para gerar RNA de senso e antissenso com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer uma de inúmeras técnicas (Veja, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nucleic

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Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), que incluem o uso de um sintetizador de DNA automatizado (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) modelo 392 ou 394 DNA/RNA Synthesizer), usando quíicas padronizadas, tais como a química da fosforoamidita. Veja, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S. 4.980.460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Químicas alternativas que resultam em grupos de arcabouços não naturais, tais como fosforotioato, fosforoamidato e semelhantes, também podem ser empregadas.

[00158] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente or aquele versado na técnica através de reações manuais ou automatizadas ou in vivo em uma células que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA . O RNA também pode ser produzido pela síntese orgânica total ou parcial e qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido pela síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, T3 RNA polimerase, T7 RNA polimerase e SP6 RNA polimerase). Construtos de expressão úteis para a clonagem e a expressão de polinucleotídeos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Publicação PCT Internacional No. WO97/32016; e Patentes U.S. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou pela síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura pela extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma

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70/157 combinação desses. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou pela síntese enzimática in vitro podem ser usadas sem ou com um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar as perdas devido ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para o armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sias para promover o anelamento e/ou a estabilização das fitas duplas da molécula de dsRNA.

[00159] Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma única fita de RNA autocomplementar ou a partir de duas fitas de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição de uma ou duas fitas de RNA in vivo ou uma RNA polimerase clonada pode ser usada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser direcionada pelo hospedeiro pela transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo celular do hospedeiro (por exemplo, pelo uso de um promotor específico para o tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, pelo uso de um promotor induzível que é responsivo à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou manipular a transcrição em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, pelo uso de um promotor específico para o estágio de desenvolvimento). As fitas de RNA que formam uma molécula de dsRNA, transcritas in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadeniladas e podem ou não ser capazes de serem traduzidas em um polipeptídeo pelo aparelho de tradução da célula.

D. Vetores Recombinantes e Transformação da Célula Hospedeira [00160] Em algumas modalidades, a invenção também fornece uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma

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71/157 célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula de planta), em que a molécula de DNA compreende um polinucleotídeo que, depois da expressão do RNA e ingestão pela praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero), obtém a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga. Portanto, algumas modalidades fornecem uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende um polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) em uma célula de planta para inibir a expressão de um gene-alvo em uma praga de inseto. A fim de iniciar ou intensificar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender um ou mais elementos reguladores, cujos elementos reguladores podem estar operativamente ligados ao polinucleotídeo capaz de ser expresso como um iRNA. Métodos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos e podem ser usados para expressar um polinucleotídeo da presente invenção. Veja, por exemplo, Publicação PCT Internacional N°. WO06/073727 e Publicação de Patente U.S. N°. 2005/0200878 AI).

[00161] Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender um polinucleotídeo que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinante podem codificar RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão dos genes-alvo endógenos em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) depois da ingestão. Em várias modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada, por exemplo, como uma estrutura em forma de hairpin ou de stem-loop.

[00162] Em algumas modalidades, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada pela transcrição a partir de um polinucleotídeo

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72/157 que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°^s:1 e 71; o complemento ou o complemento reverso de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71 (por exemplo, SEQ ID N°^s:3-5 e 73); o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero (por exemplo, BSB) que compreende a SEQ ID N°:73; o complemento ou o complemento reverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:73; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:73; and o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID N°:73.

[00163] Em algumas modalidades, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada pela transcrição de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado do grupo

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73/157 que consiste em SEQ ID N°^s:3-5 e 73; o complemento ou o complemento reverso de qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5 e 73; a um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; and o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71.

[00164] Em modalidades particulares, uma molécula de DNA recombinante que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA pode compreender uma região codificadora, em que pelo menos dois polinucleotídeos são arranjados tal que um polinucleotídeo está em uma orientação senso e o outro polinucleotídeo está em uma orientação antissenso, em relação a pelo menos um promotor, em que o polinucleotídeo de senso e o polinucleotídeos antissenso estão ligados ou conectados por um espaçador, por exemplo, com cerca de cinco (~5) a cerca de mil (~1000) nucleotídeos. O espaçador pode formar uma alça entre os polinucleotídeos de senso e antissenso. O polinucleotídeo de senso e o polinucleotídeos antissenso podem ser substancialmente homólogos a um gene-alvo (por exemplo, um gene gw que compreenda qualquer uma das SEQ ID N°^s: 1 e 71) ou um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dessas. Em algumas modalidades, entretanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA sem um espaçador. Em modalidades, um polinucleotídeo codificador de senso e o polinucleotídeo codificador antissenso podem ter extensões diferentes.

[00165] Polinucleotídeos identificados como possuindo um efeito deletério sobre uma praga de inseto ou um efeito protetor da planta com relação à praga podem ser prontamente incorporados nas moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais polinucleotídeos podem ser expressos como uma

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74/157 estrutura em hairpin com stem-loop tomando um primeiro segmento que corresponde a um polinucleotídeo do gene-alvo (por exemplo, um gene gw que compreende qualquer uma das SEQ ID N°: 1 e 71 e um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma dessas); ligar esse polinucleotídeo a um segundo segmento da região espaçadora que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando isso a um terceiro fragmento, em que pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal construto forma uma estrutura de alça e haste pelo pareamento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça compreende o segundo segmento. Veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e Publicação PCT Internacional Nos. WO94/01550 e WO98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de fita dupla tal como uma estrutura de stem-loop (por exemplo, hairpin), através da qual a produção de siRNA direcionada para um polinucleotídeo de uma praga de inseto nativo (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) é intensificada pela coexpressão de um fragmento do gene atingido, por exemplo, sobre um cassete adicional que pode ser expresso em planta, que leva a produção intensificada de siRNA ou reduz a metilação para evitar o silenciamento transcricional de gene do promotor de dsRNA hairpin. [00166] Algumas modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para obter níveis inibitórios em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) da expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetor único ou plasmídeos ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o

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DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Em adição, um vetor pode ser um vetor de expressão. Os ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para dirigir a expressão de um polinucleotídeo codificador ligado ou outro elemento de DNA. Vários vetores estão disponíveis para esse propósito e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira particular com a qual ele é compatível.

[00167] Para transmitir proteção contra uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos e fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo e especificamente hibridizável com um polinucleotídeo transcrito correspondente dentro de uma praga de inseto que pode causar dano à espécie de planta hospedeira. A praga pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita nas células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, pela ingestão das células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreende a molécula de iRNA. Portanto, em exemplos particulares, a expressão de um gene-alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro das pragas coleópteras e/ou hemípteras que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene-alvo em uma praga-alvo coleóptera e/ou hemíptera pode resultar na planta sendo protegida contra o ataque pela praga.

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76/157 [00168] A fim de possibilitar a liberação das moléculas de iRNA para uma praga de inseto em um relacionamento nutricional com uma célula de planta que tenha sido transformada com um ácido nucleico recombinante da invenção, a expressão (isto é, transcrição) das moléculas de iRNA na célula de planta é necessária. Portanto, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender um polinucleotídeo da invenção operativamente ligado a um ou mais elementos reguladores, tais como um elemento promotor heterólogo que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico vai ser amplificada e uma célula de planta em que a molécula de ácido nucleico vai ser expressa.

[00169] Promotores adequados para uso nas moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes que descrevem tais promotores incluem as Patentes U.S. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor de actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (promotor CaMV 35S); 6.433.252 (promotor L3 de oleosina do milho); 6.429.357 (promotor de actina 2 do arroz e do íntron 2 da actina do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz); 6.140.078 (promotores induzíveis pelo sal); 6.252.138 (promotores induzíveis pelos patógenos); 6.175.060 (promotores induzíveis pela deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor de gama-coixina); e Publicação de Patente U.S N°. 2009/757.089 (promotor de aldolase do cloroplasto do milho). Promotores adicionais incluem o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9) e o promotor de octopina sintase (OCS) (que são transportados sobre

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77/157 plasmídeos que induzem tumores de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovirus promoters tal como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2; promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); promotor de sucrose sintase (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); promotor do geme da proteína de ligação a/b da clorofila; CaMV 35S (Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV 35S (Patentes U.S. 6.051.753, e 5.378.619); um promotor PC1SV promoter (Patente U.S. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. 6.677.503); e o promotor AGRtu.nos (GenBank™ No. de Acesso V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00170] Em modalidades particulares, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem um promotor específico para o tecido, tal como um promotor específico para a raiz. Promotores específicos para a raiz direcionam a expressão de polinucleotídeos codificadores operativamente ligados exclusivamente ou preferencialmente no tecido da raiz. Exemplos de promotores específicos para a raiz são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; and Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo ou fragmento para o controle de uma praga de coleópteros de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos para a raiz, orientados em direções transcricionais opostas em relação ao polinucleotídeo ou fragmento e que são operáveis na célula de planta transgênica que subsequentemente pode formar moléculas de dsRNA, como descrito acima. As moléculas de iRNA exPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 87/390

78/157 pressas em tecidos de planta podem ser ingeridos por um inseto tal que a supressão da expressão do gene-alvo é obtida.

[00171] Elementos reguladores adicionais que podem ser, opcionalmente, operativamente ligados a um ácido nucleico incluem 5'UTRs localizadas entre um elemento promotor e um polinucleotídeo codificador que funciona como elemento líder da tradução. O elemento líder da tradução está presente no mRNA totalmente processado e ele pode afetar o processamento do transcrito primário e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de elementos líderes da tradução incluem as líderes da proteína de choque térmico do milho e da petúnia (Patente U.S. 5.362.865) líderes da proteína de revestimento de vírus da planta, líderes rubisco de planta e outros. Veja, por exemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. 5.659.,122); PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank™ No. de Acesso V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00172] Elementos reguladores adicionais que podem ser, opcionalmente, operativamente ligados a um ácido nucleico também incluem elementos 3' não traduzidos, regiões 3' de terminação da transcrição ou regiões de poliadenilação. Esses são elementos genéticos localizados a jusante do polinucleotídeo e incluem polinucleotídeos que fornecem um sinal de poliadenilação e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou o processamento do mRNA. O sinal de poliadenilação funciona nas plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do precursor do mRNA. O elemento de poliadenilação pode ser derivado de uma variedade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região 3' de terminação da transcrição é a região 3' de nopalina sintase (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo

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79/157 do uso de diferentes regiões 3' não traduzidas é fornecido em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um dos genes RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank™ No. de Acesso E01312).

[00173] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada que compreende pelo menos um dos elementos reguladores acima descritos operativamente ligados a um ou mais polinucleotídeos da presente invenção. Quando expressos, o um ou mais polinucleotídeos resultam em uma ou mais moléculas de iRNA que compreendem um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero). Assim o(s) polinucleotídeo(s) pode(m) compreender um segmento que codifica todo ou parte de um polirribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA de uma praga de inseto coleóptero e/ou hemíptero e pode compreender repetições invertidas de todo ou parte de um transcrito da praga atingida. Um vetor de transformação de planta pode conter polinucleotídeos especificamente complementares a mais do que um polinucleotídeo alvo, possibilitando assim a produção de mais do que um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes nas células de uma ou mais populações ou espécies de pragas de insetos-alvos. Os segmentos de polinucleotídeos especificamente complementares aos polinucleotídeos presentes em diferentes fenes podem ser combinados em uma única molécula de compósito de ácido nucleico para a expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por um espaçador.

[00174] Em outras modalidades, um plasmídeo da presente invenção que já contém pelo menos um polinucleotídeo da invenção, pode

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80/157 ser modificado pela inserção sequencial de polinucleotídeo(s) adicional(is) no mesmo plasmídeo, em que os polinucleotídeos adicionais são operativamente ligados aos mesmos elementos reguladores como o pelo menos um polinucleotídeo original. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser designada para a inibição de múltiplos genes-alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero), o que pode intensificar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas de inseto, o que pode ampliar a gama de pragas contra as quais o(s) agente(s) é/são eficaz/eficazes. Quando múltiplos genes são atingidos para a supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento e DNA policistrônico pode ser manipulado.

[00175] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar plantas ou células de planta que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência ao biocida, resistência ao antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.) ou tolerância ao herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a: um gene neo que codifica a resistência à canamicina e que pode ser selecionado para uso com canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica a resistência ao bialofós; um gene mutante de EPSP sintase que codifica a tolerância ao glifosato; um gene de nitrlase que confere resistência ao bromoxinil; um gene de acetolatato sintase (ALS) mutante que confere tolerância à imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene DHFR resistente

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81/157 ao metotrexate. Múltiplos marcadores selecionáveis que estão disponíveis conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexate, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina e semelhantes. Exemplos de tais marcadores selecionáveis estão ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[00176] Um vetor ou molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode incluir também um marcador que pode ser rastreado. Marcadores que podem ser rastreados podem ser usados para monitorar a expressão. Marcadores que podem ser rastreados exemplificadores incluem um gene de β-glicuronidase ou uidA (GUS), que codifica uma enzima para que vários substratos cromogênicos sejam conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene do lócus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta et al. (1988) Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. In 18^th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); que codifica uma enzima para vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa em melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma α-galactosidase.

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82/157 [00177] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinante, como descritas, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e a expressão de ácidos nucleicos heterólogo em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem suscetibilidade reduzida às pragas de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero). Os vetores de transformação de planta podem ser preparados, por exemplo, pela inserção de moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de iRNA em vetores de transformação de planta e introduzindo essas nas plantas.

[00178] Métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como pela transformação de protoplastos (Veja, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184), pela dessecação/inibição da absorção de DNA (Veja, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), pela eletroporação (Veja, por exemplo, Patente U.S. 5.384.253), pela agitação com fibras de carbeto de silício (Veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), pela transformação mediada por Agrobacterium (Veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; e 6.384.301) e pela aceleração de partículas cobertas com DNA (Veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865), etc. As técnicas que são particularmente úteis para a transformação do milho estão descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616; e Publicação PCT Internacional WO95/06722. Através da aplicação de técnicas tais como essas, as células de, virtualmente, qualquer espécie pode ser estavelmente transformada. Em algumas modalidades, o DNA transformante é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para

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83/157 produzir uma planta transgênica, por exemplo, que compreende um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00179] O método mais amplamente utilizado para introduzir um vetor de expressão nas plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para a planta que transformam geneticamente as células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (que induzem tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região do T-DNA é limitada pelas repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes que induzem tumor são deletados e as funções da região Vir são utilizadas para transferir o DNA estranho limitado pelos elementos de elementos de fronteira do T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente de células e plantas transgênicas e um sítio de clonagem múltipla para inserir polinucleotídeos para transferir tal ácido nucleico que codifica um dsRNA.

[00180] Em modalidades particulares, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Veja por exemplo, as Patentes U.S. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e a Patente Europeia N°. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia N°. EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos

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84/157 precedentes. Outras bactérias, tais como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente, podem ser modificados para mediar a transferência de gene para inúmeras plantas diversas. Essas bactérias simbióticas associadas com planta podem ser tornadas competentes para a transferência de gene pela aquisição de ambos, um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário adequado. [00181] Depois de fornecer um DNA exógeno para as células receptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para cultura e regeneração de planta posteriores. A fim de aperfeiçoar a habilidade para identificar as células transformadas, pode ser desejável empregar um gene marcador selecionável ou que pode ser rastreado, como previamente descrito, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é usado, as células transformadas são identificadas dentro de uma população de células potencialmente transformadas pela exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde uma marcador que pode ser rastreado é usado, as células podem ser rastreadas quanto ao traço do gene marcador.

[00182] Células que sobrevivem à exposição ao agente de seleção ou células que tenham sido classificadas como positivas em um ensaio de rastreamento, podem ser cultivadas em um meio que suporte a regeneração das plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado pela inclusão de substâncias adicionais, tais como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores do crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniciar os esforços de regeneração da planta ou depois de rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), depois transferido para um meio propício para a formação de

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85/157 raiz. As culturas são transferidas periodicamente até que a formação de brotos suficientes tenha ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, eles são transferidos para um meio propício para a formação de raiz. Uma vez que raízes suficientes estejam formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para o crescimento e maturação posteriores.

[00183] Para confirmar a presença da molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, um DNA que codifique uma ou mais moléculas de RNA que inibem a expressão do gene alvo em uma praga de coleópteros e/ou hemíptera) nas plantas regeneradas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de biologia molecular, tais como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou western blots) ou pela função enzimática; ensaios com partes de plantas tais como ensaios com folha ou raiz; e a análise do fenótipo da planta regenerada completa.

[00184] Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, pela amplificação por PCR, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para a molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem por PCR é compreendida incluir, mas não está limitada a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a amplificação de gDNA derivado de tecido de calo de planta hospedeira isolado predito conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida pela clonagem padronizada e análise de sequência dos produtos de amplificação por PCR. Métodos para a genotipagem por PCR são bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao gDNA derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays) ou tipo de tecido, incluindo culturas celulares.

[00185] Uma planta transgênica formada usando métodos de

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86/157 transformação dependentes de Agrobacterium contém um único DNA recombinante inserido em um cromossomo. O polinucleotídeo do único DNA recombinante é referido como um evento transgênico ou evento de integração. Tais plantas transgênicas são heterozigotas para o polinucleotídeo exógeno inserido. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota com relação a um transgene pode ser obtida pela reprodução sexuada (autofecundação) em uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene exógeno para si mesma, por exemplo, uma planta T₀ para produzir uma semente T₁. Um quarto das sementes T1 produzidas será homozigota com relação ao transgene. As sementes T₁ germinadas resultam em plantas que podem ser testadas quanto a heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade). [00186] Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula de planta, que possuem um efeito inibitório sobre uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero). As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de múltiplos ácidos nucleicos introduzidos em diferentes eventos de transformação ou a partir de um único ácido nucleico introduzido em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressas sob o controle de múltiplos promotores. Moléculas de iRNA isoladas que podem ser expressas compreendem múltiplos polinucleotídeos que são homólogos com loci diferentes dentro de uma ou mais pragas de insetos (por exemplo, os loci definidos pelas SEQ ID N°^s 1 e 71), ambos em diferentes populações da mesma espécie de praga de inseto ou diferentes espécies das pragas de inseto.

[00187] Em adição à transformação direta de uma planta com uma

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87/157 molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas pelo cruzamento de uma primeira planta que possui pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta que carece de tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que é passível de transformação para produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introgredir o polinucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem de planta.

[00188] Em alguns aspectos, as sementes e produtos básicos produzidos pelas plantas transgênicas derivadas das células de planta transformadas estão incluídos, em que as sementes ou produtos básicos compreendem uma quantidade detectável de um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos básicos podem ser produzidos , por exemplo, pela obtenção de plantas transgênicas e preparação de alimentos ou ração a partir deles. Os produtos básicos que compreendem um ou mais dos polinucleotídeos da invenção incluem, por exemplo e sem limitação: farelos, óleos, grãos inteiros ou triturados ou sementes de uma planta e qualquer produto alimentício que compreenda qualquer farelo, óleo ou grão inteiro ou triturado de uma planta ou semente recombinante que compreenda um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção. A detecção de um ou mais dos polinucleotídeos da invenção em um ou mais material bruto ou produto básico é, de fato, uma evidencia de que o material bruto ou produto básico é produzido por uma planta transgênica designada para expressar uma ou mais moléculas de iRNA da invenção com o propósito de controlar pragas de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero).

[00189] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção

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88/157 também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico em seu genoma, incluindo sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA que atinge um lócus em uma praga de inseto coleóptero e/ou hemíptero diferente daquele definido pela SEQ ID N°:1 e SEQ ID N°:71, tal como, por exemplo, um ou mais loci selecionados do grupo que consiste em Caf1-180 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2013/0091600), RPA70 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2013/0097730), alvos de RNAi de ROP, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 14/577.811, alvos de RNAi de RNA polimerase I1, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/133.214, alvos de RNAi de RNA polimerase II140, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 14/577.854, alvos de RNAi de RNA polimerase II215, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/133.202, alvos de RNAi de RNA polimerase II33, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/133.210), ncm (Pedido de Patente U.S. N°. 62/095487), Dre4 (Pedido de Patente U.S. N°. 14/705,807), alvos de RNAi do fator de alongamento da transcrição spt5, como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 62/168613), e uma histona chaperona spt6 (Pedido de Patente U.S. N°. 62/168606); um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA que atinge um gene em um organismo diferente da praga coleoptera e/ou hemiptera (por exemplo, um nematódeo parasita de planta); um gene que codifique uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo PIP-1 e um polipeptídeo AflP); um gene de tolerância ao herbicida (por exemplo, um gene que fornece

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89/157 tolerância ao glifosato); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica tal como o rendimento aumentado, metabolismo alterado de ácido graxo ou restauração da esterilidade citoplasmática masculina. Em modalidades particulares, os polinucleotídeos que codificam as moléculas de iRNA da invenção podem ser combinados com outros traços de controle de inseto e doença em uma planta para obter traços desejados para o controle intensificado da doença da planta e dano por inseto. Combinar traços de controle de inseto que empregam modos de ação distintos pode fornecer plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior sobre as plantas que abrigam um único traço de controle, por exemplo, devido a probabilidade reduzida de que a resistência ao traço se desenvolverá no campo. V. Supressão do Gene Alvo em uma Praga de Inseto

Visão Geral [00190] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo coleóptero e/ou hemípteros) pode ser fornecida a uma praga de inseto, em que a molécula de ácido nucleico leve ao silenciamento do gene mediado por RNAi na praga. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA, por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser fornecida para uma praga de coleópteros e/ou hemíptera. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de inseto pode ser fornecida a uma praga pelo contato da molécula de ácido nucleico com a praga. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos pode ser fornecida em um substrato alimentício da praga, por exemplo, uma composição nutricional. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos pode ser fornecida através da ingestão de um material de planta que compreenda a molécula de ácido nucleico

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90/157 que é ingerida pela praga. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente no material de planta através da expressão de um ácido nucleico recombinante introduzido no material de planta, por exemplo, pela transformação de uma célula de planta com um vetor que compreende o ácido nucleico recombinante e a regeneração de um material de planta ou da planta completa a partir da célula de planta transformada.

B. Supressão do Gene Alvo mediada por RNAi [00191] Em algumas modalidades, a invenção fornece moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que podem ser designadas para atingir polinucleotídeos nativos essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleópteros (por exemplo, WCR, NCR e SCR) ou hemíptera (por exemplo, BSB)), por exemplo, pela designação de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos uma fita que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar ao polinucleotídeo alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim designada pode ser idêntica àquela do polinucleotídeo alvo ou pode incorporar não pareamentos que não evitam a hibridização específica entre a molécula de iRNA e seu polinucleotídeo alvo.

[00192] As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para a supressão de gene em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero), reduzindo dessa maneira o nível ou a incidência do dano causado pela praga sobre a planta (por exemplo, uma planta transformada protegida que compreende uma molécula de iRNA). Como usado aqui, o termo supressão de gene refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para a redução dos níveis de proteína produzida como resultados da transcrição do gene em mRNA e subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução da expressão de proteína de um gene ou de um polinucleotídeo codificador

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91/157 incluindo a inibição pós-transcricional da expressão e supressão da transcrição. A inibição pós-transcricional é mediada pela homologia específica entre todo ou parte de um mRNA transcrito a partir de um gene atingido pela supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para a supressão. Adicionalmente, a inibição pós-transcricional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mrNA disponível na célula para a ligação pelos ribossomas.

[00193] Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de fita dupla gerada pela atividade de DICER pode ser separada em dois siRNAs de fita simples; a fita de passagem e a fita guia. A fita de passagem pode ser degradada e a fita guia pode ser incorporada em RISC. A inibição pós transcricional ocorre pela hibridização específica da fita guia com um polinucleotídeo especificamente complementar de uma molécula de mRNA e subsequente clivagem pela enzima, Argonauta (componente catalítico do complexo de RISC).

[00194] Em modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles versados na técnica compreenderão que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis durante a preparação e a duração da etapa de fornecimento da molécula de iRNA a uma célula do que as moléculas de RNA de fita simples e são também tipicamente mais estáveis em uma célula. Portanto, embora as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em algumas modalidades, a molécula de dsRNA pode ser escolhida devido a sua estabilidade.

[00195] Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico que é fornecida compreende um polinucleotídeo, cujo polinucleotídeo pode ser expresso in vitro para produzir uma molécula de iRNA

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92/157 que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada pelo polinucleotídeo dentro do genoma de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero). Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de stem-loop. Depois que um inseto contata a molécula de iRNA transcrita in vitro, a inibição pós-transcricional do gene alvo na praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) pode ocorrer.

[00196] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos) de um polinucleotídeo é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:79; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:79; SEQ ID N°:83; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:83; um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende SEQ ID N°:1; o complemento ou o complemento reverso de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Diabrotica que compreende SEQ ID N°:1; um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Euschistus heros que compreende SEQ ID N°:71; e o complemento ou o complemento reverso de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de E. heros que compreende SEQ ID N°:71. Moléculas de ácido nucleico que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos polinucleotídeos precedentes incluem, por exemplo e sem limitação, fragmentos que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°^s:80-82 e 84.

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Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80% idêntica (por exemplo, 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer uma das precedentes pode ser usada. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico que pode ser expressa hibridiza especificamente com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). [00197] Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA é fornecida em uma composição nutricional referida aqui como uma isca de RNA. Uma isca de RNA pode ser formada em modalidades particulares quando uma molécula de iRNA (por exemplo, um dsRNA) é misturado com um alimento do inseto alvo, um atraente do inseto ou ambos. Quando o inseto come a isca de RNAi, o inseto pode consumir a molécula de iRNA. A isca de RNAi pode ser, por exemplo e sem limitação, um grânulo, um gel, pó fluxível, líquido ou sólido. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser incorporada em uma formulação de isca tal como aquela descrita na Patente U.S. N°. 8.530.440, cujo conteúdo está incorporado aqui em sua totalidade por referência. Em alguns exemplos, uma isca de RNAi é colocada no ou em volta do ambiente de uma praga de inseto, tal que, por exemplo, a praga pode entrar em contato com ou ser atraída pela isca de RNAi. [00198] É uma característica importante de algumas modalidades que o sistema de inibição pós-transcricional de RNAi seja capaz de tolerar as variações de sequência entre os genes-alvo que poderiam ser esperadas serem devidas a mutação genética, polimorfismo da linhagem ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucleico introPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 103/390

94/157 duzida pode não precisar ser absolutamente homóloga ao produto de transcrição primária ou a um mRNA totalmente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não precisar ter o comprimento completo em relação a um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado do gene alvo. [00199] A inibição do gene alvo usando a tecnologia do iRNA da presente invenção é específica para a sequência; isto é, polinucleotídeos substancialmente homólogos às moléculas de iRNA são atingidos pela inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é idêntica àquela de uma porção de um gene alvo, pode ser usada para a inibição. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma ou mais inserções, deleções e/ou mutações pontuais em relação a um polinucleotídeo alvo pode ser usada. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene alvo podem partilhar, por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 100%, e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região do dúplice de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de um transcrito do gene alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, menos do que um polinucleotídeo de comprimento completo que exibe uma homologia maior compensa um polinucleotídeo mais longo, menos homólogo. O compriPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 104/390

95/157 mento do polinucleotídeo de uma região do dúplice de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um transcrito do gene alvo pode ter pelo menos 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo maior do que 20 a 100 nucleotídeos pode ser usado. Em modalidades particulares, um polinucleotídeo maior do que 200 a 300 nucleotídeos pode ser usado. Em modalidades particulares, um polinucleotídeo maior do que 500 a 1000 nucleotídeos pode ser usado, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00200] Em certas modalidades, a expressão de um gene alvo em uma praga de inseto (coleóptero ou hemíptero) pode ser inibida em pelo menos 10%, pelo menos 33%, pelo menos 50% ou pelo menos 80% dentro de uma célula de uma praga, tal que a inibição significativa ocorra. Inibição significativa refere-se à inibição acima do limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo cessação do crescimento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento, indução da mortalidade, etc.) ou uma diminuição detectável de um iRNA e/ou produto de gene da invenção que corresponde ao gene alvo a ser inibido. Embora em certas modalidades da invenção, a inibição ocorra em substancialmente todas as células da praga, em outras modalidades a inibição ocorre apenas em um subgrupo de células que expressam o gene alvo.

[00201] Em algumas modalidades, a supressão transcricional é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA que exibe identidade de sequência substancial com um promotor de DNA ou seu complemento para efetuar o que é referido como trans supressão do promotor. A supressão do gene pode ser eficaz contra os genes-alvo em uma praga de inseto que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, pela ingestão ou contato do material de planta que contém as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA

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96/157 para uso na trans supressão do promotor podem ser especificamente designadas para inibir ou suprimir a expressão de um ou mais polinucleotídeos homólogos ou complementares nas células da praga de inseto. A supressão de gene pós-transcricional pelo RNA orientado antissenso ou senso para regular a expressão em células de planta está descrita nas Patentes U.S. 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184; e 5.231.020.

C. Expressão das Moléculas de iRNA Fornecidas a uma Praga de Inseto [00202] A expressão de moléculas de iRNA para a inibição de gene mediada por RNAi em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) pode ser realizada em qualquer um de vários formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser fornecidas a uma praga de inseto, por exemplo, pelo contato das moléculas de iRNA com a praga ou fazendo com que a praga ingira ou internalize de outra maneira as moléculas de iRNA. Algumas modalidades incluem plantas hospedeiras transformadas de uma praga de coleópteros e/ou hemíptera, células de planta transformada e a progênie de plantas transformadas. As células de planta transformada e as plantas transformadas podem ser manipuladas para expressar uma ou mais moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo para fornecer um efeito protetor contra a praga. Portanto, quando uma planta ou célula de planta transgênica é consumida por uma praga de inseto durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidos em uma ampla variedade de microrganismos hospedeiros procarióticos e eucarióticos para produzir moléculas de iRNA. O termo microrganismo inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos. [00203] A modulação da expressão de um gene pode incluir a suPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 106/390

97/157 pressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para a supressão da expressão de gene de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) compreende fornecer no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade supressora de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA formada depois da transcrição de um polinucleotídeo como aqui descrito, pelo menos um segmento do qual é complementar a um mRNA dentro das células da praga de inseto. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA, ingerida pela praga de inseto pode ser pelo menos entre cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA de gw, por exemplo,, que compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°^s:1, 3-5, 71 e 73. Moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitadas a polinucleotídeos que não ocorrem naturalmente e construtos de DNA recombinante para fornecer moléculas de dsRNA são, portanto, fornecidos, que suprimem ou inibem a expressão de um polipeptídeo codificador endógeno ou de um polinucleotídeo codificador alvo em uma praga de inseto quando introduzidas nele.

[00204] Modalidades particulares fornecem um sistema de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes-alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) e controle de uma população de praga de planta. Em algumas modalidades, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula de planta hospedeira transgênica ou dos conteúdos da célula hospedeira que compreende moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nessas e em modalidades adicionais, uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênica

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98/157 que é criada contém um construto de DNA recombinante que fornece uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células de planta transgênicas e plantas transgênicas que compreendem os ácidos nucleicos que codificam uma molécula de iRNA em particular podem ser produzidas pelo emprego de tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula de planta ou planta e para gerar a célula de planta transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00205] Para transmitir proteção contra uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) para uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode ser compreendida em parte por um polinucleotídeo que é idêntico a um polinucleotídeo correspondente transcrito a partir de um DNA dentro de uma praga de inseto de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro da praga é suprimida pela molécula de dsRNA e a supressão da expressão do gene alvo na praga resulta na proteção da planta transgênica que é protegida contra a praga. Os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA têm sido mostrados serem aplicáveis a uma variedade de genes expressos nas pragas incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutenção; faPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 108/390

99/157 tores de transcrição; genes relacionados a muda; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.

[00206] Para a transcrição de um transgene in vivo ou um construto de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor, intensificador, silenciador e sinal de poliadenilação) pode ser usada em algumas modalidades para transcrever a fita de RNA (ou fitas). Portanto, em algumas modalidades, como descrito acima, um polinucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operativamente ligado a um ou mais elementos promotores funcionais em uma célula de planta hospedeira. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. O polinucleotídeo da presente invenção, sob o controle de um elemento promotor operativamente ligado, pode ainda ser flanqueado pelos elementos adicionais que afetam vantajosamente sua transcrição e/ou a estabilidade do transcrito resultante. Tais elementos podem estar localizados a montante do promotor operativamente ligado, a jusante da extremidade 3' do construto de expressão e podem ocorrer a montante do promotor e a jusante da extremidade 3' do construto de expressão.

[00207] Algumas modalidades fornecem métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causado por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) que se alimenta da planta, em que o método compreende fornecer na planta hospedeira, uma célula de planta transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a molécula de ácido nucleico funciona depois de ser absorvida pelas pragas para inibir a expressão de um polinucleotídeo alvo dentro das pragas, reduzindo dessa maneira o dano à planta hospedeira causado pelas pragas. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA. Nessas e em moPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 109/390

100/157 dalidades adicionais, as moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemíptera. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico consistem em um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto.

[00208] Em algumas modalidades, um método para aumentar o rendimento de uma cultura de milho é fornecido, em que o método compreende introduzir em uma planta de milho pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivar a planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA que compreende o ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA que compreende o ácido nucleico inibe o dano causado pela praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) e/ou seu crescimento. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a molécula de ácido nucleico compreende as moléculas de dsRNA que compreendem, cada uma, mais do um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, as moléculas de ácido nucleico compreendem um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemíptera.

[00209] Em algumas modalidades, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) é fornecido, o método compreendendo: transformar uma célula de planta com um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de iRNA da inPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 110/390

101/157 venção, em que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor e um elemento de terminação da transcrição; cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta que inclui uma pluralidade de células de planta transformadas; selecionar as células de planta transformadas que têm o polinucleotídeo integrado em seus genomas; rastrear as células de planta transformada para expressão de uma molécula de iRNA codificada pelo polinucleotídeo integrado; selecionar uma célula de planta transgênica que expresse a molécula de iRNA; e alimentar uma praga de inseto com a célula de planta transgênica selecionada. As plantas também podem ser regeneradas a partir de células de planta transformada que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrado. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) as moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, as moléculas de ácido nucleico compreendem um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de coleópteros e/ou hemíptera.

[00210] Moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho) como um produto de expressão de um gene recombinante incorporado em um genoma das células da planta ou incorporadas como um revestimento ou tratamento de semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula de planta que compreende um gene recombinante é considerada ser um evento transgênico. Também estão incluídos nas modalidades da invenção sistemas de liberação para a liberação de

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102/157 moléculas de iRNA para uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero). Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma praga. Métodos para a introdução podem incluir a misturação direta do iRNA com o tecido de planta de um hospedeiro de pragas de inseto, assim como a aplicação de composições que compreendem moléculas de iRNA da invenção ao tecido da planta hospedeira. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a superfície de uma planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microrganismo e o microrganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta ou introduzido em uma raiz ou caule por meios físicos tais como injeção. Como discutido acima, uma planta transgênica também pode ser geneticamente manipulada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar a praga de inseto conhecida por infestar a planta. As moléculas de iRNA produzidas pela síntese química ou enzimática também podem ser formuladas de uma maneira consistente com as práticas agrícolas comuns e usadas como produtos para pulverização ou iscas para controlar o dano da planta de uma praga de inseto. As formulações podem incluir adesivos e umectantes apropriados necessários para a cobertura foliar eficiente, assim como protetores UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) do dano por UV. Tais aditivos são comumente usados na indústria de bioinseticidas e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticida pulverizáveis (com base biológica ou de outra maneira) para intensificar a proteção da planta contra as pragas.

[00211] Todas as referências, incluindo as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui estão incorporados por referência na medida em que não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos

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103/157 dessa descrição e estão assim incorporados na mesma extensão como se cada referência estivesse individualmente e especialmente indicada para ser incorporada por referência e estivesse descrita em sua totalidade. As referências discutidas aqui são fornecidas apenas para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser considerado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior. [00212] Os EXEMPLOS a seguir são fornecidos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Esses EXEMPLOS não devem ser considerados limitantes da descrição das características ou aspectos particulares descritos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Materiais e Métodos

Preparação da amostra e bioensaios:

[00213] Várias moléculas de dsRNA (incluindo aquelas que correspondem a gw-1 reg-1 (SEQ ID N°:3), gw-1 v1 (SEQ ID N°:4) e gw-1 v2 (SEQ ID N°:5) foram sintetizadas e purificadas usando o kit MEGASCRIPT® T7 RNAi (LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA) ou o Kit T7 Quick High Yield RNA Synthesis (NEW ENGLAND BIOLABS, Whitby, Ontario). As moléculas de dsRNA purificado foram preparadas no tampão TE e todos os bioensaios continham um tratamento de controle que consiste nesse tampão que serviu como controle de fundo para a mortalidade ou inibição do crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00214] As amostras foram testadas quanto a atividade do inseto em bioensaios conduzidos com larvas de inseto recém-eclodidas em dieta artificial para inseto. Os ovos de WCR foram obtidos de CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

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104/157 [00215] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 poços especificamente desenhadas para bioensaios com insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada poço continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta artificial designada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL de amostra de dsRNA foi liberada por pipeta sobre a superfície da dieta de cada poço (40 pL/cm²). As concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro (ng/cm²) de área superficial (1,5 m²) no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em uma capela até que o líquido sobre a superfície da dieta evaporasse ou fossem absorvidas na dieta.

[00216] Dentro de algumas horas da eclosão, larvas individuais foram removidas com um pincel de pelo de camelo umedecido e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por poço). Os poços infestados das bandejas de plástico de 128 poços foram então fechadas com folhas adesivas de plástico claro e ventiladas para permitir a troca de gás. Bandejas de bioensaios foram mantidas sob condições ambientais controladas (28°C, ~40% de Umidade Relativa, 18:8 (Claro:Escuro)) por 9 dias, depois de cujo tempo o número total de insetos expostos para cada amostra, o número de insetos mortos e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados. O percentual médio de mortalidade e a média da inibição do crescimento foram calculados para cada tratamento. A inibição do crescimento (GI) foi calculada como a seguir:

GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)], onde TWIT é o Peso Total de Insetos vivos no Tratamento;

TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento;

TWIBC é o Peso Total de Insetos vivos no Controle de

Fundo (Controle com Tampão); e

TNIBC é o Número Total de Insetos no Controle de Fundo

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105/157 (controle com tampão) [00217] A análise estatística foi feita usando o programa JMP™ (SAS, Cary, NC).

[00218] A LC₅₀ (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% dos insetos de teste são mortos. A GI₅₀ (Inibição do Crescimento) é definida como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio visto nas amostras do Controle de Fundo.

[00219] Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade surpreendente e inesperada e inibição do crescimento das larvas da lagarta da raiz do milho.

EXEMPLO 2: Identificação de Candidatos a Genes-alvo [00220] Insetos de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) em múltiplos estágios de desenvolvimento foram selecionados para a análise agrupada do transcriptoma para fornecer as sequências de candidatos a genes-alvo para controle pela tecnologia de proteção com RNAi contra inseto em planta transgênica.

[00221] Em uma exemplificação, o RNA total foi isolado entre cerca de 0,9 g de larvas de WCR no primeiro instar; (4 a 5 dias pós-eclosão; mantidas a 16°C) e purificado usando o seguinte método baseado em fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH).

[00222] As larvas foram homogeneizadas em temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT^® até que uma suspensão homogênea fosse obtida. Depois de 5 min de incubação em temperatura ambiente, o homogenato foi vertido em tubos de microcentrífugação de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos. Depois de permitir que a extração depositasse em temperatura

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106/157 ambiente por 10 min, as fases foram separadas pela centrifugação a 12.000 x g a 4°C. A fase superior (que compreende c erca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo estéril de 1,5 mL e um volume igual de isopropanol em temperatura ambiente foi adicionado. Depois da incubação em temperatura ambiente por 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada por 8 min a 12.000 x g (4°C o u 25°C).

[00223] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e o pélete de RNA foi lavado duas vezes no misturador de vórtice com etanol 75%, com recuperação pela centrifugação por 5 min a 7500 xg (4°C ou 25°C) depois de cada lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o pélete foi deixado secar no ar por 3 a 5 min e então foi dissolvido em água estéril sem nucleasse. A concentração de RNA foi determinado pela medida da absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica entre cerca de 0,9 gm de larvas rendeu mais de 1 mg de RNA total, com uma proporção de A₂₆₀/A₂₈₀ de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80°C até o processamento p osterior.

[00224] A qualidade do RNA foi determinada pela corrida de uma alíquota através de um gel de agarose a 1%. A solução de gel de agarose foi feita usando 10x tampão TAE autoclavado (Tris acetato EDTA); concentração de 1x de tris-acetato a 0,04M. EDTA a 1 mM (sal de sódio de ácido etilenodiamina tetra-acético), pH 8,0) diluída com DEPC (pirocarbonato de dietila) em água tratada em um recipiente autoclavado. 1 x TAE foi usado como o tampão de corrida. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente para a formação de poços foram limpos com RNaseAway™ (INVITROGEN INC., Carlsbad, CA). Dois pL de amostra de RNA foram misturados com 8 pL de tampão TE (10 mM Tris HCl pH 7,0; 1 mM EDTA) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® N°. de Catálogo 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70°C por 3 min, resfriada para a temperatura ambiente e 5 pL (contendo 1 pg a 2 pg de RNA)

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107/157 foram carregados por poço. Marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram corridos simultaneamente em poços separados para a comparação do tamanho molecular. O gel foi corrido a 60 volts por duas horas.

[00225] Uma biblioteca de cDNA normalizado foi preparada a partir do RNA total de larva por um prestador de serviços comerciais (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), usando uma iniciação aleatória. A biblioteca de cDNA de larva normalizada foi sequenciada em escala de 1/2 placa pela química com a série GS FLX 454 Titanium™ em EUROFINS MWG Operon, o que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 pb. 350.000 leituras foram montadas em mais de 50.000 contigs. Ambas as leituras não montadas e os contigs foram convertidos em bancos de dados de BLASTable usando o programa disponível para o público, FORMATDB (disponibilizado por NCBI).

[00226] O RNA total e as bibliotecas de cDNA normalizado foram similarmente preparados a partir de materiais coletados em outros estágios de desenvolvimento de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupado para o rastreamento do gene alvo foi construída pela combinação dos membros de uma biblioteca de cDNA que representam vários estágios de desenvolvimento.

[00227] Os candidatos a genes para serem atingidos pelo RNAi foram admitidos serem essenciais para a sobrevida e o crescimento de pragas de inseto. Homólogos do gene alvo selecionado foram identificados no banco de dados da sequência do transcriptoma como descrito abaixo. As sequências de comprimento completo ou parciais dos genes-alvo foram amplificadas por PCR para preparar os modelos para a produção de RNA de fita dupla (dsRNA).

[00228] Pesquisas com TBLASTN usando sequências codificadoras da proteína candidata foram corridas contra os banco de dados

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BLASTable que contêm as leituras da sequência de Diabrotica não montada ou os contigs montados. Acertos significativos para uma sequência de Diabrotica (definidos como melhores do que e^-20 para homologias de contigs e melhores do que e^-10 para homologias de leituras de sequência não montada) foram confirmadas usando BLASTX contra a base de dados não redundante de NCBI. Os resultados dessa pesquisa por BLASTX confirmaram que as sequências de candidato a gene homólogo de Diabrotica identificadas na pesquisa TBLASTN compreenderam de fato genes de Diabrotica ou foram o melhor acerto para a sequência de candidato a gene de não Diabrotica presentes nas sequências de Diabrotica. Em alguns casos ficou claro que alguns dos contigs de Diabrotica ou leituras de sequências não montadas selecionadas pela homologia a um gene candidato superposto de não Diabrotica e que a montagem dos contigs falhou em unir essas superposições. Nesses casos, Sequencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, MI) foi usado para montar as sequências em contigs mais longos.

[00229] Um candidato a gene alvo que codifica Diabrotica gw (SEQ ID N°:1) foi identificado como um gene que pode levar a mortalidade de uma praga de coleópteros, inibição do crescimento, inibição do desenvolvimento e/ou inibição da alimentação em WCR.

[00230] Gawky (gw) é uma proteína que está envolvida no silenciamento de mRNA através de da repressão traducional de miRNA. [00231] A sequência de SEQ ID N° 1 é nova. A sequência não é fornecida em bancos de dados públicos e não está descrita na Publicação de Patente Internacional PCT N°. WO/2011/025860; Pedido de Patente U.S. N°. 20070124836; Pedido de Patente U.S. N°. 20090306189; Pedido de Patente U.S. N°. US20070050860; Pedido de Patente U.S. N°. 20100192265; Patente U.S. 7.612.194; ou Pedido de Patente U.S. N°. 2013192256. WCR gw (SEQ ID N°:1) está algumas

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109/157 vezes relacionada com um fragmento de sequência de Tribolium castaneum (GENBANK N°. de Acesso XM_008199035.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de GW-1 de WCR (SEQ ID N°:2) é uma proteína de Tribolium castaneum que possui o N°. de Acesso GENBANK XP_008197256.1 (77% similar; 70% idêntica sobre a região de homologia).

[00232] dsRNA de gw de transgenes podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA, por exemplo, para fornecer RNAi de direcionamento redundante e efeitos sinérgicos do RNAi. Eventos de milho transgênico que expressam dsRNA que atinge gw são úteis na prevenção do dano com a alimentação da raiz da lagarta da raiz do milho. dsRNA de gw representam novos modos de ação para a combinação com Bacillus thuringiensis, PIR e/ou a tecnologia de proteína inseticida AflP nas pirâmides de Manuseio da Resistência de Inseto para diminuir o desenvolvimento de populações de lagarta da raiz a qualquer uma dessas tecnologias de controle da lagarta da raiz.

EXEMPLO 3: Amplificação de Genes-alvo para produzir dsRNA. [00233] Clones de comprimento completo ou parciais de sequências de gene candidato de Diabrotica referido aqui como gw, foram usados para gerar amplicons de PCR para a síntese de dsRNA. Os iniciadores foram designados para amplificar porções de regiões codificadoras de cada gene alvo por PCR. Veja a Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência do promotor de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; SEQ ID N°:6) foi incorporada nas extremidades 5' das fitas de senso ou antissenso amplificadas. Veja a Tabela 1. RNA foi extraído de WCR usando TRIzol® (Life Technologies, Grand Island, NY), e foi então usado para fazer a primeira fita de cDNA com o SuperScriptIII® First-Strand Synthesis System e instruções preparadas pelo fabricante de Oligo dT (Life Technologies, Grand Island, NY). A primeira fita do cDNA foi usada como modelo para as reações de PCR usando iniciadores

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110/157 opostos posicionados para amplificar toda ou parte de uma sequência de gene alvo nativo. dsRNA também foi amplificado a partir de um clone de que compreende a região codificadora para uma proteína amarela fluorescente (YFP) (SEQ ID N°:7; Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50).

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Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar porções das regiões codificadoras do gene alvo gw exemplificador e o gene de controle negativo YFP.

	ID Gene	ID do Iniciador	Sequência
Par 1	gw-1	Dvv-gw-1_For	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCAA CAACTACGGATGTTG (SEQ ID N°:8)
Dvv-gw-1_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCCT TATCTTTACTTATCCACTGG (SEQ ID N°:9)
Par 2	gw-1 v1	Dvv-gw-1_v1_For	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAAAACG AATCCCATGCATGATTC (SEQ ID N°:10)
Dvv-gw-1_v1_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCCT TATCTTTACTTATCCACTGG (SEQ ID N°:11)
Par 3	gw-1 v2	Dvv-gw-1_v2_For	TTAATACGACTCACTATAGGGAGATCAATC ACCAGATTCTTAATCAACC (SEQ ID N°:12)
Dvv-gw-1_v2_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTATT GATTGTTGTGATATGAGCTG (SEQ ID N°:13)
Par 4	YFP	YFP-F_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAT GGGCTCCAGCGGCGCCC (SEQ ID N°:21)
YFP-R_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATCT TGAAGGCGCTCTTCAGG (SEQ ID N°:24)

Exemplo 4: Construtos de RNAi

Preparação do modelo por PCR e síntese do dsRNA [00234] As estratégias usadas para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA de gw e de dsRNA de YFP são mostradas nas Figura 1 e Figura 2. Os modelos de DNAs pretendidos para uso na síntese de dsRNA de gw foram preparados por PCR usando os pares de iniciador na Tabela 1 e (como modelo de PCR) cDNA de primeira fita preparado a partir do DNA total, isolado de ovos de WCR, larvas do primeiro instar ou adultos. Para cada região do gene alvo gw e YFP selecionada, as amplificações por PCR introduziram uma sequência do promotor T7 nas extremidades 5' das fitas de senso e antissenso (o segmento de YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região

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112/157 codificadora de YFP). Os dois fragmentos amplificados por PCR de cada região dos genes-alvo foram então misturados em aproximadamente quantidades iguais e a mistura foi usada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Veja a Figura 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificadas com os pares de iniciadores particulares foram: SEQ ID N°:3 (gw-1 regí), SEQ ID N°:4 (gw-1 v1), SEQ ID N°:5 (gw-1 v2) e SEQ ID N°:7 (YFP). O RNA de fita dupla para o bioensaio com inseto foi sintetizado e purificado usando um kit AMBION® MEGASCRIPT® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) ou o Kit HiScribe® T7 In Vitro Transcription seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE). Construção de vetores de transformação em planta [00235] Vetores de entrada que abrigam um construto de gene alvo para a formação de hairpin compreendendo os segmentos de gw (SEQ ID N°:1) são montados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos padronizados de clonagem molecular. A formação de hairpin intramolecular pelos transcritos primários de RNA é facilitada pelo arranjo (com uma única unidade de transcrição) de duas cópias do segmento do gene alvo gw em orientação oposta um ao outro, os dois segmentos estando separados por um ligante de polinucleotídeo (por exemplo, uma alça ou um íntron ST-LS1; Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Assim, o transcrito primário de mRNA contém as duas sequências de segmento de gene gw como grandes repetições invertidas um do outro, separadas pela sequência ligante. Uma cópia do promotor (por exemplo, ubiquitina 1 do milho, Patente U.S. N°. 5.510.474; 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV); promotor do badnavírus baciliforme da cana de açúcar (ScBV); promotores dos

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113/157 genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; promotor ALS; promotor do gene de faseolina; cab; rubisco; LAT52; Zm13; e/ou apg) é usada para direcionar a produção do transcrito haipin do mRNA primário e um fragmento que compreende uma região 3' não traduzida (por exemplo, um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3'UTR v2; Patente U.S. No 6.699.984), AtUbi10, AtEf1 ou StPinII) é usado para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA hairpin.

[00236] O vetor binário de destinação compreende um gene de tolerância ao herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente U.S. N° 7.838.733 (B2) e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação de um promotor operável de planta (por exemplo, promotor do badnavírus baciliforme da cana de açúcar (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) ou ZmUbi1 (Patente U.S. 5.510.474)). Uma 5'UTR e um ligante são posicionados entre a extremidade 3' do segmento do promotor e o códon de partida da região codificadora de AAD-1, Um fragmento que compreende uma região 3' não traduzida de um gene de lipase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. 7.179.902) é usado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.

[00237] Um vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio de reações de recombinação padronizadas GATEWAY® com um vetor binário de destinação típico e um vetor de entrada. O vetor binário de destinação compreende um gene de tolerância ao herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (como acima) sob a regulação da expressão de um promotor de ubiquitina 1 do milho (como acima) e um fragmento que compreende a região 3' não traduzida de um gene de lipase do milho ZmLip 3'UTR, como acima). O vetor de entrada compreende uma região codificadora de YFP (SEQ ID N°:14) sob o controle de expressão de um

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114/157 promotor de ubiquitina 1 do milho (como acima) e um fragmento que compreende a região 3' não traduzida de um gene da peroxidase 5 do milho (como acima).

EXEMPLO 5: Rastreamento do Candidato a Genes-alvo [00238] dsRNA sintético foi designado para inibir as sequências do gene alvo identificadas no EXEMPLO 2 que causaram mortalidade e inibição do crescimento quando administradas a WCR em ensaios baseados na dieta.

[00239] Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivadas de gw-1 reg1, gw-1 v1 e gw-1 v2 resultaram na mortalidade e/ou na inibição do crescimento das larvas da lagarta da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 mostra os resultados dos ensaios de alimentação baseados na dieta de larvas de WCR depois de uma exposição por 9 dias ao dsRNA de gw-1 reg1, gw-1 v1, and gw-1 v2, assim como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparada a partir de uma região codificadora da proteína amarela fluorescente (YFP) (SEQ ID N°:14). A Tabela 3 mostra os resultados de LC₅₀ ande GI₅₀ da exposição ao dsRNA de gw-1 v1.

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Tabela 2. Resultados dos ensaios de alimentação com dieta com dsRNA de gw obtidos com larvas da lagarta da raiz do milho ocidental depois de 9 dias de alimentação. A análise ANOVA encontrou diferenças significativas no % Mortalidade Média e % Médio de Inibição de Crescimento (GI). As médias foram separadas usando o teste de Turkey-Kramer.

NOME DO GENE	DOSE (NG/CM2)	N	MÉDIA (%MORTALIDADE) ± SEM*	MÉDIA (GI) ± SEM
gw-1 Regí	500	18	56,49±4,46 (A)	0,83±0,03 (A)
gw-1 ví	500	2	23,53±5,88 (AB)	0,70±0,10 (A)
gw-1 v2	500	2	31,37±1,96 (B)	0,55±0,10 (A)
TE**	0	20	12,21±2,32 (B)	0,06±0,03 (B)
ÁGUA	0	19	12,94±1,97 (B)	-0,01±0,04 (B)
YFP***	500	20	10,26±1,87 (B)	0,02±0,04 (B)
*SEM = Erro Padrão da Méd	ia. Letras entre parênteses designam os

níveis estatísticos. Níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (P<0,05).

**TE = tampão Tris HCl (1 mM) mais EDTA (0,1 mM), pH 7,2 *** yfp = Proteína Amarela Fluorescente

Tabela 3. Sumário da potência oral do dsRNA de gw sobre larvas de

WCR (ng/cm²).

Nome do Gene	LC50	Faixa	GI50	Faixa
gw-1 v1	188	118,38 - 329,62	4,41	2,88 - 6,78

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116/157 [00240] Foi sugerido previamente que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para o controle de inseto mediado por RNAi. Veja a Publicação de Patente U.S. N°. 2007/0124836, que descreve 906 sequências e a Patente U.S. N°. 7.612.194 que descreve 9112 sequências. Entretanto, foi determinado que vários genes sugeridos por ter utilidade para o controle de inseto mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Também foi determinado que as sequências de dsRNA de gw-1 reg1, gw-1 v1 e gw-1 v2 fornecem um controle inesperado e surpreendente da Diabrotica, comparado com outros genes sugeridos por ter utilidade para o controle de inseto mediado por RNAi.

[00241] Por exemplo, anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram sugeridos na Patente U.S. 7.612.194 como eficazes no controle de inseto mediado por RNAi. SEQ ID N°:15 é a sequência de DNA da região 1 (Reg 1) da anexina e a SEQ ID N°:16 é a sequência de DNA da região 2 (Reg 2) da anexina. SEQ ID N°:17 é a sequência de DNA da região 1 (Reg 1) de beta espectrina 2 e a SEQ ID N°:18 é a sequência de DNA da região 2 (Reg2) de beta espectrina 2. SEQ ID N°:19 é a sequência de DNA da região 1 (Reg 1) de mtRP-L4 e a SEQ ID N°:20 é a sequência de DNA da região 2 (Reg 2) de mtRP-L4. Uma sequência de YFP (SEQ ID N°:7) também foi usada para produzir o dsRNA como um controle negativo.

[00242] Cada uma das sequências acima mencionadas foi usada para produzir dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia usada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA é mostrada na Figura 2. DNAs de modelo pretendidos para uso na síntese do dsRNA foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores da Tabela 4 e (como modelo de PCR) a primeira fita de cDNA preparada a partir do RNA total isolado de larvas do primeiro instar de WCR. (YFP foi amplificada a partir de um clone de DNA). Para cada

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117/157 região selecionada do gene alvo, foram realizadas duas amplificações por PCR separadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência do promotor T7 na extremidade 5' das fitas de senso amplificadas. A segunda reação incorporou a sequência do promotor T7 nas extremidades 5' das fitas antissenso. Os dois fragmentos de PCR amplificados para cada região dos genes-alvo foram então misturados em aproximadamente quantidades iguais e a mistura foi usada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Veja Figura 2. O RNA de fita dupla foi sintetizado e purificado usando um kit AMBION® MEGAscript® RNAi de acordo com as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNAs foram testados, cada um, pelos mesmos métodos de bioensaio baseado na dieta descritos acima. Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores usados para produzir as moléculas de dsRNA de anexina Reg1, anexina Reg2, beta espectrina 2 Reg1, beta espectrina 2 Reg2, mtRP-L4 Reg1, mtRP-L4 Reg2 e YFP. Tabela 5 apresenta os resultados dos bioensaios baseados na dieta de larvas de WCR depois de 9 dias de exposição a essas moléculas de dsRNA. Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão desses dsRNAs não resultou na mortalidade ou inibição do crescimento das larvas de lagarta da raiz do milho ocidental acima daquelas vistas com amostras de controle de tampão TE, água ou proteína YFP.

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Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar as porções das regiões codificadoras dos genes.

	Gene (Região)	ID Iniciador	Sequência
Par 5	YFP	YFP-F_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACACCATGGGCTCCAGCGGCG CCC (SEQ ID N°:21)
YFP	YFP-R	AGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG (SEQ ID N°:22)
Par 6	YFP	YFP-F	CACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC (SEQ ID N°:23)
YFP	YFP-R_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATCTTGAAGGCGCTCTTCA GG (SEQ ID N°:24)
Par 7	anexina (Reg 1)	Ann-F1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTCCAACAGTGGTTCCTTAT C (SEQ ID N°:25)
anexina (Reg 1)	Ann-R1	CTAATAATTCTTTTTTAATGTTCCTGAGG (SEQ ID N°:26)
Par 8	anexina (Reg 1)	Ann-F1	GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (SEQ ID N°:27)
anexina (Reg 1)	Ann-R1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTAATAATTCTTTTTTAATGTT CCTGAGG (SEQ ID N°:28)
Par 9	anexina (Reg 2)	Ann-F2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGTTACAAGCTGGAGAACTT CTC (SEQ ID N°:29)
anexina (Reg 2)	Ann-R2	CTTAACCAACAACGGCTAATAAGG (SEQ ID N°:30)
Par 10	anexina (Reg 2)	Ann-F2	TTGTTACAAGCTGGAGAACTTCTC (SEQ ID N°:31)
anexina (Reg 2)	Ann-R2T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTAACCAACAACGGCTAATA AGG (SEQ ID N°:32)
Par 11	beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-F1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATGTTGGCTGCATCTAGAG AA (SEQ ID N°:33)
beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-R1	GTCCATTCGTCCATCCACTGCA (SEQ ID N°:34)
Par 12	beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-F1	AGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (SEQ ID N°:35)
beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-R1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTCCATTCGTCCATCCACTGC A (SEQ ID N°:36)
Par 13	beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-F2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGATGAACACCAGCGAGA AA (SEQ ID N°:37)
beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-R2	CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (SEQ ID N°:38)
Par 14	beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-F2	GCAGATGAACACCAGCGAGAAA (SEQ ID N°:39)
beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-R2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGGGCAGCTTCTTGTTTCCT C (SEQ ID N°:40)
Par 15	mtRP-L4 (Reg 1)	L4-F1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTGAAATGTTAGCAAATATA ACATCC (SEQ ID N°:41)
mtRP-L4 (Reg 1)	L4-R1	ACCTCTCACTTCAAATCTTGACTTTG (SEQ ID N°:42)
Par 16	mtRP-L4 (Reg 1)	L4-F1	AGTGAAATGTTAGCAAATATAACATCC (SEQ ID N°:43)
mtRP-L4 (Reg 1)	L4-R1_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCTCTCACTTCAAATCTTGA CTTTG (SEQ ID N°:44)
Par 17	mtRP-L4 (Reg 2)	L4-F2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAAGTCAAGATTTGAAGTGA GAGGT (SEQ ID N°:45)
mtRP-L4 (Reg 2)	L4-R2	CTACAAATAAAACAAGAAGGACCCC (SEQ ID N°:46)
Par 18	mtRP-L4 (Reg 2)	L4-F2	CAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGAGGT (SEQ ID N°:47)
mtRP-L4 (Reg 2)	L4-R2_T7	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTACAAATAAAACAAGAAGGA CCCC (SEQ ID N°:48)

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Tabela 5. Resultados dos ensaios de alimentação com dieta obtidos com larvas de lagarta da raiz do milho ocidental depois de 9 dias.

Nome do Gene	Dose (ng/cm2)	Peso Médio das Larvas Vivas (mg)	% Médio da Mortalidade	Inibição Média do Crescimento
anexina-Reg 1	1000	0,545	0	-0,262
anexina-Reg 2	1000	0,565	0	-0,301
beta espectrina2 Reg 1	1000	0,340	12	-0,014
beta espectrina2 Reg 2	1000	0,465	18	-0,367
mtRP-L4 Reg 1	1000	0,305	4	-0,168
mtRP-L4 Reg 2	1000	0,305	7	-0,180
tampão TE*	0	0,430	13	0,000
água	0	0,535	12	0,000
YFP**	1000	0,480	9	-0,386
*TE = tampão Tris HCl (10 m	M) mais EDTA (1 mM), pH 8

**YFP = Proteína Amarela Fluorescente

EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs inseticidas [00243] Transformação mediada por Agrobacterium. Células, tecidos e plantas de milho transgênico que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticida (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA que inclui uma molécula de dsRNA que atinge um gene que compreende gw (por exemplo, SEQ ID N°:1)) através da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado no genoma da planta, são produzidos de acordo com a transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação do milho que empregam vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica como descritos, por exemplo, na Patente U.S. 8.304.604, que está incorporada por referência em sua totalidade. Os tecidos transformados são selecionados pela sua habilidade de crescer em um meio que contém Haloxyfop e são rastreados quanto a produção de dsRNA, quando apropriado. Porções de tais culturas de tecido transformado podem ser

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120/157 apresentadas às larvas recém-eclodidas de lagarta da raiz do milho para o bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 1. [00244] Iniciação da Cultura de Agrobacterium. Estoques em glicerol de células DAt13192 da cepa de Agrobacterium (Publicação PCT Internacional N°. WO 2012/016222A2) que abriga um vetor de transformação binário descrito acima (EXEMPLO 4) são plaqueados em placas com meio mínimo AB (Watson, et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo os antibióticos apropriados e são cultivados a 20°C por 3 dias. As culturas são então plaqueadas em placas YEP (gm/L: extrato de levedura, 10; Peptona, 10; NaCl, 5) contendo os mesmos antibióticos e são incubados a 20°C por 1 dia.

[00245] Cultura de Agrobacterium: No dia do experimento, uma solução estoque de Meio de Inoculação e acetosiringona é preparada em um volume apropriado para o número de construtos no experimento e pipetada em um frasco de 250 mL, estéril, descartável. O Meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341) contém: 2,2 gm/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas (Frame et al., ibid.) 68,4 gm/L de sucrose; 36 gm/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de miyo-inositol; em pH 5,4.). A acetosiringona é adicionada ao frasco contendo o Meio de Inoculação até uma concentração final de 200 pM de uma solução estoque 1 M em dimetil sulfóxido 100% e a solução é intensamente misturada.

[00246] Para cada construto, 1 ou 2 alças de inoculação cheias de Agrobacterium da placa YEP são suspensas em 15 mL de uma solução estoque de Meio de Inoculação/acetosiringona em um tubo de centrífuga estéril, descartável de 50 mL e a densidade óptica da solução a 550 nm (OD₅₅₀) é medida em um espectrofotômetro. A suspensão é

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121/157 então diluída para OD₅₅₀ de 0,3 a,4 usando misturas adicionais de Meio de Inoculação/acetosiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium é então colocado horizontalmente sobre uma plataforma de agitação ajustada para cerca de 75 rpm em temperatura ambiente e agitado por 1 a 4 horas enquanto a dissecção do embrião é realizada.

[00247] Esterilização da espiga e isolamento do embrião. Embriões imaturos de milho são obtidos de plantas da linhagem nativa B104 de Zea mays (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406), cultivados em uma estufa e autopolinizados ou polinizados por via endogâmica para produzir espigas. As espigas são coletadas aproximadamente 10 a 12 dias depois da polinização. No dia do experimento, as espigas descascadas têm a superfície esterilizada por imersão em uma solução a 20% de um branqueador comercial (ULTRA CLOROX^® Germicidal Bleach, hipoclorito de sódio 6,15%; com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas por 20 a 30 min seguido por três lavagens em água estéril dionizada em uma capela de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) são dissecados assepticamente de cada espiga e distribuídos aleatoriamente em tubos de microcentrífuga contendo 2,0 mL de uma suspensão apropriada de células de Agrobacterium em um Meio de Inoculação líquido com 200 μΜ de acetosiringona, no qual 2 pL de tensoativo BREAK-THRU® S233 10% (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Alemanha) são adicionados. Para um dado grupo de experimentos, os embriões das espigas agrupadas são usados em cada transformação.

[00248] Cocultura com Agrobacterium. Depois do Isolamento, os embriões são colocados em uma plataforma oscilante por 5 minutos. Os conteúdos do tubo são então vertidos sobre uma placa de Meio de Cocultura, que contém 4,33 gm/L de sais MS 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 gm/L de sucrose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anisico ou ácido

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3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO₃; 200 μM de acetosiringona em DMSO; e 3 gm/L de GELZAN™, em pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium é removida com uma pipeta de transferência estéril, descartável. Os embriões são então orientados com o escutelo virado para cima usando um fórceps esterilizado com a ajuda de um microscópio. A placa é fechada, lacrada com a fita médica 3M™ MICROPORE™ e colocada em uma incubadora a 25°C com luz contínua em aproximadamente 60 pmol m^-2s^-1 de Radiação Fotossinteticamente (PAR.) [00249] Seleção do Calo e Regeneração de Eventos Transgênicos. Depois do período de cocultura, os embriões são transferidos para o Meio de Repouso que é composto por 4,33 gm/L de sais MS, 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 gm/L de sucrose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO₃; 0,5 gm/L de MES (mono-hidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfonico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenicilina e 2,3 gm/L de GELZAN™, em pH 5,8. Não mais do que 36 embriões são movidos para cada placa. As placas são colocadas em uma caixa de plástico claro e incubadas a 27°C com luz contín ua em aproximadamente 50 pmol m^-2s^-1 de PAR por 7 a 10 dias. Embriões de calos são então transferidos (<18/placa) para o Meio de Seleção I, que é compreendido pelo Meio de Repouso (acima) com 100 nM de ácido R-Haloxyfop (0,0362 mg/L; para a seleção de calos que abrigam o gene AAD-1). As placas são recolocadas nas caixas claras e incubadas a 27°C com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m^-2s^-1 de PAR por 7 dias. Os embriões dos calos são então transferidos (<12/placa) para o Meio de Seleção II, que é compreendido pelo Meio de Repouso (acima) com 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0,181 mg/L). As placas

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123/157 são recolocadas nas caixas claras e incubadas a 27°C com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m^-2s^-1 de PAR por 14 dias. Essa etapa de seleção permite que os calos transgênicos proliferem e se diferenciem. [00250] Calos embriogênicos proliferativos são transferidos (<9/placa) para um meio de Pré-Regeneração. O Meio de Pré-Regeneração contém 4,33 gm/L de sais MS, 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 45 gm/L de sucrose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 gm/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH, 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de

6-benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 gm/L de GELZAN™; e 0,181 mg/L de ácido R-Haloxyfop em pH 5,8. As placas são armazenadas em caixas claras e incubadas a 27°C com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m^-2s^-1 de PAR por 7 dias. Calos regenerados são então transferidos (<6/placa) para o Meio de Regeneração em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28°C com 6 horas de luz/8horas de escuro por dia (aproximadamente 160 pmol m^-2s^-1 PAR) por 14 dias ou até que brotos e raízes se desenvolvam. O Meio de Regeneração contém: 4,33 gm/L de sais MS, 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 60 gm/L de sucrose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3 gm/L de goma GELLAN™; e 0,181 mg/L de ácido R-Haloxyfop em pH 5,8. Brotos pequenos com raízes primárias são então isolados e transferidos para o Meio de Alogamento sem seleção. O Meio de Alongamento contém: 4,33 gm/L de sais MS, 1X ISU Vitaminas MS Modificadas; 30 gm/L de sucrose; e 3,5 gm/L de GELRITE™; em pH 5,8.

[00251] As mudas de plantas transformadas selecionadas por sua habilidade de crescer em meio contendo Haloxyfop são transplantadas das PHYTATRAYS™ para pequenos vasos preenchidos com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), coPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 133/390

124/157 bertas com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS) e então aclimatadas em câmara de crescimento CONVIRON (27°C de dia/24°C de noite, 16 h de fotoperíodo, 50 a 70% de RH, 200 pmol m^-2s^-1 PAR). Em alguns exemplos, plântulas transgênicas putativas são analisadas quanto ao transgene em relação ao número de cópias pelos ensaios de PCR quantitativa em tempo real usando iniciadores designados para detectar o gene de tolerância ao herbicida AAD1 integrado no genoma do milho. Posteriormente, ensaios de qPCR são usados para detectar a presença de ligante e/ou da sequência alvo nos transformantes putativos. As plântulas transformadas selecionadas são então movidas para uma estufa para o crescimento posterior e teste.

[00252] Transferência e estabelecimento de plantas T₀ na estufa para o bioensaio e produção de semente. Quando as plantas atingem o estágio V3-V4, elas são transplantadas na mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e cultivadas para florescer na estufa (Tipo de Exposição à Luz: Foto ou Assimilação; Limite Superior de Iluminação 1200 PAR; duração do dia de 16 h; 27°C de dia/24°C de noite).

[00253] As plantas a serem usadas para os bioensaios com inseto são transplantadas dos pequenos vasos para TINUS™ 350-4 ROOTRAINERS^® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canada) (uma planta por evento por ROOTRAINER^®). Aproximadamente quatro dias depois do transplante para as ROOTRAINERS^®, as plantas são infestadas para o bioensaio.

[00254] Plantas da geração T₁ são obtidas pela polinização das sedas das plantas transgênicas T₀ com o pólen coletado das plantas da linhagem endogâmica da elite não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados e plantando as sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos são realizados quando possível.

EXEMPLO 7: Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transgênico.

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125/157 [00255] As análises moleculares (por exemplo, RT-qPCR) de tecidos de milho são realizadas em amostras de folhas coletadas das plantas cultivadas na estufa nos mesmos dias em que o dano da raiz é avaliado. [00256] Os resultados dos ensaios de RT-qPCR para o gene alvo Per5 3'UTRor são usados para validar a expressão dos transgenes. (Um baixo nível de detecção de Per5 3'UTR é esperado em plantas de milho não transformadas, já que geralmente há expressão do gene Per5 endógeno nos tecidos de milho). Os resultados dos ensaios de RT-qPCR para a sequência ligante (que é integral para a formação das moléculas de dsRNA hairpin) nos RNAs expressos são usados para validar a presença dos hairpins transcritos. Os níveis de expressão de RNA do transgene são medidos em relação aos níveis de RNA do gene endógeno do milho.

[00257] As análises de qPCR do DNA para detectar uma porção da região codificadora de AAD1 no gDNA são usadas para avaliar o número de cópias de inserção do transgene. As amostras para essas análises são coletadas das plantas que crescem em câmaras ambientais. Os resultados são comparados com os resultados de qPCR de DNA dos ensaios designados para detectar uma porção de uma única cópia do gene nativo e eventos simples (que possuem uma ou duas cópias de transgenes gw) são avançados para estudos posteriores na estufa.

[00258] Adicionalmente, ensaios de qPCR designados para detectar uma porção do gene de resistência a espectinomicina (SpecR; alojado no vetor binário de plasmídeos fora do T-DNA) são usados para determinar se as plantas transgênicas contêm sequências estranhas integradas no arcabouço do plasmídeo.

[00259] Nível de expressão do transcrito: qPCR do gene alvo Per5 3'UTRor. Eventos celulares de calo ou plantas transgênicas são analisados pela PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) da sequência

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126/157 alvo de Per 5 3'UTRor para determinar o nível de expressão relativa do transcrito hairpin de comprimento completo, quando comparado com o nível do transcrito de um gene interno do milho (por exemplo, No. de Acesso do GENBANK BT069734), que codifica uma proteína semelhante a TIP4-1 (isto é, um homólogo do milho com No. de Acesso do GENBANK AT4G34270; que possui um escore em tBLASTX de 74% de identidade; SEQ ID N°:49). O RNA é isolado usando um Kit Norgen BioTek Total RNA Isolation Kit (Norgen, Thorold, ON) ou o kit RNeasy™ 96 (QIAGEN, Valencia, CA). O RNA total é submetido a um tratamento em um On Column DNasel de acordo com o protocolo sugerido pelo kit. O RNA é então quantificado em um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração é normalizada para 25 ou 50 ng/pL. A primeira fita de cDNA é preparada usando HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo é modificado discretamente para incluir a adição de 10 pL de oligonucleotídeo T20VN 100 μΜ (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C ou G e N é A, C, G ou T; SEQ ID N°:50) no tubo de 1 mL de mistura estoque de iniciador aleatório a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios e oligo DT combinados.

[00260] Depois da síntese do DNA, as amostras são diluídas 1:3 com água sem nuclease e armazenadas a -20°C até o e nsaio.

[00261] Ensaios de PCR em tempo real separados para o gene alvo Per5 3'UTRor e o transcrito semelhante a TIP-41 são realizados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volumes de reação de 10 μL. Para o ensaio de Per5 3'UTR, as reações são corridas com os iniciadores P5U76S (F) (SEQ ID N°:51) e P5U76A (R) (SEQ ID N°:52), uma sonda IDT Custom Oligo marcada com FAM e duplamente extinta com os supressores Zen e Iowa Black

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127/157 de uma ROCHE UNIVERSAL PROBE™ (UPL76; N°. de Catálogo 4889960001; marcada com FAM). Para o ensaio do gene semelhante a TIP41 de referência, os iniciadores TIPmxF (SEQ ID N°:53) e TIPmxR (SEQ ID N°:54), e a sonda Probe HXTIP (SEQ ID N°:55) marcada com HEX (hexaclorofluoresceina) são usados.

[00262] Todos os ensaios incluíram controles negativos sem modelo (mistura apenas). Para as curvas padronizadas, um branco (água no poço fonte) também é incluído na placa fonte para avaliar a contaminação cruzada da amostra. As sequências do iniciador e da sonda estão descritas na Tabela 6. As fórmulas dos componentes de reação para a detecção dos vários transcritos estão descritas na Tabela 7 e as condições das reações de PCR estão resumidas na Tabela 8. A porção fluorescente FAM (6-Carboxi Fluoresceína Amidita) é excitada a 465 nm e a fluorescência é medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção fluorescente HEX (hexaclorofluoresceina) são 533 nm e 580 nm.

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Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeos usadas para as análises moleculares dos níveis de transcrito no milho transgênico.

Alvo	Oligonucleotideo	Sequência
Per5 3'UTR	P5U76S (F)	ttgtgatgttggtggcgtat (SEQ ID N°:51)
Per5 3'UTR	P5U76A (R)	tgttaaataaaaccccaaagatcg (SEQ ID N°:52)
Per5 3'UTR	Roche UPL76 (FAM-Probe)	Roche Diagnostics Número de Catálogo 488996001**
TIP41	TIPmxF	TGAGGGTAATGCCAACTGGTT (SEQ ID N°:53)
TIP41	TIPmxR	GCAATGTAACCGAGTGTCTCTCAA (SEQ ID N°:54)
TIP41	HXTIP (HEX-Probe)	TTTTTGGCTTAGAGTTGATGGTGTACTGATGA (SEQ ID N°:55)

Proteína semelhante a TIP41.

**NAv Sequência não Disponível no fornecedor.

Tabela 7. Fórmulas da reação de PCR para detecção do transcrito.

	Per5 3'UTR	Gene semelhante a TIP
Componente	Concentração Final
Roche Buffer	1 X	1X
P5U76S (F)	0,4 pM	0
P5U76A (R)	0,4 pM	0
Roche UPL76 (FAM)	0,2 pM	0
HEXtipZM F	0	0,4 pM
HEXtipZM R	0	0,4 pM
HEXtipZMP (HEX)	0	0,2 pM
cDNA (2,0 pL)	NA	NA
Água	Até 10 pL	Até 10 pL

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Tabela 8. Condições do termociclador para qPCR de RNA

Per5 3'UTR e Detecção do Gene semelhante a TIP41

Processo	Temp.	Tempo	N°. Ciclos
Ativação do Alvo	95°C	10 min	1
Desnaturação	95°C	10 s	40
Comprimento	60°C	40 s
Aquisição de FAM ou HEX	72°C	1 s
Resfriamento	40°C	10 s	1

[00263] Os dados são analisados usando o Programa LIGHTCYCLER™ v1.5 pela quantificação relativa usando uma segunda derivada o algoritmo max para o cálculo dos valores de Cq, de acordo com as recomendações do fabricante. Para as análises de termo, os valores de termo são calculados usando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que recai na comparação das diferenças dos valores de Cq entre os dois alvos com o valor de base de 2 sendo selecionado sob a presunção de que, para reações de PCR otimizadas, o produto dobra a cada ciclo.

[00264] Tamanho e integridade do transcrito: Ensaio Northern Blot. Em algumas circunstâncias, a caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida pelo uso da análise Northern Blot (RNA blot) para determinar o tamanho molecular do dsRNA hairpin de gw nas plantas transgênicas que expressam um dsRNA de gw.

[00265] Todos os materiais e equipamentos são tratados com RNaseZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos de 2 mL SAFELOCK EPPENDORF, rompidas com um pulverizador de tecido KLECKO™

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130/157 (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) com três esferas de tungstênio em 1 mL de TRIZOL (INVITROGEN) por 5 min, depois incubadas em temperatura ambiente (RT) por 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas por 10 min a 4°C em 11.000 rpm e o sobrenadante é transferido para um tubo novo SAFELOCK EPPENDORF de 2 mL. Depois, 200 pL de clorofórmio são adicionados ao homogenato, o tubo é misturado por inversão por 2 a 5 min, incubado em RT por 10 minutos e centrifugado a 12.000 x g por 15 min a 4°C. A fase superior é transferida para um tubo EPPENDORF de 1,5 mL estéril, 600 pL de isopropanol 100% são adicionados, seguido pela incubação em RT por 10 minutos a 2 horas e depois centrifugada a 12.000 x g por 10 min a 4°C a 25°C. O sobrenadante é descartado e o pélete de RNA é lavado duas vezes com 1 ml de etanol 70%, com centrifugação a 7.500 x g por 10 min a 4°C a 25°C entre as lavagens. O etanol é descartado e o pélete é rapidamente seco com ar por 3 a 5 min antes de ser re-suspenso em 50 pL de água sem nuclease.

[00266] O RNA total é quantificado usando NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas para 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) são então adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura de marcador padronizada DIG RNA (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) são dispensadas e adicionadas a um volume igual de glioxal. As amostras e os RNAs marcados são desnaturados a 50°C por 45 min e armaz enados com gelo até o carregamento sobre um gel de agarose 1,25% SEAKEM GOLD (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de corrida NORTHERNMAX 10 X glioxal (AMBION/INVITROGEN). RNAs são separados por eletroforese a 65 volts/30 mA por duas horas e 15 minutos.

[00267] Depois da eletroforese, o gel é lavado em 2X SSC por 5 min e fotografado em uma estação GEL DOC (BIORAD, Hercules, CA),

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131/157 depois o RNA é passivamente transferido para uma membrana de nylon (MILLIPORE) durante a noite em RT, usando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste em cloreto de sódio 3 mM e citrato trissódico 300 mM, pH 7,0). Depois da transferência, a membrana é lavada em 2x SSC por 5 minutos, o RNA é reticulado com UV à membrana (AGILENT/STRATAGENE) e a membrana é deixada secar em temperatura ambiente por até 2 dias.

[00268] A membrana é pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB™ (AMBION/INVITROGEN) por uma a duas horas. A sonda consiste em um produto de PCR amplificado contendo a sequência de interesse (por exemplo, a porção da sequência antissenso de SEQ ID N°^s:3-5, conforme apropriado) marcada com digoxigenina por meio de um procedimento da ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridização no tampão recomendado é durante a noite em uma temperatura de 60Q em tubos de hibridização. Depois da hibridização, o blot é submetido a lavagens com DIG, acondicionados, expostos a um filme por 1 a 30 minutos, depois o filme é revelado, tudo pelo método recomendado pelo fornecedor do kit DIG.

[00269] Determinação do número de cópias do transgene. Pedaços de folha de milho aproximadamente equivalentes a 2 punções de folha são coletados em placas de coleta de 96 poços (QIAGEN). O rompimento do tecido é realizado com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um kit BIOSPRINT96 PLANT KIT; QIAGEN) com uma esfera de aço inoxidável. Depois da maceração do tecido, gDNA é isolado em um formato de alto rendimento usando um Kit BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô de extração BIOSPRINT96. gDNA é diluído 2:3 em água antes de ajustar a reação de qPCR.

[00270] Análise de qPCR. A detecção do transgene pelo ensaio de hidrólise da sonda é realizada pela PCR em tempo real usando um

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132/157 sistema LIGHTCYCLER®480. Oligonucleotídeos a serem usados nos ensaios de hidrólise da sonda para detectar o gene alvo, a sequência ligante ou para detectar uma porção do gene SpecR (isto é, o gene de resistência a espectinomicina, originado nos plasmídeos do vetor binário; SEQ ID N°:56; oligonucleotídeos de SPC1 na Tabela 9), são designados usando LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Adicionalmente, os oligonucleotídeos a serem usados nos ensaios de hidrólise da sonda para detectar um segmento do gene de tolerância ao herbicida AAD-1 (SEQ ID N°:57; oligonucleotideos GAAD1 na Tabela 9) são designados usando o programa PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS). Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e sondas. Os ensaios são multiplexados com reagentes para um gene cromossômico endógeno do milho (Invertase (SEQ ID N°:58; GENBANK No de Acesso: U16123; referido aqui como IVR1), que serve como uma sequência de referência interna para garantir que gDNA esteja presente em cada ensaio. Para a amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) é preparada em uma concentração final em um volume de reação multiplex de 10 pL contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação em duas etapas é realizada como delineado na Tabela 11. A ativação do fluóroforo e a emissão das sondas marcadas com FAM e HEX são como descritas acima; conjugados de CY5 são excitados maximamente a 650 nm e fluorescem maximamente a 670 nm.

[00271] Os escores de Cp (o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limiar de fundo) são determinados a partir dos dados de PCR em tempo real usando o algoritmo de pontos de ajuste (LIGHTCYCLER® SOFTWARE release 1.5) e o módulo Relative Quant (baseado no método DDCt). Os dados são manuseados como descrito previamente (acima, qPCR).

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Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) usadas para determinações do número de cópias de gene e detecção do arcabouço do plasmídeo do vetor binário.

Nome	Sequência
GAAD1-F	TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (SEQ ID N°:59)
GAAD1-R	CAACATCCATCACCTTGACTGA (SEQ ID N°:60)
GAAD1-P (FAM)	CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA (SEQ ID N°:61)
IVR1-F	TGGCGGACGACGACTTGT (SEQ ID N°:62)
IVR1-R	AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (SEQ ID N°:63)
IVR1-P (HEX)	CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC (SEQ ID N°:64)
SPC1A	CTTAGCTGGATAACGCCAC (SEQ ID N°:65)
SPC1S	GACCGTAAGGCTTGATGAA (SEQ ID N°:66)
TQSPEC (CY5*)	CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA (SEQ ID N°:67)
ST-LS1- F	GTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGAT (SEQ ID N°:68)
ST-LS1- R	CCATGTTTTGGTCATATATTAGAAAAGTT (SEQ ID N°:69)
ST-LS1-P (FAM)	AGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAAT (SEQ ID N°:70)

CY5= Cianina-5

Tabela 10. Componentes da reação para as análises do número de cópia de gene e detecção do arcabouço do plasmídeo.

Componente	Amt. (pL)	Estoque	Conc. Final
2x Tampão	5,0	2x	1x
Iniciador Direto Apropriado	0,4	10 μΜ	0,4
Iniciador Reverso Apropriado	0,4	10 μΜ	0,4
Sonda Apropriada	0,4	5 μΜ	0,2
IVR1-Iniciador Direto	0,4	10 μΜ	0,4
IVR1-Iniciador Reverso	0,4	10 μΜ	0,4
IVR1-Sonda	0,4	5 μΜ	0,2
H2O	0,6	NA*	NA
gDNA	2,0	ND**	ND
Total	10,0

*NA = Não Aplicável **ND = Não Determinado

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Tabela 11. Condições do termociclador para qPCR de DNA

Análises do número de cópia genômica
Processo	Temp.	Tempo	N°. de Ciclos
Ativação do alvo	95°C	10 min	1
Desnaturação	95°C	10 s	40
Comprimento & Aquisição FAM, HEX, ou CY5	60°C	40 s
Resfriamento	40°C	10 s	1

Exemplo 8: Bioensaio de Milho Transgênico [00272] Bioensaios com Inseto. A bioatividade de dsRNA da invenção em questão produzido nas células de planta é demonstrada pelos métodos de bioensaio. Veja, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. Um é capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, pela alimentação com vários tecidos de planta ou pedaços de tecido derivados de uma planta que produz um dsRNA inseticida para insetos alvos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados a partir de vários tecidos de planta derivados de uma planta que produz um dsRNA inseticida e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados sobre dietas artificiais para bioensaios como previamente descrito aqui. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com bioensaios similarmente conduzidos que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida ou outras amostras de controle. O crescimento e sobrevida de insetos alvos na dieta de teste está reduzido em comparação com aquele do grupo de controle. [00273] Bioensaios de Inseto com Eventos de Milho Transgênico.

Duas larvas de lagarta da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) eclodidas de ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada poço de uma bandeja de bioensaios. Os poços são então cobertos com uma

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135/157 capa protetora PULL N' PEEL (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocados em uma incubadora a 28°C com um ciclo de claro/escuro de 18h/6h. Nove dias depois da infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto a mortalidade, que é calculada como o percentual de insetos mortos em relação ao número total de insetos em cada tratamento. As amostras de inseto são congeladas a -20°C por 2 dias e depois a s larvas de inseto de cada tratamento são agrupadas e pesadas. O percentual de inibição do crescimento é calculado como a o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pela média do peso dos dois poços de tratamento de controle. Os dados são expressos como o Percentual de Inibição de crescimento (dos controles negativos). Os pesos médios que excedem ao peso médio de controle são normalizados para zero.

[00274] Bioensaios de inseto na estufa. Ovos de lagarta da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) são recebidos em solo de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Ovos de WCR são incubados a 28°C por 10 a 11 dias. Os ovos são lavados, colocados em uma solução de ágar 0,15% e a concentração é ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa com escotilha é ajustada em um disco de Petri com uma alíquota de suspensão de ovo para monitorar as taxas de eclosão. _ [00275] O solo em volta das plantas de milho que estão crescendo em ROOTRANERS® é infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos são deixados se alimentar por duas semanas, depois de cujo tempo, uma Classificação da Raiz é dada a cada planta. Uma Escala de Lesão de Nódulo é utilizada para graduar, essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8. As plantas que passam por esse bioensaios, que mostram dano reduzido, são transplantadas para potes de 5 galões para a produção de sementes. Os transplantes são tratados com inseticida para evitar o dano posterior pela lagarta da raiz e a liberação de insetos nas estufas. As plantas são

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136/157 polinizadas manualmente para a produção de semente. As sementes produzidas pelas plantas são salvas para a avaliação de T₁ e subsequente geração de plantas.

[00276] Plantas de controle negativo são gerados pela transformação com vetores que abrigam genes designados para produzir uma proteína amarela fluorescente (YFP). Os bioensaios são conduzidos com os controles negativos incluídos em cada conjunto de material de planta.

EXEMPLO 9: Zea mays Transgênica Compreendendo Sequências de uma Praga de coleópteros [00277] 10 a 20 plantas T₀ transgênicas de Zea mays são geradas como descrito no EXEMPLO 6. Um adicional de 10 a 20 linhagens independentes de Zea mays T1 que expressam dsRNA hairpin para um construto de RNAi são obtidas para o desafio com a lagarta da raiz do milho. dsRNA hairpin compreende uma porção da SEQ ID N°:1. dsRNAs hairpin adicionais são derivados, por exemplo, de sequências de praga de coleópteros tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2013/0091600), RPA70 (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de patente U.S. N°. 2013/0097730), ROP ( Pedido de Patente U.S. 14/577,811), RNA polimerase II140 (Pedido de Patente U.S. 14/577,854), RNA polimerase I1 (Pedido de Patente U.S. 62/133,214), RNA polimerase II-215 (Pedido de Patente U.S. 62/133,202), RNA polimerase 33 (Pedido de Patente U.S. 62/133,210), ncm (Pedido de Patente U.S.. 62/095487), Dre4 (Pedido de Patente U.S. 14/705,807), fator de alongamento da transcrição spt5 (Pedido de Patente U.S..

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62/168613), e spt6 (Pedido de Patente U.S. 62/168606). Esses são confirmados por RT-PCR ou outros métodos de análises moleculares. [00278] Preparações de RNA total de linhagens T₁ independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para se ligar ao ligante do cassete de expressão do hairpin em cada um dos construtos de RNAi. Em adição, iniciadores específicos para cada gene alvo em um construto RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta de Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA haipin dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[00279] Além disso, as moléculas de RNAi que possuem sequências não pareadas com mais do 80% de identidade de sequência com genes-alvo afetam as lagartas da raiz do milho de uma maneira similar àquela vista com moléculas de RNAi que possuem 100% de identidade de sequência com os genes-alvo. O pareamento de uma sequência incompatível com sequências nativas para formar um dsRNA hairpin no mesmo construto de RNAi libera siRNAs processados em planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pragas coleópteras.

[00280] A liberação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA que correspondem aos genes-alvo e a absorção subsequente pelas pragas coleópteras através da alimentação resulta na regulação negativa dos genes-alvo na praga de coleópteros através do silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento e/ou desenvolvimento da praga de coleópteros é afetado e no caso de pelo menos

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138/157 um de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. speciosa Germar, D. u. tenella, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva a falha da infestação, alimentação e/ou desenvolvimento bem-sucedidos ou leva a morte da praga de coleópteros. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então usadas para controlar pragas coleópteras.

[00281] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênico e Zea mays não transformada. Genes de praga de coleópteros alvo ou sequencias selecionadas para criar dsRNA hairpin não possuem similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Portanto, não é esperado que a produção ou ativação de RNAi (sistêmico) pelos construtos que atingem esses genes ou sequências das pragas coleópteras terá qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, assim como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio que não possui o gene que expressa o hairpin. A raiz da planta, broto, folhagem e características de reprodução são comparados. As características do broto da planta tais como altura, número e tamanho de folhas, tempo de floração, tamanho floral e aparência são registradas. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão das moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 10: Zea mays transgênica compreendendo uma Sequência de Praga de coleópteros e Construtos de RNAi Adicionais.

[00282] Uma planta transgênica de Zea mays compreendendo uma sequência codificadora heteróloga no seu genoma é transcrita em uma molécula de iRNA que atinge um organismo diferente de uma praga de coleópteros, é secundariamente transformada através de metodologias com Agrobacterium ou WHISKERS™ (veja Petolino and Arnold (2009)

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Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que atinge um gene que compreende uma SEQ ID N°:1). Os vetores de plasmídeo de transformação de planta essencialmente como descritos no EXEMPLO 4 são liberados através de métodos de transformação mediados com Agrobacterium ou WHISKERS™ em uma suspensão de células de milho ou embriões imaturos de milho obtidos a partir de uma planta de Zea mays Hi II ou B 104 compreendendo uma sequência codificadora heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que atinge um organismo diferente de uma praga de coleópteros.

EXEMPLO 11. Zea mays Compreendendo um Construto de RNAi e Sequências de Controle de Praga de coleópteros Adicionais [00283] Uma planta de Zea mays transgênica que compreende uma sequência codificadora heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que atinge um organismo de praga de coleópteros (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA que inclui uma molécula de dsRNA que atinge um gene que compreende a SEQ ID N°:1) é secundariamente transformada através de metodologias com Agrobacterium ou WHISKERS™ (veja Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de proteínas inseticidas, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3, Cry34 e Cry35. Vetores de plasmídeo de transformação em planta preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados através de métodos de transformação através de Agrobacterium ou WHISKERS™ em uma suspensão de células de milho ou embriões imaturos obtidos a partir de uma planta de Zea mays transgênica B104 que compreende uma sequência codificadora heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que atinge o organismo de uma praga de coleópteros. Plantas duplamente transformadas que são obtidas proPetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 149/390

140/157 duzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de pragas coleópteras.

EXEMPLO 12: Rastreamento de Candidatos a Gene Alvo no Percevejo Marrom Neotropical (Euschistus heros) [00284] Colônia de Percevejo Marrom Neotropical (BSB; Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora a 27°C, em 6 5% de unidade relativa com um ciclo de 16:8 horas de claro:escuro. Um grama de ovos coletados durante 2 a 3 dias foram semeadas em recipientes de 5 mL com discos de papel de filtro no fundo e os recipientes foram cobertos com uma rede #18 para ventilação. Cada recipiente criado forneceu aproximadamente 300 a 400 BSB adultos. Em todos os estágios, os insetos foram alimentados com feijões verdes frescos três vezes por semana, um sache de mistura de semente que continha sementes de girassol, soja e amendoins (3:1:1 de proporção em peso) foi substituído uma vez por semana. A água foi suplementada em frascos com plugues de algodão como mechas. Depois das duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para um novo recipiente uma vez por semana.

[00285] Dieta artificial de BSB. Uma dieta artificial para BSB foi preparada como se segue. Feijões verdes liofilizados foram misturados até um pó fino em um misturador MAGIC BULLET®. Os ingredientes secos misturados foram combinados (percentuais em peso: feijões verdes, 35%; amendoins, 35%; sucrose, 5%; Complexo de Vitamina (por exemplo, Vanderzant Vitamin Mixture para insetos, SIGMA-ALDRICH, No de Catalogo V1007), 0,9%); em um grande misturador MAGIC BULLET^®, que foi tampado e bem agitado para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos misturados foram então adicionados a um bowl de misturação. Em um recipiente separado, água e o agente antifúngico benomyl (50 ppm; 25 pL de uma solução a 20.000 ppm /50 mL de solução de dieta) foram bem misturados e depois

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141/157 adicionados à mistura de ingredientes secos. Todos os ingredientes foram misturados a mão até que a solução estava completamente misturada. A dieta foi formatada nos tamanhos desejados, embrulhada frouxamente em folha de alumínio, aquecida por 4 horas a 60°C e depois resfriada e armazenada a 4°C. A dieta artifi cial foi usada dentro de duas semanas da preparação.

[00286] Montagem do transcriptoma de BSB. Seis estágios de desenvolvimento de BSB foram selecionados para a preparação de uma biblioteca de mRNA. O RNA total foi extraído de insetos congelados a -70°C e homogeneizados em 10 volumes de tampão de Lise/Ligação em tubos Lysing MATRIX A de 2 mL (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) em um instrumento FastPrep^®-24 (MP BIOMEDICALS). O mRNA total foi extraído usando um kit mirVana™ miRNA Isolation (AMBION; INVITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequenciamento do RNA usando um sistema illumina^® HiSeq™ (San Diego, CA) forneceu candidatas a sequências de gene alvo para uso na tecnologia de controle de RNAi de inseto. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra usando um programa de montagem TRINITY™ (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). Os transcritos montados foram combinados para gerar um transcriptoma agrupado. Esse transcriptoma agrupado de BSB continha 378.457 sequências.

[00287] Identificação do ortólogo de gw de BSB. Uma pesquisa tBLASTn do transcriptoma agrupado de BSB foi realizado usando como interrogação as isoformas A, B, E, F, I, e J de proteína gw de Drosophila (GENBANK No. de Acesso NP_726600, NP_726597, NP_726601, NP_726596, NP_726599, respectivamente). gw-1 de BSB (SEQ ID N°:71), foi identificado como candidato a gene alvo gw de Euschistus heros, cujo produto tem a sequência de aminoácidos predita de SEQ ID

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N°:72.

[00288] Preparação do modelo e síntese de dsRNA. cDNA foi preparado a partir do RNA total de BSB extraído de um único inseto adulto jovem (cerca de 90 mg) usando TRIzol® Reagent (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizado em temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga com 200 pL de TRIzol® usando um pilão de pélete (FISHERBRAND No. de Catálogo 12-141-363) e Pestle Motor Mixer (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Depois da homogeneização, um adicional de 800 pL de TRIzol® foi adicionado, o homogenato foi centrifugado e depois incubado em temperatura ambiente por cinco minutos. Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. De acordo com o protocolo de extração com TRIzol® recomendado pelo fabricante para 1 ml de TRIzol®, o pélete de RNA foi seco em temperatura ambiente e suspenso novamente em 200 pL de Tampão Tris de um KIT GFX PCR DNA e GEL EXTRACTION KIT (illustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) usando um Tampão de Eluição Tipo 4 (isto é, 10 mM Tris-HCl; pH8,0). A concentração de RNA foi determinada usando o espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00289] Amplificação de cDNA. cDNA foi transcrito reversamente a partir de 5 pg de modelo de RNA total de BSB e o iniciador oligo dT usando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ para RT-PCR (INVITROGEN), seguindo o protocolo recomendado pelo fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi trazido para 100 pL com água sem nucleasse.

[00290] Iniciadores como mostrados na Tabela 12 foram usados para amplificar BSB_gw-1 regí. O DNA de modelo foi amplificado por PCR touch-down (temperatura de anelamento diminuída de 60°C para 50°C, em um ciclo de diminuição de 1°C) com 1 pL de cDNA (acima)

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143/157 como modelo. Um fragmento que compreende 493 pb de BSB_gw-1 regí (SEQ ID N°:73), foi gerado durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima também foi usado para amplificar um modelo de controle negativo com 301 pb YFPv2 (SEQ ID N°:76), usando os iniciadores YFPv2-F (SEQ ID N°:77) e YFPv2-R (SEQ ID N°:78). Os iniciadores BSB_ gw-1 regí e YFPv2 continham uma sequência promotora do fago T7 (SEQ ID N°:6) em suas extremidades 5', e portanto possibilitou o uso dos fragmentos de DNA de YFPv2 e BSB gw para a transcrição do dsRNA.

Tabela 12. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar porções das regiões codificadoras de genes-alvo gw exemplificadores e um gene de controle negativo YFP.

	ID Gene	ID do Iniciador	Sequência
Par 19	gw-1 reg1	BSB_gw-1_For	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATGTTAAGCATC AACAGCATACAC (SEQ ID N°:74)
BSB_gw-1_Rev	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACACAACCGAACCA GGTGTAAG (SEQ ID N°:75)
Par 20	YFP	YFPv2-F	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCATCTGGAGCAC TTCTCTTTCA (SEQ ID N°:77)
YFPv2-R	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACCATCTCCTTCAAA GGTGATTG (SEQ ID N°:78)

[00291] Síntese do dsRNA. dsRNA foi sintetizado usando 2 pL do produto de PCR (acima) como o modelo com um kit MEGAscript™ T7 RNAi (AMBION) usado de acordo com as instruções do fabricante. Veja a Figura 1. dsRNA foi quantificado em um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 e diluído para 500 ng/pL em um tampão 0,1X TE sem nuclease (1 mM Tris HCL, 0,1 mM EDTA, pH 7,4).

[00292] Injeção de dsRNA em hemocel de BSB. BSB foram criados com uma dieta de feijão verde e semente, como a colônia, em uma incubadora a 27°C e 65% de umidade relativa e um fotoperíodo de 16:8

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144/157 horas de claro:escuro. Ninfas do segundo instar (cada uma pesando 1 a 1,5 mg) foram cuidadosamente manuseadas com um pequeno pincel para evitar danos e foram colocadas sobre um disco de Petri sobre gelo para resfriar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de uma solução de 500 ng/pL de dsRNA (isto é, 27, 6 ng de dsRNA; dosagem de 18,4 a 27,6 pg/g de peso corporal). As injeções foram realizadas usando um injetor NANOJECT™ II (DRUMMOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA), equipado com uma agulha de injeção puxada de um capilar de vidro Drummond 3,5 polegadas #3-000-203-G/X. A ponta da agulha foi quebrada e o capilar foi preenchido com óleo mineral leve e depois preenchida com 2 a 3 pL de dsRNA. dsRNA foi injetado no abdome das ninfas (10 insetos injetados com dsRNA por teste) e os testes foram repetidos em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por poço) foram transferidos para bandejas de 32 poços (Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo um pélete de dieta artificial para BSB e cobertas com Pull-N- Peel™ (BIO-CV-4; BIO-SERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 mL de água em um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL com um tampão de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5°C, umidade de 60% e fotoperíodo de 16:8 horas de claro:escuro. A contagem da viabilidade e os pesos foram avaliadas no dia 7 depois das injeções.

[00293] BSB gw é um alvo de dsRNA letal. Como resumido na Tabela 13, em cada replicata, pelo menos dez ninfas de BSB no segundo instar (1 a 1,5 mg cada uma) foram injetadas no hemocel com 55,2 nL de BSB_gw-1 reg1 dsRNA (500 ng/pL), para uma concentração final aproximada de 18.4 - 27.6 pg dsRNA/g de inseto. A mortalidade determinada para o dsRNA de BSB_gw-1 reg1 foi maior do que a observada com a mesma quantidade de dsRNA de YFPv2 (controle negativo).

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Tabela 13. Resultados da injeção de RNA de BSB gw no hemocel de ninfas do segundo instar de Percevejo Marrom Neotropical sete dias depois da injeção.

Tratamento*	N Ensaios	% de Mortalidade Média ± SEM**	valor de p teste t
BSB gw-1 regí	3	67 ± 8,8	0,031t
Não injetado	1	7	0,35
YFPv2	3	19 ± 11,6

*Dez insetos injetados por teste para cada dsRNA. **Erro padrão da média.

t indica diferença significativa entre o dsRNA de YFPv2 de controle usando um teste t de Student p<0,05.

EXEMPLO 13: Zea mays transgênica Compreendendo Sequências de Praga de hemípteros [00294] Dez a 20 plantas transgênicas T₀ de Zea mays abrigando vetores de expressão para ácidos nucleicos que compreendem qualquer porção da SEQ ID N°:71 (por exemplo, SEQ ID N°:73) são descritas como no EXEMPLO 4. Um adicional de 10-20 linhagens independentes T1 Zea mays que expressam dsRNA hairpin para um construto de RNAi são obtidas para o desafio com BSB. dsRNA hairpin são derivados compreendendo uma porção da SEQ ID N°:71 ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID N°:73). Esses são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. Preparações de RNA total de linhagens T₁ selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para ligar o íntron ligante do cassete de expressão de hairpin de cada um dos construtos de RNAi. Em adição, iniciadores específicos para gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção dedo mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA na planta. A amplificação das bandas desejadas para

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146/157 cada gene alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta transgênica de Zea mays. O processamento do dsRNA hairpin dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado nas linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[00295] Além disso, moléculas de RNAi que possuem sequências incompatíveis com mais do que 80% de identidade de sequência para os genes-alvo, afetam os hemípteros de uma maneira similar àquela vista com moléculas de RNAi que possuem 100% de identidade de sequência com os genes-alvo. O pareamento da sequência incompatível com sequências nativas para formar dsRNA hairpin no mesmo construto de RNAi libera siRNAs processados de planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e a viabilidade de pragas hemípteras.

[00296] A liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA ou miRNA que correspondem aos genes-alvo e a ingestão subsequente pelas pragas hemípteras através do silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevida da praga de hemípteros é afetado e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, E. servus, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus; Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e L. lineolaris leva a falha para infestar, alimentar, desenvolver com sucesso e/ou leva a morte da praga de hemípteros. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem-sucedida de RNAi é então usada para controlar as pragas hemípteras.

[0029 7] Comparação fenotípica de linhagens transgênicas de RNAi

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147/157 e Zea mays não transformadas. Genes-alvo de praga de hemípteros ou sequências selecionadas para criar dsRNA hairpin não têm similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Portanto, não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) pelos construtos que atingem esses genes de praga de hemípteros ou sequências tenha qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, assim como aquelas das linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio que não possui o gene que expressa o hairpin. A raiz da planta, broto, folhagem e características de reprodução são comparados. Não há diferença observável no comprimento da raiz e nos padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto da planta tais como altura, número e tamanho de folhas, tempo de floração, tamanho floral e aparência são registradas. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão das moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 14: Glycine max Transgênica Compreendendo Sequências de Praga de hemípteros [00298] Dez a vinte plantas transgênicas T₀ de Glycine max que alojam vetores de expressão para ácidos nucleicos que compreendem uma porção da SEQ ID N°:71 ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID N°:73) são geradas como é conhecido na técnica., incluindo, por exemplo, pela transformação mediada por Agrobacterium como a seguir. Sementes de soja maduras (Glycine max) são esterilizadas por uma noite com gás cloro por dezesseis horas. Depois da esterilização com gás cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma capela de fluxo LAMINAR™ para dispersar o gás cloro. Depois, as sementes esterilizadas são embebidas com H₂O estéril por dezesseis

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148/157 horas no escuro usando uma caixa preta a 24°C.

[00299] Preparação de sementes de soja divididas. A semente de soja dividida compreendendo uma porção do protocolo do eixo embrionário requer a preparação do material de semente de soja que é cortada longitudinalmente, usando uma lamina #10 afixada a um bisturi ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento da semente e dividir a semente em duas seções de cotilédone. Atenção cuidadosa é dada para a remoção parcial do eixo embrionário, em que cerca de 1/2 a 1/3 do eixo do embrião permanece acoplado à extremidade nodal do cotilédone.

[00300] Inoculação. As sementes de soja divididas compreendendo uma porção parcial do eixo embrionário são então imersas por cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo um plasmídeo binário que compreende a SEQ ID N°:71 e/ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID N°:73). A solução de A. tumefaciens é diluída até uma concentração final de λ=0,6 OD₆₅₀ antes da imersão dos cotilédones que compreendem o eixo do embrião.

[00301] Cocultura. Depois da inoculação, a semente de soja dividida é deixada cocultivar com a cepa de Agrobacaterium tumefaciens por 5 dias em meio de cocultura (Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2^nd Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.

[00302] Indução de broto. Depois de 5 dias de cocultura, as sementes de soja divididas são lavadas com meio de Indução de Broto líquido (SI I) que consiste em sais B5, vitaminas B5, ágar Noble 7 g/L, Ferro 28 mg/L, 38 mg/L de Na₂EDTA, 30 g/L de sucrose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7) com o lado plano do cotilédone para cima e a extremidade nodal do cotilédone embebida no

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149/157 meio. Depois de 2 semanas de cultura, os explantes das sementes de soja dividida transformada são transferidos para o meio de Indução de Broto II (SI II) contendo o meio SI I suplementado com 6 mg/L de glifosinato (LIBERTY®).

[00303] Alongamento do broto. Depois de duas semanas de cultura no meio SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e flush shoot pad contendo o eixo embrionário são excisados pela realização de um corte na base do cotilédone. A shoot pad isolada do cotilédone é transferida para o meio de Alongamento de Broto (SE). O meio SE consiste em sais MS, Ferro 28 mg/L, 38 mg/L de Na₂EDTA, 30 g/L de sucrose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de asparaginase, 100 mg/L de ácido L-piroglutamico, 0,1 mg/L de IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de zeatina ribosideo, 50 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glifosinato e 7 g/L de ágar Noble, (pH 5,7). As culturas são transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas são cultivadas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24°C com um fotoperíodo de 18 h em uma intensidade luminosa de 80-90 pmol/m²seg.

[00304] Enraizamento. Os brotos alongados que se desenvolveram a partir do shoot pad do cotilédone e mergulhando o broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido indol 3-butírico) por 1 a 3 minutos para promover o enraizamento. Depois, os brotos alongados são transferidos para o meio de enraizamento (sais MS, Vitaminas B5, Ferro 28 mg/L, 38 mg/L de Na₂EDTA, 20 g/L de sucrose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutamico, e 7 g/L de ágar Noble, (pH 5,6) em phyta trays.

[00305] Cultura. Depois da cultura em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24°C, 18 h de fotoperíodo, por uma a duas semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de sundae coberto e colocado em uma câmara de

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150/157 crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) sob condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuro) em uma intensidade luminosa de 120-150 pmol/m²seg sob temperatura constante (22°C) e umidade (40-50%) para a aclimatação das plântulas. As plântulas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes de serem transferidos para uma estufa para aclimatação posterior e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[00306] 10-20 linhagens independentes de T₁ deGlycine max adicionais que expressam dsRNA hairpin para um construto de RNAi são obtidas para o desafio com BSB. dsRNA hairpin são derivados compreendendo uma porção da SEQ ID N°:71 ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID N°:73). Esses são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular como conhecidos na técnica. Preparações de RNA total de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para se ligar ao íntron ligante do cassete de expressão do hairpin em cada um dos construtos de RNAi. Adicionalmente, iniciadores específicos para cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta de Glycine max transgênica. O processamento do dsRNA haipin dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blot de RNA.

[00307] Moléculas de RNAi que possuem sequências incompatíveis com mais do que 80% de identidade de sequência para os genes-alvo, afetam BSB de uma maneira similar àquela vista com moléculas de RNAi que possuem 100% de identidade de sequência com os gePetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 160/390

151/157 nes-alvo. O pareamento da sequência incompatível com sequências nativas para formar dsRNA hairpin no mesmo construto de RNAi libera siRNAs processados de planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e a viabilidade de pragas hemípteras.

[00308] A liberação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA que correspondem aos genes-alvo e a absorção subsequente pelas pragas hemípteras através da alimentação resulta na regulação negativa dos genes-alvo na praga de hemípteros através do silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e a viabilidade de alimentação da praga de hemípteros é afetado e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacanthus, Dichelops furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Chinavia marginatum, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e Lygus lineolaris leva a falha para infestar, alimentar, desenvolver com sucesso e/ou leva a morte da praga de hemípteros. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi é então usada para controlar as pragas hemípteras. [00309] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Glycine max não transformada. Genes de praga de hemípteros alvo ou sequencias selecionadas para criar dsRNA hairpin não possuem similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecido. Portanto, não é esperado que a produção ou ativação de RNAi (sistêmico) pelos construtos que atingem esses genes ou sequências das pragas hemípteras terá qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, assim como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com

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152/157 um vetor vazio que não possui o gene que expressa o hairpin. A raiz da planta, broto, folhagem e características de reprodução são comparados. Não há diferença observável no comprimento da raiz e nos padrões de crescimento das plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto da planta tais como altura, número e tamanho das folhas, tempo de florescimento, tamanho floral e aparência são similares. Em geral não há diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo da estufa.

EXEMPLO 15: Bioensaios de E. heros com Dieta Artificial.

[00310] Em ensaios de alimentação com dsRNA em dieta artificial, bandejas de 32 poços são montadas com ~18 mg de pélete de dieta artificial e água, como para experimentos com injeção (Veja o EXEMPLO 12). dsRNA em uma concentração de 200 ng/pL é adicionado ao pélete de alimento e amostra de água; 100 pL de cada um dos dois poços. Cinco ninfas do 2° instar de E. heros são introduzidas em cada poço. Amostras de água e dsRNA que atinge um transcrito de YFP são usados como controles negativos. Os experimentos são repetidos em três dias diferentes. Os insetos sobreviventes são pesados e as taxas de mortalidade são determinadas depois de 8 dias de tratamento. A mortalidade e/ou a inibição do crescimento são observadas nos poços fornecidos com dsRNA de gw de BSB comparados com os poços de controle.

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EXEMPLO 16: Arabidopsis thaliana Transgênica Compreendendo Sequências de Praga de hemípteros [00311] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo um construto de gene alvo para a formação de hairpin compreendendo segmentos de gw (SEQ ID N°:71), são gerados usando métodos moleculares padronizados similares ao EXEMPLO 4. A transformação de Arabidopsis é realizada usando um procedimento padronizado baseado em Agrobacterium. Sementes T₁ são selecionadas com um marcador selecionável de resistência ao glifosinato. Plantas transgênicas T₁ de Arabidopsis são geradas e plantas transgênicas T₂ de cópia simples homozigotas são geradas para os estudos com insetos. Os bioensaios são realizados em plantas de Arabidopsis em crescimento com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados sobre cada planta e monitorados quanto a sobrevida por 14 dias.

[00312] Construção de vetores de transformação de Arabidopsis. Clones de entrada baseados em um vetor de entrada que abriga um construto de gene alvo para a formação de hairpin compreendendo segmentos de gw (SEQ ID N°:71), são montados usando uma combinação de segmentos sintetizados quimicamente (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular. A formação de hairpin intramolecular pelos transcritos de RNA primário é facilitada pelo arranjo (com uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento do gene alvo em orientações opostas, os dois segmentos sendo separados pela sequência ligante (por exemplo, uma alça ou um íntron ST-LS1) (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Portanto, o transcrito de mRNA primário contém as duas sequências do segmento de gene gw como grandes repetições invertidas uma da outra, separadas pela sequência ligante. Uma cópia de um promotor (por exemplo, promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana do milho, (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493)) é usada para

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154/157 direcionar a produção do transcrito hairpin do mRNA primário e um fragmento que compreende uma região 3' não traduzida da Fase de Leitura Aberta 23 de grobacterium tumefasciens (AtuORF23 3' UTR v1; Patente US 5.428.147) é usado para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA hairpin.

[00313] Clones de hairpin dentro de vetores de entrada são usados para as reações de recombinação Gateway® padronizadas com um vetor de destinação binário típico para produzir vetores de transformação para expressão de RNA hairpin para a transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium.

[00314] Um vetor de destinação binário que compreende um gene de tolerância ao herbicida, DSM-2v2 (Publicação de Patente U.S. N°. 2011/0107455), sob a regulação de um promotor do vírus do mosaico da veia da Cassava (CsVMV Promoter v2, Patente U.S. 7.601.885; Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39). Um fragmento que compreende uma região 3' não traduzida da Fase de Leitura Aberta 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6; Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22) é usada para terminar a transcrição do mRNA de DSM2v2.

[00315] Um construto binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa um RNA hairpin de YFP, é construído por meio de reações de recombinação padronizadas GATEWAY® com um vetor binário de destinação típico e um vetor de entrada. O construto de entrada compreende uma sequência de hairpin de YFP sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis (como acima) e um fragmento que compreende a ORF23 3' não traduzida de Agrobacterium tumefaciens (como acima).

[00316] Produção de Arabidospsis transgênica compreendendo RNAs inseticidas: transformação mediada por Agrobacterim. Plasmídeos binários contendo sequências de dsRNA hairpin são eletroporados

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155/157 na cepa GV3101 de Agrobacterium (pMP90RK). Os clones de Agrobacterium recombinante são confirmados pela análise de restrição das preparações de plasmídeos das colônias de Agrobacterium recombinante. Um Qiagen Plasmid Max Kit (Qiagen, Cat# 12162) é usado para extrair plasmídeos das culturas de Agrobacterium de acordo com o protocolo recomendado pela fabricante.

[00317] Transformação de Arabidopsis e Seleção de T_x Doze de quinze plantas de Arabidopsis (c.v. Columbia) são cultivadas em potes de 4 na estufa com intensidade luminosa 250 pmol/m², 25°C e 18:6 horas de condições de claro:escuro. Caules de flores primárias são podados uma semana antes da transformação. Inóculos de Agrobacterium são preparados pela incubação de 10 pL de um concentrado de Agrobacterium glicerol em 100 mL de caldo LB (Sigma L3022) +100 mg/L Espectinomicina + 50 mg/L Canamicina a 28°C e agitação a 225 rpm por 72 horas. Células de Agrobacterium são coletadas e suspensas em 5% sucrose + 0,04% Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat # VIS-02) +10 pg/L de solução de benzamino purina (BA) para OD₆₀₀ 0,8~1,0 antes da imersão floral. As partes acima do solo são mergulhadas na solução de Agrobacterium por 5-10 minutos, com agitação cuidados. As plantas são então transferidas para a estufa para o crescimento normal com irrigação regular e fertilização até a produção das sementes.

EXEMPLO 17: Crescimento e Bioensaios de Arabidopsis Transgênica [00318] Seleção de Arabidopsis T₁ transformada com construtos de dsRNA. Até 200 mg de sementes T₁ de cada transformação são estratificadas em uma solução de agarose 0,1%. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (10,5 x 21 x 1; T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN.) com meio Sunshine #5. Os transformantes são selecionados quanto a tolerância a Ignite® (glifosinato) em 280 g/ha 6 a 9 dias depois do plantio. Os eventos selecionados são transplantados

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156/157 para potes com 4'' de diâmetro. A análise de inserção de cópia é realizada dentro de uma semana do transplante através da hidrólise quantitativa por PCR em Tempo Real (qPCR) usando Roche LightCycler480™. Os iniciadores de PCR e as sondas de hidrólise são designadas contra um marcador selecionável DSM2v2 usando LightCycler™ Probe Design Software 2.0 (Roche). Plantas são mantidas a 24°C, com um fotoperíodo de 16:8 horas de claro:escuro sob luzes fluorescentes e incandescentes em uma intensidade de 100-150 mE/m²s.

[00319] Bioensaio de alimentação com planta de E. heros. Eventos com pelo menos quatro cópias inferiores (uma a duas inserções), quatro cópias médias (duas a três inserções) e quatro cópias superiores (>4 inserções) são selecionados para cada construto. As plantas são cultivadas até um estágio reprodutivo (plantas que contêm flores e siliques). A superfície do solo é coberta com um volume de ~ 50 mL de areia branca para facilitar a identificação do inseto. Cinco a dez ninfas de E heros no segundo instar são introduzidas em cada planta. As plantas são cobertas com tubos plásticos que têm 3 de diâmetro, 16 de altura e com espessura da parede de 0,03 (Item N°. 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com uma rede de nylon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob condições de temperatura, lua e irrigação normais em um Conviron. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; o percentual de mortalidade assim como a inibição de crescimento (1 - peso no tratamento/peso do controle) são calculados. Plantas que expressam hairpin de YFP são usadas como controles. Mortalidade significativa e/ou a inibição do crescimento são observadas nas ninfas que se alimentam de plantas transgênicas com dsRNA de gw de BSB, comparados com aquelas de ninfas de plantas de controle.

[00320] Geração de sementes T₂ de Arabidopsis e bioensaios de T₂.

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A semente T₂ é produzida a partir de eventos com poucas cópias (1 a 2 inserções) selecionados para cada construto. As plantas (homozigotas e/ou heterozigotas) são submetidas ao bioensaio de alimentação de E. heros, como descrito acima. As sementes T₃ são coletadas dos homozigotos e armazenadas para análise futura.

EXEMPLO 18: Transformação de Espécies de Cultura Adicionais [00321] O algodão é transformado com um transgene de dsRNA de gw para fornecer o controle de insetos hemípteros pela utilização de um método conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas previamente descritas no EXEMPLO 14 da Patente U.S. 7.838.733 ou no Exemplo 12 da Publicação PCT Internacional N°. WO 2007/053482.

EXEMPLO 19: dsRNA de gw no Manuseio de inseto [00322] Transgenes de dsRNA de gw são combinados com outras moléculas de dsRNA em plantas transgênicas para fornecer um RNAi redundante e efeitos sinérgicos de RNAi. As plantas transgênicas que incluem, por exemplo e sem limitação, milho, soja e algodão que expressam dsRNA que atinge gw são úteis para prevenir o dano causado pela alimentação por insetos coleópteros e hemípteros. Transgenes de dsRNA de gw também são combinados em plantas com a tecnologia das proteínas inseticidas Bacillus thuringiensis, PIP-1 e/ou AflP para representar novos modos de ação nas pirâmides de genes no Manuseio de Resistencia a Inseto. Quando combinadas com outras moléculas de dsRNA que atingem pragas de insetos e/ou com proteínas inseticidas em plantas transgênicas, um efeito inseticida sinérgico é observado que também diminui o desenvolvimento de populações de inseto resistente.

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Claims (60)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um polinucleotídeo operativamente ligado a um promotor heterólogo, em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em:

   SEQ ID N°:1; o complemento ou o complemento reverso de SEQ ID N°:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende as SEQ ID N°^s:3-5; o complemento ou o complemento reverso da sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende SEQ ID N°^s:3-5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende SEQ ID N°^s:3-5; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende SEQ ID N°^s:3-5;

   SEQ ID N°:71; o complemento ou o complemento reverso de SEQ ID N°:71; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:71; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:71; uma sequência codificadora nativa de um organismo de Euschistus que compreende as SEQ ID N°^s:73; o complemento ou o complemento reverso de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:73; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:73; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa

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2. 2/15 de um organismo de Euschistus que compreende a SEQ ID N°:73

   2. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende as SEQ ID N°^s:3-5; o complemento de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5.
3. 3. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°:1, SEQ ID N°:3, SEQ ID N°:4, SEQ ID N°:5, SEQ ID N°:71, SEQ ID N°:73 e o complemento ou o complemento reverso de qualquer uma das precedentes.
4. 4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado do grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa; D. u. undecimpunctata Mannerheim; Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo marrom neotropical); Nezara viridula (L.) (Percevejo Verde do Sul); Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo com Banda Vermelha); Halyomorpha halys (Stál) (Percevejo Marrom Marmorizado); Chinavia hilare (Say) (Percevejo Verde); Euschistus servus (Say) (Percevejo

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   Marrom); Dichelops melacanthus (Dallas); Dichelops furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.) (Percevejo Vermelho Neotropical); Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do Algodão); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Percevejo Manchado Ocidental); e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).
5. 5. Vetor de transformação em planta, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
6. 6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA), caracterizada pelo fato de ser transcrita a partir do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
7. 7. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla, caracterizada pelo fato de ser produzida a partir da termo do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
8. 8. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência de polinucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero inibe a termo de uma sequência de nucleotídeo endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.
9. 9. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato da dita molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero mata ou inibe o crescimento, a viabilidade e/ou a alimentação do inseto.
10. 10. Ácido ribonucleico (RNA) de fita dupla de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento está ligado ao primeiro segmento de RNA pela segunda sePetição 870170007396, de 02/02/2017, pág. 170/390

    4/15 quência de polinucleotídeo e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, tal que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridizam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de fita dupla.
11. 11. Ácido ribonucleico (RNA) de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste em uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla e uma molécula de ácido ribonucleico de fita simples entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
12. 12. Vetor de transformação de planta, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, em que o promotor heterólogo é funcional em uma célula de planta.
13. 13. Célula, caracterizada pelo fato de ser transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
14. 14. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de ser uma célula procariótica.
15. 15. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de ser uma célula eucariótica.
16. 16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de ser uma célula de planta.
17. 17. Planta, caracterizada pelo fato de ser transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
18. 18. Semente da planta como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o polinucleotídeo.
19. 19. Produto básico produzido a partir da planta como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto básico compreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo, o produto básico sendo preferivelmente um alimento ou óleo.

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20. 20. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla.
21. 21. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de a célula ser célula de milho, soja ou algodão.
22. 22. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de a planta ser planta de milho, soja ou algodão.
23. 23. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico e a molécula de ácido ribonucleico inibe a termo de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar a pelo menos um polinucleotídeo quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.
24. 24. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menos um polinucleotídeo adicional que codifica uma molécula de RNA que inibe a termo de um gene endógeno do inseto.
25. 25. Vetor de transformação em planta, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 24, em que o(s) polinucleotídeo(s) adicional/adicionais está/estão, cada um, operativamente ligado(s) a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta.
26. 26. Método para controlar uma população de pragas coleópteras ou hemípteras, caracterizado pelo fato do método compreender fornecer um agente que compreende uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona depois do contato com a praga para inibir uma função biológica dentro da praga, em que o RNA é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste na SEQ ID N°:79; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°:79; SEQ ID N°:83; o complemento ou o complemento

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    6/15 reverso da SEQ ID N°:83; um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83; um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; o complemento ou o complemento reverso de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de o RNA do agente ser especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID N°:80-82 e 84; o complemento ou o complemento reverso da SEQ ID N°: 80-82 e 84; um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 80-82 e 84; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 80-82 e 84; um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5 e 73; o complemento ou o complemento reverso de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 3-5 e 73; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 3-5 e 73; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 3-5 e 73.
28. 28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de fita dupla.
29. 29. Método para controlar uma população de praga de coleópteros, caracterizado pelo fato de compreender:

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    7/15 fornecer um agente que compreenda uma primeira e uma segunda sequências de polinucleotídeo que funcionem depois do contato com a praga de coleópteros para inibir a função biológica dentro da praga de coleópteros, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma região que exibe cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência com cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 79-82 e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizável com a segunda sequência de polinucleotídeo.
30. 30. Método para controlar uma população de praga de hemípteros, caracterizado pelo fato de compreender:

    fornecer um agente que compreenda uma primeira e uma segunda sequências de polinucleotídeo que funcionem depois do contato com a praga de hemípteros para inibir uma função biológica dentro da praga de hemípteros, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que exibe cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência com cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°: 83 e SEQ ID N°:84 e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizável com a segunda sequência de polinucleotídeo.
31. 31. Método para controlar uma população de praga de coleópteros, caracterizado pelo fato de compreender:

    fornecer em uma planta hospedeira de uma praga de coleópteros, uma célula de planta transformada compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona depois do contato com uma praga de coleópteros que pertence à população para inibir a termo de uma sequência alvo dentro da praga de coleópteros e resulte em crescimento e/ou sobrevida diminuídas da praga de coleópteros ou população de praga, em relação à reprodução

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    8/15 da mesma espécie de praga sobre uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo.
32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla.
33. 33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a população de praga de coleóptero está reduzida em relação a uma população da mesma espécie de praga que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie da planta hospedeira que carece da célula de planta transformada.
34. 34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população de praga de coleóptero está reduzida em relação a uma população de praga de coleóptero que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie que carece da célula de planta transformada.
35. 35. Método de controle da infestação de praga de inseto em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender fornecer na dieta de uma praga coleóptera um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em:

    SEQ ID N°:79 e SEQ ID N°:83;

    o complemento ou o complemento reverso de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83;

    um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83;

    o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83;

    um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; o complemento ou o complemento reverso de um transcrito

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    9/15 de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71;

    um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71.
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula de planta transformada para expressar o polinucleotídeo ou uma isca de RNAi que compreenda o RNA.
37. 37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de fita dupla.
38. 38. Método de controle da infestação de praga de inseto em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender contatar uma praga de inseto com um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em:

    SEQ ID N°:79 e SEQ ID N°:83;

    o complemento ou o complemento reverso de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83;

    um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83;

    o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID N°^s:79 e 83;

    um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; o complemento ou o complemento reverso de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71;

    um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos

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    10/15 de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID N°^s:1 e 71.
39. 39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o contato da praga de inseto com o RNA compreende pulverizar a planta com uma composição que compreende o RNA.
40. 40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de fita dupla.
41. 41. Método para melhorar o rendimento de uma cultura de planta, caracterizado pelo fato de compreender:

    introduzir o ácido nucleico como definido na reivindicação 1, em uma planta para produzir uma planta transgênica; e cultivar a planta para permitir a termo de pelo menos um polinucleotídeo;

    em que a termo de pelo menos um polinucleotídeo inibe a reprodução ou o crescimento da praga de inseto e a perda de rendimento devido à infestação pela praga de inseto.
42. 42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a termo de pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de inseto que tenha contatado uma porção da planta de milho.
43. 43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°:1, SEQ ID N°:3, SEQ ID N°:4, SEQ ID N°:5, SEQ ID N°:71, SEQ ID N°:73 e o complemento ou o complemento reverso de qualquer uma das precedentes.

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44. 44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de a planta ser planta de milho, soja ou algodão.
45. 45. Método para a produção de uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de compreender:

    transformar uma célula de planta com um vetor que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 1;

    cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta que compreende uma pluralidade de células de planta transformadas;

    selecionar as células de planta transformadas que possuem integrado o pelo menos um polinucleotídeo em seus genomas;

    rastrear as células de planta transformadas quanto à termo de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificado por pelo menos um polinucleotídeo; e selecionar a célula de planta que expressa o RNA.
46. 46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID N°:1; o complemento ou o complemento reverso de SEQ ID N°:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1; uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende as SEQ ID N°^s:3-5; o complemento ou o complemento reverso de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5; e o complemento ou o complemento reverso de um fragmento de pelo

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    12/15 menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID N°^s:3-5.
47. 47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de fita dupla.
48. 48. Método para produzir uma planta transgênica protegida contra uma praga de coleóptero, caracterizado pelo fato de compreender:

    fornecer a célula de planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 46; e regenerar a planta transgênica a partir da célula de planta transgênica , em que a termo da molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos um polinucleotídeo é suficiente para modular a termo do gene alvo em uma praga de coleóptero que contata a planta transformada.
49. 49. Método para produzir uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de compreender:

    transformar uma célula de planta com um vetor que compreende um meio gw para fornecer proteção contra uma praga coleóptera para uma planta;

    cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta que compreende uma pluralidade de células de planta transformadas;

    selecionar as células de planta transformadas que têm integrado meio gw para fornecer proteção contra uma praga coleóptera para uma planta em seus genomas;

    rastrear as células de planta transformada para termo meio gw para inibir a termo de um gene essencial em uma praga coleóptera;

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    13/15 e

    selecionar uma célula de planta que expressa o meio gw para inibir a termo de um gene essencial em uma praga coleóptera.
50. 50. Método para produzir uma planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, caracterizado pelo fato de compreender:

    fornecer a célula de planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 49; e regenerar a planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que a termo de meio gw para inibir a termo de um gene essencial na praga de coleóptero é suficiente para modular a termo de um gene alvo em uma praga de coleóptero que contata a planta transformada.
51. 51. Método para produzir uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de compreender:

    transformar uma célula de planta com um vetor que compreende um meio gw para fornecer proteção contra uma praga hemíptera para uma planta;

    cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta que compreende uma pluralidade de células de planta transformadas;

    selecionar as células de planta transformadas que têm integrado o meio gw para fornecer proteção contra uma praga hemíptera para uma planta em seus genomas;

    rastrear as células de planta transformada para termo um meio gw para inibir a termo de um gene essencial em uma praga hemíptera; e selecionar uma célula de planta que expressa o meio gw para inibir a termo de um gene essencial em uma praga hemíptera.
52. 52. Método para produzir uma planta transgênica protegida

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    14/15 contra uma praga hemíptera, caracterizado pelo fato de compreender:

    fornecer a célula de planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 51; e regenerar a planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que a termo do meio gw para inibir a termo de um gene essencial na praga hemíptera é suficiente para modular a termo de um gene alvo em uma praga hemíptera que contata a planta transformada.
53. 53. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo de PIP-1 ou um polipeptídeo de AflP-1A.
54. 54. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado do grupo que compreende Cry1 B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e Cyt2C.
55. 55. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de compreender ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo de PIP-1 ou um polipeptídeo de AflP-1A.
56. 56. Célula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado do grupo que compreende Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e Cyt2C.
57. 57. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo de PIP-1 ou um polipeptídeo de AflP-1 A.
58. 58. Planta de acordo com a reivindicação 57, caracterizada

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    15/15 pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado do grupo que compreende CrylB, CrylI, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e Cyt2C.
59. 59. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula de planta transformada compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo de PIP-1 ou um polipeptídeo de AflP-1A.
60. 60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo que compreende Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e Cyt2C.

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