ES2811279T3

ES2811279T3 - Moléculas de ácido nucleico de Nucampholin para controlar plagas de insectos coleópteros

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Publication number: ES2811279T3
Application number: ES15202058T
Authority: ES
Inventors: Kenneth E Narva; Sarah E Worden; Megan L Frey; Chaoxian Geng; Murugesan Rangasamy; Kanika Arora; Balaji Veeramani; Premchand Gandra; Andreas Vilcinskas; Eileen Knorr
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2021-03-11
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: EP3037432A1; EP3037432B1; US20160194658A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de ácido ribonucleico de horquilla (hpARN) con una estructura de tallo y lazo que es capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula de un insecto coleóptero tras la ingestión, en donde el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo, y en donde el polinucleótido comprende: una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN, en donde la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:84, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:84, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:86, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:86, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:88, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:88, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:93 y el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:93; una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN; y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN, en donde la tercera secuencia de nucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de nucleótidos, de manera que los polirribonucleótidos codificados por la primera y la tercera secuencias de nucleótidos se hibridan en una estructura de tallo de la molécula de hpARN, en donde una estructura de lazo de la molécula de hpARN comprende el polirribonucleótido codificado por la segunda secuencia de nucleótidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de ácido nucleico de Nucampholin para controlar plagas de insectos coleópteros

Campo técnico de la descripción

La presente invención se refiere generalmente al control genético del daño a las plantas causado por plagas de insectos (por ejemplo, plagas de coleópteros). La presente invención se refiere a polinucleótidos codificantes y no codificantes objetivo, y al uso de tecnologías de ARNi para la represión o inhibición postranscripcional de la expresión de polinucleótidos codificantes y no codificantes en las células de una plaga de insectos para proporcionar un efecto protector a la planta.

Antecedentes

El gusano de la raíz del maíz occidental (WCR, por sus siglas en inglés), Diabrotica virgifera LeConte, es una de las especies de gusanos de la raíz del maíz más devastadoras en América del Norte y es una preocupación particular en las áreas de cultivo de maíz del medio oeste de los Estados Unidos. El gusano de la raíz del maíz del norte (NCR, por sus siglas en inglés), Diabrotica barberi Smith y Lawrence, es una especie estrechamente relacionada que convive en gran parte del mismo intervalo que WCR. Hay otras varias subespecies relacionadas de Diabrotica que son plagas importantes en América del Norte: el gusano de la raíz del maíz mexicano (MCR, por sus siglas en inglés), D. virgifera zeae Krysan y Smith; el gusano de la raíz del maíz del sur (SCR, por sus siglas en inglés), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; y D. u. undecimpunctata Mannerheim. El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos ha estimado que los gusanos de la raíz del maíz causan $ 1 billón en pérdidas de ingreso cada año, incluidos $ 800 millones en pérdida de rendimiento y $ 200 millones en costos de tratamiento.

Tanto WCR como NCR se depositan en el suelo como huevos durante el verano. Los insectos permanecen en la etapa de huevo por todo el invierno. Los huevos son alargados, blancos y de menos de 0,004 pulgadas de longitud. Las larvas eclosionan a fines de mayo o principios de junio, y el momento preciso de la eclosión de los huevos varía de un año a otro debido a las diferencias de temperatura y ubicación. Las larvas recién eclosionadas son gusanos blancos que tienen menos de 0,125 pulgadas de longitud. Una vez eclosionadas, las larvas comienzan a alimentarse de raíces de maíz. Los gusanos de la raíz del maíz pasan a través de tres estadios larvarios. Después de alimentarse durante varias semanas, las larvas mudan a la etapa pupal. Pupan en el suelo, y luego emergen del suelo como adultos en julio y agosto. Los gusanos de la raíz adultos tienen alrededor de 0,25 pulgadas de longitud.

Las larvas del gusano de la raíz del maíz completan el desarrollo en el maíz y otras varias especies de pastos. Las larvas criadas en cola de zorro amarilla emergen más tarde y tienen un tamaño de cápsula de cabeza más pequeño en la edad adulta que las larvas criadas en maíz. Ellsbury y otros (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. Los WCR adultos se alimentan de la seda, polen y granos del maíz expuestos en las puntas de las mazorcas. Si los WCR adultos emergen antes de que estén presentes los tejidos reproductivos del maíz, pueden alimentarse del tejido de la hoja, de esta manera ralentiza el crecimiento de la planta y ocasionalmente mata a la planta huésped. Sin embargo, los adultos cambiarán rápidamente a las sedas y polen preferidos cuando estén disponibles. Los adultos de NCR también se alimentan de tejidos reproductivos de la planta de maíz, pero por el contrario raramente se alimentan de hojas de maíz.

La mayor parte del daño del gusano de la raíz en el maíz es causada por la alimentación larval. Los gusanos de la raíz recién eclosionados se alimentan inicialmente de los finos pelos de la raíz del maíz y excavan en las puntas de las raíces. A medida que las larvas crecen, se alimentan y excavan en las raíces primarias. Cuando los gusanos de la raíz del maíz son abundantes, la alimentación larval a menudo resulta en la poda de las raíces hasta la base del tallo del maíz. La lesión severa de la raíz interfiere con la capacidad de las raíces para transportar agua y nutrientes a la planta, reduce el crecimiento de la planta y resulta en una producción reducida de granos, de esta manera, a menudo se reduce drásticamente el rendimiento general. La lesión severa de la raíz también a menudo resulta en el alojamiento de plantas de maíz, lo que dificulta la cosecha y disminuye más el rendimiento. Además, la alimentación por los adultos de los tejidos reproductivos del maíz puede resultar en la poda de sedas en la punta de la mazorca. Si este "recorte de seda" es lo suficientemente severo durante el desprendimiento del polen, la polinización puede interrumpirse.

El control de los gusanos de la raíz del maíz puede intentarse mediante rotación de cultivos, insecticidas químicos, biopesticidas (por ejemplo, la bacteria grampositiva formadora de esporas, Bacillus thuringiensis), o una combinación de estos. La rotación de cultivos tiene la desventaja significativa de imponer restricciones no deseadas sobre el uso de tierras de cultivo. Además, la oviposición de algunas especies de gusanos de la raíz puede ocurrir en los campos de soya, lo que mitiga, de esta manera, la efectividad de la rotación de cultivos practicada con maíz y soya.

Los insecticidas químicos son la estrategia más fuertemente confiada para lograr el control del gusano de la raíz del maíz. Se cree que el uso de insecticidas químicos es una estrategia imperfecta de control del gusano de la raíz del maíz; más de $ 1 billón puede perderse en los Estados Unidos cada año debido al gusano de la raíz del maíz cuando los costos de los insecticidas químicos se añaden a los costos del daño del gusano de la raíz que puede ocurrir a pesar del uso de los insecticidas. Las altas poblaciones de larvas, las fuertes lluvias y la aplicación inadecuada de los insecticidas pueden resultar todos en un control del gusano de la raíz del maíz inadecuado. Además, el uso continuo de insecticidas puede seleccionar cepas de gusanos de la raíz resistentes a los insecticidas, así como también plantea preocupaciones ambientales significativas debido a la toxicidad de muchos de ellos para especies no objetivo.

Los escarabajos del polen europeos (PB, por sus siglas en inglés) son plagas graves en la colza oleaginosa, tanto las larvas como los adultos se alimentan de flores y polen. El daño del escarabajo del polen al cultivo puede causar una pérdida de rendimiento del 20-40 %. La principal especie de plaga es Meligethes aeneus Fabricius. Actualmente, el control del escarabajo del polen en la colza oleaginosa se basa principalmente en piretroides que se espera que sean eliminados pronto debido a su perfil ambiental y regulatorio. Además, se ha informado de la resistencia del escarabajo del polen a los insecticidas químicos existentes. Por lo tanto, se necesitan con urgencia soluciones de control del escarabajo del polen amigables con el ambiente con nuevos modos de acción.

En la naturaleza, los escarabajos del polen pasan el invierno como adultos en el suelo o debajo de la hojarasca. En primavera, los adultos salen de la hibernación y comienzan a alimentarse de flores de malezas y migran a plantas de colza oleaginosa florecidas. Los huevos se ponen en los capullos de colza oleaginosa. Las larvas se alimentan y se desarrollan en los capullos y las flores. Las larvas de etapa tardía encuentran un sitio de pupación en el suelo. Los adultos de segunda generación emergen en julio y agosto y se alimentan de varias plantas florecidas antes de encontrar sitios para pasar el invierno.

La interferencia de ARN (ARNi) es un proceso que utiliza trayectorias celulares endógenas, de manera que una molécula de ARN interferente (iARN) (por ejemplo, una molécula de ARNds) que es específica para todo, o cualquier porción de tamaño adecuado, de un gen objetivo resulta en la degradación del ARNm codificado de esta manera. En los últimos años, el ARNi se ha usado para realizar la "eliminación" de genes en una serie de especies y sistemas experimentales; por ejemplo, plantas Caenorhabditis elegans, embriones de insectos y células en cultivo de tejidos. Véase, por ejemplo, Fire y otros (1998) Nature 391:806-11; Martinez y otros (2002) Cell 110:563-74; McManus y Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

El ARNi logra la degradación del ARNm a través de una trayectoria endógena que incluye el complejo de proteínas DICER. DICER escinde moléculas de ARNds largas en fragmentos cortos de aproximadamente 20 nucleótidos, denominados ARN interferente pequeño (siARN, por sus siglas en inglés). El siARN se desenrolla en dos ARNs monocatenarios: la cadena de pasajeros y la cadena guía. La cadena de pasajeros se degrada y la cadena guía se incorpora al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). Los ácidos micro ribonucleicos (miARNs) son moléculas estructuralmente muy similares que se escinden de las moléculas precursoras que contienen un "lazo" polinucleotídico que conecta las cadenas de pasajero y guía hibridadas, y pueden incorporarse de manera similar en RISC. El silenciamiento génico postranscripcional ocurre cuando la cadena guía se une específicamente a una molécula de ARNm complementaria e induce la escisión por parte de Argonaute, el componente catalítico del complejo RISC. Se sabe que este proceso se propaga sistémicamente por todo el organismo a pesar de las concentraciones inicialmente limitadas de siARN y/o miARN en algunos eucariotas, tales como plantas, nemátodos y algunos insectos.

La patente de Estados Unidos 7,612,194 y las publicaciones de patente de Estados Unidos Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, y 2011/0154545 describen una biblioteca de 9112 secuencias de etiquetas de secuencias expresadas (EST, por sus siglas en inglés) aisladas a partir de D. v. virgifera LeConte pupae. Se sugiere en la patente de Estados Unidos 7,612,194 y la publicación de patente de Estados Unidos No. 2007/0050860 enlazar operativamente a un promotor una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una de varias secuencias parciales particulares de D. v. Virgifera tipo vacuolar H+-ATPasa (V-ATPasa) descrita en el mismo para la expresión de ARN antisentido en células vegetales. La publicación de patente de Estados Unidos No. 2010/0192265 sugiere unir operativamente un promotor a una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia parcial particular de un gen de D. v. virgifera de función desconocida y no descrita (se establece que la secuencia parcial es 58 % idéntica al producto génico C56C10.3 en C. elegans) para la expresión de ARN antisentido en células vegetales. La publicación de patente de Estados Unidos No.

2011/0154545 sugiere unir operativamente un promotor a una molécula de ácido nucleico que sea complementaria a dos secuencias parciales particulares de genes de la subunidad beta del coatómero de D. v. Virgifera para la expresión de ARN antisentido en células vegetales. Además, la patente de Estados Unidos 7,943,819 describe una biblioteca de 906 secuencias de etiquetas de secuencias expresadas (EST) aisladas de larvas, pupas e intestinos disecados de D. v. Virgifera LeConte y sugiere unir operativamente un promotor a una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia parcial particular de un gen de proteína 4b del cuerpo multivesicular cargado de D. v. virgifera para la expresión de a Rn bicatenario en células vegetales.

No se proporcionan más sugerencias en la patente de Estados Unidos 7,612,194 y las publicaciones de patente de Estados Unidos Nos. 2007/0050860, 2010/0192265y 2011/0154545 para usar cualquier secuencia particular de las más de nueve mil secuencias enumeradas allí para la interferencia de ARN, aparte de las varias secuencias parciales particulares de V-ATPasa y las secuencias parciales particulares de genes de función desconocida. Además, ninguno de la patente de Estados Unidos 7,612,194 y las publicaciones de patente de Estados Unidos Nos. 2007/0050860 y 2010/0192265y 2011/0154545 proporciona alguna orientación sobre qué otra de las más de nueve mil secuencias proporcionadas sería letal, o incluso de cualquier otra manera útil, en especies de gusano de la raíz del maíz cuando se usa como ARNds o siARN. La patente de Estados Unidos 7,943,819 no proporciona ninguna sugerencia para usar una secuencia particular de las más de novecientas secuencias enumeradas allí para la interferencia de ARN, que no sea la secuencia parcial particular de un gen de proteína 4b del cuerpo multivesicular cargado. Además, la patente de Estados Unidos 7,943,819 no proporciona orientación sobre qué otra de las más de novecientas secuencias proporcionadas sería letal, o incluso de cualquier otra manera útil, en especies de gusano de la raíz del maíz cuando se usa como ARNds o siARN. La solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. U.S. 2013/040173 y la publicación de solicitud de PCT No. WO 2013/169923 describe el uso de una secuencia derivada de un gen Snf7 deDiabrotica virgifera para la interferencia de ARN en el maíz. (También descrito en Bolognesi y otros (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/joumal.pone.0047534).

La abrumadora mayoría de las secuencias complementarias a los ADNs del gusano de la raíz del maíz (tales como las anteriores) no proporcionan un efecto protector de las plantas de las especies del gusano de la raíz del maíz cuando se usan como ARNds o siARN. Por ejemplo, Baum y otros (2007) Nature Biotechnology 25: 1322-1326, describen los efectos de la inhibición de varios genes WCR marcados por ARNi. Estos autores informaron que 8 de los 26 genes objetivo que probaron no fueron capaces de proporcionar mortalidad de plagas de coleópteros experimentalmente significativa a una concentración de iARN muy alta (por ejemplo, ARNds) de más de 520 ng/cm2

Los autores de la patente de Estados Unidos 7,612,194 y la publicación de patente de Estados Unidos No. 2007/0050860 hicieron el primer informe de ARNi in planta en plantas de maíz dirigidas al gusano de la raíz del maíz occidental. Baum y otros (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Estos autores describen un sistema de ARNi dietético de alto rendimiento in vivo para tamizar genes objetivo potenciales para el desarrollo de maíz transgénico de ARNi. De un grupo inicial de genes de 290 objetivos, solo 14 exhibieron potencial control de larvas. Uno de los ARN bicatenarios (ARNds) más efectivos marcó a un gen que codifica la subunidad A de la ATPasa vacuolar (V-ATPasa), lo que resulta en una supresión rápida del ARNm endógeno correspondiente y desencadena una respuesta específica de ARNi con bajas concentraciones de ARNds. Por lo tanto, estos autores documentaron por primera vez el potencial para el ARNiin planta como una posible herramienta para el manejo de plagas, al tiempo que demuestra simultáneamente que los objetivos efectivos no pueden identificarse con precisión a priori, incluso a partir de un conjunto relativamente pequeño de genes candidatos.

El documento WO 2012/092544 A2 describe secuencias de ácido nucleico de Diabrotica virgifera para el control de plaga de coleópteros a través de la interferencia de ARN.

Resumen de la descripción

En un primer aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de ácido ribonucleico de horquilla (hpARN) con una estructura de tallo y lazo que es capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula de un insecto coleóptero tras la ingestión, en donde el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo, y en donde el polinucleótido comprende: una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN, en donde la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID n O:84, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:84, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:86, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:86, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:88, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:88, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:93 y el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:93; una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN; y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN, en donde la tercera secuencia de nucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de nucleótidos, de manera que los polirribonucleótidos codificados por la primera y la tercera secuencias de nucleótidos se hibridan en una estructura de tallo de la molécula de hpARN, en donde una estructura de lazo de la molécula de hpARN comprende el polirribonucleótido codificado por la segunda secuencia de nucleótidos.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a la molécula de ácido ribonucleico de horquilla (hpARN) codificada por el polinucleótido de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención que es capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula de un insecto coleóptero tras la ingestión, la molécula de hpARN comprende: el primer polirribonucleótido codificado por la primera secuencia de nucleótidos; el segundo polirribonucleótido codificado por la segunda secuencia de nucleótidos; y el tercer polirribonucleótido codificado por la tercera secuencia de nucleótidos, en donde los polirribonucleótidos primero y tercero se hibridan en una estructura de tallo de la molécula de hpARN.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a una planta transgénica o una semilla de planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el promotor heterólogo es funcional en una célula vegetal.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para controlar una población de insectos coleópteros, el método comprende alimentar insectos de la población con un agente que comprende el hpARN de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para producir una célula vegetal transgénica, el método comprende: transformar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el promotor heterólogo es funcional en una célula vegetal y en donde la molécula es un vector de transformación vegetal; cultivar la célula vegetal transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo celular vegetal que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas; seleccionar células vegetales transformadas que han integrado el polinucleótido en sus genomas; tamizar las células vegetales transformadas para la expresión de la molécula de hpARN codificada por el polinucleótido; y seleccionar una célula vegetal que expresa la molécula de hpARN.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica resistente a plagas de coleópteros, el método comprende: regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica de acuerdo con la invención, en donde la expresión de la molécula de ARN codificada por el polinucleótido es suficiente para reducir la expresión de un gen objetivo en una plaga de coleópteros que ingiere una célula de la planta transgénica.

En la presente descripción se describen moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, genes objetivo, ADNs, ARNdss, siARNs, miARNs, shARNs y hpARNs), y métodos de uso de estos, para el control de plagas de insectos, incluidas, por ejemplo, plagas de coleópteros, tales como D. v. Virgifera LeConte (gusano de la raíz del maíz occidental, "WCR"); D. barberi Smith y Lawrence (gusano de la raíz del maíz del norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (gusano de la raíz del maíz del sur, "SCR"); D. v. zeae Krysan y Smith (gusano de la raíz del maíz mexicano, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar D. u. undecimpunctata Mannerheim y Meligethes aeneus Fabricius (escarabajo del polen, "PB"). En ejemplos particulares, se describen moléculas de ácido nucleico ilustrativas que pueden ser homólogas a, al menos, una porción de uno o más ácidos nucleicos nativos en una plaga de insectos.

En estos y otros ejemplos, la secuencia de ácido nucleico nativo puede ser un gen objetivo, cuyo producto puede estar, por ejemplo y sin limitación: involucrado en un proceso metabólico; involucrado en un proceso reproductivo; o involucrado en el desarrollo larvario. En algunos ejemplos, la inhibición postranscripcional de la expresión de un gen objetivo por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido homólogo a la misma puede ser letal para una plaga de insectos o resultar en un crecimiento y/o desarrollo reducido de una plaga de insectos. En ejemplos específicos, nucampholin (referido en la presente descripción como ncm) puede seleccionarse como un gen objetivo para el silenciamiento postranscripcional. En ejemplos particulares, un gen objetivo útil para la inhibición postranscripcional es un gen nuevo referido en la presente descripción como Diabrotica ncm (por ejemplo, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:77). En ejemplos particulares, un gen objetivo útil para la inhibición postranscripcional es un gen nuevo referido en la presente descripción como Meligethes ncm (por ejemplo, SEQ ID NO:84, SEQ iD NO:86, SEQ ID NO:88 y SEQ ID NO:93). Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO:1; el complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:77; el complemento de SEQ ID NO:77; SEQ ID NO:84; el complemento de SEQ ID NO:84; SEQ ID NO:86; el complemento de SEQ ID NO:86; SEQ ID NO:88; el complemento de SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:93; el complemento de SEQ ID NO:93; y/o fragmentos de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, SEQ ID NOs: 3-6 y 90) se describen, por lo tanto, en la presente descripción.

También se describen moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que es al menos alrededor de 85 % idéntico a una secuencia de aminoácidos dentro de un producto génico objetivo (por ejemplo, el producto de un gen ncm). Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido que es al menos 85 % idéntico a un Diabrotica NCM (por ejemplo, SEQ ID NO:2); un Meligethes NCM (por ejemplo, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89 y SEQ ID No :94); y/o una secuencia de aminoácidos dentro de un producto de un Diabrotica ncm o un Meligethes ncm. Además, se describen moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que es el complemento inverso de un polinucleótido que codifica un polipéptido al menos 85 % idéntico a una secuencia de aminoácidos dentro de un producto génico objetivo.

También se describen polinucleótidos de ADNc que pueden usarse para la producción de moléculas de iARN (por ejemplo, ARNds, siARN, shARN, miARN y hpARN) que son complementarios a todo o parte de un gen objetivo de plagas de insectos, por ejemplo, un gen ncm. En modalidades particulares, se pueden producir hpARN in vitro o in vivo por un organismo genéticamente modificado, tal como una planta o bacteria. En ejemplos particulares, se describen moléculas de ADNc que pueden usarse para producir moléculas de iARN que son complementarias a todo o parte de un Diabrotica ncm (por ejemplo, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:77) o un Meligethes ncm (por ejemplo, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88 y SEQ ID NO:93).

Además, se describen medios para inhibir la expresión de un gen esencial en una plaga de coleópteros, y medios para proporcionar resistencia a plagas de coleópteros a una planta. Un medio para inhibir la expresión de un gen esencial en una plaga de coleópteros es una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria que consiste de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 79-82; y complementos de estos. Los equivalentes funcionales de los medios para inhibir la expresión de un gen esencial en una plaga de coleópteros incluyen moléculas de ARN monocatenarias o bicatenarias que son sustancialmente homólogas a todo o parte del complemento del producto de expresión de ARN de un gen ncm de un organismo del orden de los coleópteros, que comprende la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88 o SEQ ID NO:93. Un medio para proporcionar resistencia a plagas de coleópteros a una planta es una molécula de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un medio para inhibir la expresión de un gen esencial en una plaga de coleópteros operativamente unido a un promotor, en donde la molécula de a Dn es capaz de integrarse dentro del genoma de una planta de maíz.

Se describen métodos para controlar una población de plagas de insectos (por ejemplo, una plaga de coleópteros), que comprende proporcionar a una plaga de insectos (por ejemplo, una plaga de coleópteros) una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds, siARN, shARN, miARN y hpARN) que funciona tras ser absorbido por la plaga para inhibir una función biológica dentro de la plaga, en donde la molécula de iARN comprende todo o parte de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO:78; el complemento de SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; el complemento de SEQ ID NO:79; SEQ ID NO:80; el complemento de SEQ ID N0: 80; SEQ ID NO:81; el complemento de SEQ ID NO:81; SEQ ID NO:82; el complemento de SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:83; el complemento de Se Q ID NO:83; un polinucleótido que se hibrida con un polinucléotido codificante nativo de un organismo Diabrotica (por ejemplo, WCR) que comprende todo o parte de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:77; el complemento de un polinucleótido que se hibrida con un polinucléotido codificante nativo de un organismo Diabrotica que comprende todo o parte de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:77; SEQ ID NO:95; el complemento de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; el complemento de SEQ ID NO:96; SEQ ID NO:97; el complemento de SEQ ID NO:97; SEQ ID NO:98; el complemento de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; el complemento de SEQ ID NO:99; un polinucleótido que se hibrida con un polinucléotido codificante nativo de un organismo Meligethes (por ejemplo, PB) que comprende todo o parte de cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93; y el complemento de un polinucleótido que se hibrida con un polinucléotido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende todo o parte de cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93.

En modalidades particulares, un iARN que funciona tras ser absorbido por una plaga de insectos para inhibir una función biológica dentro de la plaga se transcribe a partir de un ADN que comprende todo o parte de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ; SEQ ID NO:84; el complemento de SeQ ID NO:84; SEQ ID NO:86; el complemento de SEQ ID NO:86; SEQ ID NO:88; el complemento de SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:93; el complemento de SEQ ID NO:93; un polinucléotido codificante nativo de un organismo Meligethes (por ejemplo, PB) que comprende todo o parte de cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93; y el complemento de un polinucléotido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende todo o parte de cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93.

También se describen en la presente descripción métodos en donde se pueden proporcionar ARNdss, siARNs, shARNs, miARNs y/o hpARNs a una plaga de insectos en un ensayo basado en la dieta, o en células vegetales genéticamente modificadas que expresan los ARNdss, siARNs, shARNs, miARNs y/o hpARNs. En estos y otros ejemplos, los ARNdss, siARNs, shARNs, miARNs y/o hpARNs pueden ser ingeridos por la plaga. La ingestión de ARNdss, siARNs, shARNs, miARNs y/o hpARNs como lo descrito en la presente descripción entonces puede resultar en ARNi en la plaga, lo que a su vez puede resultar en el silenciamiento de un gen esencial para la viabilidad de la plaga y, conduce en última instancia a la mortalidad. Por lo tanto, se describen métodos en donde se describen moléculas de ácido nucleico que comprenden polinucleótidos ilustrativos útiles para el control parental de plagas de insectos de una plaga de insectos. En ejemplos particulares, una plaga de coleópteros controlada mediante el uso de moléculas de ácido nucleico de la invención puede ser WCR, NCR, SCR, D. undecimpunctata howardi, D. balteata, D. undecimpunctata tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, o Meligethes aeneus.

Las características anteriores y otras se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias modalidades, que procede con referencia a las figuras acompañantes 1-2.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 incluye una representación de una estrategia usada para proporcionar ARNds a partir de un solo molde de transcripción con un solo par de cebadores.

La Figura 2 incluye una representación de una estrategia usada para proporcionar ARNds a partir de dos moldes de transcripción.

Listado de secuencias

Las secuencias de ácido nucleico enumeradas en el listado de secuencias acompañantes se muestran mediante el uso de las abreviaturas de letras estándares para las bases nucleotídicas, como se define en 37 C.F.R. § 1.822. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos enumeradas definen moléculas (es decir, polinucleótidos y polipéptidos, respectivamente) que tienen los monómeros de nucleótidos y aminoácidos dispuestos de la manera descrita. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos enumeradas también definen un género de polinucleótidos o polipéptidos que comprenden los monómeros de nucleótidos y aminoácidos dispuestos de la manera descrita. En vista de la redundancia del código genético, se debe entender que una secuencia de nucleótidos que incluye una secuencia codificante también describe el género de polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido como un polinucleótido que consiste de la secuencia de referencia. Se entenderá además que una secuencia de aminoácidos describe el género de los polinucleótidos ORF que codifican ese polipéptido.

Se muestra solo una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria se incluye mediante cualquier referencia a la cadena mostrada. Como el complemento y el complemento inverso de una secuencia de ácido nucleico primaria se describen necesariamente por la secuencia primaria, la secuencia complementaria y la secuencia complementaria inversa de una secuencia de ácido nucleico se incluyen por cualquier referencia a la secuencia de ácido nucleico, a menos que se establezca explícitamente que es de cualquier otra manera (o está claro que es de cualquier otra manera a partir del contexto en el que aparece la secuencia). Además, como se entiende en la técnica, la secuencia de nucleótidos de una cadena de ARN está determinada por la secuencia de ADN a partir de la cual se transcribió (pero por la sustitución de las nucleobases de uracilo (U) portimina (T)), una secuencia de ARN se incluye por cualquier referencia a la secuencia de ADN que la codifica. En el listado de secuencia acompañante:

La SEQ ID NO:1 muestra un marco de lectura abierto de ADN ilustrativo Diabrotica ncm:

ATGCCAGATACCAAGGATGCCAAGGATACCAAGGATGCTAATTTGAGTTCTCCTGA

ACGTAAAAGACGAAGAAAGAGTAGATCTAAATCTCCAGAACGAAAAGAGAAAAAGT

CTTCCAAAAAGAAAGCCCACAATAGTAGAGACAGAGATTCATCAGAGGAAGGTTAC

AACCCTAAAGATTATCAGAGATACTATGGGGAAGATCGCCCAAACAGTGACAAATA

TTGGAATAAATATCCAAGGAAAGATACTACCAAAGTTGGCCAAAGATACTATGATG

CGGCTCCCGAAGAATCTGGCAAGAAGGGGCCAGATAGAAATTCAGAGGAGAAGGAG

TTACCAAAGCCAATGGAGTCTGTTCCTGATAAATCAGTCATCAAACCAAGAGAAAG

AAAAACTGTAGATATGTTAACATCGAGGACTGGTGGTGCTTATATTCCCCCAGCTA

AGCTACGATTGTTACAAGCCAGTATTACAGACAAAACATCAGCAGCCTATCAGCGT

ATAGCATGGGAAGCCTTAAAGAAATCCGTTCATGGTTACATTAATAAAATTAACAC

CTCGAATATTGGCATCATCGCCAGAGAATTATTGCATGAAAATATAGTAAGAGGTA

GAGGTTTGCTGTGCAAGTCAATAATACAAGCACAAGCAGCATCTCCTACTTTTACA

AACGTTTACGCAGCCTTAGTAGCTGTTATTAATTCGAAGTTTCCAAGTATAGGAGA

GCTTTTATTGAAGAGGTTGGTTTTGCAGTTCAAAAGAGGGTTTAAACAAAATAATA

AGTCTATTTGCATATCGGCTACTACTTTCGTAGCTCATTTAGTAAATCAGAGAGTG

GCACATGAAATTTTGGCTTTGGAGATACTTACATTGTTGGTGGAGACTCCTACAGA

TGATTCTGTGGAGGTGGCCATTTCATTTTTGAAGGAATGTGGACAAAAACTGACAG

AAGTTTCAAGTAGAGGTATTACTGCTATATTTGAGATGTTAAGAAACATTTTACAT

GAAGGC CAGC T AGAAAAAAAGAAT T CAGTACAT GAT T GA

La SEQ ID NO:2 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NCM de Diabrotica codificado por un ADN ilustrativo Diabrotica ncm:

MRGGVSDDMTSTCVQGGIRPIGRYQPNMLMEPSSPQSAWQFHPAMPKREPVDHDGR

NDSGLASGGEFISSSPGSDNSEHFSASYSSPTSCHTVISTNTYYPTNLRRPSQAQT

SIPTHMMYTGDHNPLTPPNSEPMISPKSVLSRNNEGEHQTTLTPCASPEDASVDAT

DSVNCDGALKKLQATFEKNAFSEGSGDDDTKSDGEAEEYDEQGLRVPKVNSHGKIK

TFKCKQCDFVAITKLVFWEHTKLHIKADKLLKCPKCPFVTEYKHHLEYHLRNHYGS

KPFKCNQCSYSCVNKSMLNSHLKSHSNIYQYRCSDCSYATKYCHSLKLHLRKYSHK

PAMVLNPDGTPNPLPIIDVYGTRRGPKMKSEQKSSEEMSPKPEQVLPFPFNQFLPQ

MQLPFPGFPLFGGFPGGIPNPLLLQNLEKLARERRESMNSSERFSPAQSEQMDTDA

GVLDLSKPDDSSQTNRRKDSAYKLSTGDNSSDEEDDEATTTMFGNVEVVENKELED

TSSGKQTPTSAKKDDYSCQYCQINFGDPVLYTMHMGYHGYKNPFICNMCGEECNDK

VSFFLHIARNPHS

GATGCGGCTCCCGAAGAATCTGGCAAGAAGGGGCCAGATAGAAATTCAGAGGAGAA

GGAGTTACCAAAGCCAATGGAGTCTGTTCCTGATAAATCAGTCATCAAACCAAGAG

AAAGAAAAACTGTAGATATGTTAACATCGAGGACTGGTGGTGCTTATATTCCCCCA

GCTAAGCTACGATTGTTACAAGCCAGTATTACAGACAAAACATCAGCAGCCTATCA

GCGTATAGCATGGGAAGCCTTAAAGAAATCCGTTCATGGTTACATTAATAAAATTA

ACACCTCGAATATTGGCATCATCGCCAGAGAATTATTGCATGAAAATATAGTAAGA

GGTAGAGGTTTGCTGTGCAAGTCAATAATACAAGCACAAGCAGCATCTCCTACTTT

TACAAACGTTTACGCAGCC

CCCTTAGTAAAGAAATCTTAGGCAGTGATGGTGAGTCTGAATCAGGTTCCGAAGGT

T CAGAAGAGGAAT C T GAT AAT GAAAAT GAGGAC GAAGT CAAGGAC CAGGGAACAAT

TATTGACAATACTGAAACGAATTTAATTTCTCTTAGAAGAACCATATATTTGACTA

TTCAGTCTAGTTTAGATTTTGAAGAATGTGCACATAAGCTACTGAAGATGGAGTTG

AAACCTGGACAAGAAATAGAATTGTGTCACATGTTTCTTGACTGCTGCGCAGAACA

AAGAACCTACGAAAAGTTTTATGGTCTTTTGGCTCAAAGATTTTGTCAAATCAACA

AAGTGTATATCGAGCCTTTCCAACAAATTTTTAAAGATACCTATTCTACCACTCAC

AGACTAGATGCTAAC

CAGT CAT CAAAC CAAGAGAAAGAAAAAC T GTAGATAT GT TAACAT C GAGGAC T GGT

GGTGCTTATATTCCCCCAGCTAAGCTACGATTGTTACAAGCCAGTATTACAGACAA

AACATCAGCAGCCTATCAGCGTATAGCATGGGAAGCCTTAAAGAAATCCGTTCATG

GTTACATTAA

ATTGGCATCATCGCCAGAGAATTATTGCATGAAAATATAGTAAGAGGTAGAGGTTT

GCTGTGCAAGTCAATAATACAAGCACAAGCAGCATCTCCTACTTTTACAAACGTTT

ACGCAGCC

La SEQ ID NO:7 muestra la secuencia de nucleótidos de un promotor de fago T7.

La SEQ ID NO:8 muestra un gen ilustrativo YFP.

Las SEQ ID NOs: 9-16 muestran cebadores usados para la amplificación por PCR de secuencias ncm que comprenden ncm reg1, ncm reg2, ncm v1, y ncm v2, usados en algunos ejemplos para la producción de ARNds.

La SEQ ID NO:17 muestra un ADN ilustrativo que codifica un ARN Diabrotica ncm v2; que contiene un polinucleótido de sentido, una secuencia de lazo (subrayado) y un polinucleótido antisentido (fuente en negrita):

GGCTGCGTAAACGTTTGTAAAAGTAGGAGATGCTGCTTGTGCTTGTATTATTGACT

TGCACAGCAAACCTCTACCTCTTACTATATTTTCATGCAATAATTCTCTGGCGATG

ATGCCAATGAAACTAGTACCAGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCAT

CAGAAAGTCATTGTGTATATCTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTTCCCTT

CCGTAGTCAGAGTCATCAATCAGCTGCACCGTGTCGTAAAGCGGGACGTTCGCAAG

C T C GT C C GC GGT TAATTGGCATCATCGCCAGAGAATTATTGCATGAAAATATAGTA

AGAGGTAGAGGTTTGCTGTGCAAGTCAATAATACAAGCACAAGCAGCATCTCCTAC

TTTTACAAACGTTTACGCAGCC

La SEQ ID NO:18 muestra un ADN ilustrativo que codifica un YFP v2

ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGA

AGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCT

CAGTGGGAAAGGTTGATGCACAGTTCATCTGCACAACTGGTGATGTTCCTGTGCCT

TGGAGCACACTTGTCACCACTCTCACCTATGGAGCACAGTGCTTTGCCAAGTATGG

TCCAGAGTTGAAGGACTTCTACAAGTCCTGTATGCCAGATGGCTATGTGCAAGAGC

GCACAATCACCTTTGAAGGAGATGGCAACTTCAAGACTAGGGCTGAAGTCACCTTT

GAGAAT GGGTCTGTCT ACAATAGGGT CAAAC T CAAT GGT CAAGGC T T CAAGAAAGA

TGGTCATGTGTTGGGAAAGAACTTGGAGTTCAACTTCACTCCCCACTGCCTCTACA

TCTGGGGTGACCAAGCCAACCACGGTCTCAAGTCAGCCTTCAAGATCTGTCATGAG

ATTACTGGCAGCAAAGGCGACTTCATAGTGGCTGACCACACCCAGATGAACACTCC

CATTGGTGGAGGTCCAGTTCATGTTCCAGAGTATCATCACATGTCTTACCATGTGA

AACTTTCCAAAGATGTGACAGACCACAGAGACAACATGTCCTTGAAAGAAACTGTC

AGAGCTGTTGACTGTCGCAAGACCTACCTTTGA

La SEQ ID NO:19 muestra un ADN ilustrativo que comprende un lazo:

AGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCATCAGAAAGTCATTGTGTATAT

CTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTTCCCTTCCGTAGTCAGAGTCATCAAT

CAGCTGCACCGTGTCGTAAAGCGGGACGTTCGCAAGCTCGT

La SEQ ID NO:20 muestra un gen ilustrativo YFP.

La SEQ ID NO:21 muestra una secuencia de ADN de anexina región 1.

La SEQ ID NO:22 muestra una secuencia de ADN de anexina región 2.

La SEQ ID NO:23 muestra una secuencia de ADN de beta espectrina 2 región 1.

La SEQ ID NO:24 muestra una secuencia de ADN de beta espectrina 2 región 2.

La SEQ ID NO:25 muestra una secuencia de ADN de mtRP-L4 región 1.

La SEQ ID NO:26 muestra una secuencia de ADN de mtRP-L4 región 2.

Las SEQ ID NOs: 27-54 muestran cebadores usados para amplificar regiones génicas de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4, y YFP para la síntesis de ARNds.

La SEQ ID NO:55 muestra una secuencia de ADN de maíz que codifica una proteína similar a TIP41.

La SEQ ID NO:56 muestra la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido cebador T20VN.

Las SEQ ID NOs: 57-61 muestran cebadores y sondas usadas para el análisis de la expresión de transcripción de ARNds.

La SEQ ID NO:62 muestra una secuencia de nucleótidos de una porción de una región codificante SpecR usada para la detección de la cadena principal de vectores binarios.

La SEQ ID NO:63 muestra una secuencia de nucleótidos de una región codificante AAD1 usada para el análisis del número de copias genómicas.

La SEQ ID n O:64 muestra una secuencia de ADN de un gen de invertasa de maíz.

Las SEQ ID NOs: 65-73 muestran las secuencias de nucleótidos de los oligonucleótidos de ADN usados para las determinaciones del número de copias de genes y la detección de la cadena principal del vector binario.

Las SEQ ID NOs: 74-76 muestran cebadores y sondas usadas para el análisis de la expresión de transcripción de ARNds del maíz.

La SEQ ID NO:77 muestra un cóntigo que comprende un ADN de Diabrotica ncm ilustrativo:

ATTACCAAATGTCAATGTCACTCATTACTCATTACCAAATGTCAATGTCACTGTCA

GGTAACGTGCAATGCAAATTGTCAATGTCAAACTTAAAAATATTTTCCTGCAACTG

CATCAAATTGTAAATTTTATTTTTTTTAAATATGCCAGATACCAAGGATGCCAAGG

ATACCAAGGATGCTAATTTGAGTTCTCCTGAACGTAAAAGACGAAGAAAGAGTAGA

TCTAAATCTCCAGAACGAAAAGAGAAAAAGTCTTCCAAAAAGAAAGCCCACAATAG

TAGAGACAGAGATTCATCAGAGGAAGGTTACAACCCTAAAGATTATCAGAGATACT

ATGGGGAAGATCGCCCAAACAGTGACAAATATTGGAATAAATATCCAAGGAAAGAT

ACTACCAAAGTTGGCCAAAGATACTATGATGCGGCTCCCGAAGAATCTGGCAAGAA

GGGGCCAGATAGAAATTCAGAGGAGAAGGAGTTACCAAAGCCAATGGAGTCTGTTC

CTGATAAATCAGTCATCAAACCAAGAGAAAGAAAAACTGTAGATATGTTAACATCG

AGGACTGGTGGTGCTTATATTCCCCCAGCTAAGCTACGATTGTTACAAGCCAGTAT

TACAGACAAAACATCAGCAGCCTATCAGCGTATAGCATGGGAAGCCTTAAAGAAAT

CCGTTCATGGTTACATTAATAAAATTAACACCTCGAATATTGGCATCATCGCCAGA

GAATTATTGCATGAAAATATAGTAAGAGGTAGAGGTTTGCTGTGCAAGTCAATAAT

ACAAGCACAAGCAGCATCTCCTACTTTTACAAACGTTTACGCAGCCTTAGTAGCTG

TTATTAATTCGAAGTTTCCAAGTATAGGAGAGCTTTTATTGAAGAGGTTGGTTTTG

CAGTTCAAAAGAGGGTTTAAACAAAATAATAAGTCTATTTGCATATCGGCTACTAC

TTTCGTAGCTCATTTAGTAAATCAGAGAGTGGCACATGAAATTTTGGCTTTGGAGA

TACTTACATTGTTGGTGGAGACTCCTACAGATGATTCTGTGGAGGTGGCCATTTCA

TTTTTGAAGGAATGTGGACAAAAACTGACAGAAGTTTCAAGTAGAGGTATTACTGC

TATATTTGAGATGTTAAGAAACATTTTACATGAAGGCCAGCTAGAAAAAAAGAATT

CAGTACATGATTGAAGTTATGTTTCAAATAAGGAAAGACGGATTTAAGGATCATGC

TGCTGTCGTAGAAGAATTAGATTTAGTAGAAGAGGAAGATCAATTCACTCATCTTA

TTATGTTAGATGATGTTAAAGAGGCTGATGCAGAGGATATATTGAATGTGTTCAAA

T T T GAT GAGAG T T AT GAAGAAAAT GAAGAT AAAT ACAAAAC C C T TAG TAAAGAAAT

CTTAGGCAGTGATGGTGAGTCTGAATCAGGTTCCGAAGGTTCAGAAGAGGAATCTG

ATAATGAAAATGAGGACGAAGTCAAGGACCAGGGAACAATTATTGACAATACTGAA

ACGAATTTAATTTCTCTTAGAAGAACCATATATTTGACTATTCAGTCTAGTTTAGA

TTTTGAAGAATGTGCACATAAGCTACTGAAGATGGAGTTGAAACCTGGACAAGAAA

TAGAATTGTGTCACATGTTTCTTGACTGCTGCGCAGAACAAAGAACCTACGAAAAG

TTTTATGGTCTTTTGGCTCAAAGATTTTGTCAAATCAACAAAGTGTATATCGAGCC

TTTCCAACAAATTTTTAAAGATACCTATTCTACCACTCACAGACTAGATGCTAACA

GGTTAAGAAACGTCAGCAAATTTTTTGCGCATTTACTTTTTACGGATGCCATTGGA

TGGGAAGTCCTTGACATCATGAAATTGAATGAAGAGGATACCAATAGTTCTAGTAG

GATTTTCATAAAAATCTTGTTTCAAGAATTGGCTGAATATATGGGACTAGGAAAAT

TAAACGCAAGGCTAAAGGATGAGACCCTGCAGGCTTATTTTTCAGGACTGTTTCCT

AGAGATAACCCAAAGAATACCAGATTTTCTATTAATTTTTTTACCTCTATCGGTTT

GGGAGGATTAACTGATGAACTCAGAGAACATTTAAAAAATATTCCAAAAATGATGG

AAATGAAGTTAGCCACTAAAGAAAAGGAAAGCAGTGGTAGTAGTAGTTCAGAAAGT

AGTTCTGAGGAAGATAGTAGTGACGACAGCTCTGAAGATTCATCAAGTTCTGAAGA

C GATAGAGGCAAAAAGAAGAAAAAAAC CAAAAAGC TAGAAGAAAAAAAT T C GAAAG

TAAATTCTAAGTCTAGACCTAGATCAAAAGAGAAAGAACACGCAGACAAACCTAGA

GACAAACATAGAAAGGAAGATAGACATAAATCTGACAAAAATCCCGATAGATCCTC

GT C CAAAAAAT AT T C T AAAGAAGATAACAAGAGGAAGAAAGAC TAC GAAT GGAT GA

AGAGCAGATATGAAGATGATATTAAGCAATTAAAAAACGATAAAAGGGTATTTGAA

AAGT C T T C CAAAC GAC GAT CAAGAT C TAGAGACAGGGTAAAAGT CAAGGAAGAGC G

TAGACGTAGAAGCAGAGAAAGAAGAAGGAGCTAAGATAATTTTTTAATAAGGATCT

ATGTATATTTATGTAAACATTTATTTAATACATGTTTTTTAAAAAAAAA

Las SEQ ID NOs: 78-83 muestran ARN ilustrativos transcritos a partir de ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos ilustrativos de Diabrotica ncm y fragmentos de estos.

La SEQ ID NO:84 muestra un cóntigo que comprende un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

GCAATTTCGTTTTTGAAGGAAAGTGGTCAAAAACTCACTGAGGTGTCGAGTAAAGG

TATCAATGCCATATTTGAGATGTTGAGGAATATTCTGCATGAAGGACAGTTGGAGA

AGAGAATACAGTACATGATTGAAGTCATGTTCCAAGTTCGGAAAGATGGTTTCAAG

GATCATGCTGCTGTTACTGAAGAACTAGATATTGTTGAAGAGGAAGATCAGTTTAC

TCACCTAATCACATTGGATGATGTTAAACAAGCTAACTCAGAGGATATATTGAATG

TGTTTAAATTTGATGATAAATATGAGGAAAATGAGGGTAAATACAAAACTTTAAGT

AAGGAAATTCTCCAGTCAGACAGTGAATCAGGCGAATCTGGTTCAGAGGGGTCTGA

AGAAGACTCGGAAGATGAAGAAGGTGAAGAAGATGAAACCAAAAATCAAACCATTA

TTGATAACACAGAAACTAATTTAATCACCTTAAGGAGAACCATCTATCTCACAATA

CAATCCAGTTTGGATTTTGAGGAATGTGCCCATAAATTGATGAAAATGGAGATCAA

ACCTGGACAAGAGATTGAATTGTGTCACATGTTCCTTGATTGTTGCGCTGAACAGC

GTACCTACGAAAAATTCTTCGGCCTCCTCTCGCAGCGCTTCTGCCAAATAAACAAG

ACTTTCATCGAACCGTTCCAACAAATTTTCAAAGATACCTATTCCACAACTCACAG

ACTTGACGCCAATCGATTGAGAAACGTTAGCAAATTCTTCGCGCATTTATTGTTCA

CCGACGCCATCGGCTGGGAAGTGCTCGATATCATGAAATTAAACGAGGAAGACACC

AACAGTTCCAGCAGGATTTTCATCAAGATTTTGTTCCAGGAGTTGTCCGAATATAT

GGGATTAGCGAAGTTGAATAAAAGGCTAAAGGATGAAACTTTACAGGAATATTTCG

CGGGGCTATTTCCGAGGGATAACCCGAAGAACACGCGTTTCGCCATCAATTTTTTC

ACGTCGATCGGTTTAGGAGGTCTAACGGACGAGTTGAGGGAGCACTTGAAAAACGT

GCCAAAACATCTGGAAGTGATGGCTTTGAAAGCAGATTCGAGCAGCTCTAGCAGCA

GTAGCAGCAGTTCCAGTAACGATTCCAGCAGCAGTTCAGATTCTTCCGATGACGAG

GGTTCCAGGAAGAAGAAAACAAAAAAATTGAAAACCCCGGACAAAAAGAAGAAACA

GAAAGAAGATGAAAAACCCAAAAAGAAAAGCGAGGATAAACCGAGGAACAAACCAG

ACTATAGAGATAGAAGAAACGACGACAGGGAAAAGTTTAAAAAATACAGAAACAAC

GACGAAGAAAGCCACAGAAGAAGCAGAGAAGATGCAAGAGAAAAATACAGAGGTCA

CGAGGAAAGAAGAAGCGACCACAGAGAAGAATACCGGCCGAGAGAACATAGAGGTA

GAGATAGACGTTAGTTGTATAATAATGTATATTTTTTCGTATTTAATAAAATAAAT

TATACATTTTATAGTGTTTCGGAGCATTCACCAAGCAAGGGTTTTACTTTCGGATA

GCAATGGTGTAGTACGTTTTTGAAGGTGTCCACACACACCAAGCCGGTTTTATCTA

AATCTAGAGCTATCTTCCAAAAGTCTTCAAAGGA

La SEQ ID NO:85 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NCM de Meligethes aeneus codificado por un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

AISFLKESGQKLTEVSSKGINAIFEMLRNILHEGQLEKRIQYMIEVMFQVRKDGFK

DHAAVTEELDIVEEEDQFTHLITLDDVKQANSEDILNVFKFDDKYEENEGKYKTLS

KEILQSDSESGESGSEGSEEDSEDEEGEEDETKNQTIIDNTETNLITLRRTIYLTI

QSSLDFEECAHKLMKMEIKPGQEIELCHMFLDCCAEQRTYEKFFGLLSQRFCQINK

TFIEPFQQIFKDTYSTTHRLDANRLRNVSKFFAHLLFTDAIGWEVLDIMKLNEEDT

NSSSRIFIKILFQELSEYMGLAKLNKRLKDETLQEYFAGLFPRDNPKNTRFAINFF

TSIGLGGLTDELREHLKNVPKHLEVMALKADSSSSSSSSSSSSNDSSSSSDSSDDE

GSRKKKTKKLKTPDKKKKQKEDEKPKKKSEDKPRNKPDYRDRRNDDREKFKKYRNN

DEESHRRSREDAREKYRGHEERRSDHREEYRPREHRGRDRR

La SEQ ID NO:86 muestra un cóntigo que comprende un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

CCACACGAATTGACTGGTTAATTAAAAATAAGCACAAGAAACGAATAACACTACAA

TGGTTTGAATTTACACAAAAAAAAAAATGTAGTCACTACCATTGTAGTGTTATTCG

TTTCTTGTGCTTATTTTTAATTAACCAGTCAATTCGTGTGGTGTAGTGAACAAAGG

TTATAGTTATGACGACGGATTCCGAGAGAGGTTCCCCTACAGCTGCGGCTCCACGC

AGAAGCGCCTCGAAATCGCCAGAACCAAAAAAAGCAAAGTACGATAAGAAAGAGAA

GGGCGATAAAGATCGCAAGAGGAGATCCCACAGATCCAGATCTAGATCCAGGGATA

GAGACCATAGGGACAAACATGGTGGAAAAAAACGTTACCACGACCTGGACGACCCT

TCTGAAGACTACCCAAGATATTATGGCGAGGATAGAAAACAGAACAGTGACAGATA

TTGGTCCAAGTACCCAAAGAAAGACAGGGACGAATATGTTATTGGTAGCCGGTATT

AT GAT GT T GAGGAAAAGAAGGAGAAAAAAGAAAAAGAGGAT GAAAAT AAGGAT AAA

TCCGTCATCACTCCAAGGGAAAGGAAAACAGTGGACTTACTAACATCTCGAACAGG

TGGGGCTTATATACCTCCAGCTAAATTACGTATGATGCAGGCTGAGATAACTGATA

AATCATCAGCTGCATATCAAAGAATTGCCTGGGAAGCTTTAAAAAAGTCCATTCAT

GGTTACATCAACAAAATTAACACTTCCAATATTGGTCTTATTGCTAGAGAATTACT

GCATGAAAACATTGTAAGAGGTAGAGGTTTGCTGTGTAAATCTATAATACAAGCAC

AGGCAGCTTCCCCGACGTTCACCAATGTTTATGCAGCTTTAGTTGCAGTCATAAAT

TCAAAATTCCCCAACATTGGAGAACTGTTACTGAAAAGGTTGGTTTTGCAGTTTAA

AAGGGGTTTCAAGCAGAACAACAAGTCTATCTGTATATCGGCTGCTACCTTTGTCG

CGCATTTAGTAAACCAAAGAGTGGCCCACGAAATTTTAGCATTGGAAATTCTTACT

TTACTTGTTGAGTCCCCCACAGATGATTCAGTGGAAGTAGCAATTTCGTTTTTGAA

GGAAAGTGGTCAAAAACTCACTGAGGTGTCGAGTAAAGGTATCAATGCCATATTTG

AGATGTTGAGGAATATTCTGCATGAAGGACAGTTGGAGAAGAGAATACAGTACATG

ATTGAAGTCATGTTCCAAGTTCGGAAAGATGGTTTCAAGGATCATGCTGCTGTTAC

TGAAGAACTAGATATTGTTGAAGAGGAAGATCAGTTTACTCACCTAATCACATTGG

ATGATGTTAAACAAGCTAACTCAGAGGATATATTGAATGTGTTTAAATTTGATGAT

AAATATGAGGAAAATGAGGGTAAATACAAAACTTTAAGTAAGGAAATTCTCCAGTC

AGACAGTGAATCAGGCGAATCTGGTTCAGAGGGGTCTGAAGAAGACTCGGAAGATG

AAGAAGGTGAAGAAGATGAAACCAAAAATCAAACCATTATTGATAACACAGAAACT

AATTTAATCACCTTAAGGAGAACCATCTATCTCACAATACAATCCAGTTTGGATTT

T GAGGAAT GT GC C CAT AAAT T GAT GAAAAT GGAGAT CAAAC C T GGACAAGAGAT T G

AATTGTGTCACATGTTCCTTGATTGTTGCGCTGAACAGCGTACCTACGAAAAATTC

TTCGGCCTCCTCTCGCAGCGCTTCTGCCAAATAAACAAGACTTTCATCGAACCGTT

CCAACAAATTTTCAAAGATACCTATTCCACAACTCACAGACTTGACGCCAATCGAT

TGAGAAACGTTAGCAAATTCTTCGCGCATTTATTGTTCACCGACGCCATCGGCTGG

GAAGTGCTCGATATCATGAAATTAAACGAGGAAGACACCAACAGTTCCAGCAGGAT

TTTTATCAAGATTTTGTTCCAGGAGTTGTCCGAATATATGGGATTAGCGAAGTTGA

ATAAAAGGCTAAAGGATGAAACTTTACAGGAATATTTCGCGGGGCTATTTCCGAGG

GATAACCCGAAGAACACGCGTTTCGCCATCAATTTTTTCACGTCGATCGGTTTAGG

AGGTCTAACGGACGAGTTGAGGGAGCACTTGAAAAACGTGCCAAAACATCTGGAAG

TGATGGCTTTGAAAGCAGATTCGAGCAGCTCTAGCAGCAGTAGCAGCAGTTCCAGT

AAC GAT T C CAGCAGCAGT T CAGAT T C T T C C GAT GAC GAGGGT T C CAGGAAGAAGAA

AACAAAAAAAT T GAAAAC C C C GGACAAAAAGAAGAAACAGAAAGAAGAT GAAAAAC

CCAAAAAGAAAAGCGAGGATAAACCGAGGAACAAACCAGACTATAGAGATAGGAGA

AAC GAC GACAGGGAAAAGT T T AAAAAAT ACAGAAACAAC GAC GAAGAAAGC CACAG

AAGAAGCAGAGAAGATGCAAGAGAAAAATACAGAGGTCACGAGGAAAGAAGACGAG

GCCGAGAAGACCAAACGCGAAGAGGACAAGACCAAGTTCCAAGGTTTGTGC

La SEQ ID NO:87 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NCM de Meligethes aeneus codificado por un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

MTTDSERGSPTAAAPRRSASKSPEPKKAKYDKKEKGDKDRKRRSHRSRSRSRDRDH

RDKHGGKKRYHDLDDPSEDYPRYYGEDRKQNSDRYWSKYPKKDRDEYVIGSRYYDV

EEKKEKKEKEDENKDKSVITPRERKTVDLLTSRTGGAYIPPAKLRMMQAEITDKSS

AAYQRIAWEALKKSIHGYINKINTSNIGLIARELLHENIVRGRGLLCKSIIQAQAA

SPTFTNVYAALVAVINSKFPNIGELLLKRLVLQFKRGFKQNNKSICISAATFVAHL

VNQRVAHEILALEILTLLVESPTDDSVEVAISFLKESGQKLTEVSSKGINAIFEML

RNILHEGQLEKRIQYMIEVMFQVRKDGFKDHAAVTEELDIVEEEDQFTHLITLDDV

KQANSEDILNVFKFDDKYEENEGKYKTLSKEILQSDSESGESGSEGSEEDSEDEEG

EEDETKNQTIIDNTETNLITLRRTIYLTIQSSLDFEECAHKLMKMEIKPGQEIELC

HMFLDCCAEQRTYEKFFGLLSQRFCQINKTFIEPFQQIFKDTYSTTHRLDANRLRN

VSKFFAHLLFTDAIGWEVLDIMKLNEEDTNSSSRIFIKILFQELSEYMGLAKLNKR

LKDETLQEYFAGLFPRDNPKNTRFAINFFTSIGLGGLTDELREHLKNVPKHLEVMA

LKADSSSSSSSSSSSSNDSSSSSDSSDDEGSRKKKTKKLKTPDKKKKQKEDEKPKK

KSEDKPRNKPDYRDRRNDDREKFKKYRNNDEESHRRSREDAREKYRGHEERRRGRE

DQTRRGQDQVPRFV

La SEQ ID NO:88 muestra un cóntigo que comprende un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

AAATGTAGTCACTACCATTGTAGTGTTATTCGTTTCTTGTGCTTATTTTTAATTAA

CCAGTCAATTCGTGTGGTGTAGTGAACAAAGGTTATAGTTATGACGACGGATTCCG

AGAGAGGTTCCCCTACAGCTGCGGCTCCACGCAGAAGCGCCTCGAAATCGCCAGAA

C CAAAAAAAGCAAAGTAC GATAAGAAAGAGAAGGGC GATAAAGAT C GCAAGAGGAG

ATCCCACAGATCCAGATCTAGATCCAGGGATAGAGACCATAGGGACAAACATGGTG

GAAAAAAACGTTACCACGACCTGGACGACCCTTCTGAAGACTACCCAAGATATTAT

GGCGAGGATAGAAAACAGAACAGTGACAGATATTGGTCCAAGTACCCAAAAGAAAG

ACAGGGACGAATATGTTATTGGTAACCGGTATTATGATGTTGAGGAAAAGAAGGAG

AAAAAGGAAAAAGAGGAT GAAAAT AAGGAT AAAT C C GT CAT TAC T C CAAGGGAAAG

GAAAACAGTGGACTTACTAACATCTCGAACAGGTGGGGCTTATATACCTCCAGCTA

AATTACGTATGATGCAGGCTGAGATAACTGATAAATCATCAGCTGCATATCAAAGA

ATTGCCTGGGAAGCTTTAAAAAAGTCCATTCATGGTTACATCAACAAAATTAACAC

TTCCAATATTGGTCTTATTGCTAGAGAATTACTGCATGAAAACATTGTAAGAGGTA

GAGGTTTGCTGTGTAAATCTATAATACAAGCACAGGCAGCTTCCCCGACGTTCACC

AATGTTTATGCAGCTTTAGTTGCAGTCATAAATTCAAAATTCCCCAACATTGGAGA

ACTGTTACTGAAAAGGTTGGTTTTGCAGTTTAAAAGGGGTTTCAAGCAGAACAACA

AGTCTATCTGTATATCGGCTGCTACCTTTGTCGCGCATTTAGTAAACCAAAGAGTG

GCTCATGAAATTTTAGCATTGGAAATTCTTACTTTACTTGTTGAGTCCCCCACAGA

TGATTCAGTAGAAGTGAGCAGAACAACAAGTCTATCTGTATATCGGCTGCTACCTT

TGTCGCGCATTTAGTAAACCAAAGAGTGGCCCACGAAATTTTAGCATTGGAAATTC

TTACTTTACTTGTTGAGTCCCCCACAGATGATTCAGTGGAAGTAGCAATTTCGTTT

TTGAAGGAAAGTGGTCAAAAACTCACTGAGGTGTCGAGTAAAGGTATCAATGCCAT

ATTTGAGATGTTGAGGAATATTCTGCATGAAGGACAGTTGGAGAAGAGAATACAGT

ACATGATTGAAGTCATGTTCCAAGTTCGGAAAGATGGTTTCAAGGATCATGCTGCT

GTTACTGAAGAACTAGATATTGTTGAAGAGGAAGATCAGTTTACTCACCTAATCAC

ATTGGATGATGTTAAACAAGCTAACTCAGAGGATATATTGAATGTGTTTAAATTTG

ATGATAAATATGAGGAAAATGAGGGTAAATACAAAACTTTAAGTAAGGAAATTCTC

CAGTCAGACAGTGAATCAGGCGAATCTGGTTCAGAGGGGTCTGAAGAAGACTCGGA

AGAT GAAGAAGGT GAAGAAGAT GAAAC CAAAAAT CAAAC CAT TAT T GATAACACAG

AAACTAATTTAATCACCTTAAGGAGAACCATCTATCTCACAATACAATCCAGTTTG

GATTTTGAGGAATGTGCCCATAAATTGATGAAAATGGAGATCAAACCTGGACAAGA

GATTGAATTGTGTCACATGTTCCTTGATTGTTGCGCTGAACAGCGTACCTACGAAA

AATTCTTCGGCCTCCTCTCGCAGCGCTTCTGCCAAATAAACAAGACTTTCATCGAA

CCGTTCCAACAAATTTTCAAAGATACCTATTCCACAACTCACAGACTTGACGCCAA

TCGATTGAGAAACGTTAGCAAATTCTTCGCGCATTTATTGTTCACCGACGCCATCG

GCTGGGAAGTGCTCGATATCATGAAATTAAACGAGGAAGACACCAACAGTTCCAGC

AGGATTTTCATCAAGATTTTGTTCCAGGAGTTGTCCGAATATATGGGATTAGCGAA

GTTGAATAAAAGGCTAAAGGATGAAACTTTACAGGAATATTTCGCGGGGCTATTTC

CGAGGGATAACCCGAAGAACACGCGTTTCGCCATCAATTTTTTCACGTCGATCGGT

TTAGGAGGTCTAACGGACGAGTTGAGGGAGCACTTGAAAAACGTGCCAAAACATCT

GGAAGTGATGGCTTTGAAAGCAGATTCGAGCAGCTCTAGCAGCAGTAGCAGCAGTT

CCAGTAACGATTCCAGCAGCAGTTCAGATTCTTCCGATGACGAGGGTTCCAGGAAG

AAGAAAACAAAAAAAT T GAAAAC C C C GGACAAAAAGAAGAAACAGAAAGAAGAT GA

AAAACCCAAAAAGAAAAGCGAGGATAAACCGAGGAACAAAGTAAATGGTGATAAGA

ATATAGAAACAGAAGATACACAAGGAGT T GAGGACACAAAAAAGAC T G

La SEQ ID NO:89 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NCM de Meligethes aeneus codificado por un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

MLRNILHEGQLEKRIQYMIEVMFQVRKDGFKDHAAVTEELDIVEEEDQFTHLITL

DDVKQANSEDILNVFKFDDKYEENEGKYKTLSKEILQSDSESGESGSEGSEEDSE

DEEGEEDETKNQTIIDNTETNLITLRRTIYLTIQSSLDFEECAHKLMKMEIKPGQ

EIELCHMFLDCCAEQRTYEKFFGLLSQRFCQINKTFIEPFQQIFKDTYSTTHRLD

ANRLRNVSKFFAHLLFTDAIGWEVLDIMKLNEEDTNSSSRIFIKILFQELSEYMG

LAKLNKRLKDETLQEYFAGLFPRDNPKNTRFAINFFTSIGLGGLTDELREHLKNV

PKHLEVMALKADSSSSSSSSSSSSNDSSSSSDSSDDEGSRKKKTKKLKTPDKKKK

QKEDEKPKKKSEDKPRNKVNGDKNIETEDTQGVEDTKKT

La SEQ ID NO:90 muestra un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm, referido en la presente descripción en algunos lugares como ncm reg1 (región 1), que se usa en algunos ejemplos para la producción de un ARNds:

GTTCCTTGATTGTTGCGCTGAACAGCGTACCTACGAAAAATTCTTCGGCCTCCTCT

CGCAGCGCTTCTGCCAAATAAACAAGACTTTCATCGAACCGTTCCAACAAATTTTC

AAAGATACCTATTCCACAACTCACAGACTTGACGCCAATCGATTGAGAAACGTTAG

CAAATTCTTCGCGCATTTATTGTTCACCGACGCCATCGGCTGGGAAGTGCTCGATA

TCATGAAATTAAACGAGGAAGACACCAACAGTTCCAGCAGGATTTTCATCAAGATT

TTGTTCCAGGAGTTGTCCGAATATATGGGATTAGCGAAGTTGAATAAAAGGCTAAA

GGATGAAACTTTACAGGAATATTTCGCGGGGCTATTTCCGAGGGATAACCCGAAGA

ACACGCGTTTCGCCATCAATTTTTTCACGTCGATCGGTTTAGGAGGTCTAACGGAC

GAGT T GAGGGAGCAC T T GAAAAAC GT GC CAAAACAT C T GGA

Las SEQ ID NOs: 91-92 muestran cebadores usados para amplificar porciones de una secuencia Meligethes aeneus ncm que comprende ncm reg1.

La SEQ ID n O:93 muestra un cóntigo que comprende un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

TTTTTGTTACCAACCAAACGGCCTAAATTTCCCTAGATAACCTAAAATAAAAACAA

CACTTCGTCATTTGTGTAAATTCAAACAAATGTAGTCACTACCATTGTAGTGTTAT

TCGTTTCTTGTGCTTATTTTTAATTAACCAGTCAATTCGTGTGGTGTAGTGAACAA

AGGTTATAGTTATGACGACGGATTCCGAGAGAGGTTCCCCTACAGCTGCGGCTCCA

CGCAGAAGCGCCTCGAAATCGCCAGAACCAAAAAAAGCAAAGTACGATAAGAAAGA

GAAGGGCGATAAAGATCGCAAGAGGAGATCCCACAGATCCAGATCTAGATCCAGGG

ATAGAGACCATAGGGACAAACATGGTGGAAAAAAACGTTACCACGACCTGGACGAC

CCTTCTGAAGACTACCCAAGATATTATGGCGAGGATAGAAAACAGAACAGTGACAG

ATATTGGTCCAAGTACCCAAAGAAAGACAGGGACGAATATGTTATTGGTAGCCGGT

ATTATGATGTTGAGGAAAAGAAGGAGAAAAAGGAAAAAGAGGATGAAAATAAGGAT

AAATCCGTCATTACTCCAAGGGAAAGGAAAACAGTGGACTTACTAACATCTCGAAC

AGGTGGGGCTTATATACCTCCAGCTAAATTACGTATGATGCAGGCTGAGATAACTG

ATAAATCATCAGCTGCATATCAAAGAATTGCCTGGGAAGCTTTAAAAAAGTCCATT

CATGGTTACATCAACAAAATTAACACTTCCAATATTGGTCTTATTGCTAGAGAATT

ACTGCATGAAAACATTGTAAGAGGTAGAGGTTTGCTGTGTAAATCTATAATACAAG

CACAGGCAGCTTCCCCGACATTCACCAATGTTTATGCAGCTTTAGTTGCAGTCATA

AATTCAAAATTCCCCAACATTGGAGAACTGTTACTGAAAAGGTTGGTTTTGCAGTT

TAAAAGGGGTTTCAAGCAGAACAACAAGTCTATCTGTATATCGGCTGCTACCTTTG

TCGCGCATTTAGTAAACCAAAGAGTGGCCCATGAAATTTTAGCATTGGAAATTCTT

ACTTTACTTGTTGAGTCCCCCACAGATGATTCAGTGGAAGTAGCAATTTCGTTTTT

GAAGGAAAGTGGTCAAAAACTCACTGAGGTGTCGAGTAAAGGTATCAATGCCATAT

T T GAGAT GT T GAGGAAT AT T C T GCAT GAAGGACAGT T GGAGAAGAGAATACAGTAC

ATGATTGAAGTCATGTTCCAAGTTCGGAAAGATGGTTTCAAGGATCATGCTGCTGT

TACTGAAGAACTAGATATTGTTGAAGAGGAAGATCAGTTTACTCACCTAATCACAT

TGGATGATGTTAAACAAGCTAACTCAGAGGATATATTGAATGTGTTTAAATTTGAT

GATAAATATGAGGAAAATGAGGGTAAATACAAAACTTTAAGTAAGGAAATTCTCCA

GTCAGACAGTGAATCAGGCGAATCTGGTTCAGAGGGGTCTGAAGAAGACTCGGAAG

ATGAAGAAGGTGAAGAAGATGAAACCAAAAATCAAACCATTATTGATAACACAGAA

ACTAATTTAATCACCTTAAGGAGAACCATCTATCTCACAATACAATCCAGTTTGGA

TTTTGAGGAATGTGCCCATAAATTGATGAAAATGGAGATCAAACCTGGACAAGAGA

TTGAATTGTGTCACATGTTCCTTGATTGTTGCGCTGAACAGCGTACCTACGAAAAA

TTCTTCGGCCTCCTCTCGCAGCGCTTCTGCCAAATAAACAAGACTTTCATCGAACC

GTTCCAACAAATTTTCAAAGATACCTATTCCACAACTCACAGACTTGACGCCAATC

GATTGAGAAACGTTAGCAAATTCTTCGCGCATTTATTGTTCACCGACGCCATCGGC

TGGGAAGTGCTCGATATCATGAAATTAAACGAGGAAGACACCAACAGTTCCAGCAG

GATTTTCATCAAGATTTTGTTCCAGGAGTTGTCCGAATATATGGGATTAGCGAAGT

TGAATAAAAGGCTAAAGGATGAAACTTTACAGGAATATTTCGCGGGGCTATTTCCG

AGGGATAACCCGAAGAACACGCGTTTCGCCATCAATTTTTTCACGTCGATCGGTTT

AGGAGGTCTAACGGACGAGTTGAGGGAGCACTTGAAAAACGTGCCAAAACATCTGG

AAGTGATGGCTTTGAAAGCAGATTCGAGCAGCTCTAGCAGCAGTAGCAGCAGTTCC

AGTAACGATTCCAGCAGCAGTTCAGATTCTTCCGATGACGAGGGTTCCAGGAAGAA

GAAAACAAAAAAATTGAAAACCCCGGACAAAAAGAAGAAACAGAAAGAAGATGAAA

AACCCAAAAAGAAAAGCGAGGATAAACCGAGGAACAAACCAGACTATAGAGATAGA

AGAAAC GAC GACAGGGAAAAGT T T AAAAAAT ACAGAAACAAC GAC GAAGAAAGC CA

CAGAAGAAGCAGAGAAGATGCAAGAGAAAAATACAGAGGTCACGAGGAAAGAAGAA

GCGACCACAGAGAAGAATACCGGCCGAGAGAACATAGAGGTAGAGATAGACGTTAG

TTGTATAATAATGTATATTTTTT

La SEQ ID NO:94 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NCM de Meligethes aeneus codificado por un ADN ilustrativo Meligethes aeneus ncm:

MTTDSERGSPTAAAPRRSASKSPEPKKAKYDKKEKGDKDRKRRSHRSRSRSRDRDH

RDKHGGKKRYHDLDDPSEDYPRYYGEDRKQNSDRYWSKYPKKDRDEYVIGSRYYDV

EEKKEKKEKEDENKDKSVITPRERKTVDLLTSRTGGAYIPPAKLRMMQAEITDKSS

AAYQRIAWEALKKSIHGYINKINTSNIGLIARELLHENIVRGRGLLCKSIIQAQAA

SPTFTNVYAALVAVINSKFPNIGELLLKRLVLQFKRGFKQNNKSICISAATFVAHL

VNQRVAHEILALEILTLLVESPTDDSVEVAISFLKESGQKLTEVSSKGINAIFEML

RNILHEGQLEKRIQYMIEVMFQVRKDGFKDHAAVTEELDIVEEEDQFTHLITLDDV

KQANSEDILNVFKFDDKYEENEGKYKTLSKEILQSDSESGESGSEGSEEDSEDEEG

EEDETKNQTIIDNTETNLITLRRTIYLTIQSSLDFEECAHKLMKMEIKPGQEIELC

HMFLDCCAEQRTYEKFFGLLSQRFCQINKTFIEPFQQIFKDTYSTTHRLDANRLRN

VSKFFAHLLFTDAIGWEVLDIMKLNEEDTNSSSRIFIKILFQELSEYMGLAKLNKR

LKDETLQEYFAGLFPRDNPKNTRFAINFFTSIGLGGLTDELREHLKNVPKHLEVMA

LKADSSSSSSSSSSSSNDSSSSSDSSDDEGSRKKKTKKLKTPDKKKKQKEDEKPKK

KSEDKPRNKPDYRDRRNDDREKFKKYRNNDEESHRRSREDAREKYRGHEERRSDHR

EEYRPREHRGRDRR

Las SEQ ID NOs: 95-99 muestran ARN ilustrativos transcritos a partir de ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos ilustrativos de Meligethes ncm y fragmentos de estos.

Descripción detallada

1. Visión general de diversas modalidades

Desarrollamos la interferencia de ARN (ARNi) como una herramienta para el manejo de plagas de insectos, mediante el uso de una de las especies de plagas objetivo más probables para plantas transgénicas que expresan ARNds; el gusano de la raíz del maíz occidental. Hasta ahora, la mayoría de los genes propuestos como objetivos para el ARNi en las larvas de gusanos de la raíz no logran realmente su propósito. En la presente descripción, describimos la eliminación mediada por ARNi nucampholin (ncm) en la plaga de insectos ilustrativos, el gusano de la raíz del maíz occidental, que se muestra que tiene un fenotipo letal cuando, por ejemplo, el iARN son moléculas suministradas a través de ARNds ncm ingerido. En modalidades en la presente descripción, la capacidad de suministrar ARNds ncm al alimentara los insectos le confiere un efecto ARNi que es muy útil para el manejo de plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero). Mediante la combinación de ARNi mediado por ncm con otros objetivos de ARNi útiles (por ejemplo, objetivos de ARNi ROP, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/577,811; objetivos de ARNi RNAPII140, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/577,854; objetivos de ARNi Dre4, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/705,807; objetivos de a Rní COPI alfa, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,199; objetivos de ARNi COPI beta, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,203; objetivos de ARNi COPI gamma, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,192; objetivos de ARNi COPI delta, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,216) el potencial de afectar múltiples secuencias objetivo, por ejemplo, en coleópteros (por ejemplo, gusanos de la raíz larvarios), pueden aumentar las oportunidades para desarrollar enfoques sostenibles para el manejo de plagas de insectos con tecnologías de ARNi.

En la presente descripción se describen métodos y composiciones para el control genético de infestaciones de plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero). También se proporcionan métodos para identificar uno o más genes esenciales para el ciclo de vida de una plaga de insectos para uso como gen objetivo para el control mediado por ARNi de una población de plagas de insectos. Los vectores plasmídicos de ADN que codifican una molécula de a Rn pueden diseñarse para suprimir uno o más genes objetivos esenciales para el crecimiento, la supervivencia y/o el desarrollo. En algunos aspectos de la descripción, la molécula de ARN puede ser capaz de formar moléculas de ARNds. En algunas modalidades, se proporcionan métodos para la represión postranscripcional de la expresión o la inhibición de un gen objetivo a través de moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una secuencia codificante o no codificante del gen objetivo en una plaga de insectos. En estas y otras modalidades, una plaga puede ingerir una o más moléculas de hpARN transcritas a partir de toda o una porción de una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia codificante o no codificante de un gen objetivo, lo que proporciona de esta manera un efecto protector de la planta.

Por lo tanto, algunas modalidades implican la inhibición específica de secuencia de la expresión de productos génicos objetivo, mediante el uso de hpARN que es complementario a las secuencias codificantes y/o no codificantes del (de los) gen(es) objetivo para lograr al menos un control parcial de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Se describe un conjunto de moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas que comprenden un polinucleótido, por ejemplo, como se establece en una de las SEQ ID NOs: 1; 77; 84; 86; 88 y 93, y fragmentos de estos. En algunas modalidades, una molécula de ARNds estabilizada puede expresarse a partir de estos polinucleótidos, fragmentos de estos, o un gen que comprende uno de estos polinucleótidos, para el silenciamiento o inhibición postranscripcional de un gen objetivo. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas comprenden todo o parte de cualquiera de las SEQ ID NOs: 84; 86; 88 y 93.

Algunas modalidades implican una célula huésped recombinante (por ejemplo, una célula vegetal) que tiene en su genoma al menos un ADN recombinante que codifica al menos una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds). En modalidades particulares, la(s) molécula(s) de ARNds pueden proporcionarse cuando se ingieren por una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) para silenciar o inhibir postranscripcionalmente la expresión de un gen objetivo en la plaga. El ADN recombinante puede comprender, por ejemplo, fragmentos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93; y un polinucleótido que consiste de una secuencia parcial de un gen que comprende uno de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93, y/o complementos de estos.

Algunos aspectos de la descripción implican una célula huésped recombinante que tiene en su genoma un ADN recombinante que codifica al menos una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds) que comprende todo o parte de la SEC ID NO: 78 o SEC ID NO: 83 (por ejemplo, al menos un polinucleótido seleccionado de un grupo que comprende las SEQ ID NOs: 78-83). Algunos aspectos de la descripción implican una célula huésped recombinante que tiene en su genoma un ADN recombinante que codifica al menos una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds) que comprende todo o parte de cualquiera de las SEQ ID NOs: 95-97 y 99 (por ejemplo, SEQ ID n O:98). Cuando se ingiere por una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero), la(s) molécula(s) de iARN pueden silenciar o inhibir la expresión de un ADN objetivo ncm (por ejemplo, un ADN que comprende todo o parte de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1; 3-6; 77, 84, 86, 88, 90 y 93) en la plaga y, de esta manera, resultan en el cese del crecimiento, el desarrollo y/o la alimentación en la plaga.

En algunas modalidades, una célula huésped recombinante que tiene en su genoma al menos un ADN recombinante que codifica al menos una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds puede ser una célula vegetal transformada. Algunas modalidades implican plantas transgénicas que comprenden dicha célula vegetal transformada. Además de tales plantas transgénicas, se proporcionan plantas de progenie de cualquier generación de plantas transgénicas, semillas transgénicas y productos vegetales transgénicos, cada uno de los cuales comprende ADN(s) recombinante(s). En modalidades particulares, una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds puede expresarse en una célula vegetal transgénica. Por lo tanto, en estas y otras modalidades, una molécula de ARNds puede aislarse de una célula vegetal transgénica. En modalidades particulares, la planta transgénica es una planta seleccionada del grupo que comprende maíz (Zea mays), soya (Glycine max), colza (Brassica sp.) y plantas de la familia Poaceae.

Algunas modalidades implican un método para modular la expresión de un gen objetivo en una célula de plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). En estas y otras modalidades, se puede proporcionar una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds. En modalidades, un polinucleótido que codifica una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds está unida operativamente a un promotor, y también puede estar unido operativamente a una secuencia de terminación de la transcripción. En modalidades particulares, un método para modular la expresión de un gen objetivo en una célula de plaga de insectos puede comprender: (a) transformar una célula vegetal con un vector que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds; (b) cultivar la célula vegetal transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo celular vegetal que comprenda una pluralidad de células vegetales transformadas; (c) seleccionar una célula vegetal transformada que ha integrado el vector en su genoma; y (d) determinar que la célula vegetal transformada seleccionada comprende la molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds codificada por el polinucleótido del vector. Una planta puede regenerarse a partir de una célula vegetal que tiene el vector integrado en su genoma y comprende la molécula de ARNds codificada por el polinucleótido del vector.

Por lo tanto, también se describe una planta transgénica que comprende un vector que tiene un polinucleótido que codifica una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds integrada en su genoma, en donde la planta transgénica comprende la molécula de ARNds codificada por el polinucleótido del vector. En modalidades particulares, la expresión de una molécula de ARN capaz de formar una molécula de ARNds en la planta es suficiente para modular la expresión de un gen objetivo en una célula de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) que contacta la planta transformada o la célula vegetal (por ejemplo, al alimentarse de la planta transformada, una parte de la planta (por ejemplo, raíz) o célula vegetal), de manera que se inhibe el crecimiento y/o supervivencia de la plaga. Las plantas transgénicas descritas en la presente descripción pueden mostrar resistencia y/o tolerancia mejorada a las infestaciones de plaga de insectos. Las plantas transgénicas particulares pueden mostrar resistencia y/o tolerancia mejorada a una o más plagas de coleópteros seleccionados del grupo que consiste en: WCR; NCR SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar D. u. undecimpunctata Mannerheim y Meligethes aeneus.

También se describen en la presente descripción métodos para el suministro de agentes de control, tales como una molécula de iARN, a una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Dichos agentes de control pueden causar, directa o indirectamente, un deterioro en la capacidad de una población de plaga de insectos para alimentarse, crecer o de cualquier otra manera, causar daños en un huésped. En algunas modalidades, se proporciona un método que comprende el suministro de una molécula de ARNds estabilizada a una plaga de insectos para suprimir al menos un gen objetivo en la plaga, lo que causa, de esta manera, ARNi y reduce o elimina el daño de la planta en un huésped de plaga. En algunas modalidades, un método de inhibición de la expresión de un gen objetivo en la plaga de insectos puede resultar en el cese del crecimiento, supervivencia y/o desarrollo, en la plaga.

En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan composiciones (por ejemplo, una composición tópica) que comprenden una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds) para usar en plantas, animales y/o el ambiente de una planta o animal para lograr la eliminación o reducción de una infestación de plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). En aspectos particulares de la descripción, la composición puede ser una composición nutricional o una fuente de alimento para alimentar a la plaga de insectos. Algunos aspectos de la descripción comprenden hacer la composición nutricional o fuente de alimento disponible para la plaga. La ingestión de una composición que comprende moléculas de iARN puede resultar en la absorción de las moléculas por una o más células de la plaga, lo que a su vez puede resultar en la inhibición de la expresión de al menos un gen objetivo en la(s) célula(s) de la plaga. La ingestión o daño a una planta o célula vegetal por una infestación de plaga de insectos puede limitarse o eliminarse en o sobre cualquier tejido o entorno del huésped en el que esté presente la plaga al proporcionar una o más composiciones que comprenden una molécula de iARN en el huésped de la plaga.

Los cebos de ARNi se forman cuando el ARNds se mezcla con alimentos o un atrayente o ambos. Cuando las plagas ingieren el cebo, también consumen el ARNds. Los cebos pueden tomar la forma de gránulos, geles, polvos fluidos, líquidos o sólidos. En otra modalidad, ncm puede incorporarse a una formulación de cebo tal como la descrita en la patente de Estados Unidos No. 8,530,440 que se incorpora aquí por referencia. Generalmente, con cebos, los cebos se colocan en o alrededor del entorno de la plaga de insectos, por ejemplo, el WCR puede entrar en contacto con el cebo, y/o sentirse atraído hacia él.

Las composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse juntos en combinaciones con otros métodos y composiciones para controlar el daño por plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero). Por ejemplo, una molécula de íaRn como se describe en la presente descripción para proteger a las plantas de las plagas de insectos puede usarse en un método que comprende el uso adicional de uno o más agentes químicos efectivos contra una plaga de insectos, biopesticidas efectivos contra dicha plaga, rotación de cultivos, técnicas genéticas recombinantes que exhiben características diferentes de las características de los métodos mediados por ARNi y las composiciones de a Rní (por ejemplo, producción recombinante de proteínas en plantas que son perjudiciales para una plaga de insectos (por ejemplo, toxinasBt)).

II. Abreviaturas

ARNds ácido ribonucleico bicatenario

GI inhibición del crecimiento

NCBI Centro Nacional para la Información Biotecnológica

ADNg ácido desoxirribonucleico genómico

iARN ácido ribonucleico inhibitorio

ORF marco de lectura abierto

ARNi interferencia de ácido ribonucleico

miARN ácido micro ribonucleico

shARN ácido ribonucleico de horquilla corta

siARN ácido ribonucleico inhibitorio pequeño

hpARN ácido ribonucleico de horquilla

UTR región no traducida

WCR gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera LeConte)

NCR gusano de la raíz del maíz del norte (Diabrotica barberi Smith y Lawrence)

MCR Gusano de la raíz del maíz mexicano (Diabrotica virgifera zeae Krysan y Smith)

PCR reacción en cadena de la polimerasa

qPCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

RISC complejo de silenciamiento inducido por ARN

SCR gusano de la raíz del maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata Howardi Barber)

YFP proteína fluorescente amarilla

EEM error estándar de la media

PB escarabajo del polen (Meligethes aeneus Fabricius)

III. Términos

En la siguiente descripción y tablas que siguen, se usan una serie de términos. Con el objetivo de proporcionar una comprensión clara y consistente de la especificación y reivindicaciones, que incluyen el alcance que debe darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones:

Plaga de coleópteros: Como se usa en la presente descripción, el término "plaga de coleópteros" se refiere a los insectos plagas del orden Coleoptera, incluidos los insectos plagas del género Diabrotica, que se alimentan de cultivos agrícolas y productos agrícolas, incluidos el maíz y otros pastos verdaderos. En ejemplos particulares, una plaga de coleópteros se selecciona de una lista que comprende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith y Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; D. u. undecimpunctata Mannerheim; y Meligethes aeneus Fabricius.

Contacto (con un organismo): Como se usa en la presente descripción, el término “contacto con” o “absorción por” un organismo (por ejemplo,un coleóptero), con respecto a una molécula de ácido nucleico, incluye la internalización de la molécula de ácido nucleico en el organismo, por ejemplo y sin limitación: ingestión de la molécula por el organismo (por ejemplo, mediante la alimentación); contacto del organismo con una composición que comprende la molécula de ácido nucleico; y remojo de organismos con una solución que comprende la molécula de ácido nucleico.

Cóntigo: Como se usa en la presente descripción, el término "cóntigo" se refiere a una secuencia de ADN que se reconstruye a partir de un conjunto de segmentos de ADN solapados derivados de una sola fuente genética.

Planta de maíz: Como se usa en la presente descripción, el término "planta de maíz" se refiere a una planta de la especie, Zea mays (maíz).

Expresión: Como se usa en la presente descripción, la "expresión" de un polinucleótido codificante (por ejemplo, un gen o un transgen) se refiere al proceso mediante el cual la información codificada de una unidad transcripcional de ácido nucleico (que incluye, por ejemplo, ADNg o ADNc) se convierte en una parte operativa, no operativa, o estructural de una célula, lo que incluye con frecuencia la síntesis de una proteína. La expresión génica puede estar influenciada por señales externas; por ejemplo, la exposición de una célula, tejido u organismo a un agente que aumenta o disminuye la expresión génica. La expresión de un gen también puede regularse en cualquier parte de la trayectoria del ADN al ARN a la proteína. La regulación de la expresión génica se produce, por ejemplo, a través de controles que actúan en la transcripción, la traducción, el transporte y el procesamiento del ARN, la degradación de moléculas intermediarias tales como ARNm, o a través de la activación, inactivación, compartimentación o degradación de moléculas de proteínas específicas luego de su elaboración, o mediante combinaciones de estas. La expresión génica puede medirse a nivel de ARN o a nivel de proteína mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, sin limitación, Northern blot, RT-PCR, Western blot o ensayo(s) de actividad proteica in vitro, in situo in vivo.

Material genético: Como se usa en la presente descripción, el término "material genético" incluye todos los genes y moléculas de ácido nucleico, tales como ADN y ARN.

Inhibición: Como se usa en la presente descripción, el término "inhibición", cuando se usa para describir un efecto sobre un polinucleótido codificante (por ejemplo, un gen), se refiere a una disminución medible en el nivel celular de ARNm transcrito desde el polinucleótido codificante y/o péptido, polipéptido, o producto proteico del polinucleótido codificante. En algunos ejemplos, la expresión de un polinucleótido codificante puede inhibirse de manera que la expresión aproximadamente se elimine. "Inhibición específica" se refiere a la inhibición de un polinucleótido codificante objetivo sin afectar consecuentemente la expresión de otros polinucleótidos codificantes (por ejemplo, genes) en la célula en donde se realiza la inhibición específica.

Insecto: Como se usa en la presente descripción con respecto a las plagas, el término "plaga de insectos" incluye específicamente las plagas de insectos coleópteros.

Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o una proteína) se ha separado sustancialmente, producido aparte o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en la que el componente se encuentra naturalmente (es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, y proteínas), mientras se produce un cambio químico o funcional en el componente (por ejemplo, un ácido nucleico puede aislarse de un cromosoma al romper enlaces químicos que conectan el ácido nucleico con el ADN restante en el cromosoma). Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han "aislado" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas por métodos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como también moléculas de ácido nucleico, proteínas y péptidos sintetizados químicamente.

Molécula de ácido nucleico: Como se usa en la presente descripción, el término "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos, que puede incluir tanto cadenas antisentido como sentido de ARN, ADNc, ADNg y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido o nucleobase puede referirse a un ribonucleótido, desoxirribonucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Una "molécula de ácido nucleico" como se usa en la presente descripción, es sinónimo de "ácido nucleico" y "polinucleótido." Una molécula de ácido nucleico usualmente tiene al menos 10 bases de longitud, a menos que de cualquier otra manera se especifique. Por convención, la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico se lee desde el extremo 5' hasta el 3' de la molécula. El "complemento" de una molécula de ácido nucleico se refiere a un polinucleótido que tiene nucleobases que pueden formar pares de bases con las nucleobases de la molécula de ácido nucleico (es decir, A-T/U y G-C).

Algunas modalidades incluyen ácidos nucleicos que comprenden un ADN molde que se transcribe en una molécula de ARN que es el complemento de una molécula de ARNm. En estas modalidades, el complemento del ácido nucleico transcrito en la molécula de ARNm está presente en la orientación 5' a 3', de manera que la ARN polimerasa (que transcribe el ADN en la dirección 5' a 3') transcribirá un ácido nucleico a partir del complemento que puede hibridarse con la molécula de ARNm. A menos que se establezca explícitamente de cualquier otra manera, o esté claro ser de cualquier otra manera a partir del contexto, el término "complemento" se refiere, por lo tanto, a un polinucleótido que tiene nucleobases, de 5' a 3', que pueden formar pares de bases con las nucleobases de un ácido nucleico de referencia. De manera similar, a menos que se establezca explícitamente ser de cualquier otra manera (o esté claro ser de cualquier otra manera a partir del contexto), el "complemento inverso" de un ácido nucleico se refiere al complemento en orientación inversa. Lo anterior se demuestra en la siguiente ilustración:

ATGATGATG polinucleótido

TACTACTAC "complemento" del polinucleótido

CATCATCAT "complemento inverso" del polinucleótido

Las modalidades de la invención se refieren a moléculas de ARNi formadoras de ARN en horquilla. En estas moléculas de ARNi, el complemento de un ácido nucleico que es marcado por la interferencia de ARN y el complemento inverso se pueden encontrar en la misma molécula, de manera que la molécula de ARN monocatenario puede "doblarse" e hibridarse a sí misma sobre la región que comprende los polinucleótidos complementarios y complementarios inversos.

"Moléculas de ácido nucleico" incluyen todos los polinucleótidos, por ejemplo: formas de ADN monocatenario y bicatenario; formas monocatenarias de ARN; y formas bicatenarias de ARN (ARNds). El término "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere tanto a las cadenas sentido y antisentido de un ácido nucleico como a cadenas solas o en el dúplex. El término "ácido ribonucleico" (ARN) incluye iARN (ARN inhibitorio), ARNds (ARN bicatenario), siARN (ARN interferente pequeño), shARN (ARN en horquilla pequeño), ARNm (ARN mensajero), miARN (micro-ARN), hpARN (ARN en horquilla), ARNt (ARN de transferencia, ya sea cargado o descargado con un aminoácido acilado correspondiente) y ARNc (ARN complementario). El término "ácido desoxirribonucleico" (ADN) incluye ADNc, ADNg e híbridos de ADN-ARN. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" y "fragmentos" de estos serán entendidos por los expertos en la técnica como un término que incluye ADNg, ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN mensajero, operones y polinucleótidos ingenierizados más pequeños que codifican o puede adaptarse para codificar, péptidos, polipéptidos o proteínas.

Oligonucleótido: Un oligonucleótido es un polímero corto de ácido nucleico. Los oligonucleótidos pueden formarse por escisión de segmentos de ácido nucleico más largos, o por polimerización de precursores de nucleótidos individuales. Los sintetizadores automatizados permiten la síntesis de oligonucleótidos de hasta varios cientos de bases de longitud. Debido a que los oligonucleótidos pueden unirse a un ácido nucleico complementario, pueden usarse como sondas para detectar ADN o ARN. Los oligonucleótidos compuestos de ADN (oligodesoxirribonucleótidos) pueden usarse en PCR, una técnica para la amplificación de ADN. En PCR, el oligonucleótido es referido típicamente como "cebador", que permite que una ADN polimerasa extender el oligonucleótido y replicar la cadena complementaria.

Una molécula de ácido nucleico puede incluir cualquiera o ambos nucleótidos naturales y modificados unidos entre sí por enlaces nucleotídicos naturales y/o no naturales. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse química o bioquímicamente, o pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones entre nucleótidos (por ejemplo,, enlaces sin carga: por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; enlaces con carga: por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; restos pendientes: por ejemplo, péptidos; intercaladores: por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes y enlaces modificados: por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). El término "molécula de ácido nucleico" también incluye cualquier conformación topológica, incluidas conformaciones monocatenarias, bicatenarias, parcialmente en forma de duplex, triplex, de horquilla, circulares y de candado.

Como se usa en la presente descripción con respecto al ADN, el término “polinucleótido codificante”, “polinucleótido estructural” o “molécula de ácido nucleico estructural” se refiere a un polinucleótido que en última instancia se traduce a un polipéptido, a través de transcripción y ARNm, cuando se coloca bajo el control de elementos regulatorios adecuados. Con respecto al ARN, el término "polinucleótido codificante" se refiere a un polinucleótido que se traduce en un péptido, polipéptido o proteína. Los límites de un polinucleótido codificante están determinados por un codón de inicio de la traducción en el extremo 5' y un codón de parada de la traducción en el extremo 3'. Los polinucleótidos codificantes incluyen, pero no se limitan a: ADNg; ADNc; EST; y polinucleótidos recombinantes.

Como se usa en la presente descripción, "polinucleótido no codificante transcrito" se refiere a segmentos de moléculas de ARNm tales como 5'UTR, 3'UTR y segmentos de intrones que no se traducen en un péptido, polipéptido o proteína. Además, "polinucleótido no codificante transcrito" se refiere a un ácido nucleico que se transcribe en un ARN que funciona en la célula, por ejemplo, ARN estructurales (por ejemplo, ARN ribosómico (ARNr) como se ejemplifica por ARNr 5S, ARNr 5,8S, ARNr 16S, ARNr 18S, ARNr 23S y ARNr 28S, y similares); ARN de transferencia (ARNt); y snARN tales como U4, U5, U6 y similares. Los polinucleótidos no codificantes transcritos también incluyen, por ejemplo y sin limitación, ARN pequeños (sARN), término que a menudo se usa para describir pequeños ARN no codificantes bacterianos; ARN nucleolar pequeños (snoARN); microARN; ARN interferentes pequeños (siARN); ARN asociados a Piwi (piARN); y ARN largos no codificantes. Aún más, "polinucleótido no codificante transcrito" se refiere a un polinucleótido que puede existir de forma nativa como un "separador" intragénico en un ácido nucleico y que se transcribe en una molécula de ARN.

ARN de interferencia letal: Como se usa en la presente descripción, el término "ARN de interferencia letal" se refiere al ARN de interferencia que da como resultado la muerte o una reducción en la viabilidad del sujeto individual al que, por ejemplo, se suministra un ARNds, miARN, siARN, shARN y/o hpARN.

Genoma: Como se usa en la presente descripción, el término "genoma" se refiere al ADN cromosómico encontrado dentro del núcleo de una célula, y también se refiere al ADN de orgánulo encontrado dentro de los componentes subcelulares de la célula. En algunas modalidades de la invención, se puede introducir una molécula de ADN en una célula vegetal, de manera que la molécula de ADN se integre en el genoma de la célula vegetal. En estas y otras modalidades, la molécula de ADN puede integrarse en el ADN nuclear de la célula vegetal, o integrarse en el ADN del cloroplasto o en la mitocondria de la célula vegetal. El término "genoma," como se aplica a las bacterias, se refiere al cromosoma y a los plásmidos dentro de la célula bacteriana. En algunas modalidades de la invención, se puede introducir una molécula de ADN en una bacteria, de manera que la molécula de ADN se integre en el genoma de la bacteria. En estas y otras modalidades, la molécula de ADN puede estar integrada cromosómicamente o localizada como o en un plásmido estable.

Identidad de secuencia: Como se usa en la presente descripción, el término "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos polinucleótidos o polipéptidos, se refiere a los residuos en las secuencias de dos moléculas que son iguales cuando se alinean por correspondencia máxima en una ventana de comparación especificada.

Como se usa en la presente descripción, el término "porcentaje de identidad de secuencia" puede referirse al valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o secuencias de polipéptidos) de una molécula sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las que se presenta el residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias para rendir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para rendir el porcentaje de identidad de secuencia. Se dice que una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia es 100 % idéntica a la secuencia de referencia, y viceversa.

Los métodos para el alineamiento de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineamiento se describen en, por ejemplo: Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU 85:2444; Higgins y Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet y otros (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y otros (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson y otros (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana y otros (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Puede encontrarse una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencias y cálculos de homología en, por ejemplo, Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

El Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul y otros (1990)) está disponible a partir de varias fuentes, incluso en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (Bethesda, MD), y en internet, para uso en relación con varios programas de análisis de secuencias. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia mediante el uso de este programa está disponible en internet en la sección de "ayuda" para BLAST™. Para las comparaciones de secuencias de ácido nucleico, puede emplearse la función "Blast 2 secuencias" del programa BLAST™ (Blastn) mediante el uso de la matriz BLOSUM62 predeterminada configurada con los parámetros predeterminados. Los ácidos nucleicos con una similitud de secuencia superior a las secuencias de los polinucleótidos de referencia mostrarán aumento del porcentaje de identidad cuando se evalúa mediante este método.

Específicamente hibridable/Específicamente complementario: Como se usa en la presente descripción, los términos "específicamente hibridable" y "específicamente complementario" son términos que indican un grado suficiente de complementariedad de manera que se produzca una unión específica y estable entre la molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico objetivo. La hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico implica la formación de un alineamiento antiparalelo entre las nucleobases de las dos moléculas de ácido nucleico. Las dos moléculas son capaces de formar enlaces de hidrógeno con las bases correspondientes en la cadena opuesta para formar una molécula dúplex que, si es suficientemente estable, es detectable mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica. Un polinucleótido no necesita ser 100 % complementario a su ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridable. Sin embargo, la cantidad de complementariedad que debe existir para que la hibridación sea específica es una función de las condiciones de hibridación usadas.

Las condiciones de hibridación que resultan en grados particulares de rigurosidad variarán en dependencia de la naturaleza del método de hibridación de elección y la composición y longitud de los ácidos nucleicos de hibridación. Generalmente, la temperatura de hibridación y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o Mg++) del tampón de hibridación determinará la rigurosidad de hibridación, aunque los tiempos de lavado también influyen en la rigurosidad. Los cálculos sobre las condiciones de hibridación que se necesitan para alcanzar grados particulares de rigurosidad son conocidos por los expertos en la técnica y se discuten, por ejemplo, en Sambrook y otros (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 y 11; y Hames y Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Las instrucciones y guías más detalladas con respecto a la hibridación de ácidos nucleicos pueden encontrarse, por ejemplo, en Tijssen, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, Ny , 1993; y Ausubel y otros, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

Como se usa en la presente descripción, las "condiciones rigurosas" abarcan las condiciones bajo las cuales la hibridación solo ocurrirá si hay menos del 20 % de discordancia entre la secuencia de la molécula de hibridación y un polinucleótido homólogo dentro de la molécula de ácido nucleico objetivo. "Condiciones rigurosas" incluyen niveles particulares adicionales de rigurosidad. Por lo tanto, como se usa en la presente descripción, las condiciones de "rigurosidad moderada" son aquellas bajo las cuales las moléculas con más del 20 % de discordancia de secuencia no se hibridarán; las condiciones de "rigurosidad alta" son aquellas en las que las secuencias con más del 10 % de discordancia no se hibridarán; y las condiciones de "rigurosidad muy alta" son aquellas en las que las secuencias con más del 5 % de discordancia no se hibridarán.

Siguen a continuación condiciones de hibridación no limitantes y representativas.

Condición de rigurosidad alta (detecta polinucleótidos que comparten al menos 90 % de identidad de secuencia): Hibridación en tampón SSC 5x a 65 °C durante 16 horas; lavado dos veces en tampón SSC 2x a temperatura ambiente durante 15 minutos cada uno; y lavado dos veces en tampón SSC 0,5x a 65 °C durante 20 minutos cada uno.

Condición de rigurosidad moderada (detecta polinucleótidos que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia): Hibridación en tampón SSC 5x-6x a 65-70 °C durante 16-20 horas; lavado dos veces en tampón SSC 2x a temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada uno; y lavado dos veces en tampón SSC 1x a 55-70 °C durante 30 minutos cada uno.

Condición de control no riguroso (polinucleótidos que comparten al menos un 50 % de identidad de secuencia se hibridarán): Hibridación en tampón SSC 6x de temperatura ambiente a 55 °C durante 16-20 horas; lavado al menos dos veces en tampón SSC 2x-3x de temperatura ambiente a 55 °C durante 20-30 minutos cada uno.

Como se usa en la presente descripción, el término “sustancialmente homólogo” u “homología sustancial,” con respecto a un ácido nucleico, se refiere a un polinucleótido que tiene nucleobases contiguas que se hibridan en condiciones rigurosas al ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que son sustancialmente homólogos a un ácido nucleico de referencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3-6, 17, 77, 84, 86, 88, 90 y 93 son aquellos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas (por ejemplo, las condiciones de rigurosidad moderada establecidas, más arriba) al ácido nucleico de referencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3-6, 17, 77, 84, 86, 88, 90 y 93. Los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener al menos un 80 % de identidad de secuencia. Por ejemplo, los polirribonucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener de aproximadamente 80 % a 100 % de identidad de secuencia, tal como de 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 % alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Condiciones de rigurosidad moderada establecidas, (más arriba) para el ácido nucleico de referencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3-6, 17, 77, 84, 86, 88, 90 y 93. Los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener al menos un 80 % de identidad de secuencia. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 1, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de s Eq ID NO: 3, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 4, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de s Eq ID NO: 5, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 6, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 17, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 77, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 84, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 86, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 88, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 90, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. Por ejemplo, los polinucleótidos sustancialmente homólogos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a 100 % con el ácido nucleico de referencia de SEQ ID NO: 93, tal como 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; y alrededor de 100 %. La propiedad de la homología sustancial está estrechamente relacionada con la hibridación específica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico es específicamente hibridable cuando hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del ácido nucleico a polinucleótidos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas.

Como se usa en la presente descripción, el término "ortólogo" se refiere a un gen en dos o más especies que ha evolucionado a partir de un ácido nucleico ancestral común y puede retener la misma función en las dos o más especies.

Como se usa en la presente descripción, se dice que dos moléculas de ácido nucleico exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de un polinucleótido leído en la dirección 5' a 3' es complementario a cada nucleótido del otro polinucleótido cuando se lee en la dirección 3' a 5'. Un polinucleótido que es complementario a un polinucleótido de referencia exhibirá una secuencia idéntica al complemento inverso del polinucleótido de referencia. Estos términos y descripciones están bien definidos en la técnica y son fácilmente entendibles por los expertos en la técnica.

Operativamente unido: Un primer polinucleótido está operativamente unido con un segundo polinucleótido cuando el primer polinucleótido está en una relación funcional con el segundo polinucleótido. Cuando se produce de manera recombinante, los polinucleótidos operativamente unido son generalmente contiguos y, donde se necesite unir dos regiones codificantes de proteínas, en el mismo marco de lectura (por ejemplo, en un ORF fusionado traduccionalmente). Sin embargo, los ácidos nucleicos no necesitan ser contiguos para estar operativamente unidos.

El término "operativamente unido", cuando se usa en referencia a un elemento genético regulador y un polinucleótido codificante, significa que el elemento regulador afecta la expresión del polinucleótido codificante unido. Los "elementos reguladores" o "elementos de control" se refieren a polinucleótidos que influyen en el momento y el nivel/cantidad de transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción del polinucleótido codificante asociado. Los elementos reguladores pueden incluir promotores; líderes de traducción; intrones; potenciadores; estructuras de tallo-lazo; polinucleótidos de unión al represor; polinucleótidos con una secuencia de terminación; polinucleótidos con una secuencia de reconocimiento de poliadenilación; etc. Se pueden ubicar elementos reguladores particulares aguas arriba y/o aguas abajo de un polinucleótido codificante operativamente unido al mismo. Además, elementos reguladores particulares operativamente unidos a un polinucleótido codificante pueden estar ubicados en la cadena complementaria asociada de una molécula de ácido nucleico bicatenario.

Promotor: Como se usa en la presente descripción, el término "promotor" se refiere a una región de ADN que puede estar aguas arriba desde el inicio de la transcripción, y que puede estar implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un promotor puede estar operativamente unido a un polinucleótido codificante para la expresión en una célula, o un promotor puede estar operativamente unido a un polinucleótido que codifica un péptido señal que puede estar operativamente unido a un polinucleótido codificante para la expresión en una célula. Un “promotor vegetal” puede ser un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Los ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que preferentemente inician la transcripción en determinados tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos xilemáticos, traqueidas, o esclerénquima. Tales promotores son referidos como “preferidos del tejido”. Los promotores que inician la transcripción solamente en determinados tejidos son referidos como "específicos del tejido". Un promotor "celular tipo específico" impulsa principalmente la expresión en ciertos tipos celulares en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor "inducible" puede ser un promotor que puede estar bajo control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden iniciar la transcripción por los promotores inducibles incluyen las condiciones anaeróbicas y la presencia de luz. Los promotores específicos del tejido, preferidos del tejido, tipo celular específicos, e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor “constitutivo” es un promotor que puede estar activo en la mayoría de las condiciones ambientales o en la mayoría de tejidos o tipos celulares.

Puede usarse cualquier promotor inducible en algunas modalidades de la invención. Véase Ward y otros (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Con un promotor inducible, la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. Los promotores inducibles ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: Promotores a partir del sistema ACEI que responde al cobre; el gen In2 a partir del maíz que responde a los protectores de herbicidas de bencenosulfonamida; el represor Tet a partir de Tn10; y el promotor inducible a partir de un gen de hormona esteroidea, cuya actividad transcripcional puede estar inducida por una hormona glucocorticoesteroide (Schena y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88:0421).

Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: Promotores a partir de virus de plantas, tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, por sus siglas en inglés); promotores de los genes de la actina de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 de maíz; y el promotor de ALS, el fragmento Xba1/NcoI 5' al gen estructural Brassica napus ALS3 (o un polinucleótido similar a dicho fragmento Xba1/NcoI) (publicación de patente internacional PCT No. Wo 96/30530).

Adicionalmente, cualquier promotor específico del tejido o preferido del tejido puede utilizarse en algunas modalidades de la invención. Las plantas transformadas con una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido codificante operativamente unido a un promotor específico del tejido pueden producir el producto del polinucleótido codificante exclusivamente, o preferentemente, en un tejido específico. Los promotores específicos del tejido o preferidos del tejido ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: Un promotor preferido de la raíz, tal como el del gen de la faseolina; un promotor específico de hoja e inducible por la luz tal como el de cab o rubisco; un promotor específico de antera tal como el de LAT52; un promotor específico del polen tal como el de Zm13; y un promotor preferido de microspora tal como el de apg.

Planta Brassica: Como se usa en la presente descripción, los términos "colza", "colza oleaginosa", "colza" y "canola" se usan indistintamente y se refieren a una planta de la especie Brassica; por ejemplo, B. napus.

Transformación: Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" o “transducción” se refiere a la transferencia de una o más moléculas de ácido nucleico a una célula. Una célula está "transformada" por una molécula de ácido nucleico que se transduce en la célula cuando la molécula de ácido nucleico se replica de manera estable en la célula, ya sea mediante la incorporación de la molécula de ácido nucleico en el genoma celular, o mediante replicación episomal. Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" abarca todas las técnicas mediante las cuales se puede introducir una molécula de ácido nucleico en dicha célula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: transfección con vectores virales; transformación con vectores plasmídicos, electroporación (Fromm y otros (1986) Nature 319:791-3); lipofección (Felgner y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:7413-7); microinyección (Mueller y otros (1978) Cell 15:579-85); transferencia mediada por Agrobacterium (Fraley y otros (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80:4803-7); captación directa de ADN; y bombardeo de microproyectiles (Klein y otros (1987) Nature 327:70).

Transgen: Un ácido nucleico exógeno. En algunos ejemplos, un transgen puede ser un ADN que codifica una o ambas cadenas de un ARN capaz de formar una molécula de ARNds que comprende un polinucleótido que es complementario a una molécula de ácido nucleico encontrada en una plaga de coleópteros. En otros ejemplos, un transgen puede ser un polinucleótido antisentido, en donde la expresión del polinucleótido antisentido inhibe la expresión de un ácido nucleico objetivo. En aún otros ejemplos, un transgen puede ser un gen (por ejemplo, un gen de tolerancia a herbicidas, un gen que codifica un compuesto útil industrial o farmacéuticamente, o un gen que codifica un rasgo agrícola conveniente). En estos y otros ejemplos, un transgen puede contener elementos reguladores operativamente unidos a un polinucleótido codificante del transgén (por ejemplo, un promotor).

Vector: Una molécula de ácido nucleico tal como se introduce en una célula, por ejemplo, para producir una célula transformada. Un vector puede incluir elementos genéticos que le permitan replicarse en la célula huésped, tales como un origen de replicación. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a: un plásmido; un cósmido; un bacteriófago; o un virus que transporta ADN exógeno a una célula. Un vector puede incluir también, uno o más genes, incluidos lo que producen moléculas antisentido, y/o genes marcadores de selección y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Un vector puede transducir, transformar o infectar una célula, lo que causa de esta manera que la célula exprese las moléculas de ácido nucleico y/o proteínas codificadas por el vector. Un vector incluye opcionalmente materiales para ayudar a lograr la entrada de la molécula de ácido nucleico en la célula (por ejemplo, un liposoma, recubrimiento de proteína, etc.).

Rendimiento: Un rendimiento estabilizado de alrededor de 100 % o superior con relación al rendimiento de las variedades chequeadas en el mismo lugar de cultivo que crecen al mismo tiempo y en las mismas condiciones. En modalidades particulares, "rendimiento mejorado" o "al mejorar el rendimiento" significa un cultivar que tiene un rendimiento estabilizado de 105 % o superior con relación al rendimiento de las variedades chequeadas en el mismo lugar de cultivo que contiene densidades significativas de las plagas de coleópteros que son perjudiciales para ese cultivo en crecimiento al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones, que son objeto de las composiciones y métodos en la presente descripción.

A menos que se indique o se dé a entender específicamente, los términos “un”, “una” y “el/la” significan “al menos uno”, como se usa en la presente descripción.

A menos que se explique específicamente de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta descripción. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en, por ejemplo, Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs y otros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de la mezcla de solventes son en volumen a menos que de cualquier otra manera se note. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

IV. Moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de plaga de insectos

A. Visión general

En la presente descripción se describen moléculas de ácido nucleico útiles para el control de plagas de insectos. La plaga de insectos es una plaga de insectos coleópteros. Las moléculas de ácido nucleico descritas incluyen polinucleótidos objetivo (por ejemplo, genes nativos y polinucleótidos no codificantes), ARNdss, siARNs, shARNs, hpARNs y miARNs. Por ejemplo, las moléculas de hpARN se describen en algunas modalidades que pueden ser específicamente complementarias a todo o parte de uno o más ácidos nucleicos nativos en una plaga de coleópteros. En estas y otras modalidades, los ácidos nucleicos nativos pueden ser uno o más genes objetivos, cuyo producto puede estar, por ejemplo y sin limitación: involucrado en un proceso metabólico o involucrado en el desarrollo larvario. Las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente descripción, cuando se introducen en una célula que comprende al menos uno o más ácidos nucleicos nativos a los que las moléculas de ácido nucleico son específicamente complementarias, pueden iniciar el ARNi en la célula y, consecuentemente, reducir o eliminar la expresión de ácido(s) nucleico(s) nativo(s). En algunos ejemplos, la reducción o eliminación de la expresión de un gen objetivo por una molécula de ácido nucleico específicamente complementaria a la misma puede resultar en la reducción o el cese del crecimiento, desarrollo y/o alimentación en la plaga de coleópteros.

En algunas modalidades, se puede seleccionar al menos un gen objetivo en una plaga de insectos, en donde el gen objetivo comprende un polinucleótido ncm. En ejemplos particulares, se selecciona un gen objetivo en una plaga de coleópteros, en donde el gen objetivo comprende un polinucleótido seleccionado de las SEQ ID NOs: 1, 3-6, 77, 84, 86, 88, 90 y 93.

En algunas modalidades, un gen objetivo puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos, alrededor de 85 % idéntica (por ejemplo, al menos 84 %, 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, alrededor de 100 % o 100 % idéntico) a la secuencia de aminoácidos de un producto proteico de un polinucleótido ncm. Un gen objetivo puede ser cualquier polinucleótido ncm en una plaga de insectos, cuya inhibición postranscripcional tiene un efecto nocivo sobre el crecimiento y/o supervivencia de la plaga, por ejemplo, para proporcionar un beneficio protector contra la plaga a una planta. En ejemplos particulares, un gen objetivo es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos alrededor de 85 % idéntica, alrededor de 90 % idéntica, alrededor de 95 % idéntica, alrededor de 96 % idéntica, alrededor de 97 % idéntica, alrededor de 98 % idéntica, alrededor de 99 % idéntica, alrededor de 100 % idéntico o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 85, 87, 89 y 94. En ejemplos particulares, un gen objetivo es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos alrededor de 85 % idéntica, alrededor de 90 % idéntica, alrededor de 95 % idéntica, alrededor de 96 % idéntica, alrededor de 97 % idéntica, alrededor de 98 % idéntica, alrededor de 99 % idéntica, alrededor de 100 % idéntico o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:2. En ejemplos particulares, un gen objetivo es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos alrededor de 85 % idéntica, alrededor de 90 % idéntica, alrededor de 95 % idéntica, alrededor de 96 % idéntica, alrededor de 97 % idéntica, alrededor de 98 % idéntica, alrededor de 99 % idéntica, alrededor de 100 % idéntico o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:85. En ejemplos particulares, un gen objetivo es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos alrededor de 85 % idéntica, alrededor de 90 % idéntica, alrededor de 95 % idéntica, alrededor de 96 % idéntica, alrededor de 97 % idéntica, alrededor de 98 % idéntica, alrededor de 99 % idéntica, alrededor de 100 % idéntico o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:87. En ejemplos particulares, un gen objetivo es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos alrededor de 85 % idéntica, alrededor de 90 % idéntica, alrededor de 95 % idéntica, alrededor de 96 % idéntica, alrededor de 97 % idéntica, alrededor de 98 % idéntica, alrededor de 99 % idéntica, alrededor de 100 % idéntico o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:89. En ejemplos particulares, un gen objetivo es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que puede traducirse inversamente in silico a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos alrededor de 85 % idéntica, alrededor de 90 % idéntica, alrededor de 95 % idéntica, alrededor de 96 % idéntica, alrededor de 97 % idéntica, alrededor de 98 % idéntica, alrededor de 99 % idéntica, alrededor de 100 % idéntico o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:94.

De acuerdo con la invención, se proporcionan ADNs, cuya expresión resulta en una molécula de ARN que comprende un polinucleótido que es específicamente complementario de toda o parte de una molécula de ARN nativo que está codificada por un polinucleótido codificante en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). En algunas modalidades, después de la ingestión por una plaga de insectos de la molécula de ARN expresada, puede obtenerse una regulación negativa del polinucleótido codificante en las células de la plaga. En modalidades particulares, la regulación negativa de la secuencia codificante en células de la plaga de insectos puede resultar en un efecto nocivo sobre el crecimiento y/o desarrollo de la plaga.

En algunas modalidades, los polinucleótidos objetivo incluyen ARN no codificantes transcritos, tales como 5'UTRs; 3'UTRs; líderes empalmados; intrones, outrones (por ejemplo, ARN 5'UTR subsecuentemente modificado en empalme trans); donatrones (por ejemplo, ARN no codificante requerido para proporcionar secuencias donantes para empalme trans); y otros ARN transcriptos no codificantes de genes objetivo de plagas de insectos. Dichos polinucleótidos pueden derivarse a partir de genes mono-cistrónicos y poli-cistrónicos.

Por lo tanto, también se describe en la presente descripción en relación con algunas modalidades las moléculas de iARN (hpARNs) que comprenden al menos un polinucleótido que es específicamente complementario de todo o parte de un ácido nucleico objetivo en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). En algunas modalidades, una molécula de iARN puede comprender polinucleótido(s) que son complementarios a todo o parte de una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo; por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ácidos nucleicos objetivos. En modalidades particulares, se puede producir una molécula de iARN in vitro o in vivo por un organismo genéticamente modificado, tal como una planta o bacteria. También se describen ADNcs que pueden usarse para la producción de moléculas de ARNds, moléculas de siARN, moléculas de miARN, moléculas de shARN y/o moléculas de hpARN que son específicamente complementarias a todo o parte de un ácido nucleico objetivo en una plaga de insectos. Además, se describen constructos de ADN recombinante para usar en el logro de la transformación estable de objetivos particulares del huésped. Los objetivos del huésped transformado pueden expresar niveles efectivos de moléculas de ARNds, siARN, miARN, shARN y/o hpARN a partir de los constructos de ADN recombinante. Por lo tanto, también se describe un vector de transformación vegetal que comprende al menos un polinucleótido operativamente unido a un promotor heterólogo funcional en una célula vegetal, en donde la expresión de los polinucleótidos resulta en una molécula de ARN que comprende una cadena de nucleobases contiguas que es específicamente complementaria a todo o parte de un ácido nucleico objetivo en una plaga de insectos.

En ejemplos particulares, las moléculas de ácido nucleico útiles para el control de plagas de insectos (por ejemplo,coleóptero) pueden incluir: todo o parte de un ácido nucleico nativo aislado a partir de Diabrotica que comprende un polinucleótido ncm (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3-6 y 77); todo o parte de un ácido nucleico nativo aislado a partir de Meligethes aeneus que comprende un polinucleótido ncm (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, 90 y 93; los ADNs que, cuando se expresan, resultan en una molécula de ARN que comprende un polinucleótido que es específicamente complementario a toda o parte de una molécula de ARN nativo que está codificada por ncm; las moléculas de iARN (por ejemplo, las ARNdss, siARNs, miARNs, shARNs y hpARNs) que comprenden al menos un polinucleótido que es específicamente complementario a todo o parte de ncm; los ADNcs que pueden usarse para la producción de moléculas de ARNds, moléculas de siARN, moléculas de miARN, moléculas de shARN y/o moléculas de hpARN que son específicamente complementarias a todo o parte de ncm; y constructos de a Dn recombinante para uso en el logro de la transformación estable de objetivos particulares del huésped, en donde un objetivo del huésped transformado comprende una o más de las moléculas de ácido nucleico anteriores.

B. Moléculas de ácido nucleico

La presente invención proporciona, entre otros, las moléculas de iARN (hpARN) que inhiben la expresión del gen objetivo en una célula, tejido u órgano de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero); y moléculas de ADN capaces de expresarse como una molécula de iARN en una célula o microorganismo para inhibir la expresión del gen objetivo en una célula, tejido u órgano de una plaga de insectos.

Algunas modalidades de la invención proporcionan una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos un (por ejemplo, uno, dos, tres o más) polinucleótido(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 1, 77, 84, 86, 88 y 93; el complemento de SEQ ID NO:1, 77, 84, 86, 88 o 93; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ iD NO:84, 86, 88 o 93; el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 84, 86, 88 o 93; un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes (por ejemplo, PB) que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 o 93; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 o 93; un fragmento de al menos 15 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 o 93; y el complemento de un fragmento de al menos 15 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 o 93. En modalidades particulares, el contacto o la absorción por una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) de un iARN transcrito a partir del polinucleótido aislado inhibe el crecimiento, desarrollo y/o alimentación de la plaga.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención puede comprender al menos un (por ejemplo, uno, dos, tres o más) polinucleótido(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en: un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 y/o 93; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 y/o 93; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo planta Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 y/o 93; y el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84, 86, 88 y/o 93. En modalidades particulares, el contacto o la absorción por una plaga de coleópteros del polinucleótido aislado inhibe el crecimiento, desarrollo y/o alimentación de la plaga.

En ciertas modalidades, las moléculas de ARNds proporcionadas por la invención comprenden polinucleótidos complementarios a una transcripto a partir de un gen objetivo que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93, y fragmentos de estos, cuya inhibición del gen objetivo en una plaga de insectos resulta en la reducción o eliminación de un agente polipeptídico o polinucleotídico que es esencial para el crecimiento, desarrollo u otra función biológica de la plaga. Un gen objetivo seleccionado puede exhibir una identidad de secuencia de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 77, 84, 86, 88 y 93; un fragmento contiguo de SEQ ID NO:1, 77, 84, 86, 88 y/o 93; y el complemento de cualquiera de las anteriores. Por ejemplo, un gen objetivo seleccionado puede exhibir 79 %; 80 %; alrededor de 81 %; alrededor de 82 %; alrededor de 83 %; alrededor de 84 %; alrededor de 85 %; alrededor de 86 %; alrededor de 87 %; alrededor de 88 %; alrededor de 89 %; alrededor de 90 %; alrededor de 91 %; alrededor de 92 %; alrededor de 93 %; alrededor de 94 %; alrededor de 95 %; alrededor de 96 %; alrededor de 97 %; alrededor de 98 %; alrededor de 98,5 %; alrededor de 99 %; alrededor de 99,5 %; o alrededor de 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3-6, 77, 84, 86, 88, 90 y 93; un fragmento contiguo de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3-6, 77, 84, 86, 88, 90 y 93; y el complemento de cualquiera de las anteriores.

En algunas modalidades, una molécula de ADN capaz de expresarse como una molécula de iARN en una célula o microorganismo para inhibir la expresión del gen objetivo puede comprender un solo polinucleótido que es específicamente complementario a todo o parte de un polinucleótido nativo encontrado en una o más especies de plagas de insectos objetivo (por ejemplo, una especie de plaga de coleópteros), o la molécula de ADN puede construirse como una quimera a partir de una pluralidad de tales polinucleótidos específicamente complementarios.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico puede comprender un primer y un segundo polinucleótido separados por un "separador." Un separador puede ser una región que comprende cualquier secuencia de nucleótidos que facilite la formación de estructuras secundarias entre los polinucleótidos primero y segundo, donde se desee. En una modalidad, el separador es parte de un polinucleótido codificante sentido o antisentido para ARNm. El separador puede comprender alternativamente cualquier combinación de nucleótidos u homólogos de estos que sean capaces de unirse covalentemente a una molécula de ácido nucleico.

Por ejemplo, en algunas modalidades, la molécula de ADN puede comprender un polinucleótido que codifica para una o más moléculas de iARN diferentes, en donde cada una de las diferentes moléculas de iARN comprende un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido, en donde los polinucleótidos primero y segundo son complementarios entre sí. Los polinucleótidos primero y segundo pueden estar conectados dentro de una molécula de ARN por un separador. El separador puede constituir parte del primer polinucleótido o el segundo polinucleótido. La expresión de una molécula de a Rn que comprende el primer y segundo polinucleótidos de nucleótidos puede provocar la formación de una molécula de ARNds, por apareamiento de bases intramoleculares específicas del primer y segundo polinucleótidos de nucleótidos. El primer polinucleótido o el segundo polinucleótido pueden ser sustancialmente idénticos a un polinucleótido (por ejemplo, un gen objetivo o polinucleótido no codificante transcrito) nativo de una plaga de insectos (por ejemplo, una plaga de coleópteros), un derivado de este, o un polinucleótido complementario al mismo.

Las moléculas de ácido nucleico de ARNds comprenden cadenas dobles de ribonucleótidos polimerizados, y pueden incluir modificaciones a la cadena principal de fosfato-azúcar o al nucleósido. Las modificaciones en la estructura del ARN pueden adaptarse para permitir la inhibición específica. En una modalidad, las moléculas de ARNds pueden modificarse a través de un proceso enzimático ubicuo para que puedan generarse moléculas de siARN. Este proceso enzimático puede utilizar una enzima RNasa III, tal como DICEr en eucariotas, ya sea in vitro o in vivo. Véase Elbashir y otros (2001) Nature 411:494-8; y Hamilton y Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2. DICER o enzimas RNasa III funcionalmente equivalentes escinden cadenas de ARNds más grandes y/o moléculas de hpARN en oligonucleótidos más pequeños (por ejemplo, siARNs), cada uno de los cuales tiene alrededor de 19-25 nucleótidos de longitud. Las moléculas de siARN producidas por estas enzimas tienen de 2 a 3 nucleótidos salientes 3', y fosfato 5' e hidroxilo 3' terminales. Las moléculas de siARN generadas por las enzimas RNasa III se desenrollan y se separan en ARN monocatenario en la célula. Las moléculas de siARN se hibridan específicamente con los ARNs transcritos a partir de un gen objetivo, y ambas moléculas de ARN se degradan subsecuentemente por un mecanismo inherente de degradación del ARN celular. Este proceso puede resultar en la degradación o eliminación efectiva del ARN codificado por el gen objetivo en el organismo objetivo. El resultado es el silenciamiento postranscripcional del gen objetivo. En algunas modalidades, las moléculas de siARN producidas por enzimas RNasa III a partir de moléculas de ácido nucleico heterólogo pueden mediar eficientemente la regulación negativa de genes objetivo en plagas de insectos.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico puede incluir al menos un polinucleótido de origen no natural que puede transcribirse en una molécula de ARN monocatenario capaz de formar una molécula de ARNds in vivo a través de la hibridación intermolecular. Tales ARNdss típicamente se autoensamblan y pueden proporcionarse en la fuente de nutrición de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) para lograr la inhibición postranscripcional de un gen objetivo. En estas y otras modalidades, una molécula de ácido nucleico puede comprender dos polinucleótidos diferentes de origen no natural, cada uno de los cuales es específicamente complementario a un gen objetivo diferente en una plaga de insectos. Cuando dicha molécula de ácido nucleico se proporciona como una molécula de ARNds para, por ejemplo, una plaga de coleópteros, la molécula de ARNds inhibe la expresión de al menos dos genes objetivo diferentes en la plaga.

C. Obtención de moléculas de ácido nucleico

Una variedad de polinucleótidos en plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero) pueden usarse como objetivos para el diseño de moléculas de ácido nucleico, tales como iARNs y las moléculas de ADN que codifican los iARNs. La selección de polinucleótidos nativos no es, sin embargo, un proceso directo. Por ejemplo, solo un pequeño número de polinucleótidos nativos en una plaga de coleópteros serán objetivos efectivos. No se puede predecir con certeza si un polinucleótido nativo particular puede ser regulado negativamente con efectividad por las moléculas de ácido nucleico de la invención, o si la regulación negativa de un polinucleótido nativo particular tendrá un efecto perjudicial sobre el crecimiento, desarrollo y/o viabilidad de una plaga de insectos. La gran mayoría de los polinucleótidos de plaga de coleópteros nativos, tales como los ESTs aislados de los mismos (por ejemplo, los polinucleótidos de plaga de coleópteros enumerados en la patente de Estados Unidos 7,612,194), no tienen un efecto perjudicial sobre el crecimiento y/o la viabilidad de la plaga. Tampoco es predecible cuáles de los polinucleótidos nativos que pueden tener un efecto perjudicial sobre una plaga de insectos pueden usarse en técnicas recombinantes para expresar moléculas de ácido nucleico complementarias a dichos polinucleótidos nativos en una planta huésped y proporcionar el efecto perjudicial sobre la plaga al alimentarse sin causar daño a la planta huésped.

En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNds para proporcionar en la planta huésped de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero)) se seleccionan para marcar los ADNcs que codifican proteínas o partes de proteínas esenciales para el desarrollo de la plaga, tales como polipéptidos involucrados en vías bioquímicas metabólicas o catabólicas, división celular, metabolismo energético, digestión, reconocimiento de la planta hospedera, y similares. Como se describe en la presente descripción, la ingestión de composiciones por parte de un organismo de plaga objetivo que contiene uno o más ARNdss, de los cuales al menos un segmento es específicamente complementario a al menos un segmento sustancialmente idéntico de ARN producido en las células del organismo de plaga objetivo, puede resultar en la muerte u otra inhibición del objetivo. Puede usarse un polinucleótido, ya sea ADN o ARN, derivado a partir de una plaga de insectos para construir células vegetales resistentes a la infestación por las plagas. La planta huésped de la plaga de coleópteros (por ejemplo, Z. mays o Brassica), por ejemplo, puede transformarse para contener uno o más polinucleótidos derivados a partir de la plaga de coleópteros como se proporcionan en la presente descripción. El polinucleótido transformado dentro del huésped puede codificar uno o más A r Ns que se forman en una estructura de ARNds en las células o fluidos biológicos dentro del huésped transformado, lo que hace, por lo tanto, que el ARNds esté disponible si/cuando la plaga forma una relación nutricional con el huésped transgénico. Esto puede resultar en la supresión de la expresión de uno o más genes en las células de la plaga y, en última instancia, la muerte o la inhibición de su crecimiento o desarrollo.

Por lo tanto, en algunas modalidades, se dirige un gen que está esencialmente involucrado en el crecimiento y/o desarrollo de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Otros genes objetivo para usar en la presente invención pueden incluir, por ejemplo, aquellos que juegan papeles importantes en la viabilidad de la plaga, movimiento, migración, crecimiento, desarrollo, infectividad y establecimiento de sitios de alimentación. Por lo tanto, un gen objetivo puede ser un gen de limpieza o un factor de transcripción. Adicionalmente, un polinucleótido nativo de plaga de insectos para usar en la presente invención también puede derivarse a partir de un homólogo (por ejemplo, un ortólogo), de un gen vegetal, viral, bacteriano o de insectos, cuya función es conocida por los expertos en la técnica, y cuyo polinucleótido es específicamente hibridable con un gen objetivo en el genoma de la plaga objetivo. Los métodos para identificar un homólogo de un gen con una secuencia de nucleótidos conocida por hibridación son conocidos por los expertos en la técnica.

Algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos para obtener una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido para producir una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds, siARN, miARN, shARN y hpARN). Uno de esos aspectos de la descripción comprende: (a) analizar uno o más gen(es) objetivo para su expresión, función y fenotipo tras la supresión génica mediada por ARNds en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero); (b) sondear una biblioteca de ADNc o ADNg con una sonda que comprende todo o una porción de un polinucleótido o un homólogo de este a partir de una plaga marcada que muestra una alteración (por ejemplo, reducido) fenotipo de crecimiento o desarrollo en un análisis de supresión mediada por ARNds; (c) identificar un clon de ADN que hibrida específicamente con la sonda; (d) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); (e) secuenciar el fragmento de ADNc o ADNg que comprende el clon aislado en la etapa (d), en donde la molécula de ácido nucleico secuenciada comprende todo o una porción sustancial del ARN o un homólogo de este; y (f) sintetizar químicamente todo o una porción sustancial de un gen, o un siARN, miARN, hpARN, ARNm, shARN o ARNds.

En aspectos adicionales de la descripción, un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que comprende un polinucleótido para producir una porción sustancial de una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds, siARN, miARN, shARN y hpARN) incluye: (a) sintetizar cebadores oligonucleotídicos primero y segundo específicamente complementarios a una porción de un polinucleótido nativo a partir de una plaga de insectos objetivo (por ejemplo, coleóptero); y (b) amplificar un inserto de ADNc o ADNg presente en un vector de clonación mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos primero y segundo de la etapa (a), en donde la molécula de ácido nucleico amplificada comprende una porción sustancial de una molécula de siARN, miARN, hpARN, ARNm, shARN o ARNds.

Los ácidos nucleicos pueden aislarse, amplificarse o producirse por una serie de enfoques. Por ejemplo, una molécula de iARN (por ejemplo, ARNds, siARN, miARN, shARN y hpARN) pueden obtenerse mediante amplificación por PCR de un polinucleótido objetivo (por ejemplo, un gen objetivo o un polinucleótido no codificante transcrito objetivo) derivado a partir de una biblioteca de ADNg o ADNc, o porciones de estos. Se puede extraer ADN o ARN de un organismo objetivo, y a partir de ellos pueden prepararse bibliotecas de ácido nucleico mediante el uso de métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica. Las bibliotecas de ADNg o ADNc generadas a partir de un organismo objetivo pueden usarse para la amplificación por PCR y la secuenciación de genes objetivo. Un producto de PCR confirmado puede usarse como molde para la transcripción in vitro para generar ARN sentido y antisentido con promotores mínimos. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico pueden sintetizarse por cualquiera de una serie de técnicas (véase, por ejemplo, Ozaki y otros (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; y Agrawal y otros (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluido el uso de un sintetizador de ADN automatizado (por ejemplo, un sintetizador de ADN/ARN de PE Biosystems, Inc. (Foster City, California) modelo 392 o 394), mediante el uso de productos químicos estándar, tales como la química de fosforamidita. Véase, por ejemplo, Beaucage y otros (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; patente de Estados Unidos 4,980,460, 4,725,677, 4,415,732, 4,458,066, y 4,973,679. Además, se pueden emplear químicas alternativas que resultan en grupos del esqueleto no naturales, tales como fosforotioato, fosforamidato, y similares.

Una molécula de hpARN de la presente invención puede ser producida química o enzimáticamente por un experto en la técnica a través de reacciones manuales o automatizadas, o in vivo en una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica la molécula de hpARN. El ARN también puede producirse por síntesis orgánica parcial o total; cualquier ribonucleótido modificado puede introducirse por síntesis enzimática u orgánica in vitro. Una molécula de ARN puede ser sintetizada por una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa bacteriófaga (por ejemplo, ARN polimerasa T3, ARN polimerasa T7 y ARN polimerasa SP6). Los constructos de expresión útiles para la clonación y expresión de polinucleótidos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, publicación de patente internacional PCT No. WO97/32016; y las patentes de Estados Unidos 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214, y 5,804,693. Las moléculas de ARN que se sintetizan químicamente o por síntesis enzimática in vitro pueden purificarse antes de la introducción en una célula. Por ejemplo, las moléculas de ARN pueden purificarse a partir de una mezcla mediante extracción con un solvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una combinación de estos. Alternativamente, las moléculas de ARN que se sintetizan químicamente o por síntesis enzimática in vitro pueden usarse sin purificación o con un mínimo de purificación, por ejemplo, para evitar pérdidas debido al procesamiento de la muestra. Las moléculas de ARN pueden secarse para almacenamiento o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales para promover el alineamiento y/o la estabilización de las cadenas dúplex de la molécula de ARNds.

En modalidades, una molécula de ARNds puede estar formada por una sola cadena de ARN autocomplementaria o por dos cadenas de ARN complementarias. Las moléculas de ARNds pueden sintetizarse in vivo o in vitro. Una ARN polimerasa endógena de la célula puede mediar la transcripción de una o dos cadenas de ARN in vivo, o la ARN polimerasa clonada puede usarse para mediar la transcripción in vivo o in vitro. La inhibición postranscripcional de un gen objetivo en una plaga de insectos puede ser dirigida al huésped por transcripción específica en un órgano, tejido o tipo celular del huésped (por ejemplo, mediante el uso de un promotor específico del tejido); estimulación de una condición ambiental en el huésped (por ejemplo, mediante el uso de un promotor inducible que responda a infecciones, estrés, temperatura y/o inductores químicos); y/o transcripción de ingeniería en una etapa de desarrollo o edad del huésped (por ejemplo, mediante el uso de un promotor específico de la etapa de desarrollo). Las cadenas de ARN que forman una molécula de ARNds, ya sea transcrita in vitro o in vivo, puede o no estar poliadenilada, y puede o no ser capaz de ser traducida a un polipéptido por un aparato traduccional de la célula.

D. Vectores recombinantes y transformación de la célula huésped

En algunas modalidades, la invención también proporciona una molécula de ADN para la introducción en una célula (por ejemplo, una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula vegetal), en donde la molécula de ADN comprende un polinucleótido que, tras la expresión en ARN y la ingestión por una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero), logra la supresión de un gen objetivo en una célula, tejido u órgano de la plaga. Por lo tanto, algunas modalidades proporcionan una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido capaz de expresarse como una molécula de iARN (hpARN) en una célula vegetal para inhibir la expresión del gen objetivo en una plaga de insectos. Para iniciar o mejorar la expresión, tales moléculas de ácido nucleico recombinante pueden comprender uno o más elementos reguladores, cuyos elementos reguladores pueden estar operativamente unidos al polinucleótido capaz de expresarse como un iARN. Se conocen métodos para expresar una molécula de supresión génica en plantas, y pueden usarse para expresar un polinucleótido de la presente invención. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional PCT No. WO06/073727; y la publicación de patente de Estados Unidos No. 2006/0200878 A1)

En modalidades, una molécula de ADN recombinante de la invención comprende un polinucleótido que codifica un ARN que puede formar una molécula de ARNds. Dichas moléculas de ADN recombinante pueden codificar ARNs que pueden formar moléculas de ARNds capaces de inhibir la expresión de gen(es) objetivo endógeno(s) en una célula de plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) tras la ingestión. En modalidades, un ARN transcrito forma una molécula de ARNds que puede proporcionarse en una forma estabilizada; por ejemplo, como una horquilla y estructura de tallo y lazo.

En algunas modalidades, se puede formar una cadena de una molécula de ARNds por transcripción a partir de un polinucleótido que es sustancialmente homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, y 93; los complementos de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88 y 93; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEC ID NOs: 84, 86, 88 y 93 (por ejemplo, SEQ ID NO:90); el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEC ID NOs: 84, 86, 88 y 93; un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes (por ejemplo, PB) que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, 90 y/o 93; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, 90 y/o 93; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, 90 y/o 93; y el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, 90 y/o 93.

En algunos aspectos de la descripción, se puede formar una cadena de una molécula de ARNds por transcripción a partir de un polinucleótido que es sustancialmente homólogo a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3-6 y 90; los complementos de las SEQ ID NOs: 3-6 y 90; fragmentos de al menos 15 nucleótidos contiguos de las SEQ ID NOs: 3-6 y 90; y los complementos de fragmentos de al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NOs: 3-6 y 90.

En modalidades particulares, una molécula de ADN recombinante que codifica un ARN que puede formar una molécula de ARNds puede comprender una región codificante en donde al menos dos polinucleótidos están dispuestos de manera que un polinucleótido esté en una orientación sentido, y el otro polinucleótido esté en una orientación antisentido, con relación a, al menos, a un promotor, en donde el polinucleótido sentido y el polinucleótido antisentido están unidos o conectados por un separador de, por ejemplo, de aproximadamente cinco (~5) a aproximadamente mil (-1000) nucleótidos. El separador puede formar un lazo entre los polinucleótidos sentido y antisentido. El polinucleótido sentido o el polinucleótido antisentido puede ser sustancialmente homólogos a un gen objetivo (por ejemplo, un gen ncm que comprende la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, y/o SEQ ID NO:93) o un fragmento de estos. Sin embargo, en algunas modalidades, una molécula de ADN recombinante puede codificar un ARN que puede formar una molécula de ARNds sin un separador. En modalidades, un polinucleótido codificante sentido y un polinucleótido codificante antisentido pueden tener diferentes longitudes.

Los polinucleótidos identificados como que tienen un efecto nocivo sobre una plaga de insectos o un efecto protector de la planta con respecto a la plaga pueden incorporarse fácilmente en las moléculas de ARNds expresadas a través de la creación de casetes de expresión apropiados en una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. Por ejemplo, dichos polinucleótidos pueden expresarse como una horquilla con estructura de tallo y lazo al tomar un primer segmento correspondiente a un polinucleótido del gen objetivo (porejemplo, un gen ncm que comprende la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, y/o SEQ ID NO:93, y fragmentos de cualquiera de los anteriores); unir este polinucleótido a una región separadora del segundo segmento que no es homóloga o complementaria al primer segmento; y unir esto a un tercer segmento, en donde al menos una porción del tercer segmento es sustancialmente complementario al primer segmento. Tal construcción forma una estructura de tallo y lazo mediante el apareamiento de bases intramolecular del primer segmento con el tercer segmento, en donde las formas de estructura de lazo comprenden el segundo segmento. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos Nos.

2002/0048814 y 2003/0018993; las publicaciones de patente internacional PCT Nos. WO94/01550 y WO98/05770. Se puede generar una molécula de ARNds, por ejemplo, en forma de una estructura bicatenaria, tal como una estructura de tallo-lazo (por ejemplo, horquilla), de manera que la producción de siARN dirigida a un polinucleótido nativo de plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) se potencia mediante la coexpresión de un fragmento del gen objetivo, por ejemplo, en un casete adicional expresable en plantas, que conduce a una producción de siARN mejorada, o reduce la metilación para evitar el silenciamiento génico transcripcional del promotor de horquilla de ARNds.

Las modalidades de la invención incluyen la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención en una planta (es decir, transformación) para lograr niveles de expresión de una o más moléculas de iARN inhibitorios de plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Una molécula de ADN recombinante puede ser, por ejemplo, un vector, tal como un plásmido lineal o circular cerrado. El sistema de vectores puede ser un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se introducirá dentro del genoma de un huésped. Además, un vector puede ser un vector de expresión. Los ácidos nucleicos de la invención pueden, por ejemplo, insertarse adecuadamente en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o más huéspedes para conducir la expresión de un polinucleótido codificador unido u otro elemento de ADN. Se dispone de muchos vectores para este fin, y la selección del vector apropiado dependerá, principalmente, del tamaño del ácido nucleico a insertar dentro del vector y la célula huésped particular a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, en dependencia de su función (por ejemplo, amplificación de ADN y expresión de ADN), y la célula huésped particular con la que es compatible.

Para impartir resistencia a plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) a una planta transgénica, un ADN recombinante puede, por ejemplo, transcribirse en una molécula de iARN (por ejemplo, una molécula de ARN que forma una molécula de ARNds) dentro de los tejidos o fluidos de la planta recombinante. Una molécula de iARN puede comprender un polinucleótido que es sustancialmente homólogo y específicamente hibridable con un polinucleótido transcrito correspondiente dentro de una plaga de insectos que puede causar daño a la especie de la planta huésped. La plaga puede contactar con la molécula de iARN que se transcribe en las células de la planta huésped transgénica, por ejemplo, al ingerir células o fluidos de la planta huésped transgénica que comprende la molécula de iARN. Por lo tanto, en ejemplos particulares, la expresión de un gen objetivo es suprimida por la molécula de iARN dentro de las plagas de coleópteros que infestan la planta huésped transgénica. En algunas modalidades, la supresión de la expresión del gen objetivo en una plaga de coleópteros objetivo puede resultar en que la planta sea resistente al ataque de la plaga.

Para permitir el suministro de moléculas de iARN a una plaga de insectos en una relación nutricional con una célula vegetal que se ha transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención, expresión (es decir, transcripción) de las moléculas de iARN en la célula vegetal. Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender un polinucleótido de la invención operativamente unido a uno o más elementos reguladores, tales como un elemento promotor heterólogo que funciona en una célula huésped, tal como una célula bacteriana en donde la molécula de ácido nucleico se va a amplificar, y una célula vegetal en donde se va a expresar la molécula de ácido nucleico.

Los promotores adecuados para uso en las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen aquellos que son inducibles, virales, sintéticos, o constitutivos, todos los cuales se conocen bien en la técnica. Los ejemplos no limitantes que describen tales promotores incluyen las patentes de Estados Unidos 6,437,217 (promotor de maíz RS81 ); 5,641,876 (promotor de actina de arroz); 6,426,446 (promotor de maíz RS324); 6,429,362 (promotor de maíz PR-1); 6,232,526 (promotor de maíz A3); 6,177,611 (promotores constitutivos de maíz); 5,322,938, 5,352,605,5,359,142, y 5,530,196 (promotor de CaMV 35S); 6,433,252 (promotor de oleosina de maíz L3); 6,429,357 (promotor de actina 2 de arroz, e intrón de actina 2 de arroz); 6,294,714 (promotores inducibles por la luz); 6,140,078 (promotores inducibles por sales); 6,252,138 (promotores inducibles por patógenos); 6,175,060 (promotores inducibles por deficiencia de fósforo); 6,388,170 (promotores bidireccionales); 6,635,806 (promotor de gamma-coixina); y la publicación de patente de Estados Unidos No.

2009/757,089 (promotor de aldolasa de cloroplasto de maíz). Los promotores adicionales incluyen el promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. e Ua 84(16):5745-9) y los promotores de octopina sintasa (OCS) (que se transportan en los plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); los promotores de caulimovirus tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor 19S (CaMV) (Lawton y otros (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); el promotor de CaMV 35S (Odell y otros (1985) Nature 313:810-2; el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (Walker y otros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. EuA 84(19):6624-8); el promotor de la sacarosa sintasa (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:4144-8); el promotor del complejo de gene R (Chandler y otros (1989) Plant Cell 1:1175-83); el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/b; CaMV 35S (patentes de Estados Unidos 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, y 5,530,196); FMV 35S (patentes de Estados Unidos 6,051,753, y 5,378,619); un promotor PC1SV (patente de Estados Unidos 5,850,019); el promotor SCP1 (patente de Estados Unidos 6,677,503); y promotores AGRtu.nos (GenBank™ No. de acceso V00087; Depicker y otros (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan y otros (1983) Nature 304:184-7).

En modalidades particulares, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden un promotor específico del tejido, tal como un promotor específicos de la raíz. Los promotores específicos de la raíz impulsan la expresión de polinucleótidos codificantes unidos operativamente de manera exclusiva o preferencial en el tejido de la raíz. Ejemplos de promotores específicos de la raíz son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos 5,110,732; 5,459,252 y 5,837,848; y Opperman y otros (1994) Science 263:221-3; and Hirel y otros (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. En algunas modalidades, un polinucleótido o fragmento para el control de plaga de coleópteros de acuerdo con la invención puede clonarse entre dos promotores específicos de la raíz orientados en direcciones transcripcionales opuestas con relación al polinucleótido o fragmento, y que son operables en una célula vegetal transgénica y expresados en el mismo para producir moléculas de ARN en la célula vegetal transgénica que subsecuentemente pueden formar moléculas de ARNds, como se describe, más arriba. Las moléculas de iARN expresadas en tejidos vegetales pueden ser ingeridas por una plaga de insectos para que se logre la supresión de la expresión del gen objetivo.

Los elementos reguladores adicionales que opcionalmente pueden estar operativamente unidos a un ácido nucleico incluyen 5'UTRs ubicados entre un elemento promotor y un polinucleótido codificante que funciona como un elemento líder de traducción. El elemento líder de la traducción está presente en el ARNm completamente procesado, y puede afectar el procesamiento del transcrito primario, y/o la estabilidad del ARN. Los ejemplos de elementos líderes de la traducción incluyen los líderes de proteínas de choque térmico del maíz y petunia (patente de Estados Unidos 5,362,865), los líderes de la cubierta de virus de plantas, los líderes de rubisco de plantas, y otros. Véase, por ejemplo, Turner y Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Los ejemplos no limitantes de 5'UTRs incluyen GmHsp (patente de Estados Unidos 5,659,122); PhDnaK (patente de Estados Unidos 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington y Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); y AGRtunos (GenBank™ No. de acceso V00087; y Bevan y otros (1983) Nature 304:184-7).

Los elementos reguladores adicionales que opcionalmente pueden estar operativamente unidos a un ácido nucleico también incluyen elementos 3' no traducidos, regiones determinación de la transcripción 3' o regiones de poliadenilación. Estos son elementos genéticos ubicados aguas abajo de un polirribonucleótido, e incluyen polinucleótidos que proporcionan señales de poliadenilación, y/u otras señales reguladoras capaces de afectar la transcripción o el procesamiento del ARNm. La señal de poliadenilación funciona en plantas para causar la adición de nucleótidos de poliadenilato al extremo 3' del precursor de ARNm. El elemento de poliadenilación puede derivarse a partir de una variedad de genes de plantas, o de genes de ADN-T. Un ejemplo no limitante de una región de terminación de la transcripción 3' es la región 3' de nopalina sintasa (nos 3'; Fraley y otros (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80:4803-7). Un ejemplo del uso de diferentes regiones 3' no traducidas se proporciona en Ingelbrecht y otros, (1989), Plant Cell 1:671-80. Los ejemplos no limitantes de señales de poliadenilación incluyen una a partir de un gen de RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi y otros (1984) EMBO J. 3:1671-9) y AGRtu.nos (GenBank™ No. de acceso E01312).

Algunas modalidades pueden incluir un vector de transformación vegetal que comprende una molécula de ADN aislada y purificada que comprende al menos uno de los elementos reguladores descritos anteriormente unidos operativamente a uno o más polinucleótidos de la presente invención. Cuando se expresa, el uno o más polinucleótidos resultan en una o más molécula(s) de iARN que comprenden un polinucleótido que es específicamente complementario a todo o parte de una molécula de ARN nativo en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Por lo tanto, los polinucleótido(s) pueden comprender un segmento que codifica todo o parte de un polirribonucleótido presente dentro de un transcrito de ARN de plaga de coleópteros objetivo, y puede comprender repeticiones invertidas de todo o parte de un transcrito de plaga objetivo. Un vector de transformación vegetal puede contener polinucleótidos específicamente complementarios a más de un polinucleótido objetivo, por lo tanto, permite la producción de más de un ARNds para inhibir la expresión de dos o más genes en células de una o más poblaciones o especies de plagas de insectos objetivo. Los segmentos de polinucleótidos específicamente complementarios a los polinucleótidos presentes en diferentes genes pueden combinarse en una sola molécula de ácido nucleico compuesta para la expresión en una planta transgénica. Dichos segmentos pueden ser contiguos o separados por un separador.

En algunas modalidades, un plásmido de la presente invención que ya contiene al menos un polinucleótido(s) de la invención puede modificarse mediante la inserción secuencial de polinucleótido(s) adicional(es) en el mismo plásmido, en donde los polinucleótido(s) adicional(es) están operativamente unidos a los mismos elementos reguladores como al menos un polinucleótido(s) original. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico puede diseñarse para la inhibición de múltiples genes objetivo. En algunas modalidades, los múltiples genes a inhibir pueden obtenerse a partir de la misma especie de plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero), que pueden mejorar la efectividad de la molécula de ácido nucleico. En otras modalidades, los genes pueden derivarse a partir de diferentes plagas de insectos, lo que puede ampliar el rango de plagas contra las cuales el(los) agente(s) son efectivo(s). Cuando se dirigen múltiples genes para la supresión o una combinación de expresión y supresión, se puede diseñar un elemento de ADN policistrónico.

Una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la presente invención puede comprender un marcador de selección que confiere un fenotipo seleccionable a una célula transformada, tal como una célula vegetal. Los marcadores de selección pueden usarse, además, para seleccionar plantas o células vegetales que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. El marcador puede codificar resistencia a biocidas, resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.), o tolerancia a herbicidas (por ejemplo, glifosfato, etc.). Los ejemplos de marcadores de selección incluyen, pero no se limitan a: un gen neo que codifica para resistencia a kanamicina y puede seleccionarse mediante el uso de kanamicina, G418, etc.; un gen bar que codifica resistencia a bialafos; un gen mutante de EPSP sintasa que codifica tolerancia a glifosato; un gen de nitrilase que confiere resistencia a bromoxinil; un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS) que confiere tolerancia a imidazolinona o sulfonilurea; y un gen de DHFR de resistencia a metotrexato. Se dispone de múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloramfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina y tetraciclina, y similares. Los ejemplos de tales marcadores de selección se ilustran, por ejemplo, patente de Estados Unidos 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 y 6,118,047.

Una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la presente invención puede incluir también un marcador que puede tamizarse. Los marcadores que pueden tamizarse pueden usarse para monitorear la expresión. Los marcadores que pueden tamizarse ilustrativos incluyen un gen de p-glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (Jefferson y otros (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); un gen del locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y otros (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson y R. Appels, eds. (Nueva York: Plenum), pp. 263-82); un gen de p-lactamasa (Sutcliffe y otros (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 75:3737-41); un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Owy otros (1986) Science 234:856-9); un gen xylE que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos (Zukowski y otros (1983) Gene 46(2-3):247-55); un gen de amilasa (Ikatu y otros (1990) Bio/Technol. 8:241-2); un gen de tirosinasa que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona la que a su vez se condensa a melanina (Katz y otros (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); y una a-galactosidasa.

En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinante, como se describe, más arriba, puede usarse en métodos para la creación de plantas transgénicas y la expresión de ácidos nucleicos heterólogos en plantas para preparar plantas transgénicas que exhiben una susceptibilidad reducida a plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Los vectores de transformación vegetal se pueden preparar, por ejemplo, al insertar moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de iARN en vectores de transformación vegetal e introducir estos en las plantas.

Los métodos adecuados para la transformación de células huésped incluyen cualquier método mediante el cual el ADN puede introducirse en una célula, tal como por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos 5,508,184); mediante la captación de ADN mediada por desecación/inhibición (véase, por ejemplo, Potrykus y otros (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), mediante electroporación (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos 5,384,253), mediate agitación con fibras de carburo de silicio (véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos 5,302,523 y 5,464,765), mediante transformación mediada por Agrobacterium (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos 5,563,055; 5,591,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; y 6,384,301) y mediante aceleración de partículas recubiertas con ADN (véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; y 6,403,865), etc. Las técnicas que son particularmente útiles para transformar el maíz se describen, por ejemplo, en Patentes de Estados Unidos 7,060,876 y 5,591,616; y publicación de patente internacional PCT WO95/06722. Mediante la aplicación de técnicas como estas, las células de prácticamente cualquier especie pueden transformarse de manera estable. En algunas modalidades, el ADN transformante se integra dentro del genoma de la célula huésped. En el caso de especies multicelulares, las células transgénicas pueden regenerarse en un organismo transgénico. Cualquiera de estas técnicas puede usarse para producir una planta transgénica, por ejemplo, que comprende uno o más ácidos nucleico que codifican uno o más moléculas de iARN en el genoma de la planta transgénica.

El método más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas para las plantas que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de la transformación genética de la planta. Los plásmidos Ti (inductores de tumor) contienen un segmento grande, conocido como ADN-T, que se transfiere a las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región Vir, es responsable de la transferencia del ADN-T. La región de ADN-T presenta repeticiones terminales en sus extremos. En vectores binarios modificados, los genes que inducen tumor se han eliminado, y las funciones de la región Vir se utilizan para transferir el ADN extraño bordeado por los elementos del borde del ADN-T. La región T también puede contener un marcador de selección para la recuperación eficiente de células y plantas transgénicas, y un sitio de clonación múltiple para insertar polinucleótidos para transferencia tales como un ácido nucleico que codifica ARNds.

Por lo tanto, en algunas modalidades, un vector de transformación vegetal se deriva a partir de un plásmido Ti de A. tumefaciens (véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, and 5,501,967; y patente Europea No. EP 0 122791) or un plásmido Ri of A. rhizogenes. Otros vectores de transformación vegetal incluyen, por ejemplo y sin limitación, los descritos por Herrera-Estrellay otros (1983) Nature 303:209-13; Bevan y otros (1983) Nature 304:184-7; Klee y otros (1985) Bio/Technol. 3: 637-42; y en la patente Europea No. EP 0120516, y aquellos derivados a partir de cualquiera de los anteriores. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium, y Mesorhizobium que interactúan naturalmente con plantas pueden modificarse para mediar la transferencia génica a una serie de diversas plantas. Estas bacterias simbióticas asociadas a plantas pueden hacerse competentes para la transferencia génica mediante la adquisición de un plásmido Ti desarmado y un vector binario adecuado.

Después de proporcionar ADN exógeno a las células receptoras, las células transformadas se identifican generalmente para su cultivo posterior y la regeneración de plantas. Para mejorar la capacidad de identificar células transformadas, puede desearse emplear un gen selectivo o marcador que puede tamizarse, como se estableció anteriormente, con el vector de transformación usado para generar el transformante. En el caso en que se use un marcador de selección, las células transformadas se identifican dentro de la población de células potencialmente transformadas mediante la exposición de las células a un agente o agentes de selección. En el caso en que se use un marcador que puede tamizarse, las células pueden tamizarse para detectar el rasgo del gen marcador deseado.

Las células que sobreviven a la exposición al agente de selección, o las células calificadas de positivas en un ensayo de tamizaje, pueden cultivarse en un medio que soporte la regeneración de las plantas. En algunas modalidades, cualquier medio de cultivo de tejidos vegetales adecuado (por ejemplo, los medios MS y N6 ) puede modificarse mediante la inclusión de sustancias adicionales, tales como reguladores del crecimiento. El tejido puede mantenerse en un medio básico con reguladores del crecimiento hasta disponer de tejido suficiente para comenzar los esfuerzos de regeneración de plantas, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para la regeneración (por ejemplo, al menos 2 semanas), después puede transferirse a los medios propicios para la formación de brotes. Los cultivos se transfieren periódicamente hasta que se haya producido suficiente formación de brotes. Una vez que se forman los brotes, se transfieren a los medios propicios para la formación de raíces. Una vez que se forman suficientes raíces, las plantas pueden transferirse al suelo para un mayor crecimiento y maduración.

Para confirmar la presencia de una molécula de ácido nucleico de interés (por ejemplo, un ADN que codifica una o más moléculas de iARN que inhiben la expresión del gen objetivo en una plaga de coleópteros) en las plantas en regeneración, se pueden realizar una serie de ensayos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo: ensayos de biología molecular, tales como southern y northern blot, PCR, y secuenciación de ácidos nucleicos; ensayos bioquímicos, tales como detección de la presencia de un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y/o western blot) o mediante la función enzimática; ensayos de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces; y análisis del fenotipo de la planta regenerada completa.

Los eventos de integración pueden analizarse, por ejemplo, por amplificación por PCR mediante el uso de, por ejemplo, de cebadores de oligonucleótidos específicos para una molécula de ácido nucleico de interés. Se entiende que el genotipado por PCR incluye, pero no se limita a, la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADNg derivado a partir del tejido calloso aislado de la planta huésped que se predice que contiene una molécula de ácido nucleico de interés integrada dentro del genoma, seguido de clonación estándar y análisis de secuencias de los productos de amplificación por PCR. Los métodos de genotipado por PCR se han descrito bien (por ejemplo, Rios, G. y otros (2002) Plant J. 32:243-53) y puede aplicarse al ADNg derivado a partir de cualquier especie vegetal (por ejemplo, Z. mays o Brassica napus) o tipo de tejido, incluidos los cultivos celulares.

Una planta transgénica formada mediante el uso de métodos de transformación dependientes de Agrobacterium contiene típicamente un solo ADN recombinante insertado dentro de un cromosoma. El polinucleótido de un solo ADN recombinante es referido como un "evento transgénico" o "evento de integración". Dichas plantas transgénicas son heterocigotas para el polinucleótido exógeno insertado. En algunas modalidades, una planta transgénica homocigota con respecto a un transgen puede obtenerse por apareamiento sexual consigo misma (autopolinización) de una planta transgénica segregante independiente que contiene un solo gen exógeno para sí mismo, por ejemplo, una planta T0, para producir semilla T1. La cuarta parte de la semilla T1 producida será homocigota con respecto al transgen. La germinación de la semilla T1 resulta en plantas que pueden probarse para determinar su heterocigosidad, típicamente mediante el uso de un ensayo SNP o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotas y homocigotas (es decir, un ensayo de cigosidad).

En modalidades particulares, se producen al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 o más moléculas de iARN diferentes en una célula vegetal que tiene efecto inhibidor de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). Las moléculas de iARN (por ejemplo., moléculas de ARNds) pueden expresarse a partir de múltiples ácidos nucleicos introducidos en diferentes eventos de transformación, o de un solo ácido nucleico introducido en un solo evento de transformación. En algunas modalidades, una pluralidad de moléculas de iARN se expresan bajo el control de un solo promotor. En otras modalidades, una pluralidad de moléculas de iARN se expresan bajo el control de múltiples promotores. Se pueden expresar moléculas de iARN individuales que comprenden múltiples polinucleótidos que son homólogos a diferentes loci dentro de una o más plagas de insectos (por ejemplo, los loci definidos por las SEQ ID NOs: 1, 77, 84, 86 , 88 y 93), ambos en diferentes poblaciones de la misma especie de plaga de insectos, o en diferentes especies de plagas de insectos.

Además de dirigir la transformación de una planta con una molécula de ácido nucleico recombinante, las plantas transgénicas pueden prepararse mediante el cruzamiento de una primera planta que tiene al menos un evento transgénico con una segunda planta que carece de un evento de este tipo. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de iARN puede introducirse en una primera línea vegetal que es susceptible de transformación para producir una planta transgénica, cuya planta transgénica puede cruzarse con una segunda línea vegetal para introgurar el polinucleótido que codifica la molécula de iARN dentro la segunda línea vegetal.

En algunos aspectos, se incluyen semillas y productos básicos producidos por plantas transgénicas derivadas de células vegetales transformadas, en donde las semillas o productos básicos comprenden una cantidad detectable de un ácido nucleico de la invención. En algunas modalidades, tales productos básicos pueden producirse, por ejemplo, al obtener plantas transgénicas y preparar alimentos o piensos a partir de ellas. Los productos básicos que comprenden uno o más de los polinucleótidos de la invención incluyen, por ejemplo y sin limitación: harinas, aceites, granos triturados o enteros o semillas de una planta, y cualquier producto alimenticio que comprenda cualquier harina, aceite o grano triturado o entero de una planta o semilla recombinante que comprende uno o más de los ácidos nucleicos de la invención. La detección de uno o más de los polinucleótidos de la invención en uno o más productos o productos básicos es de facto evidencia de que el producto o producto básico se produce a partir de una planta transgénica diseñada para expresar una o más de las moléculas de iARN de la invención con el propósito de controlar plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero).

En algunas modalidades, una planta o semilla transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención también puede comprender al menos otro evento transgénico en su genoma, que incluye, sin limitación: un evento transgénico a partir del cual se transcribe una molécula de iARN dirigida a un locus en una plaga de coleópteros que no sea de las definidas por las SEC ID NOs: 1, 77, 84, 86 , 88 y 93, tal como, por ejemplo, uno o más loci seleccionados del grupo que consiste en Cafl-180 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0174258), VatpaseC (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0174259), Rho1 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0174260), VatpaseH (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No.

2012/0198586), PPI-87B (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2013/0091600), RPA70 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2013/0091601), RPS6 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2013/0097730), ROP (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/577,811), RNAPII140 (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/577,854), Dre4 (solicitud de patente de los Estados Unidos No.

14/705,807), COPI alpha (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,199), COPI beta (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,203), Co PI gamma (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,192), y COPI delta (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,216); un evento transgénico a partir del cual se transcribe una molécula de iARN dirigida a un gen en un organismo que no sea una plaga de coleópteros (por ejemplo, un nematodo parásito de la planta); un gen que codifica una proteína insecticida (por ejemplo, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis ); un gen de tolerancia a herbicidaspor ejemplo, un gen que proporciona tolerancia al glifosato); y un gen que contribuye a un fenotipo conveniente en la planta transgénica, tal como aumento del rendimiento, metabolismo de los ácidos grasos alterado o restauración de la esterilidad masculina citoplasmática. En modalidades particulares, los polinucleótidos que codifican moléculas de iARN de la invención pueden combinarse con otros rasgos de control y enfermedad de insectos en una planta para lograr los rasgos deseados para un control mejorado de enfermedad de plantas y daños de insectos. La combinación de rasgos de control de insectos que emplean modos de acción distintos puede proporcionar plantas transgénicas protegidas con durabilidad superior sobre las plantas que albergan un solo rasgo de control, por ejemplo, debido a la probabilidad reducida de que se desarrolle resistencia a los rasgo(s) en el campo.

V. Supresión del gen objetivo en una plaga de insectos

A. Visión general

En algunas modalidades de la invención, al menos una molécula de ácido nucleico útil para el control de plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero) puede proporcionarse a una plaga de insectos, en donde la molécula de ácido nucleico conduce al silenciamiento génico mediado por ARNi en la plaga. En modalidades particulares, se puede proporcionar una molécula de iARN (hpARN) a una plaga de coleópteros. En algunas modalidades, se puede proporcionar una molécula de ácido nucleico útil para el control de plagas de insectos a una plaga al poner en contacto la molécula de ácido nucleico con la plaga. En estas y otras modalidades, se puede proporcionar una molécula de ácido nucleico útil para el control de plagas de insectos en un sustrato de alimentación de la plaga, por ejemplo, una composición nutricional. En estas y otras modalidades, se puede proporcionar una molécula de ácido nucleico útil para el control de una plaga de insectos a través de la ingestión de material vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico que se ingiere por la plaga. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico está presente en el material vegetal a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante introducido dentro del material vegetal, por ejemplo, mediante la transformación de una célula vegetal con un vector que comprende el ácido nucleico recombinante y la regeneración de un material vegetal o planta entera a partir de la célula vegetal transformada.

B. Supresión del gen objetivo mediada por ARNi

En modalidades, la invención proporciona moléculas de iARN (hpARN) que pueden diseñarse para dirigirse a polinucleótidos nativos esenciales (por ejemplo, genes esenciales) en el transcriptoma de una plaga de insectos (por ejemplo, una plaga de coleópteros (por ejemplo, WCR, NCR, SCR y Meligethes aeneus)), por ejemplo, al diseñar una molécula de iARN que comprende al menos una cadena que comprende un polinucleótido que es específicamente complementario al polinucleótido objetivo. La secuencia de una molécula de iARN así diseñada puede ser idéntica a la del polinucleótido objetivo, o puede incorporar discordancias que no impiden la hibridación específica entre la molécula de iARN y su polinucleótido objetivo.

Las moléculas de iARN de la invención pueden usarse en métodos para la supresión génica en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero), al reducir, de esta manera, el nivel o la incidencia de daño causado por la plaga en una planta (por ejemplo, una planta transformada protegida que comprende una molécula de iARN). Como se usa en la presente descripción, el término "supresión génica" se refiere a cualquiera de los métodos bien conocidos para reducir los niveles de proteína producidos como resultado de la transcripción génica en ARNm y la traducción posterior del ARNm, incluida la reducción de la expresión de proteínas a partir de un gen o un polinucleótido codificante que incluye inhibición postranscripcional de la expresión y supresión transcripcional. La inhibición postranscripcional está mediada por homología específica entre todo o parte de un ARNm transcrito a partir de un gen dirigido a la supresión y la correspondiente molécula de iARN usada para la supresión. Adicionalmente, la inhibición postranscripcional se refiere a la reducción sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible en la célula para la unión por ribosomas.

En modalidades, la molécula de ARNds puede ser escindida por la enzima, DICER, en moléculas cortas de siARN (aproximadamente 20 nucleótidos de longitud). La molécula de siARN bicatenaria generada por la actividad de DICER sobre la molécula de ARNds puede separarse en dos siARNs monocatenarios; la "cadena de pasajeros" y la "cadena guía". La cadena de pasajeros puede degradarse y la cadena guía puede incorporarse a RISC. La inhibición postranscripcional se produce por hibridación específica de la cadena guía con un polinucleótido específicamente complementario de una molécula de ARNm, y la subsecuente escisión por la enzima Argonaute (componente catalítico del complejo RISC).

Se describe el uso de cualquier forma de molécula de iARN. Los expertos en la técnica entenderán que las moléculas de ARNds son típicamente más estables durante la preparación y durante la etapa de proporcionar la molécula de iARN a una célula que las moléculas de ARN monocatenario, y típicamente también son más estables en una célula. Por lo tanto, mientras que las moléculas de siARN y miARN, por ejemplo, pueden ser igualmente efectivas, se puede elegir una molécula de ARNds debido a su estabilidad.

En modalidades particulares, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido, cuyo polinucleótido puede expresarse in vitro para producir una molécula de iARN que sea sustancialmente homóloga a una molécula de ácido nucleico codificada por un polinucleótido dentro del genoma de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero). En modalidades, la molécula de iARN transcrita in vitro es una molécula de ARNds estabilizada que comprende una estructura de tallo-lazo. Después de que una plaga de insectos contacta a la molécula de iARN transcrita in vitro, puede producirse inhibición postranscripcional de un gen objetivo en la plaga (por ejemplo, un gen esencial).

En algunas modalidades de la invención, la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido se usa en un método para la inhibición postranscripcional de un gen objetivo en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero), en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: la SEQ ID NO:84; el complemento de la SEQ ID NO:84, la SEQ ID NO:86; el complemento de la SeQ ID NO:86, la SEQ ID NO:88; el complemento de la SEQ ID NO:88; la SEQ ID NO:90; el complemento de la SEQ ID NO:90; la SEQ ID NO:93; el complemento de la SEQ ID NO:93; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:84; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:84; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:86; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:86; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:88; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:88; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:90; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:90; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:93; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:93; un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84; un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:86; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:86; un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la s Eq ID NO:88; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:88; un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:90; el complemento de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:90; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:84; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:86; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:86; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:88; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:88; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:90; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:90; un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:93; el complemento de un fragmento de al menos 50 nucleótidos contiguos de un polinucleótido codificante nativo de un organismo Meligethes que comprende la SEQ ID NO:93. En ciertas modalidades, la expresión de una molécula de ácido nucleico que es al menos alrededor de 80 % idéntica (por ejemplo, 79 %, alrededor de 80 %, alrededor de 81 %, alrededor de 82 %, alrededor de 83 %, alrededor de 84 %, alrededor de 85 %, alrededor de 86 %, alrededor de 87 %, alrededor de 88 %, alrededor de 89 %, alrededor de 90 %, alrededor de 91 %, alrededor de 92 %, alrededor de 93 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, alrededor de 100 % y 100 %) pueden usarse con cualquiera de los anteriores. En estas y otras modalidades, se puede expresar una molécula de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ARN presente en al menos una célula de una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero).

Es una característica importante de algunas modalidades en la presente descripción que el sistema de inhibición postranscripcional de ARNi es capaz de tolerar variaciones de secuencia entre genes objetivo que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. La molécula de ácido nucleico introducida no necesita ser absolutamente homóloga a un producto de transcripción primario o a un ARNm completamente procesado de un gen objetivo, siempre que la molécula de ácido nucleico introducida sea específicamente hibridable a un producto de transcripción primario o a un ARNm completamente procesado del gen objetivo. Además, la molécula de ácido nucleico introducida puede no necesitar ser de longitud completa, con relación a un producto de transcripción primario o un ARNm completamente procesado del gen objetivo.

La inhibición de un gen objetivo mediante el uso de la tecnología de iARN de la presente invención es específica de secuencia; es decir, polinucleótidos sustancialmente homólogos a la(s) molécula(s) de iARN están dirigidos a la inhibición genética. En algunas modalidades, una molécula de ARN que comprende un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la de una porción de un gen objetivo puede usarse para la inhibición. En estas y otras modalidades, puede usarse una molécula de ARN que comprende un polinucleótido con una o más mutaciones de inserción, deleción y/o puntuales con relación a a un polinucleótido objetivo. En modalidades particulares, una molécula de iARN y una porción de un gen objetivo pueden compartir, por ejemplo, al menos de aproximadamente 80 %, al menos de aproximadamente 81 %, al menos de aproximadamente 82 %, al menos de aproximadamente 83 %, al menos de aproximadamente 84 %, al menos de aproximadamente 85 %, al menos de aproximadamente 86 %, al menos de aproximadamente 87 %, al menos de aproximadamente 88 %, al menos de aproximadamente 89 %, al menos de aproximadamente 90 %, al menos de aproximadamente 91 %, al menos de aproximadamente 92 %, al menos de aproximadamente 93 %, al menos de aproximadamente 94 %, al menos de aproximadamente 95 %, al menos de aproximadamente 96 %, al menos de aproximadamente 97 %, al menos de aproximadamente 98 %, al menos de aproximadamente el 99 %, al menos de aproximadamente el 100 % y 100 % de identidad de secuencia. Alternativamente, la región dúplex de una molécula de ARNds puede ser específicamente hibridable con una porción de un transcrito del gen objetivo. En moléculas específicamente hibridables, un polinucleótido de longitud inferior a la completa que exhibe una mayor homología compensa un polinucleótido más largo y menos homólogo. La longitud del polinucleótido de una región dúplex de una molécula de ARNds que es idéntica a una porción de un transcrito del gen objetivo puede ser de al menos alrededor de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos alrededor de 1000 bases. En algunas modalidades, puede usarse un polinucleótido de más de 50-100 nucleótidos. En modalidades particulares, puede usarse un polinucleótido de más de alrededor de 200-300 nucleótidos. En modalidades particulares, puede usarse un polinucleótido de más de alrededor de 500-1000 nucleótidos, en dependencia del tamaño del gen objetivo.

En ciertas modalidades, la expresión de un gen objetivo en una plaga de insectos (por ejemplo, una plaga de insectos coleópteros) puede inhibirse al menos en un 10 %; al menos 33 %; al menos 50 %; o al menos 80 % dentro de una célula de la plaga, de manera que tenga lugar una inhibición significativa. La inhibición significativa se refiere a la inhibición por encima de un umbral que resulta en un fenotipo detectable (por ejemplo, cese del crecimiento, cese de la alimentación, cese del desarrollo, mortalidad inducida, etc.), o una disminución detectable en el ARN y/o el producto génico correspondiente al gen objetivo que se inhibe. Aunque, en ciertas modalidades de la invención, la inhibición ocurre sustancialmente en todas las células de la plaga, en otras modalidades la inhibición ocurre solo en un subconjunto de células que expresan el gen objetivo.

En algunas modalidades, la supresión transcripcional está mediada por la presencia en una célula de una molécula de ARNds que exhibe una identidad de secuencia sustancial con un ADN promotor o el complemento de este para efectuar lo que es referido como una "supresión trans del promotor." La supresión génica puede ser efectiva contra genes objetivo en una plaga de insectos que pueden ingerir o contactar tales moléculas de ARNds, por ejemplo, al ingerir o poner en contacto con tal material vegetal que contiene las moléculas de ARNds. Las moléculas de ARNds para uso en la supresión trans del promotor pueden diseñarse específicamente para inhibir o suprimir la expresión de uno o más polinucleótidos homólogos o complementarios en las células de la plaga de insectos. La supresión génica postranscripcional por ARN orientado al sentido o antisentido para regular la expresión génica en células vegetales se describe en las patentes de Estados Unidos 5,107,065; 5,759,829; 5,283,184; and 5,231,020.

C. Expresión de moléculas de iARN proporcionadas a una plaga de insectos

La expresión de moléculas de iARN para la inhibición génica mediada por ARNi en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) se puede llevar a cabo en cualquiera de muchos formatos in vitro o in vivo. Las moléculas de iARN se pueden proporcionar a una plaga de insectos, por ejemplo, al poner en contacto las moléculas de iARN con la plaga, o al hacer que la plaga ingiera o de cualquier otra manera internalice las moléculas de iARN. Algunas modalidades incluyen plantas huésped transformadas de una plaga de coleópteros, células vegetales transformadas y progenie de plantas transformadas. Las células vegetales transformadas y las plantas transformadas se pueden diseñar para expresar una o más de las moléculas de iARN, por ejemplo, bajo el control de un promotor heterólogo, para proporcionar un efecto protector de plagas. Por lo tanto, cuando una planta transgénica o célula vegetal es consumida por una plaga de insectos durante la alimentación, la plaga puede ingerir moléculas de iARN expresadas en las células o plantas transgénicas. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de microorganismos procariotas y eucariotas para producir moléculas de iARN. El término "microorganismo" incluye especies procariotas y eucariotas, tales como bacterias y hongos.

La modulación de la expresión génica puede incluir la supresión parcial o completa de dicha expresión. En otra modalidad, un método para la supresión de la expresión génica en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) comprende proporcionar en el tejido del huésped de la plaga una cantidad supresora de genes de al menos una molécula de ARNds formada después de la transcripción de un polinucleótido como se describe en la presente descripción, al menos un segmento del cual es complementario a un ARNm dentro de las células de la plaga de insectos. Una molécula de hpARN, ingerida por una plaga de insectos puede ser al menos de aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o alrededor de 100 % idéntico a una molécula de ARN transcrita a partir de una molécula de ADN ncm, por ejemplo, que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 84, 86, 88, 90, y 93. En particular, una molécula de hpARN, ingerida por una plaga de insectos puede ser al menos de aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o alrededor de 100 % idéntico a una molécula de ARN transcrita a partir de polinucleótido de acuerdo con la SEC ID NO: 84. En particular, una molécula de hpARN, ingerida por una plaga de insectos puede ser al menos de aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o alrededor de 100 % idéntico a una molécula de ARN transcrita a partir de polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO:86. En particular, una molécula de hpARN, ingerida por una plaga de insectos puede ser al menos de aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o alrededor de 100 % idéntico a una molécula de ARN transcrita a partir de polinucleótido de acuerdo con la SEC ID NO: 88. En particular, la molécula de hpARN, ingerida por una plaga de insectos puede ser al menos de aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o alrededor de 100 % idéntico a una molécula de ARN transcrita a partir de polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO:90. En particular, una molécula de hpARN, ingerida por una plaga de insectos puede ser al menos de aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o alrededor de 100 % idéntico a una molécula de ARN transcrita a partir de polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO:93. Se proporcionan, por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas y sustancialmente purificadas que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos de origen no natural y constructos de ADN recombinante para proporcionar moléculas de ARNds, que suprimen o inhiben la expresión de un polinucleótido codificante endógeno o un polinucleótido codificante objetivo en una plaga de insectos cuando se les presenta.

Las modalidades particulares proporcionan un sistema de suministro para el suministro de moléculas de iARN para la inhibición postranscripcional de uno o más gene(s) objetivo en una plaga de insectos de plantas (por ejemplo, coleóptero) y control de una población de plagas de plantas. En algunas modalidades, el sistema de suministro comprende la ingestión de una célula vegetal transgénica huésped o el contenido de la célula huésped que comprende moléculas de ARN transcritas en la célula huésped. En estas y otras modalidades, se crea una célula vegetal transgénica o una planta transgénica que contiene un constructo de ADN recombinante que proporciona una molécula de ARNds estabilizada de la invención. Las células vegetales transgénicas y las plantas transgénicas que comprenden ácidos nucleicos que codifican una molécula de iARN particular pueden producirse mediante el empleo de tecnologías de ADN recombinante (cuyas tecnologías básicas son bien conocidas en la técnica) para construir un vector de transformación vegetal que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de iARN de la invención (una molécula de hpARN); para transformar una célula vegetal o planta; y para generar la célula vegetal transgénica o la planta transgénica que contiene la molécula de iARN transcrita.

Para impartir resistencia a plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) a una planta transgénica, una molécula de ADN recombinante puede, por ejemplo, transcribirse en una molécula de iARN, tal como una molécula de ARNds, una molécula de siARN, una molécula de miARN, una molécula de shARN o una molécula de hpARN. En algunas modalidades, una molécula de ARN transcrita a partir de una molécula de ADN recombinante puede formar una molécula de ARNds dentro de los tejidos o fluidos de la planta recombinante. Dicha molécula de ARNds puede estar compuesta en parte de un polinucleótido que es idéntico a un polinucleótido correspondiente transcrito a partir de un ADN dentro de una plaga de insectos de un tipo que puede infestar la planta huésped. La expresión de un gen objetivo dentro de la plaga es suprimida por la molécula de ARNds, y la supresión de la expresión del gen objetivo en la plaga resulta en que la planta transgénica sea resistente a la plaga. Se ha demostrado que los efectos moduladores de las moléculas de ARNds son aplicables a una variedad de genes expresados en plagas, que incluyen, por ejemplo, genes endógenos responsables del metabolismo celular o la transformación celular, incluidos genes de limpieza; factores de transcripción; genes relacionados con la muda; y otros genes que codifican polipéptidos involucrados en el metabolismo celular o en el crecimiento y desarrollo normal.

Para la transcripción de un transgen in vivo o un constructo de expresión, una región reguladora (por ejemplo, promotor, potenciador, silenciador y señal de poliadenilación) pueden usarse en algunas modalidades para transcribir la cadena de ARN (o cadenas). Por lo tanto, en algunas modalidades, como se establece, más arriba, un polinucleótido para usar en la producción de moléculas de iARN puede estar operativamente unido a uno o más elementos promotores funcionales en una célula huésped de planta. El promotor puede ser un promotor endógeno, normalmente residente en el genoma huésped. El polinucleótido de la presente invención, bajo el control de un elemento promotor operativamente unido, puede estar flanqueado además por elementos adicionales que afectan ventajosamente su transcripción y/o la estabilidad del transcripto resultante. Dichos elementos pueden ubicarse aguas arriba del promotor operativamente unido, aguas abajo del extremo 3' del constructo de expresión, y pueden ocurrir aguas arriba del promotor y aguas abajo del extremo 3' del constructo de expresión.

Algunas modalidades proporcionan métodos para reducir el daño a una planta huésped (por ejemplo, una planta de maíz o una planta de canola) causada por una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero) que se alimenta de la planta, en donde el método comprende proporcionar en la planta huésped una célula vegetal transformada que expresa al menos una molécula de ácido nucleico de la invención, en donde la(s) molécula(s) de ácido nucleico funciona(n) tras ser absorbida(s) por la(s) plaga(s) para inhibir la expresión de un polinucleótido objetivo dentro de la(s) plaga(s), cuya inhibición de la expresión resulta en mortalidad y/o crecimiento reducido de la(s) plaga(s), lo que reduce de esta manera el daño a la planta huésped causado por la(s) plaga(s). En algunas modalidades, la(s) molécula(s) de ácido nucleico comprenden moléculas de ARNds. En estas y otras modalidades, la(s) molécula(s) de ácido nucleico comprenden moléculas de ARNds que comprenden cada una más de un polinucleótido que es específicamente hibridable a una molécula de ácido nucleico expresada en una célula de plaga de coleópteros. En algunas modalidades, la(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(n) en un polinucleótido que es específicamente hibridable a una molécula de ácido nucleico expresada en una célula de plaga de insectos.

En algunas modalidades, se proporciona un método para aumentar el rendimiento de un cultivo de maíz, en donde el método comprende introducir en una planta de maíz al menos una molécula de ácido nucleico de la invención; cultivar la planta de maíz para permitir la expresión de una molécula de iARN que comprende el ácido nucleico, en donde la expresión de una molécula de iARN que comprende el ácido nucleico inhibe el daño y/o crecimiento de plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero), lo que reduce o elimina de esta manera una pérdida del rendimiento debido a la infestación de plagas. En modalidades, la molécula de iARN es una molécula de ARNds. En estas y otras modalidades, la(s) molécula(s) de ácido nucleico comprende(n) moléculas de ARNds que comprenden cada una más de un polinucleótido que es específicamente hibridable a una molécula de ácido nucleico expresada en una célula de plaga de insectos. En algunos ejemplos, la(s) molécula(s) de ácido nucleico comprende(n) un polinucleótido que es específicamente hibridable a una molécula de ácido nucleico expresada en una célula de plaga de coleópteros.

En algunas modalidades, se proporciona un método para modular la expresión de un gen objetivo en una plaga de insectos (por ejemplo, coleóptero), el método comprende: transformar una célula vegetal con un vector que comprende un polinucleótido que codifica al menos una molécula de iARN de la invención, en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor y un elemento de terminación de la transcripción; cultivar la célula vegetal transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo celular vegetal que incluye una pluralidad de células vegetales transformadas; seleccionar células vegetales transformadas que han integrado el polinucleótido en sus genomas; tamizar las células vegetales transformadas para la expresión de una molécula de iARN codificada por el polinucleótido integrado; seleccionar una célula vegetal transgénica que expresa la molécula de iARN; y alimentar con la célula vegetal transgénica seleccionada a la plaga de insectos. Las plantas también pueden regenerarse a partir de células vegetales transformadas que expresan una molécula de iARN codificada por la molécula de ácido nucleico integrada. En modalidades, la molécula de íaRn es una molécula de ARNds. En estas y otras modalidades, la(s) molécula(s) de ácido nucleico comprende(n) moléculas de ARNds que comprenden cada una más de un polinucleótido que es específicamente hibridable a una molécula de ácido nucleico expresada en una célula de plaga de insectos. En algunos ejemplos, la(s) molécula(s) de ácido nucleico comprende(n) un polinucleótido que es específicamente hibridable a una molécula de ácido nucleico expresada en una célula de plaga de coleópteros.

Las moléculas de iARN de la invención pueden incorporarse dentro de las semillas de una especie de planta (por ejemplo, maíz o canola), ya sea como un producto de expresión de un gen recombinante incorporado en un genoma de las células vegetales, o incorporado en un recubrimiento o tratamiento semilla que se aplica a la semilla antes de plantar. Una célula vegetal que comprende un gen recombinante se considera un evento transgénico. También se incluyen en modalidades de la invención los sistemas de suministro para el suministro de moléculas de iARN a plagas de insectos (por ejemplo, coleóptero). Por ejemplo, las moléculas de iARN de la invención pueden introducirse directamente dentro de las células de una plaga(s). Los métodos para la introducción pueden incluir la mezcla directa de iARN con tejido vegetal de un huésped para la(s) plaga(s) del insecto, así como también la aplicación de composiciones que comprenden moléculas de iARN de la invención al tejido de la planta huésped. Por ejemplo, las moléculas de íaRn se pueden rociar sobre la superficie de una planta. Alternativamente, una molécula de iARN puede ser expresada por un microorganismo, y el microorganismo puede aplicarse sobre la superficie de la planta, o introducirse en una raíz o tallo por medios físicos tales como una inyección. Como se discutió, más arriba, una planta transgénica también puede ser modificada genéticamente para expresar al menos una molécula de iARN en una cantidad suficiente para matar las plagas de insectos que se sabe que infestan la planta. Las moléculas de iARN producidas por síntesis química o enzimática también pueden formularse de manera consistente con las prácticas agrícolas comunes, y usarse como productos en aerosol para controlar el daño a las plantas por una plaga de insectos. Las formulaciones pueden incluir los adhesivos y humectantes apropiados requeridos para una cobertura foliar eficiente, así como también protectores UV para proteger las moléculas de iARN (por ejemplo, moléculas de ARNds) del daño de los rayos UV. Dichos aditivos se usan comúnmente en la industria de bioinsecticidas, y se conocen bien por los expertos en la técnica. Dichas aplicaciones pueden combinarse con otras aplicaciones de insecticidas en aerosol (de base biológica o de cualquier otra manera) para mejorar la protección de las plantas de las plagas.

Todas las referencias, que incluyen publicaciones, solicitudes de patentes y patentes, citadas en la presente descripción se incorporan por referencia en la medida en que no sean inconsistentes con los detalles explícitos de esta divulgación y se incorporan de la misma manera que si cada referencia se indicara individual y específicamente para ser incorporada por referencia y se establezca en su totalidad en la presente descripción. Las publicaciones discutidas en la presente descripción se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente descripción debe interpretarse como una aceptación de que los inventores no tienen derecho a antedatar dicha descripción en virtud de invención previa.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar determinadas características y/o aspectos particulares. Estos ejemplos no deben considerarse que limitan la descripción a las características o aspectos particulares descritos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Preparación de muestras y bioensayos.

Una serie de moléculas de ARNds (incluidas aquellas correspondientes a ncm reg1 (SEQ ID NO:3), ncm reg2 (SEQ ID NO:4), ncm v1 (SEQ ID NO:5), y ncm v2 (SEQ ID NO:6 ) se sintetizaron y purificaron mediante el uso de un MEGASCRIPT® RNAi Kit o HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit. Las moléculas de ARNds purificadas se prepararon en tampón TE, y todos los bioensayos contenían un tratamiento de control que consistía en este tampón, que sirvió como verificación de antecedentes para la mortalidad o inhibición del crecimiento del WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). Las concentraciones de moléculas de ARNds en el tampón del bioensayo se midieron mediante el uso de un espectrofotómetro NANODROP ™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

Las muestras se analizaron para la actividad de los insectos en los bioensayos realizados con larvas de insectos neonatos en una dieta de insectos artificial. Los huevos del WCR se obtuvieron a partir de CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

Los bioensayos se realizaron en bandejas de plástico de 128 pozos específicamente diseñadas para bioensayos de insectos (CD INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada pocillo contenía aproximadamente 1,0 mL de una dieta artificial diseñada para el crecimiento de insectos coleópteros. Una alícuota de 60 ^L de muestra de ARNds fue suministrada por pipeta sobre la superficie de la dieta de cada pocillo (40 ^L/cm2) Las concentraciones de la muestra de ARNds se calcularon como la cantidad de ARNds por centímetro cuadrado (ng/cm2) del área superficial (1,5 cm2) en el pozo. Las bandejas tratadas se mantuvieron en una campana extractora hasta que el líquido en la superficie de la dieta se evaporó o fue absorbido dentro de la dieta.

A las pocas horas de eclosión, las larvas individuales se recogieron con un cepillo de pelo de camello humedecido y se depositaron en la dieta tratada (una o dos larvas por pocillo). Los pozos infestados de las bandejas de plástico de 128 pozos se sellaron con láminas adhesivas de plástico transparente y se ventilaron para permitir el intercambio de gases. Las bandejas del bioensayo se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (28 °C, ~40 % de humedad relativa, 16:8 (luz: oscuridad) durante 9 días, después de los cuales se registró el número total de insectos expuestos a cada muestra, el número de insectos muertos y el peso de los insectos sobrevivientes. El porcentaje de mortalidad promedio y la inhibición del crecimiento promedio se calcularon para cada tratamiento. La inhibición del crecimiento (GI, por sus siglas en inglés) se calculó como sigue:

GI = [1 -(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)],

donde TWIT es el peso total de insectos vivos en el tratamiento;

TNIT es el número total de insectos en el tratamiento;

TWIBC es el peso total de los insectos vivos en la verificación de antecedentes (control de tampón); y

TNIBC es el número total de insectos en la verificación de antecedentes (control de tampón).

El análisis estadístico se realizó mediante el uso del software JMP™ (SAS, Cary, NC).

La CL50(concentración letal) se define como la dosis a la que se mata el 50 % de los insectos de la prueba. El GI50(GI, por sus siglas en inglés) (inhibición del crecimiento) se define como la dosis a la que el crecimiento medio (por ejemplo, peso vivo) de los insectos de la prueba es el 50 % del valor medio visto en las muestras de verificación de antecedentes. Los bioensayos replicados demostraron que la ingestión de muestras particulares resultó en una sorprendente e inesperada de la mortalidad e inhibición del crecimiento de las larvas del gusano de la raíz del maíz.

Ejemplo 2: Identificación de genes objetivo candidatos

Múltiples etapas del desarrollo del WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) se seleccionaron para el análisis de transcriptoma agrupado para proporcionar secuencias de genes objetivo candidatas para el control mediante la tecnología de resistencia a insectos de plantas transgénicas de ARNi.

En un ejemplo, el ARN total se aisló de aproximadamente 0,9 g de larvas del WCR completas del primer estadio; (4 a 5 días después de la eclosión; mantenido a 16 °C) y purificado mediante el uso del siguiente método basado en fenol/TRI REAGENT® (CENTRO DE INVESTIGACIÓN MOLECULAR, Cincinnati, OH):

Las larvas se homogeneizaron a temperatura ambiente en un homogeneizador de 15 mL con 10 mL de TRI REAGENT® hasta que se obtuvo una suspensión homogénea. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, el homogeneizado se dispensó en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mL por tubo), se añadieron 200 pL de cloroformo y la mezcla se agitó vigorosamente durante 15 segundos. Después de dejar que la extracción reposara a temperatura ambiente durante 10 minutos, las fases se separaron por centrifugación a 12 000 x g a 4 °C. La fase superior (que comprende alrededor de 0,6 mL) se transfirió cuidadosamente a otro tubo estéril de 1,5 mL y se añadió un volumen igual de isopropanol a temperatura ambiente. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos, la mezcla se centrifugó 8 minutos a 12000 x g (4 °C o 25 °C).

El sobrenadante se retiró cuidadosamente y se desechó, y el sedimento de ARN se lavó dos veces mediante agitación vorticial con etanol al 75 %, con recuperación por centrifugación durante 5 minutos a 7500 x g (4 °C o 25 °C) después de cada lavado. El etanol se retiró cuidadosamente, el sedimento se dejó secar al aire durante 3 a 5 minutos, y luego se disolvió en agua estéril libre de nucleasas. La concentración de ARN se determinó mediante la medición de la absorbancia (A) a 260 nm y 280 nm. Una extracción típica de aproximadamente 0,9 g de larvas produjo más de 1 mg de ARN total, con una relación de A260/A280 de 1,9. El ARN, por lo tanto, extraído se almacenó a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

La calidad del ARN se determinó al correr una alícuota a través de un gel de agarosa al 1 %. La solución de gel de agarosa se preparó mediante el uso de tampón TAE 10x en autoclave (EDTA con Tris-acetato; la concentración 1x es Tris-acetato 0,04 M, EDTA 1 mM (sal sódica de ácido etilenediaminotetraacético sal sódica), pH 8,0) diluido con agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato) en un contenedor autoclavado. Se usó TAE 1x como tampón de corrida. Antes de su uso, el tanque de electroforesis y el peine formador de pozos se limpiaron con RNaseAway™ (INVITROGEN INC., Carlsbad, CA). Se mezclaron dos pL de muestra de ARN con 8 pL de tampón TE (Tris HCl 10 mM pH 7,0; EDTA 1 mM) y 10 pL de tampón de muestra de Ar N (NOVAGEN® Catálogo No 70606; Em D4 Bioscience, Gibbstown, NJ). La muestra se calentó a 70 °C durante 3 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se cargaron por pocillo 5 pL (que contienen de 1 pg a 2 pg de ARN). Los marcadores de peso molecular de ARN disponibles comercialmente se corrieron simultáneamente en pocillos separados para la comparación del tamaño molecular. El gel se corrió a 60 volts por 2 horas.

Un proveedor de servicios comerciales (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL) preparó una biblioteca de ADNc normalizada a partir del ARN total de las larvas, mediante el uso de cebadores aleatorios. La biblioteca de ADNc de larvas normalizada fue secuenciada a escala de 1/2 placa por la química de la serie GS FLX 454 Titanium ™ en EUROFINS MWG Operon, que resultó en más de 600000 lecturas con una longitud de lectura promedio de 348 pb. Se ensamblaron 350000 lecturas en más de 50000 cóntigos. Tanto las lecturas sin ensamblar como los cóntigos se convirtieron en bases de datos BLASTable mediante el uso del programa disponible públicamente, FORMATDB (disponible de NCBI).

Las bibliotecas de ARN total y ADNc normalizado se prepararon de manera similar a partir de materiales cosechados en otras etapas de desarrollo del WCR. Se construyó una biblioteca de transcriptoma agrupada para el tamizaje del gen objetivo mediante la combinación de miembros de la biblioteca de ADNc que representan las diversas etapas de desarrollo.

Los genes candidatos para el ARNi dirigido se seleccionaron mediante el uso de información respecto a los efectos letales del ARNi de genes particulares en otros insectos tales como Drosophila y Tribolium. Se hipotetiza que estos genes son esenciales para la supervivencia y el crecimiento de los insectos coleópteros. Los homólogos de genes objetivo seleccionados se identificaron en la base de datos de secuencia del transcriptoma como se describe más abajo. Las secuencias de longitud completa o parciales de los genes objetivo se amplificaron por PCR para preparar moldes para la producción de ARN bicatenario (ARNds).

Se corrieron búsquedas de TBLASTN mediante el uso de secuencias codificantes de proteínas candidatas contra bases de datos de BLASTable que contienen lecturas de secuencia no ensambladas de Diabrotica o los cóntigos ensamblados. Se confirmaron aciertos significativos a una secuencia de Diabrotica (definida como mejor que e'20 para homologías de cóntigos y mejor que e'10 para homologías de lecturas de secuencias sin ensamblar) mediante el uso de BLASTX contra la base de datos no redundante NCBI. Los resultados de esta búsqueda de BLASTX confirmaron que las secuencias génicas candidatas homólogas de Diabrotica identificadas en la búsqueda TBLASTN de hecho comprendieron genes de Diabrotica, o fueron el mejor acierto para la secuencia génica candidata no-Diabrotica presente en las secuencias Diabrotica. En algunos casos, estaba claro que algunos de los cóntigos de Diabrotica o lecturas de secuencias sin ensamblar seleccionadas por homología a un gen candidato no-Diabrotica se solapaban, y que el ensamblaje de los cóntigos no había logrado unir estos solapamientos. En esos casos, se usó Sequencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, MI) para ensamblar las secuencias en cóntigos más largos.

Un gen objetivo candidato que codifica Diabrotica ncm (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:77) se identificó como un gen que puede provocar mortalidad de plaga de coleópteros, inhibición del crecimiento o inhibición del desarrollo en el WCR.

Los transgenes de ARNds Ncm se pueden combinar con otras moléculas de ARNds para proporcionar direccionamiento de ARNi redundantes y efectos de ARNi sinérgicos. Los eventos de maíz transgénico que expresan ARNds que se dirigen a ncm son útiles para prevenir el daño de alimentación de raíz por el gusano de la raíz del maíz. Los transgenes de ARNds Ncm representan nuevos modos de acción para combinar con la tecnología de proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis en pirámides génicas de gestión de resistencia a los insectos para mitigar el desarrollo de poblaciones del gusano de la raíz resistentes a cualquiera de estas tecnologías de control del gusano de la raíz.

Los clones completos o parciales de secuencias de un gen candidato de Diabrotica, en la presente descripción referido como ncm, se usaron para generar amplicones de PCR para la síntesis de ARNds.

Ejemplo 3: Amplificación de genes objetivo para producir ARNds

Los cebadores se diseñaron para amplificar porciones de regiones codificantes de cada gen objetivo por PCR. Véase Tabla 1. Donde fue apropiado, se incorporó una secuencia promotora de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; SEQ ID NO:7) en los extremos 5' de las cadenas sentido o antisentido amplificadas. Véase Tabla 1. El ARN total se extrajo del WCR mediante el uso de TRIzol® (Life Technologies, Grand Island, NY), donde las larvas y los adultos del WCR se homogeneizaron a temperatura ambiente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 1 mL de TRIzol® mediante el uso de un mezclador de mortero de motor (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) hasta que se obtuvo una suspensión homogénea. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, el homogeneizado se centrifugó para eliminar los restos celulares y 1 mL del sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Se añadieron 200 ^L de cloroformo y la mezcla se agitó vigorosamente durante 15 segundos. Después de dejar que la extracción reposara a temperatura ambiente durante 2-3 minutos, las fases se separaron por centrifugación a 12000 x g a 4 °C. La fase superior (que comprende alrededor de 0,6 mL) se transfirió cuidadosamente a otro tubo estéril de 1,5 mL y se añadieron 500 uL de isopropanol a temperatura ambiente. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, la mezcla se centrifugó 10 minutos a 12 000 x g a 4 °C. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y se desechó, y el sedimento de ARN se lavó dos veces mediante agitación vorticial con etanol al 75 %, con recuperación por centrifugación durante 5 minutos a 7500 x g (4 °C o 25 °C) después de cada lavado. El etanol se retiró cuidadosamente, el sedimento se dejó secar al aire durante 3 a 5 minutos, y luego se disolvió en agua estéril libre de nucleasas.

Luego se usó el ARN total para hacer la primera cadena de ADNc con SuperScriptIII® First-Strand Synthesis System y las instrucciones de cebado de los fabricantes de Oligo dT (Life Technologies, Grand Island, NY). Esta primera cadena de ADNc se usó como molde para reacciones de PCR mediante el uso de cebadores opuestos posicionados para amplificar toda o parte de la secuencia del gen objetivo nativo. El ARNds también se amplificó a partir de un clon de A d N que comprende la región codificante para una proteína fluorescente amarilla (YFP) (SEQ ID NO:8; Shagin y otros (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50).

Tabla 1. Cebadores y pares de cebadores usados para amplificar porciones de regiones codificantes del gen objetivo ilustrativo ncm y el gen de control negativo YFP.

Ejemplo 4: Constructos de ARNi

Preparación de moldes por PCR y síntesis de ARNds.

Una estrategia usada para proporcionar moldes específicos para la producción de ARNds de ncm y YFP se muestra en la figura 1. Los ADNs moldes destinados para usar en la síntesis de ARNds de ncm se prepararon por PCR mediante el uso de los pares de cebadores en la tabla 1 y (como molde de PCR) primera cadena de ADNc preparada a partir de ARN total aislado de huevos WCR, larvas de primer estadio o adultos. Para cada región del gen objetivo seleccionado ncm y YFP, las amplificaciones por PCR introdujeron una secuencia promotora de T7 en los extremos 5' de las cadenas sentido y antisentido amplificadas (el segmento YFP se amplificó a partir de un clon de ADN de la región codificante YFP). Los dos fragmentos amplificados por PCR para cada región de los genes objetivo se mezclaron en cantidades aproximadamente iguales, y la mezcla se usó como molde de transcripción para la producción de ARNds. Véase figura 1. Las secuencias de los moldes de ARNds amplificados con los pares de cebadores particulares fueron: SEQ ID NO:3 (ncm reg1), SEQ ID NO:4 (ncm reg2), SEQ ID NO:5 (ncm v1), SEQ ID NO:6 (ncm v2) and YFP (SEQ ID NO:8). El ARN bicatenario para el bioensayo de insectos se sintetizó y purificó mediante el uso de un AMBION® MEGASCRiPt ® RNAi Kit al seguir las instrucciones del fabricante (INVIt ROg EN) o HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit al seguir las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). Las concentraciones de ARNdss se midieron mediante el uso de un espectrofotómetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

Construcción de vectores de transformación vegetal.

Los vectores de entrada que albergan un constructo de gen objetivo para la formación de horquilla que comprenden segmentos de ncm (SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:77) se ensamblan mediante el uso de una combinación de fragmentos químicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) y métodos estándar de clonación molecular. La formación de horquilla intramolecular mediante transcriptos primarios de ARN se facilita mediante la disposición (dentro de una sola unidad de transcripción) de dos copias de un segmento del gen objetivo en orientación opuesta entre sí, los dos segmentos están separados por una secuencia de enlace (por ejemplo, SEQ ID NO:19). Por lo tanto, el transcripto de ARNm primario contiene las dos secuencias de segmentos génicos ncm como grandes repeticiones invertidas entre sí, separadas por la secuencia de enlace. Una copia de un promotor (por ejemplo ubiquitina 1 de maíz, patente de Estados Unidos No.

5,510,474; 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV); promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar (ScBV); promotores a partir de genes de la actina de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 de maíz; promotor de ALS; promotor del gen de faseolina; cab; rubisco; LAT52; Zm13; y/o apg) se usa para impulsar la producción del transcripto de horquilla de ARNm primario, y un fragmento que comprende una región 3' no traducida, por ejemplo, pero no se limita a, un gen de peroxidasa 5 de maíz (ZmPer5 3'UTR v2; patente de Estados Unidos No.

6,699,984), AtUbi10, AtEfl, o StPinII se usa para terminar la transcripción del gen que expresa el ARN de horquilla. Los vectores de entrada pDAB126948 y pDAB126954 comprenden un constructo de v2-RNA ncm (SEQ ID NO:17) que comprende un segmento de ncm (SEQ ID NO:1).

Los vectores de entrada descritos anteriormente se usan en reacciones de recombinación GATEWAY® estándar con un vector de destino binario típico para producir vectores de transformación de la expresión de ARN en horquilla de ncm para transformaciones de embriones de maíz mediadas por Agrobacterium.

El vector de destino binario comprende un gen de tolerancia a herbicidas (ariloxialcanoato dioxigenasa; AAD-1 v3) (patente de Estados Unidos 7,838,733, y Wrighty otros (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5) bajo la regulación de un promotor operable en la planta (por ejemplo, promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar (ScBV) (Schenk y otros (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) o ZmUbi1 (patente de Estados Unidos 5,510,474)). Un 5'UTR y un intrón se colocan entre el extremo 3' del segmento promotor y el codón de inicio de la región codificante AAD-1. Un fragmento que comprende una región 3' no traducida de un gen de lipasa de maíz (ZmLip 3'UTR; patente de Estados Unidos 7,179,902) se usa para finalizar la transcripción del ARNm AAD-1.

Un vector binario de control negativo que comprende un gen que expresa una proteína YFP, se construye por medio de reacciones de recombinación GATEWAY® estándar con un vector de destino binario típico y un vector de entrada. El vector de destino binario comprende un gen de tolerancia a herbicidas (ariloxialcanoato dioxigenasa; AAD-1 v3) (como anteriormente) bajo la regulación de la expresión de un promotor de ubiquitina 1 de maíz (como anteriormente) y un fragmento que comprende una región 3' no traducida a partir de un gen de lipasa de maíz (ZmLip 3'UTR; como anteriormente). El vector de entrada comprende una región codificante YFP (SEQ ID NO:20) bajo el control de expresión de un promotor de ubiquitina 1 de maíz (como anteriormente) y un fragmento que comprende una región 3' no traducida a partir de un gen de peroxidasa 5 de maíz (como anteriormente).

Ejemplo 5: Detección de genes objetivo candidatos

El ARNds sintético diseñado para inhibir las secuencias de genes objetivo identificadas en el ejemplo 2 causó mortalidad e inhibición del crecimiento cuando se administró a WCR en ensayos basados en la dieta. Se observó que Ncm reg1, ncm reg2, ncm v1 y ncm v2 exhibían una eficacia mucho mayor en este ensayo sobre otros ARNdss tamizados.

Los bioensayos replicados demostraron que la ingestión de preparaciones de ARNds derivadas de ncm reg1, ncm reg2, ncm v1 y ncm cada v2 resultó en la mortalidad y/o inhibición del crecimiento de las larvas del gusano de la raíz del maíz occidental. La tabla 2 y la tabla 3 muestran los resultados de los bioensayos de alimentación basados en la dieta de larvas del WCR después de 9 días de exposición a estos ARNdss, así como también los resultados obtenidos con una muestra de control negativo de ARNds preparada a partir de una región codificante de la proteína fluorescente amarilla (YFP) (SEQ ID NO:8).

Tabla 2. Resultados de los ensayos de alimentación de la dieta ARNds ncm obtenidos con larvas del gusano de la raíz del maíz occidental después de 9 días de alimentación. El análisis ANOVA encontró diferencias significativas en la media del % de mortalidad y la media del % de inhibición del crecimiento (GI). Las medias se separaron mediante el uso de la prueba de Tukey-Kramer.

Tabla 3. Resumen de la potencia oral de ARNds de ncm en larvas del WCR (ng/cm2).

Se ha sugerido previamente que ciertos genes de Diabrotica spp. pueden ser explotados para el control de insectos mediado por ARNi. Véase publicación de patente de Estados Unidos No. 2007/0124836, que describe 906 secuencias, y patente de Estados Unidos No. 7,612,194, que describe 9112 secuencias. Sin embargo, se determinó que muchos genes sugeridos para tener utilidad para el control de insectos mediado por ARNi no son eficaces para controlar Diabrotica.

También se determinó que las secuencias ncm reg1, ncm reg2, ncm v1 y ncm v2 cada una proporciona un control superior sorprendente e inesperado de Diabrotica, en comparación con otros genes sugeridos para tener utilidad para el control de insectos mediado por ARNi.

Por ejemplo, anexina, beta espectrina 2 y mtRP-L4 cada uno fue sugerido en la patente de Estados Unidos No. 7,612,194 ser eficaz en el control de insectos mediado por ARNi. La SEQ ID NO:21 es la secuencia de ADN de anexina región 1 (Reg 1) y la SEQ ID NO:22 es la secuencia de ADN de anexina región 2 (Reg 2). La SEQ ID NO:23 es la secuencia de ADN de beta espectrina 2 región 1 (Reg 1) y la SEQ ID NO:24 es la secuencia de ADN de beta espectrina 2 región 2 (Reg2). La SEQ ID NO:25 es la secuencia de ADN de mtRP-L4 región 1 (Reg 1) y la SEQ ID NO:26 es la secuencia de ADN de mtRP-L4 región 2 (Reg 2). También se usó una secuencia YFP (SEQ ID NO:8) para producir ARNds como un control negativo.

Cada una de las secuencias mencionadas anteriormente se usó para producir ARNds por los métodos del ejemplo 3. La estrategia usada para proporcionar moldes específicos para la producción de ARNds se muestra en la figura 2. Los ADNs moldes destinados para usar en la síntesis de ARNds se prepararon por PCR mediante el uso de los pares de cebadores en la tabla 4 y (como molde de PCR) la primera cadena de ADNc se preparó a partir de ARN total aislado de larvas de primer estadio del WCR. (YFP se amplificó a partir de un clon de ADN). Para cada región del gen objetivo seleccionado, se realizaron dos amplificaciones por PCR separadas. La primera amplificación por PCR introdujo una secuencia promotora de T7 en el extremo 5' de las cadenas sentido amplificadas. La segunda reacción incorporó la secuencia promotora de T7 en los extremos 5' de las cadenas antisentido. Los dos fragmentos amplificados por PCR para cada región de los genes objetivo se mezclaron en cantidades aproximadamente iguales, y la mezcla se usó como molde de transcripción para la producción de ARNds. Véase figura 2. El ARN bicatenario se sintetizó y purificó mediante el uso de un AMBION® MEGASCRIPT® RNAi Kit al seguir las instrucciones del fabricante (INVITrOGe N). Las concentraciones de ARNdss se midieron mediante el uso de un espectrofotómetro NANODrOp ™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) y cada uno de los ARNdss se probó mediante los mismos métodos de bioensayo basados en la dieta descritos anteriormente. La Tabla 4 enumera las secuencias de los cebadores usados para producir las moléculas de ARNds de anexina Reg1, anexina Reg2, beta espectrina 2 Reg1, beta espectrina 2 Reg2, mtRP-L4 Reg1 y mtRP-L4 Reg2. Las secuencias del cebador YFP para usar en el método representado en la figura 2 también se enumeran en la tabla 4. La Tabla 5 presenta los resultados de los bioensayos de alimentación basados en la dieta de larvas del WCR después de 9 días de exposición a estas moléculas de ARNds. Los bioensayos replicados demostraron que la ingestión de estos ARNdss no produjo mortalidad ni inhibición del crecimiento de las larvas del gusano de la raíz del maíz occidental por encima de lo observado con las muestras de control de tampón TE, agua o proteína YFP.

Tabla 4. Cebadores y pares de cebadores usados para amplificar porciones de regiones codificantes de genes.

Tabla 5. Resultados de los ensayos de alimentación de la dieta obtenidos con larvas del gusano de la raíz del maíz occidental después de 9 días.

Ejemplo 6: producción de tejidos de maíz transgénico que comprenden ARNdss insecticidas

Transformación mediada por Agrobacterium. Las células, tejidos y plantas de maíz transgénicos que producen una o más moléculas de ARNds insecticidas (por ejemplo, al menos una molécula de ARNds que incluye una molécula de ARNds dirigida a un gen que comprende ncm; SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:77) a través de la expresión de un gen quimérico integrado de forma estable dentro del genoma de la planta se producen seguidos de la transformación mediada por Agrobacterium. Los métodos de transformación de maíz que emplean vectores de transformación binarios o superbinarios se conocen en la técnica, como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 8,304,604, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad. Los tejidos transformados se seleccionan por su capacidad de crecer en medio que contiene Haloxifop y se tamizan para la producción de ARNds, según corresponda. Las porciones de tales cultivos de tejidos transformados pueden presentarse a larvas recién nacidas del gusano de la raíz del maíz para bioensayo, esencialmente como se describe en el ejemplo 1.

Iniciación del cultivo de Agrobacterium. Las reservas de glicerol de células de la cepa DAt13192 de Agrobacterium (WO 2012/016222A2) que albergan un vector de transformación binario como se describió anteriormente (ejemplo 4) se rayan en placas de medio mínimo AB (Watson y otros (1975) J. Bacteriol. 123: 255-64) que contienen antibióticos apropiados y se cultivan a 20 °C durante 3 días. Luego los cultivos se rayan en placas YEP (g/L: extracto de levadura, 10; peptona, 10; NaCl, 5) que contienen los mismos antibióticos y se incuban a 20 °C durante 1 día.

Cultivo de Agrobacterium. El día del experimento, se prepara una solución de reserva de medio de inoculación y acetosiringona en un volumen apropiado para el número de constructos en el experimento y se pipetea en un matraz estéril desechable de 250 mL. El medio de inoculación ((Frame y otros (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341) contenía: 2,2 g/L de sales de MS; Vitaminas de MS Modificadas por ISU 1X (Frame y otros, Ibid.) 68,4 g/L de sacarosa; 36 g/L de glucosa; 115 mg/L de L-prolina; y 100 mg/L de mioinositol; a pH 5,4). Se añade acetosiringona al matraz que contiene medio de inoculación a una concentración final de 200 pM a partir de una solución de reserva de 1 M en dimetilsulfóxido al 100 % y la solución se mezcla completamente.

Para cada constructo, 1 o 2 asas de inoculación llenas de Agrobacterium a partir de la placa YEP se suspenden en 15 mL de medio de inoculación/solución de reserva de acetosiringona en un tubo de centrífuga desechable estéril de 50 mL y la densidad óptica de la solución a 550 nm (DO ⁵⁵⁰ ) se mide en un espectrofotómetro. Luego la suspensión se diluye a DO ⁵⁵⁰ de 0,3 a 0,4 mediante el uso de una mezcla adicional de medio de inoculación/acetosiringona. Luego el tubo de la suspensión de Agrobacterium se coloca horizontalmente en un conjunto de agitador de plataforma establecido a alrededor de 75 rpm a temperatura ambiente y se agita durante 1 a 4 horas mientras se realiza la disección de embriones.

Esterilización de mazorca y aislamiento embrionario. Los embriones inmaduros de maíz se obtienen a partir de la línea endogámica B104 de plantas de Zea mays (Hallauer y otros (1997) Crop Science 37: 1405-1406) cultivadas en invernadero y auto-o sibpolinizadas para producir mazorcas. Las mazorcas se cosechan aproximadamente de 10 a 12 días después de la polinización. En el día experimental, las mazorcas descascaradas se esterilizan superficialmente por inmersión en una solución al 20 % de blanqueador comercial (Blanqueador Germicida ULTRA CLOROX®, hipoclorito sódico al 6,15 %; con dos gotas de TWEEN 20) y se agitan durante 20 a 30 minutos, seguido de tres enjuagues en agua desionizada estéril en una campana de flujo laminar. Los embriones cigóticos inmaduros (de 1,8 a 2,2 mm de largo) se diseccionan asépticamente a partir de cada mazorca y se distribuyen aleatoriamente en tubos de microcentrífuga que contienen 2,0 mL de una suspensión apropiada de células de Agrobacterium en medio de inoculación líquido con acetosiringona 200 j M, en la que se habían añadido 2 j L de surfactante BREAK-THRU® S233 al 10 % (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Alemania). Para un conjunto dado de experimentos, se usan embriones a partir de mazorcas agrupadas para cada transformación.

Cocultivo de Agrobacterium. Después del aislamiento, los embriones se colocan en una plataforma basculante durante 5 minutos. El contenido del tubo se vierte sobre una placa de medio de cocultivo, que contiene 4,33 g/L de sales de MS; Vitaminas de MS Modificadas por ISU 1X; 30 g/L de sacarosa; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de dicamba en KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico o ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); 100 mg/L de mioinositol; 100 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgNO3; acetosiringona 200 j M en DMSO; y 3 g/L de GELZAN™, a pH 5,8. El líquido de la suspensión de Agrobacterium se elimina con una pipeta de transferencia estéril y desechable. Luego los embriones se orientan con el escutelo hacia arriba mediante el uso de unas pinzas estériles con la ayuda de un microscopio. La placa se cierra, se sella con cinta médica 3M™ MICROPORE™ y se coloca en una incubadora a 25 °C con luz continua a aproximadamente 60 jm ol i r r V de radiación fotosintéticamente activa (PAR, por sus siglas en inglés).

Selección de callos y regeneración de eventos transgénicos. Después del período de cocultivo, los embriones se transfieren al Medio de Reposo, que está compuesto por 4,33 g/L de sales de MS; Vitaminas de MS Modificadas por ISU 1X; 30 g/L de sacarosa; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de dicamba en KOH; 100 mg/L de mioinositol; 100 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgNO3; 0,5 g/L de MES (monohidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de carbenicilina; y 2,3 g/L de GELZAN™; a pH 5,8. No se mueven más de 36 embriones a cada placa. Las placas se colocan en una caja de plástico transparente y se incuban a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 jm ol i r r V de PAR de 7 a 10 días. Luego los embriones callosos se transfieren (<18/placa) al Medio de Selección I, que está compuesto por Medio de Reposo (anteriormente) con ácido R-Haloxifop 100 nM (0,0362 mg/L; para la selección de callos que albergan el gen AAD-1). Las placas se devuelven a cajas transparentes y se incuban a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 jm ol i r r V de PAR por 7 días. Luego, los embriones callosos se transfieren (<12/placa) al Medio de Selección II, que está compuesto por Medio de reposo (anteriormente) con ácido R-Haloxifop 500 nM (0,181 mg/L). Las placas se devuelven a cajas transparentes y se incuban a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 jm ol i r r V de PAR por 14 días. Esta etapa de selección permite que el callo transgénico prolifere y se diferencie aún más.

Los callos embriogénicos proliferantes se transfieren (<9/placa) al medio de pre-regeneración. El Medio de Pre regeneración contiene 4,33 g/L de sales de MS; Vitaminas de MS Modificadas por ISU 1X; 45 g/L de sacarosa; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mioinositol; 50 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 g/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftaleneacético en NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico en etanol; 1 mg/L de 6-bencilaminopurina; 250 mg/L de carbenicilina; 2,5 g/L de GELZAN™; y 0,181 mg/L de ácido Haloxifop; a pH 5,8. Las placas se almacenan en cajas transparentes y se incuban a 27 °C con luz continua a aproximadamente 50 jm ol i r r V de PAR por 7 días. Los callos en regeneración se transfieren (<6/placa) al medio de regeneración en PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) y se incuban a 28 °C con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad por día (a aproximadamente 160 jm o l i r r V de PAR) durante 14 días o hasta que se desarrollen brotes y raíces. El medio de regeneración contiene 4,33 g/L de sales de MS; Vitaminas de MS Modificadas por ISU 1X; 60 g/L de sacarosa; 100 mg/L de mioinositol; 125 mg/L de carbenicilina; 3 g/L de goma GELLAN™; y 0,181 mg/L de ácido R-Haloxifop; a pH 5,8. Luego se aíslan pequeños brotes con raíces primarias y se transfieren al Medio de Elongación sin selección. El Medio de Elongación contiene 4,33 g/L de sales de MS; Vitaminas de MS Modificadas por ISU 1X; 30 g/L de sacarosa; y 3,5 g/L de GELRITE™: a pH 5,8.

Los brotes de plantas transformadas seleccionados por su capacidad de crecer en medio que contiene Haloxyfop se trasplantan de PHYTATRAYS™ a macetas pequeñas rellenadas con medio de crecimiento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), cubiertas con copas o Hu MI-DOMES (ARCO PLASTICS), y luego se endurecen en una cámara de crecimiento CONVIRON (27 °C día/24 °C noche, fotoperíodo de 16 horas, 50-70 % de HR, 200 jm ol i r r V de PAR). En algunos casos, las plántulas transgénicas putativas se analizan para el número relativo de copias del transgen mediante ensayos de p Cr en tiempo real cuantitativos mediante el uso de cebadores diseñados para detectar el gen de tolerancia a herbicidas AAD1 integrado dentro del genoma del maíz. Además, los ensayos de a Dn qPCR se usan para detectar la presencia de la secuencia de enlace y/o secuencia objetivo en transformantes putativos. Las plántulas transformadas seleccionadas se trasladan a un invernadero para un mayor crecimiento y pruebas.

Transferencia y establecimiento de plantas To en el invernadero para bioensayo y producción de semillas. Cuando las plantas alcanzan la etapa V3-V4, se trasplantan a la mezcla de suelo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) y crecen en el invernadero hasta el florecimiento (Tipo de exposición a la luz: foto o asimilación; Límite alto de luz: 1200 de PAR; 16 horas de duración del día; 27 °C día/24 °C noche).

Las plantas que se usarán para los bioensayos de insectos se trasplantan a partir de macetas pequeñas a TINUS™ 350 4 ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canadá;) (una planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente cuatro días después del trasplante a ROOTRAINERS®, las plantas se infestan para el bioensayo.

Plantas de la generación T1 se obtienen al polinizar las sedas de plantas transgénicas T0 con polen recolectado a partir de plantas de la línea endogámica B104 no transgénica u otros donantes de polen apropiados, y plantar las semillas resultantes. Se realizan cruces recíprocos cuando es posible.

Ejemplo 7: Análisis moleculares de tejidos de maíz transgénico

Los análisis moleculares (por ejemplo, ARN qPCR) de los tejidos de maíz se realizan en muestras de hojas recolectadas de plantas cultivadas en invernadero el día anterior o el mismo día en que se evalúa el daño a la alimentación de la raíz.

Los resultados de los ensayos de ARN qPCR para el gen objetivo se usan para validar la expresión del transgen. Los resultados del ensayo de ARN qPCR para la secuencia intermedia entre las secuencias repetidas (que es integral a la formación de moléculas de horquilla de ARNds) en los ARNs expresados también se pueden usar para validar la presencia de transcriptos en horquilla. Los niveles de expresión de ARN transgénico se miden con relación a los niveles de ARN de un gen de maíz endógeno.

Los análisis de ADN qPCR para detectar una porción de la región codificante AAD1 en el ADN genómico se usan para estimar el número de copias de inserción transgénica. Las muestras para estos análisis se recogen a partir de plantas cultivadas en cámaras ambientales. Los resultados se comparan con los resultados de los ensayos de ADN qPCR diseñados para detectar una porción de un gen nativo de una sola copia, y los eventos simples (que tienen una o dos copias de los transgenes) se avanzan para estudios adicionales en el invernadero. Los resultados se comparan con los resultados de los ensayos de ADN qPCR diseñados para detectar una porción de un gen nativo de una sola copia, y los eventos simples (una o dos copias de los transgenes) se avanzan para estudios adicionales.

Adicionalmente, los ensayos de qPCR diseñados para detectar una porción del gen de resistencia a espectinomicina (SpecR; albergado en los plásmidos del vector binario fuera del ADN-T) se usan para determinar si las plantas transgénicas contenían secuencias de cadena principal de plásmidos integrados extraños.

Nivel de expresión de transcripción de ARN: qPCR objetivo. Los eventos de células callosas o plantas transgénicas se analizan mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de la secuencia objetivo para determinar el nivel de expresión relativo del transgen, en comparación con el nivel de transcripto de un gen interno de maíz (SEQ ID NO:55; GENBANK No. de acceso BT069734), que codifica una proteína similar a TIP41 (es decir, un homólogo de maíz de No. de acceso de GENBANK AT4G34270; que tiene una puntuación de tBLASTX del 74 % de identidad). El ARN se aísla mediante el uso de Norgen BioTek Total RNA Isolation Kit (Norgen, Thorold, ON). El ARN total se somete a un tratamiento con DNasa1 en columna de acuerdo con el protocolo sugerido por el estuche. Luego se cuantifica el ARN en un espectrofotómetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) y la concentración se normaliza a 50 ng/pL. La primera cadena de ADNc se prepara mediante el uso de un estuche de síntesis de ADNc de alta capacidad (INVITROGEN) en un volumen de reacción de 10 pL con 5 pL de ARN desnaturalizado, sustancialmente de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El protocolo se modifica ligeramente para incluir la adición de 10 pL de oligonucleótido T20VN (IDT) 100 pM (SEQ ID NO:56; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, donde V es A, C o G, y N es A, C, G o T/U) dentro del tubo de 1 mL de mezcla de reserva del cebador aleatorio, para preparar una reserva de trabajo de cebadores aleatorios combinados y oligo dT.

Después de la síntesis de ADNc, las muestras se diluyen 1:3 con agua libre de nucleasas y se almacenan a -20 °C hasta su análisis.

Ensayos de PCR en tiempo real separados para el gen objetivo y el transcripto similar a TIP41 se realizan en un LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTIc S, Indianapolis, IN) en volúmenes de reacción de 10 pL. Para el ensayo del gen objetivo, las reacciones se corren con cebadores HpNcmlv2 FWD Set 1 (SEQ ID NO:57) y HpNCM1v2 REV Set1 (SEQ ID NO:58), y una sonda IDT Custom Oligo HpNcm1v2 PRB Set1, marcada con FAM y doble enfriamiento con los extintores negros Zen y Iowa. Para el ensayo del gen de referencia similar a TIP41, se usan los cebadores TIPmxF (SEQ ID NO:59) y TIPmxR (Se Q ID NO:60), y la sonda HXTIP (SEQ ID NO:61) marcada con HEX (hexaclorofluoresceína).

Todos los ensayos incluyen controles negativos de no molde (solo mezcla). Para las curvas estándar, también se incluye un blanco (agua en el pozo fuente) en la placa fuente para verificar la contaminación cruzada de la muestra. Las secuencias de cebadores y sondas se establecen en la tabla 7. Las recetas de los componentes de reacción para la detección de los diversos transcriptos se describen en la tabla 8, y las condiciones de las reacciones de PCR se resumen en la tabla 9. El resto fluorescente FAM (6-carboxi fluoresceína amidita) se excita a 465 nm y la fluorescencia se mide a 510 nm; los valores correspondientes para el resto fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) son 533 nm y 580 nm.

Tabla 7. Secuencias de oligonucleótidos para análisis moleculares de niveles de transcriptos en maíz transgénico.

Tabla 8. Recetas de reacción de PCR para la detección de transcriptos.

Tabla 9. Condiciones del termociclador para ARN qPCR.

Los datos se analizan mediante el uso del software LIGHTCYCLER™ v1.5 por cuantificación relativa mediante el uso de un segundo algoritmo derivado máximo para el cálculo de los valores de Cq de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Para los análisis de expresión, los valores de expresión se calculan mediante el uso del método AACt (es decir, 2-(Cq Objetivo - Cq Ref)), que se basa en la comparación de las diferencias de los valores de Cq entre dos objetivos, con el valor base de 2 seleccionado bajo el supuesto de que, para reacciones de PCR optimizadas, el producto se duplica en cada ciclo.

Tamaño e integridad del transcripto en horquilla: Ensayo de Northern Blot. En algunos casos, se obtiene una caracterización molecular adicional de las plantas transgénicas mediante el uso del análisis de Northern Blot (transferencia de ARN) para determinar el tamaño molecular del ARN en horquilla ncm en plantas transgénicas que expresan un ARNds en horquilla ncm.

Todos los materiales y equipos se tratan con RNASFZAP™ (AMBION/INVITROGEN) antes de su uso. Las muestras de tejido (100 mg a 500 mg) se recogen en tubos SAFELOCK EPPENDORF de 2 mL, se rompen con un pulverizador de tejidos KLFCKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) con tres cuentas de tungsteno en 1 mL de TRIZOL (INVITROGEN) durante 5 minutos, luego se incuban a temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos. Opcionalmente, las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 4 °C a 11 000 rpm y el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo SAFELOCK EPPENDORF de 2 mL. Después se añaden 200 pL de cloroformo al homogenado, el tubo se mezcla por inversión durante 2 a 5 minutos, se incuba a TA durante 10 minutos y se centrifuga a 12000 x g durante 15 minutos a 4 °C. La fase superior se transfiere a un tubo EPPENDORF estéril de 1,5 mL, se añaden 600 pL de isopropanol al 100 %, seguido de incubación a TA durante 10 minutos a 2 horas, luego se centrifuga a 12000 x g durante 10 minutos a 4 a 25 °C. El sobrenadante se desecha y el sedimento de ARN se lava dos veces con 1 mL de etanol al 70 %, con centrifugación a 7500 x g durante 10 minutos a 4 a 25 °C entre lavados. El etanol se desecha y el sedimento se seca brevemente al aire durante 3 a 5 minutos antes de resuspender en 50 pL de agua libre de nucleasas.

El ARN total se cuantifica mediante el uso del NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) y las muestras se normalizan a 5 pg/10 pL. Luego se añaden 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) a cada muestra. Se dispensan de 5 a 14 ng de la mezcla de marcadores estándar de ARN DIG (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) y se añaden a un volumen igual de glioxal. Las muestras y los ARN marcadores se desnaturalizan a 50 °C durante 45 minutos y se almacenan en hielo hasta que se cargan en un gel de agarosa SEAKEM GOLD (LONZA, Allendale, NJ) al 1,25 % en tampón de corrida glioxal NORTHERNMAX 10 X (AMBION/INVITROGEN). Los ARNs se separan por electroforesis a 65 voltios/30 mA durante 2 horas y 15 minutos.

Después de la electroforesis, el gel se enjuaga en SSC 2X durante 5 minutos y se forma una imagen en una estación GEL DOC (BIORAD, Hercules, CA), luego el ARN se transfiere pasivamente a una membrana de nylon (MILLIPORE) durante la noche a TA, mediante el uso de SSC 10X como tampón de transferencia (SSC 20X consiste en cloruro de sodio 3 M y citrato trisódico 300 mM, pH 7,0). Después de la transferencia, la membrana se enjuaga en SSC 2X durante 5 minutos, el ARN se reticula con UV a la membrana (AGILENT/STRATAGENE), y la membrana se deja secar a temperatura ambiente durante hasta 2 días.

La membrana se prehibrida en tampón ULTRAHYB™ (AMBION/INVITROGEN) durante 1 a 2 horas. La sonda consiste en un producto amplificado por PCR que contiene la secuencia de interés, (por ejemplo, la porción de secuencia antisentido de la SEQ ID NO:17, según corresponda) marcada con digoxigenina por medio de un procedimiento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. La hibridación en el tampón recomendado es durante la noche a una temperatura de 60 °C en tubos de hibridación. Después de la hibridación, la transferencia se somete a lavados DIG, se envuelve, se expone a película durante 1 a 30 minutos, luego se desarrolla la película, todo por métodos recomendados por el proveedor del estuche DIG.

Determinación del número de copias del transgen. Las piezas de hojas de maíz aproximadamente equivalentes a 2 perforaciones se recolectan en placas de recolección de 96 pocillos (QIAGEN™). La interrupción del tejido se realiza con un pulverizador de tejido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) en el tampón de lisis API BIOSPRINT96™ (suministrado con un BIOSPRINT96™ PLANT KIT; QIAGEN™) con una perla de acero inoxidable. Después de la maceración de tejidos, el ADN genómico (ADNg) se aísla en formato de alto rendimiento mediante el uso de un BIOSPRINT96™ PlANT KIT y un robot de extracción BIOSPRINT96™. El ADN genómico se diluye 1:3 ADN: agua antes de ajustar la reacción qPCR.

Análisis de qPCR. La detección de transgenes mediante un ensayo de sonda de hidrólisis se realiza por PCR en tiempo real mediante el uso de un sistema LIGHTCYCLER®480. Los oligonucleótidos a usar en los ensayos de sonda de hidrólisis para detectar el gen objetivo (por ejemplo, ncm), la secuencia de enlace (por ejemplo, SEQ ID NO:19), y/o para detectar una porción del gen SpecR (es decir el gen de resistencia a la espectinomicina portado en los plásmidos del vector binario; SEQ ID NO:73; los oligonucleótidos SPC1 en la tabla 10), están diseñados mediante el uso de LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Además, los oligonucleótidos a usar en los ensayos de sonda de hidrólisis para detectar un segmento del gen de tolerancia a herbicidas AAD-1 (SEQ ID NO:67; los oligonucleótidos GAAD1 en la Tabla 10) están diseñados mediante el uso del software PRIMER EXPRESS (BIOSYSTEMS APLICADO). La tabla 10 muestra las secuencias de los cebadores y las sondas. Los ensayos se multiplexan con reactivos para un gen cromosómico endógeno del maíz (Invertasa (SEQ ID No :64; GENBANK No. de acceso: U16123; referido en la presente descripción como IVR1), que sirve como una secuencia de referencia interna para garantizar que el ADNg esté presente en cada ensayo. Para la amplificación, se preparó la mezcla mLIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) a una concentración final 1X en un volumen de reacción multiplex de 10 pL que contiene 0,4 pM de cada cebador y 0,2 pM de cada sonda (tabla 11). Se realiza una reacción de amplificación de dos etapas como se describe en la tabla 12. La activación y emisión de fluoróforos para las sondas marcadas con FAM y HEX son como se describió anteriormente; los conjugados CY5 se excitan al máximo a 650 nm y fluorescen al máximo a 670 nm.

Las puntuaciones de Cp (el punto en el que la señal de fluorescencia cruza el umbral de fondo) se determinan a partir de los datos de PCR en tiempo real mediante el uso del algoritmo de puntos de ajuste (LIGHTCYCLER® SOFTWARE versión 1.5) y el módulo Relative Quant (basado en el método AACt). Los datos se manejan como se describió previamente (anteriormente; ARN qPCR).

Tabla 10. Secuencias de cebadores y sondas (con conjugado fluorescente) para las determinaciones del número de copias de genes y la detección del esqueleto del plásmido del vector binario.

Tabla 11. Componentes de reacción para el análisis del número de copias de genes y detección de esqueleto de plásmidos.

Tabla 12. Condiciones de termociclador para ADN qPCR.

Ejemplo 8 : Bioensayo de maíz transgénico

Bioensayos de insectos. La bioactividad del ARNds de la presente invención producida en células vegetales se demuestra mediante métodos de bioensayos. Véase, por ejemplo, Baum y otros (2007) Nat. Biotechnol. 25(11): 1322-1326. Se puede demostrar la eficacia, por ejemplo, mediante alimentación de diversos tejidos vegetales o piezas de tejidos derivados a partir de una planta que producen un ARNds insecticida para apuntar a los insectos en un entorno de alimentación controlado. Alternativamente, los extractos se preparan a partir de diversos tejidos vegetales derivados de una planta que produce el ARNds insecticida, y los ácidos nucleicos extraídos se dispensan en la parte superior de las dietas artificiales para bioensayos como se describió anteriormente en la presente descripción. Los resultados de tales ensayos de alimentación se comparan con bioensayos realizados de manera similar que emplean tejidos control apropiados a partir de plantas huésped que no producen un ARNds insecticida, o con otras muestras de control. El crecimiento y la supervivencia de los insectos objetivo en la dieta de prueba se reduce en comparación con la del grupo de control.

Bioensayos de insectos con eventos de maíz transgénico. Se seleccionan dos larvas del gusano de la raíz del maíz occidental (de 1 a 3 días de edad) eclosionadas a partir de huevos lavados y se colocan en cada pocillo de la bandeja de bioensayo. Luego los pozos se cubren con una tapa con lengüeta "PULL N' PEEL" (BIO-CV-16, BIO-SERV) y se colocan en una incubadora a 28 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 18 h/6 h. Nueve días después de la infestación inicial, se evalúa la mortalidad de las larvas, que se calcula como el porcentaje de insectos muertos del número total de insectos en cada tratamiento. Se observa mortalidad significativa. Las muestras de insectos se congelan a -20 °C durante dos días, luego se agrupan y pesan las larvas de insectos de cada tratamiento. El por ciento de inhibición del crecimiento se calcula como el peso promedio de los tratamientos experimentales dividido por el promedio del peso promedio de los tratamientos de dos pocillos control. Los datos se expresan como por ciento de inhibición del crecimiento (de los controles negativos). Los pesos medios que exceden el peso medio control se normalizan a cero. Se observa una inhibición del crecimiento significativa.

Bioensayos de insectos en el invernadero. Los huevos del gusano de la raíz del maíz occidental (WCR, Diabrotica virgifera LeConte) se reciben en el suelo a partir de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Los huevos del WCR se incuban a 28 °C durante 10 a 11 días. Los huevos se lavan del suelo, se colocan en una solución de agar al 0,15 %, y la concentración se ajusta a aproximadamente 75 a 100 huevos por alícuota de 0,25 mL. Se instala una placa de eclosión en una placa de Petri con una alícuota de suspensión de huevo para monitorear las tasas de eclosión.

El suelo alrededor de las plantas de maíz que crecen en ROOTRANERS® se infestan de 150 a 200 huevos del WCR. Se permite que los insectos se alimenten durante 2 semanas, después de lo cual se otorga una "Calificación de Raíz" a cada planta. Una escala de lesión de nodo se utiliza para calificar, esencialmente de acuerdo con Oleson y otros (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8. Las plantas que pasan este bioensayo, que muestran lesiones reducidas, se trasplantan a macetas de 5 galones para la producción de semillas. Los trasplantes se tratan con insecticida para evitar daños mayores de gusano de la raíz y la liberación de insectos en los invernaderos. Las plantas son polinizadas a mano para la producción de semillas. Las semillas producidas por estas plantas se guardan para su evaluación en las generaciones de plantas T1 y subsecuentes.

Las plantas de control negativo transgénico se generan por transformación con vectores que albergan genes diseñados para producir una proteína fluorescente amarilla (YFP). Las plantas de control negativo no transformadas se cultivan a partir de semillas de variedades de maíz parental a partir de los cuales se producen las plantas transgénicas. Los bioensayos se realizan con controles negativos incluidos en cada conjunto de materiales vegetales.

Ejemplo 9: Zea mays transgénico que comprende secuencias de plagas de coleópteros

10-20 plantas de Zea mays transgénico TO se generan como se describe en el ejemplo 6. Otras 10-20 líneas independientes Zea mays T1 que expresan ARNds en horquilla para un constructo de ARNi se obtienen para el desafío del gusano de la raíz del maíz. Los ARNds en horquilla son como se establece en la SEQ ID NO:17, o de cualquier otra manera que comprende además la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:77. Los ARNdss en horquilla adicionales se derivan, por ejemplo, a partir de secuencias de plagas de coleópteros tales como, por ejemplo, Cafl-180 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0174258), VatpaseC (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0174259), Rho1 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0174260), VatpaseH (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2012/0198586), PPI-87B (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2013/0091600), RPA70 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2013/0091601), RPS6 (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos No. 2013/0097730), ROP (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/577,811), RNAPII14O (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/577,854), Dre4 (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/705,807), c Op I alfa (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,199), COPI beta (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,203), COPI gamma (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,192) o COPI Delta (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 62/063,216). Estos se confirman a través de RT-PCR u otros métodos de análisis molecular.

Las preparaciones de ARN totales seleccionadas independiente de las líneas T1 se usan opcionalmente para RT-PCR con cebadores diseñados para unirse en el conector del casete de expresión en horquilla en cada uno de los constructos de ARNi. Además, los cebadores específicos para cada gen objetivo en un constructo de ARNi se usan opcionalmente para amplificar y confirmar la producción del ARNm preprocesado requerido para la producción de siARN in planta. La amplificación de las bandas deseadas para cada gen objetivo confirma la expresión del ARN en horquilla en cada planta de Zea mays transgénica. El procesamiento de la horquilla de ARNds de los genes objetivo en siARN opcionalmente se confirma subsecuentemente en líneas transgénicas independientes mediante el uso de hibridaciones de transferencia de ARN.

Además, las moléculas de ARNi que tienen secuencias de discordancia con más del 80 % de identidad de secuencia con los genes objetivo afectan a los gusanos de la raíz del maíz de una manera similar a la observada con las moléculas de ARNi que tienen una identidad de secuencia del 100 % con los genes objetivo. El emparejamiento de la secuencia de discordancia con las secuencias nativas para formar un ARNds en horquilla en el mismo constructo de ARNi suministra siARNs procesados por la planta capaces de afectar el crecimiento, desarrollo y viabilidad de alimentación de plagas de coleópteros.

In planta el suministro de ARNds, siARN o miARN correspondiente a genes objetivo y la subsecuente absorción por plagas de coleópteros a través de la alimentación resulta en una regulación negativa de los genes objetivo en la plaga de coleópteros a través del silenciamiento génico mediado por ARN. Cuando la función de un gen objetivo es importante en una o más etapas de desarrollo, se afecta el crecimiento y/o desarrollo de la plaga de coleópteros, y en el caso de al menos uno del WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte D. u. tenella, D. speciosa Germar D. u. undecimpunctata Mannerheim y Meligethes aeneus Fabricius, conduce a la falta de infestación, alimentación y/o desarrollo exitoso, o conduce a la muerte de la plaga de coleópteros. La elección de genes objetivo y la aplicación exitosa de ARNi se usan luego para controlar las plagas de coleópteros.

Comparación fenotípica de líneas de ARNi transgénicas y no transformadas de Zea mays. Los genes o secuencias de plagas de coleópteros objetivo seleccionados para crear ARNds en horquilla no tienen similitud con ninguna secuencia génica de plantas conocida. Por lo tanto, no se espera que la producción o la activación de ARNi (sistémica) mediante constructos dirigidas a estos genes o secuencias de plagas de coleópteros tengan algún efecto nocivo en las plantas transgénicas. Sin embargo, el desarrollo y las características morfológicas de las líneas transgénicas se comparan con las plantas no transformadas, así como también aquellas de las líneas transgénicas transformadas con un vector "vacío" que no tiene un gen que exprese la horquilla. Se comparan las características de la raíz de la planta, el brote, el follaje y la reproducción. Se registran las características del brote de la planta, tales como la altura, el número y el tamaño de las hojas, el tiempo de florecimiento, el tamaño floral y la apariencia. En general, no hay diferencias morfológicas observables entre líneas transgénicas y aquellas sin expresión de moléculas de iARN objetivos cuando se cultivan in vitro y en tierra en el invernadero.

Ejemplo 10: Zea mays transgénico que comprende una secuencia de plaga de coleópteros y constructos de ARNi adicionales

Una planta de Zea mays transgénico que comprende una secuencia codificante heteróloga en su genoma que se transcribe en una molécula de iARN que se dirige a un organismo distinto de una plaga de coleópteros se transforma secundariamente a través de Agrobacterium o metodologías WHISKERS™ (véase Petolino y Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para producir una o más moléculas de ARNds insecticidas (por ejemplo, al menos una molécula de ARNds que incluye una molécula de ARNds dirigida a un gen que comprende SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:77). Los vectores plasmídicos de transformación vegetal preparados esencialmente como se describe en el ejemplo 4 se suministran a través de Agrobacterium o métodos de transformación mediados por WHISKERS™ en células de maíz en suspensión o embriones de maíz inmaduros obtenidos a partir de una planta de Zea mays transgénico Hi II o B104 que comprende una secuencia codificante heteróloga en su genoma que se transcribe en una molécula de iARN que se dirige a un organismo distinto de una plaga de coleópteros.

Ejemplo 11: Zea mays transgénico que comprende un constructo de ARNi y secuencias control de plaga de coleópteros adicionales

Una planta de Zea mays transgénico que comprende una secuencia codificante heteróloga en su genoma que se transcribe en una molécula de iARN que se dirige a un organismo de plaga de coleópteros (por ejemplo, al menos una molécula de ARNds que incluye una molécula de ARNds dirigida a un gen que comprende la SEC ID n O: 1 o SEC ID NO: 77) se transforma secundariamente a través de Agrobacterium o metodologías WHISKERS™ (véase Petolino y Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para producir una o más moléculas de proteínas insecticidas, por ejemplo, proteínas insecticidas Cry3, Cry34 y Cry35. Los vectores plasmídicos de transformación vegetal preparados esencialmente como se describe en el ejemplo 4 se entregan a través de Agrobacterium o métodos de transformación mediados por WHISKERS™ en células de maíz en suspensión o embriones de maíz inmaduros obtenidos a partir de una planta de Zea mays transgénico B104 que comprende una secuencia codificante heteróloga en su genoma que se transcribe en una molécula de iARN que se dirige a un organismo plaga de coleópteros. Se obtienen plantas doblemente transformadas que producen molécula de iARN y proteínas insecticidas para el control de plagas de coleópteros.

Ejemplo 12: Transcriptoma del escarabajo del polen

Insectos: Se recolectaron larvas y escarabajos del polen adultos de los campos con plantas de colza florecidas (Giessen, Alemania). Los escarabajos adultos jóvenes (cada uno por grupo de tratamiento: n = 20; 3 réplicas) fueron retados al inyectar una mezcla de dos bacterias diferentes (Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa), una levadura (Saccharomyces cerevisiae) y LPS bacteriano. Los cultivos bacterianos se cultivaron a 37 °C con agitación, y la densidad óptica se controló a 600 nm (OD600). Las células fueron cosechadas a OD600 ~1 por centrifugación y resuspendidas en solución salina fosfato tamponada. La mezcla se introdujo ventrolateralmente al pinchar el abdomen de los escarabajos del polen imagoes mediante el uso de una aguja de disección sumergida en una solución acuosa de 10 mg/mL de LPS (endotoxinaE coli purificada; Sigma, Taufkirchen, Alemania) y los cultivos bacterianos y de levadura. Junto con los escarabajos inmunes retados, se recolectaron escarabajos y larvas vírgenes (n = 20 por y 3 repeticiones de cada uno) en el mismo punto de tiempo.

Aislamiento de ARN: El ARN total se extrajo 8 h después de la inmunización de escarabajos y larvas congelados mediante el uso de TriReagent (Centro de Investigación Molecular, Cincinnati, OH, EUA) y se purificó mediante el uso de RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) en cada caso se siguieron las guías de los fabricantes. La integridad del ARN se verificó mediante el uso de un bioanalizador Agilent 2100 y un estuche de ARN 6000 Nano (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA). La cantidad de ARN se determinó mediante el uso de un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000. El ARN se extrajo de cada uno de los grupos de tratamiento inducidos por el sistema inmune de adultos, los grupos controles de adultos y los grupos de larvas de forma individual, y subsecuentemente se combinaron cantidades iguales de ARN total en un grupo por muestra (adultos inmunes retados, adultos control y larvas) para la secuenciación.

Información del transcriptoma: La generación de datos de RNA-Seq y ensamblaje RNA-Seq de 100 pb de lectura única se llevó a cabo por separado en 5 |jg de ARN total aislado de escarabajos adultos inmuno retados, escarabajos adultos vírgenes (control) y larvas no tratadas. La secuenciación se llevó a cabo por Eurofins MWG Operon mediante el uso de la plataforma Illumina HiSeq-2000. Esto produjo 20,8 millones de lecturas para la muestra de escarabajo control adulto, 21,5 millones de lecturas para la muestra de escarabajo adulto retado con LPS y 25,1 millones de lecturas para la muestra de larvas. Las lecturas agrupadas (67,5 millones) se ensamblaron mediante el uso de software ensamblador Velvet/Oases (M.H. Schulz y otros (2012) Bioinformatics. 28:1086-92; Zerbino & E. Birney (2008) Genome Research. 18:821-9). El transcriptoma contenía 55648 secuencias.

Identificación de ncm del escarabajo del polen: Se usó una búsqueda tblastn del transcriptoma para identificar cóntigos coincidentes. Se usó como consulta la secuencia peptídica de ncm de Tribolium castaneum (GenbankXM_001811253.1). Se usó GAP5(Bonfield JK & Whitwham (2010). Bioinformatics 26: 1699-1703) para la verificación de secuencias.

Ejemplo 13: Mortalidad del escarabajo del polen (Meligethes aeneus)

después del tratamiento con ARNi ncm

Los cebadores específicos de genes que incluyen la secuencia promotora de la polimerasa T7 en el extremo 5' se usaron para crear productos de PCR de aproximadamente 500 pb por PCR (SEQ ID NOs: 91-92). Los fragmentos de PCR se clonaron en el vector fácil pGEM T de acuerdo con el protocolo del fabricante y se enviaron a una compañía de secuenciación para verificar la secuencia. El ARNds fue producido por la ARN polimerasa T7 (MEGAscript® RNAi Kit, Applied Biosystems) a partir de un constructo de PCR generado a partir del plásmido secuenciado de acuerdo con el protocolo del fabricante.

La inyección de ~100 nL de ARNds (1 jg / jL ) se realizó en larvas y escarabajos adultos con un micromanipulador bajo un estereomicroscopio de disección (n = 10, 3 repeticiones biológicas). Los animales se anestesiaron en hielo antes de ser pegados con cinta adhesiva doble. Los controles recibieron el mismo volumen de agua. Un ARNds de control negativo de IMPI (gen inhibidor de metaloproteinasas de insectos del lepidóptero Gallería mellonella) se condujeron. No se pudieron probar todos los controles en todas las etapas debido a la falta de animales.

Los escarabajos del polen se mantuvieron en placas Petri con polen seco y un tejido húmedo. Las larvas se criaron en cajas de plástico en inflorescencia de canola en un medio de agar/agua.

Tabla 13. Resultados del bioensayo de inyección del escarabajo del polen adulto.

Tabla 14. Resultados del bioensayo de inyección de larvas del escarabajo del polen.

Los controles se realizaron en una fecha diferente debido a la disponibilidad limitada de insectos.

Bioensayo de alimentación: Los escarabajos se mantuvieron sin acceso al agua en tubos de halcón vacíos 24 h antes del tratamiento. Una gota de ARNds (~5 |jL) se colocó en una pequeña placa Petri y se añadieron de 5 a 8 escarabajos a la placa Petri. Los animales se observaron bajo un estereomicroscopio y aquellos que ingirieron la solución de dieta que contiene ARNds se seleccionaron para el bioensayo. Los escarabajos se transfirieron a placas Petri con polen seco y un tejido húmedo. Los controles recibieron el mismo volumen de agua. Un ARNds de control negativo de IMpI (gen inhibidor de metaloproteinasa de insectos del lepidóptero Gallería mellonella) se condujo. No se pudieron probar todos los controles en todas las etapas debido a la falta de animales.

Tabla 15. Resultados del bioensayo de alimentación de adultos.

Mientras la presente descripción puede ser susceptible a diversas modificaciones y formas alternativas, los aspectos específicos de la descripción se han descrito a manera de ejemplo en la presente descripción en detalle. Sin embargo, debe entenderse que la presente descripción no pretende limitarse a las formas particulares descritas. Más bien, la presente descripción es para cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que caen dentro del alcance de la presente descripción como se define en las siguientes reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales.

Ejemplo 14: Transformación de hipocotilos de Canola mediada por Agrobacterium (Brassica nanus)

Preparación de Agrobacterium

La cepa de Agrobacterium que contiene un plásmido binario se extiende en placas de medio YEP (Bacto Peptone™ 20,0 g/L y extracto de levadura 10,0 g/L) que contienen estreptomicina (100 mg/mL) y espectinomicina (50 mg/mL) y se incuba durante 2 días a 28 °C. La cepa propagada de Agrobacterium que contiene el plásmido binario se raspa de la placa estriada de 2 días mediante el uso de un asa de inoculación estéril. La cepa raspada de Agrobacterium que contiene el plásmido binario se inocula luego en 150 mL de líquido YEP modificado con estreptomicina (100 mg/mL) y espectinomicina (50 mg/mL) en matraz(es) deflector(es) estériles de 500 mL y se agita a 200 rpm a 28 °C. Los cultivos se centrifugan y se resuspenden en medio M (sales LS, glucosa al 3 %, vitaminas B5 modificadas, cinetina 1 j M, 2,4-D 1 j M, pH 5,8) y se diluyen a la densidad apropiada (50 unidades Klett como se midió mediante el uso de un espectrofotómetro) antes de la transformación de hipocotilos de canola.

Transformación de canola

Germinación de la semilla: Las semillas de canola (var. NEXERA 710™) se esterilizan en superficie en Clorox™ al 10 % durante 10 minutos y se enjuagan tres veces con agua destilada estéril (las semillas están contenidas en filtros de acero durante este proceso). Las semillas se plantan para germinar en medio de Canola A MS (1/2 MS, sacarosa al 2 %, agar al 0,8 %) contenido en Phytatrays ™ (25 semillas por Phytatray ™) y se colocan en una cámara de crecimiento Percival™ con un régimen de crecimiento establecido a 25 °C, fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad durante 5 días de germinación.

Pre-tratamiento: En el día 5, se cortan asépticamente segmentos de hipocotilo de alrededor de 3 mm de longitud, se descartan las secciones restantes de raíz y brote (se evita el secado de los segmentos de hipocotilo al sumergir los segmentos de hipocotilo en 10 mL de agua estéril milliQ™ durante el proceso de escisión). Los segmentos de hipocotilo se colocan horizontalmente sobre papel de filtro estéril en medio de inducción de callos, MSK1D1 (MS, 1 mg/L de cinetina, 1 mg/L de 2,4-D, 3,0 % de sacarosa, fitagar al 0,7 %) durante 3 días de pretratamiento en una cámara de crecimiento Percival™ con un régimen de crecimiento de 22-23 °C y un fotoperíodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad.

Cocultivo con Agrobacterium: El día antes del co-cultivo de Agrobacterium, los matraces de medio YEP que contienen los antibióticos apropiados se inoculan con la cepa de Agrobacterium que contiene el plásmido binario. Los segmentos de hipocotilo se transfieren del medio de inducción de callos de papel de filtro, MSK1D1, a placas Petri™ vacías de 100 x 25 mm que contienen 10 mL de medio M líquido para evitar que los segmentos de hipocotilo se sequen. Se usa una espátula en esta etapa para recoger los segmentos y transferir los segmentos a un nuevo medio. El medio M líquido se elimina con una pipeta y 40 mL de suspensión de Agrobacterium se añaden a la placa Petri™ (500 segmentos con 40 mL de solución de Agrobacterium). Los segmentos de hipocotilo se tratan durante 30 minutos con agitación periódica de la placa Petri™ para que los segmentos de hipocotilo permanezcan sumergidos en la solución de Agrobacterium. Al final del período de tratamiento, la solución de Agrobacterium se pipetea en un vaso de precipitados de desecho; se autoclavea y se descarta (la solución de Agrobacterium se elimina por completo para evitar el crecimiento excesivo de Agrobacterium). Los hipocotilos tratados se transfieren con fórceps de nuevo a las placas originales que contienen medios MSK1D1 cubiertos con papel de filtro (se debe tener cuidado para garantizar que los segmentos no se sequen). Los segmentos de hipocotilo transformados y los segmentos de hipocotilo de control no transformados se devuelven a la cámara de crecimiento Percival™ con una intensidad de luz reducida (al cubrir las placas con hoja de aluminio), y los segmentos de hipocotilo tratados se cocultivan con Agrobacterium por 3 días.

Inducción de callos en medio de selección: Después de 3 días de cocultivo, los segmentos de hipocotilo se transfieren individualmente con fórceps al medio de inducción de callos, MSK1D1H1 (MS, 1 mg/L de cinetina, 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgNO3, 300 mg/L de Timentin™, 200 mg/L de carbenicilina, 1 mg/L de Herbiace™, sacarosa al 3 %, fitagar al 0,7 %) con un régimen de crecimiento establecido a 22-26 °C. Los segmentos de hipocotilo están anclados en el medio, pero no están profundamente embebidos dentro del medio.

Selección y regeneración de brotes: Después de 7 días en medio de inducción de callos, los segmentos de hipocotilo callosos se transfieren al medio de regeneración de Brotes 1 con selección, MSB3Z1H1 (MS, 3 mg/L de BAP, 1 mg/L de zeatina, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgNO3, 300 mg/L de Timentin™, 200 mg/L de carbenicilina, 1 mg/L de Herbiace™, sacarosa al 3 %, fitagar al 0,7 %). Después de 14 días, los segmentos de hipocotilo que desarrollan brotes se transfieren al medio de regeneración 2 con aumento de selección, MSB3Z1H3 (MS, 3 mg/L de BAP, 1 mg/L de zeatina, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgNO3, 300 mg/L de Timentin™, 200 mg/L de carbenicilina, 3 mg/L de Herbiace™, sacarosa al 3 %, fitagar al 0,7 %) con un régimen de crecimiento establecido a 22-26 °C.

Elongación del brote: Después de 14 días, los segmentos de hipocotilo que desarrollan brotes se transfieren del medio de regeneración 2 al medio de elongación del brote, MSMESH5 (MS, 300 mg/L de Timentin™, 5 mg/L de Herbiace™, sacarosa al 2 %, agar TC al 0,7 %) con régimen de crecimiento establecido a 22-26 °C. Los brotes que ya están alargados se aislaron de los segmentos de hipocotilo y se transfirieron a MSMESH5. Después de 14 días, los brotes restantes que no se han alargado en la primera ronda de cultivo en medio de medio de elongación del brote se transfieren al medio de elongación del brote fresco, MSMESH5. En esta etapa, todos los segmentos de hipocotilo restantes que no producen brotes se descartan.

Inducción de raíz: Después de 14 días de cultivo en el medio de elongación del brote, los brotes aislados se transfieren al medio MSMEST (m S, 0,5 g/L de MES, 300 mg/L de Timentin™, sacarosa al 2 %, agar TC al 0,7 %) para la inducción de raíz a 22-26 °C. Aquellos brotes que no producen raíces después de la incubación en la primera transferencia al medio MSMEST se transfieren para una segunda o tercera ronda de incubación en el medio MSMEST hasta que los brotes desarrollen raíces.

Análisis por PCR: Los segmentos de hipocotilo de canola transformados que se regeneraron en brotes que comprenden raíces se analizan adicionalmente a través de un ensayo de confirmación molecular de PCR. El tejido de la hoja se obtiene

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de ácido ribonucleico de horquilla (hpARN) con una estructura de tallo y lazo que es capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula de un insecto coleóptero tras la ingestión, en donde el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo, y en donde el polinucleótido comprende:

una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN, en donde la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:84, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:84, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:86, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:86, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:88, el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:88, al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:93 y el complemento de al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:93;

una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN; y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica un polirribonucleótido de la molécula de hpARN, en donde la tercera secuencia de nucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de nucleótidos, de manera que los polirribonucleótidos codificados por la primera y la tercera secuencias de nucleótidos se hibridan en una estructura de tallo de la molécula de hpARN,

en donde una estructura de lazo de la molécula de hpARN comprende el polirribonucleótido codificado por la segunda secuencia de nucleótidos.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde

la primera secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO:90 o el complemento de SEQ ID NO: 90.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el promotor heterólogo es funcional en una célula vegetal.

4. Una molécula de ácido ribonucleico de horquilla (hpARN) codificada por el polinucleótido de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que es capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula de un insecto coleóptero tras la ingestión, la molécula de hpARN comprende:

el primer polirribonucleótido codificado por la primera secuencia de nucleótidos;

el segundo polirribonucleótido codificado por la segunda secuencia de nucleótidos; y

el tercer polirribonucleótido codificado por la tercera secuencia de nucleótidos,

en donde el primer y tercer polirribonucleótidos se hibridan en una estructura de tallo de la molécula de hpARN.

5. Una célula transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la célula es una célula procariota o una célula eucariota.

6. Una célula vegetal transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

7. La célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido insecticida a partir de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste en Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1AyCyt2C.

8. Una planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

9. La planta transgénica de la reivindicación 8, en donde la planta comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido insecticida a partir de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste en Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A y Cyt2C.

10. Una semilla de planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.

11. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido insecticida a partir de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste en Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A y Cyt2C.

12. Un método para controlar una población de insectos coleópteros, el método comprende alimentar insectos de la población con un agente que comprende la molécula de hpARN de la reivindicación 4.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el agente es un cebo de ARN que comprende la molécula de hpARN, o un producto de pulverización que comprende la molécula de hpARN.

14. El método de la reivindicación 12, en donde el agente comprende una célula vegetal transgénica que expresa la molécula de hpARN a partir de un polinucleótido en la célula vegetal.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el agente es una planta transgénica o material vegetal transgénico que expresa la molécula de hpARN a partir de un polinucleótido en la planta o material vegetal.

16. Un método para producir una célula vegetal transgénica, el método comprende:

transformar una célula vegetal con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde la molécula es un vector de transformación vegetal;

cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo celular vegetal que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas;

seleccionar células vegetales transformadas que han integrado el polinucleótido en sus genomas;

tamizar las células vegetales transformadas para la expresión de la molécula de hpARN codificada por el polinucleótido; y

seleccionar una célula vegetal que expresa la molécula de hpARN.

17. Un método para producir una planta transgénica resistente a plagas de coleópteros, el método comprende: regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde la expresión de la molécula de ARN codificada por el polinucleótido es suficiente para reducir la expresión de un gen objetivo en una plaga de coleópteros que ingiere una célula de la planta transgénica.

18. El método de la reivindicación 16, en donde la célula vegetal transformada comprende además un polinucleótido insecticida que codifica un polipéptido a partir de Bacillus thuringiensis seleccionado del grupo que consiste en Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1Ay Cyt2C.

19. El método de la reivindicación 12, en donde el método comprende además alimentar los insectos de la población con un polipéptido insecticida a partir de Bacillus thuringiensis.