JP5530632B2 - ＲＮＡｉを使用した害虫の抑制方法 - Google Patents

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Description

技術分野
本発明は、全般的には害虫侵入の遺伝子制御に関する。より具体的には、本発明は、害虫標的コード配列の発現を抑制する、もしくは阻害するための組み換え技術に関連するものである。
序論
昆虫や他の害虫は、かみ傷または刺し傷で損傷および更には死亡の原因にすらなり得る。また、多くの害虫によって、病気の原因となる細菌類や他の病原体が感染する。例えば、蚊によって、マラリア、黄熱病、脳炎などの病気の原因となる病原体が感染する。腺ペスト、すなわち黒死病は、ラットなどのげっ歯類に感染する細菌が原因となる。極微の害虫の侵入を抑制するための組成物が、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌組成物という形で提供されてきた。線形動物や昆虫などの害虫の侵入を抑制するための方法は、一般に、害虫が存在する表面に塗る化学組成物という形であるか、またはペレット剤、粉末剤、錠剤、ペースト剤、カプセル剤という形で感染動物に投与されてきた。
商品作物が昆虫の攻撃目標となることが多い。過去数十年間で、植物での昆虫侵入を抑制するためのより効率的な方法および組成物の開発が大幅に進展した。害虫の侵入の根絶において化学殺虫剤は非常に有効である。しかし、化学殺虫剤の使用には不都合な点がいくつかある。化学殺虫剤は環境に有害となり得るだけでなく、非選択的であるため、標的以外の動植物に害を与える可能性がある。化学殺虫剤は環境中に残留して、一般に、たとえあったとしても代謝に時間を要する。化学殺虫剤は、食物連鎖において、特により高位の肉食動物種に蓄積する。化学殺虫剤の蓄積は薬剤に対する耐性発現を招き、進化のはしごを上った種においては、化学殺虫剤は、突然変異原および／または発がん性物質として作用し、不可逆的かつ有害な遺伝子改変の原因となりうる。
化学殺虫剤に関連する危険性のために、害虫の侵入を抑制するための生物学的方法が開発されてきた。例えば、葉への製剤の噴霧、もしくはジャガイモ葉での発現によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来のタンパク質Ｃｒｙ３Ａを利用した生物学的抑制によりコロラドハムシの幼虫は効果的に抑制されてきた。代わりとなる生物学的作用物質は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。過去数年間で、ＲＮＡ干渉法の用いた多細胞生物における遺伝子のダウンレギュレーション（別名「遺伝子サイレンシング」）が揺るぎない技術となっている。
ＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ）により、標的選択におけるその特異性、および標的ｍＲＮＡ抑制が非常に効率的であるために、遺伝子発現を抑制するための強力となりうるツールが提供される。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）を介した、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの工程を意味する（Zamore、Pら、Cell 101:25-33 (2000)（非特許文献１）; Fire、Aら、Nature 391:806 (1998)（非特許文献２）; Hamiltonら、Science 286、950-951 (1999)（非特許文献３）; Linら、Nature 402:128-129 (1999)（非特許文献４））。ＲＮＡｉの基本メカニズムは完全には特性付けされていないが、細胞内にｄｓＲＮＡが存在することにより、リボヌクレアーゼ３酵素であるＤｉｃｅｒの活性化によって、ＲＮＡｉが誘発されると考えられる（Zamore、Pら、(2000)（非特許文献１）; Hammondら、Nature 404、293 (2000)（非特許文献５））。ＤｉｃｅｒはｄｓＲＮＡを処理して、低分子干渉ＲＮＡと呼ばれる短い小片（ｓｉＲＮＡｓ）にし、これらは約２１〜２３個のヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖から成る（Zamore ら、(2000)（非特許文献１）; Elbashir ら、Genes Dev., 15, 188 (2001)（非特許文献６））。細胞内への送達後、ｓｉＲＮＡ分子はエンドヌクレアーゼ複合体（通称、ＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））に結合して、これによってｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と細胞のｍＲＮＡ遺伝子標的とが引き寄せられる。ＲＩＳＣによってｍＲＮＡは切断されて、ｍＲＮＡはその後、放出され、分解される。重要なことは、その後、ＲＩＳＣが更に別の標的ｍＲＮＡを分解できる点である。
Zamore、Pら、Cell 101:25-33 (2000) Fire、Aら、Nature 391:806 (1998) Hamiltonら、Science 286、950-951 (1999) Linら、Nature 402:128-129 (1999) Hammondら、Nature 404、293 (2000) Elbashir ら、Genes Dev., 15, 188 (2001)
したがって、本発明は、特定の害虫内での遺伝子発現を抑制、遅延、低減することにより、害虫の侵入を抑制する方法および抑制用の組成物を提供する。
発明の要約
一態様では、本発明は、以下の配列番号で示される核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列を提供する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３‐５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。一実施態様では、二本鎖リボヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の発現から産生され、害虫と前記リボヌクレオチド配列との接触によって前記害虫の増殖が抑制される。別の実施態様では、該配列との接触によって前記配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列の発現が抑制される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドで細胞を形質転換する。別の実施態様では、細胞は細菌、酵母、または藻類細胞である。更に別の実施態様では、貯蔵穀物、ペットフード、または粉末チョコレートなどの食品が、ポリヌクレオチドで形質転換された細胞を含む。更に別の実施態様では、噴霧剤、粉剤、ペレット剤、ゲル、カプセル剤、食品、衣装袋、本などの組成物がポリヌクレオチドを含む。更に別の実施態様では、発明は、ポリヌクレオチドを含む殺虫剤を提供する。別の実施態様では、発明は、該ポリヌクレオチドを含む組成物での前記表面の処理を含む、害虫の侵入から木材、木、製本、布、食品貯蔵容器などの対象物を防御するための方法を提供する。
別の態様では、発明は、以下の配列番号で示される核酸配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を提供する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４‐２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。一実施態様では、二本鎖リボヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の発現から産生され、害虫と前記リボヌクレオチド配列との接触によって該害虫の増殖が抑制される。別の実施態様では、該配列との接触によって前記配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列の発現が抑制される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドで細胞を形質転換する。別の実施態様では、細胞は細菌、酵母、または藻類細胞である。更に別の実施態様では、貯蔵穀物、ペットフード、または粉末チョコレートなどの食品が、ポリヌクレオチドで形質転換された細胞を含む。更に別の実施態様では、噴霧剤、粉剤、ペレット剤、ゲル、カプセル剤、食品、衣装袋、本などの組成物が、ポリヌクレオチドを含む。更に別の実施態様では、発明は、ポリヌクレオチドを含む殺虫剤を提供する。別の実施態様では、発明は、該ポリヌクレオチドを含む組成物での前記表面の処理を含む、害虫の侵入から木材、木、製本、布、食品貯蔵容器などの対象物を防御するための方法を提供する。
別の態様では、発明は、害虫の生物活性を抑制するポリヌクレオチド配列を含む組成物を害虫にさらすこと含む、害虫の侵入を抑制するための方法を提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチド配列は、以下の配列番号のいずれかで示される：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。
他の実施態様では、本発明は昆虫、線虫、または菌性の侵入などの侵入を予防または処理するための、単離されたヌクレオチド配列、二本鎖リボヌクレオチド配列、細胞、組成物、または殺虫剤の使用を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、害虫に必須の生物学的機能を転写後に抑制・阻害する標的コード配列に害虫をさらすことにより害虫の侵入を抑制する手段を提供する。標的配列にさらした後、標的は、害虫の必須遺伝子の一部または全体に対応するｄｓＲＮＡを形成して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって該害虫標的をダウンレギュレートさせる。ｍＲＮＡの該ダウンレギュレーションの結果、ｄｓＲＮＡによって害虫標的タンパク質の発現が妨げられ、これによって該害虫に死、増殖停止、繁殖不能を起こす。
本発明は、害虫の生存、成長、発生、生殖の阻害、または害虫の病原性や感染性の低減に望ましい分野に適用される。実際の適用としては、（１）害虫の侵入からの植物の保護、（２）ヒトや動物における医薬的用途または獣医学的用途（例、ヒトや動物における昆虫感染症の抑制、治療、予防）、（３）害虫が原因となる損傷からの物質の保護、（４）害虫が原因となる損傷から腐敗しやすい物（食材、種子など）の保護が挙げられるが、これらに限定されない。
二本鎖リボ核酸分子を害虫に投与することにより、あるいはさらすことによって以下の特質の１つ以上が引き起こされる：該害虫の摂食量の減少、該害虫の生存能の低下、該害虫の死、該害虫の分化および発生の抑制、該害虫の有性生殖能、筋肉形成、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節・輸送、細胞膜電位の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感知、触角形成、翼形成、脚形成、発生および分化、卵形成、幼虫の成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、細胞分裂、エネルギー代謝、呼吸、アポトーシス、そしてアクチンとチュービュリンなどの真核細胞の細胞骨格構造の任意の成分の欠如ないし低下。これらの特質の１つまたは任意の組み合わせによって、害虫の侵入を効果的に阻害できる。
本明細書で使用する全ての技術用語は、生化学、分子生物学、農学において一般に使用されるため、本発明が属する分野の当業者であれば理解できる。これらの技術用語は、例えば、以下の文献中に見ることができる：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed.Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001;Current Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel ら、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988 (with periodic updates);Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5th ed., vol. 1-2, ed.Ausubelら、John Wiley & Sons, Inc., 2002;Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed.Greenら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997。
例えば、Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990、およびDieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003にＰＣＲを利用した様々な技術は、記述している。ＰＣＲプライマー対は、この用途のためのコンピュータープログラムの利用など、既知の技術（例、Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA）による既知の配列に由来しうる。核酸の化学合成の方法は、例えば、Beaucage & Caruthers, Tetra.Letts.22: 1859-62 (1981), and Matteucci & Caruthers, J.Am.Chem.Soc.103: 3185 (1981)において考察されている。
制限酵素消化、リン酸化、ライゲーション、形質転換は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の通りに行った。特に指定しない限り、細菌細胞の増殖および維持に使用した試薬や材料は、Aldrich Chemicals（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、DIFCO Laboratories（ミシガン州デトロイト）、Invitrogen社（メリーランド州ゲイサーズバーグ）、Sigma Chemical Company（ミズーリ州セントルイス）。
生物活性とは、生物学的挙動、および害虫に及ぼすタンパク質またはペプチドおよびその発現の効果を指す。例えば、発明のＲＮＡｉは特定のｍＲＮＡの翻訳を抑制することで、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の生物活性または害虫の他の生物活性を抑制する。
本明細書において、ＲＮＡｉ分子により害虫の生物活性が抑制され、その結果、以下の特質の１つ以上が引き起こされることもある：該害虫の摂食量の減少、該害虫の生存能の低下、該害虫の死、該害虫の分化および発生の阻害、該害虫の有性生殖能、筋肉形成、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節・輸送、細胞膜電位の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感知、触角形成、翼形成、脚形成、発生および分化、卵形成、幼虫の成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、細胞分裂、エネルギー代謝、呼吸、アポトーシス、そして、例えばアクチンとチュービュリンなどの真核細胞の細胞骨格構造の任意の成分。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とは、成熟ｍＲＮＡの鋳型から合成される一本鎖ＤＮＡを指す。いくつかの方法があるが、ｃＤＮＡは逆転写酵素を使用して成熟（完全なスプライシングを受けた）ｍＲＮＡから合成されることが多い。この酵素は、一本鎖のｍＲＮＡに作用して、ＲＮＡ塩基対（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）とこれらのＤＮＡ相補体（Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｇ）の対合に基づく相補的ＤＮＡを生じる。２本の核酸鎖が、それらの塩基対の少なくとも８５％が対を成す場合、実質的に相補的である。
所望のポリヌクレオチド：本発明の所望のポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、もしくはゲノム中に所望のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞において転写および／または翻訳される遺伝子またはポリヌクレオチド、などの遺伝要素である。所望のポリヌクレオチドがタンパク質産物をコードする配列を含む場合、コーディング領域は、所望のポリヌクレオチドによってコードされる関連したメッセンジャーＲＮＡ転写産物および／またはタンパク質産物の発現を引き起こすように、プロモーターやターミネーターなどの調節エレメントに機能的に連結しうる。このように、「所望のポリヌクレオチド」は、５’→３’の方向に機能的に連結している遺伝子、プロモーター、タンパク質をコードする遺伝子、ターミネーターを含みうる。または、所望のポリヌクレオチドは、「センス」または「アンチセンス」の方向で遺伝子またはその断片を含むことができ、その転写により宿主細胞の内在性遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性のある核酸が産生される。所望のポリヌクレオチドは転写時に二本鎖ＲＮＡ産物も産生して、これは所望のポリヌクレオチドが結合する遺伝子のＲＮＡ干渉を開始させる。本発明の所望のポリヌクレオチドは、左右の境界配列が所望のポリヌクレオチドに隣接するか、もしくはその片側に位置するように、ベクター内に配置できる。本発明では、少なくとも１種の宿主細胞内のゲノム内への１つ以上の所望のポリヌクレオチドの安定挿入を想定している。所望のポリヌクレオチドは突然変異体、またはその野生型配列の変異体でありうる。所望のポリヌクレオチドの一部または全体が宿主のゲノム内に挿入されると理解される。「所望のポリヌクレオチド」とは、１つ以上の該ポリヌクレオチドを含むとも理解される。このように、本発明のベクターは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の所望のポリヌクレオチドを含むことができる。
「さらすこと」とは、害虫がｄｓＲＮＡと接触する任意の方法を含み、ここではｄｓＲＮＡがアニーリングした相補鎖を含み、この一方が、ダウンレギュレートされる害虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する。直接取り込み（例、給餌）によって害虫をｄｓＲＮＡにさらすことができ、この場合には害虫内でのｄｓＲＮＡの発現は不要である。または、ｄｓＲＮＡを含む組成物を害虫に直接侵入させることができる。例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物で処理した表面または物質と害虫を接触させることができる。ｄｓＲＮＡは、原核生物（例として細菌が挙げられるが、これに限定されない）、真核生物（例として細菌が挙げられるが、これに限定されない）の宿主細胞または宿主生物により、ｄｓＲＮＡを発現させることができる。
外来：核酸に関して「外来」とは、その核酸が宿主以外の生物に由来することを意味する。本発明によれば、外来ＤＮＡ／ＲＮＡとは、ウイルス、哺乳動物、魚類、鳥類の遺伝子構造においては天然に生じるが、形質転換させる宿主においては天然に生じない核酸を指す。このように、外来核酸は、例えば、形質転換宿主が産生しないポリペプチドをコードする核酸である。外来核酸はタンパク質産物をコードする必要はない。
遺伝子とは、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御配列およびコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。ポリペプチドを、完全長のコード配列またはコード配列の一部分によってコードできる。遺伝子は、連続コード配列を構成する、または適切なスプライス部位によって結合される１つ以上のイントロンを含むことができる。さらに、遺伝子は、発現産物の生物活性または化学構造、発現率、発現調節様式に影響を及ぼしうるコーディング領域または非翻訳領域のいずれかに１つ以上の修飾を含むことができる。該修飾として、突然変異、挿入、欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換が挙げられるが、これらに限定されない。この点について、該修飾遺伝子は、「野生型」遺伝子の「変異体」と呼ばれる。
遺伝要素：「遺伝要素」とは、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、イントロン、エンハンサー、スペーサー、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、組み換え酵素の認識部位などであるが、これらに限定されない、任意の別々のヌクレオチド配列である。
遺伝子改変：分子細胞生物学での方法の適用によって特定の生物のゲノムに核酸を安定導入。
「遺伝子抑制」または「遺伝子発現のダウンレギュレーション」または「遺伝子発現の阻害」とは、互換的に使用され、標的遺伝子からのタンパク質産物および／またはｍＲＮＡ産物のレベルでの、測定可能な、または観察可能な遺伝子発現の低減、または検出可能な遺伝子発現の完全な停止を指す。標的遺伝子のダウンレギュレーションまたは阻害が、害虫の他の遺伝子に明らかな影響を及ぼすことなく起る場合、遺伝子発現のダウンレギュレーションまたは阻害は「特異的」である。
標的遺伝子の性質に応じて、害虫の細胞での遺伝子発現のダウンレギュレーションまたは阻害は、細胞または害虫の全生物体の表現型分析、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンブロット法、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、他の免疫測定分析、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）などの分子技術を利用したｍＲＮＡやタンパク質の発現測定によって確認できる。
本明細書で裸子植物とは、子房のない種子を有する種子植物が指す。裸子植物の例として、針葉樹、ソテツ、イチョウ、マオウが挙げられる。
本明細書で使用する相同性とは、配列に関連しており、「有意な」レベルの配列類似性、より好ましくは配列同一性を示す場合に、タンパク質またはヌクレオチドは相同である可能性が高い。真の相同配列は、共通の祖先遺伝子からの分岐によって関連付けられる。配列相同体には以下の２種類がありうる：（ｉ）異なる種に存在する相同体の場合、それらはオルソローグとして知られており、例えば、マウスとヒトのαグロブリンはオルソローグである；（ｉｉ）パラログとは単一の種内で相同な遺伝子であり、例えば、マウスのαグロブリンとβグロブリンはパラログである。
宿主細胞：微生物、原核生物細胞、真核生物細胞、または単細胞として培養された細胞株を指し、それは組み換えベクターや他のポリヌクレオチドの移入において受容細胞として使用できるし、または使用されてきており、形質導入した親細胞の子孫細胞を含む。単一細胞の子孫は、自然発生的な、偶発的な、または意図的な突然変異のために、必ずしも形態、ゲノム、全ＤＮＡ相補体において元の親細胞と全く同一ではない可能性がある。
導入：本明細書において使用する場合は、感染、形質移入、形質転換、形質導入などの方法による細胞内への核酸配列の挿入を指す。
本明細書において使用する害虫には、限定されないが、以下が挙げられる：鱗翅目では、例えば、ハマキガ科、ウスコカクモンハマキ科、スカシバ科、モンヤガ科、アラバマ・アルギラシアエ種、アミロイス種、アンチカルシア・ゲマタリス、アルチプス種、コハマキ科、アウトグラファ種、アフリカズイムシ、スジマダラメイガ、モモシンクイガ、ニカメイチュウ、コリストネウラ種、クリシア・アンビグエラ、コブノメイガ、クネファジア種、コクリス種、コレオフォラ種、クロシドロミア・ビノタリス、クリプトフレビア・レウコトレタ、ヒメハマキガ類、ジアトレア種、ディパロプシス・カスタネア、エアリアス属、メイガ科、ヒメハマキガ科、ブドウホソハマキ、ドクガ属、ユークソア、ハマキガ科、ヘディア・ヌビフェラナ、ヘリオティス属、ハイマダラノメイガ、アメリカシロヒトリ、ケイフェリア・リコペルシセラ、ロイコプテラ・シテラ、リトコレシス種、ホソバヒメハマキ、マイマイガ、ハモグリガ科、オビカレハ、ヨトウガ、タバコスズメガ、オペロフテラ種、ヨーロッパアワノメイガ；パメネ種、パンデミス種、マツキリガ、ワタアカミムシガ、ジャガイモキバガ、モンシロチョウ、アオムシ、コナガ、プレイス種、シルポファガ種、セザミア種、スパルガノチス種、シロナヨトウ、コスカシバ属、タウメトペア、トルトリクス、イラクサギンウワバ、ウポノモイタ種；
甲虫類では、例えば、コメツキムシ、ハナゾウムシ、アトマリア・リネアリス、カエトクネマ・ティビアリス、コスモポリテス、クルクリオ種、カツオブシムシ、エピラクナ属、エレムヌス種、コロラドハムシ、イネミズゾウ属；コフキコガネ、オリカエフィルス、クチブトゾウムシ、フリクチヌス種、ポピッリア種、ハムシ科、ナガシンクイ、コガネムシ科、コクゾウムシ、シトトロガ種、ゴミムシダマシ、コクヌストモドキ、カツオブシムシ；
直翅目では、例えば、ゴキブリ属、チャバネゴキブリ属、ケラ属、マデラゴキブリ、トノサマバッタ属、ゴキブリ科、バッタ科；
等翅目では、例えば、ヤマトシロアリ属；
チャタテムシ目では、例えば、コナチャタテ科；
シラミ類では、例えば、ブタジラミ属、ケモノホソジラミ属、ペジクルス種、天疱瘡、フィロキセラ；
食毛目では、例えば、ダマリネア種、ハジラミ属；
総翅目では、例えば、ミカンキイロアザミウマ、クリガネアザミウマ、タエニオトリップス種、ミナミキイロアザミウマ、ネギアザミウマ、ウスミドリアザミウマ；
異翅目では、例えば、トコジラミ、ジスタンチエラ・セオブロマ、ホシカメムシ科、チャイロカメムシ（Ｅｕｃｈｉｓｔｕｓ）、クモヘリカメムシ、ミナミアオカメムシ、チビカメムシ科、サシガメ、サルベルゲラ・シングラリス、クロカメムシ、サシガメ、カスミカメムシ科（Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ、Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌｏｒｉｓ）、ナガカメムシ科（アメリカコバネナガカメムシ）、カメムシ科（Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ）；
同翅亜目では、例えば、ミカンワタコナジラミ、アレイロデス・ブラシカエ（Ａｌｅｙｒｏｄｅｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、カイガラムシ科、アブラムシ科（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ、Ａｐｈｉｓ）、カイガラムシ、タバココナジラミ、セロプラステル種、クリソンファルス・アオニディウム、マルカイガラムシ科、ヒラタカタカイガラムシ、ヒメヨコバイ、エリオソマ・ラリゲルム、クズウコン科（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ）、ガスカルディア（Ｇａｓｃａｒｄｉａ）種、ヒメトビウンカ、Ｌａｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ、カキカイガラムシ（Ｌｅｐｉｄｏｓａｐｈｅｓ）、マクロシフス種、アブラムシ科、Ｎｅｈｏｔｅｔｔｉｘ、ウンカ科、パラトリア種、天疱瘡細菌（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、コナカイガラムシ科、カイガラムシ科（Ｐｓｅｕｄａｕｌａｃａｓｐｉｓ）、コナカイガラムシ、キジラミ、プルヴィナリア・アエチオピカ、クリマルカイガラムシ（Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ）、アブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ）、カイガラムシ（Ｓａｉｓｓｅｔｉａ）、カタカイガラムシ科（Ｓｃａｐｈｏｉｄｅｕｓ）、アブラムシ科（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ）、アブラムシ科（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ）、オンシツコナジラミ、ミカンキジラミ、カイガラムシ類（Ｕｎａｓｐｉｓ ｃｉｔｒｉ；）；
膜翅目（ハチ目）では、例えば、ハキリアリ属、Ａｔｔａ種、クチヒゲグエノン（Ｃｅｐｈｕｓ）、マツハバチ種（Ｄｉｐｒｉｏｎ、Ｄｉｐｒｉｏｎｉｄａｅ）、ジリピニア・ポリトマ、Ｈｏｐｌｏｃａｍｐａ（ハバチの一種）、ケアリ属、イエヒメアリ、ハバチ、トフシアリ属、スズメバチ；
ハエ目（双翅目）では、例えば、ヤブカ属、アンセリゴナ・ソカタ、ケバエ（Ｂｉｂｉｏ ｈｏｒｔｕｌａｎｕｓ）、クロバエ・エリスロセファラ、ミバエ、オビキンバエ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ）、イエカ属、ウサギヒフバエ、ミバエ類、キイロショウジョウバエ、ヒメイエバエ科、ウマバエ科、ツェツェバエ科、ウシバエ科、イヌシラミバエ、Ｌｉｒｉｏｍｙｓａ、キンパエ（Ｌｕｃｉｌｉａ）、ダイズメモグリバエ、イエバエ科、ヒツジバエ科、イネノシントメタマバエ（Ｏｒｓｅｏｌｉａ）、オスシネラ・フリト（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ）、アカザモグリハナバエ、クロキンバエ、リンゴミバエ、シアラ（Ｓｃｉａｒａ）種）、サシバエ、アブ（Ｔａｂａｎｕｓ）、タニア、ガガンボ属；
ノミ目（隠翅目）では、例えば、セラトフィルス種（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ケオピスネヅミノミ；
シミ目では、例えば、セイヨウシミ。
単子葉植物は、１個の子葉または双葉、平行葉脈、および３の倍数単位の花部を有する開花植物である。単子葉植物の例としては、芝草、トウモロコシ、米、オート麦、小麦、大麦、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、玉葱、ヤシが挙げられるが、これらに限定されない。
害虫または標的の害虫とは、ヒトの環境中に偏在する、昆虫、クモ形動物、甲殼類、菌類、細菌、ウイルス、線形動物、扁形虫、回虫、蟯虫、鉤虫、サナダムシ、トリパノソーマ類、住血吸虫、ウシバエ、蚤、マダニ、コダニ、シラミを指す。二本鎖の遺伝子抑制剤で処理した物質または表面の他、二本鎖の遺伝子抑制剤で形質転換させた生物が産生する、１つ以上の細胞、組織、産物を害虫に摂食または接触させることができる。
線虫、または回虫は、最も一般的な動物門の１種であり、２０，０００種以上の異なる種が記述されている（１５，０００種以上が寄生性である）。それらは、真水、海、陸環境に偏在しており、ここではこれらの種は個体数および種の数のいずれにおいても他の動物のそれらよりも多く、南極や海溝に至るまで広範囲な場所で認められる。さらに、大半の動植物での病原体など、非常に多くの寄生形態がある。
特に対象となる線虫としては、例えば、センチュウ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）、コブセンチュウ（Ｎａｃｏｂｂｕｓ）、クキセンチュウ、ナガハリセンチュウ、ユミハリセンチュウ、マツノザイセンチュウの他、Ａ．ｃａｎｉｎｕｍ、Ａ．ｃｅｙｌａｎｃｉｕｍ、Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ（胃虫）、Ｏ．ｏｓｔｅｒｔａｇｉ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅ、Ｐ． ｐａｃｉｆｉｃｕｓ，（イソスジエビ（磯筋蝦））、Ｓ．ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ，（イヌの糞線虫）、Ｓ．ｒａｔｔｉ（寄生性線虫）、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｓｕｒｉ、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ、（ネコブセンチユウ）、Ｍ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ、キタネコブセンチュウ、サツマイモネコブセンチュウ、ジャワネコブセンチュウ、Ｍ．ｐａｒａｅｎｓｉｓ、ジャガイモシストセンチュウ、ジャガイモシロシストセンチュウ、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｈ．ｓｃｈａｔｔｉｉ、キタネグサレセンチュウ、クルミネグサレセンチュウ、Ｒ．ｓｉｍｉｌｉｓ、Ｚ．ｐｕｎｃｔａｔａ、豚回虫、イヌ回虫、マレー糸状虫、犬糸状虫、糸状虫、イヌ鞭虫、旋毛虫、Ｘ．ｉｎｄｅｘ、ズビニコウチュウ、ブタ回虫が挙げられる。
正常細胞とは、非形質転換体の表現型を有する細胞、または検証される組織型の非形質転換細胞の形態を呈する細胞を指す。
機能的に連結：組み合わせて細胞内で適切に機能するように２以上の分子を連結させることを指す。例えば、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御する場合、プロモーターは構造遺伝子に機能的に連結している。
オルソローグは共通の先祖からの垂直遺伝によって関連する遺伝子であり、異なる種において同じ機能を有するタンパク質をコードする。種分化後の分離のため、オルソローグは分かれて別々の進化の道筋をたどるが、通常、配列および構造レベルで類似性を有する。共通の先祖に由来し、類似の機能を有するタンパク質をコードする２つの遺伝子は、オーソロガスであると呼ばれる。オルソローグの同定は、新たに配列構造が解明されたゲノムにおける遺伝子機能の確かな予測において不可欠である。
「害虫防除剤」または「遺伝子抑制剤」とは、第１ＲＮＡ断片と第２ＲＮＡ断片を含む特定のＲＮＡ分子を指し、ここで第１、２ＲＮＡ断片の相補性によって２つの断片がインビボおよびインビトロでハイブリダイズして２本鎖分子を形成することが可能となる。第３断片によって第１、２断片の各末端で連結したステムを形成し、ループを形成できるように、つまり構造全体がステム・アンド・ループ構造を形成する、または更に強固なハイブリダイズ構造がステムループノット構造を形成できるように、第１、２配列を連結し、安定化させる第３断片を含めることが一般に好ましい。または、第３断片なしに対称ヘアピンを形成可能であるが（ここではループ設計は存在しない）、ステムがそれ自体を安定化させるのに十分な長さがある場合、立体構造のためヘアピンがそれ自体のループを形成するであろう。通常、第１、２ＲＮＡ断片はＲＮＡ分子の全長にわたり位置しており、実質的にはそれぞれの逆方向反復となっており、第３ＲＮＡ断片によって連結している。第１、および２断片は、ｄｓＲＮＡの摂取によって抑制される、標的昆虫内の標的遺伝子から転写される標的ＲＮＡのセンス、アンチセンス配列に常に対応し、また各々はセンス配列、およびアンチセンス配列とは限らない。
害虫防除剤は、実質的に精製した（または単離した）核酸分子、より具体的にはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはｃＤＮＡライブラリー由来の核酸分子またはその核酸分子の断片でありうる。または、断片は、約１５〜２５０個のヌクレオチド残基、より好ましくは、約１５〜３０個のヌクレオチド残基のより小さなオリゴヌクレオチドから成り得る。
殺虫剤とは、害虫を予防、破壊、撃退、軽減させることを目的とした任意の物質または物質の混合物を指す。殺虫剤は、人間と食物をめぐって競合する、所有物を破壊する、病気を蔓延させる、または不快な昆虫、病原体、雑草、線虫、微生物などの害虫に対して使用される化学物質または生物学的薬剤であってもよい。
表現型は生物の顕著な特徴または特性であり、形質転換生物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に１つ以上の「所望のポリヌクレオチド」、および／またはスクリーニング可能／選択マーカーを挿入させることで、本発明に従って改変してもよい。「所望のポリヌクレオチド」および／またはマーカーは、形質転換細胞または生物全体の多くの遺伝的、分子的、生化学的、生理学的、形態学的特徴または特性のいずれか１つを修飾することで、形質転換生物の表現型を変えてもよい。
植物および植物組織：「植物」は、植物界における様々な光合成生物、真核生物、多細胞生物のいずれかであり、胚形成、葉緑体の含有、セルロースの細胞壁を特徴とする。植物の一部、つまり「植物組織」は、植物、または植物の部分において害虫の侵入を予防するために、本発明の方法に従って処理してもよい。多くの適切な植物組織を本発明に従って処理でき、植物組織としては、体細胞胚、花粉、葉、茎、カルス、芽茎、極小塊茎、新芽が挙げられるが、これらに限定されない。このように、本発明では、アカシア、アルファルファ、リンゴ、杏、アーティチョーク、ａｓｈ ｔｒｅｅ、アスパラガス、アボカド、バナナ、大麦、豆、ビート、カンバ、ブナノキ、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、アブラナ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、杉、シリアル、セロリ、クリノキ、桜、白菜、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、コーヒー、コットン、カウピー豆、キュウリ、ヒノキ、なす、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ピーナツ、ホオズキ、ゴム毒人参、ヒッコリー、ケール、キーウィ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、バッタ、松、アジアンタム、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、マッシュルーム、マスタード、木の実、樫、オート麦、オクラ、玉葱、オレンジ、観賞植物／花／木、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウ豆、桃、ピーナッツ、西洋ナシ、泥炭、ペッパー、柿、キマメ、松、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、パンプキン、赤チコリー、大根、菜種、ラズベリー、米、ライ麦、モロコシ、サルヤナギ、ホウレンソウ、モミの木、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ひまわり、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、お茶、タバコ、トマト、木、ライコムギ、芝草、つる草、クルミ、クレソン、スイカ、小麦、ヤムイモ、イチイ、およびズッキーニなどの被子植物／裸子植物の処理を想定している。
本発明によると、「植物組織」には植物細胞も含まれる。植物細胞としては、浮遊培養物、カルス、胚、成長点部分、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉、種子、小胞子が挙げられる。植物組織は様々な成熟段階にあり、液体／固形培養、または鉢、温室、田畑の土壌または適切な培地中で増殖できる。植物組織とは、有性生殖、無性生殖を問わず、該植物、種子、後代、珠芽のクローン、および切り枝や種子といったこれらの子孫も指す。
プロモーターとは、核酸、好ましくはＲＮＡポリメラーゼと結合するＤＮＡ、および／または他の転写調節因子を意味することを意図している。任意のプロモーターと同様に、本発明のプロモーターによってＤＮＡまたはＲＮＡの転写が促進・調節されて、プロモーターと機能的に連結した核酸分子からｍＲＮＡ分子を生じる。先述の通り、生じたＲＮＡは、タンパク質またはポリペプチドをコードし、またはＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子をコードできる。
ポリヌクレオチドはヌクレオチド配列であり、遺伝子コード配列またはその断片、プロモーター、イントロン、エンハンサー部位、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、５’または３’非翻訳部位、レポーター遺伝子、選択マーカーなどを含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。該ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾骨格を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡなど）、または処理済のヌクレオチド配列（ｃＤＮＡなど）であってもよい。該ポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス方向の配列を含んでもよい。
単離されたポリヌクレオチドは、野生型の状態ではないポリヌクレオチド配列であり、例えば、ポリヌクレオチドは自然界では見られないヌクレオチド配列からなり、ポリヌクレオチドは通常は近傍にあるヌクレオチド配列から分離しているか、または通常は近傍にはないヌクレオチド配列に隣接しているが挙げられる。
組み換えヌクレオチド配列とは、突然変異生成、制限酵素などでの改変による遺伝子組み換え修飾を含む核酸分子を指す。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介した配列特異的または遺伝子特異的な遺伝子発現（タンパク質合成）抑制を指す。
配列同一性：本明細書において２つの核酸配列における「配列同一性」または「同一性」とは、特定部位にわたって一致率が最高となるように配列させた場合に同じである２つの配列内の残基の対照を含める。
本明細書で使用する配列同一性の割合とは、配列比較用ウィンドウに最適に配列された２つの配列の比較によって決まる値を意味しており、配列比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントの基準配列（付加や欠失は含まない）と比較して、付加または欠失（つまり、ギャップ）を含むことができる。同じ核酸塩基が両方の配列で現れる位置の数を決定して、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を配列比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、この結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を求める。
「配列同一性」には、当業者には周知の意味があり、公表された技術を利用して算出できる。Computational Molecular Biology, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988); Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, ed. (Academic Press, 1993); Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Griffin & Griffin, eds., (Humana Press, 1994); Sequence Analysis In Molecular Biology, Von Heinje ed., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov & Devereux, eds.(Macmillan Stockton Press, 1991); Carillo & Lipton, SIAM J. Applied Math.48: 1073 (1988)を参照のこと。２つの配列の同一性または類似性の決定に一般に使用する方法として、Guide To Huge Computers, Bishop, ed., (Academic Press, 1994)およびCarillo & Lipton（上記）で発表されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。同一性と類似性の測定方法は、コンピュータープログラムで体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラムの方法として、GCG program package (Devereuxら、Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)); BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschulら、J. Mol.Biol.215: 403 (1990)); FASTDB (Brutlagら、Comp.App.Biosci.6: 237 (1990))が挙げられるが、これらに限定されない。
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ鎖の一部がヘアピンループを形成するような高度な二次構造を有する低分子一本鎖ＲＮＡである。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とは、遺伝子タンパク質発現に対する特異的な干渉能に由来する約１０〜３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。
標的配列とは、二本鎖ＲＮＡ技術によって抑制または阻害が選択される害虫内のヌクレオチド配列を指す。標的配列は、害虫内において不可欠な特性または生物活性をコードする。
転写ターミネーター：本発明の発現ＤＮＡコンストラクトにおいては、一般に、転写開始調節部位の反対側に転写終結部位がある。転写終結部位は、発現を高めるためのｍＲＮＡの安定化、および／または遺伝子転写産物へのポリアデニル化末端の付加で選択できる。３つの連鎖停止コドンのいずれかがリボゾームＡ部位に入ると、新生ポリペプチドの翻訳が終了する。翻訳終結コドンはＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡである。
形質転換：核酸が生物のゲノム内に安定的に挿入される過程をいう。当業者に周知の様々な方法を利用して、自然または人工条件下で形質転換は起こりうる。微生物を介した形質転換、ウイルス感染、ウィスカー法、電気穿孔法、微量注入法、ポリエチレングリコール処理、熱ショック、リポフェクション、微粒子銃など、原核生物や真核生物の宿主細胞内に核酸配列を挿入するための周知の方法を形質転換に利用できる。
トランスジェニック生物は、外来核酸を安定的に挿入させた少なくとも１個の細胞を含む。本発明においてトランスジェニック生物は、細菌、または酵母などの真核生物の宿主細胞または宿主生物である。限定されないが、大腸菌（例、大腸菌）、桿菌属（例、バシラス‐スリンジエンシス）、根粒菌属、乳酸菌、ラクトコッカス属など、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を含むグループから細菌を選択できる。サッカロミセス属などを含むグループから酵母を選択できる。
変異体：本明細書で用いる「変異体」とは、当然のことながら、特定の遺伝子やタンパク質の標準的な、または任意のヌクレオチドやアミノ酸から逸脱したヌクレオチド配列を意味する。「イソ型」、「アイソタイプ」、「類似体」という用語は、ヌクレオチド配列の「変異体」も指す。「変異体」とは、Ｍａｘｙｇｅｎに譲渡した特許に記載の「シャッフル遺伝子」を指すこともできる。
本発明では、方法論、プロトコル、ベクター、試薬などが変わる可能性があるため、当然のことながら、これらが本明細書に記載のものに限定されない。本明細書で使用する専門用語は、当然特定の実施態様を記載するためのみに使用し、本発明の範囲を限定することを目的としないことも理解されたい。本明細書で使用する通り、および添付請求項においては、文脈上、別段明確に指示がある場合を除き、単数形の"ａ"、"ａｎ"、"ｔｈｅ"は、複数の記載を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１遺伝子」の記載は、１つ以上の遺伝子の記載であり、当業者などには周知の、それと同等な物も含む。
Ｉ．標的害虫
本発明は、転写後に害虫に必須の生物機能を抑制／阻害する標的コード配列（コード配列）を害虫に投与する、もしくはさらすことで害虫の侵入を抑制するための方法論およびコンストラクトを提供する。本明細書で「害虫」とは、ヒトの環境中に偏在する、昆虫、クモ形動物、甲殼類、菌類、細菌、ウイルス、線形動物、扁形虫、回虫、蟯虫、鉤虫、サナダムシ、トリパノソーマ類、住血吸虫、ウシバエ、蚤、マダニ、コダニ、シラミなどを指す。二本鎖の遺伝子抑制剤で処理した物質または表面の他、二本鎖の遺伝子抑制剤で形質転換させた生物が産生する、１つ以上の細胞、組織、産物を害虫に摂食または接触させることができる。
「病虫害抵抗性」は、通常、宿主に損傷を及ぼす害虫からの攻撃に対して、宿主に耐性を付与するトランスジェニック宿主の特性である。該病虫害抵抗性は、自然突然変異から、またはより一般的には病虫害抵抗性を付与する組み換えＤＮＡの取り込みから、生じる。トランスジェニック宿主に病虫害抵抗性を付与するには、例えば、組み換えＤＮＡは、組み換え宿主の組織または体液中においてｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子に転写可能である。ｄｓＲＮＡ分子は、組み換え宿主の摂食を好む害虫内において、ＤＮＡ配列からコードされる対応するＲＮＡ断片と同一のＲＮＡ断片から部分的に成る。標的害虫内での遺伝子発現はｄｓＲＮＡによって抑制され、標的害虫内での遺伝子発現の阻害は宿主に病虫害抵抗性をもたらす。
適切な害虫としては、他の生物に損傷を与える任意の生物が挙げられる。発明では、特に昆虫、線虫、真菌性の害虫を検討している。
本明細書において昆虫とは任意の昆虫であり、動物界（Ｋｉｎｇｄｏｍ Ａｎｉｍａｌｓ）、門節足動物（Ｐｈｙｌｕｍ Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）、昆虫類（Ｃｌａｓｓ Ｉｎｓｅｃｔａ）、またはクモ類（Ｃｌａｓｓ Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属する任意の生物を意味する。本発明の方法は、ＲＮＡ干渉法による遺伝子サイレンシングに対して感受性があり、身近な環境から二本鎖ＲＮＡを取り込み可能な全ての昆虫に適用できる。
本発明の一実施態様では、昆虫は以下の目に属することができる：ダニ類、真正クモ目、シラミ目、甲虫類、トビムシ目、革翅目、網翅類、双尾目、双翅目、紡脚目、カゲロウ目、蛩れん目(Grylloblatodea)、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鱗翅目、食毛目、シリアゲムシ目、脈翅目、トンボ目、直翅類、ナナフシ類、カワゲラ目、原尾目、チャタテムシ目、ノミ目、シラミ目、総尾目、ネジレバネ目、アザミウマ類、毛翅目、絶翅目。
本発明の好ましいが、非限定的な実施態様および方法において、昆虫は以下から成るグループから選択する：
（１）限定されないが、トビイロウンカ科（例、Ｎ．ｌｕｇｅｎｓ（トビイロウンカ））；ヒメトビウンカ科（例、Ｌ．ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ（ヒメトビウンカ））；ツマグロヨコバイ科（例、タイワンツマグロヨコバイまたはＮ．ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ（ミドリヒメヨコバイ）またはクロスジツマグロヨコバイ（ツマグロヨコバイ）；セジロウンカ科（例、Ｓ．ｆｕｒｃｉｆｅｒａ（セジロウンカ））；ナガカメムシ科（例、Ｂ．ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ（ヒメオオメカメムシ））；イネクロカメムシカメムシ科（例、Ｓ．ｖｅｒｍｉｄｕｌａｔｅ（イネクロカメムシ）；アオクサカメムシ科（例、Ａ．ｈｉｌａｒｅ（アオクサカメムシ））；イチモンジセセリ属（例、Ｐ．ｇｕｔｔａｔａ（イチモンジセセリ））；メイガ科（例、Ｃ．ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ）、Ｃ．ａｕｒｉｃｉｌｉｕｓ（ｇｏｌｄ−ｆｒｉｎｇｅｄ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ）、またはＣ．ｐｏｌｙｃｈｒｙｓｕｓ（ネッタイメイチュウ））；Ｃｈｉｌｏｔｒａｅａ ｓｐｐ．（例、Ｃ．ｐｏｌｙｃｈｒｙｓａ（ｒｉｃｅ ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ））；ヨトウ科（例、イネヨトウ（イネの茎の穿孔虫））；トリポリザ科（例、Ｔ．ｉｎｎｏｔａｔａ（ｗｈｉｔｅ ｒｉｃｅ ｂｏｒｅｒ）、Ｔ．ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ（サンカメイガ）；ノメイガ科（例、Ｃ．ｍｅｄｉｎａｌｉｓ（コブノメイガ））；ハモグリバエ科（例、麹菌（ハモグリバエ）またはＡ．ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ（ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；ディアトラエア（Ｄｉａｔｒａｅａ）種（例、Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビメイガ）またはＤ．ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（南西部アワノメイガ））；フタオビコヤガ種（例、Ｎ．ａｅｎｅｓｃｅｎｓ（フタオビコヤガ））；フタトガリコヤガ科（例、Ｘ．ｔｒａｎｓｖｅｒｓａ（フタトガリコヤガ））；ヨトウ科（例、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ：ヨトウガの一種）、Ｓ．ｅｘｉｇｕａ（シロイチモジヨトウ）、アフリカヨトウ（ネキリムシ（ｃｌｉｍｂｉｎｇ ｃｕｔｗｏｒｍ））またはＳ．ｐｒａｅｆｉｃａ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；ヨトウ（例、アワヨトウ（ヨトウムシ））；オオタバコガ（例、Ｈ．ｚｅａ（トウモロコシミミズ））；Ｃｏｌａｓｐｉｓ種（例、コゴメスゲ（ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ））；イネミズゾウムシ種（例、Ｌ．ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ（イネミズゾウムシ））；イネゾウムシ科（例、Ｅ．ｓｑｕａｍｏｓ（イネゾウムシ））；Ｄｉｃｌｏｄｉｓｐａ科（例、Ｄ．ａｒｍｉｇｅｒａ（オオタバコガ））；ハムシ科（例、イネクビボソハムシ（ハムシ）；コクゾウムシ（例、Ｓ．オリゼ（ココクゾウムシ））；タマバエ科（例、 Ｐ． オリゼ（イネいもち病菌））；ミギワバエ科（例、イネヒメハモグリバエ（イネミギワバエ）またはイネカラバエ（イネキモグリバエ）；イネキモグリバエ種（例、Ｃ． オリゼ（カラバエ））；ノメイガ科（例、Ｏ．ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（アワノメイガ））；ヤガ科（例、Ａ．ｉｐｓｉｌｏｎ（タマナヤガ））；マダラメイガ科（例、エラスモパルパス・リグノセラス（モロコシマダラメイガ））；コメツキムシ科（ハリガネムシ）；コガネカブト科（例、Ｃ．ｂｏｒｅａｌｉｓ（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）またはＣ．ｉｍｍａｃｕｌａｔａ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ））；マメコガネムシ（例、Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ（マメコガネ虫））；ハムシ科（例、Ｃ．ｐｕｌｉｃａｒｉａ（トウモロコシハムシ））；オサゾウムシ科（例、Ｓ．ｍａｉｄｉｓ（トウモロコゾウムシ））；アブラムシ科（例、Ｒ．ｍａｉｄｉｓ（トウモロコシアブラムシ））； Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｓｐｐ．（例、Ａ．ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ））；メラノプラス科（例、Ｍ．ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ（アカアシセンチュウ）Ｍ．ジフェレンチアリス（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）Ｍ．ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ（ミグラトリーグラスホッパー））；ハナバエ科（例、タネバエ（ダイズサヤタマバエ））；アザミウマ目（例、Ａ．ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ（ｇｒａｓｓ ｔｈｒｉｐｓ））；トフシアリ科（例、Ｓ．ｍｉｌｅｓｔａ（ｔｈｉｅｆ ａｎｔ））；または（例、ナミハダニ（タネバエ）、Ｔ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ（ニセナミハダニ）；オオタバコガ科（例、Ｈ．ｚｅａ （ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）またはオオタバコガ（アメリカンボールワーム））；キバガ科（例、ワタアカミムシ（ワタキバガ））；エアリアス属（例、クサオビリンガ（スポテッドボールワーム））；ヤガ科（例、Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（タバコガ））；ハナゾウムシ（例、グランディスドロワムシ（ワタノハナゾウムシ））；ワタノミハムシ（例、Ｐ．ｓｅｒｉａｔｕｓ（コットンフリーホッパー））；オンシツコナジラミ （例、Ｔ．ａｂｕｔｉｌｏｎｅｕｓ（ｂａｎｄｅｄ−ｗｉｎｇｅｄ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）、オンシツコナジラミ（シルバーリーフコナジラミ））；コナジラミ（例、フコナジラミ（シルバーリーフコナジラミ））；アブラムシ（例、Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ（ワタアブラムシ）、セイヨウミツバチ）；メクラガメ（例、リガス・リネオラリス（マキバメクラガメ）またはＬ．ｈｅｓｐｅｒｕｓ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ））；カメムシ科（例、Ｅ．ｃｏｎｓｐｅｒｓｕｓ（ｃｏｎｓｐｅｒｓｅ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ））；アイイロタテハ（例、Ｃ．ｓａｙｉ（Ｓａｙ ｓｔｉｎｋｂｕｇ））；アオカメムシ（例、Ｎ．ｖｉｒｉｄｕｌａ（ミナミアオカメムシ））；アザミウマ（例、Ｔ．ｔａｂａｃｉ（ネギアザミウマ））；キイロアザミウマ（例、Ｆ．ｆｕｓｃａ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐｓ）またはＦ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ミカンキイロアザミウマ））；ハムシ（例、コロラドハムシ）、Ｌ．ｊｕｎｃｔａ （ｆａｌｓｅ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ）、またはＬ．ｔｅｘａｎａ（Ｔｅｘａｎ ｆａｌｓｅ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ））；ハムシ科（例、Ｌ．ｔｒｉｌｉｎｅａｔａ（ｔｈｒｅｅ−ｌｉｎｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ））；ノミハムシ（例、Ｅ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ（ｐｏｔａｔｏ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）、Ｅ．ｈｉｒｔｉｐｅｎｎｉｓ （トビハムシ）、またはＥ．ｔｕｂｅｒｉｓ （ジャガイモノミハムシｔｕｂｅｒ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；ハンミョウ科（例、Ｅ．ｖｉｔｔａｔａ （ツチハンミョウｓｔｒｉｐｅｄ ｂｌｉｓｔｅｒ ｂｅｅｔｌｅ））；ヨコバイ科（例、ジャガイモヒメヨコバイ（ポテトリーフホッパー））；アブラムシ科（例、Ｍ．ｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ））；Ｐａｒａｔｒｉｏｚａ（例、アオキシロカイガラムシ（キジラミ））；ハムシ科（例、Ｃ．ｆａｌｌｉ （ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｒｅｗｏｒｍ）、またはキビタイシメ（ｔｏｂａｃｃｏ ｗｉｒｅｗｏｒｍ））；ジャガイモキバガ（例、Ｐ．ｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ（ジャガイモガ））；アブラムシ科（例、Ｍ．ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ（ジャガイモアブラムシ））；Ｔｈｙａｎｔａ ｓｐｐ．（例、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｏｖｉｒｅｎｓ（ｒｅｄｓｈｏｕｌｄｅｒｅｄ ｓｔｉｎｋｂｕｇ））；キバガ科（例、Ｐ．ｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ（ジャガイモキバガ））；オオタバコガ科（例、Ｈ．ｚｅａ（ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔｗｏｒｍ）；キバガ科（例、Ｋ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ（ｔｏｍａｔｏ ｐｉｎｗｏｒｍ））；Ｌｉｍｏｎｉｕｓ（ハリガネムシ）；スズメガ科（例、Ｍ．ｓｅｘｔａ（タバコホーンウォーム）、またはＭ．ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ（トマトホーンワーム））；ハモグリバエ科（例、トマトハモグリバエ、マメハモグリバエ、またはアシグロハモグリバエ（ハモグリバエ））；ショウジョウバエ（例、キイロショウジョウバエ、Ｄ．ｙａｋｕｂａ、ウスグロショウジョウバエ、オナジショウジョウバエ）；オサムシ科（例、アカガネオサムシ）；ユスリカ（例、Ｃ．ｔｅｎｔａｎｕｓ破傷風）；Ｃ．ｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｓｐｐ． ノミ（例、Ｃ．ｆｅｌｉｓ （ネコノミ））；ゾウムシ科（例、Ｄ．ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ （根のゾウムシｒｏｏｔ ｗｅｅｖｉｌ））；キクイ（例、Ｉ．ｐｉｎｉ（キクイムシ））；コクヌストモドキ科（例、Ｔ．ｃａｓｔａｎｅｕｍ（コクヌストモドキ））；ツェツェバエ科（例、Ｇ．ｍｏｒｓｉｔａｎｓ（ツェツェバエ））；ハマダラカ科（例、Ａ．ｇａｍｂｉａｅ（ガンビエハマダラカ））；オオタバコガ（例、オオタバコガ（Ａｆｒｉｃａｎ Ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；アブラムシ科（例、Ａ．ｐｉｓｕｍ（エンドウヒゲナガアブラムシ））；ミツバチ科（例、セイヨウミツバチ（ミツバチ））；ヨコバイ科（例、Ｈ．ｃｏａｇｕｌａｔｅ（グラッシーウイングド・シャープシューター））；ヤブカ属（例、Ａｅ．ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマカ））；カイコガ科（例、Ｂ．ｍｏｒｉ（カイコガ）、Ｂ．ｍａｎｄａｒｉｎａ）；バッタ科（例、Ｌ．ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ））；マダニ科（例、オオシマダニ（ウシダニ））；タランチュラ科（例、Ａ．ｇｏｍｅｓｉａｎａ（ｒｅｄ−ｈａｉｒｅｄ ｃｈｏｌｏｌａｔｅ ｂｉｒｄ ｅａｔｅｒ））；胎生ゴキブリ（例、Ｄ．ｐｕｎｃｔａｔａ（ｐａｃｉｆｉｃ ｂｅｅｔｌｅ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ））；ドクチョウ（例、Ｈ．ｅｒａｔｏ （ベニバナトケイソウ）またはメルポメネベニモンドクチョウ（ｐｏｓｔｍａｎ ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ））；ゾウムシ（例、Ｃ．ｇｌａｎｄｉｕｍ（どんぐり・ゾウムシ））；コナガ科（例、Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（ｄｉａｍｏｎｔｂａｃｋ ｍｏｔｈ））；キララマダニ（例、Ａ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ（ウシダニ））；Ａｎｔｅｒａｅａ ｓｐｐ． （例、ヤママユ（ヤママユガ））；Ｂｅｌｇｉｃａ ｓｐｐ．（例、Ｂ．ａｎｔａｒｔｉｃａ）、Ｂｅｍｉｓａ ｓｐｐ．（例、タバココナジラミ）、ジャノメチョウ、Ｂｉｐｈｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、マメゾウムシ、ハマキガ、ハンミョウ、イエカ、ヌカカ、ミカンキジラミ、ゾウムシ科、ヤガ科、シタバガ亜科、ツェツェバエ、コオロギ、シマトビケラ、タマムシ、ヤママユガ．，Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ種、Ｌｙｓｉｐｈｅｂｕｓ ｓｐｐ、Ｍｅｌａｄｅｍａ ｓｐｐ．、コキノコムシ科、Ｎａｓｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ｏｎｃｏｍｅｔｏｐｉａ ｓｐｐ．、アゲハ属、シラミ目、ノシメマダラメイガ、Ｒｈｙｎｃｈｏｓｃｉａｒａ ｓｐｐ．、Ｓｐｈａｅｒｉｕｓ ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．、 Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ ｓｐｐ．、クロヤブカ種（例、オオクロヤブカ）；
（２）限定されないが、カメムシ目および蚊、蜜蜂、カリバチ、シラミ、ノミ、アリなどの数種のハチ、ハエ、およびクモ類、ダニ類（例、オオシロカネグモ、ワクモ科、マダニ、アノセンター属、カズキダニ属、マダニ、ツメダニ、ニキビダニ、カクマダニ、ワクモ、ヘモフィサリス、チマダニ、ダニ、トゲダニ、ヒゼンダニ、カズキダニ、トリサシダニ、オトビアス、ミミヒゼンダニ、サルハイダニ、キュウセンダニ、コイタマダニ、ヒゼンダニ、またはツシマツツガムシ；シラミ目（吸血／刺咬性のシラミ）例、ハジラミ、ケモノジラミ、イヌジラミ、ニワトリハジラミ、コロモジラミ、天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、フィロキセラ ブドウネアブラムシ、ホソジラミ；ハエ目、例、シマカ、ハマダラカ、クロバエ、オビキンバエ， メクラアブ、コクリオミイア種、イエカ、ヌカカ、クテレブラ、ヒトヒフバエ、ウマバエ、ツェツェバエ、イエバエ科 ノサシバエ、ゴマフアブアブ、ヒポボスカ種、ウマシラミバエ属、ウシバエ、キンバエ、ノサシバエ、シラミバエ、ヒツジバエ、ヒロズキンバエ双翔目、サシチョウバエ、クロキンバエ、ニクバエ、ブユ、サシバエ、アブ科、タニアまたはガガンボ；ハジラミ目（刺咬性のシラミ）例、トリコデクテス、ハジラミ（Ｆｅｌｉｃｏｌａ）またはワラビーハジラミまたはイヌハジラミ；またはノミ目（無翅昆虫）例、ナガノミ科、ヒトノミ、またはケオプスネズミノミ；トコジラミ科（ナンキンムシ）例、トコジラミ、オオキノコムシ科、Ｒｈｏｄｉｎｉｕｓまたはサシガメ科において認められる人および／または動物に感染する、または損傷を及ぼすことのできる昆虫；
（３）食料、種子、木材、塗料、プラスチック、衣類などを攻撃する昆虫など、基材や材料に好ましくない損傷を与える昆虫。
本発明の方法は、ＲＮＡ干渉法による遺伝子サイレンシングに対して感受性があり、身近な環境から二本鎖ＲＮＡを取り込み可能な全ての線虫に適用できる。
本発明の一実施態様では、線虫は、シストセンチュウ属やジャガイモシストセンチュウ属を含むヘテロデラ科に属しうる。
本発明の好ましいが、限定的な実施態様および方法において、以下から成るグループから昆虫は選択される：
（１）ネコブセンチュウ（例、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ、Ｍ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ、Ｍ．ｈａｐｌａ、Ｍ．ｐａｒａｎａｅｎｓｉｓ）；ダイズシスト線虫（例、Ｈ．ｏｒｙｚａｅ、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｈ．ｚｅａｅ、Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）；ジャガイモシストセンチュウ（例、Ｇ．ｐａｌｌｉｄａ、Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）；ニセフクロセンチュウ（例、Ｒ．レニフォルミス）；ネグサレセンチュウ（例、ミナミネグサレセンチュウ、モロコシネグサレセンチュウ、プラチレンカス・ゴーデイ；ネモグリセンチュウ（例、Ｒ．Ｓｉｍｉｌｉｓ）；Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ属線虫（例、イネネモグリセンチュウ）；鉤虫（例、イヌ鈎虫、内臓幼虫移行症、ズビニ鉤虫、猫鉤虫）； アニサキス類；Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ（例、オオオサムシ）；犬回虫；回虫類（例、ブタ回虫、Ａ．Ｌｕｍｂｒｉｄｏｉｄｅｓ）；Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｓｐｐ．；糸状虫症（フィラリア症）（例、マレー糸状虫、Ｂ．ｐａｈａｎｇｉ）；マツノザイセンチュウ；ケノルハブディティス（例、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ， Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅまたはＣ．ｒｅｍａｎｅｉ）；クロストリジウム（例、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）；コオペリア（例、Ｃ．ｏｎｃｏｐｈｏｒａ）；ワセンチュウ類；シアトストーマム属（例、Ｃ．ｃａｔｉｎａｔｕｍ、Ｃ．ｃｏｒｏｎａｔｕｍ、Ｃ．ｐａｔｅｒａｔｕｍ）；Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ ｓｐｐ．（例、Ｃ．ｉｎｓｉｇｎｅ、Ｃ．ｎａｓｓａｔｕｓ、Ｃ．ｒａｄｉａｔｕｓ）；シリコステファヌス（例、Ｃ．ｇｏｌｄｉまたはＣ．ｌｏｎｇｉｂｕｒｓａｔｕｓ）；裂頭条虫；犬糸状虫（例、イヌ糸状虫）；Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ（例、Ｄ．ｄｉｐｓａｃｉ、Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、Ｄ．Ａｎｇｕｓｔｕｓ）；蟯虫（例、Ｅ．ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）；捻転胃虫（例、Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）；センセンチュウ；ヤリセンチュウ；リトモソイデス（例、Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）；ハリセンチュウ（例、Ｌ．ｍａｃｒｏｓｏｍａ）；鉤虫（例、アメリカ鉤虫）；ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス線虫（例、Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）；糸状虫（例、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ）；オステルタギア（例、Ｏ．ｏｓｔｅｒｔａｇｉ）；線虫類（例、Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｓｕｒｉ）；ユミハリセンチュウ（例、Ｐ．ｍｉｎｏｒ、Ｐ．ｔｅｒｅｓ）；パレラフォストロンギルス（例、Ｐ．ｔｅｎｕｉｓ）；Ｒａｄｏｐｈｕｌｕｓ ｓｐｐ．；Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｒｎａ ｓｐｐ．；糞線虫ストロンギロイデス属（例、Ｓ．Ｒａｔｔｉ、Ｓ．ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）；テラドルサジア（例、Ｔ．ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）；トキサスカリス（例、Ｔ．ｌｅｏｎｉｎａ）；回虫（例、イヌハジラミ、猫回虫）；旋毛虫（例、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉ、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔ．ｓｐｉｒａｅ）；ユミハリセンチュウ（例、Ｔ．ｓｉｍｉｌｉｓ）；鞭虫． （例、Ｔ．ｍｕｒｉｓ、Ｔ．ｖｕｌｐｉｓ、Ｔ．ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）；ミカンネセンチュウ；Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．；鉤虫（例、挟頭鉤虫）；糸状虫（例、バンクロフト糸状虫）；オオハリセンチュウ（例、Ｘ．Ｉｎｄｅｘ、Ｘ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）；
（２）限定されないが、ヒトに感染可能な線虫として以下が挙げられる：Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ＝蟯虫症の原因となる蟯虫；Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｄｏｉｄｅｓ＝回虫症の原因となる大型の腸内回虫；Ｎｅｃａｔｏｒ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ＝鉤虫症の原因となる２種類の鉤虫；Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ＝鞭虫症の原因となる鞭虫；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ＝糞線虫症の原因となる糞線虫；旋毛虫症の原因となるＴｒｉｃｈｏｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｅ；マレー糸状虫、バンクロフト糸状虫＝リンパ管フィラリア症およびその肉眼所見である象皮病として知られている寄生虫感染症に関連する糸状虫（フィラリア）、河川盲目症の原因となる回旋線糸状虫。感染した動物や人に侵入した吸血蚊を介して線虫から人への移動が起りうる；
（３）限定されないが、イヌ［鉤虫（例、イヌ鉤虫、挟頭鉤虫）、イヌ科回虫類（例、イヌ回虫、犬小回虫）、鞭虫（例、犬鞭虫）、ネコ［鉤虫（例、アンキロストマ・トゥバエフォルメ、回虫類（例、猫回虫）］、魚［アニサキス、シュードテラノーバ（例、アニサキス）、サナダムシ（例、裂頭条虫属）、ヒツジ［ハリガネムシ（例、捻転胃虫）、ウシ［腸内寄生虫（例、オステルタギア・オステルタギ Ｃｏｏｐｅｒｉａ ｏｎｃｏｐｈｏｒａ）などが動物に侵入できる線虫である；
（４）食料、種子、木材、塗布剤、プラスチック、衣類などの基材や物質に好ましくない損傷を招く線虫 限定されないが、該線虫の例として、ネコブセンチュウ（例、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｍ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉまたはＭ．ｈａｐｌａ）；ダイズシスト線虫（例、Ｈ．ｏｒｙｚａｅ、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｈ．Ｚｅａｅ、Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）；ジャガイモシストセンチュウ（例、Ｇ．ｐａｌｌｉｄａ、Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）；Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ（例、Ｄ．ｄｉｐｓａｃｉ、Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、Ｄ．ａｎｇｕｓｔｕｓ）；Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｓｐｐ．；ニセフクロセンチュウ類（例、Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）；ネグサレセンチュウ．（例、ミナミネグサレセンチュウ、プラチレンカス・ゴーデイ、Ｐ．Ｚｅａｅ）；Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ（例、バナナネモグリセンチュウ）；Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ（例、Ｈ．Ｏｒｙｚａｅ）；Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ（例、イネシンガレセンチュウ）；Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．；Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．；Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．；ヤリセンチュウ；オオハリセンチュウ；ユミハリセンチュウ（例、土壌線虫パラトリコドラス・マイナー）；イシュクセンチュウ；
（５）ウイルス伝播性線虫（例、Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｍａｃｒｏｓｏｍａはプルヌスネクロティックリングスポットウイルスを伝播する。アメリカオオハリセンチュウはタバコ輪班ウイルスを伝播する。Ｐａｒａｔｒｉｃｈａｄｏｒｕｓ ｔｅｒｅｓはｐｅａ ｅａｒｌｙ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｖｉｒｕｓを伝播する。ハリセンチュウはタバコラットルウイルスを伝播する。）。
特定の対象となる真菌性害虫として以下が挙げられるが、限定されない。本発明の１実施態様では、真菌類はカビ、特に糸状菌でありうる。本発明の他の実施態様では、真菌類は酵母でありうる。
一実施態様では、真菌類は、子嚢菌類、つまり子嚢菌門に属する真菌類でありうる。
本発明の好ましい実施態様では、限定されないが、真菌細胞は以下から成るグループから選択される：
（１）限定されないが、Ａｃｒｅｍｏｎｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、黒斑病（例、キャベツ黒すす病菌または輪紋病）、黒斑病（例、エンドウ黒斑病）、かび病菌（例、灰色かび病菌または糸状菌）、クラドスポリウム属、褐斑病（例、ダイズ紫斑病またはＣｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚａｅａ−ｍａｙｄｉｓ）、クロカビ（例、トマト葉カビ病菌）、コレトトリカム属菌、炭疽病菌（例、コレトトリカム・リンデムチアナム）、カルバラリア、円斑病菌（例、Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｍａｙｄｉｓ）、うどんこ病菌（例、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ． ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ． ｈｏｒｄｅｉ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｐｉｓｉ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｒｍｙｌｏｖｏｒａ、フザリウム属（例、麦類赤かび病菌、フザリウム・スポロトリキオイデス、萎ちょう病菌、ムギ類赤かび病菌、チオファネートメチル耐性コムギ赤かび病菌， Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、フザリウム・モニリフォルメまたはＦｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例、Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ． ｔｒｉｔｉｃｉ（ムギ類のうどんこ病菌））、イネばか苗病菌（例、赤かび病菌）、ごま葉枯病菌（例、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｕｍ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｖｄｉｓ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ（イネ小球菌核病菌））、小球菌核病菌、立枯病すみぐされびょう菌（例、炭腐病菌）、 Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａ（例、イネいもち病菌）、リンゴ黒点病菌、株枯病菌 Ｎｅｃｔｒｉａ属（例、Ｎｅｃｔｒｉａ ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ〉、べと病菌 （例、ダイズのべと病菌（またはタバコのべと病菌）、Ｐｈｏｍａ属菌（例、蛇の目病菌）、サビ病菌（例、大豆サビ病菌）、カンキツグリーニング病原体（例、Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｍｎｉｖｏｒｕｍ）、エキビョウキン（例、フィトフトラ・シンナモミ、フィトフトラ カクトラム、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、褐色腐敗病菌、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ．ｓｐ． ｓｏｉａｅ、フィトフトラ・インフェスタンス）、べと病菌（例、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）、うどんこ病菌（例、リンゴうどんこ病菌）、さび病菌（例、トウモロコシさび病菌、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、小麦黒銹病菌、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｓｐａｒａｇｉ、コムギ赤さび病菌、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｒａｃｈｉｄｉｓ）、土壤病菌（例、赤焼病菌）、斑葉病菌（例、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｅｎｓ、網斑病菌）、いもち病菌（例、イネいもち病菌）、土壤病菌（例、ピシウム・ウルティマム）、Ｒｈｉｎｃｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ、ベントグラス葉腐病菌（例、イネ紋枯病菌、イネ赤色菌核病菌、株腐病）、クモノスカビ属（例、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｄ）、Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｓｐｐ．（例、Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ）、菌核病菌（例、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐｐ．（例、白星病菌、褐紋病菌、ふ枯病菌、葉枯病）、タバコ黒根病（例、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）、黒穂病菌、トリコデルマ（例、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｄｅ）、ウドンコカビ（例、Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）、トウモロコシ黒穂病菌（例、トウモロコシ黒穂病）、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｓｐｐ．（例、黒星病菌、ナシの黒星病菌）、昆虫寄生性糸状菌（例、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）などの植物病原菌の真菌細胞、または植物病原菌に由来する細胞；
（２）限定されないが、カンジダ属、特にカンジダアルビカンス；Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．、白癬菌、ミクロスポルムを含むＤｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ；アスペルギルス属（特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）；Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ；パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス；コクシジオイデス・イミティス；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ Ｖａｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍまたはＶａｒ．ｄｕｂｏｉｓｉｉ；Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ属菌；Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｌｉｓ；Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．；またはＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ群の真菌（特に、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）；
（３）限定されないが、カンジダ、ミクロスポルム（特に、ミクロスポルムカニス、ミクロスポルム・ギプセウム）、毛瘡白癬菌、アスペルギルス属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎなどの人に侵入できる真菌の真菌細胞、または真菌に由来する細胞；
（４）食料、種子、木材、塗料、プラスチック、衣類などを攻撃する真菌など、基材や材料に好ましくない損傷を与える真菌細胞または真菌に由来する細胞。該真菌類の例として、スタキボトリス属、コウジカビ属、アルテルナリア属、クラドスポリウム属、アオカビ属、白色腐朽担子菌などの糸状菌が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＩ．標的配列の同定
本発明は、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成させるためのヌクレオチド配列を含む核酸を同定、得るするための方法を提供する。例えば、該方法は以下を含む：（ａ）標的害虫からのヌクレオチド核酸またはその相同体の全体または一部を含むハイブリダイゼーションプローブでｃＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを調べること；（ｂ）ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；（ｃ）ステップ（ｂ）で同定したＤＮＡクローンを単離すること；および（ｄ）ステップ（ｃ）で単離したクローンを含むｃＤＮＡまたはＤＮＡ断片の配列を決定すること（配列決定した核酸分子は、ＲＮＡ核酸配列またはその相同体の全体または実質的な部分を転写する）。
さらに、本発明では、以下を含むｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの実質的な部分を産生するヌクレオチド配列を含む核酸断片を得る方法を意図している：（ａ）標的害虫のヌクレオチド配列の１つの一部に対応する第１、２オリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；および（ｂ）ステップ（ａ）の第１、２オリゴヌクレオチドプライマーを使用したクローニングベクター内でのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型を増幅すること（増幅させた核酸分子は、本発明のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの実質的な部分を転写する）。
本発明の実施時、標的遺伝子は別の生物に損傷を与える任意の害虫に由来できる。いくつかの基準が、好ましい標的遺伝子の選択に使用できる。該遺伝子は、ｄｓＲＮＡ阻害がタンパク質濃度の急速な低下を招くように、タンパク質産物の回転率が速い、遺伝子である。ある実施態様では、発現レベルのわずかな低下が受体害虫に有害な作用をもたらす、遺伝子を選択することが有利である。広範な昆虫種を標的とすることが望ましい場合、例えば、これらの種にわたって高度に保存された遺伝子を選択する。逆に、特異性を付与するために、本発明のある実施態様では、個々の昆虫種間、または昆虫と他の生物との間で保存度の低い部位を含む遺伝子を選択する。ある実施態様では、他の生体に周知されていない相同体を有する遺伝子を選択することが望まれることもある。
本明細書において「由来する」とは、特定の材料または種に必ずしも直接由来しないが、とりわけ特定の材料または種から得ることができる特定のヌクレオチド配列を指す。
一実施態様では、昆虫の腸内で発現する遺伝子を選択する。腸内で発現する遺伝子を標的にすることで、ｄｓＲＮＡが昆虫内で散在する必要性がなくなる。本発明で使用する標的遺伝子には、例えば、原形質膜のプロトンＶ−ＡＴＰａｓｅのタンパク質成分をコードする既知の腸内発現遺伝子のヌクレオチド配列と実質的な相同性を有する遺伝子を挙げることができる（Ｄｏｗら、１９９７，；Ｄｏｗ，１９９９）。このタンパク質複合体は、上皮性イオン輸送の唯一のエナジャイザーであり、中腸内腔のアルカリ化に関与する。哺乳動物の腎臓器官と同様に体液平衡および異物の解毒において作用する昆虫後腸のこぶであるマルピーギ管でもＶ−ＡＴＰａｓｅは発現する。
別の実施態様では、実質的に昆虫の成長、発生、生殖に関与する遺伝子を選択する。例示的な遺伝子として、例えば、リボソームタンパク質の構造サブユニット、β−ｃｏａｔａｍｅｒ遺伝子、ＣＨＤ３遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓ４（ＲｐＳ４）およびＳ９（ＲｐＳ９）などのリボゾームタンパク質は、タンパク質合成に関与する構造成分であり、細胞質のリボソーム小サブユニットの成分である。Ｌ９およびＬ１９などのリボゾームタンパク質は、タンパク質合成に関与する構造成分であり、リボソームに局在する。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のβ−ｃｏａｔａｍｅｒ遺伝子は、膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする。類似配列が、シロイヌナズナ、キイロショウジョウバエ、出芽酵母などの多様な生物において見いだされている。関連配列が、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓなどの多様な生物において認められる。本発明で使用する他の標的遺伝子として、例えば、生育力、成長、発生、生殖、感染能において重要な役割を果たす遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子には、例えば、線虫やショウジョウバエのハウスキーピング遺伝子、転写因子、昆虫特異的な遺伝子、致死的ノックアウト変異が挙げられる。本発明で使用する標的遺伝子として、他の生物由来の遺伝子でもよい（例、ネコブセンチュウまたはダイズシスト線虫）、他の昆虫または蛛形類（例、コロラドハムシ、ダイコンハムシ、ホシテントウ、ハナゾウムシ、コクヌストモドキ、アブラムシ、トビイロウンカ、メイガ、コナガ、コオロギ）。また、本発明において標的配列として使用されるヌクレオチド配列は、文献からその機能が明確であり、また昆虫のゲノムの標的遺伝子と実質的な類似性を有する、ウイルス、細菌、真菌、昆虫の遺伝子にも由来できる。
本発明による制御の標的となりうる多くの昆虫において、大半の遺伝子の配列または特定の遺伝子の変異に起因する表現型に関する情報は限られることがある。従って、線虫、ショウジョウバエ、他の一部の昆虫種などのモデル生物の対応する遺伝子に関して入手可能な情報に基づいて遺伝子を選択できる。遺伝子が特性付けされている、線虫や真菌類などの他の種に関して入手可能な情報に基づいて遺伝子を選択することもできる。場合によっては、遺伝子の名称や遺伝子配列を利用して、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを検索することで、標的昆虫から対応する遺伝子の配列を入手することは可能であろう。配列が得られれば、ＰＣＲを利用して、本発明で使用する昆虫の遺伝子の適切に選択した断片を増幅できる。
昆虫種の対応する遺伝子からＤＮＡ断片を得るために、例えば、Ｃ．エレガンスまたはショウジョウバエにおいて、または遺伝子が既にクローニングされている昆虫において認められる配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計できる。本発明で使用するために十分な長さのＤＮＡ断片を増幅させるようにプライマーを設計する。プライマーが標的配列と厳密に一致しない場合でも増幅が起るように増幅条件を選択する。または、既知の昆虫遺伝子をプローブに用いて、害虫種から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子または遺伝子の一部分をクローニングできる。ＰＣＲの実施方法およびライブラリーからのクローニングの技術は周知である。昆虫種から過去にクローニングされた配列に基づいて、標的害虫種からＤＮＡ断片を単離する工程に関する詳細を実施例に示している。他の種から過去に単離された遺伝子と対応する遺伝子断片を害虫種から単離するために様々な方法が利用できることを当業者であれば理解するであろう。
ＩＩＩ．標的遺伝子の阻害／抑制方法
本発明は、安定化ｄｓＲＮＡ法を使用した標的害虫における１つ以上の標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本発明は、真核生物の遺伝子発現の調節、特に消化器系が約４．５〜９．５、より好ましくは約５．０〜８．０、更に好ましくは約６．５〜７．５のｐＨレベルを示す害虫に存在する遺伝子の発現調節に特に有用である。これらの範囲外のｐＨを示す消化器系を有する害虫では、ｄｓＲＮＡ分子の摂取を必要としない使用法での送達方法が望ましい。
本発明の方法には、複数の標的遺伝子をダウンレギュレーションするまたは阻害する、または単一の標的遺伝子をより強力に阻害するために、同じ昆虫への２以上の二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡコンストラクトの同時／連続供給が含まれる。
または、複数の標的配列を攻撃する１つの二本鎖ＲＮＡの供給により複数の標的を攻撃する、また標的遺伝子に対応する１コピー以上の二本鎖ＲＮＡ断片の存在によって単一標的を効果的に阻害する。このように、本発明の一実施態様では、二本鎖ＲＮＡコンストラクトが複数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも一方の鎖が昆虫の標的遺伝子の標的ヌクレオチドの少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。本発明によると、ＲＮＡコンストラクトのｄｓＲＮＡ部位は同じ標的遺伝子、または異なる標的遺伝子に相補的であり、および／もしくはｄｓＲＮＡ部位は同じ昆虫種、または異なる昆虫種の標的に相補的でありうる。植物宿主細胞における該ｄｓＲＮＡコンストラクトの使用によって、植物において単一または複数の昆虫種に対する耐性がより強力となる。一実施態様では、二本鎖ＲＮＡ部位には標的遺伝子と相補的な複数コピーのヌクレオチド配列が含まれる。または、ｄｓＲＮＡは同じ標的遺伝子の２つ以上の標的配列を攻撃する。このように、本発明では、昆虫の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的な前記ヌクレオチド配列を少なくとも２コピー含む単離した二本鎖ＲＮＡコンストラクトを含む。上記の２つ以上の標的を攻撃するｄｓＲＮＡ、または上記の標的の異なる部位に対する異なるｄｓＲＮＡの組み合わせを開発して、本発明の方法に使用する。適切なｄｓＲＮＡヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡコンストラクトは、ＷＯ第２００６／０４６１４８号に記載しており、その全体は本明細書に援用される。
「攻撃（ｈｉｔ，ｈｉｔｓ，ｈｉｔｔｉｎｇ）」という用語は、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が標的遺伝子またはヌクレオチド配列と相補的であり、およびそのため標的遺伝子またはヌクレオチド配列に結合できること示す代用表現である。
ｄｓＲＮＡの調節作用は、例えば、ハウスキーピング遺伝子、転写因子などの細胞代謝や細胞形質転換に関与する内因性遺伝子、および細胞代謝に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子など、該害虫において発現している様々な遺伝子に適用できる。
本明細書で用いる「遺伝子発現の阻害」または「害虫の細胞内における標的遺伝子の発現阻害」とは、該標的遺伝子のタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物が存在しない（または減少が認められる）ことを指す。「特異性」とは、細胞の他の遺伝子に明らかな作用を及ぼすことなく、またｄｓＲＮＡ分子を産生する、細胞内の任意の遺伝子に影響を及ぼすことなく、該標的遺伝子を阻害できることを指す。該害虫内での該標的遺伝子の発現阻害によって、該害虫に新しい表現型がもたらすことができる。
「遺伝子抑制」とは、ｍＲＮＡへの遺伝子転写、および／またはそれに続くｍＲＮＡの翻訳のレベルを低下させるための周知の方法のいずれをも指す。遺伝子抑制は、転写後の遺伝子発現および転写抑制など、遺伝子またはコード配列からのタンパク質発現の低下を意味することも意図している。転写後の遺伝子抑制は、抑制の標的となる遺伝子またはコード配列から転写されるｍＲＮＡの全体または一部と、抑制に使用する対応する二本鎖ＲＮＡとの相同性を介しており、細胞においてリボソームの結合に利用可能なｍＲＮＡ量の実質的かつ測定可能な低下を指す。転写ＲＮＡは、いわゆる共抑制に作用するセンス方向、いわゆるアンチセンス抑制に作用するアンチセンス方向、もしくはいわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に作用するｄｓＲＮＡ産生の両方向にできる。
転写抑制は、プロモーターＤＮＡ配列またはその相補配列と実質的な配列同一性を示すｄｓＲＮＡ遺伝子抑制剤の細胞内での存在を介しており、プロモーター・トランス・サプレッションと呼ばれる作用を及ぼす。遺伝子抑制は、任意の特性に関連する野生型の宿主遺伝子に対して効果的である（例、野生型遺伝子のコードするタンパク質レベル、または影響を受ける代謝産物レベルの低下した宿主の提供）。遺伝子抑制は、害虫の細胞の１つ以上の相同配列または相補配列の発現を阻害あるいは抑制するように特別に設計した、遺伝子抑制剤を含む物質を摂取あるいは接触できる害虫内の標的遺伝子に対しても効果を発揮できる。
宿主内での転写後の遺伝子抑制に関する有益な方法では、安定化させたセンス方向およびアンチセンス方向の転写ＲＮＡのいずれも利用する（例、ヘアピン・ステム・ループ構造）。転写後の遺伝子抑制に効果を及ぼす好ましいＤＮＡコンストラクトは、抑制の標的となる遺伝子の断片と実質的な同一性を示す、アンチセンス方向を示すＲＮＡを第１断片がコードしており、第１断片は第１断片と実質的な相補性を示すＲＮＡをコードするセンス方向の第２断片に連結している、ＤＮＡコンストラクトである。該コンストラクトは、第１断片と第２断片とのハイブリダイゼーションによってステム・アンド・ループ構造を、および２つの断片を連結するヌクレオチド配列からループ構造を、形成する（ＷＯ９４／０１５５０号、ＷＯ９８／０５７７０号、米国特許第２００２／００４８８１４号、米国特許第２００３／００１８９９３号を参照）。
本発明の一実施態様によると、害虫のゲノム内においてヌクレオチド配列によってコードされるＲＮＡ配列を含む、害虫内での標的遺伝子のＲＮＡ分子と実質的に相同な安定化ＲＮＡ配列の転写をインビトロ発現によってもたらすヌクレオチド配列を提供する。このように、該害虫が安定化ＲＮＡ配列を摂取後、またはそうでなければ該ｄｓＲＮＡにさらされた後、標的害虫の細胞内において標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列がダウンレギュレーションを受ける。
本発明の安定化ｄｓＲＮＡ技術を利用した標的遺伝子の阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列を遺伝子抑制の標的としている点で配列特異的である。抑制には、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡが好ましい。標的配列と比較して、挿入、欠失、点突然変異を有するＲＮＡ配列が抑制に効果的であることも見出されている。本発明の実施において、抑制性ｄｓＲＮＡおよび標的遺伝子の一部が、少なくとも約８０％以上、または約８５％以上、または約９０％以上、または約９５％以上、または約９９％以上、更には約１００％の配列同一性を有することが好ましい。または、ＲＮＡの二本鎖部位は、機能上、標的遺伝子の転写産物の一部分とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列と定義できる。相同性のより高い、完全長に満たない配列は、より長い、相同性の低い配列を補う。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または少なくとも約１０００塩基でありうる。通常、２０〜１００ヌクレオチド以上の配列を使用する必要があるが、約２００〜３００ヌクレオチド以上の配列が好ましく、また標的遺伝子の大きさに応じて、約５００〜１０００ヌクレオチド以上の配列が特に好ましい。本発明には、遺伝子突然変異、株による多型性、または進化的分岐のために予測されうる配列変化を許容できる利点がある。導入する核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングを受けたｍＲＮＡと比較して、完全に相同である必要はなく、また完全長である必要もない。従って、本明細書に開示する通り、本発明を実施するために、ＲＮＡと標的遺伝子との１００％の配列同一性は要求されないことを当業者であれば理解する必要がある。
ＩＶ．ｄｓＲＮＡの調製方法
ｄｓＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロのいずれかで合成できる。１つの自己−相補ＲＮＡ鎖、または２つの相補ＲＮＡ鎖からｄｓＲＮＡは形成できる。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、インビボでの転写を媒介でき、クローン化ＲＮＡポリメラーゼをインビボ／インビトロ転写に使用できる。阻害は器官、組織、または細胞型内で特異的転写、環境条件という刺激（例、感染、ストレス、温度、化学誘発物質）、および／もしくは発生段階または発生時期での工学転写、の標的とされうる。ＲＮＡ鎖はポリアデニル化を受ける場合、受けない場合があり、細胞の翻訳装置によってポリペプチドに翻訳できる場合、できない場合がある。
本発明のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、あるいはｍｉＲＮＡは、マニュアル反応または自動化反応、もしくは別の生物内でのインビボにおいて、当業者が化学的または酵素的に産生できる。ＲＮＡは部分的または全体を有機合成によって産生することも可能であり、インビトロでの酵素合成または有機合成によって任意の修飾リボヌクレオチドを導入できる。ＲＮＡは細胞のＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）によって合成できる。発現コンストラクトの使用法および産生は当業者には周知である（例、ＷＯ９７／３２０１６号、米国特許第５，５９３、８７４、５，６９８，４２５、５，７１２，１３５、５，７８９，２１４、５，８０４，６９３号参照）。化学合成またはインビトロで酵素合成する場合、細胞内への導入前にＲＮＡを精製できる。例えば、溶剤または樹脂、沈殿物、電気泳動法、クロマトグラフ法、またはこれらの併用での抽出によって混合物からＲＮＡを精製できる。または、サンプル処理による損失を避けるために、未精製、または精製を最低限にしたＲＮＡを使用できる。ＲＮＡは、保存のために乾燥させるか、水溶液に溶解できる。溶液は、二重鎖アニーリングおよび／または安定化を促進させるために緩衝剤や塩を含むことができる。
Ｖ．ポリヌクレオチド配列
本発明によってヌクレオチド配列を提供する場合、その発現は、害虫のゲノム内においてヌクレオチド配列がコードするＲＮＡ配列を含む、該害虫標的遺伝子のＲＮＡ分子と実質的に相同なＲＮＡ配列をもたらす。このように、ｄｓＲＮＡ配列の摂取後、該害虫の細胞内において該標的遺伝子のヌクレオチド配列がダウンレギュレートされて、該害虫の維持、生存、増殖、生殖、侵入に有害な影響を招くことがありうる。
本明細書に記載の各「核酸配列」は、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔと略す）の配列として示す。一方、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチド配列、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチドの対応する配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）（ここでは特定のデオキシヌクレオチド配列内の各チミジン・デオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドであるウリジン（Ｕ）で置換される）を指す。
本明細書で用いる「核酸」とは、５’から３’末端まで読み取られる、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。核酸は、ポリメラーゼにより正確な読み取り可能であり、その核酸がコードするポリペプチドの発現を低下させない、人工または改変ヌクレオチド塩基を任意に含むこともできる。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、個々の単一鎖または二本鎖の核酸のセンスおよびアンチセンス鎖を指す。
「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語には、ＲＮＡｉ（抑制性ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ；対応するアシル化アミノ酸の荷電状態を問わない）、ｃＲＮＡ（相補ＲＮＡ）が含まれ、そして「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが含まれる。
「核酸断片」、「ヌクレオチド配列断片」、あるいはより一般的には「断片」という用語は、ゲノム配列、リボソームＲＮＡ配列、トランスファーＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、オペロン配列、およびタンパク質、ポリペプチド、ペプチドを発現する、またはこれらの発現に適した改変低分子ヌクレオチド配列を含む機能上の用語と当業者には理解される。
従って、本発明は、以下の配列番号のポリヌクレオチド配列のいずれかから成るグループから選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子に関する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３‐８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０‐２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。本発明は、以下の配列番号のポリヌクレオチド配列の機能的断片も提供する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１‐１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。本発明は、更に、以下の配列番号のポリヌクレオチド配列のいずれかとハイブリダイズする少なくとも１５個の連続塩基を含む核酸の他（１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３‐８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１）、以下の配列番号のポリヌクレオチド配列のいずれかと相補的な核酸、またはその断片を提供する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９‐１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。
本発明では、以下の本発明の配列番号のポリヌクレオチド配列のオーソロガス配列、ならびにその相補配列および断片も提供する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。従って、本発明は、以下の配列番号のいずれかで示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の昆虫オルソローグである標的遺伝子を含む：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。一例として、昆虫オルソローグは、配列番号：４９‐１２３、２７５〜４３４、５３３〜５６２、６２１〜７３８、８１３〜８５２、９０８〜１０１０、１１６１〜１４３７、１７３０〜１９８７、２１２０‐２２９０、２３８４〜２４３８のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはこれらの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個のヌクレオチドの断片を含むことができる。限定されないが、昆虫またはクモ類のオルソローグ遺伝子、または本発明の配列の１つの少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１７個の断片を含む配列を表(Table)４に記載している。
本発明は、以下の本発明の配列番号のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の線虫オルソローグである標的遺伝子も含む：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３‐５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。一例として、線虫オルソローグは、本発明の配列番号：１２４〜１３５、４３５〜４４６、５６３、５６４、７３９〜７５１、８５３、８５４、１０１１〜１０２５、１４３８〜１４７３、１９８８〜２００１、２２９１〜２２９８、２４３９〜２４４０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはこれらの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個のヌクレオチドを含むことができる。別の態様によると、このように本発明は、本明細書に記載している、線虫細胞と二本鎖ＲＮＡとの接触を含む、生物における線虫の増殖抑制方法、または線虫感染に感受性のある生物における線虫侵入の予防方法を含み、ここで二本鎖ＲＮＡはアニーリングした相補鎖を含んでおり、この内の１つは以下の配列番号で表される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個のヌクレオチド断片を含む、標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を有しており、これによって二本鎖ＲＮＡが真菌に取り込まれることで、増殖は抑制されて、侵入は予防される：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０‐２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。本発明は、以下の配列番号で示される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個のヌクレオチド断片を含む、線虫耐性トランスジェニック植物にも関する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９‐１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。限定されないが、本発明の配列の１つの少なくとも１５ｂｐ、好ましくは少なくとも１７ｂｐの断片を含む線虫のオルソローグ遺伝子または配列を表(Table)５に記載している。
別の実施態様では、本発明は、以下の本発明の配列番号で示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の真菌オルソローグである標的遺伝子を含む：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９‐１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。一例として、真菌オルソローグは、配列番号：１３６〜１５８、４４７〜４７２、５６５〜５７５、７５２〜７６７、８５５〜８６２、１０２６〜１０４０、１４７４〜１５７１、２００２〜２０３９、２２９９〜２３３８、２４４１〜２４６０のいずれかに示すヌクレオチド配列、またはこれらの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個のヌクレオチド断片を含むことができる。別の態様によると、このように本発明は、本明細書に記載している、真菌細胞と二本鎖ＲＮＡとの接触を含む、細胞または生物体における真菌の増殖抑制方法、または真菌感染に感受性のある細胞または生物体における真菌侵入の予防方法を含み、ここで二本鎖ＲＮＡはアニーリングした相補鎖を含んでおり、この内の１つは以下の配列番号で示される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個のヌクレオチド断片を含む、標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を有しており、これによって二本鎖ＲＮＡが真菌に取り込まれることで、増殖は抑制されて、侵入は予防される：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。本発明は、以下の配列番号で示される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個のヌクレオチド断片を含む、真菌耐性トランスジェニック植物にも関する：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。限定されないが、本発明の配列の１つの少なくとも１５ｂｐ、好ましくは少なくとも１７ｂｐの断片を含む真菌のオルソローグ遺伝子または配列を表(Table)６に記載している。
別の実施態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、以下の配列番号のいずれかを含むが（１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１）、以下の配列番号で示される配列に限定されない：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、害虫種の連続する任意の標的遺伝子を含むことができる（例、約１５〜２５以上、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の連続ヌクレオチド）。
「単離した」核酸とは、自然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。例えば、ＤＮＡコンストラクトに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離していると考える。単離ＤＮＡ分子の別の例として、異種宿主内に保持される組み換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的に、または実質的に）精製したＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明による単離核酸分子として、更に、合成的に生成した分子が挙げられる。
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、または、例えば、クローニングによって得た、もしくは合成的に生成したｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどのＤＮＡの形であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二重鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡはコーディング鎖（別名、センス鎖）であるか、もしくは非コーディング鎖（別名、アンチセンス鎖）であり得る。
ＩＶ．配列分析
特記ある場合を除き、本明細書において配列決定したＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（Model373、Applied Biosystems, Inc.）を使用して決定した。従って、この自動化アプローチによって決定したＤＮＡ配列に関して該技術分野で周知の通り、本明細書で決定した任意のヌクレオチド配列にはいくつかのエラーが含まれうる。自動決定したヌクレオチド配列は、配列決定したＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と、通常、少なくとも約９５％、より多くは、少なくとも約９６〜９９．９％同一である。該技術分野において周知のマニュアルＤＮＡシークエンシング法などの他のアプローチによって実際の配列をより正確に決定できる。同様に該技術分野において周知の通り、実際の配列との比較で、決定したヌクレオチド配列における１個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを起こし、決定したヌクレオチド配列がコードする予測アミノ酸配列は、配列決定したＤＮＡ分子が実際にコードするアミノ酸配列とは全く異なり、これらの挿入点または欠失点から開始しうる。
別の態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子の一部のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約３０個のヌクレオチド、更に好ましくは３０個以上の基準ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。基準断片にハイブリダイズするこれらの断片は、診断用プローブ／プライマーとして有用である。本発明の目的で、ハイブリダイゼーション溶液（６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘデンハート液、１００μｇ非特異的キャリアーＤＮＡ）中で二本鎖複合体を形成する場合に２つの配列はハイブリダイズする。Ausubelら、section 2.9, supplement 27 (1994)参照。配列は「中程度のストリンジェンシー」でハイブリダイズ可能であり、これはハイブリダイゼーション溶液（６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘデンハート液、１００μｇ非特異的キャリアーＤＮＡ）中、温度６０℃と定義される。「高いストリンジェンシー」でのハイブリダイゼーションでは、温度を６８℃に上げる。中程度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション反応後、ヌクレオチドを室温の洗浄液（２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ）で５回、続いて６０℃の洗浄液（０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で１時間洗う。「高いストリンジェンシー」では、洗浄温度を６８℃に上げる。本発明の目的では、ハイブリダイズしたヌクレオチドは、比放射能が１０，０００ｃｐｍ／ｎｇの放射線標識プローブ１ｎｇを使用して検出されるヌクレオチドであり、ここでハイブリダイズしたヌクレオチドは−７０℃、７２時間以内のＸ線フィルムに暴露後にはっきりと見ることができる。
本願は、以下の配列番号のいずれかで示される核酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％同一な核酸分子を対象としている：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。一方、好ましくは、以下の配列番号で示される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％同一な核酸分子である：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。核酸配列の差は、基準ヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置、またはこれらの末端位置のいずれかの場所に生じ、基準配列内の個々のヌクレオチド間または基準配列内の１つ以上の連続群内に散在している。
実際的な問題として、任意の特定の核酸分子が、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか否かは、当業者には周知の基準アルゴリズムを利用した２分子間での比較を指し、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムなどの公的に利用可能なコンピュータープログラムを使用して、従来どおりに判断できる。 Altschulら、Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (1997)参照。
本発明の一実施態様では、核酸は、約１５〜３０個（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個）のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は細胞周期または相同組み換えを制御するタンパク質をコードするＲＮＡ配列またはその一部と相補的であり、前記ｓｉＲＮＡは更に約１５〜３０個（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個）のヌクレオチドを有するセンス鎖を含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、各鎖の少なくとも約１５ヌクレオチドが他の鎖と相補的な異なるヌクレオチド配列である。
一実施態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシングを媒介する二本鎖核酸分子を提供する。別の一実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は約１５〜３０個（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個）のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間に約１５〜３０個の塩基対を含む二本鎖核酸分子からなる。更に別の一実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡは、約１〜３２個（例、約１、２、３個）のヌクレオチドのオーバーハング末端を有する二本鎖核酸分子、例えば、約１９個の塩基対および３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチドのオーバーハングを有する約２１個のヌクレオチド二本鎖、を含む。更に別の一実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸分子を含み、ここで両末端は平滑、もしくは末端の一方は平滑である。
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ媒介能を保持したままで修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、安定性、活性、および／または生物学的利用能などのインビトロまたはインビボでの特性を改善するために使用できる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に存在しているヌクレオチドの総数の割合で修飾ヌクレオチドを含むことができる。該ものとして、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、一般に、約５〜１００％の修飾ヌクレオチド（例、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。任意のｓｉＲＮＡ分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は、ｓｉＲＮＡに存在するヌクレオチドの総数に左右される。ｓｉＲＮＡが一本鎖の場合、ｓｉＲＮＡ分子に存在するヌクレオチドの総数に基づいて割合を修正できる。同様に、ｓｉＲＮＡ分子が二本鎖の場合、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス／アンチセンス鎖に存在するヌクレオチドの総数に基づいて割合を修正できる。
ＶＩＩ．核酸コンストラクト
組み換え核酸ベクターは、例えば、線状または閉環状プラスミドであり得る。ベクター系は、細菌宿主のゲノム内に導入する全核酸を一緒に含んでいる、単一のベクターまたはプラスミド、もしくは２以上のベクターまたはプラスミドでありうる。また、細菌ベクターは発現ベクターでありうる。以下の配列番号に記載の核酸分子、またはこれらの断片は、例えば、連結したコード配列または他のＤＮＡ配列の発現を促進させるために、１つ以上の微生物宿主内において機能する適切なプロモーターの制御下でベクター内に適当に挿入できる：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４６、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１２、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７０、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、および２４８１。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、適切なベクターの選択は主にベクターに挿入する核酸の大きさ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に左右される。各ベクターには、その機能（ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現）およびベクターが適合する特定の宿主細胞に応じた様々な要素が含まれる。細菌の形質転換のためのベクター成分には、限定されないが、一般に、以下の１つ以上が含まれる：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子、外来ＤＮＡの発現を可能にする誘導プロモーター。
プロモーター
調節配列および構造ヌクレオチド配列に関連して使用する「機能的に連結した」とは、調節配列が連結している構造ヌクレオチド配列の発現を調節することを意味する。「調節配列」または「制御要素」とは、構造ヌクレオチド配列の上流（５’非コード配列）、内部、下流（３’非翻訳配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、転写の時期およびレベルまたは量、ＲＮＡの処理または安定性、関連する構造ヌクレオチド配列の翻訳、に影響を及ぼす。調節配列としては、プロモーター、翻訳のリーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、ポリアデニル化認識配列などを挙げることができる。
ｍＲＮＡ産生用の発現ベクターには、宿主細菌が認識する誘導プロモーターも含まれ、例えば、Ｄ． ｖ． ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｍＲＮＡまたは目的とするその断片をコードする核酸分子をコードする核酸と機能的に連結している。細菌宿主との使用に適した誘導プロモーターとして、βラクタマーゼ・プロモーター、大腸菌λファージＰＬおよびＰＲプロモーター、および大腸菌ガラクトース・プロモーター、アラビノース・プロモーター、アルカリフォスファターゼ・プロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース・オペロン・プロモーター、およびこれらの変異体、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッド・プロモーターが挙げられる。一方で、他の周知の細菌誘導プロモーターが適している。
具体的な実施態様では、薬剤が有効な昆虫の範囲を広げるために、遺伝子は異なる昆虫に由来できる。抑制、または発現と抑制の組み合わせのために複数の遺伝子を標的とする場合、米国特許出願公開第２００４−００２９２８３号に図示・開示する通りにポリシストロニックＤＮＡ成分を製造できる。
選択マーカー遺伝子
本発明の組み換えＤＮＡベクターまたはコンストラクトには、一般に、形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーが含まれる。選択マーカーは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性核酸を含む細胞の選択にも使用できる。マーカーは、抗生物質耐性（例、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど）などのバイオサイド耐性をコードしうる。選択マーカーの例として、カナマイシン耐性をコードしており、カナマイシン、Ｇ４１８などを使用して選択可能な、ｎｅｏ遺伝子、ビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子、ブロモキシニル耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。該選択マーカーの例が、米国特許第５，５５０，３１８号、第５，６３３，４３５号、第５，７８０，７０８号、第６，１１８，０４７号に説明している。
本発明の組み換えベクターまたはコンストラクトには、スクリーニング用マーカーも含まれうる。スクリーニング用マーカーを使用して、発現をモニターできる。代表的なスクリーニング用マーカーとしては、様々な色素生成基質が知られている酵素をコードするαグルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson, 1987; Jeffersonら、1987）、様々な色素生成基質が知られている酵素（例、ＰＡＤＡＣ、色素生成セファロスポリン）をコードする遺伝子であるαラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffeら、1978）、ルシフェラーゼ遺伝子（Owら、1986）、色素生成カテコールを変換可能なカテコール・ジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowskyら、1983）、αアミラーゼ遺伝子（Ikatuら、1990）、チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノン（続いてメラニンに凝固する）に酸化できる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katzら、1983）、色素生成αガラクトース基質に触媒作用を及ぼすαガラクトシダーゼが挙げられる。
該技術分野で利用可能な方法によって容易に形質転換ベクターを調製できる。形質転換ベクターは、ＲＮＡ分子に転写可能であり、昆虫ゲノムによってコードされる１つ以上のヌクレオチド配列と実質的に相同および／または相補的な、１つ以上のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡの取り込み時に、害虫ゲノムの各ヌクレオチド配列の少なくとも１つの発現をダウンレギュレートさせる。
ＶＩＩＩ．遺伝子操作法
本発明では、生物にヌクレオチド配列を導入し、害虫において１つ以上のｄｓＲＮＡ分子の阻害発現レベルを達成することを意図している。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、該技術分野において周知である、標的宿主細胞内に組み換え配列を導入する標準手段によって、細菌性細胞または酵母細胞などの宿主細胞に導入できる。該手段としては、限定されないが、形質移入、感染、形質転換、自然取り込み、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション微粒子銃、微生物を介した形質転換プロトコルが挙げられる。宿主生物に応じて様々な方法を選択する。
本発明のトランスジェニック生物は、ゲノム内に外来核酸が安定的に挿入された少なくとも１つの細胞を含む生物である。このように、トランスジェニック生物は、その構造の一部に遺伝子組み換え細胞のみを含むことができる。
従って、本発明には、本明細書に記載のヌクレオチド配列または組み換えＤＮＡコンストラクトのいずれかを含むトランスジェニック細胞または生物体も含まれる。本発明には、原核細胞（限定されないが、グラム陽性細菌性細胞およびグラム陰性細菌性細胞など）および真核細胞（限定されないが、酵母細胞又は植物細胞など）が更に含まれる。
例えば、本発明では、乳酸桿菌などの細菌内に標的遺伝子を導入することを意図している。核酸コンストラクトは、組込み型ベクターと共に細菌ゲノム内に組み入れることが可能である。通常、組込み型ベクターは、ベクターの組込みを可能にする細菌染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組込みは、ベクター内の相同なＤＮＡと細菌染色体との組み換えに起因すると考えられる。例えば、様々な桿菌株由来のＤＮＡで作製した組込み型ベクターは、桿菌属の染色体に組み入れる（欧州特許第０１２７，３２８号）。組込み型ベクターは、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から成り得る。自殺ベクターも該技術分野において周知である。
上記の１つ以上の成分を含む適切なベクターの構築では、標準的な組み換えＤＮＡ技術が利用される。単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、必要なプラスミドの作製に望ましい形に、切断、構成、再結合させる。利用可能な細菌発現ベクターの例としては、限定されないが、BluescriptTM（商標）(Stratagene、カリフォルニア州ラ・ホーヤ)などの多機能性大腸菌クローニング／発現ベクターが挙げられ、これには、例えば、Ｄ．ｖ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａタンパク質またはその断片を、アミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７個のβガラクトシダーゼの残基の配列と一緒にベクター内にインフレームで連結して、ハイブリッド・タンパク質を産生できる；ｐＩＮベクター（Van Heeke and Schuster, 1989）など。
本発明では酵母細胞内への標的遺伝子の導入についても意図している。通常、酵母の組み換えコンストラクトには以下の１つ以上が含まれる：プロモーター配列、融合パートナー配列、リーダー配列、転写終結配列、選択可能なマーカー。これらのエレメントは発現カセット内で連結することができ、酵母や細菌などの宿主内において安定に保持可能な染色体外エレメント（例、プラスミド）といったレプリコン内に発現カセットを保持できる。レプリコンには２つの複製系があり、これらによって、例えば、酵母内での発現および原核生物の宿主内でのクローニングや増幅が可能になる。該酵母‐細菌シャトルベクターの例として、ＹＥｐ２４（Botstein ら、1979）、ｐＣｌ／１（Brake ら、1984）、ＹＲｐ１７（Stinchcomb ら、1982）が挙げられる。また、レプリコンは高コピー数、低コピー数のいずれかのプラスミドでありうる。高コピー・プラスミドのコピー数は、一般に約５〜２００個、通常は約１０〜１５０個である。高コピー・プラスミドを含む宿主は、好ましくは約１０個、より好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを有する。
有用な酵母プロモーター配列は、代謝経路の酵素をコードする遺伝子から得ることができる。該遺伝子の例として、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）（欧州特許第０２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許第０３２１５４４７号）が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子は、有用なプロモーター配列も提供する（Myanohara ら、1983）。また、自然発生しない合成プロモーターが酵母プロモーターの役割を果たす。該ハイブリッド・プロモーターの例として、ＧＡＰ転写活性化部位に連結するＡＤＨ調節配列が挙げられる（米国特許第４，８７６，１９７、４，８８０，７３４号）。糖分解酵素をコードする配列など、転写ターミネーター配列および他の酵母が認識する終結配列の例は、当業者には周知である。
または、発現コンストラクトは、組込み型ベクターを伴う酵母ゲノム内に組み入れることができる。組込み型ベクターは、通常、ベクターの組込みを可能にする酵母染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、好ましくは、発現コンストラクトに隣接する２つの相同配列を含む。組込みは、ベクター内の相同ＤＮＡと酵母染色体の間での組み換えに起因すると考えられる（Orr-Weaver ら、1983）。組込み型ベクターは、ベクター内での融合のための適切な相同配列を選択することにより、特定部位に向けることができる。Orr-Weaverら、上記参照。１つ以上の発現コンストラクトが組み入れて、組み換えタンパク質の産生量に影響を及ぼす可能性がある（Rine ら、1983）。
ＩＸ．標的遺伝子の発現阻害の定量化
標的遺伝子の発現阻害は、内因性ＲＮＡまたは標的ＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質のいずれかによって定量可能であり、阻害の結果は、細胞または生物の表面上の特性を検証することで確認できる。ＲＮＡおよびタンパク質の定量方法は当業者には周知である。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニュール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレザト、フォスフィノスリシン、プロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、テトラサイクリンなどに対する耐性を付与する複数の選択可能なマーカーを利用できる。
ある実施態様では、遺伝子発現は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも５０％、更に好ましくは少なくとも８０％阻害される。本発明の特に好ましい実施態様では、害虫の細胞内において遺伝子発現は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、または少なくとも９９％阻害されて、有意な阻害が起る。有意な阻害とは、検出可能な表現型（例、幼虫の成長停止、麻痺、死亡など）、または阻害される標的遺伝子に対応するＲＮＡおよび／またはタンパク質の検出可能な低下、をもたらす十分な阻害を指す。本発明のある実施態様では、実質的に全ての害虫の細胞において阻害が起り、他の好ましい実施態様では、遺伝子を発現する一部の細胞においてのみ阻害制は起る。例えば、標的遺伝子が昆虫の消化管内の細胞において重要な役割を果たす場合、これらの細胞内での遺伝子阻害は昆虫に有害作用を与えるのに十分である。
Ｘ．害虫をｄｓＲＮＡにさらすこと
ｄｓＲＮＡを害虫に投与可能な適切な任意の方法で、害虫をｄｓＲＮＡにさらすことができる。例えば、ｄｓＲＮＡを含む水溶液など、純粋または実質的に純粋な状態のｄｓＲＮＡを害虫に接触させることができる。一実施態様では、ｄｓＲＮＡを含む水溶液を昆虫に単に「浸す」または「噴霧する」ことができる。または、ｄｓＲＮＡを含む溶液を害虫に「噴霧する」ことができる。
または、昆虫によるｄｓＲＮＡの取り込みを増加させるために、哺乳動物の病原性害虫の食物成分といった害虫の食物成分にｄｓＲＮＡは結合できる。害虫による摂取によって害虫抑制剤の害虫への送達が可能となり、宿主内での標的遺伝子のダウンレギュレーションが起る。経口投与方法として、例えば、食物として使用する種がｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現するように改変し、それから標的害虫に給餌する工学的アプローチの他、害虫の食物とｄｓＲＮＡとを直接混合することが挙げられる。例えば、乳酸桿菌などの細菌は、標的配列で形質転換させて、害虫に与えることができる。一実施態様では、例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子は、昆虫の餌の中に取り込ませる、または昆虫の餌の上付加した状態にすることができる。
他の実施態様では、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を害虫に接触させることができる。該組成物には、ｄｓＲＮＡの他、さらに賦形剤、希釈剤、担体を含むことができる。
害虫が増殖あるいは感染する培地中にｄｓＲＮＡを取り込ませることもできる。例えば、害虫の侵入を阻害する方法として、食物容器または保護ラップ内にｄｓＲＮＡを取り込ませることができる。害虫の侵入を抑制するためｄｓＲＮＡを含む溶液で、例えば、木材を処理できる。
他の実施態様では、細菌または真菌細胞内においてｄｓＲＮＡを発現させて、細菌または真菌細胞は昆虫種によって取り込まれる、または食べられる。
実施例に示す通り、細菌を改変して、本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコンストラクトを産生できる。昆虫種はこれらの細菌を食べることができる。取り込まれた場合、ｄｓＲＮＡはＲＮＡｉ反応を開始でき、標的ｍＲＮＡを分解させ、および摂取した昆虫の衰弱または死を引き起こす。または、ｄｓＲＮＡ産生細菌あるいは酵母細胞を作物に直接噴霧できる。
一部の細菌は、Ｌｅｇｍｉｎｏｓｅａ（例、大豆）と共生的な根粒菌に限定されないが、それらのような宿主植物と非常に密接に相互作用する。該組み換え細菌を種子と混合させて（例、被覆剤）、土壌改良剤として使用できる。
昆虫に特異的に感染するバキュロウイルスなどのウイルスも使用できる。ウイルスは哺乳動物には感染しないため、望ましくないＲＮＡｉ作用は起らず、これによって哺乳動物、特にヒトにおける安全性が確保される。
可能な用途としては、大豆などのより広範な農作物の他、集約的な温室培養物、例えば、ＧＭＯの観点からそれほど重要ではない農作物が挙げられる。
このアプローチにはいくつかの利点があり、例えば：植物宿主によって分解される可能性の問題がないため、餌を与えられた害虫の腸管内腔内に大きなｄｓＲＮＡ断片を送達することが可能である；特にトランスジェニック変異体の入手が困難な特定の作物において、殺虫剤としての細菌の使用にはトランスジェニック作物の生成は含まれない；例えば、異なるｄｓＲＮＡを産生する異なる細菌の併用によって、同じ田畑で異なる作物を同時に処理できる点で、および／または異なる害虫を同時に標的にできる点で広範かつ柔軟な用途が存在する）。
ＸＩ．産物
本発明は、害虫抑制に使用するｄｓＲＮＡを包含できる多くの製品を提供する。例えば、本発明は、ヒトまたは動物に対する害虫病または感染症を治療または予防するための医薬的組成物または獣医的組成物を提供する。該組成物には、少なくとも１つのｄｓＲＮＡまたはＲＮＡコンストラクト、または該ｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列または組み換えＤＮＡコンストラクト、またはＲＮＡコンストラクト（ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、その相補鎖の一方が病気または感染症を起こす害虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する）、および医薬的用途に適した少なくとも１つの担体、賦形剤、あるいは希釈剤が含まれる。
または、動物やヒトの皮膚への適用といった、局所使用に適した組成物として、医薬的組成物または獣医的組成物を使用できる。例えば、滴剤、ゲル、エアゾル、乳剤、軟膏などとして皮膚に塗る液体組成物中でｄｓＲＮＡを使用できる。また、病気または疾患を治療／予防するために、経皮貼布や他の医療機器にｄｓＲＮＡを組み込むことができる。錠剤、カプセル剤、ペッサリー、経皮貼布、座薬などの他の従来の医薬剤形でも製造できる。剤形は、標的害虫の性質、ひいては治療対象となる病気の性質に基づいて選択する。
経口ワクチンは、例えば、本発明のコンストラクトおよび方法を利用して製造できる。例えば、細菌（例、乳酸桿菌）中でｄｓＲＮＡを生産することによってワクチンを作製でき、その細菌は食物中に含ませて、昆虫感染に対する経口ワクチンとして作用できる。従って、本発明は、治療および／または予防が必要な被験体に本発明に記載のいずれかの組成物を投与すること含む、害虫病または疾患を治療および／または予防するコンストラクトおよび方法を提供するものであり、前記組成物はアニールさせた相補鎖を含む、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡコンストラクトを含み、相補鎖の一方の鎖が、該病気または疾患を引き起こす害虫の標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を有する。
本発明の組成物は被験患者の病気や疾患の治療に使用可能であり、組成物および方法は害虫の侵入から基材や材料を保護する手段としても使用できる。組成物に含まれる賦形剤の性質や組成物の物理的形状は、治療対象となる基材の性質に依存して変化しうる。
例えば、該組成物は、基材を昆虫侵入から保護するための手段として基材に塗布できる被覆剤または粉剤であり、これによって基材や材質への害虫による損傷を防ぐ。従って、一実施態様では、該組成物は、適切な表面上での被覆剤という方式を取っており、被覆剤と接触する昆虫に付着して、最終的に摂取される。該組成物を使用して、害虫の侵入、または害虫が原因となる損傷を受けやすい基材や材質（例、食材や他の腐れやすい材質、および木材などの基材）を保護できる。
例えば、組成物は、処理する材質や基材にブラッシング、スプレー、または印刷される液体でありうる。このように、使用者は昆虫や基材に組成物を直接噴霧できる。
例えば、家と他の木材製品を、白アリ、ヒラタキクイムシ、オオアリは破壊することかできる。ｄｓＲＮＡを含む組成物で木材や家壁板を処理することで、害虫の侵入を減らすことができる可能性がある。同様に、ｄｓＲＮＡを含む組成物で木の幹を処理できる。
台所の食料庫内にある未保護の貯蔵穀物、穀類、ペットフード、粉末チョコレート、および他のほぼ全ては、コクヌストモドキ、コクゾウムシ、ノシメマダラメイガなどの害虫が常食としている。従って、本発明は、標的ｄｓＲＮＡを含む組成物で、穀物箱、他の食物貯蔵容器、および包装材料を処理するための手段を提供する。
イガの幼虫は、毛皮、絹、羊毛などの動物製品から作られた衣類を食べる。従って、ハンガー、クロゼット一式、衣装袋を本発明のｄｓＲＮＡで処理することが望まれうる。製本用デンプンのりを食べるため、コナチャタテとセイヨウシミは図書館の害虫である。従って、本発明は、害虫による侵入と破損に対する本処理用の組成物を提供する。
一実施態様では、該組成物は餌という形式を取っている。昆虫をおびき寄せて、該組成物と接触するように該餌を設計している。ここで接触した際、例えば摂食によって該昆虫内に組成物が取り込まれ、ＲＮＡｉを介して昆虫を殺す。餌は標的種によって決まる。誘引物質も使用できる。該誘引物質は、例えば、雄あるいは雌フェロモンなどのフェロモンであり得る。該誘引物質は昆虫を餌におびき寄せるように作用して、特定の昆虫を標的にするか、または全種の昆虫を引き付けることができる。該餌は、固形、ペースト、錠剤、粉末などの適切な形式であり得る。
該餌は昆虫によってコロニーに持ち帰らせることもできる。該餌はコロニーの他の昆虫の食料源としての役割を果たすことができるため、多数の昆虫、ひいては害虫コロニー全体を効果的に抑制できる可能性がある。害虫に及ぼすＲＮＡｉ媒介性の遅延作用によって該餌がコロニーに持ち帰られ、その結果、昆虫にさらされるという点で最大の効果がもたらされるため、これは二本鎖ＲＮＡまたは本発明のｄｓＲＮＡを発現する細菌の使用に関連する利点である。
適切な「ハウジング」または「わな」で餌を提供できる。該ハウジングとわなは市販されており、本発明の組成物を含むように既存のわなを適合できる。ハウジングやわなは例えば箱型であり、予備形成した状態で提供するか、例えば折り畳み式のボール紙の形状にすることができる。ハウジングやわなの適切な材質には、プラスチックやボール紙、特に段ボールが挙げられる。わなに入った昆虫の動きを制限するために、わなの内側表面には粘着物質で覆われるようにできる。ハウジングやわなには、内側に餌を収納できる適切な餌入れを入れておくことができる。昆虫は進入後に容易にはわなから出られないが、ハウジングは、餌を食べることができ、捕食者から安全だと感じる好ましい環境をクモ形類動物に与える「給餌場」として機能するため、わなはハウジングとは区別される。
害虫の侵入を減らすために、本発明の組成物で多くの製品や基材を処理できることは明らかである。勿論、賦形剤の性質や組成物の物理的形状は、処理が望まれる基材の性質に応じて変わりうる。例えば、組成物は、ブラッシング、スプレー、または印刷される液体、または処理される材質や基材に塗布する被覆剤であり得る。
標的配列の同定方法、および様々な細胞や組成物への配列の導入方法の具体的な実施例を、以下に示している。これらは具体例であることを意図して作られており、本発明を限定するためのものではない。
実施例１：ハイスループット・スクリーニングでのＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）におけるＣ．エレガンス標的遺伝子のサイレンシング
同じ２個のＴ７プロモーターとターミネーターとの間のｐＧＮ９Ａベクター（ＷＯ第０１／８８１２１号）内にＣ．エレガンス・ゲノム・ワイドライブラリーを作製して、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７ポリメラーゼの発現時にセンスおよびアンチセンス方向での発現を促進させた。
このライブラリーを９６ウェル・プレートフォーマットにて細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）に形質転換させた。ゲノム・ワイドスクリーニングのため、これら細菌性細胞をヌクレアーゼ欠損Ｃ．エレガンス株ｎｕｃ−１（ｅ１３９２）を餌として与えた。
細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）中で産生したｄｓＲＮＡをＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）虫に餌として与えることを、以下のように９６ウェル・プレートフォーマットにて行った：別々のプレートにｎｕｃ−１の卵を移して、２０℃で同時孵化させて、Ｌ１世代を同期化させた。ＩＰＴＧを含む液体増殖培地１００μＬ、およびｄｓＲＮＡ発現のためのＣ．エレガンス・ゲノム断片を伴う各ベクターを有するＣ．エレガンスｄｓＲＮＡライブラリーの細菌性細胞培養液（ＯＤ６００１ ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３））１０μＬで９６ウェル・プレートを満たした。各ウェルに、同期化したＬ１虫４匹を加え、２５℃で少なくとも４〜５日間培養させた。これらの実験は４回行った。スクリーニングでは、６つの対照を使用した：
‐ｐＧＮ２９＝陰性対照、野生型
‐ｐＧＺ１＝ｕｎｃ−２２＝収縮性の表現型
‐ｐＧＺ１８＝キチンシンターゼ＝胚致死
‐ｐＧＺ２５＝ｐｏｓ−１＝胚致死
‐ｐＧＺ５９＝ｂｌｉ−４Ｄ＝急性致死
‐ＡＣＣ＝アセチル補酵素Ａ カルボキシラーゼ＝急性致死
５日後、ｄｓＲＮＡ産生細菌を餌として与えたＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）虫の表現型と、空ベクター（ｐＧＮ２９）および他の対照を与えた虫の表現型を比較した。ｄｓＲＮＡを餌として与えた虫について、親（Ｐｏ）世代の（急性または幼性）致死率、一代雑種（Ｆ１）の（胚性）致死率、Ｐｏの発育遅延を以下の通りにスクリーニングした：（ｉ）Ｐｏの急性致死：Ｌ１は発生せず、死亡し、この表現型では子孫はできず、ウェルは全く空に見える、（ｉｉ）Ｐｏの（幼性）致死：ＰｏはＬ１よりも後期に死亡し、この表現型でも子孫はできない。幼虫または成虫の死亡がウェル内で認められた：（ｉｉｉ）Ｆ１の致死率：Ｌ１は成虫段階まで発生して、依然として生存している。この表現型では子孫はできない。これは不妊性、胚性致死（ウェル底での卵死）、胚性停止、または幼性停止（最終的には致死）に起因する可能性がある：（ｉｖ）子孫の通常発生および通常個体数が正常なウェルとの比較で、増殖停止および増殖遅延。
表(Table)１Ａに示した標的配列について、Ｃ．エレガンスなどの線虫におけるＣ．エレガンス標的遺伝子のｄｓＲＮＡ媒介性サイレンシングは虫の増殖や生存に致死的影響を及ぼすと結論付けた。
上記のｄｓＲＮＡサイレンシング実験に続いて、２４ウェル・プレート上で、ハイスループット・フォーマットにてＣ．エレガンスの詳細な表現型実験を実施した。上記の通り、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）中で産生したｄｓＲＮＡライブラリーを２４ウェル・プレート上の線虫ｎｕｃ−１（ｅ１３９２）に餌として、以下のように与えた：別々のプレートにｎｕｃ−１卵を移して、２０℃で同時孵化させて、Ｌ１世代を同期化させた。続いて、同期化させたＬ１虫１００匹を、５μ／ｍＬコレステロール、４μ／ｍＬ ＰＥＧ、および１ｍＭ ＩＰＴＧ、ならびにｄｓＲＮＡ発現のためのＣ．エレガンス・ゲノム断片を伴う各ベクターのＣ．エレガンスｄｓＲＮＡライブラリー５００μＬ細菌性細胞培養物（ＯＤ６００１ ＡＢ３０１−１０５ （ＤＥ３））を含むＳ‐完全培地の混合物５００μＬに浸した。浸したＬ１虫を２５℃で２時間回転させた。
上精９５０μＬを遠心分離で除去した後、残りの再懸濁した沈殿５μＬ（約１０〜１５匹の虫を含む）を２４ウェル・プレートの各ウェルの中央に移して、アガーＬＢ培地の層で満たした。摂取したプレートを２５℃で２日間培養した。成虫段階では、成虫１匹を選び出し、２５℃で２日間培養して、その子孫について検証した。他の成虫をインシツにて元の２４ウェル・プレート上で検証した。これらの実験は４回行った。
第２バッチの虫について詳細な表現型スクリーニングを繰り返し、第２バッチの虫を２０℃で３日間培養した点のみが異なっていた。
Ｃ．エレガンスのｄｓＲＮＡを餌として与えた虫の表現形を、空ベクターを餌として与えたＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）虫の表現形と比較した。
この実験に基づき、表(Table)１Ａに示したように、Ｃ．エレガンス標的遺伝子のサイレンシングは虫の増殖や生存に致死的作用を及ぼし、標的遺伝子が線虫の生存に必須であると結論付けた。従って、これらの遺伝子は、ｄｓＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングを介した線虫の抑制（殺傷または増殖抑制）において良好な標的遺伝子である。従って、本発明は、様々な生物や材質に線虫が侵入するのを抑制するための、上記のＣ．エレガンス標的遺伝子の線虫オルソローグの使用を含む。
実施例２：キイロショウジョウバエのオルソローグの同定
実施例１に記載の通り、多数のＣ．エレガンスの致死配列が同定されており、他の種や属でのオルソローグの同定に利用可能である。例えば、Ｃ．エレガンスの致死配列を使用して、キイロショウジョウバエのオルソローグ配列を同定できる。つまり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースによって、キイロショウジョウバエのオーソロガス配列について、各Ｃ．エレガンス配列を照合できる。配列相同性の高く（好ましくは、Ｅ値は１Ｅ−３０以下）、ＢＬＡＳＴ検索で配列のヒットが相互に最高となる、潜在的なキイロショウジョウバエのオルソローグを選択し、後者は他の生物（例、Ｃ．エレガンス、キイロショウジョウバエ）由来の配列が、ＢＬＡＳＴ検索で互いにヒットが最高となることを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴを利用して、Ｃ．エレガンス由来の配列をキイロショウジョウバエの配列と比較した。配列Ｃについてはキイロショウジョウバエの配列Ｄでヒットが最高となるが、ＤをＣ．エレガンスの全配列と比較した場合、やはり配列Ｃが最高であることが分かり、ＤとＣでヒットは互いに最高となる。オルソロジー（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）を定義するためにこの基準を利用すること多く、同様の機能を有する異なる種由来の同様の配列を意味している。表(Table)１Ａにキイロショウジョウバエ配列の発見者を示している。
実施例３：Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドハムシ）
Ａ．コロラドハムシ由来の遺伝子の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、異なる４幼虫期のＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドハムシ；入手先：Jeroen van Schaik,Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162, 6700 AD Wageningen、オランダ）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを生成した。
ＬＤ００１、ＬＤ００２、ＬＤ００３、ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、ＬＤ０１４、ＬＤ０１５、ＬＤ０１６、ＬＤ０１８遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＬＤに示しており、これらはプライマー配列および得られたｃＤＮＡ配列などのＬｅｐｔｉｎｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ標的遺伝子を示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクター（カタログ番号K2500-20，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＬＤに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＬＤに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示し、ここではリーディング・フレームの開始部分をカッコで示している。
Ｂ．コロラドハムシ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５'Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＬＤに示している。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃４分間、続いて９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を３５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＬＤに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＬＤに示している。表(Table)８−ＬＤには、コロラドハムシの標的配列に対するｄｓＲＮＡ断片の調製用配列、およびプライマー配列を含むコンカテマー配列を示している。
Ｃ．人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のコロラドハムシに対する活性のスクリーニング
コロラドハムシ用の人工飼料を以下の通りに調製した（Gelmanら、2001, J. Ins.Sc., vol. 1, no. 7, 1-10を改変）：水とアガーをオートクレーブして、温度が５５℃まで下がった時点で残りの成分（表２）を加えた。この温度で、成分を十分に混合した後、１ウェル当たり１ｍＬ量の飼料を２４ウェル・プレート（Nunc社）に分注した。人工飼料を室温まで冷まして、固まらせた。飼料は最長３週間まで４℃で保存した。
表２：人工飼料の成分
１ｍｇ／ｍＬ濃度のｄｓＲＮＡ液剤５０μＬをマルチウェル・プレートのウェル内の固形人工飼料に局所適用した。層流キャビン内で飼料を乾燥させた。処理毎に、コロラドハムシの幼虫２４匹（第２幼虫期）を試験した（１ウェル当たり昆虫２匹）。プレートを２５±２℃、相対湿度６０％の昆虫飼育用チェンバー内に保存した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。コロラドハムシの生死を１、２、３日毎に評価した。７日後、標的ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、ＬＤ０１４について、同濃度（１ｍｇ／ｍＬ）のｄｓＲＮＡを局所適用した新しい飼料と交換した；標的ＬＤ００１、ＬＤ００２、ＬＤ００３、ＬＤ０１５、ＬＤ０１６については、新しい飼料のみと交換した。飼料のみ、またはＧＦＰ（緑色螢光タンパク質）のコード配列（配列番号：２３５）の断片に対応するｄｓＲＮＡを局所適用した飼料について、ｄｓＲＮＡ標的を比較した。
異なる２回のバイオアッセイで示したように、無傷で裸のｄｓＲＮＡを含む人工飼料をＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの幼虫に餌として与えると、幼虫の死亡率が有意に上昇した（図１ＬＤ−２ＬＤ）。
最終的には、試験した全てのｄｓＲＮＡによって７‐１４日目に１００％の死亡率が招かれた。ＧＦＰ ｄｓＲＮＡの有無に関わらず、バイオアッセイを通して、飼料によって昆虫が維持されて、死亡率は０％に近かった。
一般に、観察した全てのアッセイにおいて、第２幼虫期のＣＢＰには、通常、２日間にわたりｄｓＲＮＡを含む飼料、または含まない飼料を与え、第３幼虫期に脱皮させた。この新しい幼虫期では、ＣＰＢによるこれらの給餌の有意な減少、または完全な停止が認められ、結果として死亡率が上昇した。
Ｄ．ジャガイモ葉ディスクを使用した、ｄｓＲＮＡ標的のコロラドハムシに対する活性のバイオアッセイ
ＣＰＢの食物源として人工飼料ではなくジャガイモ葉材料を使用した、代替バイオアッセイを利用した。適切な大きさの穿孔器を使用して、２〜３週目のジャガイモ植物の葉から、直径約１．１ｃｍ（または０．９５ｃｍ２）のディスクを切り出した。葉の向軸面に標的ＬＤ００２ ｄｓＲＮＡまたは対照ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ １０ｎｇ／μＬ溶液２０μＬを塗布することで、処理済み葉ディスクを調製した。葉ディスクを乾燥させて、一個一個を２４ウェル・マルチプレート（Nunc社）の２４ウェル内に置いた。第２幼虫期のＣＢＰ１匹を各ウェル内に置いて、ティッシュペーパーとマルチウェルのプラスチック蓋で覆った。昆虫と葉ディスクを含むプレートを、光周期が明期１６時間／暗期８時間の昆虫チェンバー内で維持した。昆虫に２日間葉ディスクを食べさせて、その後、新しい処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに昆虫を移した。その後、７日目まで毎日、未処理の葉ディスクを含むプレートに昆虫を移した。昆虫の死亡率と重量スコアを記録した。
標的ＬＤ００２に対する表面塗布した無傷で、裸のｄｓＲＮＡを有するジャガイモ葉ディスクをＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａに餌として与えると、幼虫の死亡率が有意に上昇したが（７日目には全ての昆虫が死亡した；死亡率１００％）、対照ｇｆｐ ｄｓＲＮＡはＣＰＢの生存率に影響を及ぼさなかった。標的ＬＤ００２ ｄｓＲＮＡは２〜３日目に幼虫の成長に深刻な影響を及ぼしたが、同じ濃度のｇｆｐ ｄｓＲＮＡを与えた幼虫は正常に発育した（図３−ＬＤ）。
Ｄ．人工飼料を使用した、より短いｄｓＲＮＡ標的のコロラドハムシに対する活性のスクリーニング
この実施例では、より短い（６０あるいは１００ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片が、それ自体として、またはコンカテマー・コンストラクトとして、コロラドハムシに対して毒性を起こすのに十分であるとの知見を例示している。
この実施例においては、コロラドハムシに致死を誘発することが判明している標的ＬＤ０１４を選択した。この遺伝子は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅサブユニットＥ（配列番号：１５）をコードする。
配列番号：１５（配列番号：１５９）の１９５−２９４番目の位置の１００塩基対（ｂｐ）断片ＬＤ０１４＿Ｆ１、および配列番号：１５（配列番号：１６０）の２３５〜２９４番目の位置の６０塩基対（ｂｐ）断片ＬＤ０１４＿Ｆ２を更に選択した。表(Table)７−ＬＤも参照。
３００塩基対（ｂｐ）の２つのコンカテマー（ＬＤ０１４＿Ｃ１、ＬＤ０１４＿Ｃ２）を設計した（配列番号：１６１、配列番号：１６２）。ＬＤ０１４＿Ｃ１は上記の１００塩基対（ｂｐ）断片（配列番号：１５９）を３リピート含んでいたが、ＬＤ０１４＿Ｃ２は上記の６０塩基対（ｂｐ）断片（配列番号：１６０）を５リピート含んでいた。表(Table)７−ＬＤも参照。
センス／アンチセンス・プライマーとしてＬＤ０１４＿Ｆ１、ＬＤ０１４＿Ｆ２断片を合成した。これらのプライマーをアニーリングさせて、クローニング前に二本鎖ＤＮＡ分子を作った。クローニングを容易にするために、プライマーの５’、３’末端にはそれぞれＸｂａＩ、ＸｍａＩ制限酵素部位が含まれた。
コンカテマーは３００塩基対（ｂｐ）の合成遺伝子として作製した。クローニングを容易にするために、合成ＤＮＡ断片の５’、３’末端にはそれぞれＸｂａＩ、ＸｍａＩ制限酵素部位が含まれた。
４つのＤＮＡ分子（即ち、２つの単一ユニット（ＬＤ０１４＿Ｆ１ ＆ ＬＤ０１４＿Ｆ２））と２つのコンカテマー（ＬＤ０１４＿Ｃ１ ＆ ＬＤ０１４＿Ｃ２）をＸｂａＩ／ＸｍａＩで切断して、ＸｂａＩ／ＸｍａＩ切断により線形化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋にサブクローニングさせて、それぞれ組み換えプラスミドｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４を作製した。
二本鎖ＲＮＡ産生：市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において、異なる２つずつの５’ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。ＬＤ０１４＿Ｆ１については、以下の条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーｏＧＢＭ１５９と特異的Ｔ７リバース・プライマーｏＧＢＭ１６４（本明細書ではそれぞれ配列番号：２０４、２０５と記載）を使用してセンスＴ７テンプレートを作製した：９５℃４分間、続いて９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を３５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーｏＧＢＭ１６３と特異的Ｔ７リバース・プライマーｏＧＢＭ１６０（本明細書ではそれぞれ配列番号：２０６、２０７と記載）を使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖は、本明細書において配列番号：２０３と示した。
ＬＤ０１４＿Ｆ２については、以下の条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーｏＧＢＭ１６１と特異的Ｔ７リバース・プライマーｏＧＢＭ１６６（本明細書ではそれぞれ配列番号：２０９、および２１０と記載）を使用してセンスＴ７テンプレートを作製した：９５℃４分間、続いて９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を３５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーｏＧＢＭ１６５と特異的Ｔ７リバース・プライマーｏＧＢＭ１６２（本明細書ではそれぞれ配列番号：２１１、および２１２と記載）を使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖は、本明細書において配列番号：２０８と示した。
コンカテマーについても、２つの別々のＰＣＲ反応において、異なる２つずつの５' Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。ＬＤ０１４＿Ｃ１＆ＬＤ０１４＿Ｃ２を含む組み換えプラスミドｐ３、ｐ４をＸｂａＩまたはＸｍａＩで線形化させて、各コンストラクトの２つの線形化断片を精製して、クローニング部位に隣接するＴ７プロモーターを利用して、インビトロ転写でのテンプレートとして使用した。T7 RiboMAXTM（商標）Express RNAi System（Promega社）を使用して、インビトロ転写によって二本鎖ＲＮＡを調製した。ＬＤ０１４＿Ｃ１、ＬＤ０１４＿Ｃ２について結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖は、本明細書においてそれぞれ配列番号：２１３、および２１４と示した。
図４−ＬＤに示すように、標的ＬＤ０１４のより短い配列およびコンカテマーによってコロラドハムシを殺すことができる。
Ｇ．人工飼料を使用した、異なる濃度のｄｓＲＮＡのコロラドハムシに対する活性のスクリーニング
１μｇ／μＬ（標的ＬＤ０２７では、０．１μｇ／μＬから）から０．０１ｎｇ／μＬまでの１０倍濃度系列のｄｓＲＮＡ溶液５０μＬを２４ウェル・プレート（Nunc社）のウェル内の固形人工飼料上に局所適用した。層流キャビン内で飼料を乾燥させた。処理毎に、コロラドハムシの幼虫２４匹（第２幼虫期；２匹／ウェル）を試験した。プレートを２５±２℃、相対湿度６０％の昆虫飼育用チェンバー内（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）に保存した。コロラドハムシの生死を１４日目まで定期的に評価した。７日後、同濃度のｄｓＲＮＡを局所適用した新しい飼料と交換した。ｄｓＲＮＡ標的を飼料のみと比較した。
様々な標的の完全な裸のｄｓＲＮＡを含む人工飼料をＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの幼虫に与えると、図５−ＬＤに示すように、０．１‐１０ｎｇ ｄｓＲＮＡ／μＬという低濃度で幼虫の死亡率が高まった。
Ｈ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＣＰＢ遺伝断片のクローニング
任意の効率的な細菌プロモーターを使用できるが、ＭＬＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片を細菌宿主での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内にクローニングした（ＷＯ第００／０１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８に示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００３と名付けた。
標的遺伝子断片ＬＤ０１０の増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している（フォーワード・プライマー配列番号：１９１、リバース・プライマー配列番号：１９０）。使用したテンプレートは、ＬＤ０１０配列（配列番号：１１）を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターであった。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００／１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８に示す配列番号：１８８に対応する。この配列を伴う組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００３と名付けた。
Ｉ．２種の大腸菌株、（１）ＡＢ３０９−１０５、（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において標的ＬＤ０１０に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩを含む細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較でＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）５０μＬにゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に置いた。室温のＳＯＣ培地４５０μＬを細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｊ．コロラドハムシに対するｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌を試験するための実験
２種のバイオアッセイ方法を利用して、コロラドハムシの幼虫に対して大腸菌内で産生させた二本鎖ＲＮＡを検証した：（１）人工飼料バイオアッセイ、および（２）植物バイオアッセイ。
人工飼料バイオアッセイ
先の実施例４に記載のとおりに、コロラドハムシの人工飼料を調製した。飼料０．５ｍＬを４８ウェル・マルチウェル試験プレートの各ウェルに分注した。処理毎に、熱処理済みｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液（ＯＤ１）５０μＬ（約５×１０７個の細菌細胞に相当）をウェル内の固形飼料に局所適用して、プレートを層流キャビン内で乾燥させた。処理毎に、第２幼虫期のコロラドハムシ４８匹（飼料および細菌を含む各ウェルに１匹）を検証した。プレート（８ウェル）の各列を１複製物と見なした。プレートを２５±２℃、相対湿度６０％の昆虫飼育用チェンバー内に保存した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。４日後毎に、局所適用した細菌を含む新しい飼料にコロラドハムシを移した。侵入から１〜３日後毎にコロラドハムシの生死を評価した。生存個体については、侵入後７日目に幼虫の重量に関する成長および発生を記録した。
ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損大腸菌株ＡＢ３０９−１０５については、ＣＰＢ毒性のバイオアッセイにおいてプラスミドｐＧＢＮＪ００３を含む細菌、および空ベクターｐＧＮ２９（ＷＯ第００／１８８１２１Ａ１号参照）を含む細菌を検証した。ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを保有する細菌では、昆虫の致死率において明らかな経時的上昇が示されたが、ｐＧＮ２９および飼料のみの対照において死亡はほとんど認められなかった（図６ａ−ＬＤ ＆ ７ａ−ＬＤ）。ｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する細菌を含む人工飼料を与えてから７日後、生き残ったコロラドハムシ幼虫の成長および発生が大幅に遅くなった（表(Table)１０−ＬＤ、図８ａ−ＬＤ）。
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）について、コロラドハムシの幼虫に対するプラスミドｐＧＢＮＪ００３を含む細菌、および空ベクターｐＧＮ２９を含む細菌を検証した。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損大腸菌株ＡＢ３０９−１０５について、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を添加した飼料を与えた幼虫に及ぼす同様の有害影響が認められた（図６ｂ−ＬＤ、７ｂ−ＬＤ）。しかし、５クローンでの生存個体数はＡＢ３０９−１０５よりもＢＬ２１（ＤＥ３）で高かった。１２日目、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ欠損株と比較して、この株での平均致死率は約２５％低かった。また、標的ＬＤ０１０に対応するｄｓＲＮＡを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）を含む飼料を与えた生存個体での平均重量は、大幅に低下していた（表(Table)１０−ＬＤ、図８ｂ−ＬＤ）。
空ベクターｐＧＮ２９を保有する細菌、または飼料のみのプレートと比較して、４日目以降、新しいプレートのウェルには粉くずは認められなかったため、プラスミドｐＧＢＮＪ００３を保有する２種類の細菌株のいずれかを含む飼料を与えたＣＰＢ幼虫の成長および発生の遅延と給餌阻害には直接的な相関関係が認められた。人工飼料に局所適用したインビトロ転写された二本鎖ＲＮＡをＣＢＰに与えた場合での知見とこの知見は似ており（実施例３Ｄ参照）、ここでは、処理済み飼料において２回目以降に給餌を停止した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液をジャガイモ植物全体に噴霧して、植物をＣＰＢ幼虫に食べさせた。以下の条件の植物生育室内において塊茎から８〜１２開葉期までジャガイモ品種「５系統」を生育させた：２５±２℃、相対湿度６０％、光周期：明期１６時間、暗期８時間。通気可能にして、内部での凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防ぐように底部を開けて細目ナイロン・メッシュを被せた、５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定することで、植物を囲った。Ｌ１幼虫期のコロラドハムシ幼虫１５匹を囲い内の各処理済み植物に置いた。ｐＧＢＮＪ００３プラスミド（クローン１；図７ａ−ＬＤ）またはｐＧＮ２９プラスミド（クローン１；図７ａ−ＬＤ）を保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１．６ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。細菌細胞懸濁液の９倍希釈時、死亡個体数は維持された（図９−ＬＤ）。ｐＧＢＮＪ００３ベクターを保有する細菌を噴霧した植物において、１１日目に生存していた幼虫の平均重量は、ｐＧＮ２９での重量の約１０倍少なかった（図１０−ＬＤ）。空ベクターｐＧＮ２９を含む細菌を噴霧したジャガイモ植物に生じた損傷と比較して、ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを含む細菌を噴霧したジャガイモ植物でのＣＰＢ幼虫の摂食による損傷はずっと軽度であった（図１１−ＬＤ）。
これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
Ｋ．コロラドハムシに対するｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌の様々な濃度の培養懸濁液の試験
実施例３Ｊに細菌培養物の調製／処理について記載している。標的ＬＤ０１０の二本鎖ＲＮＡを発現するＲＮＡａｓｅＩＩＩ欠損大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の３倍希釈培養物（０．２５ユニット相当から開始）を８〜１２開葉期の「Ｂｉｎｔｊｅ」品種のジャガイモ植物葉に適用した。処理済み植物上に第１幼虫期のＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａを１０匹を置いた（処理当たり１植物）。７日目に昆虫の死亡率および増殖遅延を点数化した（侵入後７日目）。
図１４−ＬＤに示すように、濃度０．２５、０．０８、および０．０２５細菌ユニットでｐＧＢＮＪ００３プラスミド（標的１０ｄｓＲＮＡ発現用）を保有する大腸菌の熱不活化培養物を細目スプレーによって局所適用したジャガイモ葉を昆虫に与えた１週間後にＣＰＢ幼虫の死亡率を記録した（９０〜１００％）。０．００８ユニットで、昆虫の約３分の１が死亡していたが、生き残った昆虫は、対照群よりも有意に小さかった（空ベクターｐＧＮ２９を保有する大腸菌または水のみ）。空ベクターｐＧＮ２９を含む細菌を噴霧したジャガイモ植物上で生じる損傷と比較して、濃度０．０２５または０．００８ユニットのｐＧＢＮＪ００３を含む細菌を植物に噴霧したジャガイモ植物のＣＰＢ幼虫による摂食損傷は大幅に軽減されていた（図１５−ＬＤ）。
Ｌ．標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取による、成虫の感受性は極めて高い。
以下の実施例では、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取による、成虫（幼虫のみならず）の感受性は極めて高いとの知見を提示して強調している。
この実験では４つの標的を選んだ：標的２、１０、１４、および１６（配列番号：１６８、１８８、１９８、２２０）。ＧＦＰ断片ｄｓＲＮＡ（配列番号：２３５）を対照として使用した。昆虫の雌雄に偏りがないように、実験室の飼育培養から幼齢（２〜３日齢）昆虫を無作為に取り出した。処理毎に成虫１０匹を選んだ。処理開始前の少なくとも６時間は成虫には餌を与えなかった。処理の初日、ディスク１枚当たり２５μＬの０．１μｇ／μＬ標的ｄｓＲＮＡの局所適用によって前処理したジャガイモ葉ディスク（直径１．５ｃｍ2）４枚を各成虫に与えた（実施例３Ａに記載のとおりに合成；実施例３Ｅに記載の局所適用）。全ての昆虫が同量の食物を食べて、同用量のｄｓＲＮＡを摂取するように、各成虫を小さなペトリ・ディッシュ（直径３ｃｍ）内に閉じ込めた。後日、上記のとおり、処理済み葉４枚を各成虫に再び与えた。３日目、処理当たり成虫１０匹を集めて、通気を良くするために細目ナイロン・メッシュをフタに付けたプラスチック箱（寸法３０ｃｍ ｘ ２０ｃｍ ｘ １５ｃｍ）から成るケージ内に置いた。箱内には、底に湿らせたろ紙を置いた。紙上にジャガイモ葉（未治療）を置いて、実験中に成虫を保持させた。５日目以降、死亡／生存（動いている）／瀕死状態の昆虫の個体数を定期的に評価した。昆虫の瀕死状態については、昆虫を逆さまに置いて、数分以内に戻れるか否かを調べた。戻れない場合には昆虫は瀕死状態と見なされた。
この実験では、コロラドハムシの成虫に対する、異なる標的に対応する二本鎖ＲＮＡの明確な特異的毒性影響が実証された（図１２−ＬＤ）。ｇｆｐ断片に対応する二本鎖ＲＮＡについては、最終評価日にＣＰＢの成虫に対する毒性は認められなかった（１９日目）。この実験では、経口投与時に数日間ｄｓＲＮＡにさらされた後、ＣＰＢの成虫の生存率は大幅に低下することが明確に示された。例えば、標的１０では、５日目に、成虫１０匹中５匹が瀕死の状態であった（病気または動きが鈍い）。６日目、成虫１０匹中４匹が死亡し、生き残った３匹は瀕死の状態であった。９日目、全ての成虫の死亡が認められた。
この実験の結果として、害虫に対する標的二本鎖ＲＮＡの適用を拡大させて、コロラドハムシの場合と同様に、広範な作物損傷の原因となりうる２発育段階（幼虫期および成虫期）の害虫を含めたることができる。
実施例４：Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ（マスタードハムシ）
Ａ．ファミリーＰＣＲによるＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ（マスタードハムシ）のＰＣ００１、ＰＣ００３、ＰＣ００５、ＰＣ０１０、ＰＣ０１４、ＰＣ０１６、およびＰＣ０２７遺伝子の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、第３幼虫期のＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ（マスタードハムシ；入手先：Dr. Caroline Muller, Julius-von-Sachs-INSTITUTE for Biosciences, Chemical Ecology Group, University of Wuerzburg, Julius-von-Sachs-Platz 3, D-97082 Wuerzburg,ドイツ）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScript TM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを生成した。
ＰＣ００１、ＰＣ００３、ＰＣ００５、ＰＣ０１０、ＰＣ０１４、ＰＣ０１６、およびＰＣ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＰＣに示している。表(Table)２−ＰＣには、プライマー配列および得られたｃＤＮＡ配列などのＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ標的遺伝子を示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５３０−２０，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＰＣに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。
表(Table)３−ＰＣに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。表(Table)３−ＰＣには、ｃＤＮＡクローンのアミノ酸配列を示しており、リーディング・フレームの開始部分をカッコで示している。
Ｂ．Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＰＣに示している。表(Table)８‐ＰＣには、プライマー配列を含むＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ標的配列のｄｓＲＮＡ断片の調製に関する詳細が示されている。
ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＰＣに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＰＣに示している。
Ｃ．アブラナ葉ディスクを使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ幼虫に対する活性を試験するための実験
以下の実施例は、マスタードハムシ（ＭＬＢ）の幼虫が、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
ＭＬＢ幼虫に対する二本鎖ＲＮＡサンプルを試験するために、アブラナ葉材料（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒｉｅｔｙ ＳＷ Ｏｂａｎ；入手先：Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, イギリス）を食物源として使用した葉ディスクアッセイを利用した。昆虫培養物を、２５±２℃、相対湿度６０％±５％の昆虫飼育用チェンバー内の同じ品種のアブラナ上に保持した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。適切な大きさの穿孔器を使用して、４〜６週目のアブラナ葉から、直径約１．１ｃｍ（または０．９５ｃｍ２）のディスクを切り出した。二本鎖ＲＮＡサンプルを０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に０．１μｇ／μＬに希釈した。葉の向軸面に標的ＰＣ００１、ＰＣ００３、ＰＣ００５、ＰＣ０１０、ＰＣ０１４、ＰＣ０１６、ＰＣ０２７ ｄｓＲＮＡおよび対照であるｇｆｐ ｄｓＲＮＡの希釈溶液、または０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２５μＬ塗布することで、処理済み葉ディスクを調製した。葉ディスクを放置して乾かし、葉ディスクの乾燥予防に役立つゲル化２％アガー１ｍＬを含む２４ウェル・マルチプレートの各２４ウェルにそれぞれ置いた。ＭＬＢの新生幼虫２匹をプレートの各ウェル内に置き、これをマルチウェル・プラスチック・フタで覆った。プレート（１処理に４８匹含む）を４つの複製物（１複製物１２匹）に分けた（各列）。昆虫と葉ディスクを含むプレートを、２５±２℃、相対湿度６０％±５％の昆虫飼育用チェンバー内に保持した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。昆虫に２日間葉ディスクを食べさせて、その後、新しい処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに昆虫を移した。その後、バイオアッセイの開始から４日後、各複製物から昆虫を回収して、未処理アブラナ葉を含むペトリ・ディッシュに移した。２、４、７、９、および１１日目に幼虫の死亡率および平均重量を記録した。
図１（ａ）で示したように、完全な裸の標的ｄｓＲＮＡで処理したアブラナ葉をＰ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅの幼虫に与えると、幼虫の死亡率が有意に上昇した。標的ＰＣ０１０では９日目に、標的ＰＣ０２７では１１日目に、試験した二本鎖ＲＮＡによって幼虫の死亡率が１００％になった。他の全ての標的について、対照のｇｆｐ ｄｓＲＮＡと比較して、１１日目に死亡率が有意に高くなった：（パーセントの平均値±信頼区間＋α０．０５）ＰＣ００１（９４．４±８．２）；ＰＣ００３（８６．１±４．１）；ＰＣ００５（８３．３±７．８）；ＰＣ０１４（６３．９±２０．６）；ＰＣ０１６（７５．０±１６．８）；ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（１１．１±８．２）；０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１９．４±１０．５）；葉のみ（８．３±１０．５）。
平均重量に基づいて、生き残った幼虫を評価した。全ての標的について、バイオアッセイの４日目以降、マスタードハムシの幼虫の平均重量は有意に低下した。葉のみでの幼虫と同様に、対照であるｇｆｐ ｄｓＲＮＡまたは０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のみを与えた昆虫は正常に発生した（図１（ｂ）−ＰＣ）。
Ｄ．アブラナ葉ディスクを使用した、異なる濃度のｄｓＲＮＡのＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ幼虫に対する活性のスクリーニング実験
上記の実施例４Ｄに記載のとおり、０．１μｇ／μＬから０．０１ｎｇ／μＬまでの１０倍濃度系列の標的ＰＣ０１０またはＰＣ０２７由来のｄｓＲＮＡ溶液２５μＬをアブラナ葉ディスク上に局所適用した。陰性対照として、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のみを葉ディスクに投与した。処理毎に、マスタードハムシの新生幼虫２４匹（２匹／ウェル）を試験した。プレートを２５±２℃、相対湿度６０±５％の昆虫飼育用チェンバー内（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）に保存した。２日目、新しいｄｓＲＮＡ処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに幼虫を移した。標的ＰＣ０１０では４日目、標的ＰＣ０２７では５日目、十分量の未処理葉材料を含むペトリ・ディッシュに各複製物の昆虫を移した。標的ＰＣ０１０では２、４、７、８、９、および１１日目、標的ＰＣ０２７では２、５、８、９、および１２日目、マスタードハムシの生死を評価した。
２つの異なる標的（ＰＣ０１０、およびＰＣ０２７）の完全な裸のｄｓＲＮＡを含むアブラナ葉ディスクをＰ． ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅの幼虫に与えると、図２（ａ）（ｂ）に示すように、１ｎｇ ｄｓＲＮＡ／μＬという低濃度で幼虫の死亡率が高まった。１１日目、標的ＰＣ０１０に対する異なる濃度のｄｓＲＮＡにおけるパーセントの平均死亡率±信頼区間＋α０．０５（０μｇ／μＬ：８．３±９．４；０．１μｇ／μＬ：１００；０．０１μｇ／μＬ：７９．２±２０．６；０．００１μｇ／μＬ：５８．３±９．４；０．０００１μｇ／μＬ：１２．５±１５．６；１２日目、標的ＰＣ０２７では、０μｇ／μＬ：８．３±９．４；０．１μｇ／μＬ：９５．８±８．２；０．０１μｇ／μＬ：９５．８±８．２；０．００１μｇ／μＬ：８３．３±１３．３；０．０００１μｇ／μＬ：１２．５±８．２）。
Ｅ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＭＬＢ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＭＬＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターや細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８に示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００（未完成）と名付けた。
標的遺伝子断片ＰＣ０１０の増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８−ＰＣに示している。使用したテンプレートは、ＰＣ０１０配列（配列番号：２５３）を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターであった。以下の条件のタッチダウンＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒（１サイクルごとに温度を０．５℃下げる）、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にして、Ｓｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＰＣに示す配列番号：４８８に対応する。この配列を伴う組み換えベクターをｐＧＣＤＪ００１と名付けた。
Ｆ．大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の２株における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。この実験では、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を総量５０ｍＬの０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に再懸濁させた。チューブは使用まで４℃で保存した。
Ｇ．Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
葉ディスクバイオアッセイ
葉ディスクバイオアッセイを利用して、マスタードハムシの幼虫に対する大腸菌（プラスミドｐＧＣＤＪ００１）での標的ＰＣ０１０由来の二本鎖ＲＮＡを検証した。実施例４に記載のとおり、葉ディスクはアブラナ葉から調製した。２０μＬの細菌懸濁液（ＯＤ６００ｎｍ＝１）を各ディスク上にピペットで取った。ゲル化アガー１ｍＬを含む２４マルチウェル・プレートのウェルに葉ディスクを置いた。各葉ディスク上に新生幼虫２匹を置いた。各処理について、３複製物（新生幼虫１６匹／複製物）を準備した。プレートを２５±２℃、相対湿度６０±５％の昆虫飼育用チェンバー内（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）に保存した。３日目（バイオアッセイから３日後）、新しい処理済み（同用量）葉ディスクを含む新しいプレートに幼虫を移した。５日目以降、１日おきに葉材料を補給した。バイオアッセイでは、死亡率と平均重量を点数化した。陰性対照は、プラスミドｐＧＮ２９（空ベクター）を保有する細菌で処理した葉ディスク、および葉のみであった。
プラスミドｐＧＣＤＪ００１を含むＲＮａｓｅＩＩＩ欠損大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で処理したアブラナ葉を昆虫に与えた後、Ｐ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅの幼虫において経時的で明らかな死亡率の上昇が認められたが、プラスミドｐＧＮ２９を含む細菌または葉のみの対照では昆虫の死亡はほとんど認められなかった（図３−ＰＣ）。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＭＬＢに植物を餌として与えた。ＭＬＢは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にＭＬＢを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例５：Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓ（インゲンテントウ）
Ａ．Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓの遺伝子の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、第３幼虫期のＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓ（インゲンテントウ； 入手先：Thomas Dorsey（昆虫学者／責任者），New Jersey Department of Agriculture, Division of Plant Industry, Bureau of Biological Pest Control, Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory, 米国08625-0330ニュージャージー州トレントン私書箱３３０）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
ＥＶ００５、ＥＶ００９、ＥＶ０１０、ＥＶ０１５、およびＥＶ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＥＶに示しており、ここにはプライマー配列および得られたｃＤＮＡ配列などのＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓ標的遺伝子を示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：ＥＶ００５およびＥＶ００９では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分；ＥＶ０１４では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５３℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃７分；ＥＶ０１０およびＥＶ０１６では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分４０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ4530-20，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＥＶに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＥＶに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示し、リーディング・フレームの開始部分をカッコで示している。
Ｂ．Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＥＶに示している。
ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＥＶに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＥＶに示している。
Ｃ．マメ葉ディスクを使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓ幼虫に対する活性を試験するための実験
以下の実施例は、インゲンテントウ（ＭＢＢ）の幼虫が、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
ＭＢＢ幼虫に対する二本鎖ＲＮＡサンプルを試験するために、スナップビーン（Phaseolus vulgaris variety Montano；入手先： Aveve NV，ベルギー）を食物源として使用した葉ディスクアッセイを利用した。同じ品種のマメを使用して、昆虫培養物を２５±２℃、相対湿度６０％±５％の昆虫飼育室内で保持した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。適切な大きさの穿孔器を使用して、１‐２週目のアブラナ葉から、直径約１．１ｃｍ（または０．９５ｃｍ２）のディスクを切り出した。二本鎖ＲＮＡサンプルを０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に０．１μｇ／μＬに希釈した。葉の向軸面に標的Ｅｖ００５、Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５、Ｅｖ０１６ ｄｓＲＮＡおよび対照であるｇｆｐ ｄｓＲＮＡの希釈溶液、または０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２５μＬ塗布することで、処理済み葉ディスクを調製した。葉ディスクを放置して乾かし、葉ディスクの乾燥予防に役立つゲル化２％アガー１ｍＬを含む２４ウェル・マルチプレートの各２４ウェルにそれぞれ置いた。ＭＢＢの新生幼虫１匹をプレートの各ウェル内に置き、これをマルチウェル・プラスチック・フタで覆った。プレートを３つの複製物（１複製物８匹）に分けた（各列）。昆虫と葉ディスクを含むプレートを、２５±２℃、相対湿度６０％±５％の昆虫飼育用チェンバー内に保持した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。昆虫に２日間葉ディスクを食べさせて、その後、新しい処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに昆虫を移した。その後、バイオアッセイの開始から４日後、１０日目まで毎日、昆虫を未処理の新しいマメ葉を含むペトリ・ディッシュに移した。２日目、そしてそれ以降は毎日、昆虫の死亡率を記録した。
図１に示すとおり、表面適用した完全な裸の標的ｄｓＲＮＡを含むスナップビーンをＥ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの幼虫に与えると、幼虫の死亡率が有意に上昇した。試験した標的Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５、およびＥｖ０１６の二本鎖ＲＮＡでは８日目に死亡率が１００％になったが、標的Ｅｖ００５のｄｓＲＮＡでは全ての幼虫を殺すのに１０日間を要した。対照であるｇｆｐ ｄｓＲＮＡまたは表面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む処理済み葉ディスクを与えた昆虫の大部分が、バイオアッセイを通して保持された（図１−ＥＶ）。
Ｄ．マメ葉ディスクを使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ成虫に対する活性を試験するための実験
以下の実施例は、インゲンテントウの成虫が、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
インゲンテントウの幼虫での同様の設定のバイオアッセイにおいて、マメ葉ディスクに局所適用した二本鎖ＲＮＡに対して、成虫ＭＢＢを検証した。各標的Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５、Ｅｖ０１６からの被験ｄｓＲＮＡを０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で最終濃度０．１μｇ／μＬに希釈した。各ディスク上への試験溶液３０μＬの局所適用によってマメ葉ディスクを処理した。ディスクを完全に乾燥させて、２４ウェル・マルチウェル・プレートの各ウェル内のゲル化２％アガー・スライス上にそれぞれ置いた。３日齢の成虫を培養ケージから回収し、７〜８時間は何も与えず、その後、バイオアッセイ・プレートの各ウェルに成虫１匹を置いた（成虫２４匹／処理）。昆虫飼育室内にプレートを保持して（ＭＢＢ幼虫と同じ条件で２４時間）、その後、新しいｄｓＲＮＡ処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに成虫を移した。更に２４時間後、処理毎に成虫を回収して、２個の鉢植えである、未処理の３週齢マメ植物を含むプラスチック箱（寸法３０ｃｍ×１５ｃｍ×１０ｃｍ）内に置いた。４〜１１日目まで、昆虫の死亡率を評価した。
図２（ａ）−ＥＶに示すとおり、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫が３種の標的ｄｓＲＮＡ（Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５、Ｅｖ０１６）のいずれを摂取しても、４日目以降（バイオアッセイ開始後４日目）、死亡率が有意に上昇した。５日目以降、最初に標的ｄｓＲＮＡ処理済みマメ葉ディスクを与えた昆虫と、対照であるｇｆｐ ｄｓＲＮＡまたは界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むディスクを与えた昆虫との間に、摂食パターンに劇的な変化が認められた。程度は異なるが、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡや界面活性剤のみの対照と比較した場合、３種の標的全てについて、未処理マメ植物でのＭＢＢ成虫による葉損傷の軽減が明らかであった。標的１５を与えた昆虫において、マメ葉の損傷が最も軽度であった（図２（ｂ）−ＥＶ）。
Ｅ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＭＢＢ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＭＬＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８−ＥＶに示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＥＶに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｆ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｇ．Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｔｉｓに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＭＢＢに植物を餌として与えた。ＭＢＢは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にＭＭＢを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例６：Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ（メキシコワタノミゾウムシ）
Ａ．Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓの部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、３齢のＡｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ（メキシコワタノミゾウムシ；入手先：Dr. Gary Benzon, Benzon Research Inc., 7 Kuhn Drive, Carlisle, Pennsylvania 17013, 米国）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを生成した。
ＡＧ００１、ＡＧ００５、ＡＧ０１０、ＡＧ０１４、ＡＧ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＡＧに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：ＡＧ００１、ＡＧ００５、ＡＧ０１６では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分；ＡＧ０１０では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分；ＡＧ０１４では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃７分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号K2500-20，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＡＧに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＡＧに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ（メキシコワタノミゾウムシ）遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマー／リバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＡＧに示している。タッチダウンＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒（１サイクルごとに温度を０．５℃下げる）、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＡＧに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＡＧに示している。
Ｃ．人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のイエコオロギＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの幼虫に対する活性を試験するための実験
Insect Investigations Ltd.(origin: Blades Biological Ltd., Kent, 英国)でイエコオロギＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓを保持した。ブラン・ペレットとキャベツ葉で昆虫を飼育した。試験に使用するために、同じ大きさで、５日齢以上の雌雄同体の若虫を選んだ。二本鎖ＲＮＡを小麦ベースのネズミ用小麦ペレット飼料と混ぜた（ラット／マウス用の標準食、B & K Universal Ltd., Grimston,Aldbrough, Hull 英国）。飼料（ＢＫ００１Ｐ）には、重量順に、以下の成分が含まれる：小麦、大豆、小麦食、大麦、ペレット結合剤、ネズミ用５ビタミン、脂肪混合物、リン酸二カルシウム、カビ炭水化物（ｍｏｕｌｄ ｃａｒｂ）。ネズミ用のペレット飼料を粉砕して、電子レンジで熱処理して、酵素成分を不活化させた後、混合させた。全てのネズミ用飼料を同じバッチから取ることで、一貫性を保証した。粉砕した飼料とｄｓＲＮＡを十分に混合させて、同じ重さの小ペレットに成形させて、室温で一晩乾燥させた。
標的およびｇｆｐ対照からの二本鎖ＲＮＡサンプル（濃度１０μｇ／μＬ）を粉砕飼料１ｇにｄｓＲＮＡ溶液１ｍＬの割合で適用することで、ペレット１ｇ当たり１０ｍｇのｄｓＲＮＡという適切な割合にした。毎週、ペレットを交換した。試験の最初３週間にわたり、処理済みペレットを昆虫に与えた。その後、未処理ペレットを与えた。ふた付きプラスチック容器（直径９センチ、深さ４．５センチ）１個当たり昆虫１０匹を保持した。各領域には、処理済み餌ペレット１個と水源１個（湿らせた球状脱脂綿）が含まれ、それぞれを別々の小さな検量ボートに置いた。実験を通して、適宜、水を補給した。
対照の全ての昆虫が死ぬか、または脱皮して成虫になるまで、週２回間隔で評価を行った（８４日間で評価間隔は４日以内）。各評価において、昆虫の生死を評価し、異常を検査した。４６日目以降、成虫への脱皮が始まると直ぐに、全ての昆虫（生死を問わず）について、若虫、成虫いずれであるのかを評価した。試験の５５日目、生き残った昆虫の重量を測った。各処理について４回繰り返した。試験中、試験条件は２５〜３３℃、相対湿度２０−２５％、そして光周期が明期：暗期＝１２：１２時間であった。
Ｄ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＭＬＢ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＭＬＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
標的遺伝子の増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８に示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｅ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｆ．Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＣＢＷに植物を餌として与えた。ＣＢＷは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にＣＢＷを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例７：Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ（コクヌストモドキ）
Ａ．Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍの部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、異なる全齢のＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ（コクヌストモドキ；入手先：Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, 英国ウェールズ）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号1808004，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
ＴＣ００１、ＴＣ００２、ＴＣ０１０、ＴＣ０１４、およびＴＣ０１５遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＴＣに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分（ＴＣ００１、ＴＣ０１４、ＴＣ０１５）；９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分（ＴＣ０１０）；９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃７分（ＴＣ００２）。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号K2500-20，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＴＣに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＴＣに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍの遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマー／リバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＴＣに示している。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒（１サイクルごとに温度を０．５℃下げる）、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＴＣに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＴＣに示している。
Ｃ．人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ幼虫に対する活性を試験するための実験
以下の実施例は、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）の幼虫が、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ（コクヌストモドキ）はInsect Investigations Ltd.（入手先：Imperial College of Science, Technology and Medicine, 英国バークシャー州シルウッドパーク）で維持した。企業のＳＯＰ／２５１／０１にしたがって昆虫を培養した。簡単に説明すると、昆虫をプラスチック製のビンまたはタンクにコクヌストモドキを入れた。これらは上部が開いており、換気可能である。上部にネットを付けて、ゴムバンドで固定して、逃げないようにした。コクヌストモドキを繁殖可能な容器内に、幼虫用の飼育培地（小麦）を置いた。貯蔵食品害虫であるコクヌストモドキのコロニーを２５±２℃、相対湿度６０％±５％の温度管理室内で保持した（光周期は明期：暗期＝１６：８時間）。
標的ＴＣ０１４（配列番号：−７９９に対応する配列）からの二本鎖ＲＮＡを小麦と粉ミルク（全粒小麦粉：粉ミルク＝４：１）の混合物に取り込ませて、一晩乾燥させた。それぞれの調製物を別々に調製した：１０μｇ／μＬ ｄｓＲＮＡ溶液１００μＬ（１ｍｇ ｄｓＲＮＡ）を０．１ｇ小麦／乳混合物に加えた。乾燥させた混合物を微粉状にした。二層のろ紙を敷いたペトリ・ディッシュ（直径５５ミリ）内に昆虫を維持した。２枚のろ紙層に処理済み飼料を置いた。１齢の雌雄同体の幼虫１０匹を各ディッシュ内に置いた（複製物）。各処理について４回繰り返した。対照はＭｉｌｌｉ−Ｑ水であった。定期的に評価（生存個体数）を行った。試験中、試験条件は、温度２５〜３３℃、相対湿度２０〜２５％、光周期は明期：暗期＝１２：１２時間であった。
図１に示すとおり、飼料のみの対照と比較して、標的ＴＣ０１４ ｄｓＲＮＡで処理した人工飼料におけるＴ．ｃａｓｔａｎｅｕｍの幼虫の経時的な生存率は有意に低下した。
Ｄ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＲＦＢ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＲＦＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
標的遺伝子の増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８−ＴＣに示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＴＣに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｅ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド、すなわちＩＰＴＧの存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物の６００ｎｍでの光学濃度を測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌の沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、および１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿物を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｆ．Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＲＦＢに植物を餌として与えた。ＲＦＢは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にＲＦＢを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例１０：Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ（アカアブラムシ）
Ａ．Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅの部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅの若虫（アカアブラムシ；入手先：Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, 英国)から高品質で、無傷のＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標） III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）用いて、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを作製した。
ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１０、ＭＰ０１６、およびＭＰ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を用いて、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＭＰに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１６ では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分；ＭＰ０２７ではタッチダウンプログラムを使用：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、６０℃４０秒（１サイクルごとに温度を１℃下げる）、７２℃１分１０秒を１０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃４０秒、７２℃１分１０秒を３０サイクル、続いて７２℃７分；ＭＰ０１０では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃３分を４０サイクル、続いて７２℃７分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ２５００−２０，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＭＰに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＭＰに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅの遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 Ribomax（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＭＰに示している。タッチダウンＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒（ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１６、ＭＰ０２７、ｇｆｐ）または５０℃３０秒（ＭＰ００１）（１サイクルごとに温度を０．５℃下げる）、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、４５℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＭＰに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＭＰに示している。
Ｃ．液体人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅに対する活性を試験するための実験
Febvayらの記載(1988年)の方法[Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum (Homoptera: Aphididae).Can .J. Zool. 66: 2449-2453]に多少の改変を加えて、Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ ｐｉｓｕｍ（エンドウヒゲナガアブラムシ）に適した飼料に基づいて、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ（アカアブラムシ）用の液体人工飼料を調製した。飼料のアミノ酸成分は以下の通りに調製した（ｍｇ／１００ｍＬ）：アラニン１７８．７１、βアラニン６．２２、アルギニン２４４．９、アスパラギン２９８．５５、アスパラギン酸８８．２５、システイン２９．５９、グルタミン酸１４９．３６、グルタミン４４５．６１、グリシン１６６．５６、ヒスチジン１３６．０２、イソロイシン１６４．７５、ロイシン２３１．５６、塩酸リジン３５１．０９、メチオニン７２．３５、オルニチン（塩酸）９．４１、フェニルアラニン２９３、プロリン１２９．３３、セリン１２４．２８、トレオニン１２７．１６、トリプトファン４２．７５、チロシン３８．６３で、Ｌバリン１９０．８５。アミノ酸混合物を加える前に数滴の１Ｍ ＨＣｌに溶解したチロシンを除く、アミノ酸を３０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させた。飼料のビタミン混合成分を以下の通りに５Ｘ濃縮液として調製した（ｍｇ／Ｌ）：アミノ安息香酸１００、アスコルビン酸１０００、ビオチン１、パントテン酸カルシウム５０、塩化コリン５００、葉酸１０、ミオイノシトール４２０、ニコチン酸１００、塩酸ピリドキシン２５、リボフラビン５、塩酸チアミン２５。リボフラビンを５０℃の水１ｍＬに溶解させて、ビタミン混合物に加えた。ビタミン混合物を２０ｍＬに分注して−２０℃で保存した。ビタミン混合物２０ｍＬをアミノ酸溶液に加えた。ショ糖２０ｇ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ２４２ｍｇを混合物に加えた。微量金属ストック溶液 を以下の通りに調製した（ｍｇ／１００ｍＬ）：ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ ４．７、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ ４４．５、ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ ６．５、塩化ナトリウム２５．４、ＺｎＣｌ ２８．３。微量金属溶液１０ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ２５０ｍｇを飼料に加え、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を液体飼料に加えて、最終容積を１００ｍＬとした。１Ｍ ＫＯＨ溶液で飼料をｐＨ７に調整した。液体飼料を０．２２μｍのフィルター・ディスク（Millipore社）でろ過滅菌した。
以下の条件で、環境管理室内の７０μｍメッシュを含むアルミニウム・フレーム付きケージ内で、４〜６週齢のアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒｉｅｔｙ ＳＷ Ｏｂａｎ；入手先：Nick Balaam, Sw Seed Ltd.，49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, 英国）でアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ；入手先： Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, 英国）を飼育した：２３±２℃、相対湿度６０±５％、光周期が明期：暗期＝１６：８時間。
バイオアッセイの開始１日前、飼育ケージ内から成虫を集めて、ペトリ・ディッシュ内の新しい分離アブラナ葉上に置いて、昆虫チェンバー内で一晩放置した。翌日、一齢の若虫を選んで、給餌器内に移した。給餌器には、飼料５０μＬを加えた１枚目の薄層パラフィルムＭで覆ったペトリ・ディッシュ（直径３ｃｍ）内の一齢の若虫１０匹が含まれた。チェンバーを２枚目のパラフィルムで密封して、成虫の培養と同じ条件で培養した。ｄｓＲＮＡを含む飼料を隔日で新しい飼料と交換して、８日目（バイオアッセイ開始後８日目）に昆虫の生存率を評価した。処理毎に、バイオアッセイ用の５個の給餌器（複製物）を同時に設置した。試験用ｄｓＲＮＡ、対照（ｇｆｐ）ｄｓＲＮＡ溶液を最終濃度２μｇ／μＬで飼料に加えた。給餌器を２３±２℃、相対湿度６０±５％に保ち、光周期は明期：暗期＝１６：８時間であった。GraphPad Prism version 4によってマンホイットニー検定を決め、標的２７（ＭＰ０２７）とｇｆｐ ｄｓＲＮＡとで中央値に確実な有意差があるかどうかを立証した。
バイオアッセイでは、図１に示すとおり、給餌器を使用して、標的２７（配列番号：１０６１）からの完全な裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工飼料をＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅの若虫に与えると、死亡率が有意に上昇した。標的２７、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ、飼料のみでの生存個体の平均割合は、それぞれ２、３４、および８２％であった。マンホイットニー検定を利用した標的０２７とｇｆｐ ｄｓＲＮＡとの比較では、片側Ｐ値は０．００４であり、これは標的０２７の中央値と、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡで予測される大きい方の中央値とに有意差（ｐ＜０．０５）が有ることを示唆している。標的２７ ｄｓＲＮＡを加えた液体飼料上のアカアブラムシは、飼料のみ、またはｇｆｐ ｄｓＲＮＡ対照を加えた飼料を与えたアカアブラムシよりも顕著に小さかった（データ未掲載）。
Ｄ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＧＰＡ遺伝子断片
クローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＧＰＡ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
標的遺伝子の増幅に用いた特異的プライマーの配列を表(Table)８−ＭＰに示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＭＰに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｅ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンス／センスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物の６００ｎｍでの光学濃度を測定し、新しいＬＢ培地を添加して光学濃度を１の値に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、および１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｆ．Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＧＰＡに植物を餌として与えた。ＧＰＡは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にＧＰＡを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例１１：Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ（Ｂｒｏｗｎ Ｐｌａｎｔ Ｈｏｐｐｅｒ）
Ａ．Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの部分配列のクローニング
Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの高品質な全ＲＮＡ(入手先：Dr. J. A. Gatehouse, Dept.Biological Sciences, Durham University, 英国)から、市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを生成した。
Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓのＮＬ００１、ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００４、ＮＬ００５、ＮＬ００６、ＮＬ００７、ＮＬ００８、ＮＬ００９、ＮＬ０１０、ＮＬ０１１、ＮＬ０１２、ＮＬ０１３、ＮＬ０１４、ＮＬ０１５、ＮＬ０１６、ＮＬ０１８、ＮＬ０１９、ＮＬ０２１、ＮＬ０２２、およびＮＬ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、メーカーのプロトコルに従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＮＬに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：ＮＬ００１では、９５℃５分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００２では、９５℃３分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００３では、９５℃３分、続いて９５℃３０秒、６１℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００４では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５１℃１分、７２℃１分を４０サイクル；ＮＬ００５では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００６では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃３分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００７では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分１５秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００８では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５３℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００９では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１０では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１１では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル；ＮＬ０１２では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル；ＮＬ０１３では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分１０秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１４では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１５では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分４０秒を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１６では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分４０秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１８では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分３５秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１９では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２１では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃１分４５秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２２では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分４５秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２７では、９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分４５秒を４０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクター（カタログ番号K2500-20，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＮＬに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＮＬに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．ＥＳＴ配列によるＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ ＮＬ０２３遺伝子の部分配列のクローニング
Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの高品質な全ＲＮＡ(入手先：Dr. J. A. Gatehouse, Dept.Biological Sciences, Durham University, 英国)から、市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号1808044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、プロトコルに従って、ｃＤＮＡを生成した。
Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ ｃＤＮＡから部分ｃＤＮＡ配列ＮＬ０２３を増幅させ、これは公共データベースであるＧｅｎｂａｎｋのＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ ＥＳＴ（受託番号ＣＡＨ６５６７９．２）に対応する。ＮＬ０２３遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、PerfectShotTM（商標）ExTaq（カタログ番号RR005A，Takara Bio Inc.）を使用して、プロトコルに従って、ＥＳＴ特異的配列のプライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
ＮＬ０２３については、以下の条件の２つの独立した各ＰＣＲ反応に特異的プライマーｏＧＢＫＷ００２（配列番号：１１５７）、ｏＧＢＫＷ００３（配列番号：１１５８）を使用した：９５℃３分、続いて９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号K4575-40，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。両方のＰＣＲ産物の配列決定からのコンセンサス配列は、本明細書において配列番号：１１１１と示し、ＮＬ０２３遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列は、本明細書において配列番号：１１１２と示す。
Ｃ．Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５'Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)４に示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：ＮＬ００１では、９５℃４分、続いて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００２では、９５℃４分、続いて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００３では、９４℃４分、続いて９４℃３０秒、６６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００４では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００５では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００６では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００７では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５１℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００８では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ００９では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１０では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１１では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１２では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１３では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１４では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５１℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１５では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１６では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１８では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０１９では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２１では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２２では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２３では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分；ＮＬ０２７では、９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)４−ＮＬに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）で精製した。使用説明書に従って（改変：７０％エタノールでＲＮＡ沈殿物を洗浄）、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＮＬに示している。
緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）の対照に対するＴ７プライマーによるＰＣＲ反応で使用するテンプレートＤＮＡはプラスミドｐＰＤ９６．１２（Fire Lab, http://genome-www.stanford.edu/group/fire/）であり、これには３個の合成イントロンが散在する野生型ｇｆｐコード配列が含まれる。市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用して二本鎖ＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。ｇｆｐについては、以下の条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーｏＧＡＵ１８３（配列番号：２３６）と特異的Ｔ７リバース・プライマーｏＧＡＵ１８２（配列番号：２３６）を使用してセンスＴ７テンプレートを作製した：９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件で、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーｏＧＡＵ１８１（配列番号：２３８）と特異的Ｔ７リバース・プライマーｏＧＡＵ１８４（配列番号：２３９）を使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）で精製した。使用説明書に従って（改変：７０％エタノールでＲＮＡ沈殿物を洗浄）、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムおよびイソプロパノールで精製した。結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を本明細書では配列番号：２３５と示している。
Ｄ． 液体人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓに対する活性を試験するための実験
Ｋｏｙａｍａらの記載（１９８８年）の方法［Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppers and leafhoppers (Homoptera: Delphacidae and Deltocephalidae) on a holidic diet.JARQ 22: 20-27］に多少の改変（飼料中のショ糖成分の最終濃度：１４．４％ｗ／ｖ）を加えて、Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ（ｒｉｃｅ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）用の液体人工飼料（ＭＭＤ−１）を調製した。異なる濃度の飼料成分を調製した：１０×無機物ストック（４℃保存）、２×アミノ酸ストック（−２０℃保存）、１０×ビタミン・ストック（−２０℃保存）。バイオアッセイの開始直前、ストック成分を４／３×濃度に混合させて、ｄｓＲＮＡ試験液で希釈し（４×濃度）、ｐＨ６．５に調整して、ろ過滅菌して約５００μＬ量にした。
環境管理室内（２７±２℃、相対湿度８０％、光周期が明期：暗期＝１６：８時間）で、２〜３週齢の稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｎａｔｉｖｅ １）でＲｉｃｅ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ）を飼育した。給餌器には、飼料５０μＬを加えた１枚目の薄層パラフィルムＭを覆ったペトリ・ディッシュ（直径３ｃｍ）内の一齢または二齢の若虫１０匹が含まれた。チェンバーを２枚目のパラフィルムで密封して、直射日光が無い点を除いて、成虫の培養と同じ条件で培養した。ｄｓＲＮＡを含む飼料を隔日で新しい飼料と交換して、昆虫の生存率を毎日評価した。処理毎に、バイオアッセイ用の５個の給餌器（複製物）を同時に設置した。試験用ｄｓＲＮＡ、対照（ｇｆｐ）ｄｓＲＮＡ溶液を最終濃度２μｇ／μＬで飼料に加えた。給餌器を２７±２℃、相対湿度８０％に保ち、光周期は明期：暗期＝１６：８時間であった。カプラン・マイヤー生存曲線モデルを利用して、昆虫の生存データを分析して、ログランク検定（Prism version 4.0）を利用して群間で生存率を比較した。
４つの異なるバイオアッセイで示すとおり、給餌器を使用して、無傷で、裸のｄｓＲＮＡをインビトロで添加した液体人工飼料をＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓに与えると、若虫の死亡率が有意に上昇した（図１（ａ）−（ｄ）−ＮＬ；表(Table)１ａ−ｄ−ＮＬ）。これらの結果から、異なる必須ＢＰＨに対応するｄｓＲＮＡがｒｉｃｅ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒに対して有意な毒性を有することが実証された。
これらのバイオアッセイにおいてＢＰＨに及ぼすｇｆｐ ｄｓＲＮＡの影響は、飼料のみでの生存率とは異なった。
表(Table)１０ａ−ｄ−ＮＬには、以下の標的を２ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）添加した人工飼料におけるＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの生存率をまとめている：表(Table)１０（ａ）−ＮＬ：ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００５、ＮＬ０１０；表(Table)１０（ｂ）−ＮＬ：ＮＬ００９、ＮＬ０１６；表(Table)１０（ｃ）−ＮＬ：ＮＬ０１４、ＮＬ０１８；表(Table)１０（ｄ）−ＮＬ：ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０２１。生存率分析カラムにおいて、ＲＮＡｉの効果は以下の通りに示す。＋＝：ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ対照との比較で、生存率の有意な低下（α＜０．０５）；−＝：ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ対照との比較で、有意差なし。ログランク検定を利用して、生存曲線を比較した（飼料のみ、と試験ｄｓＲＮＡ、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡを添加した飼料、そして飼料のみとｇｆｐ ｄｓＲＮＡ）。
Ｅ．人工飼料を使用した、異なる濃度のｄｓＲＮＡ標的のＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓに対する活性のスクリーニング実験
異なる濃度（最終濃度：１、０．２、０．０８、および０．０４ｍｇ／ｍＬ）の標的ＮＬ００２ ｄｓＲＮＡを添加した液体人工飼料５０μＬをｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒの給餌器に用いた。ｄｓＲＮＡを含む飼料を隔日で新しい飼料と交換して、昆虫の生存率を毎日評価した。処理毎に、バイオアッセイ用の５個の給餌器（複製物）を同時に設置した。給餌器を２７±２℃、相対湿度８０％に保ち、光周期は明期：暗期＝１６：８時間であった。カプラン・マイヤー生存曲線モデルを利用して、昆虫の生存データを分析して、ログランク検定（Prism version 4.0）を利用して生存率を群間比較した。
標的ＮＬ００２の無傷で、裸のｄｓＲＮＡを異なる濃度で添加した人工飼料を与えると、図２−ＮＬおよび表(Table)９−ＮＬに示すように、飼料のみでの生存率と比較して、最終濃度０．０４ｍｇ ｄｓＲＮＡ／ｍＬ飼料という低濃度でＢＰＨの死亡率が有意に高まった。表(Table)９−ＮＬには、標的ＮＬ００２を１、０．２、０．０８、および０．０４ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）添加した人工飼料におけるＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの生存率をまとめている。生存率分析カラムにおいて、ＲＮＡｉの効果は以下の通りに示す。＋＝：飼料のみの対照との比較で、生存率の有意な低下（α＜０．０５）；−＝：飼料のみの対照との比較で、有意差なし。ログランク検定を利用して、生存曲線を比較した。
Ｆ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＢＰＨ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＢＰＨ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターや細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＮＬに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００と名付けた。
Ｇ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｈ．Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を検証するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＢＰＨに植物を餌として与えた。ＢＰＨは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にＢＰＨを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例１０：Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅｄ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ）
Ａ．ファミリーＰＣＲによるＣｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓの遺伝子の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、異なる４幼虫期のＣｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅｄ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700， Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
ＣＳ００１、ＣＳ００２、ＣＳ００３、ＣＳ００６、ＣＳ００７、ＣＳ００９、ＣＳ０１１、ＣＳ０１３、ＣＳ０１４、ＣＳ０１５、ＣＳ０１６、およびＣＳ０１８遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＣＳに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分を４０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ２５００−２０，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＣＳに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＣＳに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＣＳに示している。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＣＳに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＣＳに示している。
Ｃ．人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＣｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓの幼虫に対する活性を試験するための実験
Kamano & Satoの記載の改変人工飼料においてＣｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅｄ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒｓ， 入手先：Syngenta, Stein, Switzerland）を維持した（Handbook of Insect Rearing.Volumes I & II.P Singh and RF Moore, eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam and New York, 1985, pp 448）。簡単に説明すると、以下の通りに飼料１Ｌを調製した：アガー２０ｇをＭｉｌｌｉ−Ｑ水９８０ｍＬに添加して、オートクレーブした。アガー溶液を約５５℃に冷却させて、残り成分を加えて、十分に混合させた：トウモロコシ粉（Ｐｏｌｅｎｔａ）４０ｇ、セルロース２０ｇ、ショ糖３０ｇ、カゼイン３０ｇ、小麦麦芽（トースト）２０ｇ、ウェッソン塩混合物８ｇ、Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔのビタミン混合物１２ｇ、ソルビン酸１．８ｇ、ニパギン（Ｎｉｐａｇｉｎ：メチルパラベン）１．６ｇ、オーレオマイシン０．３ｇ、コレステロール０．４ｇ、Ｌ−システイン０．６ｇ。飼料を４５℃に冷却して、飼育トレイまたはカップに注いだ。水平層流キャビン内に飼料を放置した。成虫の蛾を入れているケージから産卵された卵の付着した稲葉切片を取り出して、飼育用カップまたはトレイ内の固形飼料に固定させた。卵を孵化させて、バイオアッセイにおよび昆虫培養の維持に新生幼虫を利用可能であった。試験および飼育中、条件は、２８±２℃、相対湿度８０±５％、光周期は明期：暗期＝１６：８時間であった。
同じ人工飼料をバイオアッセイに使用したが、この場合、飼料を２４ウェル・プレートに均等に注ぎ、各ウェルには飼料１ｍＬが含まれた。飼料を設置すると直ぐに、試験用調剤５０μＬを（１μｇ／μＬの標的のｄｓＲＮＡ）を飼料の表面（２ｃｍ２）に適用した。ｄｓＲＮＡ溶液は乾燥させて、各ウェルに一齢の蛾の幼虫を置いた。７日後、マルチウェル・プレート内の新しい処理済み飼料に幼虫を移した。１４日後（バイオアッセイ開始後１４日目）、昆虫の生死個体数を記録して、以上を調べた。処理毎に、幼虫計２４匹を試験した。
処理済み稲をニカメイガの新生幼虫に与える代替バイオアッセイを実施した。インディカ米品種Ｔａｉｃｈｕｎｇ ｎａｔｉｖｅ １の小葉切片を、１μｇ／μＬの標的ｄｓＲＮＡを含む０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に浸し、乾燥させて、ゲル化２％アガーを含む２４マルチウェル・プレートの１ウェルに各切片を置いた。飼育トレイから各ｄｓＲＮＡ処理済み葉切片に新生幼虫２匹を移した（２４匹／処理）。４、８日間後、新鮮な処理済み稲切片に幼虫を移した。４、８、および１２日目に幼虫の生死個体数を評価し、異常も記録した。
Ｄ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＳＳＢ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＳＳＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＣＳに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｅ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｆ．Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＳＳＢに植物を餌として与えた。ＳＳＢは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物上にＳＳＢを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例９：Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）
Ａ．Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａの部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、異なる全ての幼虫期のＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ；入手先：Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, 英国ウェールズ）から無傷の高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
ＰＸ００１、ＰＸ００９、ＰＸ０１０、ＰＸ０１５、ＰＸ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＰＸに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分（ＰＸ００１、ＰＸ００９、ＰＸ０１５、ＰＸ０１６）；９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５４℃１分、７２℃２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分（ＰＸ０１０）。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ２５００−２０，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＰＸに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＰＸに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５'Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＰＸに示している。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒（１サイクルごとに温度を０．５℃下げる）、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＰＸに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＰＸに示している。
Ｃ．人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＰｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａの幼虫に対する活性を試験するための実験
Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）はInsect Investigations Ltd.で維持した（入手先：Newcastle University,Newcastle-upon-Tyne，英国）。キャベツ葉で昆虫を飼育した。一齢の雌雄同体幼虫（１日齢前後）を試験用に選んだ。エッペンドルフ・チューブ（容積１．５ｍＬ）内で昆虫を維持した。使用説明書に従って調製した、市販のコナガ用飼料（Bio-Serv，米国ニュージャージー州）を各チューブのフタ内に置いた（容積０．２５ｍＬ、直径８ｍｍ）。まだ液状のうちに、飼料を平らにして、余分を除いて、表面を平らにした。
飼料を設置すると直ぐに、試験製剤を飼料表面に適用した（複製物当たり未希釈製剤２５μＬ（１μｇ／μＬ ｄｓＲＮＡ標的））。試験製剤を乾燥させて、一齢の蛾の幼虫を各チューブ内に置いた。フタ内の飼料表面に幼虫を置いて、注意深くチューブを閉じた。チューブを逆さまにしてフタを下にして保存し、各幼虫が飼料表面にいるままにした。週２回、幼虫を新しい飼料の入った新しいエッペンドルフ・チューブに移した。試験の最初の２週間、昆虫に処理済み飼料を与え、その後は未処理飼料を与えた。
計３８日間にわたり週２回、評価を実施し、３８日目には全ての幼虫が死んでいた。各評価において、昆虫の生死を評価し、異常を調べた。各処理について、単一の幼虫で４０回繰り返した。試験中、試験条件は２３〜２６℃、相対湿度５０〜６０％、光周期は明期：暗期＝１６：８時間であった。
Ｄ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌産生に適したベクター内でのＤＢＭ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＤＢＭ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８−ＰＸに示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＰＸに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｅ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｆ．Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＤＢＭに植物を餌として与えた。ＤＢＭは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物上にＤＢＭを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例１２：Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（イエコオロギ）
Ａ．Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、異なる全ての昆虫期のＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（イエコオロギ；入手先：Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, 英国ウェールズ）から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号18080044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
ＡＤ００１、ＡＤ００２、ＡＤ００９、ＡＤ０１５、ＡＤ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を実施した。
各遺伝子の増幅に使用する変性プライマーの配列を表(Table)２−ＡＤに示している。以下の条件の各ＰＣＲ反応にこれらのプライマーを使用した：９５℃１０分、続いて９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃７分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製して、ｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクター（カタログ番号K2500-20，Invitrogen社）にクローニングして、塩基配列を決定した。表(Table)２−ＡＤに示すように、結果として得たＰＣＲ産物の配列を各配列番号で示し、部分配列と呼ぶ。表(Table)３−ＡＤに示すように、対応する部分アミノ酸配列を各配列番号で示した。
Ｂ．Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ遺伝子のｄｓＲＮＡ産生
市販のキットT7 Ribomax（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に、２つの別々のＰＣＲ反応において２つ別々の５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはＴ７プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
各標的遺伝子について、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＡＤに示している。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒（１サイクルごとに温度を０．５℃下げる）、７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。上記と同じ条件のＰＣＲ反応において、特異的Ｔ７フォーワード・プライマーおよびリバース・プライマーを使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。各標的遺伝子のアンチセンス・テンプレート増幅用の各プライマーの配列を表(Table)８−ＡＤに示している。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、転写させ、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。各標的遺伝子について、結果として得たｄｓＲＮＡのセンス鎖を表(Table)８−ＡＤに示している。
Ｃ．人工飼料を使用した、ｄｓＲＮＡ標的のＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの幼虫に対する活性を試験するための実験
Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（イエコオロギ）はInsect Investigations Ltd.で維持した（入手先：Blades Biological Ltd.，英国ケント週）。キャベツ葉で昆虫を飼育した。試験に使用するために、同じ大きさで、５日齢以上の雌雄同体の若虫を選んだ。二本鎖ＲＮＡを小麦ベースのネズミ用小麦ペレット飼料と混ぜた（ラット／マウス用の標準食、B & K Universal Ltd., Grimston,Aldbrough, Hull 英国）。飼料（ＢＫ００１Ｐ）には、重量順に、以下の成分が含まれる：小麦、大豆、小麦食、大麦、ペレット結合剤、ネズミ用５ビタミン、脂肪混合物、リン酸二カルシウム、カビ炭水化物。ネズミ用のペレット飼料を粉砕して、電子レンジで熱処理して、酵素成分を不活化させた後、混合させた。全てのネズミ用飼料を同じバッチから取ることで、一貫性を保証した。粉砕した飼料とｄｓＲＮＡを十分に混合させて、同じ重さの小ペレットに成形させて、室温で一晩乾燥させた。
標的およびｇｆｐ対照からの二本鎖ＲＮＡサンプル（濃度１０μｇ／μＬ）を粉砕飼料１ｇにｄｓＲＮＡ溶液１ｍＬの割合で適用することで、ペレット１ｇ当たり１０ｍｇのｄｓＲＮＡという割合にした。毎週、ペレットを交換した。試験の最初３週間にわたり、処理済みペレットを昆虫に与えた。その後、未処理ペレットを与えた。ふた付きプラスチック容器（直径９センチ、深さ４．５センチ）１個当たり昆虫１０匹を保持した。各領域には、処理済み餌ペレット１個と水源１個（湿らせた球状脱脂綿）が含まれ、それぞれを別々の小さな検量ボートに置いた。実験を通して、適宜、水を補給した。
対照の全ての昆虫が死ぬか、または脱皮して成虫になるまで、週２回間隔で評価を行った（８４日間で評価間隔は４日以内）。各評価において、昆虫の生死を評価し、異常を検査した。４６日目以降、成虫への脱皮が始まると直ぐに、全ての昆虫（生死を問わず）について、若虫、成虫いずれであるのかを評価した。試験の５５日目、生き残った昆虫の重量を測った。各処理について４回繰り返した。試験中、試験条件は２５〜３３℃、相対湿度２０〜２５％、そして光周期が明期：暗期＝１２：１２時間であった。
Ｄ．昆虫−活性化二本鎖ＲＮＡの細菌生産に適したベクター内でのＨＣ遺伝子断片のクローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖ＲＮＡ発現ベクター内へのＨＣ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片のクローニングの例であり、もっともＴ７プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる（ＷＯ第０００１８４６号参照）。
増幅に使用した特異的プライマーの配列を表(Table)８に示している。使用したテンプレートは、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。以下の条件のＰＣＲ反応においてプライマーを使用した：９８℃５分、続いて９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル、続いて７２℃１０分。結果として得たＰＣＲ断片をアガロースゲル（QIAquick Gel Extraction kit，カタログ番号28706，Qiagen社）で分離・精製し、平滑末端にしてＳｒｆ Ｉで線形化したｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ第００１８８１２１Ａ１号）にクローニングして、配列を決定した。結果として得たＰＣＲ産物の配列は、表(Table)８−ＡＤに示す各配列に対応する。この配列を保有する組み換えベクターをｐＧＢＮＪ００ＸＸと名付けた。
Ｅ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
Ｆ．Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験
植物バイオアッセイ
化学誘発性のｄｓＲＮＡ発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、ＨＣに植物を餌として与えた。ＨＣは植物生育室内で生育させた。５００ｍＬプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物上にＨＣを置いた。ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを保有する大腸菌ＡＢ３０９−１０５の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した：例、６６、２２、および７ユニット（ここで１ユニットは波長６００ｎｍで光学濃度１の細菌懸濁液１ｍＬ中の１０９個の細菌と定義する）。それぞれの場合で、気化器を使用して総量１〜１０ｍＬを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に１植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
ｐＧＢＮＪ００３から標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の懸濁液を植物に噴霧することで、ｐＧＮ２９の対照と比較して、昆虫の致死率が劇的に上昇した。これらの実験では、昆虫の致死率および生き残った幼虫での成長／発生の遅延における大幅な上昇という観点から、野生型またはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現系において産生させた昆虫遺伝子の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、昆虫に対して有毒であることが示された。これらの実験から、昆虫の遺伝子標的に対応する二本鎖ＲＮＡを発現する細菌から成る製剤のスプレーを利用することで、植物／作物を昆虫による損傷から効果的に保護できることが例示されることも明らかである。
実施例１３：イモチ菌（イネイモチ病）
Ａ．イモチ菌の部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）を使用して、使用説明書に従って、異なる成長期のイモチ菌から完全な高品質ＲＮＡを単離した。使用説明書に従ったＤＮａｓｅ（カタログ番号1700，Promega社）処理によってＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（SuperScriptTM（商標）III Reverse Transcriptase，カタログ番号1808044，Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル）使用して、使用説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
標的遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Amplitaq Gold（カタログ番号N8080240，Applied Biosystems社）を使用して、使用説明書に従って、変性プライマーによるＰＣＲを実施した。結果として得たＰＣＲ産物を分画して、配列を決定した。
Ｂ．イモチ菌遺伝子のｄｓＲＮＡ生産
市販のキットT7 RibomaxTM（商標）Express RNAi System（カタログ番号P1700、Promega社）を使用してミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。結果として得たＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiaquick PCR Purification Kit，カタログ番号28106，Qiagen社）およびＮａＣｌＯ４沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したＴ７フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、結果として得たＲＮＡ鎖をアニーリングさせて、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理して、酢酸ナトリウムで精製した。
Ｃ．２種の大腸菌株（１）ＡＢ３０９−１０５、および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ標的の発現および産生
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖ＲＮＡを適切なレベルにまで発現させた。野生型ＲＮａｓｅＩＩＩ保有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）との比較で、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０９−１０５を使用した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
３００ｎｇのプラスミドを加えて、氷冷させた５０μＬの化学コンピテント大腸菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートさせて、３７℃、５分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に５分間氷上に戻した。室温のＳＯＣ培地４５０μＬをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー（２５０ｒｐｍ）で３７℃、１時間培養させた。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン抗生物質を添加したＬＢ培地１５０ｍＬの入った５００ｍＬ三角フラスコに細菌懸濁液１００μＬを移した。３７℃のInnova 4430シェーカー（２５０ｒｐｍ）で一晩（１６〜１８時間）培養物を培養した。
ＡＢ３０９−１０５およびＢＬ２１（ＤＥ３）における二本鎖ＲＮＡ発現の化学誘導
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株ＡＢ３０９−１０５またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組み換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの二本鎖ＲＮＡの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で、反対方向のＴ７プロモーターに挟まれているため、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
適切な分光光度計を使用して細菌の一晩培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、新しいＬＢ培地を添加して値を１に調整した。この培養物５０ｍＬを５０ｍＬファルコン・チューブに移して、培養物を３０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離させた。上精を除去して、細菌沈殿物を１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した新しいＳ完全培地（５μｇ／ｍＬコレステロール添加ＳＮＣ培地）５０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で２〜４時間、細菌に誘導をかけた。
細菌の熱処理
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、ＲＮＡ干渉のため、二本鎖ＲＮＡ発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を８０℃の水浴に２０分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を１．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−２０℃で保存した。
ｄｓＲＮＡ処理済みマメ葉ディスク上でのＥ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの幼虫の生存率１μｇ／μＬのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐ対照）の局所適用液剤２５μＬで処理したマメ葉ディスクを新生幼虫に与えた。２日後、新しいｄｓＲＮＡ処理済み葉ディスクに昆虫を移した。４日目、処理から幼虫を回収して、新しい未処理のマメ葉を含むプラスチックボックスに入れた。２、４、６、８、および１０日目に昆虫の死亡率を算定した。０日目（分析試験の開始日）との比較で、幼虫の生存率を算出した。標的５：配列番号：５７６、標的１０：配列番号：５８６、標的１５：配列番号：５９１、標的１６：配列番号：５９６、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号：２３５。 ｄｓＲＮＡ処理した人工飼料でのコロラドハムシ（Ｌ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）の生存率 ｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐ対照）の局所適用液剤５０μＬで処理した飼料を第２幼虫期の昆虫に与えた。７日後、飼料を、局所適用ｄｓＲＮＡを含む新しい飼料と交換した。昆虫の生存個体数を２、５、７、８、９、および１３日目に算定した。０日目（分析開始）との比較で、幼虫の生存率を算出した。標的ＬＤ００６：（配列番号：１７８）、標的ＬＤ００７（配列番号：１８３）、標的ＬＤ０１０（配列番号：１８８）、標的ＬＤ０１１（配列番号：１９３）、標的ＬＤ０１４（配列番号：１９８）、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（配列番号：２３５）。 Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅの若虫の生存率に及ぼす摂取した標的２７のｄｓＲＮＡの作用 ２μｇ／μＬのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐ対照）の液状飼料５０μＬを含む給餌器内に初齢幼虫を入れた。処理ごとに、各給餌器内に初齢幼虫１０匹と共に５個の給餌器を設置した。バイオアッセイの開始後８日目に生存個体数を算定した。エラーバーは標準偏差を示す。標的ＭＰ０２７：配列番号１０６１、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。 ｄｓＲＮＡ処理済み液体人工飼料上でのＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの生存率 別々のバイオアッセイにおいて、２ｍｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡ標的溶液を添加した飼料を第１、２幼生期の若虫に与えた：（ａ）ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００５、ＮＬ０１０、（ｂ）ＮＬ００９、ＮＬ０１６、（ｃ）ＮＬ０１４、ＮＬ０１８、（ｄ）ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０２１。昆虫の生存率を、飼料のみ、および同濃度のｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（対照）を含む飼料での生存率と比較した。２日ごとにｄｓＲＮＡを含む新しい飼料と交換した。昆虫の生存個体数を毎日算定した。 同上 同上 同上 Ｐ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅの幼虫の生存率および増殖に及ぼす摂取した標的二本鎖ＲＮＡの作用 新生幼虫に０．１μｇ／μＬ ｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐ対照）の局所適用液剤２５μＬで処理したアブラナ葉ディスクを与えた。２日後、新しいｄｓＲＮＡ処理済み葉ディスクに昆虫を移した。４日目、各処理の複製物１枚から幼虫を回収して、新しい未処理アブラナ葉を含むペトリ皿に入れた。２、４、７、９、および１１日目に昆虫を算定した。（ａ）ｄｓＲＮＡ処理済みアブラナ葉ディスク上でのＥ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの幼虫の生存率 ０日目（分析試験の開始日）との比較で、幼虫の生存率を算出した。（ｂ）ｄｓＲＮＡ処理済みアブラナ葉ディスク上でのＰ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅの幼虫の平均重量。各複製物の昆虫の重量を一緒に測り、幼虫毎に平均重量を決定した。エラーバーは標準偏差を示す。標的１：配列番号：４７３、標的３：配列番号：４７８、標的５：配列番号：４８３、標的１０：配列番号：４８８、標的１４：配列番号：４９３、標的１６：配列番号：４９８、標的２７：配列番号：５０３、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号：２３５． 同上 標的１４のｄｓＲＮＡで処理した人工飼料上でのＴ．ｃａｓｔａｎｅｕｍの幼虫の生存率 標的１４のｄｓＲＮＡを含む小麦粉／ミルク混合飼料を新生幼虫に与えた。対照では、飼料中に水（ｄｓＲＮＡなし）が含まれた。各処理について、４つ複製物（初齢幼虫１０匹／複製物）を作製した。６、１７、３１、４５、および６０日目に平均割合として昆虫の生存率を算定した。０日目（分析試験の開始日）との比較で、幼虫の生存率を算出した。エラーバーは標準偏差を示す。標的ＴＣ０１４：配列番号：８７８。 Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫の生存率、およびｓｎａｐ ｂｅａｎ ｆｏｌｉａｒ ｉｎｓｅｃｔ損傷に対する耐性に及ぼす摂取した標的二本鎖ＲＮＡの作用。（ａ）ｄｓＲＮＡ処理済みマメ葉ディスク上でのＥ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫の生存率 ０．１μｇ／μＬのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐ対照）の局所適用液剤７５μＬで処理したマメ葉ディスクを成虫に与えた。２４時間後、新しいｄｓＲＮＡ処理済み葉ディスクに昆虫を移した。更に２４時間後、各処理の成虫を回収して、新しい未処理の鉢植えマメ植物全体を含むプラスチックボックスに入れた。４、５、６、７、８、および１１日目に昆虫の死亡率を算定した。０日目（分析試験の開始日）との比較で、成虫の生存率を算出した。標的１０：配列番号：５８６、標的１５：配列番号：５９１、標的１６：配列番号：５９６、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ：配列番号：２３５。 Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫の生存率、およびｓｎａｐ ｂｅａｎ ｆｏｌｉａｒ ｉｎｓｅｃｔ損傷に対する耐性に及ぼす摂取した標的二本鎖ＲＮＡの作用。（ｂ） Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫を原因とするマメ葉損傷に対するｄｓＲＮＡによる耐性。９日目に、１つ処理での昆虫を含む全植物体（（ａ）参照）における葉の損傷を調べた。（ｉ）標的１０、（ｉｉ）標的１５ Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫の生存率、およびｓｎａｐ ｂｅａｎ ｆｏｌｉａｒ ｉｎｓｅｃｔ損傷に対する耐性に及ぼす摂取した標的二本鎖ＲＮＡの作用。（ｂ） Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫を原因とするマメ葉損傷に対するｄｓＲＮＡによる耐性。９日目に、１つ処理での昆虫を含む全植物体（（ａ）参照）における葉の損傷を調べた。（ｉｉｉ）標的１６、（ｉｖ） ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫の生存率、およびｓｎａｐ ｂｅａｎ ｆｏｌｉａｒ ｉｎｓｅｃｔ損傷に対する耐性に及ぼす摂取した標的二本鎖ＲＮＡの作用。（ｂ） Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓの成虫を原因とするマメ葉損傷に対するｄｓＲＮＡによる耐性。９日目に、１つ処理での昆虫を含む全植物体（（ａ）参照）における葉の損傷を調べた。（ｖ）未処理 ｄｓＲＮＡ処理した人工飼料でのＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの生存率 ｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐ対照）の局所適用液剤５０μＬで処理した飼料を第２幼虫期の昆虫に与えた。７日後にのみ、飼料を新しい飼料と交換した。昆虫の生存個体数を２、５、６、７、８、９、１２、および１４日目に算定した。０日目（分析開始）との比較で、幼虫の生存率を算出した。標的ＬＤ００１（配列番号：１６３）、標的ＬＤ００２（配列番号：１６８）、標的ＬＤ００３（配列番号：１７３）、標的ＬＤ０１５（配列番号：２１５）、標的ＬＤ０１６（配列番号：２２０）、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（配列番号：２３５）。 異なる濃度の標的ｄｓＲＮＡ ＮＬ００２で処理した液体人工飼料上でのＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓの生存率 １、０．２、０．０８、および０．０４ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）のＮＬ００２を添加した飼料を第１、２幼生期の若虫に与えた。２日ごとにｄｓＲＮＡを含む新しい飼料と交換した。昆虫の生存個体数を毎日算定した。 （ａ）標的ＰＣ０１０、（ｂ）標的ＰＣ０２７の異なる濃度のｄｓＲＮＡで処理したアブラナ葉ディスク上でのＰ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅの生存率 ｄｓＲＮＡの局所適用液剤２５μＬで処理した葉ディスク上に新生幼虫を置いた。２日目に新しい処理済み葉ディスクに昆虫を移した。標的ＰＣ０１０については４日目、ＰＣ０２７については５日目に、新しい処理済み葉ディスクに昆虫を移した。ＰＣ０１０については２、４、７、８、９、および１１日目、ＰＣ０２７については２、５、８、９、および１２日目に昆虫の生存個体数を算定した。０日目（分析試験の開始日）との比較で、幼虫の生存率を算出した。 同上 ｄｓＲＮＡで処理したジャガイモ葉のディスク上でのＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ幼虫の平均重量。第２幼虫期の昆虫にｄｓＲＮＡ（標的ＬＤ００２またはｇｆｐ）の局所適用液剤（１０ｎｇ／μＬ）２０μＬで処理した葉ディスクを餌として与えた。２日後、昆虫を未処理の葉に毎日移した。 マスタードハムシ（Ｐ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ）の幼虫の生存率に及ぼすｄｓＲＮＡ標的ＰＣ０１０発現大腸菌株ＡＢ３０９−１０５の作用 各処理のデータポイントは、３つの異なる複製物での平均死亡率を表す。エラーバーは標準偏差を示す。標的１０：配列番号：４８８ より短い標的ＬＤ０１４ ｄｓＲＮＡおよびコンカテマーｄｓＲＮＡで処理した人工飼料でのＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの生存率 第２幼虫期の昆虫にｄｓＲＮＡ（ｇｆｐまたは標的）の局所適用液剤５０μＬで処理した葉ディスクを与えた。昆虫の生存個体数を３、４、５、６、および７日目に算定した。０日目（分析開始）との比較で、幼虫の生存率を算出した。 標的ＬＤ００２（ａ）、標的ＬＤ００７（ｂ）、標的ＬＤ０１０（ｃ）、標的ＬＤ０１１（ｄ）、標的ＬＤ０１４（ｅ）、標的ＬＤ０１５（ｆ）、ＬＤ０１６（ｇ）、および標的ＬＤ０２７（ｈ）に対する様々な濃度のｄｓＲＮＡで処理した人工飼料でのＬ． ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの幼虫の生存率 ｄｓＲＮＡの局所適用液剤５０μＬで処理した飼料を第２幼虫期の昆虫に与えた。７日後、局所適用ｄｓＲＮＡを含む新しい飼料と交換した。昆虫の生存個体数を一定間隔で算出した。０日目（分析開始）との比較で、幼虫の生存率を算出した。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 コロラドハムシの幼虫の生存率に及ぼすｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０発現大腸菌株の経時的作用 別々の人工飼料でのバイオアッセイにおいて２種の菌株を試験した：（ａ） ＡＢ３０９−１０５；ｐＧＢＮＪ００３およびｐＧＮ２９のデータポイントは、異なる５種の細菌クローンでの平均死亡率を示しており、（ｂ） ＢＬ２１（ＤＥ３）；ｐＧＢＮＪ００３およびｐＧＮ２９のデータポイントは、異なる５種の細菌クローンおよび単一の細菌クローンでの平均死亡率の値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 同上 コロラドハムシの幼虫の生存率に及ぼす異なるクローンのｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０発現大腸菌株（（ａ） ＡＢ３０９−１０５および（ｂ） ＢＬ２１（ＤＥ３））の侵入後１２日目での作用 データポイントはｐＧＮ２９およびｐＧＢＮＪ００３の各クローンでの平均死亡率の値である。この時間点では、プラスミドｐＧＢＮＪ００３を保有するＡＢ３０９−１０５のクローン１でＣＰＢ に対する死亡率１００％が示された。エラーバーは標準偏差を示す。 同上 コロラドハムシの幼虫の増殖および発生に及ぼす異なるクローンのｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０発現大腸菌株（（ａ） ＡＢ３０９−１０５および（ｂ） ＢＬ２１（ＤＥ３））の侵入後７日目での作用 データポイントは、表１０のデータに基づく、各クローン（ｐＧＮ２９の１クローンおよびｐＧＢＮＪ００３の５クローン）での幼虫の平均重量の値（％）である。飼料のみでの処理は、正常な幼虫の重量（１００％）を示す。 同上 二本鎖ＲＮＡ産生細菌を噴霧したジャガイモにおける侵入後７日目でのコロラドハムシの幼虫の生存率 幼虫の生存個体数を数えて、死亡率（％）で表した。使用した宿主菌株は、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株のＡＢ３０９−１０５であった。昆虫の標的遺伝子はＬＤ０１０であった。 ｄｓＲＮＡ産生細菌を噴霧したジャガイモを与えた、侵入後１１日目に生き残っていたコロラドハムシの幼虫での増殖／発生の遅延。使用した宿主菌株は、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株のＡＢ３０９−１０５であった。正常な幼虫の重量（％）で示されたデータ数値；飼料のみでの処理を正常な幼虫の重量（１００％）とした。昆虫の標的遺伝子はＬＤ０１０であった。エラーバーは標準偏差を示す。 二本鎖ＲＮＡ産生細菌による、侵入後７日目でのコロラドハムシの幼虫によるジャガイモ損傷に対する耐性。左：ｐＧＮ２９プラスミドを含む７単位のＡＢ３０９−１０５細菌を噴霧された植物；右：ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを含む７単位のＡｂ３０９−１０５細菌を噴霧された植物。１単位は、６００ｎｍでＯＤ値が１である細菌懸濁液１ｍＬの同等物と定義する。昆虫の標的遺伝子はＬＤ０１０であった。 ｄｓＲＮＡ処理したジャガイモ葉ディスクでのＬ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの成虫の生存率 最初２日間は若齢成体の成虫に二本鎖ＲＮＡ処理した葉ディスクを与えて、次に未処理のジャガイモ葉に置いた。昆虫の生存個体数を定期的に算定した。動く昆虫は、生きており、普通に動くと思われる昆虫と記録した。瀕死の状態にある昆虫は、生きているが、病気であり、動きが緩慢に見える昆虫と記録した。これらの昆虫はひっくり返されても自分で戻ることができなかった。標的ＬＤ００２（配列番号：１６８）、標的ＬＤ０１０（配列番号：１８８）、標的ＬＤ０１４（配列番号：１９８）、標的ＬＤ０１６（配列番号：２２０）、ｇｆｐ ｄｓＲＮＡ（配列番号：２３５）。 Ｌ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの幼虫に対して細菌が産生した標的二本鎖ＲＮＡの作用 熱処理済みのｄｓＲＮＡ（配列番号：１８８）発現細菌の懸濁液（ＯＤ１）５０μＬを４８ウェル・プレートの各ウェル内の固形人工飼料上に局所適用した。第２幼虫期のＣＰＢ幼虫を各ウェルに入れた。７日目、（ａ）標的１０二本鎖ＲＮＡ発現細菌を含む飼料、（ｂ）空のｐＧＮ２９ベクターを有する細菌を含む飼料、そして（ｃ）飼料のみを含むプレート内でＣＰＢ幼虫の写真を撮影した。 同上 同上 昆虫侵入の前にジャガイモの葉に局所適用した、プラスミドｐＧＢＮＪ００３を有する異なる量の不活化大腸菌ＡＢ３０９−１０５株のＣＰＢ幼虫の生存率と成長に及ぼす作用 第１幼虫期の幼虫１０匹に７日間、処理済みジャガイモを与えた。植物に噴霧した細菌懸濁液の量：０．２５ Ｕ、０．０８ Ｕ、０．０２５ Ｕ、０．００８ Ｕの標的１０および０．２５ＵのｐＧＮ２９（陰性対照であるＭｉｌｌｉ−Ｑ水も含まれる）。１単位（Ｕ）は、培養液１ｍＬ（６００ｎｍでＯＤ＝１）中に存在する細菌量に等しい量と定義する。総量１．６ｍＬを植物に噴霧した。昆虫の標的遺伝子はＬＤ０１０であった。 侵入後７日目、プラスミドｐＧＢＮＪ００３を有する不活化大腸菌ＡＢ３０９−１０５株による、ＣＰＢ幼虫を原因とするジャガイモ損傷に対する耐性化。（ａ）水、（ｂ）ｐＧＮ２９を有する０．２５ Ｕの大腸菌ＡＢ３０９−１０５、（ｃ）ｐＧＢＮＪ００３を有する０．０２５Ｕの大腸菌ＡＢ３０９−１０５、（ｄ）ｐＧＢＮＪ００３を有する０．００８Ｕの大腸菌ＡＢ３０９−１０５。１単位（Ｕ）は、培養液１ｍＬ（６００ｎｍでＯＤ＝１）中に存在する細菌量に等しい量と定義する。総量１．６ｍＬを植物に噴霧した。昆虫の標的遺伝子はＬＤ０１０であった。 同上

Claims (14)

  1. アニーリングした相補鎖を含む二本鎖ＲＮＡであって、少なくとも二本鎖のうちの一方の鎖は
    （ｉ）配列番号２１０４、２１１４、２１７８〜２１９４、２３１１〜２３１４、２３４９、２３５１または２３５２からなる配列のいずれかの標的遺伝子の少なくとも２１個の連続ヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
    （ｉｉ）配列番号２１０５で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも２１個の連続ヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、および
    （ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリリボヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性があるポリリボヌクレオチド、
    からなる群から選択されるポリリボヌクレオチドを含むものであり、該二本鎖ＲＮＡは該標的遺伝子の発現を阻害するものである、二本鎖ＲＮＡ。
  2. 植物害虫が二本鎖ＲＮＡを摂取することにより該害虫の増殖を抑制する、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  3. 請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された細胞。
  5. 細胞が、細菌、酵母、または藻類細胞である、請求項４の細胞。
  6. 請求項５の細胞を含む食品。
  7. 食品が、貯蔵穀物、ペットフードおよび粉末チョコレートからなるグループから選択される、請求項６の食品。
  8. 請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡを含む組成物。
  9. 組成物が、スプレー、粉剤、ペレット剤、ゲル、カプセル剤、食品、衣服袋および本からなるグループから選択されるものに使用される、請求項８の組成物。
  10. 請求項８または９に記載の組成物を害虫にさらすことを含む、害虫の侵入（ヒトへの侵入を除く）を抑制する方法。
  11. 請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡを含む殺虫剤。
  12. 請求項８または９に記載の組成物で対象物を処理することを含む、害虫の侵入（ヒトへの侵入を除く）から対象物を保護する方法。
  13. 対象物が、木材、木、製本、布および食品貯蔵容器からなるグループから選択される、請求項１２の方法。
  14. 昆虫の侵入（ヒトへの侵入を除く）を予防または処理するための、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１もしくは２に記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項４もしくは５に記載の細胞、請求項８もしくは９に記載の組成物、または請求項１１に記載の殺虫剤の使用。
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