JP5530632B2 - RNAiを使用した害虫の抑制方法 - Google Patents
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Description
本発明は、全般的には害虫侵入の遺伝子制御に関する。より具体的には、本発明は、害虫標的コード配列の発現を抑制する、もしくは阻害するための組み換え技術に関連するものである。
昆虫や他の害虫は、かみ傷または刺し傷で損傷および更には死亡の原因にすらなり得る。また、多くの害虫によって、病気の原因となる細菌類や他の病原体が感染する。例えば、蚊によって、マラリア、黄熱病、脳炎などの病気の原因となる病原体が感染する。腺ペスト、すなわち黒死病は、ラットなどのげっ歯類に感染する細菌が原因となる。極微の害虫の侵入を抑制するための組成物が、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌組成物という形で提供されてきた。線形動物や昆虫などの害虫の侵入を抑制するための方法は、一般に、害虫が存在する表面に塗る化学組成物という形であるか、またはペレット剤、粉末剤、錠剤、ペースト剤、カプセル剤という形で感染動物に投与されてきた。
Zamore、Pら、Cell 101:25-33 (2000) Fire、Aら、Nature 391:806 (1998) Hamiltonら、Science 286、950-951 (1999) Linら、Nature 402:128-129 (1999) Hammondら、Nature 404、293 (2000) Elbashir ら、Genes Dev., 15, 188 (2001)
一態様では、本発明は、以下の配列番号で示される核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列を提供する:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533‐575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、および2481。一実施態様では、二本鎖リボヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の発現から産生され、害虫と前記リボヌクレオチド配列との接触によって前記害虫の増殖が抑制される。別の実施態様では、該配列との接触によって前記配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列の発現が抑制される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドで細胞を形質転換する。別の実施態様では、細胞は細菌、酵母、または藻類細胞である。更に別の実施態様では、貯蔵穀物、ペットフード、または粉末チョコレートなどの食品が、ポリヌクレオチドで形質転換された細胞を含む。更に別の実施態様では、噴霧剤、粉剤、ペレット剤、ゲル、カプセル剤、食品、衣装袋、本などの組成物がポリヌクレオチドを含む。更に別の実施態様では、発明は、ポリヌクレオチドを含む殺虫剤を提供する。別の実施態様では、発明は、該ポリヌクレオチドを含む組成物での前記表面の処理を含む、害虫の侵入から木材、木、製本、布、食品貯蔵容器などの対象物を防御するための方法を提供する。
本発明は、害虫に必須の生物学的機能を転写後に抑制・阻害する標的コード配列に害虫をさらすことにより害虫の侵入を抑制する手段を提供する。標的配列にさらした後、標的は、害虫の必須遺伝子の一部または全体に対応するdsRNAを形成して、RNA干渉(RNAi)によって該害虫標的をダウンレギュレートさせる。mRNAの該ダウンレギュレーションの結果、dsRNAによって害虫標的タンパク質の発現が妨げられ、これによって該害虫に死、増殖停止、繁殖不能を起こす。
甲虫類では、例えば、コメツキムシ、ハナゾウムシ、アトマリア・リネアリス、カエトクネマ・ティビアリス、コスモポリテス、クルクリオ種、カツオブシムシ、エピラクナ属、エレムヌス種、コロラドハムシ、イネミズゾウ属;コフキコガネ、オリカエフィルス、クチブトゾウムシ、フリクチヌス種、ポピッリア種、ハムシ科、ナガシンクイ、コガネムシ科、コクゾウムシ、シトトロガ種、ゴミムシダマシ、コクヌストモドキ、カツオブシムシ;
直翅目では、例えば、ゴキブリ属、チャバネゴキブリ属、ケラ属、マデラゴキブリ、トノサマバッタ属、ゴキブリ科、バッタ科;
等翅目では、例えば、ヤマトシロアリ属;
チャタテムシ目では、例えば、コナチャタテ科;
シラミ類では、例えば、ブタジラミ属、ケモノホソジラミ属、ペジクルス種、天疱瘡、フィロキセラ;
食毛目では、例えば、ダマリネア種、ハジラミ属;
総翅目では、例えば、ミカンキイロアザミウマ、クリガネアザミウマ、タエニオトリップス種、ミナミキイロアザミウマ、ネギアザミウマ、ウスミドリアザミウマ;
異翅目では、例えば、トコジラミ、ジスタンチエラ・セオブロマ、ホシカメムシ科、チャイロカメムシ(Euchistus)、クモヘリカメムシ、ミナミアオカメムシ、チビカメムシ科、サシガメ、サルベルゲラ・シングラリス、クロカメムシ、サシガメ、カスミカメムシ科(Lygus hesperus、Lygus lineoloris)、ナガカメムシ科(アメリカコバネナガカメムシ)、カメムシ科(Pentatomidae);
同翅亜目では、例えば、ミカンワタコナジラミ、アレイロデス・ブラシカエ(Aleyrodes brassicae)、カイガラムシ科、アブラムシ科(Aphididae、Aphis)、カイガラムシ、タバココナジラミ、セロプラステル種、クリソンファルス・アオニディウム、マルカイガラムシ科、ヒラタカタカイガラムシ、ヒメヨコバイ、エリオソマ・ラリゲルム、クズウコン科(Erythroneura)、ガスカルディア(Gascardia)種、ヒメトビウンカ、Lacanium corni、カキカイガラムシ(Lepidosaphes)、マクロシフス種、アブラムシ科、Nehotettix、ウンカ科、パラトリア種、天疱瘡細菌(Pemphigus)、コナカイガラムシ科、カイガラムシ科(Pseudaulacaspis)、コナカイガラムシ、キジラミ、プルヴィナリア・アエチオピカ、クリマルカイガラムシ(Quadraspidiotus)、アブラムシ(Rhopalosiphum)、カイガラムシ(Saissetia)、カタカイガラムシ科(Scaphoideus)、アブラムシ科(Schizaphis)、アブラムシ科(Sitobion)、オンシツコナジラミ、ミカンキジラミ、カイガラムシ類(Unaspis citri;);
膜翅目(ハチ目)では、例えば、ハキリアリ属、Atta種、クチヒゲグエノン(Cephus)、マツハバチ種(Diprion、Diprionidae)、ジリピニア・ポリトマ、Hoplocampa(ハバチの一種)、ケアリ属、イエヒメアリ、ハバチ、トフシアリ属、スズメバチ;
ハエ目(双翅目)では、例えば、ヤブカ属、アンセリゴナ・ソカタ、ケバエ(Bibio hortulanus)、クロバエ・エリスロセファラ、ミバエ、オビキンバエ(Chrysomyia)、イエカ属、ウサギヒフバエ、ミバエ類、キイロショウジョウバエ、ヒメイエバエ科、ウマバエ科、ツェツェバエ科、ウシバエ科、イヌシラミバエ、Liriomysa、キンパエ(Lucilia)、ダイズメモグリバエ、イエバエ科、ヒツジバエ科、イネノシントメタマバエ(Orseolia)、オスシネラ・フリト(Oscinella frit)、アカザモグリハナバエ、クロキンバエ、リンゴミバエ、シアラ(Sciara)種)、サシバエ、アブ(Tabanus)、タニア、ガガンボ属;
ノミ目(隠翅目)では、例えば、セラトフィルス種(Ceratophyllus)、ケオピスネヅミノミ;
シミ目では、例えば、セイヨウシミ。
本発明は、転写後に害虫に必須の生物機能を抑制/阻害する標的コード配列(コード配列)を害虫に投与する、もしくはさらすことで害虫の侵入を抑制するための方法論およびコンストラクトを提供する。本明細書で「害虫」とは、ヒトの環境中に偏在する、昆虫、クモ形動物、甲殼類、菌類、細菌、ウイルス、線形動物、扁形虫、回虫、蟯虫、鉤虫、サナダムシ、トリパノソーマ類、住血吸虫、ウシバエ、蚤、マダニ、コダニ、シラミなどを指す。二本鎖の遺伝子抑制剤で処理した物質または表面の他、二本鎖の遺伝子抑制剤で形質転換させた生物が産生する、1つ以上の細胞、組織、産物を害虫に摂食または接触させることができる。
(1)限定されないが、トビイロウンカ科(例、N.lugens(トビイロウンカ));ヒメトビウンカ科(例、L.striatellus(ヒメトビウンカ));ツマグロヨコバイ科(例、タイワンツマグロヨコバイまたはN.cincticeps(ミドリヒメヨコバイ)またはクロスジツマグロヨコバイ(ツマグロヨコバイ);セジロウンカ科(例、S.furcifera(セジロウンカ));ナガカメムシ科(例、B.leucopterus leucopterus(ヒメオオメカメムシ));イネクロカメムシカメムシ科(例、S.vermidulate(イネクロカメムシ);アオクサカメムシ科(例、A.hilare(アオクサカメムシ));イチモンジセセリ属(例、P.guttata(イチモンジセセリ));メイガ科(例、C.suppressalis(ニカメイガ)、C.auricilius(gold−fringed stem borer)、またはC.polychrysus(ネッタイメイチュウ));Chilotraea spp.(例、C.polychrysa(rice stalk borer));ヨトウ科(例、イネヨトウ(イネの茎の穿孔虫));トリポリザ科(例、T.innotata(white rice borer)、T.incertulas(サンカメイガ);ノメイガ科(例、C.medinalis(コブノメイガ));ハモグリバエ科(例、麹菌(ハモグリバエ)またはA.parvicornis(corn blot leafminer));ディアトラエア(Diatraea)種(例、D.saccharalis(サトウキビメイガ)またはD.grandiosella(南西部アワノメイガ));フタオビコヤガ種(例、N.aenescens(フタオビコヤガ));フタトガリコヤガ科(例、X.transversa(フタトガリコヤガ));ヨトウ科(例、S.frugiperda(fall armyworm:ヨトウガの一種)、S.exigua(シロイチモジヨトウ)、アフリカヨトウ(ネキリムシ(climbing cutworm))またはS.praefica(western yellowstriped armyworm));ヨトウ(例、アワヨトウ(ヨトウムシ));オオタバコガ(例、H.zea(トウモロコシミミズ));Colaspis種(例、コゴメスゲ(grape colaspis));イネミズゾウムシ種(例、L.oryzophilus(イネミズゾウムシ));イネゾウムシ科(例、E.squamos(イネゾウムシ));Diclodispa科(例、D.armigera(オオタバコガ));ハムシ科(例、イネクビボソハムシ(ハムシ);コクゾウムシ(例、S.オリゼ(ココクゾウムシ));タマバエ科(例、 P. オリゼ(イネいもち病菌));ミギワバエ科(例、イネヒメハモグリバエ(イネミギワバエ)またはイネカラバエ(イネキモグリバエ);イネキモグリバエ種(例、C. オリゼ(カラバエ));ノメイガ科(例、O.nubilalis(アワノメイガ));ヤガ科(例、A.ipsilon(タマナヤガ));マダラメイガ科(例、エラスモパルパス・リグノセラス(モロコシマダラメイガ));コメツキムシ科(ハリガネムシ);コガネカブト科(例、C.borealis(northern masked chafer)またはC.immaculata(southern masked chafer));マメコガネムシ(例、P.japonica(マメコガネ虫));ハムシ科(例、C.pulicaria(トウモロコシハムシ));オサゾウムシ科(例、S.maidis(トウモロコゾウムシ));アブラムシ科(例、R.maidis(トウモロコシアブラムシ)); Anuraphis spp.(例、A.maidiradicis(corn root aphid));メラノプラス科(例、M.femurrubrum(アカアシセンチュウ)M.ジフェレンチアリス(differential grasshopper)M.sanguinipes(ミグラトリーグラスホッパー));ハナバエ科(例、タネバエ(ダイズサヤタマバエ));アザミウマ目(例、A.obscrurus(grass thrips));トフシアリ科(例、S.milesta(thief ant));または(例、ナミハダニ(タネバエ)、T.cinnabarinus(ニセナミハダニ);オオタバコガ科(例、H.zea (cotton bollworm)またはオオタバコガ(アメリカンボールワーム));キバガ科(例、ワタアカミムシ(ワタキバガ));エアリアス属(例、クサオビリンガ(スポテッドボールワーム));ヤガ科(例、H.virescens(タバコガ));ハナゾウムシ(例、グランディスドロワムシ(ワタノハナゾウムシ));ワタノミハムシ(例、P.seriatus(コットンフリーホッパー));オンシツコナジラミ (例、T.abutiloneus(banded−winged whitefly)、オンシツコナジラミ(シルバーリーフコナジラミ));コナジラミ(例、フコナジラミ(シルバーリーフコナジラミ));アブラムシ(例、A.gossypii(ワタアブラムシ)、セイヨウミツバチ);メクラガメ(例、リガス・リネオラリス(マキバメクラガメ)またはL.hesperus(western tarnished plant bug));カメムシ科(例、E.conspersus(consperse stink bug));アイイロタテハ(例、C.sayi(Say stinkbug));アオカメムシ(例、N.viridula(ミナミアオカメムシ));アザミウマ(例、T.tabaci(ネギアザミウマ));キイロアザミウマ(例、F.fusca(tobacco thrips)またはF.occidentalis(ミカンキイロアザミウマ));ハムシ(例、コロラドハムシ)、L.juncta (false potato beetle)、またはL.texana(Texan false potato beetle));ハムシ科(例、L.trilineata(three−lined potato beetle));ノミハムシ(例、E.cucumeris(potato flea beetle)、E.hirtipennis (トビハムシ)、またはE.tuberis (ジャガイモノミハムシtuber flea beetle));ハンミョウ科(例、E.vittata (ツチハンミョウstriped blister beetle));ヨコバイ科(例、ジャガイモヒメヨコバイ(ポテトリーフホッパー));アブラムシ科(例、M.persicae(モモアカアブラムシ));Paratrioza(例、アオキシロカイガラムシ(キジラミ));ハムシ科(例、C.falli (southern potato wireworm)、またはキビタイシメ(tobacco wireworm));ジャガイモキバガ(例、P.operculella(ジャガイモガ));アブラムシ科(例、M.euphorbiae(ジャガイモアブラムシ));Thyanta spp.(例、T.pallidovirens(redshouldered stinkbug));キバガ科(例、P.operculella(ジャガイモキバガ));オオタバコガ科(例、H.zea(tomato fruitworm);キバガ科(例、K.lycopersicella(tomato pinworm));Limonius(ハリガネムシ);スズメガ科(例、M.sexta(タバコホーンウォーム)、またはM.quinquemaculata(トマトホーンワーム));ハモグリバエ科(例、トマトハモグリバエ、マメハモグリバエ、またはアシグロハモグリバエ(ハモグリバエ));ショウジョウバエ(例、キイロショウジョウバエ、D.yakuba、ウスグロショウジョウバエ、オナジショウジョウバエ);オサムシ科(例、アカガネオサムシ);ユスリカ(例、C.tentanus破傷風);C.tenocephalides spp. ノミ(例、C.felis (ネコノミ));ゾウムシ科(例、D.abbreviatus (根のゾウムシroot weevil));キクイ(例、I.pini(キクイムシ));コクヌストモドキ科(例、T.castaneum(コクヌストモドキ));ツェツェバエ科(例、G.morsitans(ツェツェバエ));ハマダラカ科(例、A.gambiae(ガンビエハマダラカ));オオタバコガ(例、オオタバコガ(African Bollworm));アブラムシ科(例、A.pisum(エンドウヒゲナガアブラムシ));ミツバチ科(例、セイヨウミツバチ(ミツバチ));ヨコバイ科(例、H.coagulate(グラッシーウイングド・シャープシューター));ヤブカ属(例、Ae.aegypti(ネッタイシマカ));カイコガ科(例、B.mori(カイコガ)、B.mandarina);バッタ科(例、L.migratoria(トノサマバッタ));マダニ科(例、オオシマダニ(ウシダニ));タランチュラ科(例、A.gomesiana(red−haired chololate bird eater));胎生ゴキブリ(例、D.punctata(pacific beetle cockroach));ドクチョウ(例、H.erato (ベニバナトケイソウ)またはメルポメネベニモンドクチョウ(postman butterfly));ゾウムシ(例、C.glandium(どんぐり・ゾウムシ));コナガ科(例、P.xylostella(diamontback moth));キララマダニ(例、A.variegatum(ウシダニ));Anteraea spp. (例、ヤママユ(ヤママユガ));Belgica spp.(例、B.antartica)、Bemisa spp.(例、タバココナジラミ)、ジャノメチョウ、Biphillus spp.、マメゾウムシ、ハマキガ、ハンミョウ、イエカ、ヌカカ、ミカンキジラミ、ゾウムシ科、ヤガ科、シタバガ亜科、ツェツェバエ、コオロギ、シマトビケラ、タマムシ、ヤママユガ.,Lutzomyia種、Lysiphebus spp、Meladema spp.、コキノコムシ科、Nasonia spp.、Oncometopia spp.、アゲハ属、シラミ目、ノシメマダラメイガ、Rhynchosciara spp.、Sphaerius spp.、Toxoptera spp.、 Trichoplusa spp.、クロヤブカ種(例、オオクロヤブカ);
(2)限定されないが、カメムシ目および蚊、蜜蜂、カリバチ、シラミ、ノミ、アリなどの数種のハチ、ハエ、およびクモ類、ダニ類(例、オオシロカネグモ、ワクモ科、マダニ、アノセンター属、カズキダニ属、マダニ、ツメダニ、ニキビダニ、カクマダニ、ワクモ、ヘモフィサリス、チマダニ、ダニ、トゲダニ、ヒゼンダニ、カズキダニ、トリサシダニ、オトビアス、ミミヒゼンダニ、サルハイダニ、キュウセンダニ、コイタマダニ、ヒゼンダニ、またはツシマツツガムシ;シラミ目(吸血/刺咬性のシラミ)例、ハジラミ、ケモノジラミ、イヌジラミ、ニワトリハジラミ、コロモジラミ、天疱瘡(Pemphigus)、フィロキセラ ブドウネアブラムシ、ホソジラミ;ハエ目、例、シマカ、ハマダラカ、クロバエ、オビキンバエ, メクラアブ、コクリオミイア種、イエカ、ヌカカ、クテレブラ、ヒトヒフバエ、ウマバエ、ツェツェバエ、イエバエ科 ノサシバエ、ゴマフアブアブ、ヒポボスカ種、ウマシラミバエ属、ウシバエ、キンバエ、ノサシバエ、シラミバエ、ヒツジバエ、ヒロズキンバエ双翔目、サシチョウバエ、クロキンバエ、ニクバエ、ブユ、サシバエ、アブ科、タニアまたはガガンボ;ハジラミ目(刺咬性のシラミ)例、トリコデクテス、ハジラミ(Felicola)またはワラビーハジラミまたはイヌハジラミ;またはノミ目(無翅昆虫)例、ナガノミ科、ヒトノミ、またはケオプスネズミノミ;トコジラミ科(ナンキンムシ)例、トコジラミ、オオキノコムシ科、Rhodiniusまたはサシガメ科において認められる人および/または動物に感染する、または損傷を及ぼすことのできる昆虫;
(3)食料、種子、木材、塗料、プラスチック、衣類などを攻撃する昆虫など、基材や材料に好ましくない損傷を与える昆虫。
(1)ネコブセンチュウ(例、M.incognita、M.javanica、M.graminicola、M.arenaria、M.chitwoodi、M.hapla、M.paranaensis);ダイズシスト線虫(例、H.oryzae、H.glycines、H.zeae、H.schachtii);ジャガイモシストセンチュウ(例、G.pallida、G.rostochiensis);ニセフクロセンチュウ(例、R.レニフォルミス);ネグサレセンチュウ(例、ミナミネグサレセンチュウ、モロコシネグサレセンチュウ、プラチレンカス・ゴーデイ;ネモグリセンチュウ(例、R.Similis);Hirschmaniella属線虫(例、イネネモグリセンチュウ);鉤虫(例、イヌ鈎虫、内臓幼虫移行症、ズビニ鉤虫、猫鉤虫); アニサキス類;Aphelenchoides(例、オオオサムシ);犬回虫;回虫類(例、ブタ回虫、A.Lumbridoides);Belonolaimus spp.;糸状虫症(フィラリア症)(例、マレー糸状虫、B.pahangi);マツノザイセンチュウ;ケノルハブディティス(例、C.elegans, C.briggsaeまたはC.remanei);クロストリジウム(例、C.acetobutylicum);コオペリア(例、C.oncophora);ワセンチュウ類;シアトストーマム属(例、C.catinatum、C.coronatum、C.pateratum);Cylicocyclus spp.(例、C.insigne、C.nassatus、C.radiatus);シリコステファヌス(例、C.goldiまたはC.longibursatus);裂頭条虫;犬糸状虫(例、イヌ糸状虫);Ditylenchus(例、D.dipsaci、D.destructor、D.Angustus);蟯虫(例、E.vermicularis);捻転胃虫(例、H.contortus);センセンチュウ;ヤリセンチュウ;リトモソイデス(例、L.sigmodontis);ハリセンチュウ(例、L.macrosoma);鉤虫(例、アメリカ鉤虫);ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス線虫(例、N.brasiliensis);糸状虫(例、O.volvulus);オステルタギア(例、O.ostertagi);線虫類(例、P.trichosuri);ユミハリセンチュウ(例、P.minor、P.teres);パレラフォストロンギルス(例、P.tenuis);Radophulus spp.;Scutellonerna spp.;糞線虫ストロンギロイデス属(例、S.Ratti、S.stercoralis);テラドルサジア(例、T.circumcincta);トキサスカリス(例、T.leonina);回虫(例、イヌハジラミ、猫回虫);旋毛虫(例、T.britovi、T.spiralis、T.spirae);ユミハリセンチュウ(例、T.similis);鞭虫. (例、T.muris、T.vulpis、T.trichiura);ミカンネセンチュウ;Tylenchorhynchus spp.;鉤虫(例、挟頭鉤虫);糸状虫(例、バンクロフト糸状虫);オオハリセンチュウ(例、X.Index、X.americanum);
(2)限定されないが、ヒトに感染可能な線虫として以下が挙げられる:Enterobius vermicularis=蟯虫症の原因となる蟯虫;Ascaris lumbridoides=回虫症の原因となる大型の腸内回虫;Necator、Ancylostoma=鉤虫症の原因となる2種類の鉤虫;Trichuris trichiura=鞭虫症の原因となる鞭虫;Strongyloides stercoralis=糞線虫症の原因となる糞線虫;旋毛虫症の原因となるTrichonella spirae;マレー糸状虫、バンクロフト糸状虫=リンパ管フィラリア症およびその肉眼所見である象皮病として知られている寄生虫感染症に関連する糸状虫(フィラリア)、河川盲目症の原因となる回旋線糸状虫。感染した動物や人に侵入した吸血蚊を介して線虫から人への移動が起りうる;
(3)限定されないが、イヌ[鉤虫(例、イヌ鉤虫、挟頭鉤虫)、イヌ科回虫類(例、イヌ回虫、犬小回虫)、鞭虫(例、犬鞭虫)、ネコ[鉤虫(例、アンキロストマ・トゥバエフォルメ、回虫類(例、猫回虫)]、魚[アニサキス、シュードテラノーバ(例、アニサキス)、サナダムシ(例、裂頭条虫属)、ヒツジ[ハリガネムシ(例、捻転胃虫)、ウシ[腸内寄生虫(例、オステルタギア・オステルタギ Cooperia oncophora)などが動物に侵入できる線虫である;
(4)食料、種子、木材、塗布剤、プラスチック、衣類などの基材や物質に好ましくない損傷を招く線虫 限定されないが、該線虫の例として、ネコブセンチュウ(例、M.incognita、M.javanica、M.arenaria、M.graminicola、M.chitwoodiまたはM.hapla);ダイズシスト線虫(例、H.oryzae、H.glycines、H.Zeae、H.schachtii);ジャガイモシストセンチュウ(例、G.pallida、G.rostochiensis);Ditylenchus(例、D.dipsaci、D.destructor、D.angustus);Belonolaimus spp.;ニセフクロセンチュウ類(例、R.reniformis);ネグサレセンチュウ.(例、ミナミネグサレセンチュウ、プラチレンカス・ゴーデイ、P.Zeae);Radopholus(例、バナナネモグリセンチュウ);Hirschmaniella(例、H.Oryzae);Aphelenchoides(例、イネシンガレセンチュウ);Criconemoides spp.;Longidorus spp.;Helicotylenchus spp.;ヤリセンチュウ;オオハリセンチュウ;ユミハリセンチュウ(例、土壌線虫パラトリコドラス・マイナー);イシュクセンチュウ;
(5)ウイルス伝播性線虫(例、Longidorus macrosomaはプルヌスネクロティックリングスポットウイルスを伝播する。アメリカオオハリセンチュウはタバコ輪班ウイルスを伝播する。Paratrichadorus teresはpea early browning virusを伝播する。ハリセンチュウはタバコラットルウイルスを伝播する。)。
(1)限定されないが、Acremoniella spp.、黒斑病(例、キャベツ黒すす病菌または輪紋病)、黒斑病(例、エンドウ黒斑病)、かび病菌(例、灰色かび病菌または糸状菌)、クラドスポリウム属、褐斑病(例、ダイズ紫斑病またはCercospora zaea−maydis)、クロカビ(例、トマト葉カビ病菌)、コレトトリカム属菌、炭疽病菌(例、コレトトリカム・リンデムチアナム)、カルバラリア、円斑病菌(例、Diplodia maydis)、うどんこ病菌(例、Erysiphe graminis f.sp. graminis、Erysiphe graminis f.sp. hordei、Erysiphe pisi)、Erwinia armylovora、フザリウム属(例、麦類赤かび病菌、フザリウム・スポロトリキオイデス、萎ちょう病菌、ムギ類赤かび病菌、チオファネートメチル耐性コムギ赤かび病菌, Fusarium solani、フザリウム・モニリフォルメまたはFusarium roseum)、Gaeumanomyces spp.(例、Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici(ムギ類のうどんこ病菌))、イネばか苗病菌(例、赤かび病菌)、ごま葉枯病菌(例、Helminthosporium turcicum、Helminthosporium carbonum、Helminthosporium mavdis、Helminthosporium sigmoideum(イネ小球菌核病菌))、小球菌核病菌、立枯病すみぐされびょう菌(例、炭腐病菌)、 Magnaportha(例、イネいもち病菌)、リンゴ黒点病菌、株枯病菌 Nectria属(例、Nectria heamatococca〉、べと病菌 (例、ダイズのべと病菌(またはタバコのべと病菌)、Phoma属菌(例、蛇の目病菌)、サビ病菌(例、大豆サビ病菌)、カンキツグリーニング病原体(例、Phymatotrichum omnivorum)、エキビョウキン(例、フィトフトラ・シンナモミ、フィトフトラ カクトラム、Phytophthora phaseoli、Phytophthora parasitica、褐色腐敗病菌、Phytophthora megasperma f.sp. soiae、フィトフトラ・インフェスタンス)、べと病菌(例、Plasmopara viticola)、うどんこ病菌(例、リンゴうどんこ病菌)、さび病菌(例、トウモロコシさび病菌、Puccinia striiformis、小麦黒銹病菌、Puccinia asparagi、コムギ赤さび病菌、Puccinia arachidis)、土壤病菌(例、赤焼病菌)、斑葉病菌(例、Pyrenophora tritici−repentens、網斑病菌)、いもち病菌(例、イネいもち病菌)、土壤病菌(例、ピシウム・ウルティマム)、Rhincosporium secalis、ベントグラス葉腐病菌(例、イネ紋枯病菌、イネ赤色菌核病菌、株腐病)、クモノスカビ属(例、Rhizopus chinensid)、Scerotium spp.(例、Scerotium rolfsii)、菌核病菌(例、Sclerotinia sclerotiorum)、Septoria spp.(例、白星病菌、褐紋病菌、ふ枯病菌、葉枯病)、タバコ黒根病(例、Thielaviopsis basicola)、黒穂病菌、トリコデルマ(例、Trichoderma virde)、ウドンコカビ(例、Uncinula necator)、トウモロコシ黒穂病菌(例、トウモロコシ黒穂病)、Venturia spp.(例、黒星病菌、ナシの黒星病菌)、昆虫寄生性糸状菌(例、Verticillium dahliae、Verticillium albo−atrum)などの植物病原菌の真菌細胞、または植物病原菌に由来する細胞;
(2)限定されないが、カンジダ属、特にカンジダアルビカンス;Epidermophyton spp.、白癬菌、ミクロスポルムを含むDermatophytes;アスペルギルス属(特に、Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus terreus);Blastomyces dermatitidis;パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス;コクシジオイデス・イミティス;Cryptococcus neoformans;Histoplasma capsulatum Var.capsulatumまたはVar.duboisii;Sporothrix schenckii;Fusarium属菌;Scopulariopsis brevicaulis;Fonsecaea spp;Penicillium spp.;またはZygomycetes群の真菌(特に、Absidia corymbifera、Rhizomucor pusillus、Rhizopus arrhizus);
(3)限定されないが、カンジダ、ミクロスポルム(特に、ミクロスポルムカニス、ミクロスポルム・ギプセウム)、毛瘡白癬菌、アスペルギルス属、Cryptococcus neoformanなどの人に侵入できる真菌の真菌細胞、または真菌に由来する細胞;
(4)食料、種子、木材、塗料、プラスチック、衣類などを攻撃する真菌など、基材や材料に好ましくない損傷を与える真菌細胞または真菌に由来する細胞。該真菌類の例として、スタキボトリス属、コウジカビ属、アルテルナリア属、クラドスポリウム属、アオカビ属、白色腐朽担子菌などの糸状菌が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、dsRNAまたはsiRNAを生成させるためのヌクレオチド配列を含む核酸を同定、得るするための方法を提供する。例えば、該方法は以下を含む:(a)標的害虫からのヌクレオチド核酸またはその相同体の全体または一部を含むハイブリダイゼーションプローブでcDNAまたはDNAライブラリーを調べること;(b)ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズするDNAクローンを同定すること;(c)ステップ(b)で同定したDNAクローンを単離すること;および(d)ステップ(c)で単離したクローンを含むcDNAまたはDNA断片の配列を決定すること(配列決定した核酸分子は、RNA核酸配列またはその相同体の全体または実質的な部分を転写する)。
本発明は、安定化dsRNA法を使用した標的害虫における1つ以上の標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本発明は、真核生物の遺伝子発現の調節、特に消化器系が約4.5〜9.5、より好ましくは約5.0〜8.0、更に好ましくは約6.5〜7.5のpHレベルを示す害虫に存在する遺伝子の発現調節に特に有用である。これらの範囲外のpHを示す消化器系を有する害虫では、dsRNA分子の摂取を必要としない使用法での送達方法が望ましい。
dsRNA分子は、インビボまたはインビトロのいずれかで合成できる。1つの自己−相補RNA鎖、または2つの相補RNA鎖からdsRNAは形成できる。細胞の内因性RNAポリメラーゼは、インビボでの転写を媒介でき、クローン化RNAポリメラーゼをインビボ/インビトロ転写に使用できる。阻害は器官、組織、または細胞型内で特異的転写、環境条件という刺激(例、感染、ストレス、温度、化学誘発物質)、および/もしくは発生段階または発生時期での工学転写、の標的とされうる。RNA鎖はポリアデニル化を受ける場合、受けない場合があり、細胞の翻訳装置によってポリペプチドに翻訳できる場合、できない場合がある。
本発明によってヌクレオチド配列を提供する場合、その発現は、害虫のゲノム内においてヌクレオチド配列がコードするRNA配列を含む、該害虫標的遺伝子のRNA分子と実質的に相同なRNA配列をもたらす。このように、dsRNA配列の摂取後、該害虫の細胞内において該標的遺伝子のヌクレオチド配列がダウンレギュレートされて、該害虫の維持、生存、増殖、生殖、侵入に有害な影響を招くことがありうる。
特記ある場合を除き、本明細書において配列決定したDNA分子のヌクレオチド配列は、自動DNAシークエンサー(Model373、Applied Biosystems, Inc.)を使用して決定した。従って、この自動化アプローチによって決定したDNA配列に関して該技術分野で周知の通り、本明細書で決定した任意のヌクレオチド配列にはいくつかのエラーが含まれうる。自動決定したヌクレオチド配列は、配列決定したDNA分子の実際のヌクレオチド配列と、通常、少なくとも約95%、より多くは、少なくとも約96〜99.9%同一である。該技術分野において周知のマニュアルDNAシークエンシング法などの他のアプローチによって実際の配列をより正確に決定できる。同様に該技術分野において周知の通り、実際の配列との比較で、決定したヌクレオチド配列における1個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを起こし、決定したヌクレオチド配列がコードする予測アミノ酸配列は、配列決定したDNA分子が実際にコードするアミノ酸配列とは全く異なり、これらの挿入点または欠失点から開始しうる。
組み換え核酸ベクターは、例えば、線状または閉環状プラスミドであり得る。ベクター系は、細菌宿主のゲノム内に導入する全核酸を一緒に含んでいる、単一のベクターまたはプラスミド、もしくは2以上のベクターまたはプラスミドでありうる。また、細菌ベクターは発現ベクターでありうる。以下の配列番号に記載の核酸分子、またはこれらの断片は、例えば、連結したコード配列または他のDNA配列の発現を促進させるために、1つ以上の微生物宿主内において機能する適切なプロモーターの制御下でベクター内に適当に挿入できる:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49〜158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240〜246、247、249、251、253、255、257、259、275〜472、473、478、483、488、493、498、503、508〜512、513、515、517、519、521、533〜575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621〜767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813〜862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908〜1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066〜1070、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161〜1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730〜2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120〜2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384〜2460、2461、2466、2471、2476、および2481。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、適切なベクターの選択は主にベクターに挿入する核酸の大きさ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に左右される。各ベクターには、その機能(DNA増幅またはDNA発現)およびベクターが適合する特定の宿主細胞に応じた様々な要素が含まれる。細菌の形質転換のためのベクター成分には、限定されないが、一般に、以下の1つ以上が含まれる:シグナル配列、複製起点、1つ以上の選択マーカー遺伝子、外来DNAの発現を可能にする誘導プロモーター。
調節配列および構造ヌクレオチド配列に関連して使用する「機能的に連結した」とは、調節配列が連結している構造ヌクレオチド配列の発現を調節することを意味する。「調節配列」または「制御要素」とは、構造ヌクレオチド配列の上流(5’非コード配列)、内部、下流(3’非翻訳配列)に位置するヌクレオチド配列を指し、転写の時期およびレベルまたは量、RNAの処理または安定性、関連する構造ヌクレオチド配列の翻訳、に影響を及ぼす。調節配列としては、プロモーター、翻訳のリーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、ポリアデニル化認識配列などを挙げることができる。
本発明の組み換えDNAベクターまたはコンストラクトには、一般に、形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーが含まれる。選択マーカーは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性核酸を含む細胞の選択にも使用できる。マーカーは、抗生物質耐性(例、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど)などのバイオサイド耐性をコードしうる。選択マーカーの例として、カナマイシン耐性をコードしており、カナマイシン、G418などを使用して選択可能な、neo遺伝子、ビアラホス耐性をコードするbar遺伝子、ブロモキシニル耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子、メトトレキサート耐性DHFR遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。該選択マーカーの例が、米国特許第5,550,318号、第5,633,435号、第5,780,708号、第6,118,047号に説明している。
本発明では、生物にヌクレオチド配列を導入し、害虫において1つ以上のdsRNA分子の阻害発現レベルを達成することを意図している。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、該技術分野において周知である、標的宿主細胞内に組み換え配列を導入する標準手段によって、細菌性細胞または酵母細胞などの宿主細胞に導入できる。該手段としては、限定されないが、形質移入、感染、形質転換、自然取り込み、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション微粒子銃、微生物を介した形質転換プロトコルが挙げられる。宿主生物に応じて様々な方法を選択する。
標的遺伝子の発現阻害は、内因性RNAまたは標的RNAの翻訳によって産生されるタンパク質のいずれかによって定量可能であり、阻害の結果は、細胞または生物の表面上の特性を検証することで確認できる。RNAおよびタンパク質の定量方法は当業者には周知である。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニュール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレザト、フォスフィノスリシン、プロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、テトラサイクリンなどに対する耐性を付与する複数の選択可能なマーカーを利用できる。
dsRNAを害虫に投与可能な適切な任意の方法で、害虫をdsRNAにさらすことができる。例えば、dsRNAを含む水溶液など、純粋または実質的に純粋な状態のdsRNAを害虫に接触させることができる。一実施態様では、dsRNAを含む水溶液を昆虫に単に「浸す」または「噴霧する」ことができる。または、dsRNAを含む溶液を害虫に「噴霧する」ことができる。
本発明は、害虫抑制に使用するdsRNAを包含できる多くの製品を提供する。例えば、本発明は、ヒトまたは動物に対する害虫病または感染症を治療または予防するための医薬的組成物または獣医的組成物を提供する。該組成物には、少なくとも1つのdsRNAまたはRNAコンストラクト、または該dsRNAをコードするヌクレオチド配列または組み換えDNAコンストラクト、またはRNAコンストラクト(RNAはアニールされた相補鎖を含み、その相補鎖の一方が病気または感染症を起こす害虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する)、および医薬的用途に適した少なくとも1つの担体、賦形剤、あるいは希釈剤が含まれる。
同じ2個のT7プロモーターとターミネーターとの間のpGN9Aベクター(WO第01/88121号)内にC.エレガンス・ゲノム・ワイドライブラリーを作製して、IPTG誘導性T7ポリメラーゼの発現時にセンスおよびアンチセンス方向での発現を促進させた。
‐pGN29=陰性対照、野生型
‐pGZ1=unc−22=収縮性の表現型
‐pGZ18=キチンシンターゼ=胚致死
‐pGZ25=pos−1=胚致死
‐pGZ59=bli−4D=急性致死
‐ACC=アセチル補酵素A カルボキシラーゼ=急性致死
実施例1に記載の通り、多数のC.エレガンスの致死配列が同定されており、他の種や属でのオルソローグの同定に利用可能である。例えば、C.エレガンスの致死配列を使用して、キイロショウジョウバエのオルソローグ配列を同定できる。つまり、GenBankなどの公的データベースによって、キイロショウジョウバエのオーソロガス配列について、各C.エレガンス配列を照合できる。配列相同性の高く(好ましくは、E値は1E−30以下)、BLAST検索で配列のヒットが相互に最高となる、潜在的なキイロショウジョウバエのオルソローグを選択し、後者は他の生物(例、C.エレガンス、キイロショウジョウバエ)由来の配列が、BLAST検索で互いにヒットが最高となることを意味する。例えば、BLASTを利用して、C.エレガンス由来の配列をキイロショウジョウバエの配列と比較した。配列Cについてはキイロショウジョウバエの配列Dでヒットが最高となるが、DをC.エレガンスの全配列と比較した場合、やはり配列Cが最高であることが分かり、DとCでヒットは互いに最高となる。オルソロジー(orthology)を定義するためにこの基準を利用すること多く、同様の機能を有する異なる種由来の同様の配列を意味している。表(Table)1Aにキイロショウジョウバエ配列の発見者を示している。
A.コロラドハムシ由来の遺伝子の部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、異なる4幼虫期のLeptinotarsa decemlineata(コロラドハムシ;入手先:Jeroen van Schaik,Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162, 6700 AD Wageningen、オランダ)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを生成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5'T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
コロラドハムシ用の人工飼料を以下の通りに調製した(Gelmanら、2001, J. Ins.Sc., vol. 1, no. 7, 1-10を改変):水とアガーをオートクレーブして、温度が55℃まで下がった時点で残りの成分(表2)を加えた。この温度で、成分を十分に混合した後、1ウェル当たり1mL量の飼料を24ウェル・プレート(Nunc社)に分注した。人工飼料を室温まで冷まして、固まらせた。飼料は最長3週間まで4℃で保存した。
CPBの食物源として人工飼料ではなくジャガイモ葉材料を使用した、代替バイオアッセイを利用した。適切な大きさの穿孔器を使用して、2〜3週目のジャガイモ植物の葉から、直径約1.1cm(または0.95cm2)のディスクを切り出した。葉の向軸面に標的LD002 dsRNAまたは対照gfp dsRNA 10ng/μL溶液20μLを塗布することで、処理済み葉ディスクを調製した。葉ディスクを乾燥させて、一個一個を24ウェル・マルチプレート(Nunc社)の24ウェル内に置いた。第2幼虫期のCBP1匹を各ウェル内に置いて、ティッシュペーパーとマルチウェルのプラスチック蓋で覆った。昆虫と葉ディスクを含むプレートを、光周期が明期16時間/暗期8時間の昆虫チェンバー内で維持した。昆虫に2日間葉ディスクを食べさせて、その後、新しい処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに昆虫を移した。その後、7日目まで毎日、未処理の葉ディスクを含むプレートに昆虫を移した。昆虫の死亡率と重量スコアを記録した。
1μg/μL(標的LD027では、0.1μg/μLから)から0.01ng/μLまでの10倍濃度系列のdsRNA溶液50μLを24ウェル・プレート(Nunc社)のウェル内の固形人工飼料上に局所適用した。層流キャビン内で飼料を乾燥させた。処理毎に、コロラドハムシの幼虫24匹(第2幼虫期;2匹/ウェル)を試験した。プレートを25±2℃、相対湿度60%の昆虫飼育用チェンバー内(光周期は明期:暗期=16:8時間)に保存した。コロラドハムシの生死を14日目まで定期的に評価した。7日後、同濃度のdsRNAを局所適用した新しい飼料と交換した。dsRNA標的を飼料のみと比較した。
任意の効率的な細菌プロモーターを使用できるが、MLB遺伝子標的に対応するDNA断片を細菌宿主での二本鎖RNA発現ベクター内にクローニングした(WO第00/01846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において標的LD010に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIIIを含む細菌BL21(DE3)との比較でRNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
300ngのプラスミドを加えて、氷冷させた化学コンピテント大腸菌株AB309−105またはBL21(DE3)50μLにゆっくりと混合させた。細胞を氷上で20分間インキュベートさせて、37℃、5分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に5分間氷上に置いた。室温のSOC培地450μLを細胞に加えて、懸濁液をシェーカー(250rpm)で37℃、1時間培養させた。100μg/mLカルベニシリン抗生物質を添加したLB培地150mLの入った500mL三角フラスコに細菌懸濁液100μLを移した。37℃のInnova 4430シェーカー(250rpm)で一晩(16〜18時間)培養物を培養した。
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
2種のバイオアッセイ方法を利用して、コロラドハムシの幼虫に対して大腸菌内で産生させた二本鎖RNAを検証した:(1)人工飼料バイオアッセイ、および(2)植物バイオアッセイ。
先の実施例4に記載のとおりに、コロラドハムシの人工飼料を調製した。飼料0.5mLを48ウェル・マルチウェル試験プレートの各ウェルに分注した。処理毎に、熱処理済みdsRNA発現細菌の懸濁液(OD1)50μL(約5×107個の細菌細胞に相当)をウェル内の固形飼料に局所適用して、プレートを層流キャビン内で乾燥させた。処理毎に、第2幼虫期のコロラドハムシ48匹(飼料および細菌を含む各ウェルに1匹)を検証した。プレート(8ウェル)の各列を1複製物と見なした。プレートを25±2℃、相対湿度60%の昆虫飼育用チェンバー内に保存した(光周期は明期:暗期=16:8時間)。4日後毎に、局所適用した細菌を含む新しい飼料にコロラドハムシを移した。侵入から1〜3日後毎にコロラドハムシの生死を評価した。生存個体については、侵入後7日目に幼虫の重量に関する成長および発生を記録した。
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液をジャガイモ植物全体に噴霧して、植物をCPB幼虫に食べさせた。以下の条件の植物生育室内において塊茎から8〜12開葉期までジャガイモ品種「5系統」を生育させた:25±2℃、相対湿度60%、光周期:明期16時間、暗期8時間。通気可能にして、内部での凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防ぐように底部を開けて細目ナイロン・メッシュを被せた、500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定することで、植物を囲った。L1幼虫期のコロラドハムシ幼虫15匹を囲い内の各処理済み植物に置いた。pGBNJ003プラスミド(クローン1;図7a−LD)またはpGN29プラスミド(クローン1;図7a−LD)を保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1.6mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
実施例3Jに細菌培養物の調製/処理について記載している。標的LD010の二本鎖RNAを発現するRNAaseIII欠損大腸菌株AB309−105の3倍希釈培養物(0.25ユニット相当から開始)を8〜12開葉期の「Bintje」品種のジャガイモ植物葉に適用した。処理済み植物上に第1幼虫期のL.decemlineataを10匹を置いた(処理当たり1植物)。7日目に昆虫の死亡率および増殖遅延を点数化した(侵入後7日目)。
以下の実施例では、標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取による、成虫(幼虫のみならず)の感受性は極めて高いとの知見を提示して強調している。
A.ファミリーPCRによるPhaedon cochleariae(マスタードハムシ)のPC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016、およびPC027遺伝子の部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、第3幼虫期のPhaedon cochleariae(マスタードハムシ;入手先:Dr. Caroline Muller, Julius-von-Sachs-INSTITUTE for Biosciences, Chemical Ecology Group, University of Wuerzburg, Julius-von-Sachs-Platz 3, D-97082 Wuerzburg,ドイツ)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScript TM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを生成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5’T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
以下の実施例は、マスタードハムシ(MLB)の幼虫が、標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
上記の実施例4Dに記載のとおり、0.1μg/μLから0.01ng/μLまでの10倍濃度系列の標的PC010またはPC027由来のdsRNA溶液25μLをアブラナ葉ディスク上に局所適用した。陰性対照として、0.05%Triton X−100のみを葉ディスクに投与した。処理毎に、マスタードハムシの新生幼虫24匹(2匹/ウェル)を試験した。プレートを25±2℃、相対湿度60±5%の昆虫飼育用チェンバー内(光周期は明期:暗期=16:8時間)に保存した。2日目、新しいdsRNA処理済み葉ディスクを含む新しいプレートに幼虫を移した。標的PC010では4日目、標的PC027では5日目、十分量の未処理葉材料を含むペトリ・ディッシュに各複製物の昆虫を移した。標的PC010では2、4、7、8、9、および11日目、標的PC027では2、5、8、9、および12日目、マスタードハムシの生死を評価した。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのMLB遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターや細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。この実験では、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
300ngのプラスミドを加えて、氷冷させた50μLの化学コンピテント大腸菌株AB309−105にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で20分間インキュベートさせて、37℃、5分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に5分間氷上に戻した。室温のSOC培地450μLをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー(250rpm)で37℃、1時間培養させた。100μg/mLカルベニシリン抗生物質を添加したLB培地150mLの入った500mL三角フラスコに細菌懸濁液100μLを移した。37℃のInnova 4430シェーカー(250rpm)で一晩(16〜18時間)培養物を培養した。
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を総量50mLの0.05% Triton X−100溶液に再懸濁させた。チューブは使用まで4℃で保存した。
葉ディスクバイオアッセイ
葉ディスクバイオアッセイを利用して、マスタードハムシの幼虫に対する大腸菌(プラスミドpGCDJ001)での標的PC010由来の二本鎖RNAを検証した。実施例4に記載のとおり、葉ディスクはアブラナ葉から調製した。20μLの細菌懸濁液(OD600nm=1)を各ディスク上にピペットで取った。ゲル化アガー1mLを含む24マルチウェル・プレートのウェルに葉ディスクを置いた。各葉ディスク上に新生幼虫2匹を置いた。各処理について、3複製物(新生幼虫16匹/複製物)を準備した。プレートを25±2℃、相対湿度60±5%の昆虫飼育用チェンバー内(光周期は明期:暗期=16:8時間)に保存した。3日目(バイオアッセイから3日後)、新しい処理済み(同用量)葉ディスクを含む新しいプレートに幼虫を移した。5日目以降、1日おきに葉材料を補給した。バイオアッセイでは、死亡率と平均重量を点数化した。陰性対照は、プラスミドpGN29(空ベクター)を保有する細菌で処理した葉ディスク、および葉のみであった。
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、MLBに植物を餌として与えた。MLBは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にMLBを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Epilachna varivetisの遺伝子の部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、第3幼虫期のEpilachna varivetis(インゲンテントウ; 入手先:Thomas Dorsey(昆虫学者/責任者),New Jersey Department of Agriculture, Division of Plant Industry, Bureau of Biological Pest Control, Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory, 米国08625-0330ニュージャージー州トレントン私書箱330)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを合成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5’T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
以下の実施例は、インゲンテントウ(MBB)の幼虫が、標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
以下の実施例は、インゲンテントウの成虫が、標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのMLB遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
300ngのプラスミドを加えて、氷冷させた50μLの化学コンピテント大腸菌株AB309−105またはBL21(DE3)にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で20分間インキュベートさせて、37℃、5分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に5分間氷上に戻した。室温のSOC培地450μLをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー(250rpm)で37℃、1時間培養させた。100μg/mLカルベニシリン抗生物質を添加したLB培地150mLの入った500mL三角フラスコに細菌懸濁液100μLを移した。37℃のInnova 4430シェーカー(250rpm)で一晩(16〜18時間)培養物を培養した。
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、MBBに植物を餌として与えた。MBBは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にMMBを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Anthonomus grandisの部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、3齢のAnthonomus grandis(メキシコワタノミゾウムシ;入手先:Dr. Gary Benzon, Benzon Research Inc., 7 Kuhn Drive, Carlisle, Pennsylvania 17013, 米国)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを生成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5’T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
Insect Investigations Ltd.(origin: Blades Biological Ltd., Kent, 英国)でイエコオロギAcheta domesticusを保持した。ブラン・ペレットとキャベツ葉で昆虫を飼育した。試験に使用するために、同じ大きさで、5日齢以上の雌雄同体の若虫を選んだ。二本鎖RNAを小麦ベースのネズミ用小麦ペレット飼料と混ぜた(ラット/マウス用の標準食、B & K Universal Ltd., Grimston,Aldbrough, Hull 英国)。飼料(BK001P)には、重量順に、以下の成分が含まれる:小麦、大豆、小麦食、大麦、ペレット結合剤、ネズミ用5ビタミン、脂肪混合物、リン酸二カルシウム、カビ炭水化物(mould carb)。ネズミ用のペレット飼料を粉砕して、電子レンジで熱処理して、酵素成分を不活化させた後、混合させた。全てのネズミ用飼料を同じバッチから取ることで、一貫性を保証した。粉砕した飼料とdsRNAを十分に混合させて、同じ重さの小ペレットに成形させて、室温で一晩乾燥させた。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのMLB遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、CBWに植物を餌として与えた。CBWは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にCBWを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Tribolium castaneumの部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、異なる全齢のTribolium castaneum(コクヌストモドキ;入手先:Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, 英国ウェールズ)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号1808004,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを合成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5’T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
以下の実施例は、コクヌストモドキ(RFB)の幼虫が、標的遺伝子に対応するdsRNAの経口摂取に感受性であるとの知見に関する例示である。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのRFB遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド、すなわちIPTGの存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿物を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、RFBに植物を餌として与えた。RFBは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にRFBを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Myzus persicaeの部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、Myzus persicaeの若虫(アカアブラムシ;入手先:Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, 英国)から高品質で、無傷のRNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標) III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)用いて、使用説明書に従って、cDNAを作製した。
市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5'T7RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
Febvayらの記載(1988年)の方法[Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum (Homoptera: Aphididae).Can .J. Zool. 66: 2449-2453]に多少の改変を加えて、Acyrthosiphon pisum(エンドウヒゲナガアブラムシ)に適した飼料に基づいて、Myzus persicae(アカアブラムシ)用の液体人工飼料を調製した。飼料のアミノ酸成分は以下の通りに調製した(mg/100mL):アラニン178.71、βアラニン6.22、アルギニン244.9、アスパラギン298.55、アスパラギン酸88.25、システイン29.59、グルタミン酸149.36、グルタミン445.61、グリシン166.56、ヒスチジン136.02、イソロイシン164.75、ロイシン231.56、塩酸リジン351.09、メチオニン72.35、オルニチン(塩酸)9.41、フェニルアラニン293、プロリン129.33、セリン124.28、トレオニン127.16、トリプトファン42.75、チロシン38.63で、Lバリン190.85。アミノ酸混合物を加える前に数滴の1M HClに溶解したチロシンを除く、アミノ酸を30mLのMilli−Q水に溶解させた。飼料のビタミン混合成分を以下の通りに5X濃縮液として調製した(mg/L):アミノ安息香酸100、アスコルビン酸1000、ビオチン1、パントテン酸カルシウム50、塩化コリン500、葉酸10、ミオイノシトール420、ニコチン酸100、塩酸ピリドキシン25、リボフラビン5、塩酸チアミン25。リボフラビンを50℃の水1mLに溶解させて、ビタミン混合物に加えた。ビタミン混合物を20mLに分注して−20℃で保存した。ビタミン混合物20mLをアミノ酸溶液に加えた。ショ糖20g、MgSO4.7H2O 242mgを混合物に加えた。微量金属ストック溶液 を以下の通りに調製した(mg/100mL):CuSO4.5H2O 4.7、FeCl3.6H2O 44.5、MnCl2.4H2O 6.5、塩化ナトリウム25.4、ZnCl 28.3。微量金属溶液10mL、KH2PO4 250mgを飼料に加え、Milli−Q水を液体飼料に加えて、最終容積を100mLとした。1M KOH溶液で飼料をpH7に調整した。液体飼料を0.22μmのフィルター・ディスク(Millipore社)でろ過滅菌した。
クローニング
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのGPA遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンス/センスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、GPAに植物を餌として与えた。GPAは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にGPAを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Nilaparvata lugensの部分配列のクローニング
Nilaparvata lugensの高品質な全RNA(入手先:Dr. J. A. Gatehouse, Dept.Biological Sciences, Durham University, 英国)から、市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを生成した。
Nilaparvata lugensの高品質な全RNA(入手先:Dr. J. A. Gatehouse, Dept.Biological Sciences, Durham University, 英国)から、市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号1808044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、プロトコルに従って、cDNAを生成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5'T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
Koyamaらの記載(1988年)の方法[Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppers and leafhoppers (Homoptera: Delphacidae and Deltocephalidae) on a holidic diet.JARQ 22: 20-27]に多少の改変(飼料中のショ糖成分の最終濃度:14.4%w/v)を加えて、Nilaparvata lugens(rice brown planthopper)用の液体人工飼料(MMD−1)を調製した。異なる濃度の飼料成分を調製した:10×無機物ストック(4℃保存)、2×アミノ酸ストック(−20℃保存)、10×ビタミン・ストック(−20℃保存)。バイオアッセイの開始直前、ストック成分を4/3×濃度に混合させて、dsRNA試験液で希釈し(4×濃度)、pH6.5に調整して、ろ過滅菌して約500μL量にした。
異なる濃度(最終濃度:1、0.2、0.08、および0.04mg/mL)の標的NL002 dsRNAを添加した液体人工飼料50μLをbrown plant hopperの給餌器に用いた。dsRNAを含む飼料を隔日で新しい飼料と交換して、昆虫の生存率を毎日評価した。処理毎に、バイオアッセイ用の5個の給餌器(複製物)を同時に設置した。給餌器を27±2℃、相対湿度80%に保ち、光周期は明期:暗期=16:8時間であった。カプラン・マイヤー生存曲線モデルを利用して、昆虫の生存データを分析して、ログランク検定(Prism version 4.0)を利用して生存率を群間比較した。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのBPH遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターや細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、BPHに植物を餌として与えた。BPHは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物にBPHを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.ファミリーPCRによるChilo suppressalisの遺伝子の部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、異なる4幼虫期のChilo suppressalis(ニカメイガ rice striped stem borer)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700, Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを合成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5’T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
Kamano & Satoの記載の改変人工飼料においてChilo suppressalis(ニカメイガ Rice striped stem borers, 入手先:Syngenta, Stein, Switzerland)を維持した(Handbook of Insect Rearing.Volumes I & II.P Singh and RF Moore, eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam and New York, 1985, pp 448)。簡単に説明すると、以下の通りに飼料1Lを調製した:アガー20gをMilli−Q水980mLに添加して、オートクレーブした。アガー溶液を約55℃に冷却させて、残り成分を加えて、十分に混合させた:トウモロコシ粉(Polenta)40g、セルロース20g、ショ糖30g、カゼイン30g、小麦麦芽(トースト)20g、ウェッソン塩混合物8g、Vanderzantのビタミン混合物12g、ソルビン酸1.8g、ニパギン(Nipagin:メチルパラベン)1.6g、オーレオマイシン0.3g、コレステロール0.4g、L−システイン0.6g。飼料を45℃に冷却して、飼育トレイまたはカップに注いだ。水平層流キャビン内に飼料を放置した。成虫の蛾を入れているケージから産卵された卵の付着した稲葉切片を取り出して、飼育用カップまたはトレイ内の固形飼料に固定させた。卵を孵化させて、バイオアッセイにおよび昆虫培養の維持に新生幼虫を利用可能であった。試験および飼育中、条件は、28±2℃、相対湿度80±5%、光周期は明期:暗期=16:8時間であった。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのSSB遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、SSBに植物を餌として与えた。SSBは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物上にSSBを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Plutella xylostellaの部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、異なる全ての幼虫期のPlutella xylostella(コナガ;入手先:Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, 英国ウェールズ)から無傷の高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを合成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5'T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
Plutella xylostella(コナガ)はInsect Investigations Ltd.で維持した(入手先:Newcastle University,Newcastle-upon-Tyne,英国)。キャベツ葉で昆虫を飼育した。一齢の雌雄同体幼虫(1日齢前後)を試験用に選んだ。エッペンドルフ・チューブ(容積1.5mL)内で昆虫を維持した。使用説明書に従って調製した、市販のコナガ用飼料(Bio-Serv,米国ニュージャージー州)を各チューブのフタ内に置いた(容積0.25mL、直径8mm)。まだ液状のうちに、飼料を平らにして、余分を除いて、表面を平らにした。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのDBM遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、DBMに植物を餌として与えた。DBMは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物上にDBMを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.Acheta domesticusの部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、異なる全ての昆虫期のAcheta domesticus(イエコオロギ;入手先:Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, 英国ウェールズ)から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号18080044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを合成した。
市販のキットT7 Ribomax(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。最初に、2つの別々のPCR反応において2つ別々の5’T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを作製して、各反応にはT7プロモーターに対して異なる方向の標的配列を含んでいた。
Acheta domesticus(イエコオロギ)はInsect Investigations Ltd.で維持した(入手先:Blades Biological Ltd.,英国ケント週)。キャベツ葉で昆虫を飼育した。試験に使用するために、同じ大きさで、5日齢以上の雌雄同体の若虫を選んだ。二本鎖RNAを小麦ベースのネズミ用小麦ペレット飼料と混ぜた(ラット/マウス用の標準食、B & K Universal Ltd., Grimston,Aldbrough, Hull 英国)。飼料(BK001P)には、重量順に、以下の成分が含まれる:小麦、大豆、小麦食、大麦、ペレット結合剤、ネズミ用5ビタミン、脂肪混合物、リン酸二カルシウム、カビ炭水化物。ネズミ用のペレット飼料を粉砕して、電子レンジで熱処理して、酵素成分を不活化させた後、混合させた。全てのネズミ用飼料を同じバッチから取ることで、一貫性を保証した。粉砕した飼料とdsRNAを十分に混合させて、同じ重さの小ペレットに成形させて、室温で一晩乾燥させた。
以下は、細菌宿主内での二本鎖RNA発現ベクター内へのHC遺伝子標的に対応するDNA断片のクローニングの例であり、もっともT7プロモーターまたは細菌内での効率的発現用の他のプロモーターを含む任意のベクターを使用できる(WO第0001846号参照)。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
300ngのプラスミドを加えて、氷冷させた50μLの化学コンピテント大腸菌株AB309−105またはBL21(DE3)にゆっくりと混合させた。細胞を氷上で20分間インキュベートさせて、37℃、5分間のヒートショック処理を施し、その後、細胞を更に5分間氷上に戻した。室温のSOC培地450μLをこの細胞に加えて、懸濁液をシェーカー(250rpm)で37℃、1時間培養させた。100μg/mLカルベニシリン抗生物質を添加したLB培地150mLの入った500mL三角フラスコに細菌懸濁液100μLを移した。37℃のInnova 4430シェーカー(250rpm)で一晩(16〜18時間)培養物を培養した。
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
植物バイオアッセイ
化学誘発性のdsRNA発現細菌の懸濁液を植物全体に噴霧して、HCに植物を餌として与えた。HCは植物生育室内で生育させた。500mLプラスチック・ボトルを逆さまにして、首部分をしっかりと鉢内の土壌中に固定し、底部を切り開くことで、植物を囲み、細目ナイロン・メッシュで覆って、通気が可能になり、内部凝結を減らし、幼虫が逃げるのを防いだ。囲い内の各処理済み植物上にHCを置いた。pGBNJ001プラスミドまたはpGN29プラスミドを保有する大腸菌AB309−105の懸濁液で植物を処理した。異なる量の細菌を植物に適用した:例、66、22、および7ユニット(ここで1ユニットは波長600nmで光学濃度1の細菌懸濁液1mL中の109個の細菌と定義する)。それぞれの場合で、気化器を使用して総量1〜10mLを植物に噴霧した。この試験では、処理毎に1植物を使用した。生存個体数を数え、各生存個体の重量を記録した。
A.イモチ菌の部分配列のクローニング
TRIzol試薬(カタログ番号15596-026/15596-018、Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)を使用して、使用説明書に従って、異なる成長期のイモチ菌から完全な高品質RNAを単離した。使用説明書に従ったDNase(カタログ番号1700,Promega社)処理によってRNA調製物に存在するゲノムDNAを除去した。市販のキット(SuperScriptTM(商標)III Reverse Transcriptase,カタログ番号1808044,Invitrogen社、米国メリーランド州ロックビル)使用して、使用説明書に従って、cDNAを合成した。
市販のキットT7 RibomaxTM(商標)Express RNAi System(カタログ番号P1700、Promega社)を使用してミリグラム量のdsRNAを合成した。結果として得たPCR産物をアガロースゲルで分離して、PCR精製キット(Qiaquick PCR Purification Kit,カタログ番号28106,Qiagen社)およびNaClO4沈殿で精製した。使用説明書に従って、作製したT7フォーワードおよびリバース・テンプレートを混合させて、結果として得たRNA鎖をアニーリングさせて、DNaseおよびRNase処理して、酢酸ナトリウムで精製した。
下記の手順に従って、細菌内において昆虫標的に対する昆虫‐活性化二本鎖RNAを適切なレベルにまで発現させた。野生型RNaseIII保有細菌BL21(DE3)との比較で、RNaseIII欠損株AB309−105を使用した。
AB309−105およびBL21(DE3)の形質転換
発現制御のための全ての遺伝要素が存在するため、細菌株AB309−105またはBL21(DE3)における組み換えベクターpGBNJ003からの二本鎖RNAの発現は可能となっている。化学誘導物質イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で、反対方向のT7プロモーターに挟まれているため、T7ポリメラーゼはアンチセンスおよびセンスの両方向で標的配列の転写を促進させる。
試験プレート内における人工飼料の混入リスクを最小限にするために、細菌を熱処理で殺した。しかし、RNA干渉のため、二本鎖RNA発現細菌の熱処理は、昆虫に対する毒性誘導に必須ではない。誘導をかけた細菌培養物を室温で10分間、3000gの遠心分離にかけて、上精を捨て、沈殿物を80℃の水浴に20分間浸した。熱処理後、細菌の沈殿を1.5mLのMilliQ水に再懸濁させて、懸濁液をマイクロチューブに移した。数本のチューブを準備して、補給毎にバイオアッセイに使用した。チューブは使用まで−20℃で保存した。
Claims (14)
- アニーリングした相補鎖を含む二本鎖RNAであって、少なくとも二本鎖のうちの一方の鎖は
(i)配列番号2104、2114、2178〜2194、2311〜2314、2349、2351または2352からなる配列のいずれかの標的遺伝子の少なくとも21個の連続ヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
(ii)配列番号2105で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも21個の連続ヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、および
(iii)(i)又は(ii)のポリリボヌクレオチドと少なくとも90%の配列同一性があるポリリボヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリリボヌクレオチドを含むものであり、該二本鎖RNAは該標的遺伝子の発現を阻害するものである、二本鎖RNA。 - 植物害虫が二本鎖RNAを摂取することにより該害虫の増殖を抑制する、請求項1に記載の二本鎖RNA。
- 請求項1または2に記載の二本鎖RNAをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された細胞。
- 細胞が、細菌、酵母、または藻類細胞である、請求項4の細胞。
- 請求項5の細胞を含む食品。
- 食品が、貯蔵穀物、ペットフードおよび粉末チョコレートからなるグループから選択される、請求項6の食品。
- 請求項1または2に記載の二本鎖RNAを含む組成物。
- 組成物が、スプレー、粉剤、ペレット剤、ゲル、カプセル剤、食品、衣服袋および本からなるグループから選択されるものに使用される、請求項8の組成物。
- 請求項8または9に記載の組成物を害虫にさらすことを含む、害虫の侵入(ヒトへの侵入を除く)を抑制する方法。
- 請求項1または2に記載の二本鎖RNAを含む殺虫剤。
- 請求項8または9に記載の組成物で対象物を処理することを含む、害虫の侵入(ヒトへの侵入を除く)から対象物を保護する方法。
- 対象物が、木材、木、製本、布および食品貯蔵容器からなるグループから選択される、請求項12の方法。
- 昆虫の侵入(ヒトへの侵入を除く)を予防または処理するための、請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項1もしくは2に記載の二本鎖RNA、請求項4もしくは5に記載の細胞、請求項8もしくは9に記載の組成物、または請求項11に記載の殺虫剤の使用。
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CN107148426A (zh) * | 2014-10-13 | 2017-09-08 | 美国陶氏益农公司 | 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体alpha亚单位核酸分子 |
CN108064288B (zh) | 2015-01-22 | 2021-11-26 | 孟山都技术公司 | 用于控制叶甲属的组合物和方法 |
MX2017013040A (es) | 2015-04-17 | 2017-12-08 | Dow Agrosciences Llc | Moleculas que tienen utilidad plaguicida, e intermediarios, composiciones y procesos, relacionados con ellas. |
EP3302053B1 (en) | 2015-06-02 | 2021-03-17 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant |
WO2016196782A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
CN108431207A (zh) | 2015-10-12 | 2018-08-21 | 美国陶氏益农公司 | 赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的wupa核酸分子 |
WO2017106126A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Dow Agrosciences Llc | Ribosomal protein L40 (RPL40) NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RESISTANCE TO COLEOPTERAN AND HEMIPTERAN PESTS |
EP3484280A4 (en) | 2016-07-13 | 2020-08-12 | Indiana University Research & Technology Corporation | RNAI INSECTICIDE MATERIALS AND PROCEDURES |
WO2018046312A2 (en) * | 2016-09-06 | 2018-03-15 | Syngenta Participations Ag | Improvements in or relating to gene silencing |
MX2019002949A (es) | 2016-09-16 | 2020-01-27 | Pebble Labs Usa Inc | Sistema novedoso paratransgénico para el control biológico de mosquitos transmisores de enfermedades. |
WO2018071327A1 (en) * | 2016-10-12 | 2018-04-19 | Dow Agrosciences Llc | Molecules having pesticidal utility, and intermediates, compositions, and processes, related thereto |
WO2018106847A1 (en) * | 2016-12-06 | 2018-06-14 | Pebble Labs, Inc. | System and methods for the biocontrol of plant pathogens |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
EP3342780A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-04 | Dow AgroSciences LLC | Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests |
CA3048497A1 (en) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Compositions and related methods for modulating endosymbionts |
WO2018191209A1 (en) * | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Mclaughlin Gormley King Company | Mixtures of sabadilla oil and fungicides and uses thereof |
AR113761A1 (es) | 2017-10-18 | 2020-06-10 | Syngenta Participations Ag | Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn |
IL280208B2 (en) | 2018-07-18 | 2024-06-01 | Plantarc Bio Ltd | Methods and preparations to reduce the invasion of the palm weevil pest |
CN109370910B (zh) * | 2018-08-03 | 2021-09-07 | 贵州省植物保护研究所 | 一种短帚霉及其用途 |
US20220408732A1 (en) * | 2018-09-13 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Control of plant pests using rna molecules |
CN111849980B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-03-22 | 华南农业大学 | 一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用 |
CN115786334B (zh) * | 2022-07-27 | 2023-07-18 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种调控红火蚁生殖的小分子rna及其应用 |
Family Cites Families (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4876197A (en) | 1983-02-22 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
JPS59205983A (ja) | 1983-04-28 | 1984-11-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
US4880734A (en) | 1984-05-11 | 1989-11-14 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
JP2795850B2 (ja) | 1987-03-23 | 1998-09-10 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 酵母発現ベクター |
EP0315447A3 (en) | 1987-11-06 | 1990-07-18 | Teijin Limited | Method of immunological measurement of human protein s and reagent and kit therefor |
US5789214A (en) | 1988-03-08 | 1998-08-04 | Novartis Finance Corporation | Method of inducing gene transcription in a plant |
US5614395A (en) | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
JP3209744B2 (ja) | 1990-01-22 | 2001-09-17 | デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション | 結実能力のある遺伝子変換コーン |
US5639949A (en) | 1990-08-20 | 1997-06-17 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
DK0558676T3 (da) | 1990-11-23 | 2000-09-25 | Aventis Cropscience Nv | Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter |
US5593874A (en) | 1992-03-19 | 1997-01-14 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants |
EP0649467B1 (en) | 1992-07-02 | 1998-09-16 | HYBRIDON, Inc. | Self-stabilized oligonucleotides as therapeutic agents |
US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
US7034009B2 (en) * | 1995-10-26 | 2006-04-25 | Sirna Therapeutics, Inc. | Enzymatic nucleic acid-mediated treatment of ocular diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R) |
US5693512A (en) | 1996-03-01 | 1997-12-02 | The Ohio State Research Foundation | Method for transforming plant tissue by sonication |
DE19631919C2 (de) | 1996-08-07 | 1998-07-16 | Deutsches Krebsforsch | Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur |
GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
US6703491B1 (en) * | 1999-03-17 | 2004-03-09 | Exelixis, Inc. | Drosophila sequences |
US6511824B1 (en) * | 1999-03-17 | 2003-01-28 | Exelixis, Inc. | Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use |
US6326193B1 (en) * | 1999-11-05 | 2001-12-04 | Cambria Biosciences, Llc | Insect control agent |
AU2047001A (en) * | 1999-11-24 | 2001-06-04 | Dna Plant Technology Corporation | Methods of inhibiting plant parasitic nematodes and insect pests by expression of nematode and insect specific double-stranded rna in plants |
AU2001245945A1 (en) * | 2000-03-23 | 2001-10-03 | Pe Corporation (Ny) | Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression of 10,000 or more drosophila genes and uses thereof |
GB0012233D0 (en) | 2000-05-19 | 2000-07-12 | Devgen Nv | Vector constructs |
US20020048814A1 (en) | 2000-08-15 | 2002-04-25 | Dna Plant Technology Corporation | Methods of gene silencing using poly-dT sequences |
US7109393B2 (en) | 2000-08-15 | 2006-09-19 | Mendel Biotechnology, Inc. | Methods of gene silencing using inverted repeat sequences |
EP1210875A1 (en) * | 2000-12-04 | 2002-06-05 | Aventis CropScience GmbH | Modulating gene expression in insects by using double-stranded RNA (dsRNA) |
AUPR621501A0 (en) * | 2001-07-06 | 2001-08-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery of ds rna |
WO2004002271A1 (en) | 2002-06-03 | 2004-01-08 | Harbor Steel & Supply Corporation | Carrousel file |
AU2003251579B2 (en) | 2002-06-21 | 2008-04-03 | Monsanto Technology Llc | Intron double stranded RNA constructs and uses thereof |
US20040053289A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | The Regents Of The University Of California | Short interfering nucleic acid hybrids and methods thereof |
DK2284266T3 (da) * | 2002-11-14 | 2014-01-13 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53 |
US7655785B1 (en) * | 2002-11-14 | 2010-02-02 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof |
IL157538A0 (en) * | 2003-08-21 | 2004-03-28 | Bar Ilan Res & Dev Company Ltd | Plant resistant to cytoplasm-feeding parasites |
JP2007505824A (ja) * | 2003-09-15 | 2007-03-15 | セニックス・バイオサイエンス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 増殖性疾患の診断および治療における、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に影響を与える真核生物遺伝子の利用 |
ATE526407T1 (de) * | 2003-11-17 | 2011-10-15 | Commw Scient Ind Res Org | Insektenresistenz durch inhibierung von genexpression |
CA2548484C (en) | 2003-12-23 | 2015-04-21 | Bayer Cropscience Sa | Method for modifying gene expression of a phytopathogenic fungus |
AR048685A1 (es) | 2004-04-09 | 2006-05-17 | Monsanto Technology Llc | Metodos para el control de infestaciones de insectos en plantas. |
WO2006044480A2 (en) | 2004-10-13 | 2006-04-27 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Nematode resistant transgenic plants |
MX2007004686A (es) | 2004-10-25 | 2007-06-14 | Devgen Nv | Moleculas de arn de multidominio que comprenden al menos un aptamero para suministrar arn de doble hebra a organismos nocivos. |
EP2330203A3 (en) | 2004-10-25 | 2011-10-05 | Devgen NV | Rna constructs |
CA2622660C (en) * | 2005-09-16 | 2017-11-07 | Devgen Nv | Transgenic plant-based methods for plant pests using rnai |
EP2431473B1 (en) * | 2005-09-16 | 2016-11-09 | Monsanto Technology LLC | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
AU2007214547B2 (en) * | 2006-02-13 | 2012-09-20 | Monsanto Technology Llc | Selecting and stabilizing dsRNA constructs |
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