JPS59205983A - 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 - Google Patents
異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法Info
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- JPS59205983A JPS59205983A JP59083049A JP8304984A JPS59205983A JP S59205983 A JPS59205983 A JP S59205983A JP 59083049 A JP59083049 A JP 59083049A JP 8304984 A JP8304984 A JP 8304984A JP S59205983 A JPS59205983 A JP S59205983A
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- plasmid
- gene
- prokaryotic
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
不発明は、プラスミド媒介体により運ばれた場合細菌内
で不安定となる異種の遺伝子あるいは遺伝子融合物の遺
伝を安定化する方法に関する。
で不安定となる異種の遺伝子あるいは遺伝子融合物の遺
伝を安定化する方法に関する。
生体外でのＤＮＡ組換技術の重要な利用法の１つは、特
に重要な１釉ないし数種のタンパク質を多イに産生する
微生物株やその他の細胞系を構築することである。この
ようなタンパク質は商業的あるいは研兇的価値のいずれ
かを有し同種（宿主生物から得られる遺伝子で暗記化さ
れる）あるいは異種（宿主生物以外の生物から得られる
遺伝子で暗号化芒れる）起諒である。
に重要な１釉ないし数種のタンパク質を多イに産生する
微生物株やその他の細胞系を構築することである。この
ようなタンパク質は商業的あるいは研兇的価値のいずれ
かを有し同種（宿主生物から得られる遺伝子で暗記化さ
れる）あるいは異種（宿主生物以外の生物から得られる
遺伝子で暗号化芒れる）起諒である。
このような遺伝子工学によるタンパク質の合成（あるい
は同義的に、遺伝学的に操作された遺伝子の発現）には
紀１段階としてタンパク質を暗号化１−るＤＮＡ配列を
「転写」−させる（伝令ＲＮＡへ複写させる）ことが必
要である。転写はプロモーターといわれるＤＮＡ中の特
定暗号寸たは部位から開始される。次いで伝令ＲＮＡ配
列をタンパク質の第１構造のポリペプチド鎖へ「翻訳」
せねばならない。多くの場合、遺伝子が異種の宿主内で
発現できるようにするには、その天然のプロモーターあ
るいは翻訳開始部位あるいはその双方を、新しい宿主の
発現系が認識できるような暗号に（組換ＤＮＡ技術によ
り〕置換することが必要となる。このような遺伝子融合
の使用は、元の宿主内でその遺伝子に天然に付随してい
た発現暗号を、新宿主が認識できない場合に必要となる
。遺伝子融合は対象の遺伝子産物の性質を変えること、
たとえばタンパク質の分泌能力を変化あるいは最適化さ
せたり、精製しやすくするためにタンパク質の生物化学
的あるいは生物物理的性質を変えたりすることへも利用
できる。本開示の目的においては、天然の発現暗号をも
つ異朴遺伝子であろうと、（上述のような）種々の方法
のいずれか１つにより変化をうけた異種遺伝子であろう
とその行動は等価とみなすことができる。したがって「
異種遺伝子」といつ名称は両方の場合を意味するのに使
用することとする。
は同義的に、遺伝学的に操作された遺伝子の発現）には
紀１段階としてタンパク質を暗号化１−るＤＮＡ配列を
「転写」−させる（伝令ＲＮＡへ複写させる）ことが必
要である。転写はプロモーターといわれるＤＮＡ中の特
定暗号寸たは部位から開始される。次いで伝令ＲＮＡ配
列をタンパク質の第１構造のポリペプチド鎖へ「翻訳」
せねばならない。多くの場合、遺伝子が異種の宿主内で
発現できるようにするには、その天然のプロモーターあ
るいは翻訳開始部位あるいはその双方を、新しい宿主の
発現系が認識できるような暗号に（組換ＤＮＡ技術によ
り〕置換することが必要となる。このような遺伝子融合
の使用は、元の宿主内でその遺伝子に天然に付随してい
た発現暗号を、新宿主が認識できない場合に必要となる
。遺伝子融合は対象の遺伝子産物の性質を変えること、
たとえばタンパク質の分泌能力を変化あるいは最適化さ
せたり、精製しやすくするためにタンパク質の生物化学
的あるいは生物物理的性質を変えたりすることへも利用
できる。本開示の目的においては、天然の発現暗号をも
つ異朴遺伝子であろうと、（上述のような）種々の方法
のいずれか１つにより変化をうけた異種遺伝子であろう
とその行動は等価とみなすことができる。したがって「
異種遺伝子」といつ名称は両方の場合を意味するのに使
用することとする。
この組換ＤＮＡに関する研究が特に異種遺伝子発現系の
開発においてしばしば直面する問題は、ある種のキメラ
プラスミドを伴なう細菌株を単離あるいは培養できない
ことである。この問題はそのキメラプラスミドをもつ形
質転換細胞を発見できないことで明示できる（ Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、＋第１４７巻７７６〜７８６頁（１
９８１）Ｔ、イマナカ（Ｉｍａｎａｋａ ）ら、Ｇｅｎ
ｅ第１８巻８１９−８２８頁（１９８２）Ｄ、スタッノ
（Ｓｔａｓｓｉ ）とＳ、Ａ、ラックス（Ｌａｃｈｓ
） ）。別の場合では、形質転換細胞のあるものは回収
はされるが急速に、そのキメラプラスミドを消失してし
まう（Ｃ，ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）とＡ、Ｌ、ゾ
ーネンシャイ７（Ｓｏｎｅ−ｎｓｈｅｉｎ ） ＋ 「
杆菌内での分子クローン培養と遺伝子側ｍｌ Ａ、Ｔ、
ガネサ：／ （Ｇａｎｅｓａｎ ）ら編集、。
開発においてしばしば直面する問題は、ある種のキメラ
プラスミドを伴なう細菌株を単離あるいは培養できない
ことである。この問題はそのキメラプラスミドをもつ形
質転換細胞を発見できないことで明示できる（ Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、＋第１４７巻７７６〜７８６頁（１
９８１）Ｔ、イマナカ（Ｉｍａｎａｋａ ）ら、Ｇｅｎ
ｅ第１８巻８１９−８２８頁（１９８２）Ｄ、スタッノ
（Ｓｔａｓｓｉ ）とＳ、Ａ、ラックス（Ｌａｃｈｓ
） ）。別の場合では、形質転換細胞のあるものは回収
はされるが急速に、そのキメラプラスミドを消失してし
まう（Ｃ，ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）とＡ、Ｌ、ゾ
ーネンシャイ７（Ｓｏｎｅ−ｎｓｈｅｉｎ ） ＋ 「
杆菌内での分子クローン培養と遺伝子側ｍｌ Ａ、Ｔ、
ガネサ：／ （Ｇａｎｅｓａｎ ）ら編集、。
ニーヨークアカデプレス発行（１９８ｚ）６３〜７２頁
）。またある場合には、いくらかの安定な形質転換細胞
が回収されるが、これらに含まれるキメラプラスミドは
再配列をうけたものである（Ｃ，ドネリー（Ｄｏｎｎｅ
ｌ ｌｙ ）とＡ、Ｌ、ゾーネンシャイン（５ｏｎｅｎ
ｓｈｅｉｎ ） ＋前掲より；Ｇ、グランディ（Ｇｒａ
ｎｄｉ ）ら、ｐｌａｓｍｉｄ第６巻９９−１１１頁（
１９８１）；Ｊ、クレット（Ｋｌｅｆｔ ）ら、前掲の
「杆菌内での分子クローン培養と遺伝子制御」１４５−
１５７頁；Ｍ、ウーレン（Ｕｈｌｅｎ ）ら、ｐｌａｓ
ｍｉｄ ｍ ５巻１６１−１６９頁（１９８１’ ）
）。
）。またある場合には、いくらかの安定な形質転換細胞
が回収されるが、これらに含まれるキメラプラスミドは
再配列をうけたものである（Ｃ，ドネリー（Ｄｏｎｎｅ
ｌ ｌｙ ）とＡ、Ｌ、ゾーネンシャイン（５ｏｎｅｎ
ｓｈｅｉｎ ） ＋前掲より；Ｇ、グランディ（Ｇｒａ
ｎｄｉ ）ら、ｐｌａｓｍｉｄ第６巻９９−１１１頁（
１９８１）；Ｊ、クレット（Ｋｌｅｆｔ ）ら、前掲の
「杆菌内での分子クローン培養と遺伝子制御」１４５−
１５７頁；Ｍ、ウーレン（Ｕｈｌｅｎ ）ら、ｐｌａｓ
ｍｉｄ ｍ ５巻１６１−１６９頁（１９８１’ ）
）。
このようなキメラプラスミドの不安定な性質を説明する
ために、多数の仮定が提出されてきた。
ために、多数の仮定が提出されてきた。
その中に次の説がある；（１）宿主細胞に対し阻害的−
！たさらには致命的であるような遺伝子産物の多量の産
生。あるいは（２）クローン化遺伝子産物るるいは発現
系による必須細胞成分の飽和（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
。
！たさらには致命的であるような遺伝子産物の多量の産
生。あるいは（２）クローン化遺伝子産物るるいは発現
系による必須細胞成分の飽和（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
。
纂１５２巻９８８〜９９８頁（１９８２）Ｎ、Ｅ。
バーディング（Ｈａｒｄｉｎｇ ）ら；Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、第１５２巻１．１９６〜１２１０頁ｐ、ｗ、
ライス（Ｒｉｃｅ）とＪ、Ｅ、ダールベルグ（Ｄａｈｌ
ｂｅｒｇ ） ｓＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ？Ｊ、
１４７巻７７６〜７８６頁（１９８１） ’］” 、イ
マナカ（Ｉｍａｎａｋａ ）ら； Ｇｅｎｅ第１８巻３
１９〜３２８頁（１９８２）Ｄ、スタッノ（Ｓｔａｓｓ
ｉ ）とＳ 、Ａ、ラックス（Ｌａｃｈｓ） ）ｏこ
れらのモデルではいずれも問題点はクローン化遺伝子の
過剰発現、すなわち宿主細胞の生長能力が損傷をうけず
に済む限界許容レベルを、上回るような発現にあるとさ
れている。このような過剰発現が生じた細胞は死ぬか生
長速度が遅くなり、母集団内でプラスミドを失なったり
プラスミドＤＮＡが再編成さ几てその発現が許容レベル
以下に低下したような他の細胞により置換きれる。
ｒｉｏｌ、第１５２巻１．１９６〜１２１０頁ｐ、ｗ、
ライス（Ｒｉｃｅ）とＪ、Ｅ、ダールベルグ（Ｄａｈｌ
ｂｅｒｇ ） ｓＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ？Ｊ、
１４７巻７７６〜７８６頁（１９８１） ’］” 、イ
マナカ（Ｉｍａｎａｋａ ）ら； Ｇｅｎｅ第１８巻３
１９〜３２８頁（１９８２）Ｄ、スタッノ（Ｓｔａｓｓ
ｉ ）とＳ 、Ａ、ラックス（Ｌａｃｈｓ） ）ｏこ
れらのモデルではいずれも問題点はクローン化遺伝子の
過剰発現、すなわち宿主細胞の生長能力が損傷をうけず
に済む限界許容レベルを、上回るような発現にあるとさ
れている。このような過剰発現が生じた細胞は死ぬか生
長速度が遅くなり、母集団内でプラスミドを失なったり
プラスミドＤＮＡが再編成さ几てその発現が許容レベル
以下に低下したような他の細胞により置換きれる。
第三番目の可能性は特定のプラスミド白米遺伝子がある
レベル以上発現するとプラスミド機能あるいはプラスミ
ドを維持するのに必要な機能を崩壊しつるというもので
ある（ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ第１巻１８９９〜１４
０４頁（１９８２）Ｄ、シュトイバー（５ｔｅｕｂｅｒ
）とＨ，ブヤー（Ｂｕｊａｒｄ ）。この場合の過剰
発現はプラスミドの確立あるいは細胞分裂における娘細
胞へのプラスミドの王宮な遺伝のいずれかを阻害するの
に足るようなレベルのものと考えられる。この結果、プ
ラスミドを失なった細胞はプラスミドがその生存に必要
であるような条件下（たとえば、抗生物質の存在下など
）では生育できないことになる。
レベル以上発現するとプラスミド機能あるいはプラスミ
ドを維持するのに必要な機能を崩壊しつるというもので
ある（ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ第１巻１８９９〜１４
０４頁（１９８２）Ｄ、シュトイバー（５ｔｅｕｂｅｒ
）とＨ，ブヤー（Ｂｕｊａｒｄ ）。この場合の過剰
発現はプラスミドの確立あるいは細胞分裂における娘細
胞へのプラスミドの王宮な遺伝のいずれかを阻害するの
に足るようなレベルのものと考えられる。この結果、プ
ラスミドを失なった細胞はプラスミドがその生存に必要
であるような条件下（たとえば、抗生物質の存在下など
）では生育できないことになる。
これらの説のうちいずれが与えられた条件でのキメラプ
ラスミドの不安定性に対する真の説明となるのかは現在
のところ不明だが、一般的な基本原則は過剰な遺伝子発
現はキメラプラスミドを含む安定な形質転換細胞の回収
を妨げるということである。以上のことから本発明の目
的は、プラスミド媒介体により運ばれた場合、過剰発現
のために何らかの機構により不安定となるような遺伝子
を、導入し安定に維持するための技術を開発することに
ある。
ラスミドの不安定性に対する真の説明となるのかは現在
のところ不明だが、一般的な基本原則は過剰な遺伝子発
現はキメラプラスミドを含む安定な形質転換細胞の回収
を妨げるということである。以上のことから本発明の目
的は、プラスミド媒介体により運ばれた場合、過剰発現
のために何らかの機構により不安定となるような遺伝子
を、導入し安定に維持するための技術を開発することに
ある。
プラスミド媒介体により運ばれた場合、原核微生物内で
は不安定であるような各種の異種遺伝子と遺伝子融合物
の遺伝は、本発明に従って、遺伝子を原核微生物の染色
体へ組込むことにより安定化できる。
は不安定であるような各種の異種遺伝子と遺伝子融合物
の遺伝は、本発明に従って、遺伝子を原核微生物の染色
体へ組込むことにより安定化できる。
異種遺伝子の微生物染色体への組込みには２つの効果か
める。これにより染色体外要素りにただひとつのＤＮＡ
配列複製物しか含まない細胞株が生ずる。これは、遺伝
子供与量を減少させることになり、結果的に生じた遺伝
子産物量が細胞生育を損なわぬ限界許容量以下の場合に
シまこの細胞株は不安定ではなくなることになる。第二
に、組込筐れた異種遺伝子はもはやその遺伝性をプラス
ミド維持機構に依存しなくなる。この結果、不可欠であ
ったプラスミド４Ｍ ｉｕを破壊することにより生じた
不安定性は問題ではなくなることになる。これ捷で観察
されてきた不安定性が上記の効果によるものかどうかに
かかわらず、本発明の方法ｋまこ ＼のよつな他の方
法では不安定でめるような遺伝子を安定化することが丁
でに示されている。
める。これにより染色体外要素りにただひとつのＤＮＡ
配列複製物しか含まない細胞株が生ずる。これは、遺伝
子供与量を減少させることになり、結果的に生じた遺伝
子産物量が細胞生育を損なわぬ限界許容量以下の場合に
シまこの細胞株は不安定ではなくなることになる。第二
に、組込筐れた異種遺伝子はもはやその遺伝性をプラス
ミド維持機構に依存しなくなる。この結果、不可欠であ
ったプラスミド４Ｍ ｉｕを破壊することにより生じた
不安定性は問題ではなくなることになる。これ捷で観察
されてきた不安定性が上記の効果によるものかどうかに
かかわらず、本発明の方法ｋまこ ＼のよつな他の方
法では不安定でめるような遺伝子を安定化することが丁
でに示されている。
異種遺伝子や遺伝子融合物を微生物の染色体へ組込むの
に使用できる技術には種々のものカニある。
に使用できる技術には種々のものカニある。
１つの実施例では、対象の遺伝子必るい番ま遺伝子融合
物を、微生物の染色体に相同組換えにより組込むことの
できるプラスミド内へ、クローン化する。このタイプの
プラスミドは染色体組込み媒介体といわｎ、（ａｔひと
つの宿主微生物（たとえば大腸菌（Ｆ、 ｃｏｌｉ ）
）内では機能するが他°の微生物（たとえば枯草菌（
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ）でシま機宜目しないよ
うな複製単位（その媒介体が、プラスミドとして維持さ
れるのに必要な遺伝的機能）を含み；（ｂ）各宿主内で
選択するのに利用できる遺伝的マーカーを含み；ｆｃｌ
ｉ二の微生ｖ／Ｊ（この場合では枯草菌）の染色体と相
同な１つあるいは複数のＤＮＡ配列を含むような媒介体
と定義されている。ひとつの微生物内で機能するプラス
ミド複製単位の存在により、染色体組込み媒介体はその
微生物内で容易に維持し操作することができる。このよ
うな構造物によって必要とされるクローン化と遺伝子工
学のあらゆる操作を丁みやかに行なうことが可能となる
。両宿主内で機能できる遺伝子マーカーの存在により、
個々の微生物内におけるプラスミドの存在を選択したり
検知したりできる。最後に、第二の微生物の染色体の一
部と相同ＺＤＮＡ配列の存在により、第二の宿主を形質
転換するさいに、媒介体をこの両者の相同なりＮＡ配列
間の組換えにより宿主の染色体へ組込むことができる、
。
物を、微生物の染色体に相同組換えにより組込むことの
できるプラスミド内へ、クローン化する。このタイプの
プラスミドは染色体組込み媒介体といわｎ、（ａｔひと
つの宿主微生物（たとえば大腸菌（Ｆ、 ｃｏｌｉ ）
）内では機能するが他°の微生物（たとえば枯草菌（
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ）でシま機宜目しないよ
うな複製単位（その媒介体が、プラスミドとして維持さ
れるのに必要な遺伝的機能）を含み；（ｂ）各宿主内で
選択するのに利用できる遺伝的マーカーを含み；ｆｃｌ
ｉ二の微生ｖ／Ｊ（この場合では枯草菌）の染色体と相
同な１つあるいは複数のＤＮＡ配列を含むような媒介体
と定義されている。ひとつの微生物内で機能するプラス
ミド複製単位の存在により、染色体組込み媒介体はその
微生物内で容易に維持し操作することができる。このよ
うな構造物によって必要とされるクローン化と遺伝子工
学のあらゆる操作を丁みやかに行なうことが可能となる
。両宿主内で機能できる遺伝子マーカーの存在により、
個々の微生物内におけるプラスミドの存在を選択したり
検知したりできる。最後に、第二の微生物の染色体の一
部と相同ＺＤＮＡ配列の存在により、第二の宿主を形質
転換するさいに、媒介体をこの両者の相同なりＮＡ配列
間の組換えにより宿主の染色体へ組込むことができる、
。
宿主の染色体のどの領域が相同な領域となるのかについ
ては特異性は全くなく、微生物の栗色体の分解により生
ずる多数の限定断片のうち大半のものは必要とされる相
同性を与えるのに十分役立つものと思われる。しかし、
個々の断片が組込みを促進する頻度については差異のお
る可能性がある（第２表参照）。このような差異は長さ
、ＤＮＡの塩基組成と配列、および染色体の位置などの
差異に依存する。高頻度の組込みが望ましい場合には、
特定の経験的に同定済みの断片を利用するのが有利であ
ろう。第二の宿主内においては、媒介体は機能する複製
単位をもたぬため染色体外要素として維持されることは
できない。
ては特異性は全くなく、微生物の栗色体の分解により生
ずる多数の限定断片のうち大半のものは必要とされる相
同性を与えるのに十分役立つものと思われる。しかし、
個々の断片が組込みを促進する頻度については差異のお
る可能性がある（第２表参照）。このような差異は長さ
、ＤＮＡの塩基組成と配列、および染色体の位置などの
差異に依存する。高頻度の組込みが望ましい場合には、
特定の経験的に同定済みの断片を利用するのが有利であ
ろう。第二の宿主内においては、媒介体は機能する複製
単位をもたぬため染色体外要素として維持されることは
できない。
染色体組込み媒介体は、クローン化媒介体として、たと
えば対象の遺伝子を含む限定断片のようなひとつのＤＮ
Ａ配列を挿入するのに利用することができる。このよう
な遺伝子がクローン化され、その結果生じたプラスミド
が第二の微生物を形質転換するのに使用される場合には
、対象の遺伝子は染色体組込み媒介体の残りの部分とい
っしょに第二の微生物の染色体へ組込まれることになる
。
えば対象の遺伝子を含む限定断片のようなひとつのＤＮ
Ａ配列を挿入するのに利用することができる。このよう
な遺伝子がクローン化され、その結果生じたプラスミド
が第二の微生物を形質転換するのに使用される場合には
、対象の遺伝子は染色体組込み媒介体の残りの部分とい
っしょに第二の微生物の染色体へ組込まれることになる
。
この方法において通常、宿主の染色体上で近接した位置
関係にあるいくつかの相同領域に、対象の遺伝子の両側
が接しているような場合には、実質的により高い形質転
換頻度が得られるものと思われる。
関係にあるいくつかの相同領域に、対象の遺伝子の両側
が接しているような場合には、実質的により高い形質転
換頻度が得られるものと思われる。
染色体組込み媒介体についてはすでに文献に報告てれて
いるが、その有用性についての議論は現在までのところ
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）や大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）のような微生物の遺伝的解析に
おける利用にその焦点があてられてきた（Ｍｏｌ。
いるが、その有用性についての議論は現在までのところ
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）や大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）のような微生物の遺伝的解析に
おける利用にその焦点があてられてきた（Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、第１７８巻５２５〜５８Ｂ頁Ｃ１
９８０）Ｋ、ヤマグチ（Ｙａｒｎａｇｕｃｈｔ ）とＪ
、）ミザワ（Ｔｏｍｉｚａｗａ ） ＋ Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ第１５４巻７６〜８８頁（１９８８）Ｔ、デ
ィト（Ｄａｔｅ ） ＋ Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第
１４８巻６２４〜６２８頁（１９８・ｌ ）Ｆ、Ｅ。
９８０）Ｋ、ヤマグチ（Ｙａｒｎａｇｕｃｈｔ ）とＪ
、）ミザワ（Ｔｏｍｉｚａｗａ ） ＋ Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ第１５４巻７６〜８８頁（１９８８）Ｔ、デ
ィト（Ｄａｔｅ ） ＋ Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第
１４８巻６２４〜６２８頁（１９８・ｌ ）Ｆ、Ｅ。
ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 第１４２巻８９０〜８９８頁（１９８０） Ｗ
、 Ｇ 、ノールデンヴアング（Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ
）ら、Ｍｏｌ 、Ｇｅｎ 、Ｇｅｎｅｔ 。
ｌ、 第１４２巻８９０〜８９８頁（１９８０） Ｗ
、 Ｇ 、ノールデンヴアング（Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ
）ら、Ｍｏｌ 、Ｇｅｎ 、Ｇｅｎｅｔ 。
第１８９巻３２１〜８２５頁（１９８８）Ｅ、フエラー
リ（Ｆｅｒｒａｒｉ ）とＪ、Ａ、ホラｅ （Ｈｏｃｈ
））。染色体組込み媒介体は今まで、微生物内で異種遺
伝子を安定に維持し発現させるための手段として利用さ
れたことはなかった。
リ（Ｆｅｒｒａｒｉ ）とＪ、Ａ、ホラｅ （Ｈｏｃｈ
））。染色体組込み媒介体は今まで、微生物内で異種遺
伝子を安定に維持し発現させるための手段として利用さ
れたことはなかった。
第二番目の実施例では、対象の遺伝子を一般的あるいは
特異的な組換えのいずれかにより、天然の状態から単離
した場合に宿主微生物の染色体へ組込むことのできるよ
うな媒介体内へ、クローン化することができる。一般的
組換えは媒介体と宿主との間の相同性を必要とするもの
であり、特異的組換えは相同性を必安どしないものであ
る。このような媒介体としては、溶原性バクテリオファ
ージ（Ｇｅｎｅ第５巻８７〜９１頁（１９７９）Ｆ。
特異的な組換えのいずれかにより、天然の状態から単離
した場合に宿主微生物の染色体へ組込むことのできるよ
うな媒介体内へ、クローン化することができる。一般的
組換えは媒介体と宿主との間の相同性を必要とするもの
であり、特異的組換えは相同性を必安どしないものであ
る。このような媒介体としては、溶原性バクテリオファ
ージ（Ｇｅｎｅ第５巻８７〜９１頁（１９７９）Ｆ。
カワムラ（Ｋａｗａｍｕｒａ ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙａ、Ｒｅｓ。
Ｂｉｏｐｈｙａ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｒｒｍ、 第９１巻１５５６〜１５６４頁（１９７
９）Ｙ、ヨネダ（Ｙｏｎｅｄａ）ら）やプラスミド（Ｍ
ｏｌ。
９）Ｙ、ヨネダ（Ｙｏｎｅｄａ）ら）やプラスミド（Ｍ
ｏｌ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、第１８９巻５８〜６８頁（１９８
Ｂ）Ｊ、ホフマイスタ−（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ）ら
、Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂ）Ｊ、ホフマイスタ−（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ）ら
、Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、第５５巻４４１−４５６頁（１９７１） Ｙ
。
。
ニジムラ（ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ ）ら）やトランスポゾ
ン（Ｇｅｎｅ第２１巻１８８二１４８頁（１９８８）Ｎ
。
ン（Ｇｅｎｅ第２１巻１８８二１４８頁（１９８８）Ｎ
。
Ｊ、ブリンク−（Ｇｒｉｎｔｅｒ ） ）などがある。
ひとつの微生物内へその微生物の染色体へ組込１れるこ
とのできる上記の媒介体のいずれかを導入すると、その
媒介体のＤＮＡ配列自体が染色体配列の一部となった細
菌株が生ずる。この株を引続き、第−着目の媒介体に部
分的に相同でありかつ対象の遺伝子を含むようなある識
別可能な媒介体で形質転換すると、たとえ第二番目の媒
介体が始めの微生物の染色体に由来するＤＮＡ配列を全
く含んでいなくとも、第二番目の媒介体を組込む（第一
番目の媒介体との組換えによ ）ことがでさることにな
る（ Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 ’ａＺ ｌ ８
９巻８２１〜８２５頁（１９８８）Ｅ。フエラーリ（Ｆ
ｅｒｒａｒｉ ）とＪ、Ａ、ホツヒ（Ｈｏｃｈ））。こ
のように、すでに組込み媒介体を保有する細菌株の第二
次形質転換は、対象の遺伝子の染色体組込みを行なう第
８の手段となる。
とのできる上記の媒介体のいずれかを導入すると、その
媒介体のＤＮＡ配列自体が染色体配列の一部となった細
菌株が生ずる。この株を引続き、第−着目の媒介体に部
分的に相同でありかつ対象の遺伝子を含むようなある識
別可能な媒介体で形質転換すると、たとえ第二番目の媒
介体が始めの微生物の染色体に由来するＤＮＡ配列を全
く含んでいなくとも、第二番目の媒介体を組込む（第一
番目の媒介体との組換えによ ）ことがでさることにな
る（ Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 ’ａＺ ｌ ８
９巻８２１〜８２５頁（１９８８）Ｅ。フエラーリ（Ｆ
ｅｒｒａｒｉ ）とＪ、Ａ、ホツヒ（Ｈｏｃｈ））。こ
のように、すでに組込み媒介体を保有する細菌株の第二
次形質転換は、対象の遺伝子の染色体組込みを行なう第
８の手段となる。
前記の各タイプの媒介体からひとつをとって利用すると
いずれも宿主微生物の染色体への異種遺伝子の１複製物
の組込みを生ずる。もし宿主が、遺伝機構が不安定化す
ることなく２こ以上の複製物に耐え得るような場合には
、多数の複製物を、前記の各タイプの媒介体のうちのひ
とつあるいは２つ以上を反復して使用することにより（
１回につきひとつずつ）挿入することができる。
いずれも宿主微生物の染色体への異種遺伝子の１複製物
の組込みを生ずる。もし宿主が、遺伝機構が不安定化す
ることなく２こ以上の複製物に耐え得るような場合には
、多数の複製物を、前記の各タイプの媒介体のうちのひ
とつあるいは２つ以上を反復して使用することにより（
１回につきひとつずつ）挿入することができる。
本発明のこれらの実施例で記述した各タイプの媒介体に
関する文献中の報告によると、このような媒介体が原核
生物円でこの他の方法では不安定であるような異種遺伝
子を安定化する方法として利用できるかどうかは証明さ
れていない。本発明の方法は、種々の細菌内においてそ
の発現がそれを含むキメラプラスミドの安定な遺伝を阻
害するような種々の遺伝子を、安定化するための新たな
方法を提供する。このようにして本発明の方法により、
原核および真核起源由来のタンパ・り質を多量に産生ず
ることが可能となる。このようなタンパク質は、所在は
細胞内にも細胞外にもあり、立体配置は天然の場合も（
Ｎ製その他の目的による）修飾物の場合もある。宿主微
生物はグラム陽性生物の場合もダラム陰性生物の場合も
ある。グラム陽性微生物には、杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）属、ストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ）属、および細菌のコリネフォルム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｆｏｒｍ ）群から選ばれたものがある。ダラム陰性微
生物には、大腸菌（Ｅ８（！−ｈｅｒｉｃｈｉａ ）属
およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属
から選ばれたものがある。本発明で提出した実施例では
宿主微生物は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ）である
。
関する文献中の報告によると、このような媒介体が原核
生物円でこの他の方法では不安定であるような異種遺伝
子を安定化する方法として利用できるかどうかは証明さ
れていない。本発明の方法は、種々の細菌内においてそ
の発現がそれを含むキメラプラスミドの安定な遺伝を阻
害するような種々の遺伝子を、安定化するための新たな
方法を提供する。このようにして本発明の方法により、
原核および真核起源由来のタンパ・り質を多量に産生ず
ることが可能となる。このようなタンパク質は、所在は
細胞内にも細胞外にもあり、立体配置は天然の場合も（
Ｎ製その他の目的による）修飾物の場合もある。宿主微
生物はグラム陽性生物の場合もダラム陰性生物の場合も
ある。グラム陽性微生物には、杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）属、ストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ）属、および細菌のコリネフォルム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｆｏｒｍ ）群から選ばれたものがある。ダラム陰性微
生物には、大腸菌（Ｅ８（！−ｈｅｒｉｃｈｉａ ）属
およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属
から選ばれたものがある。本発明で提出した実施例では
宿主微生物は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ）である
。
以下の実施例は、本発明の方法をどのように実行するか
を説明１−るためのものであり、制限を力口えるための
ものではない。
を説明１−るためのものであり、制限を力口えるための
ものではない。
実施例■
染色体組込み媒介体の構築
本実施例および後続の実施例で記述するＤＮＡ操作に使
用Ｔ−制限エンドヌクレアーゼおよびその他の酵素は、
ニューイングランドバイオラブ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、） ｒベテスダ
研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ｒおよびベーリンガー・マン
ハイム生化学有限会社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ）から
購入し、特にことわらぬ限り製造者の指示に従って使用
した。
用Ｔ−制限エンドヌクレアーゼおよびその他の酵素は、
ニューイングランドバイオラブ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、） ｒベテスダ
研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ｒおよびベーリンガー・マン
ハイム生化学有限会社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ）から
購入し、特にことわらぬ限り製造者の指示に従って使用
した。
Ａ、プラスミドｐＧＸ３４５の構築
プラスミドｐＧＸ８６６（第１図）をＣ１ａＩとＢａｍ
ＨＩで分解し、ｐｃ１９４由来の１キロベース（Ｋｂ）
のＤＮＡ断片をクローン化するのに使用した（Ｊ。
ＨＩで分解し、ｐｃ１９４由来の１キロベース（Ｋｂ）
のＤＮＡ断片をクローン化するのに使用した（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 第１３４巻８１８〜８２９頁（
１９７８）Ｔ、Ｊ、グリツアン（Ｇｒｙｃｚａｎ ）ら
、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１９７８）Ｔ、Ｊ、グリツアン（Ｇｒｙｃｚａｎ ）ら
、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
第１５０巻８１５〜８２５頁（１９８２）Ｓ。ホリヌチ
（Ｈｏｒｉｎｕｃｈｉ ）とＢ、パイスプルム（Ｗ ｅ
ｉ −ｓｂｌｕｍ ） ）。この断片は、枯草菌（１
３，５１１ｂｔｉｌｉｓ ）のフロラフェニコールに対
する抵抗性を記述する遺伝子であるＣａｔを含み、同菌
内で機能する複製単位を欠く。この断片はｐｃ１９４を
ＭｓｐＩ （これによりＣ１ａＩと同一の５′末端の
張出しが生ずる）とＭｂｏＩ （これにより ＢａｍＨ
Ｉと同一の５′末端の張出しが生ずる）で分解すること
により生じた。
（Ｈｏｒｉｎｕｃｈｉ ）とＢ、パイスプルム（Ｗ ｅ
ｉ −ｓｂｌｕｍ ） ）。この断片は、枯草菌（１
３，５１１ｂｔｉｌｉｓ ）のフロラフェニコールに対
する抵抗性を記述する遺伝子であるＣａｔを含み、同菌
内で機能する複製単位を欠く。この断片はｐｃ１９４を
ＭｓｐＩ （これによりＣ１ａＩと同一の５′末端の
張出しが生ずる）とＭｂｏＩ （これにより ＢａｍＨ
Ｉと同一の５′末端の張出しが生ずる）で分解すること
により生じた。
連結後、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）細胞を前記のように
して形質転換した。（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、第１２６
巻３４７〜３６５頁（１９７８）Ｍ、Ｓ、グヤー。。。
して形質転換した。（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、第１２６
巻３４７〜３６５頁（１９７８）Ｍ、Ｓ、グヤー。。。
９８４３１．。ｒ ａ ３，８Ｊ）ｉ＃、Ｘ、ＥＦＩＪ
ｊ ）。つゆ １転換細胞をアンピリジン８０μｓ／ｍ
ｌとクロラムフェニコールｌＯμ、Ｆ／ｄを含むＬ寒天
（１１−リプトン（デトロイトのディ７コ研究所株式会
社（Ｄｉｆｃｏ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＪｎｃ、
）、０．５％酵母抽出物（同上〕、１％ＮａＣ７、１，
５％寒天（同上））上で選別した。この結果化じたＣａ
ｔ含有プラスミド（第１図）をｐＧＸ ８４５と命名し
た。
ｊ ）。つゆ １転換細胞をアンピリジン８０μｓ／ｍ
ｌとクロラムフェニコールｌＯμ、Ｆ／ｄを含むＬ寒天
（１１−リプトン（デトロイトのディ７コ研究所株式会
社（Ｄｉｆｃｏ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＪｎｃ、
）、０．５％酵母抽出物（同上〕、１％ＮａＣ７、１，
５％寒天（同上））上で選別した。この結果化じたＣａ
ｔ含有プラスミド（第１図）をｐＧＸ ８４５と命名し
た。
Ｂ、プラスミドｐＧＸ２８１とプラスミドｐＧＸ ２８
２の構築 プラスミドｐＧＸ ８４５をブルント（ｂｌｕｎｔ ）
末端を生ずる制限酵素であるＮｒｕＩで分解した。枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｎｂｔｉｌｉｓ ）株のＢＲ
１５１（ｍ由来のＤＮＡをやはりブルント末端を生ずる
酵素であるＰｖｕＩＩで一分解した（ ＨＪ、Ｂａｃｔ
ｅｒ ｉｏ ｌ 、第１２７巻８１７〜８２８頁（１９
７６）Ｐ、Ｓ、ラベット（Ｌｏｖｅｔｔ ）ら）。開環
したｐＧＸ ８４５と枯草菌ＤＮＡを連続し、ついで形
質転換細胞をｐＧＸ ８４５の単離での記述に従って単
離した。本実験から、ｐＧＸ２８１（枯草菌ＤＮＡ由来
の１．１キロベース（Ｋｂ）の挿入物を含む）およびｐ
ＧＸ ２８２ （枯草菌ＤＮＡ由来の８キロベース（Ｋ
ｂ ）の挿入物を含む）と命名したプラスミドを含む細
菌株が単離された（第２図と第１表参照）。枯草菌株Ｂ
Ｒ１５１をｐＧＸ２８１で形質転換し、ＧＸ２４９９を
含めてｃｍＲ形質転換細胞を単離した。枯草菌株ＢＲ１
５１に受容能を与え、Ｃ，アナグツストポラス（Ａｎａ
ｇｎｏｓｔｏｐｏｎｌｏｓ ）とＪ、シュピツィツェン
（５ｐｉｚｉｚｅｎ ）の方法（Ｊ。
２の構築 プラスミドｐＧＸ ８４５をブルント（ｂｌｕｎｔ ）
末端を生ずる制限酵素であるＮｒｕＩで分解した。枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｎｂｔｉｌｉｓ ）株のＢＲ
１５１（ｍ由来のＤＮＡをやはりブルント末端を生ずる
酵素であるＰｖｕＩＩで一分解した（ ＨＪ、Ｂａｃｔ
ｅｒ ｉｏ ｌ 、第１２７巻８１７〜８２８頁（１９
７６）Ｐ、Ｓ、ラベット（Ｌｏｖｅｔｔ ）ら）。開環
したｐＧＸ ８４５と枯草菌ＤＮＡを連続し、ついで形
質転換細胞をｐＧＸ ８４５の単離での記述に従って単
離した。本実験から、ｐＧＸ２８１（枯草菌ＤＮＡ由来
の１．１キロベース（Ｋｂ）の挿入物を含む）およびｐ
ＧＸ ２８２ （枯草菌ＤＮＡ由来の８キロベース（Ｋ
ｂ ）の挿入物を含む）と命名したプラスミドを含む細
菌株が単離された（第２図と第１表参照）。枯草菌株Ｂ
Ｒ１５１をｐＧＸ２８１で形質転換し、ＧＸ２４９９を
含めてｃｍＲ形質転換細胞を単離した。枯草菌株ＢＲ１
５１に受容能を与え、Ｃ，アナグツストポラス（Ａｎａ
ｇｎｏｓｔｏｐｏｎｌｏｓ ）とＪ、シュピツィツェン
（５ｐｉｚｉｚｅｎ ）の方法（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第８１巻７４１〜７４６頁（１９
６１））の修飾法により形質転換した。受容能のある細
胞を調製するため、枯草菌株ＢＲ１５１をＬ寒天または
トリプトース血液寒天培養基（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）
社製〕で８７℃で一晩生育はせた。細胞を（リジン、ト
リプトファン、メチオニン各５０μｇ／７ｄずつを補充
した）ＳＰＩ培養培養液１９甲ｌ甲濁したところ、グリ
ーン、フィルター付きのＫｌｅｔｔ −８ｕｍｍｅ ｒ
ｓ ｏ ｎ比色計にューヨークのクレット製造会社（
Ｋｌｅｔｔ Ｍｆｇ、Ｃｏ。）製）で５０〜７ｏの読み
を示した。ＳＰＩ培養液の組Ｘは、１．４％に２ＨＰ０
４．０．６チ順２ ＰＯ２，０，２％（ＮＨ４） ２
Ｓ ０４．０．１チクエン酸ナトリウム２水塩、０．５
％ブドウ糖、０．１％醇分母抽出物ディフコ社製）、０
．０２％バクトヵサミノ（Ｂａｃｔｏ −Ｃａｓａｍｉ
ｎｏ ） ＷＲ（ディフコ社製）、および０．０２％Ｍ
ｇＳＯ４、７Ｈ，０である。培養基を回転振盪器上で（
”２００〜２５０ ｒｐｍ ）、対数増殖期が終わりｍ
胞が定°常期初期に達するまで、８ないし４時間半８７
℃に保温した。次に細胞を０、５ ｒｒＭＣａ（Ｊ！２
を補充した同上の培養ｇｖｃ入れて１０倍希釈した。さ
らに９０分間保温を続けた。その後細胞を室温で５分間
遠心分離し、ｌ／１０容の使用済培養液に再び懸濁した
。細胞懸濁液をＩＴｎｌずつに分注し、液体窒素中で凍
結し、用途にそなえて一８０°Ｃで保存した。
６１））の修飾法により形質転換した。受容能のある細
胞を調製するため、枯草菌株ＢＲ１５１をＬ寒天または
トリプトース血液寒天培養基（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）
社製〕で８７℃で一晩生育はせた。細胞を（リジン、ト
リプトファン、メチオニン各５０μｇ／７ｄずつを補充
した）ＳＰＩ培養培養液１９甲ｌ甲濁したところ、グリ
ーン、フィルター付きのＫｌｅｔｔ −８ｕｍｍｅ ｒ
ｓ ｏ ｎ比色計にューヨークのクレット製造会社（
Ｋｌｅｔｔ Ｍｆｇ、Ｃｏ。）製）で５０〜７ｏの読み
を示した。ＳＰＩ培養液の組Ｘは、１．４％に２ＨＰ０
４．０．６チ順２ ＰＯ２，０，２％（ＮＨ４） ２
Ｓ ０４．０．１チクエン酸ナトリウム２水塩、０．５
％ブドウ糖、０．１％醇分母抽出物ディフコ社製）、０
．０２％バクトヵサミノ（Ｂａｃｔｏ −Ｃａｓａｍｉ
ｎｏ ） ＷＲ（ディフコ社製）、および０．０２％Ｍ
ｇＳＯ４、７Ｈ，０である。培養基を回転振盪器上で（
”２００〜２５０ ｒｐｍ ）、対数増殖期が終わりｍ
胞が定°常期初期に達するまで、８ないし４時間半８７
℃に保温した。次に細胞を０、５ ｒｒＭＣａ（Ｊ！２
を補充した同上の培養ｇｖｃ入れて１０倍希釈した。さ
らに９０分間保温を続けた。その後細胞を室温で５分間
遠心分離し、ｌ／１０容の使用済培養液に再び懸濁した
。細胞懸濁液をＩＴｎｌずつに分注し、液体窒素中で凍
結し、用途にそなえて一８０°Ｃで保存した。
形質転換用に、凍結した受容能保有細胞を８７℃で速や
かに解かし、ＳＰＩの場合と同様にアミノ酸を補充した
５ＰＩＩ培養液を等各別えて希釈した。５ＰＩＩは、１
１ｖｉｇＳＯ４羨ｆが０．０４％に増加し２ｍＭエチレ
ングリコール・ビス・（βアミノエチルエーテル）Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）を添加した点を除き
、ＳＰＩと同じものである。細胞０．５ＭをＤＮＡ０．
ｌないし５μｍと１８ Ｘ １００頭のガラス管内で混
合した。細胞懸濁液を往復振盃水浴（フィッシャー・サ
イエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ｃｏ、 ）製、目盛り６）中で８０分間８．７
”Ｃに保温した。試料Ｑ、 ｌ ｍｌを、４８℃で溶解
した０、７％バクト寒天（Ｂａｃｔｏ −ａｇａｒ。
かに解かし、ＳＰＩの場合と同様にアミノ酸を補充した
５ＰＩＩ培養液を等各別えて希釈した。５ＰＩＩは、１
１ｖｉｇＳＯ４羨ｆが０．０４％に増加し２ｍＭエチレ
ングリコール・ビス・（βアミノエチルエーテル）Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）を添加した点を除き
、ＳＰＩと同じものである。細胞０．５ＭをＤＮＡ０．
ｌないし５μｍと１８ Ｘ １００頭のガラス管内で混
合した。細胞懸濁液を往復振盃水浴（フィッシャー・サ
イエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ｃｏ、 ）製、目盛り６）中で８０分間８．７
”Ｃに保温した。試料Ｑ、 ｌ ｍｌを、４８℃で溶解
した０、７％バクト寒天（Ｂａｃｔｏ −ａｇａｒ。
ティフコ社製）２．５７ｄに添加し、Ｌ寒天平板培地上
に注いだ。平板培地を１時間３７℃に保存した後、入手
したい形質転換細胞を選択するのに適した抗生物質を含
む（平板培地で９最終濃度はクロラムフェニコール１０
μ９／Ｔｄｔｉたはカナマイシン５μｍ１／ｍｌ ）
０．’７チ寒天液２５ｍ１をその上に重層した。平板培
地を１晩８７℃に保温した。ＧＸ２４９９由米の細胞Ｄ
ＮＡは、グル転換雑種形成（ｐｒｏ。
に注いだ。平板培地を１時間３７℃に保存した後、入手
したい形質転換細胞を選択するのに適した抗生物質を含
む（平板培地で９最終濃度はクロラムフェニコール１０
μ９／Ｔｄｔｉたはカナマイシン５μｍ１／ｍｌ ）
０．’７チ寒天液２５ｍ１をその上に重層した。平板培
地を１晩８７℃に保温した。ＧＸ２４９９由米の細胞Ｄ
ＮＡは、グル転換雑種形成（ｐｒｏ。
Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ 、 ｍ ７６巻８６
ｓ−ｍ 〜８６ ｓ ７頁（１９７９’）Ｇ’、Ｍ、
ヴアール（Ｗｏｈｌ）ら）により、切断翻訳された（
Ｊ 、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、第１．１８巻２３７〜２５
１頁（１９７７）Ｐ、Ｗ、Ｊ 、リグビー（Ｒｉｇｂｙ
）ら）線形のＰＧＸ ２４１８ （下記参照）をプロ
ーブとして分析した。細胞ＤＮＡを種々の制限酵累のい
ずれかひとつあるいはそれらの組合せにより分解すると
、ＤＮＡの雑種形成パターンは、媒介体全体の複製物１
こが枯草菌染色体上の相同部位に挿入された場合に予想
されるパターンに一致した（第１表）。同パターンは、
細胞内に遊離のプラスミドが存在した場合およびプラス
ミド複製物多数（同方向あるいは逆方向で）が染色体へ
組込まれた場合に予想されるパターンのいずれとも一致
しなかった。
ｓ−ｍ 〜８６ ｓ ７頁（１９７９’）Ｇ’、Ｍ、
ヴアール（Ｗｏｈｌ）ら）により、切断翻訳された（
Ｊ 、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、第１．１８巻２３７〜２５
１頁（１９７７）Ｐ、Ｗ、Ｊ 、リグビー（Ｒｉｇｂｙ
）ら）線形のＰＧＸ ２４１８ （下記参照）をプロ
ーブとして分析した。細胞ＤＮＡを種々の制限酵累のい
ずれかひとつあるいはそれらの組合せにより分解すると
、ＤＮＡの雑種形成パターンは、媒介体全体の複製物１
こが枯草菌染色体上の相同部位に挿入された場合に予想
されるパターンに一致した（第１表）。同パターンは、
細胞内に遊離のプラスミドが存在した場合およびプラス
ミド複製物多数（同方向あるいは逆方向で）が染色体へ
組込まれた場合に予想されるパターンのいずれとも一致
しなかった。
第１表
ＧＸ ２４９＜ＨＣＸ’ｆる５ｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏ
ｔ実験の結果の贅とめ５・７５，７ Ｃ，プラスミドｐＧＸ２８４の構築 プラスミドｐＧＸ ３４５をＥｃｏＲＩで分解し、枯草
菌Ｄ Ｎ Ａ （ＢＲ１５１株誘導物から入手）のＥｃ
ｏＲＩ断片をクローン培養するのに使用した。形質転換
細胞を前記と同様に単離し、ｐＧＸ’２８４− ｐＧＸ
２８９と命名した組込み媒介体を単離しｆ′ｃｏこの
グループのプラスミド内の枯草菌ＤＮＡ挿入物の大きさ
は、０６ないし５キロベース（ｋｂ）である（第１表ニ
一部の媒介体は枯草［ＤＮＡ断片を２こもつことに注意
）。種々の組込み媒介体の枯草菌形質転換能力には１０
０倍以上の差があり（第２表）おそらく各プラスミドが
持つ特定の挿入物の性質に依存したものと考えられる。
ｔ実験の結果の贅とめ５・７５，７ Ｃ，プラスミドｐＧＸ２８４の構築 プラスミドｐＧＸ ３４５をＥｃｏＲＩで分解し、枯草
菌Ｄ Ｎ Ａ （ＢＲ１５１株誘導物から入手）のＥｃ
ｏＲＩ断片をクローン培養するのに使用した。形質転換
細胞を前記と同様に単離し、ｐＧＸ’２８４− ｐＧＸ
２８９と命名した組込み媒介体を単離しｆ′ｃｏこの
グループのプラスミド内の枯草菌ＤＮＡ挿入物の大きさ
は、０６ないし５キロベース（ｋｂ）である（第１表ニ
一部の媒介体は枯草［ＤＮＡ断片を２こもつことに注意
）。種々の組込み媒介体の枯草菌形質転換能力には１０
０倍以上の差があり（第２表）おそらく各プラスミドが
持つ特定の挿入物の性質に依存したものと考えられる。
第２表
染色体組込媒介体によるＢＲＩ５１の形質転換−〈１
ｐＧＸ ８４５
＜１ｐＧＸ ２８１ １
５ｐＧＸ ２８２． ８
１４５ｐＧＸ ２８４
１． ２ ８９ｐＧＸ ２８５
１． ２ ２２０ｐＧＸ ２
８６ ２．５ ６００
ｐＧＸ ２８８ Ｂ、 ８．５
２４ｐｃｘ ２８９ ５
４７５ｐＧＸ２４１８
１ ’ ２ｐＧＸ ２４１４
１ ３（ａｔ 第２
表記載の実験では、供与体ＤＮＡを１μｊｉ／ｍｌの濃
度で受容体細胞と混合した。形質転換した反応液Ｑ、
ｌ ｍｌを平板培地上にまいて得たＣｍＲ形質転換細胞
数を表に示す。
＜１ｐＧＸ ２８１ １
５ｐＧＸ ２８２． ８
１４５ｐＧＸ ２８４
１． ２ ８９ｐＧＸ ２８５
１． ２ ２２０ｐＧＸ ２
８６ ２．５ ６００
ｐＧＸ ２８８ Ｂ、 ８．５
２４ｐｃｘ ２８９ ５
４７５ｐＧＸ２４１８
１ ’ ２ｐＧＸ ２４１４
１ ３（ａｔ 第２
表記載の実験では、供与体ＤＮＡを１μｊｉ／ｍｌの濃
度で受容体細胞と混合した。形質転換した反応液Ｑ、
ｌ ｍｌを平板培地上にまいて得たＣｍＲ形質転換細胞
数を表に示す。
実施例■
ｂｌａｚの安定化
ｂｌａｚは黄已ブドウ球菌プラスミドｐＩ ２５８ Ｃ
Ｐｉａｓｍｉｄ第２巻１０９〜１２９頁Ｃ１９７９）
Ｒ。
Ｐｉａｓｍｉｄ第２巻１０９〜１２９頁Ｃ１９７９）
Ｒ。
Ｐ、ノヴイク（Ｎｏｖｔｃｋ ）ら）中に見出されたβ
ラクタマーゼを暗号化する。Ｋ、ティミス（Ｔｉｍｍｉ
ｓ）らはｐＩ ２５８由来の７キロベース（Ｋｂ ）の
ＥｃｏＲＩ断片をｐｓｃ １０１内にクローン化し、ｐ
ｓｃ 、１２２を作り出した（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７２巻２２４２〜２２
４６頁（１９’７５ ） ）。次に、Ｊ、Ｒ。
ラクタマーゼを暗号化する。Ｋ、ティミス（Ｔｉｍｍｉ
ｓ）らはｐＩ ２５８由来の７キロベース（Ｋｂ ）の
ＥｃｏＲＩ断片をｐｓｃ １０１内にクローン化し、ｐ
ｓｃ 、１２２を作り出した（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７２巻２２４２〜２２
４６頁（１９’７５ ） ）。次に、Ｊ、Ｒ。
マクラフリン（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ）らの実験（Ｊ
、Ｂｉｏｌ。
、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 ｆｊｇ ２５６巻１１２７８〜１１２８２
頁（１９８１））を繰り返して、ｂｌａｚ含有ＥｃｏＲ
Ｉ断片をｐｓｃ １２２からより高い複製数の複製単位
ｐＭＢ ９ （Ｇｅｎｅ第２巻７５〜’；Ｊ８頁’（１
９７７） Ｆ 、ポリバー（’Ｂｏｌｉ’ｖｅｒ ）ら
）内へ再クローン化し、ｐＧＸ８００を作り出した。ｐ
Ｉ ２５８由来ＤＮＡの存在量を減らすため、ｐＧＸ
８００ ’ｉ ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃ ｏＲＩで分解し
自己連結させた。回収したＡｐ 形質転換細胞の中か
ら、より小型のプラスミドを含む２種の株を単離した。
頁（１９８１））を繰り返して、ｂｌａｚ含有ＥｃｏＲ
Ｉ断片をｐｓｃ １２２からより高い複製数の複製単位
ｐＭＢ ９ （Ｇｅｎｅ第２巻７５〜’；Ｊ８頁’（１
９７７） Ｆ 、ポリバー（’Ｂｏｌｉ’ｖｅｒ ）ら
）内へ再クローン化し、ｐＧＸ８００を作り出した。ｐ
Ｉ ２５８由来ＤＮＡの存在量を減らすため、ｐＧＸ
８００ ’ｉ ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃ ｏＲＩで分解し
自己連結させた。回収したＡｐ 形質転換細胞の中か
ら、より小型のプラスミドを含む２種の株を単離した。
これらのプラスミドｐＧＸ ８１１およびｐＧＸ ８１
０と命名した。
０と命名した。
ｐＧＸ２８１をＥｃｏＲＩで分離し、ｐＧＸ ８１’０
由米のｂｌａｚを含むＥｃ ｏＲＩ断片をタロンス化す
るための媒介体として使用した（第８図）。形質転換細
胞はｐＧＸ ８４５の場合と同様に単離した。得られた
Ａｐ”Ｃｍ”単離体は、ｐＧＸ ２４１８と命名された
プラスミドひとつを含む株であるＧＸ２４８９と１）Ｇ
Ｘ ｚ４１４ と命名さ几たプラスミドひとつを含む
株でおるＧＸ２４９０であった。この２つのプラスミド
はｂｌａｚ断片がｐＧＸ ２８１内へ挿入される方向の
みが異なるものでβる（第８図）。ｐＧＸ２４１Ｂとｐ
ＧＸ２４１４はとの親のｐＧＸ２８１と同一の頻度で枯
草菌をＣｍ −＼形１Ｍ転喚する（ｊｌＪ２表）。ｐＧ
Ｘ２４１８ オｊ： ヒｐＧＸ２４１小形／、’４を転
侠軸胎はβラクタマーゼを産生する（βラクタマーゼ産
生量はＣｅｆｉｎａｓｅ ツイスタ（ベタトン０デイ
キモ ａｎｄ Ｃｏ、） ）を提供者（Ｂ Ｂ Ｍミクロバイ
オロジーシステム（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｙｓｔ
ｅｍｓ ）メリーラント州コツキースピル任）の指示Ｖ
Ｃ従って使用することにより、活性測定した〕。βラク
タマーゼ産生能力はＣａｔ保有に関する選択性の不在下
で生育期間を通じて安定である（藁８表〕。
由米のｂｌａｚを含むＥｃ ｏＲＩ断片をタロンス化す
るための媒介体として使用した（第８図）。形質転換細
胞はｐＧＸ ８４５の場合と同様に単離した。得られた
Ａｐ”Ｃｍ”単離体は、ｐＧＸ ２４１８と命名された
プラスミドひとつを含む株であるＧＸ２４８９と１）Ｇ
Ｘ ｚ４１４ と命名さ几たプラスミドひとつを含む
株でおるＧＸ２４９０であった。この２つのプラスミド
はｂｌａｚ断片がｐＧＸ ２８１内へ挿入される方向の
みが異なるものでβる（第８図）。ｐＧＸ２４１Ｂとｐ
ＧＸ２４１４はとの親のｐＧＸ２８１と同一の頻度で枯
草菌をＣｍ −＼形１Ｍ転喚する（ｊｌＪ２表）。ｐＧ
Ｘ２４１８ オｊ： ヒｐＧＸ２４１小形／、’４を転
侠軸胎はβラクタマーゼを産生する（βラクタマーゼ産
生量はＣｅｆｉｎａｓｅ ツイスタ（ベタトン０デイ
キモ ａｎｄ Ｃｏ、） ）を提供者（Ｂ Ｂ Ｍミクロバイ
オロジーシステム（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｙｓｔ
ｅｍｓ ）メリーラント州コツキースピル任）の指示Ｖ
Ｃ従って使用することにより、活性測定した〕。βラク
タマーゼ産生能力はＣａｔ保有に関する選択性の不在下
で生育期間を通じて安定である（藁８表〕。
組込１れたｂｌａｚの動向と対照的に、ｂｌａｚを含む
遺伝子断片を多板製プラスミド媒介体を使って枯草菌内
でクローン化しようとする捜々の試みは、失敗に終わっ
た。たとえば、ｂｌａｚを枯草菌内に確立しようとする
試みでは、可能性のあるシャトル媒介体がｐＧＸ８１１
から構簗された。ＨｉｎｄＩＩＩで分解したｐ Ｃ１９
４をｐＧＸ３１１のＨｉｎｄＩＩＩ部位で挿入し、ｐＧ
Ｘ３１４と命名されたプラスミドを作った。同様にして
ＢａｍＨＩで分解したｐＵＢ １１０ （前記Ｔ、Ｊ。
遺伝子断片を多板製プラスミド媒介体を使って枯草菌内
でクローン化しようとする捜々の試みは、失敗に終わっ
た。たとえば、ｂｌａｚを枯草菌内に確立しようとする
試みでは、可能性のあるシャトル媒介体がｐＧＸ８１１
から構簗された。ＨｉｎｄＩＩＩで分解したｐ Ｃ１９
４をｐＧＸ３１１のＨｉｎｄＩＩＩ部位で挿入し、ｐＧ
Ｘ３１４と命名されたプラスミドを作った。同様にして
ＢａｍＨＩで分解したｐＵＢ １１０ （前記Ｔ、Ｊ。
グリチャン（Ｇｒｙｃｚａｎ ）ら）をｐｃｘ ａｌｌ
のＢａｍＨＩ部位で挿入し、ｐＧＸ３１２と命名された
プラスミドを作った。ｐＧＸ８１２とｐＧＸ８１４は受
容ｈヒのめるＢＲ１５１細胞をそれぞれ血 および蝕へ
形質転換したが効率は非常に低かった。検査した丁べて
の場合において、得られる数少ない形質転換細胞は、大
きさと制限パターンがその親のプラスミドと非常に異な
るプラスミドを保有していた。特に、ｂｌａｚはこれら
の形質転換細胞のいずれかにおいても１、無傷な状態に
おるとは思われ万かった。
のＢａｍＨＩ部位で挿入し、ｐＧＸ３１２と命名された
プラスミドを作った。ｐＧＸ８１２とｐＧＸ８１４は受
容ｈヒのめるＢＲ１５１細胞をそれぞれ血 および蝕へ
形質転換したが効率は非常に低かった。検査した丁べて
の場合において、得られる数少ない形質転換細胞は、大
きさと制限パターンがその親のプラスミドと非常に異な
るプラスミドを保有していた。特に、ｂｌａｚはこれら
の形質転換細胞のいずれかにおいても１、無傷な状態に
おるとは思われ万かった。
第 ８ 表
組込みプラスミドを持つ枯草菌株の安定性ＧＸ２４９５
ｐＧＸ２８１ ８８／８２ ０／９ ７／
７ ０／ＩＧＸ２４９４ ｐＧＸ２４１８ １し’
１１ １０／１０ ’Ｊ−’ＩＡ’ｌ ６／６Ｇ
Ｘ２４９８ ｐＧＸ２４１４ ８９／８９ ６／６
１３／１８ ４／４（ａｔ組込み媒介体を持つ
株の安定性を検査するため、種々の株を薬剤を含まぬＬ
寒天平板培地に毎日つぎ足して６〜１０日間副次培養し
た。この試料を薬剤を含まぬし寒天上に線条接種した。
ｐＧＸ２８１ ８８／８２ ０／９ ７／
７ ０／ＩＧＸ２４９４ ｐＧＸ２４１８ １し’
１１ １０／１０ ’Ｊ−’ＩＡ’ｌ ６／６Ｇ
Ｘ２４９８ ｐＧＸ２４１４ ８９／８９ ６／６
１３／１８ ４／４（ａｔ組込み媒介体を持つ
株の安定性を検査するため、種々の株を薬剤を含まぬＬ
寒天平板培地に毎日つぎ足して６〜１０日間副次培養し
た。この試料を薬剤を含まぬし寒天上に線条接種した。
次に単一コロ＝−ヲｍ取ｔ、、クロラムフェニコール抵
抗性（Ｃｍ 、 ）とβラクタマーゼ産生（Ｂｌａ ）
に関して検定した。もう１つの検査では、培養株を薬剤
を含まぬ液体培地で８０世代生育させた。単一コロニー
をＬ寒天上に単離し、クロラムフェニコール抵抗性とβ
ラクタマーゼ産生について検定した。
抗性（Ｃｍ 、 ）とβラクタマーゼ産生（Ｂｌａ ）
に関して検定した。もう１つの検査では、培養株を薬剤
を含まぬ液体培地で８０世代生育させた。単一コロニー
をＬ寒天上に単離し、クロラムフェニコール抵抗性とβ
ラクタマーゼ産生について検定した。
実施例■
ｐｒａの安定化
ｐｒａ遺伝子は黄色ブドウ球菌（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ ）
株から単離され、Ａタンパク質を暗号化する。ｐｒ
ａ遺伝子をＰＳＰＡＩ （Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ 、Ｕ 、 Ｓ 、 Ａ 、第８０巻６９７〜７
０１頁（１９８Ｂ）Ｓ、ロフダル（Ｌｏｆ’ｄａｈｌ
）ら）からシャトル媒介体ｐＧＸ ２５１内へ副次的に
クローン化した（ ｐＧＸ ２５１は、ＰｖｕＴ、Ｉで
分解したｐｃ １９４をＮｒｕＩで分解したｐＧＸｆ３
１５と連結した彼、大腸菌を形質転換し、ＡｐＣｍ 形
質転換細胞を選別することにより作成した（第４図〕。
株から単離され、Ａタンパク質を暗号化する。ｐｒ
ａ遺伝子をＰＳＰＡＩ （Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ 、Ｕ 、 Ｓ 、 Ａ 、第８０巻６９７〜７
０１頁（１９８Ｂ）Ｓ、ロフダル（Ｌｏｆ’ｄａｈｌ
）ら）からシャトル媒介体ｐＧＸ ２５１内へ副次的に
クローン化した（ ｐＧＸ ２５１は、ＰｖｕＴ、Ｉで
分解したｐｃ １９４をＮｒｕＩで分解したｐＧＸｆ３
１５と連結した彼、大腸菌を形質転換し、ＡｐＣｍ 形
質転換細胞を選別することにより作成した（第４図〕。
定義によれば、シャトル媒介体とは２つの宿主内で複製
することのできる媒介体であり、ｐＧＸ２５１は大腸菌
と枯草菌の双方で複製できる）。
することのできる媒介体であり、ｐＧＸ２５１は大腸菌
と枯草菌の双方で複製できる）。
ｐＧＸ２５１をＥｃｏＲＶで分解しｐｒａを含むｐｓＰ
ＡｌのＥｃｏＲＶ断片をクローン化するのに使用した（
第４図）。形質転換細胞をｐＧＸ ８４５の場合と同様
に単離した。大腸菌のＡｐ Ｃｍ 形質転換細胞は、
１）ＧＸ２９０１と命名されたプラスミドを含む株であ
るＧＸ８８１１とｐＧＸ ２９０２ と命名されたプ
ラスミドを含む株であるＧＸ８８１２であった。この２
つのプラスミドは、ｐｒａ断片がｐＧＸ２５１へ挿入さ
れる方向のみ・が異なったものでおる（第４図）。
ＡｌのＥｃｏＲＶ断片をクローン化するのに使用した（
第４図）。形質転換細胞をｐＧＸ ８４５の場合と同様
に単離した。大腸菌のＡｐ Ｃｍ 形質転換細胞は、
１）ＧＸ２９０１と命名されたプラスミドを含む株であ
るＧＸ８８１１とｐＧＸ ２９０２ と命名されたプ
ラスミドを含む株であるＧＸ８８１２であった。この２
つのプラスミドは、ｐｒａ断片がｐＧＸ２５１へ挿入さ
れる方向のみ・が異なったものでおる（第４図）。
枯草菌ＢＲＩ５１をｐＧＸ２９０１で形質転換する試み
からは何の形質転換細胞も得られなかった。
からは何の形質転換細胞も得られなかった。
ｐＧＸ２９０２による形質転換からは少数の伽 コロニ
ーが得られた。しかし、このような単離体のひとつでろ
るＧＸ８８０８に関して示すように（第４表）これらは
非常に不安定であった。したがってｐｒａは枯草菌内で
少なくとも１つのプラスミド媒介体上では安定に維持で
れることのできない、もう１つの遺伝子である。
ーが得られた。しかし、このような単離体のひとつでろ
るＧＸ８８０８に関して示すように（第４表）これらは
非常に不安定であった。したがってｐｒａは枯草菌内で
少なくとも１つのプラスミド媒介体上では安定に維持で
れることのできない、もう１つの遺伝子である。
これらの結果と比較するｐｒａ含有組込み媒介体を作成
すルｆｃめ、ｐＧＸ ２８４ ’ｘ ＥｃｏＲＶ ｆ分
解しｐｓＰＡｌのｐｒａ含有ＥｃｏＲＶ断片をクローン
化するのに使用した（第５図）。得られたＡｐ 大腸
菌形質転換細胞のうち、１つの株はｐｒａ ＥｃｏＲＶ
断片の複製ｗＪ１こを持つプラスミドｐＧＸ２９０７を
含むＧＸ ａａ２ｏであり、もう１つの株はｐｒａ Ｅ
ｃｏＲＶ断片の複製物２こをもつプラスミドｐＧＸ２９
０７−２を含むＧＸ ８３２０−２であった。形質転換
株ＧＸ３８２０は、メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプカルチャーφコレクショ７ （Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｍｅ Ｃｏ１１−ｃｔｉｏ
ｎ ）に寄託しＡ Ｔ ＣＣＮｏ、 ８９３４４と命名
した。
すルｆｃめ、ｐＧＸ ２８４ ’ｘ ＥｃｏＲＶ ｆ分
解しｐｓＰＡｌのｐｒａ含有ＥｃｏＲＶ断片をクローン
化するのに使用した（第５図）。得られたＡｐ 大腸
菌形質転換細胞のうち、１つの株はｐｒａ ＥｃｏＲＶ
断片の複製ｗＪ１こを持つプラスミドｐＧＸ２９０７を
含むＧＸ ａａ２ｏであり、もう１つの株はｐｒａ Ｅ
ｃｏＲＶ断片の複製物２こをもつプラスミドｐＧＸ２９
０７−２を含むＧＸ ８３２０−２であった。形質転換
株ＧＸ３８２０は、メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプカルチャーφコレクショ７ （Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｍｅ Ｃｏ１１−ｃｔｉｏ
ｎ ）に寄託しＡ Ｔ ＣＣＮｏ、 ８９３４４と命名
した。
ｐＧＸ ２９０７とｐＧＸ ２９０７−２は共に枯草閉
を形質転換しＧＸ ８８（１８よりもはるかに安定なら
形質転換細胞を生じた（第４表）。第４表に記載の結
果は安定性に関して、株毎におよび染色体に組込捷れた
ｐｒａを含む株についての実験毎にバラツキを示してい
るが、このような株は明らかに、ｐｒａをプラスミド内
にもつ株よりもはるかに安定である。
を形質転換しＧＸ ８８（１８よりもはるかに安定なら
形質転換細胞を生じた（第４表）。第４表に記載の結
果は安定性に関して、株毎におよび染色体に組込捷れた
ｐｒａを含む株についての実験毎にバラツキを示してい
るが、このような株は明らかに、ｐｒａをプラスミド内
にもつ株よりもはるかに安定である。
第４表
ｐｒａをもつ枯草菌株の安定性
株 世代数（ｄ１’ 、Ｒ＋ｔｅ１％
Ｏｎ Ｐｒａ 実験１ 実験２ ＧＸ３３０２−２ａ’ ５ １００ １
００１５ ７０ ６４ ２５ ’ ５ ６７３５
１０ ６０ ＧＸ８８０５ｂ５ １００ −１５
９５ −− ２５ １００ −一 ８５ ８０ −− ＧＸ３ｇ＋）５〜２ ５ １００
−１５ ’ １００ −−２５
９５ −− ３５ ８５ −− ＧＸ８３０８ ５ ＜５ −
１５ 、 ＜５ −−（ａｌ ＧＸ
８８０２−２はｐＧＸ２９０７−２で形質転換したＢＲ
Ｌ５１である。
Ｏｎ Ｐｒａ 実験１ 実験２ ＧＸ３３０２−２ａ’ ５ １００ １
００１５ ７０ ６４ ２５ ’ ５ ６７３５
１０ ６０ ＧＸ８８０５ｂ５ １００ −１５
９５ −− ２５ １００ −一 ８５ ８０ −− ＧＸ３ｇ＋）５〜２ ５ １００
−１５ ’ １００ −−２５
９５ −− ３５ ８５ −− ＧＸ８３０８ ５ ＜５ −
１５ 、 ＜５ −−（ａｌ ＧＸ
８８０２−２はｐＧＸ２９０７−２で形質転換したＢＲ
Ｌ５１である。
（ｂｌ ＧＸ ８８０５はｐＧＸ ２９０？ （ＡＴＣ
ＣＮｏ、 ８９８４５ ）で形質転換した枯草菌１ｓ５
８（ＳｐｏＯＡ△６７７、バシラス・ゲネテイツクΦス
トックΦセンター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ
５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）から入手）である。
ＣＮｏ、 ８９８４５ ）で形質転換した枯草菌１ｓ５
８（ＳｐｏＯＡ△６７７、バシラス・ゲネテイツクΦス
トックΦセンター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ
５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）から入手）である。
ｆｃｌ、ＧＸ ８３０５−２は１）ＧＸ２９０７−２で
形質転換したＢＲ１５，１である。
形質転換したＢＲ１５，１である。
（ｄｌ細胞はＡＭＰ（抗生物質培養液第８＠（ティフコ
製））中で表示の世代数だけ生育した。
製））中で表示の世代数だけ生育した。
（ｅｊＡタンパク買はロフダール（Ｌｏｆｄａｈｌ ）
らの記載（前掲）に従って活性測定した。
らの記載（前掲）に従って活性測定した。
実施例ＩＶ
ａｍｙ Ｂ Ａ ２の安定化
デンプン液化杆ｒＡ（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃ
ｉｅｎｓ ）ＡＴＣＣ２８８４４の染色体ＤＮＡをＭｂ
ｏｌで部分分解した（断片の大きさが平均４キロベース
（ｋｂ）となるような反応条件を使用、反応は等容のフ
ェノール：クロロホルム（１：１）を加えて停止させた
）。分解物を（モル比ｌ：１およびＤＮ、Ａ総濃度３０
０μ、！９膚で） Ｂａ吐■で分解した媒介体ｐＢＤ
６４ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ第１４１巻２４６〜２
５８頁（１９８０）Ｔ、Ｊ 、グリチャン（Ｇｒｙｃｚ
ａｎ ）ら）［連結した。連結した］）ＮＡをｐＵＢ
１１０をもつ枯草菌株ｌ５Ｚ４０を形質転換するのに使
用した。
ｉｅｎｓ ）ＡＴＣＣ２８８４４の染色体ＤＮＡをＭｂ
ｏｌで部分分解した（断片の大きさが平均４キロベース
（ｋｂ）となるような反応条件を使用、反応は等容のフ
ェノール：クロロホルム（１：１）を加えて停止させた
）。分解物を（モル比ｌ：１およびＤＮ、Ａ総濃度３０
０μ、！９膚で） Ｂａ吐■で分解した媒介体ｐＢＤ
６４ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ第１４１巻２４６〜２
５８頁（１９８０）Ｔ、Ｊ 、グリチャン（Ｇｒｙｃｚ
ａｎ ）ら）［連結した。連結した］）ＮＡをｐＵＢ
１１０をもつ枯草菌株ｌ５Ｚ４０を形質転換するのに使
用した。
ｌ５２４０株を使用したのはそのアミラーゼ産生量が低
いからであるが、一般ＶｃｐＵＢ １１０をもちαアミ
ラーゼを野性味と同レベルに産生する枯草菌１６８誘導
体（たとえばＢＲＩ５１は、いずれもこのクローン化に
使用できるものと考えられる。
いからであるが、一般ＶｃｐＵＢ １１０をもちαアミ
ラーゼを野性味と同レベルに産生する枯草菌１６８誘導
体（たとえばＢＲＩ５１は、いずれもこのクローン化に
使用できるものと考えられる。
αアミラーゼを産生するクローン（Ａｍｙ）は、沈殿さ
せたデンプン寒天培地（４℃で最低３週間以上保存した
、１％可溶性デンプン（シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社製）
を含むトリプトース血液寒天培養基（ディフコ社製））
上にＩＯμｇ７ｙｎｌクロラムフェニコールで透明帯を
生ずることで同定した。
せたデンプン寒天培地（４℃で最低３週間以上保存した
、１％可溶性デンプン（シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社製）
を含むトリプトース血液寒天培養基（ディフコ社製））
上にＩＯμｇ７ｙｎｌクロラムフェニコールで透明帯を
生ずることで同定した。
プラスミドＤＮＡをビルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
）とドリー（Ｄｏｌｙ）の方法（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、
Ｒｅｓ、 ’Ｋ ７巻１５１３〜１５２８頁（１９７
９））により＋ Ａｍｙクローンから抽出しＢ、Ｒ１５１の形質転換に使
用した。１つのＡｍｙ Ｃｍ 形質転換細胞はＧＸ
２５０８と命名され、１）ＧＸ ２５０８と命名された
プラスミド１つを含んでいた。αアミラーゼ活性を暗号
化するｐＧＸ ２５０８上の遺伝子はａｍｙＢＡ２と命
名して他のαアミラーゼ遺伝子と一区別した。
）とドリー（Ｄｏｌｙ）の方法（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、
Ｒｅｓ、 ’Ｋ ７巻１５１３〜１５２８頁（１９７
９））により＋ Ａｍｙクローンから抽出しＢ、Ｒ１５１の形質転換に使
用した。１つのＡｍｙ Ｃｍ 形質転換細胞はＧＸ
２５０８と命名され、１）ＧＸ ２５０８と命名された
プラスミド１つを含んでいた。αアミラーゼ活性を暗号
化するｐＧＸ ２５０８上の遺伝子はａｍｙＢＡ２と命
名して他のαアミラーゼ遺伝子と一区別した。
プラスミド内のデンプン液化％ （Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉ
ｑ−ｕｉｆａｃｉｅｎｓ ） Ｄ Ｎ Ａ量を減らすた
め、ｐＧＸ ２５０８のＰｖｕＩＩからＢａｍＨＩまで
のａｍｙＢ Ａ ２含有断片をｐＢＤ ６４内へ副次的
にクローン化しプラスミドＧＸ２５０９を作った。実験
から、本プラスミド■２５０９を含む株すなわちｐＧＸ
２５０９をもつＢＲ１５１は、不安定なαアミラーゼ
産生体であることが示づれている。プラスミドの維持に
関する選択性の不在下で、ＡＭ８培養液中で４８時間保
温すると、わずか約０；ｌ〜０．２％の細胞しかＡｍ７
表現型を維持していなかった（すなわち約８０００この
検査コロニーのうちＡｒ１１ｙはわずか５このみであっ
た）。
ｑ−ｕｉｆａｃｉｅｎｓ ） Ｄ Ｎ Ａ量を減らすた
め、ｐＧＸ ２５０８のＰｖｕＩＩからＢａｍＨＩまで
のａｍｙＢ Ａ ２含有断片をｐＢＤ ６４内へ副次的
にクローン化しプラスミドＧＸ２５０９を作った。実験
から、本プラスミド■２５０９を含む株すなわちｐＧＸ
２５０９をもつＢＲ１５１は、不安定なαアミラーゼ
産生体であることが示づれている。プラスミドの維持に
関する選択性の不在下で、ＡＭ８培養液中で４８時間保
温すると、わずか約０；ｌ〜０．２％の細胞しかＡｍ７
表現型を維持していなかった（すなわち約８０００この
検査コロニーのうちＡｒ１１ｙはわずか５このみであっ
た）。
比較のために、ａｍｙＢＡ２を７エラーリ（Ｆｅｒｒａ
ｒｉ）トホツヒ（Ｈｏｃｈ ’）の方法（前掲）とカワ
ムラらの方法（前掲）との修飾法によシ枯草菌の染色体
へ組込ませた。プラスミドｐＧＸ ２４１８とｐＧＸ
２５０９それぞれをＣ１ａＩとＸｂａＩの両方で分解し
連結した（モル比ｌ：１、ＤＮＡ総濃度１００μｇμ；
本条件下では連結産物は環状分子ではなく長い連鎖状の
線形分子となる傾向にあった）。連結したＤＮＡを使用
して、組込まれたｐＧＸ ２８１複製物を持つＢＲ，１
５１であるＧＸ４１０８を形質転換した。Ａｍｙ”クロ
ーンはＭｅｔマーカーとの接合（Ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏ
ｎ）により獲得した（ Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１
４２巻３８１〜８８４頁（１９８９）Ｃ，Ｐ、モラン（
Ｍｏｒａｎ ）Ｊｒ、ら）；これらの形質転換細胞はお
そらく、ｐＧＸ ２４１Ｂ配列に隣接するｐＧＸ ２５
０９のａｍｙ含有断片に白米し、ｐＧＸ ２４１８の相
同領域と組込まれたｐＧＸ ２８１配列との間の組換え
により生じたものと思われる（第６図）。このようなＡ
ｍｙクローンのひとつはＧＸ２５１０と命名された。プ
ラスミドの維持に関する選択性の不在下でＧＸ２５１０
をＡ’Ｍ ８培養液で４８時間保温すると、ＧＸ２５０
９の不安定な様態とは対照的に、少なくとも９０％以上
（１８／１Ｂ ）の細胞はＡｒ１１ｙ表現型を維持し
ていた。
ｒｉ）トホツヒ（Ｈｏｃｈ ’）の方法（前掲）とカワ
ムラらの方法（前掲）との修飾法によシ枯草菌の染色体
へ組込ませた。プラスミドｐＧＸ ２４１８とｐＧＸ
２５０９それぞれをＣ１ａＩとＸｂａＩの両方で分解し
連結した（モル比ｌ：１、ＤＮＡ総濃度１００μｇμ；
本条件下では連結産物は環状分子ではなく長い連鎖状の
線形分子となる傾向にあった）。連結したＤＮＡを使用
して、組込まれたｐＧＸ ２８１複製物を持つＢＲ，１
５１であるＧＸ４１０８を形質転換した。Ａｍｙ”クロ
ーンはＭｅｔマーカーとの接合（Ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏ
ｎ）により獲得した（ Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１
４２巻３８１〜８８４頁（１９８９）Ｃ，Ｐ、モラン（
Ｍｏｒａｎ ）Ｊｒ、ら）；これらの形質転換細胞はお
そらく、ｐＧＸ ２４１Ｂ配列に隣接するｐＧＸ ２５
０９のａｍｙ含有断片に白米し、ｐＧＸ ２４１８の相
同領域と組込まれたｐＧＸ ２８１配列との間の組換え
により生じたものと思われる（第６図）。このようなＡ
ｍｙクローンのひとつはＧＸ２５１０と命名された。プ
ラスミドの維持に関する選択性の不在下でＧＸ２５１０
をＡ’Ｍ ８培養液で４８時間保温すると、ＧＸ２５０
９の不安定な様態とは対照的に、少なくとも９０％以上
（１８／１Ｂ ）の細胞はＡｒ１１ｙ表現型を維持し
ていた。
第１図および後続の図面では、以下の記号な使用した：
□はｐＢＲ８２２起源のＤＮＡを示す（特にｐＧＸ８６
６では、ＰｖｕＩＩ部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位までの
ＤＮＡ配列）。 一一−−−−−は犬＃Ｊ’ｅＪＡ （Ｅ、ｃｏｌｉ ）
のｇａｌｋ領域由来のＤＮＡを示す（北ホランド州エル
スヴエアー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ）社発行Ｊ、チリキャ
ン（Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ ）ら編集遺伝子増祖と解析
（１９８１）第■巻中のに、マツケニ−（Ｍｃｋｅｎｎ
ｅ７ ）ら）。 一一一は大腸菌ファージラムダの４８転写終了領域由来
のＤＮＡを示す（同上のに、マツケ二一ら）。 ｌ■謬はｐＵｏ ９由米の合成多重制限部位配列を示す
（Ｇｅｎｅ第１９巻２６９〜２．７６頁（１９８２）Ｊ
、メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ ）とＪ。 ヴイエイラ（Ｖｉｅｔｒａ ） ｒ −一は黄色ブドウ球菌（Ｓ、ａｕｒｅｎｓ ）プラスミ
ドｐＩ ２５８のｂｌａｚ領域由来のＤＮＡを示す（Ｐ
ｌａｓｍｉｄ第２巻１０９〜．１２９頁（１９７９）Ｒ
，Ｐ 、ノグイク（Ｎｏｖｉｃｋ ）ら）。 ニコはＴ）Ｃ１９４由米のＤＮＡを示す。 区ｚ＝はデンプン准化杆ｍ （Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｉｆａｃｉ−ｅｎｓ ）のａｒｎｙＢＡ２領域由米のＤ
領域全米す（実施例■■参照）。 ＊＊＊＊＊は黄色ブドウ１ｍ （Ｓ、ａｕｒｅｎｓ ）
のｐｒａ 領域白米のＤＮＡを示す（実施例■参照）。 二二二は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ０）染
色体白米（７）ＤＮＡ又はいＡＡＡ／を示″！″。 （Ｃ／Ｍｓ）は雑種Ｃ１ａＩ／ＭｓｐＩ部位を示す。 （Ｂ／ＩＶＩｂ） は雑種ＢａｍＨＩ屑ｏ Ｉ部位な
示す。 （Ｎｌ２）は雑種ＮｒｕＩ／ＰｖｕＩＩ部位を示す。 図面は一定比率で実物を縮小したものではない。 第１図は、プラスミドｐＧＸ８４５の構築な示す。 第２図は、プラスミドｐＧＸ２８１とプラスミドｐＧＸ
２８４の構築を示す。 第８図は、フ５ スミ）” ｐ６Ｘ ２４１８ トｐＧ
Ｘ ２４１４ （Ｄ構築を示す。 第４図は、プラスミドｐＧＸ２５１とプラスミドｐＧＸ
２９０１とｐＧＸ ２９０２の構築な示す。 第５図は、プラスミドｐＧＸ ２９０７の構築を示す。 第６図は、ａｍｙＢＡ２の枯草菌染色体への組込みを示
す、それぞれ説明図である。 特許出願人 ジエネツクス・コーポレイション代
理人 弁理士 １） 澤 博 昭（ｊ（外２名
） ”−”””’″ 第２図 Ｅｃｏ日１ 第３図 ｃｏＲ１ 第１頁の続き ０発 明 者 マーク・ニス・ガイヤーアメリカ合衆国
２０８１７メリーラ ンド州ベセスダ・ルーズベルト ストリート５７１０ ０発 明 者 カール・バンナー アメリカ合衆国２０８５２メリーラ ンド州ロツクビル・ストーンレ イ・セント４６０１
６では、ＰｖｕＩＩ部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位までの
ＤＮＡ配列）。 一一−−−−−は犬＃Ｊ’ｅＪＡ （Ｅ、ｃｏｌｉ ）
のｇａｌｋ領域由来のＤＮＡを示す（北ホランド州エル
スヴエアー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ）社発行Ｊ、チリキャ
ン（Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ ）ら編集遺伝子増祖と解析
（１９８１）第■巻中のに、マツケニ−（Ｍｃｋｅｎｎ
ｅ７ ）ら）。 一一一は大腸菌ファージラムダの４８転写終了領域由来
のＤＮＡを示す（同上のに、マツケ二一ら）。 ｌ■謬はｐＵｏ ９由米の合成多重制限部位配列を示す
（Ｇｅｎｅ第１９巻２６９〜２．７６頁（１９８２）Ｊ
、メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ ）とＪ。 ヴイエイラ（Ｖｉｅｔｒａ ） ｒ −一は黄色ブドウ球菌（Ｓ、ａｕｒｅｎｓ ）プラスミ
ドｐＩ ２５８のｂｌａｚ領域由来のＤＮＡを示す（Ｐ
ｌａｓｍｉｄ第２巻１０９〜．１２９頁（１９７９）Ｒ
，Ｐ 、ノグイク（Ｎｏｖｉｃｋ ）ら）。 ニコはＴ）Ｃ１９４由米のＤＮＡを示す。 区ｚ＝はデンプン准化杆ｍ （Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｉｆａｃｉ−ｅｎｓ ）のａｒｎｙＢＡ２領域由米のＤ
領域全米す（実施例■■参照）。 ＊＊＊＊＊は黄色ブドウ１ｍ （Ｓ、ａｕｒｅｎｓ ）
のｐｒａ 領域白米のＤＮＡを示す（実施例■参照）。 二二二は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ０）染
色体白米（７）ＤＮＡ又はいＡＡＡ／を示″！″。 （Ｃ／Ｍｓ）は雑種Ｃ１ａＩ／ＭｓｐＩ部位を示す。 （Ｂ／ＩＶＩｂ） は雑種ＢａｍＨＩ屑ｏ Ｉ部位な
示す。 （Ｎｌ２）は雑種ＮｒｕＩ／ＰｖｕＩＩ部位を示す。 図面は一定比率で実物を縮小したものではない。 第１図は、プラスミドｐＧＸ８４５の構築な示す。 第２図は、プラスミドｐＧＸ２８１とプラスミドｐＧＸ
２８４の構築を示す。 第８図は、フ５ スミ）” ｐ６Ｘ ２４１８ トｐＧ
Ｘ ２４１４ （Ｄ構築を示す。 第４図は、プラスミドｐＧＸ２５１とプラスミドｐＧＸ
２９０１とｐＧＸ ２９０２の構築な示す。 第５図は、プラスミドｐＧＸ ２９０７の構築を示す。 第６図は、ａｍｙＢＡ２の枯草菌染色体への組込みを示
す、それぞれ説明図である。 特許出願人 ジエネツクス・コーポレイション代
理人 弁理士 １） 澤 博 昭（ｊ（外２名
） ”−”””’″ 第２図 Ｅｃｏ日１ 第３図 ｃｏＲ１ 第１頁の続き ０発 明 者 マーク・ニス・ガイヤーアメリカ合衆国
２０８１７メリーラ ンド州ベセスダ・ルーズベルト ストリート５７１０ ０発 明 者 カール・バンナー アメリカ合衆国２０８５２メリーラ ンド州ロツクビル・ストーンレ イ・セント４６０１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）プラスミド媒介体上に支持されたときに微生物内
で安定には維持され得ない異種遺伝子を原核微生物内で
発現させる方法であって、上記微生物の染色体に上記遺
伝子を組込むことからなる方法。 （２、特許請求の範囲第１項の方法において、（ａｔ上
記異種遺伝子は、 （１）第１番目の微生物内で発現し選択のできる表現型
マーカーと、 （１１） 第２番目の微生物内で発祝し選択すること
のできる表現型マーカーと、 （ｔｉｌｌ 第１番目の微生物内で媒介体が維持され
ることを許容する機能的複製単位と、（ｉｖｌ第２番目
の微生物の染色体の１領域に相同なりＮＡ配列と、 を含む染色体組込み媒介体へ挿入され、（ｂｌ得られた
染色体組込み媒介体と対象の遺伝子からなるキメラプラ
スミドを使用して第２番目の微生物をその染色体のＤＮ
Ａ配列の１つに相同なキメラプラスミドのＤＮＡ配列と
染色体のそのＤＮＡ配列とが組換えを行ない、組込み媒
介体に挿入した遺伝子が染色体へ組込まれるように形質
転換すること、 を特徴とする方法。 （３） （ａｔ天然から単離された時に原核微生物の染
色体に組込まれる能力をもつ媒介体へ、異種遺伝子を挿
入することと、 （ｂ）この結果生ずるキメラＤＮＡが原核微生物を形質
転換するあるいは原核微生物に感染すること、 を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）媒介体が溶原性バクテリオファージであることを
特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。 （５）媒介体がプラスミドであることを特徴とする特許
請求の範囲第８項に記載の方法。 （６）媒介体がトランスボゾンであることを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （７） （ａｌ原核微生物をその微生物の染色体に組込
まれることのできる第１番目の媒介体で形質転換するこ
とと、 （ｂｌ異種遺伝子を第１番目の媒介体に部分的に相同な
第２番目の媒介体に挿入することと、（ｃｌ操作（ａｌ
での微生物の形質転換で生じた細菌株を操作（ｂｌのキ
メラＤＮＡ配列で、異種遺伝子が微生物の染色体へ組込
まれるように形質転換すること、 を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （８）原核微生物がグラム陽性微生物であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項」■項、第８項、第４項、
第５項、第６項または第７項に記載の方法。 （９）微生物が杆菌属（ｇｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ
）であることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載
の方法。 （１０）微生物が枯草菌（５ｐｅｃｉｅｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ）であることを特徴とする特許請求の範囲第９
項に記載の方法。 αη微生物がストレプトマイセスＩＡ （ｇｅｎｕｓＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）であることを特徴とする特
許請求の範囲第８項に記載の方法。 （ハ）微生物がコリネフォルム（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ
）群であることを特徴とする特許請求の範囲第８項に
記載の方法。 （１３原核微生物がダラム陰性微生物であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項、第２項、第８項、第４項
、第５項、第６項または第７項に記載の方法。 ａ４微生物が大腸菌属（ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ）であることを特徴とする特許請求の範囲第１
３項に記載の方法。 ｏ５微生物が大腸菌（５ｐｅｃｉｅｓ ｃｏｌｉ ）で
らることを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載の
方法。 αＱ微生物がシュードモナス属（ｇｅｎｕｓ ｐｓｅｎ
ｄＣｒｒＤｎａｓンであることを特徴とする特許請求の
範囲第１８項に記載の方法。 αη通常自身に対して外米性であるようなポリペプチド
鎖を発現することのできる原核微生物株を調製する方法
でおって、 （ａｌ原核細胞を （１）前記のポリペプチド鎖を暗号化するＤＮＡ配列と
、 （１））前記原核細胞内で発現できる表現型マーカーと
、 （ｉｉｉｌその領域が染色体への媒介体の組込みを指令
する能力をもつ前記原核細胞の染色体の１領域に、相同
なりＮＡ配列を含む染色体組込み媒介体で形質転換する
ことと、 （ｂｌ記述された形質をもつ形質転換細胞を表現型マー
カーにより単離すること、 からなる方法。 ０椋タンパク質産生条件下で、特許請求の範囲第１７項
記載の方法により調製した原核微生物株を、必須同化栄
養素を含む栄養培地中で培養することからなるポリペプ
チド鎖を産生する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48932783A | 1983-04-28 | 1983-04-28 | |
| US489327 | 1983-04-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59205983A true JPS59205983A (ja) | 1984-11-21 |
Family
ID=23943389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59083049A Pending JPS59205983A (ja) | 1983-04-28 | 1984-04-26 | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0127328A3 (ja) |
| JP (1) | JPS59205983A (ja) |
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| US7384766B2 (en) | 2006-07-26 | 2008-06-10 | Kaneka Corporation | Gene-substituted microorganisms, and production method of polyesters using the same |
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|---|---|
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| EP0127328A2 (en) | 1984-12-05 |
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