JPH02211862A - 抗昆虫蛋白産生枯草菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）発明の目的 「産業上の利用分野」 本発明は鱗翅目昆虫（ガやチョウの類）の幼虫に対して
極めて優れた殺虫効果を示し、農薬として有効な結晶毒
素蛋白を人畜に無害な枯草菌を宿主として、抗生物質を
含有しない培養液で安定に産生できる方法に関するもの
であり、農薬製造工業において有効に利用されるもので
ある。

「従来の技術」 バチルス・チューリンゲンシスの生活環中、胞子形成期
中にこれと同調して形成される細胞内封入体は結晶毒素
蛋白と称され、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を
示すことから農薬として広く用いられている。

結晶毒素蛋白を有効成分とする微生物農薬の製造は、主
としてバチルス・チーーリンゲンシス変種りルスタキＨ
Ｄ−１株（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ　ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−ｊ　）を培養し
、その発酵産物である結晶毒素と、これに混在せる生芽
胞とを分離することなくそのまま製剤化することにより
なされている。

一方、近年の遺伝子組換え技術の進歩に伴ない結晶毒素
蛋白をコードする遺伝子をクロ一二ングし、大腸菌や枯
草菌等の異種微生物に導入し結晶毒素蛋白を発現させよ
うとする試みがなされている。アナパージーシバクマー
等Ｃ特開昭６２−１８１７７７　＋　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　１６６＊１９４．１９８６）はバチルス・チ
ューリンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１−ジベル（Ｄ
ｉｐｅｌ）の結晶毒素蛋白をコードする遺伝子を枯草菌
において複製しうるプラスミドに連結し枯草菌に導入し
てパイピラミダル（ｂｉｐｙｒａｍｉｄａｌ　）構造の
結晶体として産生されることを報告している。

古谷等（特開昭６２−２９４０８０）は、バチルス・チ
ューリンゲンシスソ、トーの結晶毒素蛋白をコードする
遺伝子を枯草菌で増殖可能なベクターに連結した後、枯
草菌に導入して結晶毒素蛋白を発現させ、親株のバチル
ス・チュリンゲンシスンットーより高い殺虫活性を示す
ものを得たことを報告している。

また、本発明者等は先にバチルス・チューリンゲンシス
変種クルスタキＨＤ−１の結晶毒素蛋白をコードする遺
伝子を大腸菌と枯草菌で複製しうるシャトルベクターに
連結し枯草菌に導入したところ、重ピラミッド型の結晶
体として産生され、しかも宿主枯草菌の胞子形成が阻害
されることを報告した（特開昭６３−１７６８７）。

上に述べた結晶毒素蛋白の枯草菌での生産の例は全て結
晶毒素蛋白をコードする遺伝子を枯草菌で複製可能なベ
クターに連結し枯草菌へ導入している。そして組換えプ
ラスミドを有する枯草菌形質転換体は、抗生物質を含有
する培地で培養されている。

「発明が解決しようとする問題」 微生物農薬の製造に広く用いられるバチルス・チューリ
ンゲンシスの産生ずる結晶毒素蛋白は、害虫のみならず
蚕にも強い毒性を示すことから、我国の様な養蚕国にお
いて繁殖能力をもつ生菌や生芽胞を含む製剤を使用する
ことは、きわめて危険なことと考えられる。

さらに、バチルス・チューリンゲンシスは人や家畜に対
して病原性をもつことが知られているバチルス・セレウ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ　）と病理学的
に同一の病原性を示すことが明らかとされ（秋山武久他
、北里医学１４．　２３６　。

１９８４、大沢伸孝他、北里医学１４．！１２０゜１９
８４）、　　また、バチルス・チューリンゲンシスの産
生ずる溶血毒は、バチルス・セレウスの産生ずる毒素と
同一の性状を示すこと、並びに、バチルス・チューリン
ゲンシスが何らかの下痢原因毒素を産生ずる可能性も示
唆されたこと（本田武司他、日本細菌学会誌４０，２４
０゜１９８５）からも、生菌や生芽胞を含む形での本菌
生剤の散布が人畜に対する高い危険性を含んでいること
が容易に推測できる。

以上のことから判断される様に、バチルス・チューリン
ゲンシスの産生ずる結晶毒素に生菌あるいは生芽胞が混
在したまま製剤された農薬を自然界に散布することは養
蚕の上からも公衆衛生の面からもきわめて危険なことと
いえるものである。

枯草菌はヒトに対する毒性がないこと、遺伝的性質が詳
細に調べられ種々の変異体が得られていること、及び、
菌体外に蛋白質を効率よく分泌することから遺伝子組換
えの宿主として広く利用されている。一般に遺伝子組換
え体の作製は枯草菌菌体内で自律増殖（複製）可能なプ
ラスミドベクターに目的のＤＮＡ断片、例えば結晶毒素
蛋白をコードする遺伝子を連結した後枯草菌に導入する
ことによってなされている。

しかし枯草菌を宿主とした遺伝子組換え技術・による物
質生産はいくつかの点で困難が供なう。

その最も大きな問題点に枯草菌内でのプラスミドベクタ
ーの不安定性がある。プラスミドの不安定性は２つの原
因に起因する（Ｓ、Ｂｒｏｎ　ａｎｄＥ、ｌ、ｕｘｅｎ
　ｐｌａｓｍｉｄ　　１４＋　　２３５　＋　１９８５
　）。

まず第一にプラスミドの脱落の問題である。これは、プ
ラスミドを保有する枯草菌が細胞分裂の際、娘細胞にプ
ラスミドが均等に分配されず、その結果プラスミドを保
持しない細胞が出現する現象をいう。フラスコレベルの
実験では、抗生物質の添加によってプラスミドの脱落株
の増殖を抑制することは可能である。しかし、工業的レ
ベルでは抗生物質は短時間に不活性化されるので、プラ
スミドの安定性は非常に重要な問題となる（小林　猛、
昭和６３年度農芸化学会講演要旨集、ｐ４４９）。

もう一つは、プラスミドの欠失の問題であるが、これは
プラスミドを構成するＤＮＡ断片の一部が消失（欠失）
しプラスミドが小型化する現象をいう。

上記したような原因によるプラスミドの不安定性は枯草
菌を宿主にして遺伝子組換えにより有用物質を生産する
際の解決されねばならない大きな問題点である。

仲）発明の構成 １問題点を解決するための手段」 本発明者らは上記問題点の生ずることのない結晶毒素蛋
白の生産方法について種々検討し、バチルス・チューリ
ンゲンシスの結晶毒素蛋白をコードする遺伝子が染色体
に組込まれた枯草菌が、抗生物質を含有しない培地でも
安定に結晶毒素蛋白を産生ずることを見出して本発明を
完成した。

さらに本発明者等の検討経過を詳細に説明すれば、まず
本発明者等が、バチルス・チューリンゲンシス・クルス
タキＨＤ−１株の結晶毒素蛋白をコードする遺伝子、大
腸菌プラスミドｐｕｃ　９、枯草菌で発現されるクロラ
ムフェニコール 一部（−）耐性遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）及び枯草菌染色
体由来のＤＮＡ断片より構成される枯草菌では複製され
ない結晶毒素蛋白をコードする遺伝子組込みプラスミド
を作製し、それを組メにフタ−として枯草菌に導入する
と、染色体に当該遺伝子が組込まれた形質転換体が得ら
れることを見出した。そしてこの形質転換体をクロラム
フェニコールを含有する適当な培地に接種し、好気培養
条件下で３０〜６７℃の温度で培養したところ、この培
養液は蚕に対して強い殺虫活性を有しており、農薬原料
として非常に有効であるのみならず稟含有しない培養液
でも該遺伝子が安定に保持され５０世代にわたり安定に
結晶毒素蛋白を生産することを見出し本発明を完成した
。

すなわち、本発明はバチルス・チューリンゲンシスが産
生ずる結晶毒素蛋白をコードする遺伝子を染色体中に有
する枯草菌に関するものであり、さらには当該枯草菌の
創製に用いられる結晶毒素蛋白をコードする遺伝子、枯
草菌染色体の任意はＤＮＡ断片、枯草菌で発現し得る抗
生物質耐性遺伝子及び大腸菌で複製可能なベクターより
なる組濾８クターに関するものでもあり、結晶毒素蛋白
の産生に利用されるバチルス・チューリンゲンシスが産
生ずる結晶蛋白をコードする遺伝子を染色体中に有する
枯草菌を抗生物質非存在下での培養方法に関するもので
もある。

０枯草菌 本発明で結晶毒素蛋白をコードする遺伝子（以下結晶毒
素遺伝子という）を導入すべき菌として採用した枯草菌
は人畜や植物に対して寄生、病原性のない極めて安全な
ものであると広く知られているが、それは下記に示す論
文等でも裏付けられるものである。

党閥等（Ｍｉ　ｔｓｕｏｋａ　Ｔ、他Ｑｏｌｄｓｃｈｍ
ｉｄｔｉｎｆｏｒｍｉｅｒｔ　２／７５　２３　ｒ　２
５−４１　＊　１９７３）によると、種々の動物の真中
の枯草菌を調べたところ、草食動物に多く雑食動物には
中程度認められるか存在せず、肉食動物には全く存在し
ないことが報告されている。また存在が認められる例で
も飼料に混入していた枯草菌由来であり、腸内に定着す
ることはなく、一過性であることが認められている。

さらに板目（遺伝子組換え実用化技術第−集フジテクノ
システム）は、枯草菌と分類学的に同じものと知られて
いる納豆菌を利用して作られる納豆による中毒が報告さ
れておらず、枯草菌が人畜に対して非病原性であるとし
ている。

すなわち、本発明はバチルス・チューリンゲンシスの結
晶毒素を人畜に無害な枯草菌を宿主にして安定に製造す
るための方法に関するものである。

Ｏ結晶毒素遺伝子組込みプラスミド（ｐＢＴＫＩＩＮ）
の作製 結晶毒素遺伝子を枯草菌染色体へ組込むためのプラスミ
ド（ｐＢＴＫＩＩＮ）は、結晶毒素遺伝子、大腸菌プラ
スミドｐｕｃ９、抗生物質耐性マーカーとして枯草菌プ
ラスミドｐｃ１９４由来δ書ｉ性遺伝子、□び、枯草菌
染色体由来のＤＮＡ断片より構成され、その構築方法と
構造は第１図に示されるものである。

大腸菌プラスミドとしてはｐｕｃ９に限定されるもので
はなく、ｐｕｃ１９やｐＢＲ＋２２等大腸菌で複製でき
るものであれば全て利用可能である。また、抗生物質耐
性マーカーとしてはｐｃ１９４由来分書家性遺伝子に限
定されろものではなく、ｐＵＢ　１１０　　由来のカナ
マイシン耐性遺伝子等枯草菌で発現できるものであれば
全て利用可能である。

０培養 結晶毒素遺伝子が染色体に組込まれた形質転換枯草菌ゆ
、抗ａ７含イ、ヶい。８ ＳＧ培地（ｌｅｉｇｈｔｏｎ、　’ｌ’、Ｊ、　ａｎｄ
　１）ｏｉ　＋　Ｒ，Ｈ。

Ｊ、１３ｉｏ１．ｃｈｅｍ、２４６　５１８９．１９７
１　）等の培地で３０〜６７℃の温度で好気培養条件下
で培養される。

０結晶毒素蛋白の産生 結晶毒素蛋白の発現は形質転換枯草菌の菌体抽出物を５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動することにより、あ
るいは、電気泳動された蛋白をニトロセルロース膜に転
写後、結晶毒素蛋白と作用させることにより確認できる
。

「作　用」 本発明者らは、バチルス・チューリンゲンシスの結晶毒
素遺伝子を枯草菌染色体に組込み、結晶毒素を産生させ
ることに成功したが、染色体に組込まれた該遺伝子は抗
生物質を含有しない培養液でも安定に保持され、安定に
結晶毒素を産生ずるという優れた作用を示す。

従って、バチルス・チューリンゲンシスの結晶毒素遺伝
子が染色体に組込まれた枯草菌は、経済的に高価な抗生
物質を含まな〜・培地で培養されて結晶毒素を安定に産
生できるという優れた作用を有し、より安全で安価な微
生物農薬を提供できるものである。

以下に詳細な実施例を示すが、本発明による方法は実施
例だけに限定されるものではない。

〔実施例〕

１）バチルス・チューリンゲンシス結晶毒素遺伝子の枯
草菌染色体組込みベクターの作製ｃｒｙ−１−１は円相
らが作製したプラスミドであり（微工研菌寄第８４８２
号）、バチルス・チューリンゲンシス結晶毒素遺伝子を
大腸菌ベクターｐｕｃ９のＥＣｏＲＩ部位へ連結したも
のである。

ｃｒｙ−１−１を制限酵素ｐｓｔ■で、３７℃、２時間
消化し、次いで、アルカリホスファターゼで５７℃、１
時間処理する。一方、枯草菌１Ａ９６株（本菌株は米国
オハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓＱｅｎｅｔｉｃ　
５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒより入手した）よりサイトウ
及びミウラの定める方法（Ｓａｉｔｏ、、　Ｈ。

ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、Ｊ（、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ７２　６１２．１９６３）に従がいｆ
Ａ製した染色体ＤＮＡを制限酵素ｐｓｔｉ　　で消化し
、アガロースゲル電気泳動した。泳動後、約１　ｋｂ　
部分のゲルを切り出し、フェノール抽出及びクロロホル
ム抽出により精製し、エタノール沈澱によりＤＮＡ　を
回収した。

この約ｊｋｂの枯草菌染色体ＤＮＡ断片と上述のｐｓｔ
工で消化したｃｒｙ−１−１をＴ４リガーゼで４℃、１
５時間反応させて連結し、環状化した。これをマニアチ
スらの定める方法 （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）によって大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換した
。形質転換体は４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂ−寒天培地（バクトドリブトン１０？、バクトイ−ス
トエキストラクト５５’、塩化ナトリウム５１、寒天１
５ｐ、蒸留水１ｔ）で選択した。得られた形質転換体よ
り公知の方法であるアルカリ〜ＳＤＳ法により、プラス
ミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドをｐｓｔＪ
で消化し、ｃｒｙ−１−１に相当する（５．．８ｋｂの
ＤＮＡ断片と枯草菌１Ａ９６の染色体ＤＮＡ断片に相当
する約１ｋｂ　　のＤＮＡ断片を有する組換えプラスミ
ドを選出し、それらの中の１つルミ気泳動により目的の
ＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。このプラ
スミドをｐＣＭ１９４と命名した。

１）ＣＭ１９４　を制限酵素ｐｖｕｌにより３７℃、２
時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行ない前述の方
法によりアガロースゲルよ４性遺伝子を有する約１，３
ｋｂのＤＮＡ　断片を回収プラスミドｐＣ１９４をアル
カリ−３ＤＳ法により枯草菌より分離した後）（ｐａｌ
ｌ及びＳａ　ｕ　５ＡＩにより６７℃、６時間消化した
。この消化物をアガ・−へゲル電気泳動し、ｔｔ性遺伝
子を有する約１ｋｂ部分のゲルを切り出し、フェノール
抽出及びクロロホルム抽出により精製し、エタノール沈
澱によりＤＮＡを回収した。

このＤＮＡ断片をあらかじめＡＣＣＩとＢａｍ１（Ｊで
消化しておいたｐｕｃ１９へ上述のごと＜Ｔ４リガーセ
を用い連結し、大腸菌ＨＢ１ｏ１を形質転換した。形質
転換体よりアルカ！Ｊ−８ＤＳ法によりプラスミドＤＮ
Ａを分離しアガロ−スゲの組換えプラスミドＩ）ＣＲＹ
ＩＢのＳＣａＣａ化物をＴ　４　Ｉ）ガーゼで４℃、１
５時間反応させ連結し、大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換
した。得られた形質転換体よりアルカリ−３ＤＳ法によ
りプラスミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドを
ｐｓｔ　工で消化し、１を性遺伝子ＤＮＡ断片の挿入方
向の異なる２種の組換えプラスミドｐＢＴＫＩ　ＩＮ　
（微工研菌寄第１０［］５５９号とｐＢＴＫＩＩＮＲ（
微工研菌寄第１００５８号）を得た（第１図）。

２）ｐＢＴＫＩＩＮの枯草菌への導入 大＆菌より単離したＩ）ＢＴＫＩＩＮ　　を用いて生物
学実験講座７原核生物学（丸善株式会社）に記載されて
いる方法に従って枯草菌１人９６を形質転換した。形質
転換体は５μｇ／ＩＬｔｏ％含むＬＢ−寒天培地で選択
した。得られた形質転換体より前述のサイトウ及びミウ
ラの定める方法により染色体ＤＮＡを分離した。これら
の染色体ＤＮＡ１０μｇをｐｓｔＩで３７℃３時間消化
し、アガロースゲル電気泳動を行った。泳動されたＤＮ
Ａ断片をサウザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ。

Ｍ、、　Ｊ、Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　９８　、５０３　
、１９７５　）の定める方法に従いニトロセルロース膜
へ転写した。

一方、枯草菌の形質転換に用いたｐＢＴＫＩＩＮを日本
ジーン■製ニックトランスレージ、ンキ、トな用い〔α
−５２Ｐ〕αＣＴＰ　　で標識した。

この標識されたｐＢＴＫｉｌＮとニトロセルロース膜に
転写されたＤＮＡを遺伝子操作実験マニュアル（高木康
敬編、講談社すイエンティフィク）の方法に従かいハイ
ブリダイズした。

ハイブリダイゼーションのＭ来、　ｐＢＴＫＩＩＮをＤ
ｓｔｉ　　で切断した時に生ずる６、７ｋｂ、１．８ｋ
ｂ及び０．８ｋｂのバンドが検出された形質転換体の１
つをＩＡＡ−２−５と命名した。

３）組込まれた結晶毒素遺伝子の枯草菌染色休養する。

この発酵液の内１ｄを１０μｇ／ｒｄのｊを含む５０ｍ
／のＬＢ培地に接種し、６７℃で１０ＬＢ培地に接種し
、３７℃で１０〜１２時間振と５培養する。

’７１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌ含む培地で生育
した菌体より上述のサイトウ及びミウラの方法により染
色体ＤＮＡを精製し、ｐｓ　ｔＩで消化後アガロースゲ
ル電気泳動した。そして上述の方法に従かいｐｓｔＩで
消化されたＤＮＡをニトロセルロース膜へ転写し、〔α
−５２９〕αＣＴＰ　テ標識したｐＢＴＫＩＩＮとハイ
ブリダイズした。

ハイブリダイゼーションの結果、ｐＢＴＫＩＩＮをｐｓ
ｔＩで消化した時に生ずる６、７ｋｂ、１．８ｋｂ及び
３．８ｋｂのバンドが検出された形質転換体を各々ＩＡ
Ａ−２−１０及びＩＡＡ−２−２０（微工研菌寄第１０
０６０号）と命名した。

４）ＩＡＡ−２−２０染色体に組込まれた結晶毒素遺伝
子のコピー数の測定 ＩＡＡ−２−２０染色体に組込まれた結晶毒素遺伝子の
コピー数は、ＩＡＡ−２−２０より精製した染色体ＤＮ
Ａをｐｓ　ｔＩで消化し、ｐＢＴＫＩＩＮとハイブリダ
イズした時出現する約Ｑ、３ｋｂ　　のバンドと枯草菌
１人９６より精製した染色体ＤＮＡをＰＳｔＩで消化し
、ｐＢＴＫＩＩＮとハイブリダイズした時出現する約０
，８ｋｂのバンドの濃度を比較することにより行った。

その結果、ＩＡＡ−２−２０には染色体当り１５〜２０
コピーの結晶毒素遺伝子が組込まれていることが判った
。

５）ＩＡＡ−２−２０による結晶毒素蛋白の生産 ＬＢｔ＠硲遍種し、３７℃で１２〜１５時間振と５培養
する。この発酵液の内１１ＪＬｌを２０μｇ／ｌｄのＲ
含む５０ゴの２ＸＳＧ培地（ｌｅｉｇｈｔｏｎ。

Ｔ、　、ｒ、　ａｎｄ　Ｄｏｉ、　Ｒ，Ｈ，Ｊ、１３ｉ
ｏ１．　ｃｈｅｍ、　２４６３１８９．１９７１）　　
に接種し、６７℃にて振とう培養した。

枯草菌中で結晶毒素遺伝子が発現していることの確認は
、培養菌体の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により行なった。

即ち、２０時間培養液を遠心集菌後、１０ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸−２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフ
ロライド液に憑濁し、トミーセイコー社製超音波破さい
機モデルＵＲ−２０Ｐにて、５０秒１０回超音波処理し
た。この超音波処理物を６分の１号の４×サンプル緩衝
液（０，２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ（ｐＨ６，８）、８％
ＳＤ８゜２０％β−メルカプトエタノール、４０％グリ
セロール、０２％プロモフェトルブルー）ト混合し、５
分間煮沸し、冷却後遠心した。この上清をレムリの方法
（［Ｊ　、Ｋ　、　ｌａｅｍｍｌ　ｉ　　Ｎａｔｕｒｅ
２２７．６８０．１９７０）に従い５ＤＳ−ポリアクリ
ルゲル電気泳動を行った。また、同時にバチルス・チュ
ーリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１より分離した結晶
毒素蛋白を泳動した。

第２図より明らかな様に、結晶毒素遺伝子を導入した枯
草菌ＩＡＡ−２−２０はバチルス・チューリンゲンシス
・クルスタキＨＤ−１と同じ分子量的１３０，０００の
蛋白即ち、結晶毒素蛋白を産生じていた。なお、この蛋
白は結晶毒素遺伝子を保持しない枯草菌には認められな
かった。

６）生物試験 上記方法で得たＩＡＡ−２−２０の２０時間培養液の原
液並びに希釈液（蒸留水にて希釈）０．５４を協同飼料
社製の人工飼料に混合後、９ｃａｌのシャーレに広げた
。１枚のシャーレニラき４令まで飼育した蚕幼虫１０頭
を移し、２５℃で７２時間靜装した後、シャーレ中の死
虫数を測定した。

七の結果、ＩＡＡ−２−２０は強い殺虫活性を有するこ
とが判った。

７）ＩＡＡ−２−２０染色体に組込まれた結晶毒素遺伝
子の安定性 ＩＡＡ−２−２０染色体に組込まれた結晶毒素蛋白　■
結晶毒素蛋白の産生量及び■組込まれた遺伝子のサザー
ンプロットハイプリダイゼー７冒ンによる欠失の有無及
びコピー数減少のた。即ち、２０μｇ／ａ／Ｍ含むＬＢ
寒天培地に生育したＩＡＡ−２−２０の１コロニーを２
０μｇ／Ｍｌの翁含むＬＢ培地に接種し、６７℃で１２
〜１５時間振とう培養する。この０，５ｄを摸含まない
５ＱｍｌのＬＢ培地又は２ＸＳＧ培地に接種し、３７℃
で振と５培養する。１２時間後にこの発酵液のうち０．
蝮をえ含まない５０ｍのり、Ｂ培地又は２ＸＳＧ培地に
接種し、５７℃で振とう培養する。

この操作をくり返す。

■翁性菌の出現割合による遺伝子安定性の調査 上記ｄコを含まないＬＢ培地で継代培養した各試料の１
２時間培養菌液を０．９チ塩化ナトリウム溶液で適当に
希釈後、＋＊含まないＬＢ培地に塗布し、３７℃で培養
する。生育したコロニーをつまようじて寥０μｇ／ｌ含
むＬＢ寒天培地に穿刺し、生育したコロニーの割合で安
定性を調べた。

染色体に組込まれた遺伝子は５０世代にわたり安定に（
１００％）保持されていた。

■　結晶毒素蛋白の生産量による遺伝子の安定性の調査 結晶毒素蛋白の生産量による遺伝子の安定性は、上記♂
に含まない２ＸＳＧ培地で継代培養した各２４時間培養
菌体を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、結晶毒素蛋白に相当する分子ｆｆｆ３０，０００のバ
ンドの濃淡ぎを重ねても結晶毒素蛋白の生産量に差はな
く、枯草菌染色体に組込まれた遺伝子は安定に保持され
ていることが示唆された。

■　サザーンハイプリダイゼーションによる確認 サザーンハイプリダイゼーシ、ンによる確認は、結晶毒
素遺伝子の染色体への組込みに使用したｐＢＴＫをプロ
ーブとし、上記ｄ書委含まないＬＢ培地で継代培養した
各６時間培養菌体より分離したＤＮＡをｐｓｔＩで消化
し、ハイブリダイズすることにより行なった。

をン含まない培地で植え継ぎを重ねても、組込まれた遺
伝子の構造及びコピー数に変化はなく、枯草菌染色体に
組込まれた遺伝子は安定に保持されていることが示唆さ
れた。

（ハ）発明の効果 本発明によれば、枯草菌を利用して抗生物質を含まない
培地で安定に結晶毒素を製造することが可能であり、そ
の結果、人畜に安全な農薬を安価に提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、枯草菌染色体にバチルス・チューリンゲンシ
ス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素を組込むためのプ
ラスミドの構築方法と構造を示す。 図中の制限酵素作用部位は、ＥがＥｃｏＲＩ、　Ｐがｐ
ｓｔｉ、ＳがＳ２Ｃｌ、ＰＶＩ）−ｐｖｕｌ［を表わす
。また細線は大腸菌プラスミドのｐｕｃ９又はｐｕｃ１
９、斜線は枯草菌染色体ＤＮＡ断片白ぬきはバチルス・
チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１の結晶毒素遺
伝子、白ぬきにＣＡＴはｐｃ１９４　ぷ性遺伝子を示す
。矢印は遺伝子の転写方向を表わす。 ８２図は、ｒＡＡ−２−２０培養菌体抽出物の５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動像を表わす。図中の番
号は１がバチルス・チューリンゲンシス・クルスタキＨ
Ｄ−１より単離した結晶毒素蛋白の泳動像、２〜６まで
がＩＡＡ−２−２０の独立したコロニーの２０時間培養
菌体抽出物の泳動像を表わす。また、矢印は分子量１３
０，０００に相当する結晶毒素蛋白を表わす。 第５図は、−を含まない培地で培養したＩＡＡ−２−２
０培養菌体抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電
気泳動（５）とウェスタンブロッティング像ＣＢ）を表
わす。図中の番号は１がバチルス・チューリンゲンシス
・クルスタキＨＤ−１より単出物、４〜５力１ン含まな
い培地で各々２回、４回、６回及び８回継代培養したＩ
ＡＡ−２−２０培養菌体抽出物を表わす。Ｍは分子量マ
ーカーで上から分子量２００，０００．９７，４００，
６８．０００１４！１，０００．２５，７００を表わす
。また、図中の矢印は分子蓋１３０，０ＯＯＫ相当する
結晶毒素蛋白を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス・チューリンゲンシスが産生する結晶毒素
   蛋白をコードする遺伝子を染色体中に有する枯草菌。 ２、結晶毒素蛋白をコードする遺伝子、枯草菌染色体の
   任意なＤＮＡ断片、枯草菌で発現し得る抗生物質耐性遺
   伝子及び大腸菌で複製可能なベクターよりなることを特
   徴とする組換えベクター。 ３、特許請求の範囲第１項の枯草菌を抗生物質非存在下
   で培養することを特徴とする枯草菌の培養方法。