JPH074232B2 - バチルスチユウリンゲンシス結晶蛋白遺伝子の植物上での集落形成能を有する微生物への挿入及びその用途 - Google Patents

バチルスチユウリンゲンシス結晶蛋白遺伝子の植物上での集落形成能を有する微生物への挿入及びその用途

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JPH074232B2
JPH074232B2 JP60276667A JP27666785A JPH074232B2 JP H074232 B2 JPH074232 B2 JP H074232B2 JP 60276667 A JP60276667 A JP 60276667A JP 27666785 A JP27666785 A JP 27666785A JP H074232 B2 JPH074232 B2 JP H074232B2
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas

Description

【発明の詳細な説明】 （イ） 産業上の利用分野 本発明は、りん翅目幼虫に対し殺虫活性を有する高分子
量の蛋白に関する遺伝情報をコード化している外来DNA
を含有するように遺伝子操作され、かつ、植物上での集
落形成能を有する微生物に関するものである。更に、本
発明は、かゝる微生物を活性作因として含有する殺虫性
組成物と、りん翅目害虫を撲滅する方法におけるこのよ
うな植物上での集落形成能を有する微生物の利用に関す
るものである。
（ロ） 従来の技術 バチルス チユウリンゲンシスは、広範囲のりん翅目幼
虫に致死的である副胞子結晶を産出する能力で知られて
いる胞子形成土壤細菌である。胞子を形成した培養物の
乾重で20〜30％を占めるこの結晶は、主として単一の、
高分子量の蛋白（134,000ダルトン）より構成され、胞
子形成期間のみで合成される。
ホワイトレイら（１）はバチルス チユウリンゲンシス
バール・クルスタキHD-1からのプラスミドDNAの単
離、クローン化ベクターpBR322への当該DNAの挿入及び
大腸菌HB101菌株の形質転換について報告している。組
み換えプラスミドを含有すると想定されるコロニーを用
いて、ビー・チユウリンゲンシス結晶蛋白毒素に対して
作出された抗体と反応する抗原の産出についてスクリー
ニングした。ES12と同定された一つの組み換え菌株を単
離した。この菌株は、結晶蛋白に対して作出された抗体
と反応する130,000ダルトンのポリペプチドを合成し
た。ES12の蛋白抽出物は、タバコホーンワーム（Manduc
a sexta）の幼虫に対して毒性を示した。産出されたポ
リペプチドの量はビー・チユウリンゲンシスによつて産
出される量と比較して、非常に低かつた。このことは、
大腸菌とビー・チユウリンゲンシスとでは蛋白産出の制
御の方法が異なつていることによると考えられた。
クリエール等（２）は、大きな宿主プラスミドにも、ま
た、染色体DNAにも、バチルス チユウリンゲンシス
ベルライナー1715株の当該結晶蛋白遺伝子が見出される
と報告した。そして、当該染色体配列に対応するDNA配
列をプラスミドpBT15-88に挿入した。pBT15-88への挿入
配列は、大腸菌では発現しなかつた。42メガダルトン宿
主プラスミドからの14Kb Bam HI DNA断片をpHV33のBam
HI断片へとクローン化し、このベクターを大腸菌に挿入
した。当該組み換えプラスミドを含有する大腸菌の抽出
物は、精製した結晶蛋白に対する抗体に対して、免疫学
的に交差反応性を示した。当該組み換えプラスミドを含
有する大腸菌により合成されたポリペプチドは、ビー・
チユウリンゲンシスの胞子細胞により合成されるものの
10％程度の活性しか有していなかつた。組み換えプラス
ミドを所持する大腸菌の抽出物の５倍濃縮物をキヤベツ
の葉面に散布し、任意に生育されたところ、シロチヨウ
の一種（Pierris brassica）の幼虫に対して有効であつ
た。クリエールは、また、14Kb（キロベース：以下同
じ）の挿入を含有するpHV33を枯草菌内に挿入した。こ
の結晶蛋白（をコード化している）遺伝子は、枯草菌の
栄養細胞中では発現せず、胞子細胞中で発現したが、産
出された結晶蛋白量は、胞子ビー・チユウリンゲンシス
により産出される量の約10％であつた。
ヘルド等（３）は、Eco RI消化によりビー・チユウリン
ゲンシス・バール・クルスタキのDNA断片を得、この断
片をベクター“シヤロン4A"へとクローン化している。
クローン化ベクター、すなわちシヤロン4Aとビー・チユ
ウリンゲンシス由来のDNAよりなる組み換えバクテリオ
フアージ,C4R6Cに大腸菌を感染させた。これらの感染細
胞は、ビー・チユウリンゲンシスのプロトキシンと同一
の大きさを有するプロトキシン抗原を産出し、蛋白抽出
物は、タバコホーンワーム（Manduca sexta）の新生幼
虫に対して毒作用を示した。C4K6C DNAのビー・チユウ
リンゲンシス プラスミドへのハイブリダイゼーシヨン
は、当該原シヤロン4Aクローンは、染色体起原の遺伝子
で、プラスミド起原のものではないということを明らか
とした。
ウオン等（４）は、ビー・チユウリンゲンシス・バール
・クルスタキHD-1-デペル（Dipel）からの結晶蛋白遺伝
子のプロモータ領域と当該遺伝情報をコード化している
領域の一部のヌクレオチド配列について報告している。
11個のヌクレオチドよりなる潜在的リボゾーム結合部位
は、開始ATGコドンから教えてヌクレオチド三個上流に
位置していた。結晶蛋白の最初の333個のアミノ酸に対
する推定配列についても報告している。
米国特許第4,448,885は、ビー・チユウリンゲンシスの
結晶蛋白の免疫学的性質を有する130,000ダルトンのポ
リペプチドの遺伝情報をコードして居り、発現性のある
外来DNAを含有する大腸菌主株で複製可能なプラスミド
について開示している。また、ビー・チユウリンゲンシ
スの結晶蛋白の免疫学的性質を有するという130,000ダ
ルトンのポリペプチドを発現する様に形質転換された大
腸菌についても開示している。更に、当該菌株を殺虫効
果を発揮させるために使用する方法についても開示して
いる。
バチルス チユウリンゲンシスの胞子又はそれにより産
出され結晶性蛋白を含有する殺虫組成物がデペル（Dipe
l） やチユウリサイド（Thuricide） などの名称で、
水和剤又は水性懸濁液として市販されている。これらの
製品は、タバコ、ワタ、大豆など食害する害虫、スプル
スバツドワーム（Spruce budworm）、キヤベツ シヤク
トリガ（Cabbage looper）、侵入キヤベツ ワーム（ca
bbage worm）、ジプシーモスなどのりん翅目幼虫の防除
に使用されている。
バチルス チユウリンゲンシスの結晶性エンドトキシン
の市販製剤の使用に関しては、くり返し散布の必要性、
対象害虫のストクトラムの狭いことなどの重大な限界が
ある。他のもう一つの欠点は、ビー・チユウリンゲンシ
スの生活史の胞子形成期のみで産出されるということで
ある。このような成育過程における限界、特に工業生産
において、製造が不便でかつ余分の時間を必要とすると
いうこととなる。胞子形成の完了と共に、自己溶解した
細胞から胞子と当該結晶が培養液中へ放出される。環境
問題から、製品の殺虫剤中には胞子が含まれないことが
望ましい。しかしながら、大きさ及び比重ともに胞子と
結晶蛋白毒素の間に差がないため、胞子と当該結晶の分
離は複雑で、労力がかゝり、従つて高価となる。更に、
成育期における限界又はその他の要因による淘汰圧によ
り当該結晶を産出する能力を失なつたビー・チユウリン
ゲンシスの菌株となる可能性があり、このような結晶を
産出しない菌株は殺虫活性を示さなくなる。
当該結晶毒素の遺伝情報をコード化しているビー・チユ
ウリンゲンシスからのDNAの単離、大腸菌又は枯草菌の
形質転換のための発現ベクターへのこのDNAの挿入につ
いては知られているが、この先行技術は、かゝるDNAが
植物上での集落形成能を有する微生物に挿入でき、かゝ
るDNAが発現し、当該植物上での集落形成能を有する微
生物がりん翅目害虫に対して殺虫活性を示しうるとは教
示していない。かゝる植物上での集落形成能を有する微
生物が植物環境下で生存し、生長し、当該殺虫性結晶蛋
白のくり返し散布を必要とせずに接触又は浸透性のシー
ズンを通した害虫防除を可能ならしめることも教示して
いない。“植物環境”で集落を形成し、かつ同環境下、
すなわち、葉、茎、幹、花部又は根表面で殺虫性の蛋白
を発現するように遺伝子操作された、植物上での集落形
成能を有する微生物を経由して当該殺虫性蛋白を放出す
ることは、殺虫結晶蛋白の培養液での産出に関する先行
技術からは予測し得ないことである。
従つて、本発明は、殺虫活性を有し、遺伝子操作され
た、植物上での集落形成能のある微生物を用いて、慣用
有機合成殺虫剤の使用に関連した問題や、培地中での殺
虫活性のある蛋白の生産、及び培養基からの殺虫蛋白の
分離及び精製に関連した問題及び経費に煩わされずに、
ある種のりん翅目の昆虫を撲滅する優れた方法を提供す
るものである。
（ハ） 問題点を解決するための手段 本発明は、植物環境中で植物と共生的か、又は、有害な
影響を与えずに増殖し、植物上での集落形成能を有する
微生物で、かつ遺伝子操作されたものに関する。かゝる
微生物は、殺虫性結晶蛋白毒素に関する遺伝情報をコー
ド化しているバチルスチユウリンゲンシス由来のDNAを
含む。本発明による遺伝子操作され、かつ、植物上での
集落形成能のある微生物及びその子孫は、種々のりん翅
目害虫に対して活性がある。更に本発明は、かゝる植物
上での集落形成能を有する微生物をりん翅目害虫の殺滅
又は阻止する方法に使用すること及び当該植物上での集
落形成能のある微生物を活性殺虫作因として含有する殺
虫性組成物に関する。
（ホ） 作用及び効果 本発明は、遺伝操作されて居り、植物上での集落形成能
を有し、バチルス チユウリンゲンシスの結晶蛋白毒素
の免疫学的性質を事実上有する殺虫活性のある蛋白を発
現する外来遺伝子を含有する微生物に関するものであ
る。更に、本発明は、りん翅目害虫の成育及び発生を阻
害する方法において、かゝる植物上での集落形成能を有
する微生物を使用する方法、及び活性殺虫性作因とし
て、これらの植物上での集落形成能を有する微生物を含
有する殺虫性組成物に関するものである。
この明細書において、用語“植物上での集落形成能を有
する微生物”とは、“植物環境”中で集落を形成するこ
とができ、その植物環境中で当該殺虫性蛋白を発現する
ことのできる微生物を指す。当該植物と連合した微生物
とは、“植物環境”中で植物と共生的又は悪影響を及ぼ
さない関係で生存できるものをいう。この明細書におい
て、用語“植物上での集落形成能を有する微生物”とは
バチラシエ属（Bacillaceae）の胞止形成菌、例えば、
バチルス チユウリンゲンシス バール・クルスタキ、
バチルス チユウリンゲンシス バール・イスラエリエ
ンシス（israeliensis）及び枯草菌は含まない。
用語“植物環境”とは、植物体の表面、例えば、葉、
茎、幹、花部又は根表面と根圏、すなわち植物の根を囲
み、影響される土壤を指す。
本明細書に記述する如く、遺伝子操作しうる植物での集
落形成能を有する微生物の例としては、シユウドモナス
（Pseudomonas）、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）、リゾビウム（Rhizobium）、エルウイニア（Erwini
a）、アゾトバクター（Azotobacter）、アゾスプリラム
（Azospirillum）、クレブシエラ（Klebsiella）、フラ
ボバクテリウム（Flavobacterium）及びアルカリゲネス
（Alcaligenes）属の細菌が挙げられる。シユウドモナ
ス属の細菌で根圏で集落化するものが本発明で使用する
のに適している。特に、螢光シユウドモナス、例えばシ
ユウドモナス フルオレシエンス（Pseudmonas fluores
cans）は植物圏内で特に競合に強く、多数のコロニーを
植物の根の表面に形成するので好ましい。植物上での集
落形成能を有する他の群で、本発明で使用するのに特に
好ましいものとしては、アグロバクテリウム（Agrobact
erium）属に属するもので、アグロバクテリウム ラジ
オバクター（Agrobacterium radiobacter）がその中で
特に本発明において使用するのに適している。
本明細書で使用される、用語“外来DNA"（heterologous
DNA）とは、ビー・チユウリンゲンシスから単離された
DNA断片であつて、当該微生物により産出される殺虫活
性を有する結晶蛋白毒素に対して免疫学的に交差反応す
る蛋白についての遺伝情報を有するものすべてを意味す
る。プラスミドと染色体DNA又はその断片配列の双方を
上記植物上での群落形成能を有する微生物の遺伝子操作
に使用することが可能である。合成した相当物も同様に
使用可能であり、本明細書において、その使用を試みて
いる。換言すれば、ビー・チユウリンゲンシスの結晶蛋
白毒素と事実上交差反応し、殺虫活性を有する蛋白を発
現するDNAであればその由来のいかんに拘わらず、本明
細書記載の植物上での集落形成能を有する微生物の遺伝
子操作に使用することができるということである。ビー
・チユウリンゲンシス・バール・クルスタキHD-1株のプ
ラスミドDNAを結晶蛋白毒素遺伝子の給源としてここで
は用いた。この菌株は、USDA-テキサス州ブラウンスビ
ルーのテイー・ヤマモト博士より入手したものである。
同様に使用可能なものとして、誰れもが入手可能な当該
微生物の菌株が各種知られている。例えば、ビー・チユ
ウリンゲンシス・バール・クルスタキシHD-1（NRRL B-3
792）及び同H-73株（NRRL-4499）などである。更に、米
国特許第4,277,564号を参照されたい。該ビー・チユウ
リンゲンシス供与菌株から分離したプラスミドDNA断片
は、16Kb Bam HI断片であり、当該微生物の134,000ダル
トン結晶蛋白毒素に対する抗体と免疫学的に交差反応す
る蛋白を発現する。この16KbのBam HI断片をサブクロー
ン化すると8.1KbのBam HI-Pst I断片が産出される。こ
の断片は、更にサブクローン化され4.6KbのHpa I-Pst I
断片を産出する。これらのDNA断片はすべて大きさにお
いて約134,000ダルトンの殺虫活性を有する蛋白毒素
で、ビー・チユウリンゲンシスの結晶蛋白毒素に対する
抗体と免疫学的に交差反応するものの遺伝情報をコード
化していた。欠失断片によつてコード化されうる蛋白が
殺虫性の損失とならないような範囲で当該4.6Kb断片の
欠失を目論んだ、大きさで2.4〜4.1Kbで、約80,000から
110,000ダルトンの殺虫活性を有する蛋白についての遺
伝情報を有するDNA断片を欠失により作り出した。
該技術分野において通常の知識を有する者ならば当然考
えつくことと思うが、できる丈最少のDNA断片を用い
て、依然として殺虫活性を有する蛋白を発現させること
には、先天的な利点がある。例えば、クローニング工程
でビー・テイーDNAが高収量が得られ、殺虫性のある毒
素をコード化していない余部のDNAを植物上での集落形
成能を有する微生物のゲノムへの導入が減縮される。
この発明において用いられるクローン化ベクターは、こ
の分野においては知られて居り一般に入手可能である。
特定のベクターの選択は、該技術分野において通常の知
識を有するものならば容易であり、大部分はその選択す
る者の嗜好に問題と云えよう。この発明において使用に
適するプラスミドクローニングベクターとして挙げるこ
とのできるものは表１に示す通りである。
本発明による植物上での集落形成能を有する微生物は、
植物環境又は植物の種子に殺虫的に効力のある量の当該
微生物を処理することによるりん翅目害虫を撲滅する方
法に有用である。本発明による植物上での集落形成能を
有する微生物は、バチルス チユウリンゲンシス ベル
リナー バール・クルスタキの結晶蛋白毒素と同様の殺
虫スペクトラムを示す。つまり、本発明の微生物はスプ
ルース バツドワーム、ワツクスモス、キヤベツルーパ
ー、侵入キヤベツワーム、ジプシーモス及びタバコホー
ンワームなどのりん翅目害虫の幼虫に対して殺虫効果を
有する。
本発明による植物上での集落形成能を有する微生物は、
植物環境、即ち葉、根又は花部の表面ないしは植物の種
子に直接散布可能である。種子粉衣として用いる場合、
本発明の植物上での集落形成能を有する微生物は、播種
（又は植付）前に種子に処理する。一般に、殺虫活性を
有する微生物の量は、種子処理の場合、少量で充分であ
る。
特定の作物に要求される本発明の方法において有用な植
物上での集落形成能を有する微生物の殺虫のための有効
量の決定は、この分野において通常の知識を有するもの
の常識の範囲内にあり、作物の種類、播種（又は植付）
方法、土性（即ち、pH、有機含有量、水分）などの因子
により変わる。
本発明による殺虫活性のある植物関連微生物を含有する
組成物は、当該生物活性を有する微生物を助剤、希釈
剤、賦形剤などと一緒に製剤化され、当該組成物を微粉
末、粒剤、ペレツト、水和剤、粉剤、水溶剤、ゲル、分
散液及び乳剤の型で提供するために調製される。好まし
い賦形剤の例としては、水又は有機溶媒などの溶液又は
カオリン、チヨーク、炭酸カルシユウム、タルク、硅酸
塩及び石膏などの微粉末がある。
本発明による方法及び組成物における当該殺虫性微生物
をカプセル封入体で使用することが試みられている。即
ち、当該植物上での集落形成能のある微生物を、ポリマ
ー、ゼラチン、脂肪などに封入する。また、乳化剤、分
散剤、界面活性剤、湿潤剤、消泡剤及び凍結防止剤など
他の製剤助剤を、特に使用までに不特定期間貯蔵される
場合は、混入しても差し支えない。
当該殺虫活性を有し、植物上での集落形成能を有する微
生物に加え、本発明の組成物には他の公知の生物活性を
有する剤、例えば、除草剤、殺菌剤又は他の殺虫剤を追
加含有していても良い。勿論、二種又はそれ以上の殺虫
活性を有する植物上での集落形成能を有する微生物を一
緒に使用しても良い。
本発明による遺伝子操作され、かつ植物上での集落形成
能を有する微生物を活性な作因として含有する殺虫性組
成物の施用は、慣行方法、例えば、散布機、動力散粉
機、ブーム及び手動スプレーヤー、散粉機及び散粉機を
用いて実施できる。
本発明の組成物は、防除対象のりん翅目害虫の種類、処
理すべき植物の種類、殺虫活性を有する組成物の施用方
法などの因子により適宜変更される殺虫効果のある量を
用い、施用される。
以下の実施例において、本明細書記載の本発明による種
々の実施態様を更に説明する。本技術分野に属する通常
の知識を有するものであれば明らかな如く、これらの実
施例からの種々の変更、修正は可能であり、これは本明
細書記載の発明の技術的範囲内に属すると考えられる。
ビー・チユウリンゲンシス由来で、高分子量の淡白で殺
虫活性を有するものの遺伝情報をコード化している外来
DNAの、植物上での集落形成能を有する微生物への挿入
は次のようにして実施した。
出発微生物 本発明において組み換えプラスミド用のプラスミドDNA
の給源として使用したバチルス チユウリンゲンシス
バール・クルスタキHD-1は、米国農務省（USDA）のヤマ
モトタカシ博士より入手したものである。ビー・チユウ
リンゲンシス菌株は、標準手順により胞子形成貯蔵培養
株として保持されていた。培養株は、定期的に結晶産出
を位相差顕微鏡を用いてモニターした。
合成オリゴヌクレオチドプローブの調製 バチルス チユウリンゲンシス バール・クルスタキHD
-1から単離した結晶蛋白毒素遺伝子のアミノ酸配列をハ
ンカピラー等の方法（５）により一部決定した。この配
列は、ウオン等により開示された結晶蛋白遺伝子（４）
のNH2-末端部分のDNA配列を用いて実証した。当該結晶
淡白ポリペプチドから決定したアミノ酸配列にもとづい
た合成オリゴヌクレオチド配列はベーウケージらの方法
（６）により調製した。調製したオリゴヌクレオチドプ
ローブは表IIに示した。
ビー・チユウリンゲンシスからのプラスミドDNAの単離
及び調製 ビー・チユウリンゲンシス バール・クルスタキHD-1か
らのプラスミドDNAをクロンスタツド等の手順（７）に
従つて１〜２の培養液から精製した。全プラスミド調
製物は少くなくとも１回CsCl/エチブロマイド勾配法で
分別した。大きさ30メガダルトン又はそれ以上のプラス
ミドは優先的に単離された。
制限酵素EcoRI、PstI、Hind III、BamHI及びSmaによる
消化は、供給元（ベーリンガーマンハイム）により推奨
された条件により実施した。大腸菌菌株JM101（８）及
同SR-200（９）を形質転換工程の受容株として用いた。
コンピテント細胞は、標準方法（10）により調製した。
プラスミドpUC8で形質転換したコロニーは、アンピシリ
ン100μg/ml及び40μｌの４％5-ブロモ‐4-クロロ‐3-
インドリル‐β−D-ガラクトピラノシツド（X-gal）を
含むL-寒天培地上で平板培養した。
ニトロセルロースフイルターの調製及びハイブリダイゼ
ーシヨン サザンの手順（11）の方法に従つてプラスミドDNAをニ
トロセルロースに移した。プレハイブリダイゼーシヨン
は、ニトロセルロースとそれに付着したプラスミドDNA
と一緒にプレ‐ハイブリダイゼーシヨン液、すなわち10
倍のデンハルト氏液（0.2％BSA、0.2％フアイコール、
0.2％ポリビニルピロリドン）及び６倍のSSC（0.9M NaC
lと0.09Mクエン酸ソーダ）中で２〜４時間、37℃でイン
キユベートして行つた。ハイブリダイゼーシヨンは、当
該ニトロセルロース紙を10-11mlのプレ‐ハイブリダイ
ゼーシヨン液及び標識したプローブと一緒に８〜10時間
インキユベートすることにより行なつた。温度を上昇さ
せながら（30〜45℃）数回６倍のSSCを用いて洗浄後、
当該ニトロセルロース紙をX-線フイルムに曝露した。
ビー・テイー・毒素遺伝子の大腸菌中のクローン化 Bam HI-制限酵素で処理したpBR328（100ng）で、アルカ
リホスフアターゼ（ベーリンガーマンハイム）で処理し
たものをBam HIで切断したビー・チユウリンゲンシスの
プラスミドDNA500ngとまぜリゲートした。CaCl2を用い
て調製したコンピテント大腸菌SR200を形質転換し、ア
ンピシリン抵抗性で選抜し、テトラサイクリン感受性で
スクリーニングした。ミニプラスミドプレプ手順による
解析（12）により、正確な16Kbの挿入を有している二つ
のクローンを同定した。表IIに示した標識プローブによ
るサザンハイブリダイゼーシヨン解析から、合成プロー
ブにハイブリダイゼーシヨンとした配列を含有する当該
DNA断片は、サブクローン化されていたことが明らかに
された。二つのプラスミド、即ち、pMAP1及びpMAM2と命
名されたものは、ベクター内での当該DNA断片の方向性
のみが異なつていた。これらのプラスミド構築は、ウエ
スタンブロツト手順（13）により解析したとき、ビー・
テイー・結晶淡白毒素抗体の交差反応する材料を産出し
た。挿入されたビー・テイー断片の制限地図の準備し、
そして二つの当該Bam HI（Ｂ）の切断部位の間に４つの
EcoR Ｉ（Ｅ）部位と三つのHind III（Ｈ）部位が位置
していることが判明した。これを模式的に示すと次の通
りである。
pMAP2を含有する大腸菌は米国特許庁審査基準（MPEP）
の第608・01（Ｐ）項の定めるところに従い、アメリカ
ンタイプカルチヤーコレクシヨン（米国メリーランド州
ロツクビル市パークローンドライブ12301、コード番号M
D20852以下ATCCと称す。）に寄託してあり、ATCC No.39
800が割り当てられている。
ビー・テイー毒素のサブクローン化 pMAP2のBam HI-Pst I消化後、製造業者、シユライフア
ー及びシユエル（14）の支持に従つてDEAE紙上へ予備ア
ガロースゲルから8.1KbのBam HI-Pst I断片の電気的に
溶出させることにより単離した。プラスミドpUC8を、当
該ビー・テイー遺伝子を担持しているpMAP2のBam HI-Ps
t I断片とのサブクローン化に使用した。Bam HI及びPst
Iで消化したpUC8と当該精製した8.1Kb Bam HI-Pst I断
片とのリゲーシヨンの次ぎに、コンピテント大腸菌JM10
1への形質転換を行なつた。形質転換体はアンピシリン
抵抗性とβ‐ガラクトシダーゼの欠如にもとづいて選抜
した。クローンを単離し、所望のプラスミドを含有して
いることを確認した。この構築をpMAP3と命名した。pMA
P3を含有する大腸菌JM101は、ATCCに米国特許庁審査基
準第608・01（Ｐ）項の規定にもとづいて寄託して居
り、その寄託番号はATCCNo.39801が割り当てられてい
る。
pMAP3のビー・チユウリンゲンシスの8.1Kbから4.6Kbへ
の縮減は、Sma I-Hpa I断片を欠失させることにより行
なつた。CsCl濃度勾配沈澱法により精製したプラスミド
pMAP3DNAを制限酵素Sma I及びHpa Iで消化し、再リゲー
トした。得られたDNA断片を用いてコンピテント大腸菌J
M101の細胞を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転
換体はミニプラスミド調製物のアガロース電気泳動によ
りスクリーニングした。クローンを同定したところ、予
想通りのDNA制限酵素消化パターンを持つプラスミドを
含有していた。この構築をpMAP4と名づけた。ビー・チ
ユウリンゲンシス毒素遺伝子を含有するpMAP2の16Kb挿
入の、8.1Kb挿入への上記サブクローン化（pMAP3）及び
4.6Kb挿入への上記のサブクローン化（pMAP4）は第１図
に示してある。
ビー・テイーから単離したDNAのクローン化ベクターpMO
N5008への挿入 プラスミドpMON5008は、モンサイト社のビー・シイー・
ヘミング及びデイー・ジエイ・ドラホスにより構築され
たものであるが、これをpMAP3から単離したプラスミドD
NAの4.6kb断片で大腸菌のコンピテント細胞を形質転換
するためのクローニングベクターとして、使用した。プ
ラスミドpMON5008はプラスミドpKT230の誘導体で、pMON
5008の構築は1984年３月21日に出願した米国特許出願第
592,158号にその構築については記載されている。尚、
この出願は共にモンサント者に譲渡されて居り、その内
容を一部ここで引用するために参考文献として示した。
pMAP3から単離した4.6Kb断片のpMON5008への適切な挿入
のために、当該4.6Kb断片の末端の調整が必要となつ
た。Pst Iリンカー（CCTGCAGG）を以下に述べる様な方
法で当該4.6Kb Hpa I-Pst I断片に加えた。
プラスミドpMAP3（10μｇ）をHpa Iで消化した。完全に
消化されたことをアガロースゲル解析により確認した。
消化物をフエノール／クロロホルム（1:1）の混合物で
抽出、次いでクロロホルムで抽出、そして最後にエタノ
ールで抽出した。生成した沈澱物をTE緩衝液（0.01Mト
リス/0.001M EDTA、pH8.0）で洗浄し、次いで同一のも
のに再懸濁させた。２μのPst Iリンカー（CCTGCAG
G）をニユーイングランドバイオラボラズ社より入手
し、全容で10μのキナーゼ／リガーゼ緩衝液（11）中
のT4DNAキナーゼ２単位と合わせた。混合物を37℃で１
時間インキユベートした。その後、２μｇのキナーゼ／
リンカー混合物を２μｇのHpa I消化pMAP3と２μのT4
DNAリガーゼ（２単位）に加えて、得られた混合物を22
℃で18時間インキユベートし、その後１μの0.5M EDT
A（pH8.0）を加え、混合物を上記の如く抽出した。得ら
れた沈澱物をTE緩衝液で洗浄し、新しいTE緩衝液90μ
中に再懸濁した。当該沈澱物をPst Iで消化し、消化物
は6.0μの5M NaClと混合し、セフアローズCL-4Bカラ
ムにかけた。各フラクシヨンを集め、アガロースゲル電
気泳動によりスクリーニングした。高分子量のDNAを含
有するフラクシヨンをあわせ、沈澱させ、得られた沈澱
物をTE緩衝液で洗い、次いで新しいTE緩衝液に再懸濁さ
せた。
カラムより回収したDNAを、予じめアルカリホスフアタ
ーゼ処理し、カラムを用いて精製したPst I消化プラス
ミドベクターpUC7と混合した。Pst I-Pst I断片をpUC7
のPst I部位にリゲートし、コンピテント大腸菌JM101の
形質転換に用いた。pUC7の特異的Pst I部位へのビー・
テイー遺伝子の挿入により、二つのBam HI部位の間に当
該遺伝子が位置することとなつた。
アンピシリン抵抗性、β‐gal陰性の形質転換体をミニ
プラスミド調製物と制限エンドヌクレアーゼ消化物によ
り正しいプラスミド構築について解析した。Pst I及びP
am HI部位の両方によりフランクされた4.6Kb断片をもつ
プラスミドは単離して、pMAP8と命名した。
プラスミドpMON5008DNAを単離し、Bam HI又はBgl IIで
消化し、アルカリホスフアターゼで処理し、セフアロー
ズCL-4Bカラム上で精製した。このベクターDNA/μｇとB
am HIで消化したpMAP8の２μｇの混合物をリゲートし、
コンピテント大腸菌細胞を形質転換するのに用いた。形
質転換体をカナマイシン抵抗性により選抜し、ミニプラ
スミド調製物により単離したプラスミドDNAの制限エン
ドヌクレアーゼの消化物によりスクリーニングした。ビ
ー・テイーDNAをpMON5008の両方向で、Bam HI及びBgl I
Iの両部位に挿入した構築が得られ、それぞれpMAP12、p
MAP13、pMAP14及びpMAP15とした。
植物上での集落形成能を有する微生物の選抜シユウドモ
ナス フルオレシエンス3732（Ps.3732と称す）はミゾ
リー州セントチヤールスの農場の土壤から分離したもの
である。シユウドモナス フルオレシエンス3732-3と命
名したリフアムピシン抵抗性菌株は、100μg/mlのリフ
アムピシンを含むL-寒天平板培地上で、１×109のコロ
ニー形成単位（CFUと称す）を平板培養して見出した。
ナリジクス酸抵抗性変異株でPs.3732-3-7と命名したも
のは、振とう器上でPs.3732-3の１×1010CFUを5mlのL-
ブロスを含む蓋をしていないペトリ皿を用いておだやか
に振とう培養しながら紫外線照射して得たものである。
照射時間は１から８時間にわたり、照射したコロニーは
ナリジクス酸を100μg/ml含有するL-寒天培地で平板培
養した。コロニーは、分離のため数回画線と、非選抜的
条件下で30℃でL-ブロス中で成育させ、ナリジクス酸を
含むか又は含まない培地上で平板培養した。
植物上での集落形成能を有する微生物の遺伝子操作 プラスミドpMAP12、13、14及び15を用いて、三親交配系
（16）によりPs.3732-3-7を形質転換した。この系は、
二つの供与菌と一つの受容菌より形成される。供与菌
は、両菌株とも大腸菌で、一つはpMAPプラスミド（カナ
マイシン抵抗性を有するpMON5008の誘導体）を有するも
ので、当該プラスミドをPs.3732-3-7の形質転換に使用
するものであり、他のもう一つの菌株はpRK2013を有す
る大腸菌である。pRK2の形質転換（tra）遺伝子はpRK20
13上に存在し、Ps.3732-3-7のプラスミドの形質転換を
媒体するが、それ自身はシユウドモナス属中では複製し
ない。受容菌はリフアムピシン及びナルジクス酸に抵抗
性を有し、カナマイシンには感受性である。
三親交配系に関与する３種の菌株（pRK2013を含有する
大腸菌、pMON5008誘導体を含有する大腸菌及びPs.3732-
3-7）を別々にL-ブロス中で一晩培養した。10分の1mlの
培養物を新たなL-ブロスに移し、37℃（ただしPs.3732-
3-7は30℃）で３時間成長させた。各1mlをとり遠心分離
によりペレツト化し、0.1％グルコースを補充したL-ブ
ロスで洗浄した。三菌株の培養物全部を全量200μのL
-ブロスに再懸濁して新たに注いだL-寒天平板培地の中
央に接種した。平板培地を30℃で16時間インキユベート
した。細胞は、平板培地から（かき取り）10mM MgSO41m
lを用いて再懸濁し、シユウドモナスＦ（PFと称す）寒
天（デイフコカタログ＃0448-01）に100μg/mlのリフア
ムピシン及び50μg/mlのカナマイシンを含む培地で平板
培養した。
転換接合子を50μg/mlのカナマイシン及び100μg/mlの
リフアムピシンを含むPF寒天培地上で選抜した。所望の
ピー・フルオレシエンス3732-3-7のPF寒天培地上コロニ
ーは長波紫外線に抵抗性で、同線下で螢光を発し、pMAP
12、13、14又は15の存在によりリフアムピシン及びカナ
マイシン抵抗性であつた。コロニーを、マーカーβ‐ガ
ラクトシダーゼの存在を確認するためにこの指示薬X-ga
l60μg/を含む平板培地上に線図した。
pMAP15を含有するピー・フルオレシエンス3732-3-7は米
国特許庁審査基準第608・01（Ｐ）項の定めるところに
従いATCCに寄託し、ATCC＃39803の番号が割り当てられ
ている。
ビー・テイー毒素遺伝子の欠失誘電体の調製 ビー・テイー・結晶蛋白毒素遺伝子の欠失誘導体は、当
該134,000ダルトンの毒素の遺伝情報をコード化してい
る領域内でpMAP8のDNA断片の欠失をおこさせることによ
り調製した。プラスミドpMAP8（1-1.5μｇを20μｌのTE
緩衝剤に含んだもの）を適当な酵素で切断し、フエノー
ル／クロロホルム混合物（1:1）で抽出し、TE緩衝液で4
0μｌまで希釈し、再リゲートし、CaCl2処理コンピテン
トJM101細胞の形質転換に使用した。欠失により得られ
たプラスミドは、電気泳動後アガロースゲム上でミニプ
レププラスミド調製物のスクリーニングにより固定し
た。二つの欠失誘導体はそれぞれpMAP10、pMAP11と命名
され、pMAP8からそれぞれ1.4KbのKpn I断片（pMAP10の
場合）及び0.5Kb Nru-Sca I断片（pMAP11の場合）を切
り取ることにより構築されたものである。これらの構築
のいずれかを含有する大腸菌は、マンヅカ セクスタ
（Manduca sexta）に有毒な物質を産出した。これらの
欠失断片の制限地図は第２図に示してある。
pMAP10の2.4Kb Bam HI-Kpn I断片をpUC18（18）にサブ
クローンした。pMAP10とpUC18をBam HIとKpn Iで消化
し、混合し、リゲートし、大腸菌JM101の形質転換に使
用した。クローンを単離したが、このものは、単鎖の2.
4Kb Bam HI-Kpn I断片をもつプラスミドを含有してい
た。このプラスミドをpMAP18と命令した。このプラスミ
ドを含有するプラスミドはマンヅカ セクスタに有毒で
あつた。
欠失誘導体のPs.3732-3-7への挿入 ビー・テイー遺伝子のシユウドモナス フルオレシエン
ス3732-3-7への導入のため上記の方法を繰返し、ビー・
テイーDNA断片の欠失操作を行なつた。プラスミドDNA
（pMAP10）をBam HIで消化し、pMON5008のBam HI及びBg
l II部位で両方向にクローン化した。これらの構築は、
pMAP20、21、22及び23と命名された。免疫学的分解（1
3）を用い、ピー・フルオレシエンス3732-3-7による抗
ビー・テイー抗体との交差反応性物質（CRM）の産出を
確認した。
本発明による植物体上での集落形成微生物の殺虫活性を
次の実施例にもとづき試験した。以下の実施例において
は、植物上での集落形成能を有する微生物の蛋白抽出物
又は未溶解全細胞を用いた。蛋白抽出物は実施例１記載
の如く調製した。
実施例１ 蛋白抽出物の調製 50mlの100μg/mlアンピシリン含有L-ブロスに微生物
（対照又は遺伝子操作をした植物上での集落形成能を有
する微生物）を接種し、振とう器上で一晩37℃（シユウ
ドモナス属の場合は30℃）で培養した。接種物を10分間
SS-34 10K中で遠心分離した。ペレツトは5mlのエリス
緩衝液（0.05Mのクエン酸、0.05M NaH2PO4・H2O、0.05M
Na2CO3、0.05M2-アミノ‐3-メチル‐1,3-プロパンジオ
ール、pH10.5、0.01Mジチオスライトール）に再懸濁し
た。懸濁液はドライアイス上ですばやく凍結し、次いで
30℃に保つたウオーターバス中で溶解した。その後、1m
lのガラスビーズ（トーマス科学社製＃5663R50）を懸濁
液に加えて、ボルテツクス撹拌器を用いて混合物を約15
秒撹拌した。この操作を８回繰り返した。ガラスビーズ
はガラスウールを用いて遠心分離により取り除いた。溶
解した細胞サンプルを回収し、当量のエリス緩衝液（pH
6.5）に加えた。抽出物は、昆虫検定（殺虫力の測定）
に使用した。
本発明による植物上での集落形成能を有する微生物の数
種類において発現した殺虫性蛋白の量は、可溶性蛋白の
ELISA（17）による免疫学的解析とウエスタンブロツト
（13）を用いた全蛋白の解析により推定した。数種類の
プラスミド構築の推定値は表IIIに示す。
実施例‐２飼料（による殺虫効果）検定 標準人工飼料基材を3.5cm×1.0cmの平底容器（50個/1ト
レイ、フローラボラトリーズ社製）に容量約5mlで分配
した。当該寒天を基材とする飼料は、短時間のうち固化
した。固化後被験（又は対照）材料で処理した。100μ
ｌの被験（又は対照）材料を、当該飼料を含む容器１個
あたりの表面に自動ペレツトを用い施用し、１材料当り
10容器を用いた。均一に施用するために材料の散布に、
アルコール炎で予じめ滅菌したガラス製の散布器を用い
た。このようにして調製したトレイを縦に流動するフー
ドの下で乾燥した後、10容器の各飼料表面に新生幼虫各
１匹（10匹／処理）を放飼した。トレイを覆い、28℃で
４日間インキユベートし、次いで処理により誘発された
死虫率の百分率を評価した。対照区は、各検定単位毎に
用意し、飼料及び末遺伝子操作微生物の効果を確認し
た。いずれの場合も、飼料のみ又は末遺伝子操作微生で
処理した飼料では、毒性（すなわち殺虫率）は観察され
なかつた。タバコホーンワーム（Manduca sexta）、コ
ーンイヤーワーム（Heliothis zea）及びキヤベツルー
パー（Trichoplasia sp.）の幼虫に対する毒性につい
て、本発明による新規プラスミドを含有する微生物を用
いて試験したとき観察された結果を表‐IVにまとめて示
す。
実施例３ 実施例２の手順を、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）の
幼虫を使用して繰返した。１試験例では、幼虫の死亡は
観察されなかつた。しかし、当該遺伝子操作をした微生
物の施用により、幼虫の有意な重量の損失が認められ
た。他の試験例では、死虫率が観察された。全例とも、
100μの蛋白抽出物又は未溶解細胞調製物を施用し
た。結果は表Ｖにまとめて示す。
実施例4-滴下検定 2:1（微生物調製物:FD ＆ Cブルー染料）混合物で10％
の庶糖を含有するものをボルテツクス撹拌器で混合し、
スチロホーム板の表面に約10μ滴下した。新生タバコ
ホーンワーム幼虫を滴下物の近くに放置し、自由に摂取
させた。青色の腹部から（判断して）明らかに飽食した
幼虫は、処理板より難し、人工餌で飼育した。死虫率の
百分率は４日後に評価した。結果は表VIにまとめて示
す。
実施例５ 葉片検定 2cm4方のトマト葉片を、生きている細胞を含有する溶液
中に浸した。この葉片をろ紙に吸い取らせて、次いで葉
片を蒸留水で湿らしたろ紙を含む容器にそれぞれ入れ
た。容器は飼料検定に使用したものと同一である。１処
理当り10容器を用い、各容器にタバコホーンワーム新生
幼虫を１匹づつ放した。死虫率は72時間後に記録した。
結果は表VIIIにまとめて示す。
以上の如く本発明の実施態様について説明したがその詳
細に記述した部分が、この発明の限界を構成するもので
はなく、種々な同等物、変更及び修飾が本発明の本質及
び技術的範囲から逸脱するものではないことは明らかで
あり、かゝる均等の態様は本発明に包含されるものであ
る。
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・メセツング，オリゴペプチド変異性を使用した挿入ベ
クター、「遺伝子」に投稿中（Norrander,J.,Kempe,T.a
nd Messing,J.,“Insertional Vectors Using Oligonuc
leotide Mutagenssis",Submitted to Gene.）
【図面の簡単な説明】
次に図面について説明するが、図面は実縮尺にもとづく
ものではないが、本発明の実施に際して使用可能な材料
についての例示である。 第１図はpMAP2、pMAP3及びpMAP4の挿入ビー・テイー・
断片の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図で、第２図はpM
AP8、pMAP10及びpMAP11の挿入ビー・テイー・断片の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バチルス チュウリンゲンシスの結晶蛋白
    毒素の免疫学的性質と殺虫活性を事実上有する蛋白を発
    現する外来DNAを含有するように遺伝子操作され、か
    つ、植物上での集落形成能を有する微生物であって、該
    微生物が、シュウドモナス（Pseudomonas）およびアグ
    ロバクテリウム（Agrobacterium）よりなる群より選ば
    れた微生物。
  2. 【請求項２】当該蛋白が大きさにおいて約80,000から13
    4,000ダルトンである特許請求の範囲第１項記載の微生
    物。
  3. 【請求項３】当該外来DNAがバチルス チュウリンゲン
    シス バール．クルスタキHD-1（Bacillus thuringiens
    is var.kurstaki）から誘導されたものである特許請求
    の範囲第１項記載の微生物。
  4. 【請求項４】当該微生物がシュウドモナス フルオレシ
    ェンス（Pseudomonas fluorescens）である特許請求の
    範囲第１項記載の微生物。
  5. 【請求項５】当該微生物がシュウドモナス フルオレシ
    ェンス3732-3-7ATCC＃39802である特許請求の範囲第１
    項記載の微生物。
  6. 【請求項６】生物学的に活性な作因としてのバチルス
    チュウリンゲンシスの結晶蛋白毒素の免疫学的性質と殺
    虫活性を事実上有する蛋白を発現する外来プラスミドDN
    Aを含有するように遺伝子操作され、かつ植物上での集
    落形成能を有する微生物と適当な賦形剤よりなる組成物
    であって、該微生物が、シュウドモナス（Pseudomona
    s）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）よりな
    る群より選ばれた微生物である組成物。
  7. 【請求項７】当該蛋白が大きさにおいて約80,000から13
    4,000ダルトンである特許請求の範囲第６項記載の組成
    物。
  8. 【請求項８】当該外来DNAがバチルス チュウリンゲン
    シス バール．クルスタキHD-1（Bacillus thuringiens
    is var.kurstaki）から誘導されたものである特許請求
    の範囲第６項記載の組成物。
  9. 【請求項９】当該微生物がシュウドモナス フルオレシ
    ェンス（Pseudomonas fluorescens）である特許請求の
    範囲第１項記載の組成物。
  10. 【請求項１０】当該微生物がシュウドモナス フルオレ
    シェンス3732-3-7ATCC＃39802である特許請求の範囲第
    ６項記載の組成物。
JP60276667A 1984-12-10 1985-12-09 バチルスチユウリンゲンシス結晶蛋白遺伝子の植物上での集落形成能を有する微生物への挿入及びその用途 Expired - Lifetime JPH074232B2 (ja)

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