ES2315244T3 - Gelatina recombinante en vacunas. - Google Patents

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Thomas B. Neff
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Abstract

Una formulación para vacuna que comprende gelatina, donde dicha gelatina es gelatina recombinante consistente en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.

Description

Gelatina recombinante en vacunas.
Campo de la invención
Esta invención hace referencia a vacunas, y específicamente, a formulaciones para vacunas que contienen gelatina recombinante.
Contexto de la invención
Las vacunas son preparaciones de microorganismos muertos o modificados, organismos vivos atenuados u organismos vivos completamente virulentos, u otro agente infeccioso, incluyendo, aunque sin limitar, péptidos, proteínas, macromoléculas biológicas, o ácidos nucleicos, naturales, sintéticos o semi-sintéticos, capaces de estimular una respuesta inmune cuando se administran a un sujeto. Las vacunas son suministradas con el fin de prevenir o atenuar la severidad de posterior exposición o una infección con un microorganismo similar. En vacunas con elementos vivos atenuados, el microorganismo ha sido tratado normalmente para producir una cepa no virulenta capaz de provocar inmunidad protectora. En vacunas inactivadas, los componentes de ácido nucleico microbiales infecciosos son destruidos antes de la administración, sin afectar la antigenicidad o inmunogenicidad de la capa viral o las proteínas de la membrana externa bacterial del microorganismo.
Las vacunas han sufrido cambios radicales en la salud global. Por ejemplo, en 1980, La Organización Mundial de la Salud declaró la viruela como erradicada como resultado de los esfuerzos internacionales relativos a las vacunas. La difteria, tos ferina, y sarampión, responsables de los elevados índices de mortalidad infantil, son el centro de atención de los programas establecidos para inmunización de niños y bebés en países industrializados, y se realizan continuos esfuerzos por establecer tales programas en países en vías de desarrollo. Las inmunizaciones protegen a los niños contra la polio, sarampión, paperas, rubéola (sarampión alemán), difteria, tos ferina, varicela, hepatitis B, y Haemophilus influenzae tipo B. Los programas actuales de inmunización pueden comenzar después de 12 horas tras el nacimiento, y requieren múltiples inmunizaciones durante los dos primeros años. La administración de vacunas puede darse en varios puntos a lo largo de la vida de una persona, por ejemplo, vacunas estacionales, por ejemplo, "vacuna de la gripe", y vacunas administradas a los viajeros, etc.
Las vacunas pueden administrarse de varias formas. Actualmente, las vacunas se administran principalmente a través de inyección o administración oral. Las formulaciones de vacunas pueden incluir, por ejemplo, adyuvantes para aumentar la respuesta inmune, de modo que se precisa menos vacuna para producir la respuesta inmune protectora deseada. También pueden administrarse varios excipientes y portadores, contribuyendo a la consistencia y a la liberación de la vacuna.
Las vacunas también incluyen varios componentes incluidos en la formulación de la vacuna para mantener la estabilidad de la vacuna. Tales estabilizadores pretenden mantener la integridad de la vacuna, conservando la habilidad de la vacuna para provocar una respuesta inmune protectora tras la administración. Los estabilizadores empleado en formulaciones para vacunas incluyen, aunque no se limitan a, agentes químicos y biológicos que llevan a cabo una variedad de funciones, como, por ejemplo, detergentes, búferes, sales, azúcares, y varios componentes proteicos, incluyendo gelatina, y en concreto, gelatina hidrolizada.
Fabricación de Gelatina
La gelatina es un derivado del colágeno, una proteína principal estructural y conectora en animales. La gelatina se deriva de la desnaturalización de colágeno y contiene secuencias de polipéptidos que tienen repeticiones Gly-X-Y, donde X e Y son normalmente residuos de prolina e hidroxiprolina. Estas secuencias contribuyen en la estructura triple helicoidal y afectan a la habilidad para melificarse de los polipéptidos de gelatina. La gelatina que se encuentra actualmente disponible se extrae a través del procesamiento de pieles y huesos de animales, normalmente de fuentes bovinas o porcinas. Las propiedades biofísicas de la gelatina lo hacen un material versátil, comúnmente empleado en una variedad de aplicaciones e industrias. La gelatina se emplea, por ejemplo, en productos comestibles y en bebidas y en procesos de manufactura. Por lo tanto, la gelatina es un producto comercialmente valioso y versátil.
Normalmente, la gelatina se fabrica a partir de colágeno que ocurre de manera natural en fuentes bovinas y porcinas, en particular, a partir de pieles y huesos. En algunos casos, la gelatina puede extraerse de, por ejemplo, peces, pollos, o caballos. Las materias primas de la producción habitual de gelatina, como pieles y huesos bovinos, se originan de animales sometidos a inspección certificada por el gobierno y aptos para el consumo por parte de humanos. Existe una preocupación sobre el riesgo de infección de esta materia prima debido a la presencia de agentes contaminantes como encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), en particular encefalopatía espongiforme bovina (EEB), y escrapie, etc. (Ver, por ejemplo, Rohwer, R. G. (1996), Dev Biol Stand 88:247-256). Tales cuestiones son especialmente críticas para la gelatina empleada en aplicaciones farmacéuticas y médicas.
Recientemente, la preocupación sobre la seguridad de estos materiales, derivándose una parte significativa de fuentes bovinas, ha aumentando causando que varios productos con gelatina se han convertido en el foco de atención de varias medidas reguladoras para reducir el riesgo potencial de transmisión de encefalopatía espongiforme bovina (EEB), unida a la nueva variante de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (nvECJ), una enfermedad neurológica fatal en humanos. Existe un interés basado en que los pasos de purificación actualmente empleados en el proceso de extracción de gelatina a partir de tejidos y huesos animales pueden no ser suficientes para retirar el riesgo de infección debido al tejido que transporta la EE contaminante (es decir, el tejido cerebral, etc.). Los fabricantes de Estados Unidos y Europa especifican que la materia prima para la gelatina que se incluye en productos alimenticios para humanos o en aplicaciones farmacéuticas, médicas o cosméticas no deben obtenerse de un número creciente de países con EEB. Además, las regulaciones especifican que ciertas materias, como el tejido cerebral bovino, no se emplean en la producción de gelatina.
Los procesos actuales de producción incluyen varios pasos de purificación y limpieza, y pueden requerir modos de extracción duros y largos. Las pieles y los huesos de los animales se tratan en un proceso de interpretación, y el material extraído es sometido a varios tratamientos químicos, incluyendo la exposición prolongada a soluciones altamente ácidas o alcalinas. Los numerosos pasos de purificación pueden incluir lavado y filtración y varios tratamientos con calor. La desmineralización y los tratamientos con cal se emplean para retirar impurezas como proteínas sin colágeno. Los huesos deben desgrasarse. Los pasos de lavado y filtración adicionales, intercambios de ión, y otros tratamientos químicos y esterilizadores se añaden al proceso para purificar aún más el material. Además, las sustancias contaminantes e impurezas pueden continuar tras el proceso, por lo que el producto de gelatina resultante normalmente se aclara, purifica, y con frecuencia se concentra antes de estar lista para su uso.
La gelatina comercial generalmente se clasifica como tipo A o tipo B. Estas clasificaciones reflejan el pretratamiento recibido en la fuente de extracción como parte del proceso de extracción. Normalmente, el tipo A se deriva de materiales procesados con ácido, normalmente pieles de cerdo, y el tipo B normalmente se deriva de materiales procesados con alcalina o cal, normalmente huesos (oseína) y pieles bovinas.
En la extracción de gelatina del tipo A, el proceso normalmente implica someter a las pieles porcinas frescas o congeladas a sucesivos lavados con agua y a tratamientos con ácidos diluidos, Las pieles tratados con ácido se vuelven a lavar y a continuación se someten a repetidos pasos de extracción en los cuales se tratan con agua caliente, hidrolizando parcialmente el colágeno presente. Los extractos resultantes, soluciones diluidas de gelatina, se filtran y evaporan, y los concentrados resultantes se dejan templar o enfriar hasta formar un gel. A continuación, el gel se trata en túneles de secado, o con continuos secadores o con otros dispositivos de secado.
En el proceso con cal, la gelatina de tipo B se deriva de pieles y recortes de piel de los donantes lavados y tratados posteriormente con cal. El tratamiento con cal puede tardar desde un mes a tres meses, y normalmente alrededor de sesenta días. Las pieles con cal se lavan y tratan con ácidos diluidos. A continuación las pieles se hidrolizan con agua caliente y los extractos resultantes se procesan tal y como se ha descrito anteriormente para el proceso de tratamiento con ácido.
La gelatina de tipo B también puede procesarse a partir de fuentes óseas. Los huesos duros se lavan, desgrasan, y filtran con tratamientos sucesivos de ácidos diluidos, como ácido hidroclórico. El tratamiento con ácido reacciona con los contenidos minerales del hueso, que se retiran junto con la solución ácida, dejando los huesos desmineralizados. Esta materia orgánica ósea, lavada para eliminar el ácido residual, se seca y se abona con cal inmediatamente. Tras el abono con cal, la oseína se trata a continuación tal y como se ha descrito anteriormente para la producción de gelatina a partir de pieles bovinas. En todos los casos, tras los pasos finales de filtrado, desmineralización, concentración y secado, el producto de gelatina resultante se divide en dos lotes o grupos, sometidos a varias pruebas físicas, químicas y bacteriológicas para determinar el grado y pureza, y el crudo y la mezcla de acuerdo con los requisitos comerciales. Tanto en el proceso de extracción del tipo A como el del tipo B, el producto de gelatina resultante normalmente comprende una mezcla de moléculas de gelatina, en tamaños que oscilan desde unos pocos miles hasta varios cientos de miles daltons.
La gelatina del pescado, clasificada como tipo formador de gel y no formador de gel, y normalmente se procesa como la gelatina de Tipo A, también se emplea en ciertas aplicaciones comerciales. Los tipos que forman gel normalmente se derivan de las pieles de peces en agua caliente, mientras que los tipos que no forman gel se derivan de peces en agua fría. Las gelatinas de los pescados tiene composiciones ampliamente varias de aminoácidos, y se diferencian de las gelatinas animales en que normalmente tienen proporciones más bajas de residuos de prolina e hidroxipropolina. A diferencia de las gelatinas animales, las gelatinas de los peces normalmente se quedan líquidas a temperaturas mucho más bajas, incluso en pesos moleculares medios comparables. Como otras gelatinas de animales, la gelatina del pescado se extrae mediante tratamiento y una posterior hidrolización de la piel del pescado. De nuevo, como con otros procesos de extracción animal, el proceso de extraer la gelatina del pescado da como resultado un producto que carece de homogeneidad.
Gelatina en Vacunas
Se han presentado las reacciones anafilácticas en las vacunas de sarampión, paperas y rubéola, y la vacuna combinada sarampión-paperas-rubéola (MMR). (Sakaguchi e Inouye, 2000, Vaccine, 18:2055-2058; Sakaguchi et al., 1999, J. Allergy Clin Immunol, 104:695-699). A pesar de la especulación de que estas reacciones alérgicas fueron causadas por alergia a las proteínas de huevos presentes en las vacunas, las reacciones anafilácticas han ocurrido tras la administración de la vacuna MMR en niños que toleraban los huevos. Se ha descubierto que la mayoría de las reacciones a vacunas vivas son provocadas por una sensibilidad adquirida a la gelatina bovina incluida en estas vacunas. (Ver, por ejemplo, Nakayam et al. (1999) J Allergy Clin Immunol 103:321-325, y referencias aquí indicadas; y Sakaguchi et al. (1999) Immunology, 96:286-290).
Estudios han revelado que la anafilaxis en niños en respuesta a vacunas virales vivas atenuadas que contienen gelatina es provocada por la gelatina, y que las vacunas difteria-tétano-tos ferina acelular (DTaP) que contienen gelatina parecen sensibilizar a los niños hacia la gelatina. En concreto, se ha identificado una fuerte relación entre vacunas DTaP que contienen gelatina, producción de gelatina IgE, y el riesgo de anafilaxis tras la posterior inmunización con vacunas virales vivas que contienen gelatina bovina (Sakaguchi e Inouye, supra; Nakayama et al, supra.).
Las reacciones anafilácticas a vacunas MMR que incluyen gelatina como estabilizador han sido estudiadas y han demostrado que son causadas por la gelatina bovina incluida en estas vacunas. En concreto, la reactividad de IgE a las cadenas \alpha1 y 2\alpha de colágeno bovino tipo I ha sido identificada en niños con alergia a la gelatina bovina (Sakaguchi et al., supra, y referencias aquí citadas). Las numerosas reacciones anafilácticas y alguna reacciones urticariales a vacunas de sarampión, paperas y rubéola que contienen gelatina se han asociado con respuestas alergénicas mediadas por IgE a la gelatina (Nakayama et al., supra). Se han identificado anticuerpos IgG específicos de gelatina en niños con reacciones de tipo sistémico inmediato y no inmediato a vacunas MMR, lo que sugiere que la respuesta inmune a gelatina no humana juega un papel en la patogénesis de reacciones sistémicas a vacunas con virus vivos. (Miyazawa et al., (1999) Vaccine 17:2176-2180; y Celso (1999) J Aller. Clin Immunol. 103:200-202, y referencias aquí citadas).
Dichas reacciones específicas de la vacuna provocadas por la gelatina son las más importantes en el contexto de mayor preocupación en relación con el uso de materiales derivados de animales, por ejemplo, derivados de vacas, con usos animales o humanos, por ejemplo, en aplicaciones farmacéuticas, y consumo. Dichas preocupaciones relativas a la seguridad de materiales de origen bovino se encuentran dirigidas al riesgo de exposición a agentes infecciosos que pueden sobrevivir o pueden introducirse en el proceso de extracción y purificación de gelatina de fuentes animales. (Ver, por ejemplo, Asher (1999) Dev. Biol. Stand. 99:41-44; y Verdrager (1999) Lancet 354:1304-1305). Una cierta vacuna oral para la polio empleada solamente en Reino Unido y en la República de Irlanda ha sido recientemente retirada tras determinarse que se empleó el suero fetal del ternero bovino procedente del Reino Unido en la fabricación de la vacuna (Informe de Noticias de la BBC "Polio vaccine in BSE scare", 20 octubre 2000; Organización Mundial de la Salud, "WHO Position Statement on Recall of Evans/Medeva Polio Vaccine in UK", 20 octubre 2000). Las preocupaciones en torno a la presencia de agentes infecciosos, como TSEs, así como bacterias y otros patógenos y endotoxinas que pueden existir tras la extracción, han establecido la necesidad de una materia seguro y no inmunogénica que pueda emplearse en lugar de las materias actualmente derivadas de fuentes animales.
Resumen
Los métodos actuales de extracción dan como resultado un producto de gelatina que es una mezcla heterogenia de proteínas, que contiene polipéptidos con distribuciones de peso molecular de varios ámbitos. A veces es necesario mezclar varios lotes de producto con el fin de obtener una mezcla de gelatina con las propiedades físicas apropiadas para uso en una aplicación deseada. Además, es virtualmente imposible, empleando métodos actuales de extracción, obtener una gelatina libre de impurezas sin gelatina, por ejemplo, proteína, lípido, polisacáridos, etc.
Un producto más homogéneo, y producido por medios más reproducibles, podría ser deseable. La disponibilidad de una materia homogénea con características físicas reproducibles sería deseable, por ejemplo, en varios productos y procesos, donde la disponibilidad de gelatina con características específicas, como un registro fijo de peso molecular, permitiría una actuación reproducible y controlada. Por lo tanto, existe la necesidad de un medio fiable y reproducible para la producción de gelatina que facilite un producto consistente con características controladas.
Además, existen preocupaciones en torno a la inmunogenicidad e infectividad de productos que contienen gelatina que resultan de productos de fuente animal y métodos para su preparación (Ver, por ejemplo, Sakaguchi e Inouye, supra; Sakaguchi et al., supra; Nakayama et al., supra; Asher, supra; y Verdrager, supra.). Por consiguiente, existe una necesidad por una fuente de gelatina diferente a la actualmente extraída de vacas, cerdos, y otras fuentes animales.
Los productores y consumidores finales de gelatina han investigado y testado un número de sustitutos naturales y sintéticos para la gelatina procedente de fuente animal actualmente disponible. Se han identificado alternativas para unas pocas aplicaciones, como el uso de materias primas de celulosa en cápsulas VCAPS (CAPSUGEL; Morris Plains, NJ), o el uso propuesto de proteínas del tipo de la gelatina no naturales de secuencias de colágeno de ratas y ratones en emulsiones fotográficas (Ver, por ejemplo, Werten, M. W. et al. (1999) Yeast 15:1087-1096; y De Wolf, Anton et al., Solicitud Europea Nº EP10141764A2). Sin embargo, para la mayoría de los productos y procesos con base de gelatina, las características de actuación de este material no se han duplicado y se han adoptado sustitutos. Por lo tanto, existe la necesidad de un medio para producir gelatina de una manera sintética y reproducible donde el producto resultante puede servir como sustituto racional con las características de actuación deseadas.
Existe una necesidad de un producto de gelatina versátil procedente de una fuente no animal que se adapte fácilmente a diferentes usos y que solucione los problemas existentes en salud. En particular, con respecto a las vacunas, existe una necesidad de una materia que minimice de manera seguro los riesgos de inmunogenicidad, antigenicidad, y/o infectividad de productos derivados de animales, mientras sirve como un estabilizador y componente efectivo en formulaciones para vacunas.
La presente invención responde a las necesidades proporcionando una materia de sustitución universal, obtenido de manera recombinante, apropiado para uso en el espectro extraordinariamente diverso de aplicaciones en las cuales la gelatina se emplea actualmente. En particular, la presente invención proporciona gelatina recombinante para uso en formulaciones para vacunas. Las materias presentes pueden diseñarse para poseer propiedades y características deseadas para aplicaciones específicas, y pueden por lo tanto sustituir a las gelatinas procedentes de fuentes animales actualmente disponibles así como proporcionar nuevas propiedades y usos previamente no disponibles.
Resumen de la invención
La presente invención está dirigida al uso de gelatina en vacunas. La gelatina de la presente invención es gelatina recombinante consistente en polipéptidos de peso molecular uniforme, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona una formulación para vacuna que comprende la gelatina recombinante. En una realización preferente, la gelatina recombinante es gelatina humana. Un aspecto adicional de la presente invención indica que la gelatina recombinante no es inmunogénica.
En una realización, la presente invención proporciona una formulación para vacuna que comprende la gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante confiere estabilidad a temperatura ambiente. En otra realización, la gelatina se deriva de secuencia de colágeno no nativa.
Se consideran formulaciones que contiene gelatinas específicas recombinantes. En ciertas realizaciones, la gelatina recombinante tiene un peso molecular seleccionado del grupo consistente en aproximadamente 1 kDa, aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 8 kDa, aproximadamente 9 kDa, aproximadamente 14 kDa, aproximadamente 16 kDa, aproximadamente 22 kDa, aproximadamente 23 kDa, aproximadamente 44 kDa, y aproximadamente 65 kDa.
La presente invención proporciona, en una realización, una formulación para vacuna que comprende la gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante se obtiene expresando una secuencia de polipéptido derivada de un tipo de colágeno, sin la secuencia codificadora de cualquier otro tipo de colágeno, en una célula huésped. En varios aspectos, se administra una formulación para vacuna que contiene la gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante se produce directamente desde un constructo alterado de colágeno.
En realizaciones específicas, la presente invención engloba formulaciones para vacunas que comprenden una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID Nos:15 a través de 25, 30, 31, y 33.
Las formulaciones para vacunas de la presente invención pueden ser adecuadas para varios modos de envío, incluyendo el envío por inyección, envío nasal, envío oral, envío transdérmico, y envío pulmonar profundo. Las formulaciones para vacunas de la presente invención pueden formularse en un número de modos, por ejemplo, en forma líquida, seca, polvos, spray y mediante inhalador. En varias realizaciones, las presentes formulaciones para vacunas pueden comprender por vacunas vivas, inactivadas, subunidades, dosis únicas, dosis múltiples, conjugados, ácido nucleico, ADN, vacunas combinadas y acelulares. Se consideran vacunas específicas, incluyendo, aunque sin limitar, vacunas formuladas para la prevención de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en virus vaccinia (viruela), virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola, difteria, tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes), tos ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG, tubercuolosis), haemophilus influenzae, meningitis, rabia, cólera, virus de encefalitis japonesa, salmonella, shigella, hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre amarilla, fiebre aftosa, virus herpes simples, virus sincitial respiratorio, rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus herpes del pavo (Enfermedad de Marek), gripe, y ántrax.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona formulaciones para vacunas que consisten en la gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante tiene niveles de endotoxina inferiores a 1.000 EU/mg, 0.500 EU/mg, 0.050 EU/mg, y 0.005 EU/mg. En un aspecto, la presente invención engloba una formulación para vacuna que comprende la gelatina recombinante donde la gelatina recombinante es proteolíticamente estable. Se considera un estabilizador de vacuna que comprende la gelatina recombinante. La presente invención proporciona métodos para producir formulaciones para vacunas que comprenden la gelatina recombinante. En una realización, el método comprende administrar la gelatina recombinante y administrar una vacuna, y combinar la gelatina recombinante y la vacuna. También se facilita el uso de la gelatina recombinante en la fabricación de una vacuna para provocar una respuesta inmune en un sujeto. Además, también se contemplan kits que comprenden una vacuna constituida por la gelatina recombinante y un dispositivo de envío para la vacuna. En varias realizaciones, el dispositivo de envío es un dispositivo adecuado, por ejemplo, para envío inyectable, nasal, a través de la mucosa o mediante aerosol.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 expone los resultados que muestran la expresión de gelatinas recombinantes.
Las Figuras 2A y 2B exponen los resultados que demuestran que las gelatinas recombinantes mantienen la unión celular.
La Figura 3 expone los resultados que demuestran la producción de gelatinas recombinantes proteolíticamente estables.
La Figura 4 expone resultados que demuestran la producción de gelatinas recombinantes hidroxiladas.
La Figura 5 expone resultados que muestran la purificación de gelatina recombinante después de la hidroxilación in vitro.
La Figura 6 expone resultados que muestran la estabilidad de gelatinas recombinantes expresadas en la presencia o ausencia de prolil-4-hidroxilasa.
La Figura 7 expone resultados que muestran la expresión mejorada de gelatina recombinante por la suplementación de medios de expresión.
La Figura 8 expone resultados comparando las gelatinas comercialmente disponibles con la gelatina recombinante cruzada.
La Figura 9 expone resultados comparando la distribución del peso molecular de gelatinas comercialmente disponibles.
Las Figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, y 10F exponen resultados que muestran la hidrólisis de gelatinas comercialmente disponibles llevada a cabo a 120ºC.
Las Figuras 11A, 11B, 11C y 11D exponen resultados que muestran la hidrólisis de gelatinas comercialmente disponibles llevada a cabo a 150ºC.
Las Figuras 12A y 12B exponen resultados mostrando la hidrólisis ácida y termal de colágeno humano recombinante del tipo I y tipo III.
La Figura 13 expone resultados que muestran la hidrólisis enzimática de colágeno humano recombinante de tipo I.
La Figura 14 expone un análisis Western Blot de colágenos humanos recombinantes y gelatinas humanas recombinantes usando antisuero de cerdos de Guinea inmunizados con colágeno humano recombinante del tipo I.
Las Figuras 15 A y 15B exponen resultados mostrando que el antisuero de cerdos de Guinea inmunizados con colágeno humano recombinante del tipo I es reactivo con fragmentos específicos de bromuro de cianógeno de colágeno del tipo I.
La Figura 16 expone resultados ELISA que muestran que el antisuero de cerdos de Guinea inmunizados con colágeno humano recombinante del tipo I no es reactivo con gelatinas humanas recombinantes.
Descripción de la invención
Antes de describir las presentes proteínas, secuencias de nucleótidos, y métodos, debe entenderse que esta invención no se limita a la particular metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reagentes aquí descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología aquí empleada tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención.
Debe observarse que tal y como aquí se emplean, y en las reivindicaciones ajuntas, las formas singulares "un", "una", "uno" y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que se indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula huésped" hace referencia a una o más células huésped y equivalentes de las mismas conocidos por aquellos expertos en la técnica, y la referencia a "un anticuerpo" hace referencia a uno o más anticuerpos y equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en la técnica, y etcétera.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen los significados comúnmente entendidos por un experto en la técnica a la que la invención pertenece. A pesar de que algunos métodos y materiales similares a los aquí descritos pueden emplearse en la práctica o en las pruebas de la presente invención, a continuación se describen los métodos, dispositivos y materiales preferentes. Todas las publicaciones aquí mencionadas de incorporan como referencia con el propósito de describir y exponer las líneas celulares, vectores, y metodologías, etc, que se incluyen en las publicaciones que pueden emplearse en relación con esta invención. Nada aquí descrito debe interpretarse como un reconocimiento de que la invención no merece preceder a tal exposición por virtud de la invención anterior. Cada referencia aquí citada se incorpora por referencia en su
totalidad.
La práctica de la presente invención empelará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, en la técnica en cuestión. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Prss, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series) 2ª ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag).
Definiciones
El término "colágeno" se refiere a cualquiera de los tipos conocidos de colágeno, incluyendo colágeno de tipo I hasta tipo XX, así como otros colágenos, ya sean naturales, sintéticos, semi-sintéticos o recombinantes. El término también engloba procolágenos. El término colágeno engloba cualquier polipéptido de cadena sencilla codificado por un polinucleótido sencillo, así como unidades homotriméricas y heterotriméricas de cadenas de colágeno. El término "colágeno" engloba específicamente variantes y fragmentos de los mismos, y equivalentes funcionales y derivados de los mismos, que preferiblemente retienen al menos una característica estructural y funcional de colágeno, por ejemplo, un dominio (Gly-X-Y)_{n}.
El término "procolágeno" se refiere a un procolágeno correspondiente a cualquier tipo de colágeno desde el tipo I hasta el tipo XX, así como a un procolágeno correspondiente a otros colágenos, ya sean naturales, sintéticos, semi-sintéticos o recombinantes, que posean propéptidos o telopéptidos adicionales de terminal-C y/o terminal-N que ayuden en el montaje, solubilidad, purificación, o cualquier otra función, y que a continuación se parten por N-proteinasa, C-proteinasa, u otras enzimas, por ejemplo, enzimas proteolíticas asociadas con la producción de colágeno. El término procolágeno engloba específicamente variantes y fragmentos del mismo, y equivalentes y derivados funcionales del mismo, que preferiblemente retienen al menos una característica estructural y funcional de colágeno, por ejemplo, un dominio (Gly-X-Y)_{n}.
"Gelatina" tal y como aquí se emplea hace referencia a cualquier gelatina, ya sea extraída mediante método tradicional o de origen recombinante o biosintético, o a cualquier molécula que tenga al menos una característica estructural y/o funcional de la gelatina. Actualmente, la gelatina se obtiene mediante extracción de colágeno derivado de fuentes animales (por ejemplo, ganado bovino, ganado porcino, roedores, pollos, caballos, peces, etc.), por ejemplo, huesos y tejidos. El término gelatina engloba tanto la composición de más de un polipéptido incluido en un producto de gelatina, así como un polipéptido individual que contribuye en el material de gelatina. Por lo tanto, el término gelatina recombinante tal y como aquí se emplea en referencia a la presente invención engloba tanto un material de gelatina recombinante que contiene los presentes polipéptidos de gelatina como un polipéptido individual de gelatina de la presente invención.
Los polipéptidos de los cuales la gelatina se puede derivar son polipéptidos tales como colágenos, procolágenos, y otros polipéptidos que tienen al menos una característica estructural y/o funcional de la gelatina. Dicho polipéptido podría incluir una cadena sencilla de colágeno, o un homotrimero o heterotrimero de colágeno, o fragmentos, derivados, oligómeros, polímeros, o subunidades de los mismos, conteniendo al menos un dominio de colágeno (una región Gly-X-Y). Específicamente, el término contempla secuencias injertadas no encontradas en la naturaleza, como construcciones de colágeno alteradas, etc. Una construcción de colágeno alterada es un polinucleótido que comprende una secuencia que está alterada, por medio de eliminaciones, adiciones, sustituciones, u otros cambios, procedente de un gen de colágeno que ocurre de manera natural.
Un "adyuvante" es un agente añadido a un fármaco o vacuna para aumentar, mejorar o sino ayudar en su eficacia. Un adyuvante empleado en una formulación para una vacuna podría ser un agente inmunológico que mejora la respuesta inmune produciendo un estimulador no específico de la respuesta inmune. Los adyuvantes se emplean con frecuencia en vacunas no vivas.
Los términos "alelo" o "secuencia alélica" se refieren a formas alternativas de secuencias genéticas. Los alelos pueden resultar de al menos una mutación en la secuencia de ácido nucleico y pueden dar como resultado mARNs o polipéptidos alterados cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que otorgan una mejora a los alelos generalmente se atribuyen a eliminaciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambio puede ocurrir solo, o en combinación con otros, una o más veces en una secuencia dada.
Secuencias de polinucleótidos "alterados" incluyen aquellas con eliminaciones, inserciones o sustituciones de diferentes nucleótidos que resultan en un polinucleótido que codifica el mismo polipéptido o un polipéptido funcionalmente equivalente. Se incluyen en esta definición secuencias que muestran polimorfismos que pueden o no detectarse fácilmente usando cebadores particulares para oligonucleótidos o a través de la eliminación de hibridización impropia o inesperada de alelos, con un locus diferente al locus cromosomal normal para la secuencia de polinucleótido del sujeto.
Polipéptidos "alterados" pueden contener eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos de aminoácido que producen un cambio silencioso y que dan como resultado un polipéptido funcionalmente equivalente. Las sustituciones intencionadas de aminoácido pueden realizarse en base a la similitud, polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza antipática de los residuos siempre y cuando la actividad biológica e inmunológica del polipéptido codificado se retenga. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa pueden incluir ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva pueden incluir lisina y guanina; y los aminoácidos con grupos polares sin carga que tienen similares valorasen hidrofilicidad pueden incluir leucina, isoleucina, y valina, glicina y alanina, asparagina y glutamina, serina y treonina, y fenilalanina y tirosina.
Las secuencias de "aminoácido" o "polipéptido" o "polipéptidos", ya que aquí se emplean estos términos, hacen referencia a secuencias de oligopéptido, péptido, polipéptido y proteína, y fragmentos de las mismas, y a moléculas que ocurren naturalmente o sintéticas. Los fragmentos de polipéptido o aminoácido son una parte de un polipéptido que retiene al menos una característica estructural y/o funcional del polipéptido. En al menos una realización de la invención, los fragmentos de polipéptido son aquellos que retienen al menos una región (Gly-X-Y)_{n}.
El término "animal" tal y como se emplea en referencia, por ejemplo en "colágenos animales" engloba cualquier colágeno, derivado de fuentes animales, ya sea natural, sintético, semi-sintético o recombinante. Las fuentes animales incluyen, por ejemplo, fuentes mamíferas, incluyendo, pero sin limitar, fuentes de ganado bovino, porcino, roedores, caballos y ganado ovino, y otras fuentes animales, incluyendo, pero sin limitar, pollos y fuentes de peces, y fuentes de animales no vertebrados.
"Antigenicidad" hace referencia a la habilidad de una sustancia para, cuando se introduce en el cuerpo, estimular una respuesta inmune y la producción de un anticuerpo. Un agente que muestra la propiedad de antigenicidad es denominado antigénico. Los agentes antigénicos pueden incluir, pero sin limitación, una variedad de macromoléculas como, por ejemplo, proteínas, lipoproteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, bacterias y componentes bacteriano, y virus y componentes virales.
Los términos "complementario" y "complementariedad", tal y como aquí se emplean, se refieren al enlace natural de polinucleótidos mediante emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se enlaza con la secuencia complementaria "T-C-A". La complementariedad entre dos moléculas de cadena sencilla puede ser "parcial", sólo cuando algunos de los ácidos nucleicos se enlazan, o pueden ser completas cuando existe una total complementariedad entre las moléculas de cadena sencilla. El grado de complementariedad entre cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativo sen la eficacia y fuerza de hibridización entre cadenas de ácido nucleico. Esto es particularmente importante en reacciones de amplificación, que dependen del enlace entre cadenas de ácido nucleico, y en el diseño y uso, por ejemplo, de moléculas de ácido nucleico péptido (PNA).
Una "eliminación" es un cambio en una secuencia de aminoácido o nucleótido que da como resultado la ausencia de uno o más residuos de aminoácido o nucleótidos.
El término "derivado", tal y como se aplica a polinucleótidos, hace referencia a la modificación química de un polipéptido codificador de un polipéptido en particular o complementario con un polinucleótido codificador de un polipéptido en particular. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, sustitución de hidrógeno por un alquilo, acilo, o grupo amino. Tal y como aquí se emplea con referencia a polipéptidos, el término "derivado" se refiere a un polipéptido que se modifica, por ejemplo, mediante hidroxilación, glicosilación, pegilación, o mediante otro proceso similar. El término "derivados" engloba aquellas moléculas que contienen al menos una característica estructural y/o funcional de la molécula de la cual se deriva.
Se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene fracciones químicas adicionales que normalmente no constituyen una parte de la molécula. Tales fracciones pueden mejorar la solubilidad de la molécula, la absorción, la esperanza de vida biológica y efectos similares. Las fracciones, de manera alternativa, pueden hacer descender la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseado de la molécula, y efectos similares. Las fracciones capaces de mediar tales efectos generalmente están disponibles en la técnica y pueden encontrarse por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Los procedimientos para enlazar tales fracciones o radicales son bien conocidos en la técnica.
Un "excipiente", tal y como se emplea aquí el término, es cualquier sustancia inerte empleada como diluyente o vehículo en la formulación de un fármaco, una vacuna, u otra composición farmacéutica, con el fin de conferir una consistencia o forma adecuada al fármaco, vacuna, o composición farmacéutica.
El término "equivalente funcional", tal y como aquí se emplea, hace referencia a un polipéptido o polinucleótido que posee al menos una característica funcional y/o estructural de un polipéptido o polinucleótido particular. Un equivalente funcional puede contener modificaciones que permitan la actuación de una función específica. El término "equivalente funcional" pretende incluir fragmentos, mutantes, híbridos, variantes, análogos, o derivados químicos de una molécula.
Una "proteína fusión" es una proteína en la que las secuencias péptidas de diferentes proteínas están unidas de manera operable.
El término "hibridización" se refiere al proceso por el cual la secuencia de ácido nucleico se enlaza con la secuencia complementaria por medio del emparejamiento de bases. Las condiciones para la hibridización pueden definirse, por ejemplo, mediante concentraciones de sal de formamida en la prehibridización y soluciones de hibridización, o mediante temperatura de hibridización, y son bien conocidas en la técnica. La hibridización puede darse bajo varias condiciones rigurosas.
En particular, la rigurosidad o exactitud puede aumentar reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formadita, o elevando la temperatura de hibridización. Por ejemplo, para propósitos de la presente invención, la hibridización bajo condiciones de alta rigurosidad ocurre en aproximadamente 50% formadida a aproximadamente 37ºC a 42ºC, y bajo condiciones de baja rigurosidad en aproximadamente 35% a 25% formadida a aproximadamente 30ºC a 35ºC. En particular, la hibridización ocurre en condiciones de elevada rigurosidad a 42ºC en 50% formadida, 5X SSPE, 0.3% SDS, y 200 \mug/ml ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado.
El rango de temperatura correspondiente a un nivel particular de rigurosidad puede limitarse además por medio de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, calculando la purina con el radio de pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura al respecto. Para retirar las señales no específicas, a continuación se pueden lavar las manchas, por ejemplo, a temperatura ambiente bajo condiciones rigurosas de hasta 0.1X SSC y 0.5% SDS. Variaciones en los rangos y condiciones mencionadas son bien conocidas en la técnica.
"Inmunogenicidad" se refiere a la habilidad para producir una respuesta inmune en un organismo. Un agente que demuestra la propiedad de inmunogenicidad es referido como inmunogénico. Los agentes pueden incluir, aunque sin limitar, una variedad de macromoléculas como, por ejemplo, proteínas, lipoproteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, bacterias y componentes bacterianos, y virus y componentes virales. Los agentes inmunogénicos tienen a menudo un peso molecular bastante alto (normalmente superior a 10 kDa).
"Infectividad" hace referencia a la habilidad para ser infeccioso o la habilidad para producir infección, en referencia a la invasión y multiplicación de microorganismos, como bacterias o virus en el cuerpo.
Los términos "inserción" o "adición" se refieren a un cambio en una secuencia de polipéptido o polinucleótido que da como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en comparación con la molécula que ocurre de manera natural.
El término "aislado" tal y como aquí se emplea, hace referencia a una molécula separada no sólo de proteínas, etc., que están presentes en la fuente natural de la proteína, sino también de otros componentes en general, y preferiblemente hace referencia a una molécula encontrada en la presencia de, si hay algo, únicamente un disolvente, búfer, ión, u otro componente normalmente presente en una solución de este tipo. Tal y como aquí se emplean, los términos "aislado" y "purificado" no engloban moléculas presentes en su fuente natural.
El término "micromatriz" se refiere a una disposición de ácidos nucleicos, aminoácidos, anticuerpos, etc., en un sustrato. El sustrato puede ser cualquier soporte adecuado, por ejemplo, gotas, cristal, papel, nitrocelulosa, nylon, o cualquier membrana apropiada, etc. Un sustrato puede ser cualquier soporte rígido o semi-rígido, incluyendo, pero sin limitar, membranas, filtros, láminas, pastillas, portaobjetos, fibras, gotas, incluyendo gotas magnéticas y no magnéticas, geles, tubos, placas, polímeros, micropartículas, capilares, etc. El sustrato puede proporcionar una superficie para cubrir y/o puede tener una variedad de formas superficiales, como pozos, anillas, zanjas, canales, y poros, e los cuales se colocan los ácidos nucleicos, aminoácidos, etc.
El término "microorganismo" puede incluir, aunque sin limitación, virus, bacterias, clamidia, rickettsia, micoplasmas, ureaplamas, hongos, y parásitos, incluyendo parásitos infecciosos como los protozoanos.
Los términos secuencias de "ácido nucleico" o de "polinucleótido" o "polinucleótidos" se refieren a oligonucleótidos, nucleótidos, o polinucleótidos, o fragmentos de los mismos, y a ADN o ARN de origen natural o sintético que puede ser de cadena sencilla o de cadena doble y pueden representar la cadena de sentido o antisentido, con el ácido nucleico péptido (PNA), o con material similar a ADN o ARN de origen natural o sintético. Los fragmentos de polinucleótido son cualquier porción de una secuencia de polinucleótido que retiene al menos una característica estructural o funcional del polinucleótido. En una realización de la presente invención, los fragmentos de polinucleótido son aquellos que codifican al menos una región (Gly-X-Y)_{n}. Los fragmentos de polinucleótido pueden tener longitudes variables, por ejemplo, más de 60 nucleótidos en longitud, al menos 100 nucleótidos en longitud, al menos 1000 nucleótidos en longitud, o al menos 10,000 nucleótidos en longitud.
La frase "similitud porcentual" (similitud %) hace referencia al porcentaje de similitud secuencial encontrada en una comparación de dos o más secuencias de polipéptido o polinucleótido. La similitud porcentual entre secuencias de aminoácido puede calcularse usando el método Clustal. (Ver, por ejemplo, Higgins, D. G. y P. M. Sharp (1988) Gene 73:237-244). El algoritmo Clustal agrupa secuencias en grupos examinando las distancias entre todas las parejas. Los grupos se alinean en parejas y posteriormente en grupos. La similitud porcentual entre dos secuencias de aminoácido, por ejemplo, secuencia A y secuencia B, se calcula dividiendo la longitud de la secuencia A, menos el número de residuos de separación en la secuencia A, menos el número de residuos de separación en la secuencia B, y sumando las coincidencias de residuos entre la secuencia a y secuencia B, y multiplicándolo por cien. Los espacios de poca o nula homología entre las dos secuencias de aminoácido no se incluyen en la determinación de similitud porcentual. La similitud porcentual puede calcularse mediante otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, variando las condiciones de hibridización, y puede calcularse electrónicamente usando programas tales como el programa MEGALIGN (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin).
Tal y como aquí se emplea, el término "planta" incluye una referencia a una o más plantas, es decir, cualquier organismo autotrófico eucariótico, como angiospermas y gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas, etc., incluyendo, pero sin limitar, soja, algodón, alfalfa, lino, tomate, azúcar, remolacha, girasol, tabaco, maíz, trigo, arroz, lechuga, plátano, mandioca, alazor, oleaginosa, colza, mostaza, canola, cáñamo, algas, alga parda, etc. El término "planta" también engloba una o más células de plantas. El término "células de plantas" incluye, pero sin limitar, tejidos vegetales y órganos tales como las semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejidos de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, tubérculos, bulbos, flores, frutos, piñas, microesporas, etc.
El término "enzima post-traslacional" se refiere a una enzima que cataliza una modificación post-traslacional de, por ejemplo, un colágeno o procolágeno. El término engloba, pero sin limitarse a, por ejemplo, prolil hidroxilasa, peptidil prolil isomerasa, colágeno galactosil hidroxililisil glucosil transferasa, hidroxilisil galactosil transferasa, C-proteinasa, N-proteinasa, lisil hidroxilasa, y lisil oxidasa.
Tal y como aquí se emplea, el término "promotor" generalmente se refiere a una región reguladora de secuencia de ácido nucleico capaz de iniciar, dirigir y mediar la trascripción de una secuencia de polinucleótido. Los promotores pueden comprenden adicionalmente secuencias de reconocimiento, como elementos ascendentes y descendentes del promotor, que pueden influir en la velocidad de la trascripción.
El término "promotor no-constitutivo" hace referencia promotores que provocan trascripción a través de un tejido específico, o sino bajo controles ambientales o de desarrollo, e incluye promotores contenibles e inducibles como el preferente de tejido, el específico del tejido, y los promotores específicos del tipo celular. Tales promotores incluyen, aunque no se limitan a, el promotor AdH1, que puede provocarse mediante hipoxia o tensión fría, el promotor Hsp70, que puede provocarse mediante tensión de calor, y el promotor PPDK, que puede provocarse mediante luz.
Los promotores que son "preferentes de tejido" son promotores que preferentemente inician la trascripción en ciertos tejidos. Los promotores que son "específicos de tejido" son promotores que inician la trascripción solamente en ciertos tejidos. Los promotores "específicos de tipo celular" son promotores que principalmente conducen la expresión en ciertos tipos de células en al menos un órgano, por ejemplo, células vasculares.
Los promotores "inducibles" o "contenibles" son aquellos bajo el control del medio ambiente, de tal modo que se efectúe la trascripción, por ejemplo, por una condición medioambiental como condiciones anaeróbicas, la presencia de luz, fuerzas bióticas, etc, o en respuesta de señales interna, químicas o biológicas, por ejemplo, glicerlaldehído fosfato dehidrogenasa, promotores AOX1 y AOX2 que se producen por la acción de metanol, o al daño físico.
Tal y como aquí se emplea, el término "promotores constitutivos" se refiere a promotores que inician, dirigen, o median la trascripción y son activos bajo concisiones ambientales y estados del desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, aunque no se limitan a, el virus del mosaico de la coliflor (CaMv) 35S, el promotor 1' o 2' derivado de T-ADN de Agrobacterivam turnefaciens, el promotor ubiquitina 1, el promotor Smas, el promotor cinamil alcohol dehidrogenasa, el promotor gliceraldehído dehidrogenasa, y el promotor Nos, etc.
El término "purificado" tal y como aquí se emplea denota que la molécula indicada está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas, por ejemplo, polinucleótidos, proteínas, y similares. El término preferentemente considera que la molécula de interés está presente en una solución o composición de al menos 80% por peso; preferentemente, al menos 85% por peso; más preferentemente, al menos 95% por peso; y, más preferentemente, al menos 99.8% por peso. Agua, búferes, y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente un kDa, pueden estar presentes.
El término "sustancialmente purificado", tal y como aquí se emplea, se refiere a secuencias de aminoácidos que se retiran de sus medio natural, se aíslan o separan, y son al menos 60% libres, preferiblemente 75% libres, y mas preferentemente 90% libres de otros componentes con los que se asocian de manera natural.
Una "sustitución" es el reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.
El término "transfección" tal y como aquí se emplea hace referencia al proceso de introducir un vector de expresión en una célula. En la técnica se conocen varias técnicas de transfección, por ejemplo, microinyección, lipofección, o el uso de una pistola de gen.
"Transformación", tal y como aquí se define, describe un proceso por el cual las secuencias exógenas de ácido nucleico, por ejemplo, ADN, entran y cambian una célula recipiente. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales usando varios métodos conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en cualquier método conocido para la inserción de secuencias exteriores de ácido nucleico en una célula procariótica o eucariótica. El método se selecciona en base al tipo de célula huésped que se está transformando y puede incluir, aunque no se limita a, infección viral, electroporación, descarga de calor, lipofección, y bombardeo de partículas. Tales células "transformadas" incluyen células establemente transformadas en las cuales el ADN insertado es capaz de reproducirse, ya sea reproduciendo plásmido de manera autónoma o como parte de un cromosoma huésped, y también incluye células que expresan de manera pasajera el ácido nucleico insertado durante periodos limitados de tiempo.
Tal y como aquí se emplea, el término "vacuna" se refiere a la preparación de microorganismos muertos o modificados, organismos vivos atenuados, u organismos vivos completamente virulentos, u otros agentes, incluyendo, aunque sin limitar, péptidos, proteínas, macromoléculas biológicas, o ácidos nucleicos, naturales, sintéticos, o semi-sintéticos, administrados para producir una mayor inmunidad artificial hacia una enfermedad en particular, con el fin de prevenir una futura infección con una entidad similar. Las vacunas pueden contener microorganismos o agentes vivos o inactivos, que incluyen virus y bacterias, así como subunidades, sintéticas, semi-sintéticas, o basadas en ADN recombinante.
Las vacunas pueden ser monovalentes (una vacuna para una única cepa/microorganismo/enfermedad) consistente en un microorganismo o agente (por ejemplo, vacuna para el virus de la polio) o los antígenos de un microorganismo o agente. Las vacunas también pueden ser multivalentes, por ejemplo, divalente, trivalente, etc. (una vacuna combinada), consistente en más de un microorganismo o agente (por ejemplo, la vacuna sarampión-paperas-rubéola (MMR) o los antígenos de más de un microorganismo o agente.
Las vacunas vivas se preparan a partir de microorganismos vivos. Las vacunas atenuadas son vacunas vivas preparadas a partir de microorganismos que han sufrido alteración física (como radiación o preparaciones con temperatura) o pasos en serie en huéspedes animales de laboratorio o cultivos infectados de tejido/célula, tales como los tratamientos que producen cepas no virulentas o de virulencia reducida, pero manteniendo la capacidad de provocar inmunidad protectora. Ejemplos de vacunas vivas atenuadas incluyen sarampión, paperas, rubéola y distémper canino. Las vacunas inactivadas son vacunas en las que se han destruido los componentes microbiales infecciosos, por ejemplo, mediante tratamiento químico o físico (como con formalina, beta-propiolactona, o radiación gamma), sin afectar la antigenicidad o inmunogenicidad de la capa viral o las proteínas de la membrana externa bacterial. Ejemplos de vacunas inactivadas o con subunidades incluyen la vacuna de la gripe, Hepatitis A, y poliomielitis (IPV).
Las vacunas de subunidades están compuestas por macromoléculas clave de, por ejemplo, agente viral, bacterial, u otro agente responsable de producir una respuesta inmune. Estos componentes pueden obtenerse en un número de modos, por ejemplo, a través de purificación de microorganismos, generación usando tecnología de ADN recombinante, etc. Las vacunas de subunidades pueden contener miméticos sintéticos de cualquier agente infectivo. Las vacunas de subunidades pueden incluir macromoléculas como toxinas de proteína bacteriales (por ejemplo, tétano, difteria), proteínas virales (por ejemplo, del virus de la gripe), polisacáridos de bacterias encapsuladas (por ejemplo, de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumonia), y partículas similares a los virus producidas mediante tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, antígenos superficial de Hepatitis B), etc.
Las vacunas sintéticas son las vacunas hechas de pequeños péptidos sintéticos que mimetizan los antígenos superficiales de patógenos y son inmunogénicos, o pueden ser vacunas fabricadas con la ayuda de técnicas de ADN recombinante, que incluyen virus completos cuyos ácidos nucleicos han sido modificados.
Las vacunas semi-sintéticas, o vacunas conjugadas, consisten en antígenos polisacáridos de microorganismos unidos a moléculas portadoras de proteínas.
Las vacunas ADN contienen vectores de ADN recombinante que codifican antígenos que, después de que la expresión del antígeno codificado en las células huésped ha ocupado el ADN, provocan respuestas inmunes humorales y celulares contra los antígenos codificados.
Se han desarrollado vacunas para una variedad de agentes infecciosos. La presente invención está dirigida a gelatinas recombinantes que pueden emplearse en formulaciones para vacunas con independencia del agente involucrados, y por lo tanto no se limitan a las vacunas aquí descritas de manera particular como modo de ejemplo. Las vacunas incluyen, aunque no se limitan a, vacunas para virus vaccinia (viruela), virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola, difteria, tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes), tos ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG, tubercuolosis), haemophilus influenzae, meningitis, rabia, cólera, virus de encefalitis japonesa, salmonella, shigella, hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre amarilla, fiebre aftosa, virus herpes simples, virus sincitial respiratorio, rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus herpes del pavo (Enfermedad de Marek), gripe, y ántrax. El término vacuna, tal y como aquí se emplea, se refiere a vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes y cánceres que han sido desarrollados o se desarrollarán, por ejemplo, vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes y cánceres, por ejemplo, vacunas para VIH, HCV, malaria, y vacunas para cáncer de pecho, pulmón, colon, riñón o vejiga y de ovarios.
Un polipéptido o variante de aminoácido es una secuencia de aminoácido que se altera por uno o más aminoácidos desde una secuencia particular de aminoácido. Una variante de polipéptido puede tener cambios conservadores, donde un aminoácido sustituto tiene propiedades estructurales o químicas similares al del aminoácido sustituido, por ejemplo, sustitución de leucina por isoleucina. Una variante también puede tener cambios no conservadores, en los cuales el aminoácido sustituto tiene propiedades físicas diferentes a las del aminoácido sustituido, por ejemplo, sustitución de una glicina por un triptófano. Las variaciones menores análogas pueden también incluir eliminaciones o adiciones de aminoácidos, o ambas. Preferentemente, las variantes de aminoácido retienen ciertas características estructurales o funcionales de un polipéptido en particular. La guía para determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse, o eliminarse puede encontrarse, por ejemplo, usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica, como software LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI).
Una variante de polinucleótido es una variante de una secuencia de polinucleótido particular que preferentemente tiene aproximadamente 80%, más preferentemente al menos aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95% similitud de secuencia de polinucleótido con la particular secuencia de polinucleótido. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias variantes de polinucleótido codificadoras de una proteína particular, algunas manteniendo una mínima homología con las secuencias de polinucleótido de cualquier gen conocido y que ocurra de manera natural. Por lo tanto, la invención contempla cada una de las posibles variaciones de secuencia de polinucleótido que podría realizarse seleccionando combinaciones basadas en posibles opciones de codón. Estas combinaciones se realizan de acuerdo con el código genético estándar del codón de trillizos, y se considerarán todas las variaciones por describirse de manera específica.
Invención
La presente invención muestra gelatinas recombinantes y métodos para producir estas gelatinas. La gelatina recombinante de la presente invención consiste en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas. Las gelatinas recombinantes de la presente invención proporcionan una actuación reproducible y mejorada, y responde a varios intereses relacionados con la salud y con otras materias. Usando el presente método, la gelatina puede fabricarse directamente, en lugar de extraerse de fuentes animales por medio de procesos largos y duros. La gelatina recombinante de la presente invención no tiene patógenos, por ejemplo, bacterias patogénicas, encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), etc. Los presentes métodos minimizan la variabilidad y permiten un grado de reproducibilidad inalcanzable en métodos actuales de extracción.
Los asuntos de seguridad, como la preocupación sobre la inmunogenicidad potencial, por ejemplo, las respuestas antigénicas y alergénicas, han surgido con respecto al uso de productos derivados de animales. La inhabilidad para caracterizar, purificar, o reproducir completamente mezclas con gelatina procedentes de fuentes animales empleadas actualmente es una preocupación que continúa en las comunidades farmacéuticas y médicas. Existen intereses adicionales en relación a la seguridad con respecto a la contaminación bacteriana y las cantidades de endotoxina que resultan de los procesos de extracción y purificación.
Las gelatinas recombinantes de la presente invención se dirigen a estos intereses o preocupaciones ya que se encuentran virtualmente libres de contaminación o endotoxinas. Además, las gelatinas humanas recombinantes de la presente invención ofrecerán diferentes ventajas sobre sus homólogas derivadas de animales actualmente en uso, ya que el uso de gelatinas derivadas de secuencia nativa humana puede eliminar el riesgo de respuesta inmune debido al uso de proteínas no humanas, derivadas de animales.
Además, las presentes gelatinas pueden producirse como varios y diferentes materiales, con características optimizadas para aplicaciones particulares. Los productos resultantes son internamente más consistentes y uniformes que las gelatinas actualmente disponibles procedentes de fuentes animales.
La gelatina recombinante de la presente invención puede producirse usando secuencias procedentes de varias especies incluyendo, pero sin limitar, especie humana, bovina, porcina, equina, y peces. La gelatina de la presente invención ha incrementado su pureza en comparación con los productos de gelatina de métodos actuales de fabricación, y ha reducido la cantidad de proteína y reducido los niveles de endotoxinas y otros contaminantes, incluyendo ácidos nucleicos, polisacáridos, priones, etc. Por lo tanto, la presente gelatina es más segura de usar que la gelatina fabricada por medio de métodos actuales, y puede administrarse o ingerirse por humanos y animales en una dosis más elevada mientras los riesgos de efectos secundarios negativos se minimizan.
Las gelatinas de la presente invención han incrementado su actividad y funcionabilidad en comparación con las gelatinas comerciales, ya que la presente gelatina puede producirse directamente con características optimizadas para usos específicos, mejorando su habilidad para usa y formular la gelatina. Mientras las gelatinas actualmente extraídas de fuentes animales son productos heterogéneos con una amplia variedad de pesos moleculares en un lote o muestra dada, las gelatinas de la presente invención incluyen productos consistentes, homogéneos y reproducibles.
Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden producirse por medio de una variedad de métodos. En un método, la gelatina recombinante se produce directamente a partir de la expresión de construcciones alteradas de colágeno, es decir, construcciones que contienen un polinucleótido que codifica al menos un dominio de colágeno, pero que no codifica el colágeno que ocurre de manera natural (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1, 4, y 6). En otro aspecto, la gelatina recombinante se deriva de polipéptidos que no son colágeno o procolágeno de longitud completa que ocurre de manera natural, pero que contiene al menos un dominio de colágeno. (Ver, por ejemplo, SEQ ID Nos: 15 hasta 25, 30, 31, y 33). Las gelatinas recombinantes también pueden estar formadas por secuencias que contienen polipéptidos adicionales de N-terminal y C-terminal. (Ver, por ejemplo, SEQ ID Nos: 26 hasta 29).
Las moléculas de colágeno generalmente son el resultado del ensamblaje trimérico de cadenas de polipéptido que contienen repeticiones (Gly-X-Y-)_{n} que permiten la formación de dominios triples helicoidales bajo condiciones biológicas normales. (Ver, por ejemplo, van der Rest et al., (1991), FASEB J. 5:2814-2813). En el presente, se han identificado aproximadamente veinte tipos distintos de colágeno en vertebrados, incluyendo colágenos bovinos, ovinos, porcinos, de pollos y humanos. Una descripción detallada de funciones estructurales y biológicas de los diferentes tipos de colágenos que se dan de manera natural puede encontrarse, por ejemplo, en Ayad et al., The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R. E. y Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution", Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, C. M., et al. (1993) "The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matriz", en Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics And Medical Aspects, Royce, P. M. y Steinmann, B. Eds. Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; y Prockop y Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular biology, diseases, y potentials for therapy". Annu Rev Biochem 64:403-434.
El colágeno tipo I es el principal colágeno fibrilar de hueso o piel, que contiene aproximadamente 80-90% del colágeno total del organismo. El colágeno tipo I es la principal macromoléculas estructural presente en la matriz extracelular de organismos multicelulares y constituye aproximadamente el 20% de la masa proteica total. El colágeno tipo I es una molécula heterotrimérica que comprende dos cadenas \alpha1(I) y una cadena \alpha2(I), que están codificadas por los genes COL1A1 y COL1A2, respectivamente. Otros tipos de colágenos son menos abundantes que el tipo I y muestran diferentes patrones de distribución. Por ejemplo, el colágeno tipo II es el colágeno predominantes en el cartílago y humor vítreo, mientras que el colágeno tipo III se encuentra en elevados niveles en los vasos sanguíneos y, en menor grado, en la piel.
El colágeno tipo III es el principal colágeno fibrilar encontrado en la piel y en tejidos vasculares. El colágeno tipo III es un colágeno homotrimérico que contiene tres cadenas idénticas de \alpha1(III) codificadas por el gen COL3A1. Los métodos para purificar varios colágenos de tejidos pueden encontrarse, por ejemplo, en Byers et al. (1974) Biochemistry 13:5243-5248; y Miller y Rhodes (1982) Methods in Enzymology 82:33-64.
Las enzimas post-traslacionales son importantes en la biosíntesis de procolágenos y colágenos. Por ejemplo, prolil-4-hidroxilasa es una enzima post-traslacional necesaria para la síntesis de procolágeno o colágeno mediante células. Esta enzima hidroxila residuos prolil en la posición Y- de secuencias repetitivas Gly-X-Y con 4-hidroxiprolina (Ver, por ejemplo, Prockop et al. (1984) N. Engl. J. Med. 311:376-386). A menos que se hidroxilen un número apropiado de residuos prolil en posición Y- con 4-hidroxiprolina mediante 4-hidroxilasa, las cadenas recién sintetizadas no pueden mantener una conformación estable con tres hélices. Además, si no tiene lugar hidroxilación o sub-hidroxilación, los polipéptidos no se segregan apropiadamente y pueden degenerarse.
El prolil-4-hidroxilasa vertebrado es un tetrámero \alpha_{2}\beta_{2}. (Ver, por ejemplo Berg y Prockop (1973) J. Biol. Chem. 248:1175-1192; y Tuderman et al. (1975) Eur. J. Biochem. 52:9-16). Las subunidades a contiene los puntos catalíticos incluidos en la hidroxilación de los residuos prolil, pero son insolubles en ausencia de subunidades \beta. Las subunidades \beta, proteína disulfuro isomerasa, catalizan los intercambios tiol/disulfuro, provocando la formación de enlaces de disulfuro esenciales para establecer una proteína estable. Las subunidades \beta retienen el 50% de la actividad de la proteína disulfuro isomerasa cuando parten del tetrámero prolil-4-hidroxilasa. (Ver, por ejemplo, Pihlajaniemi et al. (1987) Embo J. 6:643-649; Parkkonen et al. (1988) Biochem. J. 256:1005-1011; y Koivu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262-6447-6449.).
Se ha producido cualquier prolil 4-hidroxilasa humana recombinante activa en, por ejemplo, células de insectos Sf9 y en células de levadura, expresando simultáneamente las subunidades \alpha y (Ver, p.ej., Vuori et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-7467-7470; Patente U,S. No. 5,593,859). Además de prolil 4-hidroxilasa, se han identificado otras enzimas de colágeno post-traslacionales y se han introducido en la bibliografía, incluyendo C-proteinasa, N-proteinasa, Iisil oxidasa, lisil hidroxilasa, etc. (Ver, por ejemplo, Olsen et al. (1991) Cell Biology of Extracellular Matriz, 2ª ed., Hay editor, Plenum Press, New York).
La presente invención particularmente contempla el uso de un compuesto, biológico o químico, que confiere hidroxilación, por ejemplo, hidroxilación de prolina y/o hidroxilación de lisil, etc., como se desee, a las presentes gelatinas recombinantes. Esto incluye, por ejemplo, prolil-4-hidroxilasa de cualquier especie, suministrada endógenamente o exógenamente, incluyendo varias isoformas de prolil 4-hidroxilasa y variantes o fragmentos de subunidades de prolil 4-hidroxilasa que poseen la actividad deseada, ya sean nativas, sintéticas, o semi-sintéticas, y otras hidroxilasas como prolil 3-hidroxilasa, etc. (Ver, por ejemplo, Patente U.S Nº 5,928,922, aquí incorporada como referencia en su totalidad). En una realización, la actividad de prolil hidroxilasa se confiere por una prolil hidroxilasa derivada de la misma especie que el polinucleótido que codifica la gelatina recombinante o que codifica un polipéptido desde el que la gelatina recombinante se deriva. En una realización adicional, prolil 4-hidroxilasa es humana y el polinucleótido codificador se deriva de una secuencia humana.
La presente invención proporciona métodos para manipular la termoplasticidad de gelatina con el fin de producir un material con las características físicas deseadas. En un método, los polinucleótidos codificadores se expresan en un sistema huésped que tiene prolil hidroxilasa endógena o hidroxilasas alteradas, como ciertas células de mamíferos e insectos, o animales transgénicos o plantas o células de plantas. En dicho sistema, la presente invención proporciona métodos para producir una mezcla de gelatinas recombinantes que tienen un rango de porcentajes de hidroxilación, es decir, partes no hidroxiladas, parcialmente hidroxiladas, y completamente hidroxiladas. Por ejemplo, en un método para producir gelatinas recombinantes con porcentajes variados de hidroxilación, la hidroxilación se confiere por medio de prolil hidroxilasa endógena en, por ejemplo, una animal transgénico, y la distribución de rangos porcentuales de hidroxilación desde no hidroxilado hasta completamente hidroxilado, y las temperaturas de fusión del material producido oscilan entre 28ºC y 36ºC, con un valor medio T_{m} de aproximadamente 30ºC a 32ºC. Si se desea, las diferentes fracciones del material pueden aislarse junto con un gradiente de temperatura, ya que puede ser necesario si los usos descendentes requieren, por ejemplo, materiales más hidroxilados, como aquellos suficientemente hidroxilados como para retener una estructura triple-helicoidal en, por ejemplo, la temperatura corporal (37ºC).
En otra realización, las gelatinas recombinantes se producen en un sistema, por ejemplo, un animal transgénico, en el cual la hidroxilación se complementa con prolil hidroxilasa exógena. En un aspecto, dicho método para producir gelatinas recombinantes proporciona gelatinas recombinantes que están comprendidas entre no hidroxiladas y completamente hidroxiladas. La fracción de gelatinas recombinantes más hidroxiladas será sustancialmente más grande en material recombinante producido en la presencia de prolil hidroxilasa exógena que en material recombinante producido solamente en presencia de prolil hidroxilasa endógena. Por lo tanto, las temperaturas de fusión del material producido pueden oscilar desde, por ejemplo, 28ºC a 40ºC, teniendo un valor medio T_{m} de aproximadamente 34ºC a 36ºC. Dicha mezcla de gelatina podría ser apropiada para uso en una variedad de aplicaciones, como la fabricación de cápsulas de gel, sin la necesidad de fraccionar o separar porciones hidroxiladas de manera diferente.
Los métodos arriba citados proporcionados para la producción de materiales recombinantes con una variedad de temperaturas de fusión, que pueden dividirse fácilmente, por ejemplo, empleando un gradiente de temperatura para separar los materiales sólidos a una temperatura particular, por ejemplo, 36ºC, de aquellos líquidos a una temperatura particular. Además, la presente invención proporciona métodos de bajo coste para producir un material que, sin separación, es adecuado para uso en aplicaciones al por mayor. Por ejemplo, la fabricación de cápsulas de gel podría implicar el uso de gelatina recombínate producida a través de los métodos citados, donde el material recombinante, teniendo un rango de temperaturas de fusión, tiene una temperatura deseable de fusión de aproximadamente 33ºC, fundiéndose dicha gelatina a temperatura corporal, y siendo por lo tanto adecuada para su consumo y digestión. En el presente método, la gelatina recombinante puede producirse directamente en el sistema deseado, por ejemplo, un animal transgénico, o puede derivarse, por ejemplo, a través de hidrólisis, por ejemplo, ácida, termal, o enzimática, de colágenos recombinantes producidos en el sistema deseado.
En un aspecto, la gelatina de la presente invención comprende triple hélices desnaturalizadas, y consiste al menos en una subunidad de colágeno, cadena de colágeno, o fragmento de la misma. Las unidades Gly-X-Y en una cadena de colágeno particular, subunidad, o fragmento de la misma pueden ser las mismas o diferentes. Preferiblemente, X e Y son bien prolina o hidroxiprolina, y la glicina aparece en aproximadamente cada tercera posición en el residuo de la cadena componente. Los aminoácidos de X e Y son prolina o hidroxiprolina, y cada unidad Gly-X-Y es la misma o diferente. En otra realización, la gelatina recombinante está formada por una secuencia de aminoácido de (Gly-X-Y)_{n},
donde X e Y son cualquier aminoácido.
Los métodos presentes para producir gelatina recombinante tiene un número de ventajas sobre métodos tradicionales de extracción de gelatina. De manera más relevante, los métodos presentes proporcionan una fuente fiable sin tejido de gelatina que contiene secuencia de colágeno nativo. Además, los métodos actuales de extracción no tienen en cuenta ninguna fuente natural de gelatina humana, de modo que puede resultar ventajoso para uso en varias aplicaciones médicas. Concretamente, la presente invención proporciona gelatinas recombinantes derivadas de secuencias humanas, composiciones que contienen gelatinas humanas recombinantes, y métodos para producir estas gelatinas. La gelatina recombinante humana es no imunogénica cuando se aplica en procesos farmacéuticos y médicos, y también se consideran varios usos de los mismos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona la producción de la gelatina presente a partir de construcciones fabricadas capaces de expresar gelatina de varias formas. Esta invención particularmente considera métodos para producir gelatina usando prolil hidroxilasa recombinante y varias construcciones sintéticas, incluyendo construcciones de colágeno no nativo. Además, la presente invención proporciona gelatinas recombinantes que pueden diseñarse para poseer las características específicas necesarias para una aplicación particular. También se consideran los métodos para producir estas gelatinas. Usando los métodos actuales, se puede producir una gelatina con la deseada fuerza de gel, viscosidad, características de fusión, perfil isoeléctrico, pH, grado de hidroxilación, composición de aminoácido, olor, color, etc. En un método de acuerdo con la presente invención, se produce gelatina no-hidrolizada, y si se desea, se puede producir completamente o parcialmente hidrolizada.
Propiedades de la Gelatina
Las diferentes propiedades físicas de la gelatina definen su utilidad en aplicaciones particulares. La gelatina proporciona una única actuación en base a, por ejemplo, su naturaleza anfotérica, su habilidad para formar geles termo-reversibles, sus propiedades activas superficiales y coloidales protectoras, y su contribución a la viscosidad y estabilidad. En un número de aplicaciones, la gelatina se emplea, por ejemplo, como un emulsionante, espesante, o estabilizador; como un agente para la formación de una capa o cubierta; como un agente de enlace; como un adhesivo o pegamento; o como un agente floculante.
Las materias primas, los tipos de pre-tratamiento y los procesos de extracción llevan a cabo la composición de polipéptidos de gelatina obtenidos durante la fabricación convencional. Por lo tanto, los productos animales actualmente disponibles son mezclas heterogéneas de proteínas desde unos pocos a varios cientos kDa. La distribución del peso molecular de gelatina en un conjunto en particular puede ser crítica, ya que la distribución del peso puede influir en, por ejemplo, la viscosidad y/o fuerza de gel de una muestra de gelatina.
En general, la viscosidad de una solución de gelatina aumenta con el aumento de la concentración y con el descenso de la temperatura. Se preferiría una solución con mayor viscosidad, por ejemplo, para gelatina empleada como un estabilizador o espesante. En algunas aplicaciones, las gelatinas líquidas son preferentes, como en varios fluidos emulsionantes, etc. La viscosidad de una solución de gelatina aumenta con el aumento del peso molecular de los componentes de la gelatina. Una solución de elevada viscosidad podría consistir, por ejemplo, en una elevada concentración de gelatinas de bajo peso molecular, o de una concentración más baja de gelatinas de alta peso molecular. La viscosidad también afecta a las propiedades del gel incluyendo el punto de posición y fusión. Las soluciones de gelatina de elevada viscosidad proporcionan geles con índice más elevados de posición y fusión que las soluciones de gelatina con baja viscosidad.
La termoreversibilidad y termoplasticidad de la gelatina son propiedades explotadas en un número de aplicaciones, por ejemplo, para la fabricación de cápsulas o pastillas de gel. La gelatina puede calentarse, moldearse o dar la forma apropiada, y enfriarse para formar una cápsula o una cubierta para pastilla que tenga propiedades únicas a temperaturas homeostáticas. La gelatina comenzará a fundirse con la temperatura de la boca, se ingerirá de manera sencilla y se transformará en líquido a temperatura corporal.
Las gelatinas de varias fuerzas de gel son adecuadas par uso en diferentes aplicaciones. La firmeza o fuerza del gel normalmente se mide calculando el valor Bloom, que puede determinarse usando estándares y metodologías internacionales. En resumen, la fuerza Bloom es la medida de la fuerza de un gel formado por una solución 6.67% de gelatina en un baño a temperatura constante durante 18 horas. Se emplea un Analizador de Textura estándar para medir el peso en gramos requerido para reducir un émbolo estándar de AOAC (Asociación de Químicos Agrícolas Oficiales) de 4 milímetros en un gel. Si el peso en gramos requerido para el descenso del émbolo es 200 gramos, la gelatina en particular tiene un valor Bloom de 200. (Ver, por ejemplo, Farmacopea de Estados Unidos y Métodos Oficiales de Análisis de AOAC Internacional, 17ª edición, Volumen II).
Las gelatinas comerciales pueden por lo tanto clasificarse y venderse en fuerza Bloom. Los diferentes rangos de valores Bloom son apropiados para diferentes usos de gelatinas; por ejemplo, gelatinas para uso en varias aplicaciones industriales, por ejemplo, estabilización concreta, vaciado de arena, moldes, pegamentos, revestimientos, etc., se seleccionarán a partir de una amplia variedad de diferentes fuerza Bloom, dependiendo de las características de acción deseadas. Las gelatinas con varias fuerzas Bloom también se desean en la fabricación de varios productos farmacéuticos. Por ejemplo, cápsulas blandas de gel normalmente se fabrican usando oseína o gelatina de piel con un valor Bloom de aproximadamente 150 a 175 y/o gelatina derivada de ganado porcino con un valor Bloom de aproximadamente 190 a 210, o mezclas de los mismos, mientras que las cápsulas durad de gel podrían usar una gelatina con un valor Bloom de aproximadamente 220 a 260. En aplicaciones para comidas, la gelatina empleada, por ejemplo, como espesante en malvaviscos u otros productos de confitería podrían tener un valor Bloom de aproximadamente 250. Varias aplicaciones, incluyendo ciertos fluidos emulsionantes en aplicaciones fotográficas, y varios revestimientos industriales, implican el uso de gelatinas que no se han convertido en gel.
La presente invención proporciona la producción de gelatinas recombinantes con diferentes fuerzas Bloom. En un aspecto, la presente invención proporciona, por ejemplo, la fabricación de gelatinas con fuerzas Bloom de aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, y 300. En una realización, la presente invención proporciona la producción de una gelatina recombinante que tiene una fuerza Bloom de aproximadamente 400. Dicha gelatina puede usarse, por ejemplo, en la fabricación de cápsulas de gel, y puede considerar la fabricación de una cápsula más ligera y más fina, ya que se necesitaría emplear menos material para proporcionar un gel con suficiente fuerza. También se consideran las gelatinas recombinantes con fuerzas Bloom de menos de 100, y desde 0 a 100, ambos incluidos.
La presente invención proporciona métodos para diseñar gelatinas recombinantes con las propiedades físicas deseadas para aplicaciones particulares. La presente invención hace que el uso de gelatinas recombinantes consista en polipéptidos de peso molecular uniforme. Dichos materiales homogéneos y uniformes son ventajosos por el hecho de que facilitan una fuente fiable de producto con actuación predecible, minimizando la variabilidad en la actuación del producto y en los parámetros de fabricación. En la actualidad, gelatina de diferentes grupos pueden mezclarse en ocasiones para producir una mezcla con las características físicas deseadas, como viscosidad o fuerzas de gel, etc., proporcionadas por un peso molecular en particular o una variedad de pesos moleculares.
La presente invención hace uso de gelatinas recombinantes de peso molecular uniforme, eliminando la variabilidad y impredictibilidad, y permite afinar los procesos y predecir el comportamiento. Los presentes métodos permiten la producción de gelatinas recombinantes de cualquier peso molecular deseado. Por ejemplo, en una realización, la gelatina recombinante tiene un peso molecular superior a 300 kDa.
En otro aspecto, podría producirse gelatina recombinante con un peso molecular similar al de algunas gelatinas disponibles en el mercado, de desde 10 a 70 kDa.
En una realización particular, se administra una gelatina recombinante con una longitud de cadena que confiere propiedades específicas apropiadas para la aplicación que se pretende. En varias realizaciones de la presente invención, las gelatinas recombinantes con pesos moleculares uniformes de aproximadamente 1 kDa, 5 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 22 kDa, 23 kDa, y 24 kDa son consideradas (Ver, por ejemplo, Tabla 2).
En particular, en un método de la presente invención, se produce gelatina a partir de secuencias acortadas de colágeno, por ejemplo, las secuencias identificadas en la Tabla 2. Estas secuencias representan dominios específicos de colágeno y codifican formas cortad de gelatina.
Las presentes gelatinas son capaces de retener características físicas valiosas de la gelatina, por ejemplo, habilidades para formar capas, mientras poseen pesos moleculares medios inferiores o superiores a aquellas gelatinas convencionales derivadas de animales. Se pueden realizan varias modificaciones de secuencias de colágeno, incluyendo, por ejemplo, desnaturalización del colágeno, cadena de colágeno, subunidad o fragmentos de los mismos, o variar los grados de hidroxilación, lo que producirá gelatina con propiedades físicas específicas, es decir, mayor o menos punto de fusión en comparación con la gelatina convencional, diferentes composiciones de aminoácido, pesos moleculares específicos o rangos de pesos moleculares, etc., y aquí se consideran de manera particular estas
variaciones.
El peso molecular de una molécula de colágeno formadora de fibril, como el colágeno de tipo I, es 300 kDa. En algunas aplicaciones, como aquellas en las que se emplean gelatinas de elevado peso molecular, podría ser deseable producir una gelatina con mayor peso molecular que el de la gelatina extraída actual. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, puede producirse gelatina que contiene moléculas más grandes que el colágeno del que se extrae en la actualidad la gelatina convencional. El producto de gelatina resultante con mayor peso molecular puede emplearse directamente en varias aplicaciones en las cuales se deseen sus propiedades físicas, o puede dividirse y tratarse posteriormente para producir moléculas de tamaños más pequeños.
En una realización, la gelatina puede producirse usando colágenos más grandes que aquellos disponibles en las fuentes animales convencionales. Por ejemplo, los presentes métodos de producción podrían adaptarse para producir colágenos de cutículas solubles en ácido derivados de paredes corporales de gusano de tubo de clase vestimentifera Riftia pachyptila (peso molecular \sim 2600 kDa) y anélidos Alvinella pompejana (peso molecular \sim 1700 kDa). Estos colágenos podrían adaptarse para los presentes métodos de producción para producir moléculas más grandes que aquellas de las cuales se extrae la gelatina actualmente disponible, y el producto resultante podría tratarse para producir las gelatinas deseadas.
En particular, se considera que las gelatinas de varios pesos moleculares pueden producirse por medio de una variedad de métodos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las características de la presente gelatina recombinante, por ejemplo, hidroxilación porcentual, grados de aglutinamiento, etc., pueden variar para producir gelatinas recombinantes con los deseados pesos moleculares. En un aspecto, por ejemplo, la presente invención proporciona un método para producir gelatinas recombinantes de mayor peso molecular mediante agentes aglutinantes conocidos en la técnica para aglutinar polipéptidos de gelatina (Ver documento, infra.).
En otro aspecto de la presente invención, los polipéptidos desde los que las gelatinas podrían derivarse se expresan a partir de construcciones realizadas que contienen múltiples copias de todos los fragmentos de secuencia nativa de colágeno. Por ejemplo, en una realización, la presente invención proporciona una construcción de colágeno alterado que comprende copias del dominio de colágeno del tipo I. En otra realización, la construcción comprende copias de dominios de colágeno del tipo III. En una realización adicional, la construcción comprende copias de dominios de colágeno del tipo I y tipo III. La presente invención proporciona el uso de copias sencilla o múltiples de todas las secuencias, o de partes de ellas, codificadoras de cualquier colágeno, incluyendo los colágenos del tipo I hasta el tipo XX, ambos incluidos. Particularmente, se considera que los presentes métodos permiten la producción de gelatinas derivadas de más de un tipo de colágeno. En una realización, las gelatinas recombinantes derivadas de más de un tipo de colágeno se co-expresan en un sistema de expresión, por ejemplo, una célula huésped, animal transgénico, etc., de modo que se produzca una mezcla de gelatinas.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir gelatina sin la derivación de la fase de colágeno o procolágeno triple helicoidal. En un aspecto, esto implica la producción de gelatina recombinante mediante expresión de varias construcciones en un sistema de expresión a elevada temperatura, como aquel basado en organismos termofílicos, que no permite la formación de estructuras triples helicoidales, pero permite la actividad de prolil hidroxilasa. La presente gelatina también podría derivarse de construcciones de colágeno que contienen mutaciones, adiciones, o eliminaciones que evitan la formación triple helicoidal. En otro aspecto, esto implica la producción de gelatina a partir de construcciones acortadas que no permiten la formación de hélices triples a temperaturas regulares, es decir, 37ºC. De manera alternativa, la gelatina puede producirse en presencia de inhibidores de formación de triple hélice, por ejemplo, polianiones, que se expresan junto con las construcciones biosintéticas de colágeno. De manera adicional, la gelatina biosintética de la presente invención podría derivarse de cadenas de colágeno producidas de manera recombinante que no forman hélices triples.
La presente invención comprende gelatinas completamente hidroxiladas, parcialmente hidroxiladas, y no hidroxiladas. En otra realización, le método de la presente invención consiste en la producción de una gelatina o un precursor de gelatina que tiene un grado específico de hidroxilación. En un aspecto adicional, la invención hace referencia a un método para producir gelatina que tiene un porcentaje de hidroxilación que oscila entre 20 y 80, preferentemente un porcentaje de hidroxilación entre 30 y 60, y, más preferentemente, un porcentaje de hidroxilación de aproximadamente 40. (Ver Ejemplos 4 y 5). Las gelatinas recombinantes parcialmente hidroxiladas de la presente invención pueden obtenerse mezclando porcentajes específicos de gelatinas recombinantes con diferentes grados de hidroxilación, o pueden obtenerse directamente. (Ver Ejemplos 4 y 5). Además, la invención facilita métodos para lograr hidroxilación parcial de gelatinas recombinantes administrando propil hidroxilasa a gelatinas recombinantes no hidroxiladas in vitro, y controlando la extensión de la reacción.
Existen límites en el alcance en el que las características termales de gelatinas de fuente animal actualmente disponibles pueden alterarse. Particularmente, la presente invención proporciona método para producir gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante tiene las características termales específicas deseadas para una aplicación en particular. Empleando los métodos de la presente invención, por ejemplo, el punto de fusión y/o fuerza de gel, la gelatina recombinante puede manipularse de varias formas. La estabilidad de la temperatura y/o fuerza de gel de la gelatina recombinante puede medirse mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.
Generalmente, el punto de fusión de la gelatina aumenta cuando el grado de hidroxilación aumenta. Usando los métodos de la presente invención, es posible producir gelatinas de elevado peso molecular que, debido a la manipulación de hidroxilación y/o aglutinamiento, etc., tienen una menor fuerza de gel y/o punto de fusión más bajo que el de las gelatinas actualmente disponibles procedentes de fuentes animales. Por lo tanto, la presente invención proporciona una gelatina recombinante con propiedades inalcanzables en varios productos comerciales, adecuadas para uso en aplicaciones donde se desea una gelatina con peso molecular más elevado, con el fin de proporcionar una mayor fuerza de capa, etc., pero se desea un producto de baja fuerza de gel o sin gel. En una realización, la presente invención proporciona gelatina recombinante que tiene estabilidad a temperatura más baja debido a la hidroxilación incompleta de los residuos de prolina.
Dicha gelatina recombinante podría ser útil en una variedad de aplicaciones. En la gelatina producida mediante métodos actuales de extracción, solamente la gelatina del pescado proporciona una proteína formadora de capa de elevado peso medio molecular que no se hace gel. Las características basadas en la no gelificación y la solubilidad en agua fría ofrecidas por la gelatina de pescado sin gelificación pueden ajustarse por las gelatinas hidrolizadas bovinas y porcinas actualmente disponibles, peor con la correspondiente pérdida de fuerza de capa y flexibilidad, ya que las gelatinas hidrolizadas tienen menor peso medio molecular. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una gelatina recombinante parcialmente hidroxilada con menor fuerza de gel y mayor peso molecular que el provisto por las materias procedentes de fuentes animales actualmente disponibles.
Una gelatina con elevado peso molecular y baja fuerza de gel también puede resultar útil en aplicaciones farmacéuticas, en las que se desea estabilidad, pero también la propiedad de baja gelificación o de falta de gelificación, con el fin de mantener la maleabilidad e integridad del producto farmacéutico. Dicha gelatina recombinante podría usarse, por ejemplo, como un extensor de plasma, ya que su peso molecular proporcionaría estabilidad, aumentando el tiempo de residencia en circulación, y el punto de posición alterado evitaría que el material se transformase en gel a temperatura ambiente, permitiendo que el extensor se pueda administrar sin calentamiento. En una realización, la presente invención proporciona una gelatina parcialmente hidroxilada adecuada para uso en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, como un extensor de plasma.
En otro aspecto, la gelatina recombinante parcialmente hidroxilada se obtiene a través de expresión de gelatina recombinante, o expresión de polipéptidos desde los que la presente gelatina recombinante se deriva, en ausencia de prolil hidroxilasa, por ejemplo, en un sistema de expresión de un insecto sin prolil hidroxilasa (Ver, por ejemplo, Myllyharju et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 21824-21830). La hidroxilación puede ocurrir en el momento de la producción o puede imponerse a continuación por medio de, por ejemplo, modificación biológica o química in vitro. En un método de la presente invención, las gelatinas recombinantes se derivan de colágeno parcialmente hidroxilado o completamente hidroxilado.
Las gelatinas derivadas de fuentes naturales por medio de métodos actualmente disponibles se refuerzan en gran medida por la existencia de aglutinantes covalentes entre los residuos de lisina de las moléculas de colágeno constituyente. El aglutinamiento ocurre de manera natural en el espacio extracelular tras la secreción de colágeno y formación fibril, y antes de la secreción, ciertos residuos se hidroxilan por la enzima de lisil hidroxilasa. A continuación, la enzima extracelular lisil hidroxilasa determina ciertos residuos de lisina e hidroxilisina en las moléculas de colágeno, produciendo grupos de aldehído elevadamente reactivos que reaccionan de manera espontánea par formar enlaces covalentes. Los colágenos aglutinantes resultantes producen gelatinas de elevada fuerza de gel y elevada viscosidad. Específicamente, un grado más alto de aglutinamiento da como resultado gelatinas con temperaturas de fusión más elevadas y una mayor fuerza de gel.
En un aspecto, la presente invención proporciona gelatinas recombinantes que están aglutinadas, dando como resultado gelatinas de mayor peso molecular (Ver Ejemplo 7). El aglutinamiento puede imponerse por medio de diferentes métodos, como por medio de modificación biológica o química. Por ejemplo, en una realización, la gelatina recombinante o un polipéptido del cual se deriva la gelatina se expresa en presencia de lisil hidroxilasa y lisil oxidasa. En otra realización, el polipéptido se modifica mediante aglutinamiento tras la expresión. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la imposición del aglutinamiento por medio de medios químicos, tales como aglutinantes químicos reactivos, por ejemplo, 1-etil-3-(dimetilaminopropil) carbodiimida hidrocloruro (EDC) (Ver Ejemplo 7). Otros agentes aglutinantes químicos, como bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS3), 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidil) propionato (DTSSP), y Tris- sulfosuccinimidil aminotriacetato (Sulfo-TSAT) también pueden usarse, como lo pueden hacer otros agentes conocidos en la técnica. De manera adicional, la presente invención proporciona métodos para producir gelatinas recombinantes con varios grados de aglutinamiento, útiles para obtener gelatinas recombinantes con los deseados puntos de fusión, fuerza de gel y viscosidad.
La presente invención proporciona métodos para manipular el peso molecular, el nivel de hidroxilación, y el grado de aglutinamiento de las gelatinas recombinantes para permitir la creación de gelatinas recombinantes de diferentes y específicas fuerzas Bloom, así como gelatinas recombinantes de diferentes y específicos niveles de viscosidad.
La hidroxilación de prolina juega un papel central en la formación de colágeno natural. La hidroxilación de residuos específicos de lisil en la secuencia X-Lys-Gly también cumple una función importante en la síntesis de colágeno y en la formación de fibril. Los grupos de hidroxil sobre los residuos modificados de lisina funcionan tanto como puntos de unión para carbohidratos como puntos esenciales para la formación de aglutinantes intermoleculares estables. Estas modificaciones requieren la expresión de enzimas específicas, lisil hidroxilasa y lisil oxidasa.
Por lo tanto, en un aspecto de la invención, se considera la co-expresión de estas enzimas con los polipéptidos de la presente invención. El gen que codifica lisil hidroxilasa (Hautala et al. (1992) Genomics 13:62-69) se expresa en la célula huésped, que a continuación es modificada por la introducción de una secuencia codificadora de una gelatina o polipéptido del cual la gelatina puede derivarse, tal y como se describe en la presente invención. Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden por lo tanto modificarse de manera post-traslacional por la actividad de lisil hidroxilasa y lisil oxidasa expresadas de modo endógeno. Las gelatinas recombinantes de la presente invención también pueden modificarse por la expresión de de lisil hidroxilasa y lisil oxidasa exógenas. En una realización, las gelatinas recombinantes producidas son no-hidroxiladas, y como consecuencia se alteran imponiendo el grado deseado de hidroxilación de residuos de lisina mediante la actividad enzimática de lisii hidroxilasa. La habilidad para alterar el grado de hidroxilación de tisis es deseable para producir gelatinas, y los polipéptidos desde los cuales la gelatina puede derivarse, con varios grados de aglutinantes que llevan a las fuerzas deseadas de gel y viscosidades.
En realizaciones adicionales, un polipéptido que contiene residuos de hidroxilisina puede expresarse en, por ejemplo, una célula de levadura, en la cual la hidroxiprolina se produce a través de la actividad de prolil hidroxilasa. (Ver Ejemplos 1 y 4). En algunas realizaciones, la gelatina recombinante modificada o polipéptido del cual se deriva la gelatina puede formularse y administrarse a un animal o humano, sirviendo por lo tanto de sustrato para las actividades de enzimas endógenas, como lisil oxidasa, permitiendo por lo tanto que el polipéptido de colágeno se incorpore a los tejido en forma de aglutinante estabilizado. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona la producción de gelatinas recombinantes de fuerzas de gel y viscosidad deseable para uso comercial, sin la necesidad de las actividades de de lisil hidroxilasa o lisil oxidasa.
La invención también proporciona la producción de gelatina que tiene un punto particular de gelificación. En una realización, los métodos presentes proporcionan la producción de gelatina que tiene un punto de posición o gelificación de desde 15ºC a 35ºC. En otras realizaciones, la gelatina recombinante tiene un punto de posición de desde 15 a 25ºC, desde 25 a 35ºC, y desde 20 a 30ºC.
En varios aspectos, la presente invención proporciona gelatina recombinante que es no está hidrolizada, que está completamente hidrolizada o que se encuentra hidrolizada en varios grados, como las gelatinas que son una mezcla de productos hidrolizados y no hidrolizados. Además, la presente invención proporciona métodos para producir gelatinas recombinantes con varios grados de hidrólisis (Ver Ejemplos 9 y 10). Los hidroxilatos de gelatina normalmente son solubles en agua fría y se emplean en una variedad de aplicaciones, particularmente en las industrias farmacéutica y alimenticia, en las cuales se desea una gelatina con propiedades no gelificadoras. Los hidroxilatos de gelatina se emplean en la industria farmacéutica para formar agentes formadores de capas, procesos para microencapsulación, fórmulas para alivio de artritis y articulaciones, fabricación de pastillas, y varias fórmulas nutricionales. En la industria cosmética, los hidroxilatos de gelatina se emplean en champúes y condicionadores, lociones y otras formulaciones, incluyendo barras de labios, y en fórmulas para uñas, etc. Los hidroxilatos de gelatina aparecen como suplementos nutricionales en bebidas y comidas que aportan energía y proteína; se emplean como agentes afinadores en la clarificación de vino, cerveza y zumo; y se emplean en la microencapsulación de aditivos como saborizantes y colorantes alimenticios. Los hidroxilatos de gelatina se emplean en aplicaciones industriales por sus características capaces de formar capas, como en revestimientos de elementos en la fabricación de semiconductores, etc.
En una realización de la presente invención, la gelatina se produce a partir de secuencias de colágeno en las cuales se han eliminado a añadido dominios nativos particulares. La invención además contempla métodos para producir gelatina recombinante donde la gelatina se produce directamente a partir de una construcción alterada de colágeno, sin la producción de un colágeno intacto con triple hélice. En particular, la presente invención contempla métodos para producir gelatina recombinante que consisten en la expresión de varias construcciones que no codifican el colágeno estándar de triple hélice. Por ejemplo, las eliminaciones específicas pueden eliminar regiones responsables de colagenasa, y varias regiones que provocan respuestas inmunogénicas, por ejemplo, antigénicas o alergénicas.
Los dominios específicos de varios colágenos han sido asociados con actividades específicas. (Ver, por ejemplo, Shahan et al. (1999) Con. Tiss. Res. 40:221-232; Raff et al. (2000) Human Genet 106:19-28, cuyas referencias aquí se incorporan como referencia en su totalidad). En particular, la presente invención proporciona específicamente métodos para producir gelatinas recombinantes derivadas de colágeno, construcciones alteradas para eliminar o reducir o aumentar las regiones específicas de un gen de colágeno asociado con una actividad específica. En particular, dichas regiones pueden eliminarse completamente o en parte para producir una gelatina sin actividad específica o con reducida actividad específicas, o pueden añadirse copias adicionales de la región específica para producir una gelatina con una actividad mejorada. Por ejemplo, se han identificado secuencias en colágeno de tipo I y III reconocidas por el receptor integrina \alpha2\beta1 en la superficie celular de la plaqueta. (Knight et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:33287-33294; y Morton et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:11044-11048, cuyas referencias aquí se incorporan como referencia en su totalidad).
En un aspecto de la presente invención, se desea crear una gelatina homogénea compuesta por fragmentos sintetizados a partir de construcciones de colágeno sin regiones de activación de plaquetas. Dicha gelatina puede incluirse, por ejemplo, en productos asociados con anastomosis e injertos vasculares, etc., incluyendo cubiertas para prótesis y dispositivos de injerto. Dichos productos pueden asociarse con efectos secundarios perjudiciales, por ejemplo, trombosis, que pueden desarrollarse en asociación con le uso de tales productos como resultado de regiones agregadas a paletas presentes en el producto con colágeno. En un aspecto, la presente invención proporciona un método par producir una gelatina recombinante que puede proporcionar apoyo para la unión celular cuando se emplea en una prótesis o en un dispositivo similar, pero que no incluye regiones reactivas a las plaquetas, lo que minimiza le riesgo de agregación de plaquetas (Ver Ejemplo 2). Por lo tanto, la presente invención proporciona en una realización una cubierta de prótesis consistente en gelatina recombinante. En una realización preferente, la gelatina recombinante es gelatina recombinante humana. En algunos casos, como varias aplicaciones en la cura de heridas, puede se deseable proporcionar gelatina recombinante que comprenda dominios capaces de provocar actividades específicas de agregación.
Una gelatina de la presente invención puede expresarse a partir de construcciones de colágeno que no codificaron las regiones reconocidas por el receptor \alpha2\beta1, o a partir de construcciones con una o con múltiples copias de dichas regiones, proporcionando de este modo un producto de gelatina homogéneo y consistente sin o con reducida agregación y activación de plaquetas. En un aspecto, la presente invención facilita la producción de gelatina recombinante, mediante la expresión directa de gelatina, mediante el uso de expresión recombinante elevadamente eficiente. Los métodos de la presente invención, en oposición a los métodos actuales de extracción, ofrecen flexibilidad extrema, de modo que cualquier sistema de expresión puede emplearse. El material de producción es accesible, por ejemplo, en biomasa de levadura o plantas. La secreción en ciertos sistemas de producción pueden optimizarse, por ejemplo, por medio del establecimiento de un tamaño uniforme de moléculas particulares de gelatina que se producirán de acuerdo con los presentes métodos, En varias realizaciones, las presentes gelatinas o los polipéptidos de los que las gelatinas se derivan, se producen en sistemas de expresión incluyendo, aunque sin limitar, sistemas de expresión procariótica, sistemas de expresión bacterial, y sistemas de expresión eucariótica, incluyendo sistemas de expresión de levadura, animales, plantas e insectos. Se consideran os sistemas de expresión tales como los de los animales transgénicos y las plantas transgénicas.
La presente invención proporciona la expresión de al menos un polinucleótido que codifica una gelatina o un polipéptido del cual la gelatina puede derivarse en una célula. En una realización, la presente invención proporciona la expresión de más de un polinucleótido que codifica una gelatina o un polipéptido del cual la gelatina puede derivarse en una célula, de tal modo que se produce la gelatina recombinante que tiene polipéptidos homogéneos o heterogéneos. La presente invención además proporciona la expresión de un polinucleótido que codifica una enzima procesadora de colágeno o post-traslacional o subunidad de la misma en una célula. Diferentes modificaciones post-traslacionales, y diferentes enzimas post-traslacionales, por ejemplo, prolil hidroxilasa, lisil hidroxilasa, etc., pueden influir en, por ejemplo, fuerza Bloom y otras características físicas de las presentes gelatinas.
Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden derivarse de secuencias colagenosas. Las secuencias de las cuales se derivan los polinucleótidos codificadores de la invención pueden seleccionarse de secuencias humanas o no humanas, dependiendo de las características deseadas para el uso buscado del producto final de gelatina. Para uso farmacéuticos y médicos, es preferible la gelatina humana recombinante. Las fuentes no humanas incluyen fuentes mamíferas no humanas, tales como fuente bovina, porcina, y equina, y otras fuentes animales, como pollos y peces. Se consideran de manera particular las secuencias no nativas.
Las secuencias de ácido nucleico han sido descritas a modo general en la técnica. (Ver, por ejemplo, Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20:996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259:7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259:13668-13673; French et al. (1985) Gene 39:311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266:16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089:241-243; Wood et al. (1987) Gene 61:225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217:41-48; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17:85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253:919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252:633-640; and Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J 260:549-516). Ver también la solicitud co-pendiente y comúnmente reconocida WO 01/34647.
Las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden construirse con el fin de alterar las secuencias codificadoras empleadas para producir gelatina recombinante, o polipéptidos de los cuales puede derivarse la gelatina recombinante, para una variedad de finalidades incluyendo, pero sin limitación, alteraciones que modifican procesos y expresión del producto gen. Por ejemplo, las señales segregadoras alternativas pueden sustituirse por otras señales segregadoras nativas. Las mutaciones pueden introducirse usando técnicas bien conocidas en el campo, por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida, mutagénesis PCR-dirigida, mutagénesis de casete, y otras técnicas bien conocidas en la técnica para insertar nuevos sitios o puntos de restricción, o para alterar los patrones de glicosilación, fosforilización, pérdida/descomposición proteolítica, etc. Además, cuando se produce gelatina en un sistema de expresión usando células particulares huésped, los polinucleótidos de la invención pueden modificarse en la posición silenciosa de cualquier codón de aminoácido trillizo para que se ajuste mejor a la preferencia de codón de un organismo huésped en particular.
Las secuencias alteradas de polinucleótido que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen secuencias que contienen eliminaciones, adiciones o sustituciones de residuos de nucleótido en secuencias de colágeno nativo. Tales polinucleótidos pueden codificar el mismo producto gen o uno funcionalmente equivalente. El propio producto puede contener eliminaciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácido en una secuencia de colágeno.
Las secuencias de polinucleótido de la invención se dirigen además a secuencias que codifican variantes de los polipéptidos codificadas. La variantes de aminoácidos codificadas pueden prepararse por medio de varios métodos conocidos en la técnica para la introducción de cambios apropiados de nucleótido para codificar variantes de polipéptidos. Dos variables importantes en la construcción de variantes en secuencias de aminoácidos son la localización de la mutación y la naturaleza de la mutación. Las variantes de secuencia de aminoácido de las gelatinas de la presente invención, o de los polipéptidos de los cuales se derivan las presentes gelatinas, se construyen preferentemente mutando el polinucleótido para dar una secuencia de aminoácido que no ocurra en la naturaleza. Estas alteraciones en los aminoácidos pueden realizarse en varios puntos que se diferencian en, por ejemplo, colágenos de diferentes especies (posiciones variables), o en regiones elevadamente conservadas (regiones constantes). Los puntos en tales localizaciones se modificarán normalmente en serie, por ejemplo, sustituyendo en primer lugar con las opciones conservadoras (por ejemplo, aminoácido hidrofóbico por un aminoácido hidrofóbico diferente) y a continuación opciones más distantes (por ejemplo, aminoácido hidrofóbico por un aminoácido cargado), y posteriormente pueden realizarse eliminaciones e inserciones en el punto objetivo.
Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden emplearse otras secuencias de aminoácido que codifican sustancialmente la misma o secuencia de aminoácido u otra funcionalmente equivalente o un polipéptido, natural, sintético, semi-sintético, o recombinante en origen, en la práctica de la invención reivindicada. Particularmente, la presente invención considera las variantes degeneradas, incluyendo las secuencias optimizadas por el codón. Además, la presente invención proporciona de manera específica polinucleótidos que son capaces de hibridizar una secuencia en particular bajo condiciones rigurosas.
Expresión
Los métodos presentes se aplican de manera adecuada a una variedad de sistemas de expresión disponibles para aquellos profesionales en la técnica. Mientras se describen a continuación un número de estos sistemas de expresión, debe entenderse que la aplicación de los métodos presentes no se limita a las realizaciones específicas aquí establecidas.
Pueden utilizarse una variedad de sistemas de expresión para contener o expresar secuencias codificadoras de gelatinas recombinantes de la presente invención o polipéptidos desde lo cuales se derivan estas gelatinas. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, plásmido, o vectores cósmidos de expresión de ácido nucleico; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); hongos filamentosos transformados con vectores de hongos; sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterial (por ejemplo, plásmidos pET o Pbr322); o sistema celulares de animales.
Los elementos de control o secuencias reguladoras adecuadas para uso en la expresión de polinucleótidos de la presente invención son aquellas regiones no traducidas del vector, incluyendo procesadores, promotores, y regiones no traducidas 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares huésped para llevar a cabo la trascripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped empleado, pueden emplearse una variedad de elementos adecuados de trascripción y traducción.
Los promotores son secuencias no traducidas localizadas en dirección ascendente desde el codón de inicio del gen estructural que controlan la trascripción del ácido nucleico bajo su control. Los promotores inducibles son los promotores que alteran su nivel de iniciación de trascripción en respuesta a un cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente. Un experto en la técnica conocerá un gran número de promotores que podrían reconocerse en células huésped adecuadas para uso en los métodos de la presente invención.
El promotor, procesador, y otros elementos de control pueden seleccionarse como adecuados por un experto en la técnica. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacteriales, se pueden emplear los promotores inducibles como el promotor híbrido lacZ del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o plásmido pSPORT1 (GIBCO BRL) y similares. En sistemas de plantas, los promotores o procesadores derivados de los genomas de células de plantas (por ejemplo, promotor de corriente de calor, el promotor para la pequeña subunidad de RUBISCO; el promotor para la proteína de enlace clorofil a/b; promotores para varios genes de almacenaje de proteínas, etc.) o de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias líder, el promotor 35S ARN de CaMV, el promotor de proteína de cubierta de TMV, etc.) pueden clonarse en el vector. En sistemas celulares de mamíferos, los promotores procedentes de genes mamíferos (por ejemplo, promotor metalotioneína, promotor-actina, etc.) o de virus mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío adenovirus, CMV, SV40, LTR, TK, y los promotores del virus vaccinia 7.5 K, etc) son preferibles. Si es necesario generar una línea celular que contiene múltiples copias de la secuencia que codifica el polipéptido deseado, pueden emplearse vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.
Tales promotores pueden unirse de manera operativa con los polinucleótidos codificadores de gelatina o con los precursores de gelatina de la presente invención, retirando el promotor de su gen nativo y colocando el polinucleótido codificador en el extremo 3' de la secuencia promotora. Promotores útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, promotores procarióticos, que incluyen, por ejemplo, promotor de lactosa, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano, y promotores híbridos como el promotor tac; promotores de levadura, incluyendo, por ejemplo, el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa, otros promotores glicolíticos de enzima (hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructosequinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, etc.), el promotor para dehidrogenasa de alcohol, los promotores 1 o 2 oxidasa de alcohol (AOX, el promotor metalotioneína, el promotor de maltosa, y el promotor de galactosa; y promotores eucarióticos, que incluyen, por ejemplo, promotores de los virus polioma, difteria aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, SV40, y promotores desde la eucariota objetivo, por ejemplo, el promotor glucoamilasa de Apergillus, promotores de actina y ubiquitina, un promotor de inmunoglobulina de un mamífero y promotores de colágeno nativo (Ver, por ejemplo, de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25; Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073); Fiers et al. (1978) Nature 273:113; Mulligan and Berg (1980) Science 209:1422-1427; Pavlakis et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402; Greenway et al. (1982) Gene 18:355-360; Gray et al. (1982) Nature 295: 503-508; Reyes et al. (1982) Nature 297:598-601; Canaani and Berg (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5166-5170; Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781; and Nunberg et al. (1984) Mol. and Cell. Biol. 11(4):2306-2315).
Las secuencias de polinucleótido que codifican la gelatina y precursores de gelatina de la presente invención pueden estar bajo control trascripcional de un promotor constitutivo, que dirigen la expresión de manera general. De modo alternativo, los polinucleótidos empleados en los métodos presentes se expresan en un tipo específicos de tejido o célula, o bajo condiciones ambientales más precisas o controles de desarrollo. Los promotores que dirigen la expresión en estos casos son conocidos como promotores inducibles. En el caso en el que se emplea un promotor específico de tejido, la expresión de proteína es particularmente elevada en el tejido desde el cual se desea la extracción de la proteína. En plantas, por ejemplo, dependiendo del tejido deseado, la expresión puede estar dirigida al endoesperma, capa aleurona, embrión (o sus partes como escutelo y cotiledones), pericarpio, tallo, tubérculos de hojas, raíces, etc. Ejemplos de conocidos promotores específicos de tejido en plantas incluyen el promotor patatina clase I dirigido al tubérculo, los promotores asociados con los genes ADPGPP del tubérculo de la patata, el promotor de soja de \beta-conglicinina (proteína 7S), que conduce a la trascripción dirigida al tallo, y los promotores dirigidos al tallo procedentes de los genes de zeína de endoesperma de maíz (Ver, por ejemplo, Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4625-4638; Muller et al. (1990) Mol. Gen. Genet 224: 136-146; Bray (1987) Planta 172:364-370; and Pedersen et al. (1982) Cell 29:1015-1026).
La trascripción de las secuencias codificadoras de gelatinas o precursores de gelatina de la presente invención procedente del promotor a menudo aumenta introduciendo una secuencia potenciadota en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan con cis, normalmente desde aproximadamente 10 a 30 bp, que actúan para aumentar la velocidad en la iniciación de trascripción en un promotor. Se conocen muchos potenciadores tanto para eucarióticas como para procarióticas, y un experto en la técnica podrá seleccionar un potenciador apropiado para la célula huésped que interese (Ver, por ejemplo, Yaniv (1982) Nature 297:17-18).
Las gelatinas o precursores de gelatina de la presente invención pueden expresarse como proteínas segregadas. Cuando las células construidas empleadas para la expresión de la proteínas son células huésped no humanas, a menudo resulta ventajoso sustituir el péptido señalizador segregador de la proteína de colágeno por un péptido señalizador segregador alternativo que sea reconocible de manera más eficiente por la maquinaría segregadora de la célula. La secuencia señalizadora segregadora adecuada resulta particularmente importante para obtener expresión óptima de hongos de genes en mamíferos (Ver, por ejemplo, Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642). Otras secuencias señalizadoras para células procarióticas, de levadura, hongos, insectos o mamíferos son bien conocidas en la técnica, y un experto en la materia podrá seleccionar de manera sencilla una secuencia señalizadora apropiada para la célula huésped en cuestión.
La eficiencia de expresión puede aumentar por medio de la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular particular que se emplea, tal y como los descritos en la bibliografía. (Ver, por ejemplo, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162). Además, puede elegirse una variedad de célula huésped por su habilidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en el modo adecuado. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforolización, Iipidación, prenilación, y acilación. Los procesos post-traslacionales que parten formas "prepro" de la proteína pueden también emplearse para facilitar la inserción correcta, y/o la función de plegamiento. Diferentes células huésped como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, que tienen maquinaría celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-traslacionales, pueden elegirse para asegurar una correcta modificación y procesamiento de la proteína externa.
De acuerdo con la invención, las secuencias de polinucleótidos que codifican gelatinas recombinantes o polipéptidos de los cuales pueden derivarse las gelatinas pueden expresarse en células huéspedes apropiados. En realizaciones preferentes de la invención, las secuencias de polinucleótido se derivan de la secuencia de colágeno de tipo I, libre de secuencia codificadora para cualquier otro tipo de colágeno, del colágeno de tipo II, libre de secuencia codificadora para cualquier otro tipo de colágeno, o del colágeno de tipo III, libre de secuencia codificadora para cualquier otro tipo de colágeno. En otra realización, los polinucleótidos codificadores se derivan de colágeno de tipo I y II en cantidades específicas, de tal modo que la gelatina se produce o se deriva de los polipéptidos codificados que contienen una mezcla de colágenos del tipo I y II en cantidades definidas.
Con le fin de expresar las secuencias que conducen a la producción de la gelatina presente, las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia acortada de colágeno, como las presentadas en la Tabla 2, se insertan en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la trascripción y traducción de la secuencia codificara insertada, o en caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la réplica o traslación.
Los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica pueden emplearse para construir vectores de expresión que contengan la secuencia codificadora deseada y las señales apropiadas para el control trascripcional/traslacional. Estos métodos incluyen técnicas estándar de clonación de ADN, por ejemplo, técnicas recombinantes in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación in vivo. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., supra; Ausubel et al., supra; y Ausubel, F. M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York,
NY.
Pueden emplearse varios vectores de expresión para expresar los polipéptidos presentes. Por ejemplo, un vector de expresión típico contiene elementos codificadores para un origen de réplica; un punto de clonación para la inserción de una secuencia de nucleótido exógeno; elementos que controlan la iniciación de trascripción del gen exógeno, como un promotor, y elementos que controlan el proceso de trascripciones, como las secuencia de trascripción/terminación/poliadenilación. Un vector de expresión para uso en la presente invención también puede contener las secuencias que son necesarias para la integración final del vector en el cromosoma. Además, un gen que codifica el marcador de selección que está funcionalmente unido con los promotores que controlan la iniciación de trascripción también puede encontrarse en el vector de expresión, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos para facilitar el crecimiento y selección del vector de expresión en el huésped.
Los vectores de esta invención pueden replicarse de manera autónoma en la célula huésped, o pueden integrare en el cromosoma huésped. Los vectores adecuados con secuencias replicadoras autónomamente son bien conocidos por una variedad de bacterias, levaduras, y varias secuencias virales de réplica tanto para células procariotas como para eucariotas. Los vectores pueden integrarse en el genoma de la célula huésped cuando tienen una secuencia de ADN que es homóloga a la secuencia encontrada en el ADN genómico de la célula huésped.
Para producción a gran escala a y a largo plazo de proteínas recombinantes, es preferible la expresión estable. Por ejemplo, líneas celulares que expresan establemente los presentes polipéptidos pueden transformarse usando vectores de expresión que contienen orígenes virales de réplica o elementos apropiados de expresión (p.ej., promotores, potenciadores, terminadores de trascripción, puntos de poliadenilación, etc.) y un gen marcador seleccionable sobre el mismo vector o sobre un vector separado. Tras la introducción de los vectores, se deja que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante ofrece resistencia a la selección, permitiendo el crecimiento y la recuperación de las células que expresan de manera correcta las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula. Este método puede emplearse de manera ventajosa para producir líneas celulares que expresan un polipéptido deseado.
La expresión de varias secuencias empleadas en los métodos de la presente invención provocada por, por ejemplo, promotores de galactosa puede inducirse por el cultivo de un cultivo en azúcar que no sea capaz de contener ni provocar de modo que una rápida inducción vaya a continuación de la adición de galactosa; cultivando el cultivo en un medio de glucosa y a continuación retirando la glucosa mediante centrifugación y lavando las células antes de la resuspensión en medio de galactosa; y cultivando las células en un medio que contiene tanto glucosa como lactosa de modo que la glucosa se metaboliza preferentemente antes de que se de la inducción de la galactosa.
Puede emplearse un gran número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, aunque no se limitan a, el gen de la timidina quinasa del virus herpes simple y el gen adenina fosforibosil-transferasa que pueden emplearse en células tk o aprf, respectivamente. (Ver, por ejemplo, Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32; Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23). Así mismo, la resistencia a los antimetabolito, antibiótico o herbicidas puede emplearse como base para la selección. Por lo tanto, la presente invención contempla el uso de dichos marcadores seleccionables, por ejemplo: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; npt, que confiere resistencia a aminoglicósidos neomicina y G-418; y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y a fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente. (Ver, p. ej., Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; and Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14).
Se han descrito gentes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. (Ver, p. ej., Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y sus sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, ahora ampliamente empleada no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión proteica pasajera o estable atribuible a un sistema específico de vector. (Ver, p. ej., Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
Tal y como se ha señalado anteriormente, los vectores de expresión para uso en los métodos de la presente invención de producción pueden consistir normalmente en un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en células. Generalmente, el gen marcador seleccionable codificará la resistencia antibiótica, con genes adecuados que incluyen al menos un conjunto de genes codificadores de la resistencia a antibiótico espectinomicina, fosfotransferasa estreptomicina (SPT) gen codificador de resistencia a estreptomicina, fosfotransferasa neomicina (NPTH) gen codificador de kanamicina o resistencia a geneticina, el gen de resistencia a higromicina, genes codificadores de la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS), en particular, los herbicidas del tipo sulfonilurea (por ejemplo, el S4 y/o mutaciones Hra), genes codificadores de la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen barra), u otros genes similares conocidos en la técnica. El gen barra codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptII codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida
clorsulfurón.
Otros métodos para determinar qué células huésped, tras la transformación, contienen los polinucleótidos de interés incluyen una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, hibridizaciones con ácido nucleico, incluyendo hibridizaciones ADN-ADN o ADN-ARN, y varias técnicas de inmunoensayos y bioensayos con proteínas que incluyen tecnologías basadas en membrana, solución o chip para detectar y/o cuantificar los polinucleótidos o polipéptidos.
Además, puede elegirse una variedad de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique o procese el producto gen en el modo específico deseado. Tales modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesos (p. ej., partición) de productos de proteína puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para el proceso y modificación post-traslacional de proteínas. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para asegurar una modificación y un procesamiento correcto de la proteína externa expresadas. Con este fin, pueden emplearse células huésped eucarióticas poseen la maquinaria celular para procesar de manera óptima la trascripción primaria, incluyendo varias modificaciones como el plegamiento de proteína, la formación de enlace disulfuro, glicosilación, y fosforilación del producto gen. Dichas células huésped de mamíferos incluyen, pero sin limitar a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc.
Las señales específicas de iniciación también pueden emplearse para conseguir traslación más eficiente de los polinucleótidos de la presente invención. Tales señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los que las secuencias codificadoras de los polipéptidos presentes, junto con las secuencias de iniciación y de ascendencia requeridas para la traslación, etc., se insertan en el vector de expresión apropiado, no son necesarias señales de control transcripcional o traslacional. Sin embargo, en casos en los que solamente se insertan secuencias codificadoras, o porciones de las mismas, debería proporcionarse señales exógenas de control traslacional que incluyen el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debería estar en el correcto marco de lectura para asegurar la traslación de todo el objeto insertado. Los elementos exógenos traslacionales y los codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. (Ver, p. ej., Bittner et al. (1987) Meth. En Enzymol. 153:
516-544).
Una célula huésped de la presente invención puede infectarse, trasfectarse o transformarse con al menos un polinucleótido codificador de una enzima post-traslacional, además de al menos un polinucleótido codificador de una gelatina de la presente invención o de un polipéptido del cual la gelatina puede derivarse. Tales polinucleótidos incluyen aquellos codificadores de enzimas de colágeno post-traslacional, como prolil 4-hidroxilasa, colágeno glicosil transferasa, C-proteinasa, N-proteinasa, lisil oxidasa, o lisil hidroxilasa, y pueden insertare en células que no producen de manera natural enzimas post-traslacionales, por ejemplo, en células de levadura, o células que no producen de manera natural cantidades suficientes de enzimas post-traslacionales, por ejemplo, células de varios insectos y mamíferos, de modo que la enzima exógena puede ser necesaria para producir ciertos efectos post-traslacionales. En una realización de la presente invención, la enzima post-traslacional es prolil 4-hidroxilasa, y el polinucleótido codifica la subunidad \alpha y la subunidad \beta de prolil hidroxilasa. En una realización preferente, los polinucleótidos que codifican la subunidad \alpha y la subunidad \beta de prolil 4-hidroxilasa se insertan en una célula para producir enzima prolil 4-hidroxilasa biológicamente activa, co-expresada con un polinucleótido codificador de una gelatina o un polipéptido del cual puede derivarse la gelatina.
Los polinucleótidos que codifican enzimas post-traslacionales pueden derivarse de cualquier fuente, ya sea natural, sintética o recombinante. En una realización preferente, la enzima post-traslacional se deriva de la misma especie que la gelatina recombinante a producir. En una realización, la gelatina recombinante a producir es gelatina recombinante humana, y la enzima post-traslacional es prolil 4-hidroxilasa humana.
Las gelatinas o los precursores de gelatina expresados de la presente invención se segregan preferentemente en medio de cultivo y pueden purificarse para conseguir homogeneidad por medio de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de cromatografía. En una realización, la gelatina recombinante o precursores de gelatina se purifican a través de cromatografía de exclusión por tamaños. Sin embargo, otras técnicas de purificación conocidas en la técnica también pueden emplearse, incluyendo, pero sin limitar a, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y cromatografía en fase reversa. (Ver, p. ej., Maniatis et al., supra; Ausubel et al., supra; y Scopes (1994) Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag New York, Inc.,
NY.).
Procariótica
En sistemas procarióticos, como los sistemas bacteriales, puede seleccionarse cualquier número de vectores de expresión, dependiendo del uso que se pretenda dar al polinucleótido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de gelatinas recombinantes de la presente invención, o péptidos de los que se derivan estas gelatinas, pueden emplearse vectores que dirigen la expresión con nivel alto de proteínas de fusión que pueden purificarse fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncional, como BLUESCRIPT (Stratagene), en el cual la secuencia codificadora está ligada al vector insertado con secuencias para la amino-terminal Met y los siguientes siete residuos de \beta-galactosidasa de modo que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke, G., y S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. Los vectores pEX (Promega, Madison, Wis.) y pET (Invitrogen) también pueden emplearse para expresar polipéptidos externos como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante absorción para gotas de glutationa-agarosa seguido de elución en la presencia de glutationa libre. Las proteínas realizada mediante este sistema pueden diseñarse para incluir heparina, trombina, o puntos de partición de factor XA proteasa de modo que el polipéptido clonado de interés puede liberarse del radical
GST.
Levadura
En realizaciones preferentes, la presente invención proporciona métodos para producir gelatina recombinante usando un sistema de expresión de levadura. En realizaciones preferentes, la gelatina se produce directamente a partir de construcciones alteradas de colágeno. Un número de vectores que contienen promotores constitutivos, no-constitutivos, o promotores inducibles pueden emplearse en sistemas de levaduras. (Ver, p. ej., Ausubel et al., supra, Capítulo 13). En algunos aspectos, se emplean los vectores que contienen secuencias que dirigen la integración de ADN en el cromosoma para la expresión en S. cerevisiea.
En una realización, las gelatinas recombinantes de la invención, o los polipéptidos de los que se derivan estas gelatinas, se expresan usando células huéspedes a partir de levadura Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae puede usarse con un gran número de vectores de expresión disponibles en la técnica, incluyendo un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles como factor \alpha, AOX, GAL1-10, y PGH. (Ver, p. ej., Ausubel et al., supra, y Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544). Los vectores de expresión comúnmente empleados son los vectores lanzadera que contienen el origen 2 \mu de réplica para la propagación en levadura en el origen ColE1 para E. coli, incluyendo un promotor de levadura y un terminador para la trascripción eficiente del gen externo. Los vectores que incorporan 2 \mu plásmido incluyen, pero no se limitan a, pWYG4 y pYES2, que tienen los elementos 2 \mu ORI-STB, el GAL1-10, etc. En un método de la presente invención, en el cual se desea un producto hidroxilado, implica la co-expresión de una enzima de colágeno post-traslacional, por ejemplo, prolil 4-hidroxilasa. En dicho método, usando el vector pWYG4, el punto de clonación NcoI se emplea para insertar el gen bien para la subunidad \alpha o para \beta de prolil 4-hidroxilasa, y para proporcionar el codón de inicio ATG bien para la subunidad \alpha o para \beta. En un método, se emplean plásmidos de expresión que dirigen la integración hacia el cromosoma del
huésped.
El vector de expresión pWYG7L, que tiene ORI, STB, REP1 y REP2 intactos, el promotor GAL7, y el terminador FLP, también pueden usarse. Cuando se desea la co-expresión de una enzima post-traslacional, por ejemplo, prolil 4-hidroxilasa, el gen para para la subunidad \alpha o \beta de prolil 4-hidroxilasa se inserta en el polienlace con sus extremos 5' en el punto BamHI o NcoI. El vector que contiene el gen prolil 4-hidroxilasa se transforma en S. cerevisiae bien antes o después de la retirada de la pared celular para producir esferoplastos que toman el ADN en el tratamiento con calcio y glicol polietileno o mediante el tratamiento de células intactas con iones de litio. De manera alternativa, ADN puede introducirse por medio de electroporación. Los transformantes pueden seleccionarse usando células huésped de levadura que son auxotróficos para leucina, triptófano, uracil o histidina junto con los genes marcadores seleccionables como LEU2, TRP1, URA3, HIS3 o LEU2-D.
En otra realización preferente, los métodos para producir gelatina recombinante de acuerdo con la presente invención usan células huésped de la levadura Pichia pastoris, o de otras especies de levadura non-Saccharomyces, que poseen ventajas para producir grandes cantidades de proteína recombinante a gran escala. Los sistemas de expresión Pichia incluyen ventajas de sistemas de expresión procarióticos (p. ej., E. coli) - alto nivel de expresión, fácil ampliación, y crecimiento económico - y sistemas de expresión eucarióticos - procesamiento de proteínas, plegamiento, y modificaciones post-traslacionales. Tales sistemas de expresión pueden construirse usando varios métodos y kits disponibles para aquellos expertos en la técnica, los kits PICHIA EXPRESSION disponibles en Invitrogen Corporation (San Diego, CA).
Existen un número de genes receptivos de metanol en levaduras metilotróficas como Pichia pastoris, o Pichia methanolica, etc., estando cada expresión controlada por las regiones reguladoras receptivas de metanol (también referidas como promotores). Cualquiera de estos promotores receptivos a metanol es adecuado para uso en la práctica de la presente invención. Ejemplos de regiones reguladoras específicas incluyen el promotor para el principal gen de alcohol oxidasa de Pichia pastoris AOX1, el promotor para el gen secundario de alcohol oxidasa de Pichia pastoris AOX2, el promotor FLD1, el promotor para el gen dihidroxiacetona sintasa de Pichia pastoris (DAS), el promotor para el gen P40, etc. Normalmente, la expresión en Pichia pastoris se obtiene a través del promotor del gen AOX1 rigurosamente controlado (Ver, p. ej., Ellis et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1111; y Patente U.S Nº 4,855,231). La expresión constitutiva también puede conseguirse usando, por ejemplo, el promotor GPH.
Otra expresión de levadura preferente para uso en los métodos de la presente invención emplea la levadura metilotrófica Hansenula polymorpha. Este sistema puede emplearse, por ejemplo, en un método de producción de la presente invención donde se desea una alta producción. El cultivo en metanol da como resultado la inducción de enzimas clave en MOX (metanol oxidasa), DAS (dihidroxiacetona sintasa), y FMHD (formato dehidrogenasa). Estas enzimas pueden formar hasta el 30-40% de la proteína total celular. Los genes codificadores de la producción de MOX, DAS, y FMDH son controlados por promotores fuertes inducidos por el cultivo de metanol y reprimidos por el cultivo en glucosa. Cualquiera de estos tres promotores o los tres pueden obtener una expresión de alto nivel de secuencias heterólogas en H. polymorpha, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.
En un método de la presente invención, los polinucleótidos codificadores se clonan en un vector de expresión bajo el control de un promotor inducible H. polymorpha. Si se desea secreción del producto, un polinucleótido codificador de una secuencia señalizadora de la secreción en levadura, como MF\alpha1, se fusiona en la estructura con la secuencia codificadora para los polipéptidos de la invención. El vector de expresión preferentemente contiene un gen marcador auxotrófico, como URA3 o LEU2, u otro marcador conocido en la técnica, que puede emplearse para complementar la deficiencia de un huésped autotrófico. De manera alternativa, pueden emplearse marcadores seleccionables dominantes como zeocina o blastacina.
El vector de expresión se emplea a continuación para transformar célula huésped H. polymorpha usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Una característica interesante y útil de la transformación de H. polymorpha es la integración espontánea de hasta 100 copias del vector de expresión en el genoma. En la mayor parte de los casos, las secuencias integradas forman multímeros que muestran una disposición "de cabeza a cola". El ADN externo integrado ha demostrado ser mitóticamente estable en varias variedades recombinantes, incluso bajo condiciones no selectivas. Este fenómeno de elevada integración en copia añade además potencial de productividad del
sistema.
Planta
La presente invención contempla además la producción de la gelatina recombinante de la presente invención, o polipéptidos de los que se deriva la gelatina recombinante, en sistemas de expresión de plantas, incluyendo células huésped de plantas y plantas transgénicas (Ver, p. ej., Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen y Pen, eds., John Wiley & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun y Breiman, eds., Imperial College Press, 1997; and Applied Plant Biotechnology, Chopra et al. eds., Science Publishers, Inc., 1999). En caso en los que se emplean vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias puede estar conducida por cualquier número de promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como promotores 35S y 19S de CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia líder de colágeno de TMV. (Ver, p. ej., Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514; and Takamatsu, N. (1987) EMBO J.6:307-311). Los vectores de expresión de plantas y genes reporteros son generalmente conocidos en la técnica. (Ver, p. ej., Gruber et al. (1993) en Methods of Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press).
De manera alternativa, pueden emplearse los promotores de plantas tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o los promotores de impacto de calor, por ejemplo, soja hsp17.5-E o hsp17.3-B (Ver, p. ej., Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al.(1984) Science 224:838-843; Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105; and Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estas construcciones pueden introducirse en células de plantas usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroforación, transfección mediada por patógenos, bombardeo de partículas, o cualquier otro medio conocido en la técnica, como los descritos en un número de publicaciones generalmente disponibles. (Ver, p. ej., Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y., pp. 191-196; Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; and Grierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2ª Ed., Blackie, London, Ch.
7-9).
En varias realizaciones, la gelatina recombinante de la presente invención, o polipéptidos de los que se deriva la presente gelatina recombinante, se produce a partir de semillas por medio de técnicas de producción disponibles basadas en semillas usando, por ejemplo, semillas de canola, maíz, soja, arroz y cebada. En dichas realizaciones, la pretina es recubierta durante la germinación/cambio de la raíz. En otras realizaciones, la proteína se expresa directamente en el endoesperma o en otra partes de la planta de moto que la gelatina no se puede extraer, y la propia planta puede servir por sí misma, por ejemplo, como suplemente dietético como si fuera una fuente de proteínas.
Los promotores que pueden emplearse para dirigir la expresión de los polinucleótidos pueden ser heterólogos o no heterólogos. Estos promotores también pueden usarse para conducir la expresión de los ácidos nucleicos antisentido hacia la reducción, aumento, o alteración de la expresión tal y como se desee. Pueden realizarse otras modificaciones para aumentar y/o maximizar la trascripción de secuencias en una planta o en células de plantas que son estándar y conocidas para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido operativamente unidas con un promotor pueden además consistir en al menos un factor que modifica la velocidad de trascripción de los polipéptidos codificados, como, por ejemplo, la secuencia señalizadora de exportar un péptido, el uso de codones, intrones, señales de poliadenilación, y puntos de terminación de trascripción. Los métodos de modificación de construcciones de ácido nucleico para aumentar los niveles de expresión en plantas son generalmente conocidos por aquellos expertos en la técnica. (Ver, p. ej., Roberts et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3731; Cornejo et al., (1993) Plant Mol Biol 23:567-568). Al llevar a cabo un sistema de planta que afecte la velocidad de trascripción de los polinucleótidos, pueden emplearse varios factores conocidos en la técnica, incluyendo secuencias reguladoras como las secuencias que actúan positivamente o negativamente, potenciadores y silenciadores, estructura de cromatina,
etc.
Los vectores típicos útiles para la expresión de genes externos en plantas son bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitar a, vectores derivados del plásmido que induce tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens. Estos vectores son vectores integradores de plantas, que tras la transformación, integran una porción del ADN en el genoma de la planta huésped. (Ver, p. ej., Rogers et al. (1987) Meth. In Enzymol. 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; and Berger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:8402-8406).
Los procedimientos para transformar células de plantas se encuentran disponibles en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transferencia directa de gen, transformación protoplasto in vitro, transformación mediada por virus de planta, transformación mediada por liposoma, microinyección, electroforación, transformación mediada por Agrobacterium, y aceleración de partícula balística. (Ver, p. ej., Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; Patente U.S. No. 4,684,611; European Application No. 0 67 553; Patente No. 4,407,956; Patente U.S. No. 4,536,475; Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:5602-5606; Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-921; and U.S. Patent No. 4,945,050). Métodos estándar para la transformación de arroz, trigo, maíz, sorgo, y cebada se describen en la técnica. (Ver p. ej., Christou et al. (1992) Trends in Biotechnology 10:239; Casas et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11212; Wan et al. (1994) Plant Physiol. 104:37; and Lee et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 6389). El trigo puede transformarse mediante técnicas similares a las empleadas para transformar maíz o arroz. (Ver, p. ej., Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833; y Gordon-Kamm et al.,
supra).
Métodos adicionales que pueden emplearse para generar plantas o células de plantas que pueden expresar las gelatinas recombinantes presentes o polipéptidos de los que pueden derivarse estas gelatinas recombinantes están bien establecidos en la técnica (Ver, p. ej., Patente U.S. No. 5,959,091; Patente U.S. No. 5,859,347; Patente U.S. No. 5,763,241; Patente U.S. No. 5,659,122; Patente U.S. No. 5,593,874; U.S. Patente No. 5,495,071; Patente U.S. No. 5,424,412; Patente U.S. No. 5,362,865; y Patente U.S No. 5,229,112).
La presente invención comprende además un método para producir polipéptidos proporcionando una biomasa a partir de plantas o células de plantas que están formadas por al menos una secuencia de polinucleótido que codifica una gelatina recombinante, o un polipéptido del que la gelatina recombinante puede derivarse, donde dicha secuencia de polipéptido está operativamente enlazada con un promotor para efectuar la expresión del polipéptido. En una realización adicional, el método además comprende la co-expresión de al menos una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima que cataliza una modificación post-traslacional, o una subunidad de la misma, donde dicha secuencia de polipéptido está operativamente enlazada con un promotor. En estos métodos, las gelatinas recombinantes se extraen de biomasa.
Hongos
Los hongos filamentosos también pueden emplearse para producir los polipéptidos de la presente invención. Los vectores para expresar y/o segregar proteínas recombinantes en hongos filamentosos son bien conocidos en la técnica, y un experto en la técnica podría, usando métodos y productos disponibles en la técnica, usar estos vectores en los métodos ahora presentados. (Ver, p. ej., Patente U.S No. 5,834,191).
Insectos
Los sistemas celulares de insectos permiten que los polipéptidos de la presente invención se produzcan en grandes cantidades. En uno de estos sistemas, el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se emplea como un vector para expresar genes externos en, por ejemplo, células Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las secuencias codificadoras de las gelatinas o precursores de gelatina de la presente invención pueden clonarse en regiones no esenciales del virus, por ejemplo, el gen poliedro, y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV, por ejemplo, el promotor poliedro. La inserción correcta de una secuencia codificará dará como resultado una inactivación del gen poliedro y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de capa proteica codificada por el gen poliedro). Estos virus recombinantes se emplean a continuación para infectar célula Spodoptera frugiperda o Trichoplusia larvae en las que se expresan los polinucleótidos codificadores de las gelatinas o precursores de gelatina. (Ver, p. ej. Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227; Smith et al.(1983) J. Virol. 46:584; y Patente U.S. No. 4,215,051). Más ejemplos de este sistema de expresión pueden encontrarse en, p. ej., Ausubel et al. (1995), supra.
La producción recombinante de los polipéptidos de la presente invención puede lograrse en células de insectos, por ejemplo, a través de infección de vectores de baculovirus que contienen las secuencias apropiadas de baculovirus, incluyendo aquellas que codifican enzimas post-traslacionales que puedan ser necesarias. Los baculovirus son vectores de expresión muy eficientes para la producción a gran escala de varias proteínas recombinantes en células de insectos. Pueden emplearse varios métodos conocidos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan una secuencia codificadora de la gelatina o un precursor de gelatina de la presente invención y las señales adecuadas para control trascripcional/traslacional. (Ver, por ejemplo, Luckow et al. (1989) Virology 170:31-39; y Gruenwald, S. y J. Heitz (1993) Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods Manual, Pharmingen, San Diego,
CA).
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Animal
La presente invención proporciona métodos para expresar las gelatinas recombinantes de la presente invención, o polipéptidos de los que las gelatinas recombinantes pueden derivarse, en sistemas de animales. Dichos sistemas incluyen células huésped de mamíferos e invertebrados y de animales transgénicos. En células huésped de mamíferos, puede utilizarse un número de sistemas de expresión. En casos en los que se emplea un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias codificadoras de los polipéptidos de la presente invención pueden estar ligadas a un complejo trascripción/traslación de adenovirus consistente en el promotor tardío y en la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico pueden insertarse a continuación en el genoma adenovirus por medio de una recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral puede emplearse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar los polipéptidos de la presente invención en células huésped. (Ver, p. ej., Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). De manera alternative, puede emplearse el promotor de vacuna 7.5 K. (Ver, p. ej., Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982); Mackett et al. (1984), J. Virol. 49:857-864; and Panicali et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931). Además, varios potenciadores de trascripción conocidos en la técnica, como el el potenciador del virus del Sarcoma de Rous (RSV), puede emplearse para aumentar la expresión en, por ejemplo, células huésped de mamíferos.
El virus de los bosques de Semliki es un sistema de expresión preferente debido a que el virus tiene una amplia gama de huéspedes de modo que la infección de líneas celulares en mamíferos es posible. La infección de células huéspedes en mamíferos, por ejemplo, células del riñón de un bebé hámster (BHK) y las células de un ovario de un hámster chino (CHO), usando el mencionado vector viral puede producir altos niveles de expresión recombinante. Más específicamente, se considera que el virus de los bosques de Semliki puede emplearse en una amplia variedad de huéspedes, ya que el sistema no se basa en integración de cromosomas, y por lo tanto será un modo rápido de obtener modificaciones de las gelatinas recombinantes en estudios dirigidos a la identificación de la relación estructura-función y comprobar los efectos de varias moléculas híbridas. Métodos para construir vectores del virus de los bosques de Semliki para la expresión de proteínas exógenas en células de mamíferos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Olkkonen et al. (1994) Methods Cell Biol 43:43-53.
Además, las células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr) puede transfectarse con un plásmido de expresión que contenga un gen dgfr y el polinucleótido deseado. La selección de células CHO resistentes a las concentraciones crecientes de metotrexato sufrirán una amplificación del gen, proporcionando niveles de expresión más altos de la proteína recombinante deseada, tal y como se conoce en la técnica.
Los sistema de animales transgénicos también pueden emplearse para expresar las gelatinas de la presente invención o los polipéptidos de los cuales estas gelatinas recombinantes pueden derivarse. Dichos sistemas pueden construirse, por ejemplo, en mamíferos enlazando operativamente un polipéptido codificadora con un promotor y otras secuencias necesarias u opcionales capaces de llevar a cabo la expresión en las glándulas mamarias. De este modo, las enzimas post-traslacionales requeridas u opcionales que llevan a cabo modificaciones post-traslacionales, pueden producirse simultáneamente en la células objetivo empleando sistemas de expresión adecuados. Métodos para usar animales transgénicos para producir proteínas de manera recombinante son bien conocidos en la técnica. (Ver, p. ej., Patente U.S. No. 4,736,866; Patente U.S. No. 5,824,838; Patente U.S. No. 5,487,992; y Patente U.S. No. 5,614,396; y Solicitud co-pendiente U.S. Nº Serie 08/987,292).
Formulaciones para Vacunas
La presente invención contempla particularmente el uso de gelatinas recombinantes de la presente invención como componentes de varios productos farmacéuticos, incluyendo vacunas. (Ver, p. ej., Solicitud co-pendiente, comúnmente apropiada, WO 01/34646). Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una formulación para una vacuna consistente en la gelatina recombinante. En una realización preferente, la gelatina recombinante se deriva de fuentes humanas. Las gelatinas recombinantes presentes ofrecen una ventaja que previamente no se encontraba disponible en la técnica: usando gelatinas derivadas de secuencia de colágeno humano nativo se reduce por lo tanto el riesgo de inmunogenicidad y/o antigenicidad de la propia gelatina. En una realización específica de la presente invención, se proporciona una vacuna consistente en gelatina recombinante no inmunogénica. (Ver Ejemplo 12). En una realización adicional, la gelatina recombinante no inmunogénica se deriva de fuentes animales, por ejemplo, de secuencias bovinas o porcinas. En realizaciones adicionales, la gelatina recombinante no inmunogénica comprende una secuencia no nativa.
Además, debido a que las gelatinas presentes se producen de manera recombinante en un medio controlado, el riesgo de infección, por parte de agentes infecciosos como TSEs, bacterias patológicas, o virus, o el riesgo a la exposición a endotoxinas y patógenos introducidos durante o después del proceso, se eliminan de manera virtual. Es otro objeto de la invención proporcionar agentes estabilizadores mejorados que incluyan gelatinas recombinantes, y derivados, fragmentos, o equivalentes funcionales de los mismos, teniendo cada uno características físicas y químicas optimizadas para aplicaciones particulares.
La estabilidad es un factor crítico en el desarrollo de la vacuna, donde debe dirigirse a la inestabilidad relativa de la mayoría de los virus existentes. Las vacunas pueden degradarse a medida que transcurre el tiempo, perdiendo potencia y efectividad. Demás, las vacunas se distribuyen en todo el mundo, y en una gran variedad de medios y condiciones. El envío de vacunas a países en vías de desarrollo, por ejemplo, ha resultado problemático en ocasiones debido a las condiciones imperfectas de almacenamiento, incluyendo, por ejemplo, altas temperaturas en el ambiente. Bajo ciertas condiciones de almacenaje y/o transporte, la estabilidad de una formulación para vacuna puede cumplirse. (Ver, p.ej., Chang, A. C. et al. (1996) J. Pharm. Sci. 85:129-132; Koyama, K. et al. (1996); Osame, J., European Patent No. 0 568726 B1; y Patente U.S. No. 4,337,242).
La estabilización de vacunas hace referencia al mantenimiento de la seguridad y efectividad de una vacuna. Por lo tanto, los agentes estabilizadores son compuestos que llevan a cabo una variedad de diferentes tareas. Por ejemplo, con vacunas vivas, como sarampión, paperas, rubéola, y distémper canino, la estabilidad implica el mantenimiento del título infeccioso/infección de la vacuna y la habilidad para provocar la respuesta inmune apropiada. Con vacunas inactivadas, como la de la gripe, Hepatitis A, poliomielitis (IPV), y rabia, así como vacunas producidas a partir de toxinas proteicas bacteriales purificadas, como la cólera o tos ferina, la habilidad para producir la respuesta inmune necesaria requiere el mantenimiento de la integridad estructural de la vacuna, con el fin de preservar la estructura antigénica y la correcta presentación estérica de epítopes relevantes. Por lo tanto, existe una necesidad por una estabilización efectiva de preparaciones de vacunas en previsión a varios tiempos de almacenaje, y varias condiciones de almacenaje, transporte y uso.
Los métodos actuales de estabilización buscan mejorar el almacenaje y la estabilidad, impulsar las respuestas inmunológicas hacia el agente infeccioso asegurando el envío apropiado in vivo, y proporcionando formulaciones que contienen el potencial para reducir el número de inmunizaciones requeridas para la eficacia protectoras. Varios métodos de estabilización, como el uso de bajas temperaturas, procesos de liofilización, y estabilizadores químicos, han sido empleados en el pasado. Las instalaciones de almacenaje a bajas temperaturas, por ejemplo, ofreciendo condiciones de almacenaje de desde aproximadamente -10ºC hasta -70ºC, pueden facilitar un método para mantener la estabilidad de formulaciones para vacunas. Sin embargo, estas facilidades no siempre se encuentran disponibles durante el transporte o la distribución de vacunas. Mantener una adecuada "cadena de frío" en servicios e instalaciones puede resultar difícil a la vista de que la adecuada infraestructura requerida para controlar y mantener el equipo necesario, y para proteger la formulación de la vacuna desde su desarrollo hasta su administración.
Otra técnica de estabilización incluye el uso de varios procedimientos de liofilización y secado por congelación. La liofilización es un procedimiento razonablemente eficaz pero caro. El proceso de liofilización requiere tres fases distintas (congelación, primer secado, y segundo secado), y cada una de los cuales presenta dificultades para mantener la conformación nativa y la actividad de macromoléculas y microorganismos biológicos. (Ver, p. ej., Burke et al. (1999) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16:1-83, y referencias aquí incluidas). Las vacunas liofilizadas permanecen bastante estables en aproximadamente 4º a 8º, pero sufren deterioración a lo largo del periodo de almacenaje. Las vacunas liofilizadas se deterioran lentamente hasta que, aproximadamente tras 12 a 24 meses de almacenaje, la formulación para vacuna carece del suficiente título como para conferir inmunización. Además, las formulaciones de vacunas liofilizadas deben reconstituirse antes de su uso. Añadidamente, la preparación líquida reconstituida pierde potencia mientras se encuentra a temperatura ambiente. Esto puede resultar en una respuesta inmune imperfecta y pueden llevar a aumentar el número de inmunización requerida para conseguir una eficacia protectora.
En otra técnica para conferir estabilidad, se añaden los agentes estabilizadores a la formulación de la vacuna y se emplean junto con métodos de almacenamiento a baja temperatura o métodos de liofilización. Estos estabilizadores pueden llevar a cabo una serie de funciones dirigidas al mantenimiento de la estabilidad, incluyendo, por ejemplo, mantener el pH de la formulación, contribuir a la viscosidad y/o tonicidad, asistir en liberación controlada, minimizar la agregación y precipitación de componentes en la formulación, y hidratar componentes de la formulación, para prevenir daño causado por la deshidratación durante la desecación y/o posterior almacenaje durante largos periodos de tiempo, que pueden incluir hidratación preferencial de constituyentes proteicos para mantener la conformación proteica nativa. Con el fin de maximizar los efectos estabilizadores de estos materiales, los estabilizadores a menudo se emplean en combinación, de modo que el efecto estabilizador pueda aumentar sinergísticamente o aditivamente.
Por lo tanto, los estabilizadores empleados en la formulación de vacunas incluyen, pero no se limitan a, búferes; sales, como cloruro sódico o cloruro magnésico; aminoácidos, como glutamato sódico, arginina, lisina, y cisteína; monosacáridos, como glucosa, galactosa, fructosa, y manosa; disacáridos, como sacarosa, maltosa, y lactosa; alcoholes de azúcar, como sorbito y manitol; polisacáridos, como oligosacáridos, almidón, celulosa, y derivados de los mismos; albúmina de suero humano y albúmina de suero bovino; diversos antioxidantes, como ácido ascórbico; y gelatina, como gelatina hidrolizada.
La gelatina hidrolizada ha sido empleada como un componente de vacunas, por ejemplo, como agente estabilizador para formulaciones líquidas o liofilizadas. (Ver, p. ej., Patente U.S. No. 4,985,244; Patente U.S. No. 4,147,772;. Patente U.S No. 4,338,335; and Makino, S. et al. Patente Europea No. 0 295 043 B1). Las gelatinas parcialmente hidrolizadas disponibles hoy en día se derivan de gelatinas producidas por medio de métodos convencionales de extracción a partir de materias primas animales. (Ver p. ej., Asghar, A. (1982) Adv. Food Res. 28:231-372; y Miller, E. J. et al. (1982) Methods in Enzymology 82:33-64).
La gelatina puede servir para estabilizar vacunas, por ejemplo, vacunas liofilizadas, en diferentes fases. La liofilización implica varios extremos, incluyendo extremos de temperaturas, pH, concentraciones de sal, etc. Las reacciones Redox pueden ocurrir cuando se retira el disolvente, y las sustancias solubles se concentran y secan. Varias características de la gelatina, incluyendo su superficie activa, propiedades para adherir, emulsionar y potenciadoras de viscosidad, pueden contribuir a sus efectos estabilizadores cuando se empelan en tales circunstancias.
Mientras que las gelatinas liofilizadas de fuente animal han sido empleadas con cierto éxito, éstas son esencialmente proteínas externas para el sistema humano, y por lo tanto capaces de causar respuestas antigénicas y/o inmunogénicas no deseables. Además, los materiales actualmente disponibles son plagados por problemas de variabilidad y pureza. La preocupación por la presencia de agentes infectivos como TSEs en proteínas derivadas de animales ha llevado a restricciones gubernamentales y reguladoras en relación a la recuperación y uso de tales animales. Por ejemplo, los niveles de endotoxina de materiales comerciales normalmente oscilan entre 1.0 y 1.5 EU/mg de gelatina. (Ver, p. ej., Schaegger, H. y G. von Jagow (1987) Anal. Biochem. 166:368-379; y Friberger, P. et al. (1987) en "Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Ameobocyte Lysate Test," Prog. Clin. Biol. Res. 231:149-169).
Las gelatinas recombinantes de la presente invención empleadas como componente de vacunas, y métodos para producir dicha gelatina recombinante. En un aspecto, la gelatina recombinante es gelatina recombinante humana. En los métodos de la presente invención, los niveles de endotoxina pueden reducirse por dos o tres órdenes de magnitud a partir de aquellos de las gelatinas actualmente disponibles derivadas de fuentes animales. (Ver Ejemplo 8). Por consiguiente, la presente invención proporciona, en una realización, una gelatina recombinante que es virtualmente libre de endotoxinas.
Además, la presente invención proporciona particularmente una gelatina no inmunogénica. En una realización, la presente invención proporciona una vacuna consistente en gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante es gelatina humana. El uso de tal material como componente en formulaciones para vacunas puede reducir el riesgo de inmunogenicidad actualmente presente debido al uso de componentes de gelatina derivados de animales. (Ver, p. ej., Sakaguchi e Inouye, supra; Sakaguchi et al., supra; Nakayama et al., supra; Asher, supra; y Verdrager, supra). El uso de gelatina derivada de secuencias humanas nativas reducirá el riesgo de una respuesta inmunogénica al producto de gelatina tras la administración. En una realización, la presente invención proporciona el uso de gelatinas recombinantes codificadas por construcciones alteradas de colágeno, donde las gelatinas codificadas son no inmunogénicas. (Ver Ejemplo 12). Tales gelatinas recombinantes pueden construirse usando ensayos diseñados para identificar regiones responsables de producir respuestas inmunogénicas y antigénicas, y las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden construirse específicamente para evitar estos dominios.
Además de proporcionar un material de gelatina sin riesgos de antigenicidad, inmunogenicidad e Infectividad asociados con el uso de materiales derivados de animales, la presente invención permite una fuente reproducible de producto consistente. Particularmente, las gelatinas presentes ofrecen una mezcla homogénea de moléculas idénticas. Las características físicas deseadas en una aplicación médica particular pueden introducirse específicamente y lograrse consistentemente. Por consiguiente, la presente invención es capaz de proporcionar un producto fiable y consistente que minimizará la variabilidad asociada con la disponibilidad y uso de productos de gelatina actuales.
Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden diseñarse para poseer propiedades físicas específicas adecuadas para uso en aplicaciones particulares. La presente invención proporciona métodos para variar fas características tales como peso molecular, fuerza de gel, y pH de la formulación final de gelatina para producir gelatinas con propiedades específicas deseadas, y por lo tanto cumple los requisitos del cliente hasta un grado inalcanzable por parte de materiales actualmente disponibles. Además, dichas formulaciones permiten que el cliente explore mejoras de procesos y formulaciones existentes, y que desarrolle nuevas aplicaciones para las gelatinas recombinantes presentes.
Con respecto al problema de pureza, la presente invención proporciona gelatinas recombinantes que virtualmente están libre de endotoxinas. (Ejemplo 8). Además, se eliminan virtualmente los riesgos asociados con variabilidad y con los problemas en reproducción y predicción de comportamiento ya que las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden contener polipéptidos de gelatina con características y comportamientos muy bien definidos. En una realización, la presente invención proporciona una composición formada por una mezcla homogénea de polipéptidos de gelatina recombinante. En una realización adicional, la presente invención proporciona una mezcla heterogénea de polipéptidos de gelatina recombinante.
En una realización, la invención comprende gelatinas recombinantes con pesos moleculares específicos. (Ver Ejemplo 1).
Las gelatinas recombinantes que están formadas por polipéptidos uniformes de pesos moleculares específicos se administran de manera específica. Las gelatinas actualmente empleadas en vacunas son normalmente fragmentos hidrolizados de aproximadamente 60 kDa o menos. Dichos fragmentos son preferentes, por ejemplo, para reducir el riesgo de respuesta inmunogénica a la gelatina. Las gelatinas presentes pueden proporcionarse como polipéptidos de pequeños pesos moleculares. Además, usando los métodos de la presente invención, las gelatinas recombinantes no inmunogénicas específicas pueden construirse identificando regiones en un colágeno o secuencia colagenosa responsables de la producción de una respuesta inmunogénica, y produciendo una gelatina recombinante que no contenga esa región. (Ver, p. ej., Ejemplo 12).
Debe tenerse en cuenta que la gelatina se emplea en el proceso y preparación de vacunas y en la aparición como un componente en las formulaciones para vacunas. Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden emplearse en pasos de preparación y procesamiento, y proporcionar diferentes ventajas sobre los productos derivados de animales actualmente empleados. Por ejemplo, las gelatinas de la presente invención pueden producirse como moléculas consistentes con propiedades definidas y caracterizadas, limitando la variabilidad en la actuación permitiendo un refinamiento y una reproducción de los procedimientos de fabricación.
Las distribuciones de peso molecular de las gelatinas solubles derivadas de animales disponibles en el mercado son aquellas empeladas en la formulación de vacunas, que oscilan entre aproximadamente 0 y 30 kDa y entre aproximadamente 0 y 60 kDa. (Ver Ejemplo 9).
La presente invención proporciona múltiples métodos para I producción de gelatina recombinante del peso molecular apropiado par uso en una aplicación en concreto. Por ejemplo, se obtiene gelatina recombinante con el tamaño apropiado a través de la expresión de gelatina recombinante de una construcción alterada de colágeno (Ver Ejemplo 1).
La presente invención proporciona la producción de gelatinas recombinantes específicamente construidas, mediante la manipulación de enlaces cruzados, hidroxilación, peso molecular, o una combinación de los mismos, para poseer características termales específicas adecuadas para aplicaciones particulares. En un aspecto, la invención proporciona gelatina recombinante, adecuada para uso como agente estabilizador o excipiente para vacunas, que mejora la estabilidad termal, incluso cuando estas vacunas se someten a elevadas temperaturas durante largos periodos de tiempo. En otro aspecto, la presente invención proporciona agentes estabilizadores adecuados para uso en asociación con ciertas vacunas cuyos componentes activos son sensibles al calor, incluyendo vacunas virales como, por ejemplo, fiebre amarillas. En una realización, la presente invención proporciona una gelatina recombinante que estabiliza vacunas a temperatura bajo cero.
Hay que señalar que la presente invención considera particularmente que las gelatinas recombinantes presentes pueden facilitar una fuente aceptable de material para uso por parte de poblaciones cuya religión u otros factores excluyan el uso de materiales derivados de fuentes animales particulares, por ejemplo, de fuentes bovinas o
porcinas.
En una realización, las vacunas de la presente invención pueden fabricarse de forma listo-para-usar, como en jeringuillas rellenas o en forma de microcápsulas, eliminando la necesidad de un posterior proceso antes del uso.
La gelatina hidrolizada se emplea como estabilizador en las actuales formulaciones para vacunas. La presente invención proporciona en una realización una gelatina recombinante con características similares a la gelatina hidrolizada procedente de fuente animal, por ejemplo, pesos moleculares similares, temperaturas de fusión, etc. Estas gelatinas recombinantes pueden producirse directamente a partir de construcciones alteradas de colágeno. La presente invención proporciona gelatinas que son reproducibles y proteínas bien caracterizadas con propiedades definidas. Por lo tanto, las gelatinas recombinantes empleadas, en la preparación y fabricación de vacunas y/o estabilizadores y componentes de vacunas, pueden producirse de acuerdo con los métodos presentes para que tengan características controladas y particulares. El uso de las gelatinas presentes permite por lo tanto que los marcadores de vacunas tengan la oportunidad de afinarse y minimizar la variabilidad en sus procesos de producción, así como usar gelatina recombinante de un modo más efectivo y con unos costos más eficientes en comparación con los productos de origen animal que actualmente se encuentran disponibles.
Particularmente se contempla que las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden usarse en cualquier tipo de vacuna. Por ejemplo, las presentes gelatinas recombinantes pueden usarse en vacunas vivas atenuadas, inactivadas, y vacunas subunidad, en dosis únicas o en vacunas de combinación, en vacunas basadas en virus, basadas en bacterias, basadas en parásitos, y de ácido nucleico, incluyendo vacunas sintéticas y semi- sintéticas.
La presente invención puede formularse de cualquier modo apropiado para la vacuna en particular, por ejemplo, como formulaciones líquidas o secadas por congelación. Más en particular, la invención hace referencia a composiciones que estabilizan vacunas virales líquidas y liofilizadas y fármacos basados en proteínas. Se tienen en consideración diferentes tipos de vacunas, dirigidas a varios microorganismos, incluyendo virus, bacterias y parásitos, etc. Por ejemplo, las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden emplease en la formulación de, p. ej., vacunas vivas, inactivadas, o subunidad.
En un aspecto, la presente invención proporciona una vacuna subunidad consiste en la gelatina recombinante de la presente invención. En una realización adicional, la vacuna subunidad consiste en gelatina recombinante no inmunogénica. En varias realizaciones, la gelatina recombinante se produce directamente a partir de construcciones alteradas de colágeno, en una mezcla homogénea de uniforme peso molecular, y tiene una temperatura de fusión más apropiada para la formulación particular de la vacuna y el mecanismo de envío. En otra realización, la gelatina human recombinante consiste en una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOS: 15 hasta 25, 30, 31 y
33.
Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden emplearse como estabilizadores en cualquier vacuna dirigidas a un agente infectivo. Ejemplos de tales vacunas incluyen, peor no se limitan a, vacunas para virus vaccinia (viruela), virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola, difteria, tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes), tos ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG, tubercuolosis), haemophilus influenzae meningitis, rabia, cólera, plaga, virus de encefalitis japonesa, Salmonella typhi, shigella, hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre amarilla, fiebre aftosa, virus herpes simple, virus sincitial respiratorio, rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus herpes del pavo (Enfermedad de Marek), gripe, virus paragripal, virus sincitial respiratorio (RSV), tifus, neumonía, enfermedad de Lyme y ántrax. El término vacuna tal y como aquí se emplea, incluye referencias a vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes y cánceres que han sido o serán desarrolladas, por ejemplo, vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes y cánceres, p. ej., vacunas para el virus de la inmunodeficiencia (VIH), virus de hepatitis C (VHC), y malaria, y vacunas para cáncer de pecho, pulmón, colon, riñón, vejiga y
ovario.
La presente invención engloba formulaciones dirigidas a varios tipos de envío. Las vacunas pueden formularse para inyección, incluyendo, por ejemplo, inyección subcutánea, parenteral, p. ej., intramuscular, e intravenosa. En una realización, la vacuna es formulada para envío a una superficie de la mucosa, como para envío oral o nasal, en spray, líquido, u otra forma. En un aspecto adicional, tales formulaciones incluyen procesadores de absorción en mucosa cuando es apropiado. Las vacunas formuladas como inhalantes, p. ej., para envío profundo al pulmón, se consideran de manera específica. Dicha vacuna puede formulare, por ejemplo, en forma de polvo fino. Las vacunas de la presente invención también podrían formularse para envío transdérmico y liposomal. Se contemplan de manera particular varias formulaciones adecuadas para, p. ej., liberación entérica.
Las formulaciones para vacunas de la presente invención pueden incluir vacunas que tienen como objetivo ser vacunas comestibles, como vacunas alimenticias, en las cuales el antígeno se envía en forma comestible, como plantas transgénicas, p. ej., patatas, son capaces de inducir la respuesta protectora apropiada. (Ver, p. ej., Tacket, C. O. et al. (2000) J. Infect. Dis. 182:302-305; and Richter, L. J. et al. (2000) Nat. Biotech. 18:1167-1171). Las vacunas de la presente invención pueden facilitarse en forma de plantas transgénicas, p. ej., frutas comestibles, como plátanos o fresas.
La encapsulación de la presente invención, por ejemplo, en microesferas, se considera de manera específica. (Ver, p. ej., Moldoveanu, Z. et al. (1993) J. Inf. Dis. 167:85-90). Se contemplan específicamente las tecnologías de liberación controlada disponibles para aquellos expertos en la técnica pueden aplicarse para obtener formulaciones apropiadas en, por ejemplo, varias formas de liberación, como p. ej., formas de liberación trasndérmica, pulmonar y
polimérica.
Rutas adecuadas de administración pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal o intestinal y envío parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, o intraocular. También se contemplan formulaciones para liberación entérica, etc. La composición puede administrarse de una manera local en lugar de sistémica.
Las técnicas para varias formulaciones y sistemas de envío de fármacos están disponibles en la técnica y se describen en numerosas fuentes. (Ver, p. ej., Remington's Pharmaceutical Siences, supra). La ruta más efectiva y convenientes de administración y la formulación más apropiada para una situación particular puede determinarse sencillamente a través de métodos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos explican la invención con más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se presentan para permitir que aquellos expertos en la técnica comprendan más claramente pongan en práctica la presente invención. Sin embargo, la presente invención no se limita al alcance dado por las realizaciones ejemplificadas, que solamente pretenden ser ilustraciones de aspectos únicos de la invención, y métodos que son funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las aquí descritas resultarán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la precedente descripción y de las figuras acompañantes. Dichas modificaciones pretenden situarse dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
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Ejemplos
A menos que se indique lo contrario, los siguientes materiales y métodos se emplearon en los ejemplos de la presente invención.
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Ejemplo 1
Expresión Directa de Gelatinas Recombinantes
Se amplificaron fragmentos específicos de \alpha1(1) ADN de colágeno humano del tipo I mediante PCR y se clonaron en el plásmido pPICZ\alphaA o pPIC9K (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Los cebadores específicos PCR empleados en la clonación se establecen en la Tabla 1 a continuación. Las gelatinas recombinantes específicas se identifican en la Tabla 2 como SEQ ID Nos: 15 hasta 25, y 30, 31 y 33. Estas gelatinas recombinantes se identifican adicionalmente por referencia a colágeno humano prepro- \alpha1(1). (Número de Acceso Genbank CAA98968). Los plásmidos de expresión empleados contenían secuencias \alpha1(1) cADN de diferentes tamaños fusionadas con la secuencia prepro de secreción factor alpha de apareamiento de levadura. También pueden emplearse otras secuencias señalizadoras conocidas en la técnica, por ejemplo, invertasa de levadura (SUC2), secuencias de fosfatasa ácida de levadura (PHO), la secuencia señalizadora de pro-colágeno nativo, y la secuencia señalizadora para albúmina de suero humano. Debe elegirse una secuencia señalizadora que proporcione el nivel óptimo de expresión para un fragmento específico de gelatina en un sistema específico de expresión.
TABLA 1
1
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TABLA 2
2
Los plásmidos de expresión se insertaron en células Pichia pastoris por medio de electroporación, y las partes transformadas fueron seleccionadas por complementación de una auxotrofía his4 (vectores pPIC9K) o por resistencia a zeocina (vectores pPICZ\alphaA). La expresión de gelatina recombinante fue controlada por parte del promotor de alcohol oxidasa inducible por metanol (P_{AOX1}). Las células huésped Pichia pastoris contenían copias integradas de subunidades \alpha y \beta de proli 4-hidroxilasa humana (P4H), la enzima responsable de la síntesis post-traslacional de hidroxiprolina en colágeno, y que se han descrito previamente. (Ver, p. ej., Vuorela, M. et al. (1997) EMBO J 16:6702-6712).
Las variedades de levadura se cultivaron en medio de glicerol con búfer mínimo, y la expresión de proteína recombinante se produjo usando el mismo medio con metanol (0.5%) sustituido por glicerol como fuente de carbono, tal y como se describe en el Manual de Expresión de Pichia de Invitrogen. Las variedades que produjeron gelatina fueron identificadas por 10-20% análisis SDS-PAGE Tricina de medio acondicionado y la actividad de prolil 4-hidroxilasa en extractos procedentes de cultivos en un matraz de agitación. La co-expresión de prolil 4-hidroxilasa y los fragmentos de colágeno dieron como resultado las gelatinas recombinantes con secuencias humanas nativas.
Los fragmentos se expresaron y segregaron en el medio. Las gelatina recombinante fue cubierta y purificada del medio por medio de precipitación con acetona, cromatografía de intercambio de anión o catión, o una combinación de los mismos. La precipitación con acetona se llevó a cabo a 4ºC a través de la adición de acetona a los sobrenadantes del cultivo libres de células hasta conseguir una concentración final del 40%. El precipitado resultante, consistente principalmente en proteínas endógenas de levaduras, fue recolectado por medio de centrifugación. A continuación, se añadió acetona a este sobrenadante hasta una concentración final del 80%, provocando que la gelatina se precipitara, que a continuación se recogió mediante centrifugación, se dializó durante la noche contra agua, y se liofilizó. Se obtuvo gelatina con elevada pureza mediante una combinación de cromatografía de intercambio de anión y catión. Las purificaciones cromatográficas se llevaron a cabo en temperatura ambiente.
La estimación de los tamaños de proteínas colagenosas por medio de electroforesis, en comparación con el cálculo de peso molecular en base a composición de aminoácido es conocida en la técnica (Butkowski et al. (1982) Methods Enzymol 82:410-423). El análisis de la secuencia N-terminal de las gelatinas recombinantes demostró un correcto procesamiento de la secuencia prepro que se fusionó con los fragmentos de gelatina con el fin de dirigir la proteína hacia la ruta segregadora de levadura. Las gelatinas producidas en este sistema obtuvieron solamente secuencias derivadas de colágeno humano. Además, las gelatinas recombinantes representaron el principal componente del medio acondicionado, ya que la células Pichia pastoris segregan muy pocas proteínas.
Las gelatinas recombinantes expresadas mostraron tamaños discretos, desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 65 kDa tal y como lo midió SDS-PAGE, correspondiendo a gelatinas de 5 kDa (ruta 2, SEQ ID NO:18), 10 kDa (ruta 3, SEQ ID NO:19), 16 kDa (ruta 4, SEQ ID NO:24), 18 kDa (ruta 5, SEQ ID NO:20), 20 kDa (ruta 6, SEQ ID NO:28) (también habiendo calculado el peso molecular de 17,914 Da, no mostrado en la Tabla 1), 33 kDa (ruta 7, SEQ ID NO:27) (también habiendo calculado el peso molecular de 29,625 Da, no mostrado en la Tabla 1), 41 kDa (ruta 8, SEQ ID NO:25), y 50 kDa (ruta 9, SEQ ID NO:22), tal y como se indica en la Figura 1 (ruta 10 representa colágeno humano recombinante hidrolizado del tipo I, preparado tal y como se describe en el Ejemplo 10).
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Ejemplo 2
Actividad de Unión Celular de Soporte a Gelatinas Recombinantes Humanas
Los fragmentos de gelatina recombinante humana de la presente invención demostraron actividad de unión celular in vitro. En el siguiente ensayo, placas con 96 pozos Maxisorp (Nunc) se cubrieron con los siguientes dominios de gelatina recombinante humano procedentes de la cadena \alpha1 de colágeno humano de tipo I, tal y como se describe en el Ejemplo 1 y se lista en la Tabla 2: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, y SEQ ID NO: 22. Colágeno bovino VITROGEN (Cohesion Technologies; Palo Alto, A) y albúmina de suero bovino sirvieron como controles positivo y negativo, respectivamente. Cada una de las proteínas se diluyó a 0.1 mg/ml en 0.1 M NaHCO_{3}, pH 10.0, y las placas de cubrieron durante toda la noche a 4ºC. Se cultivaron células de fibroblastos del prepucio humano (HFF) o células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, de Clonetics, pasaje 5), en las placas cubiertas y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Le grado de unión celular se midió a continuación usando el Reagente WST-1, cuya absorción se leyó a 450 mM en un lector ELISA. La Figura 2A muestra que las gelatinas humanas recombinantes ayudó en la unión HFF a placas Maxisorp, y, para esas células, la unión fue directamente proporcional al peso molecular de la gelatina humana recombinante cubierta en cada pozo. Específicamente, las gelatinas recombinantes de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 ayudaron en la unión HFF en mayor medida que el observado con BSA. La Figura 2B muestra que las diferentes gelatinas recombinantes humanas ayudaron en la unión de célula endotelial. La actividad de unión celular también se demostró con la gelatina recombinante humana preparada por hidrólisis termal de colágeno humano recombinante (descrito a continuación en el Ejemplo 9), usando gelatinas recombinantes de pesos moleculares que oscilan entre 0-30 kDa y 0-50 kDa.
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Ejemplo 3
Identificación de un Fragmento de Gelatina Proteolíticamente Estable
Los fragmentos de gelatina recombinante resultaron estar proteolíticamente modificados durante su expresión y acumulación en el medio de células recombinantes Pichia pastoris. La expresión de varias porciones diferentes del dominio helicoidal de la cadena \alpha1 de colágeno tipo I llevó a la identificación de una gelatina recombinante que tenía estabilidad superior con respecto a proteólisis. Se donaron tres fragmentos diferentes de gelatina en plásmido pPICZ\alphaA, y sus relativas estabilidades se evaluaron
\hbox{durante la
expresión de proteína recombinante en células   Pichia
pastoris .}
La primera variedad empleada se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2, correspondiente a la SEQ ID NO: 19. Se crearon variedades adicionales usando plásmidos codificadores de residuos aminoácidos de dominio helicoidal humano \alpha1 (1) 179-280 (SEQ ID NO: 15) y 615-715 (SEQ ID NO: 23). Estas gelatinas recombinantes se construyeron tal y como se describe en el Ejemplo 1, usando cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7. Los productos PCR se digirieron con XhoI y XbaI, se clonaron y prepararon para electroforación tal y como se ha descrito anteriormente. Se cultivaron las cepas, se provocó la expresión de proteína y los fragmentos de gelatina expresados se compararon mediante SDS-PAGE. La Figura 3 muestra que la gelatina recombinante de SEQ ID NO: 15 (ruta 2) y la gelatina recombinante de SEQ ID NO: 19 (ruta 3) sufrieron proteólisis, mientras que la gelatina recombinante de SEQ ID NO: 23 (ruta 4) permaneció completamente intacta. Este resultado demostró que los fragmentos de gelatina recombinante de la presente invención podían producirse con una estabilidad superior.
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Ejemplo 4
Expresión de Gelatina Recombinante Humana Hidroxilada
No se ha detectado actividad prolil 4-hidroxilasa en levadura. Se ha producido una variedad de Pichia pastoris para expresarprolil 4-hidroxilasa activa y se ha empleado previamente para producir colágeno hidroxilado (Ver, Patente U.S No. 5,593,859). Para expresar gelatina recombinante humana hidroxilada, la variedad se transformó con una cinta de expresión de gelatina que codificó 100 aminoácidos de un recombinante de colágeno humano \alpha1(1) (SEQ ID NO: 19, Tabla 2), generado por PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. El producto de ADN PCR (\sim 330 bp) se asimiló con XhoI-XbaI y se ligó con los puntos XhoI-XbaI de pPICZ\alphaA (Invitrogen), creando plásmido pDO7.
Un fragmento 1048 bp Cel II-Agel se aisló de pDO7 que contenía la porción 3' de la región promotora AOX1, la señal de secreción facto alpha de apareamiento, la gelatina recombinante de SEQ ID NO. 19, la secuencia polienlace de pPICZ\alphaA y 56 parejas base del terminador de trascripción AOX1. Este fragmento fue ligado en los puntos Cel II-Agel de pPIC9K (Invitrogen) para crear pDO41. La cepa \alpha\beta38 de Pichia pastoris (his4) se transformó con plásmido linearizdo StuI pDO41 por medio de electroforación, se emplató sobre placas con mínima dextrosa, y se seleccionaron las partículas transformadas que se complementaban la auxotrofía his4. Se cultivaron aproximadamente 20 transformantes his^{+} y se inducieron con metanol tal y como se describe en el Ejemplo 1. Las variedades que expresaron SEQ ID NO: 19 fueron identificadas a través de análisis SDS-PAGE del medio acondicionado (Figura 4).
Los fragmentos de gelatina recombinante de variedades positivas fueron purificados del medio por medio de precipitación con acetona, y además se analizaron mediante análisis de aminoácido, tal y como se describe, por ejemplo, en Hare, PE. (1977) Methods of Enzymology 47:3-18. El análisis de aminoácido del producto de gelatina de una de las variedades demostró la presencia de hidroxiprolina en las gelatinas recombinantes segregadas. Se determinó que el radio de hidroxiprolina en prolina fue 0.29 en gelatina aislada de la variedad mostrada en la Figura 4, aislada #2, indicando la co-expresión de gelatina y prolil 4-hidroxilasa.
Las gelatinas recombinantes no-hidroxiladas se expresaron y purificaron de una cepa Pichia pastoris que no expresa prolil 4-hidroxilasa. Los residuos de prolina en el interior de esta gelatina recombinante se convirtieron a continuación en residuos de hidroxiprolina in vitro usando actividad de enzima prolil 4-hidroxilasa. Se creó un plásmido de expresión de gelatina a través de PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, llevando a la expresión de gelatina recombinante de SEQ ID NO: 24. El producto PCR con 525 parejas base fue purificado y asimilado con XhoI-XbaI y se ligó con XhoI-XbaI para asimilar pPICZ\alphaA. El plásmido fue linearizado con PmeI y se sometió a electroporación en cepa X-33 Pichia pastoris (Invitrogen). Los transformantes fueron seleccionados por el cultivo sobre placas YDP que contenían 500 \mug/ml zeocina. Las cepas se testaron para localizar expresión de gelatina tal y como se ha descrito anteriormente y la gelatina recombinante no hidroxilada fue purificada del medio de un aislado positivo. El medio acondicionado fue concentrado 10 veces mediante diálisis con presión usando una membrana de corte de 10 kDa de peso molecular, y la muestra fue dializada contra Búfer A (50 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM NaCl). El material dializado fue sometido a cromatografía en una columna Q-sefarosa equilibrada en Búfer A. La gelatina no se une con la columna bajo estas condiciones, y por lo tanto, estuvo presente en la fracción a través del flujo. La mayor parte de las proteínas contaminantes de la levadura unidas a la columna eluyeron con Búfer B (Búfer A + 0.5 M NaCl).
Se dializó la fracción que atravesó el flujo contra 0.5 mM acetato sódico, pH 4.5, y a continuación la gelatina se purificó sobre una columna Q-sefarosa equilibrada en el mismo búfer. La gelatina recombinante se unió a la columna y se eluyó con 0.2 M NaCl. La gelatina purificada, a 1 mg/ml, se desnaturalizó con calor (100ºC durante 10 minutos) y se mezcló con P4H purificado en una enzima a un radio de sustrato de 1:30 en presencia de los siguientes componentes: 50 mM Tris-HCl pH 7.8, 2 mM ascorbato, 2 mM \alpha-ketoglutarato, 0.1 mM FeSO_{4}, 10 \muM DTT, 10 mg/ml albúmina de suero bovino, y 100 unidades de catalasa (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). (Ver, p. ej., Kivirikko, K.I. y Myllyla, R. (1982) Methods in Enzymology 82:245-304; and Vuori, K., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:7467-7470). Se dejó que la reacción actuara a 37ºC durante 16 horas.
A continuación, la gelatina recombinante fue purificada mediante cromatografía sobre Q-sefarosa tal y como se ha descrito anteriormente. Las proteínas unidas se eluyeron de la columna con 0.5 M NaCl y se recolectaron (Figura 5, rutas 7, 8 y 9). Las fracciones que atravesaron el flujo y que se eluyeron fueron analizadas por medio de SDS-PAGE para demostrar la pureza de la gelatina recuperada (Figura 5). El análisis de aminoácido de la gelatina se llevó a cabo tras la diálisis de las fracciones que atravesaron el flujo. (Figura 5, rutas 3 hasta 6). El análisis de aminoácido demostró que la gelatina estaba 87% hidroxilada. La hidroxilación del 100% se consigue cuando el número de moles de hidroxiprolina/moles de prolina + moles de hidroxiprolina en gelatina es igual a 0.5.
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Ejemplo 5
Estabilidad de Gelatinas en Presencia o Ausencia de Prolil 4-hidroxilasa
Una gelatina recombinante de 18 kDa (SEQ ID NO: 20) se expresó de acuerdo con los métodos anteriormente descrito. Los fragmentos expresados fueron analizados mediante electroforesis con gel. La gelatina recombinante expresada en presencia de prolil 4-hidroxilasa tuvo una marcada mayor estabilidad que la gelatina expresa en ausencia de prolil 4-hidroxilasa. (Ver Figura 6).
Un papel de la hidroxilación de prolina en la estabilidad de gelatina recombinante humana y en un aumento de estabilidad se encontró en prolil 4-hidroxilasa que expresa las variedades de Pichia pastoris. Se construyó un plásmido codificador de SEQ ID NO: 20 (pDO32) a través de PCR usando los cebadores SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 7. El producto PCR fue purificado, asimilado, y donado tal y como se ha descrito anteriormente. El mismo fragmento \alpha1(1) cADN se expresó en células huésped que carecían de prolil hidroxilasa, y en células huésped que contenían las subunidades \alpha y \beta de prolil 4-hidroxilasa. Tres variedades de Pichia pastoris se sometieron a electroforesis con PmeI-linearizado pDO32: cepa X-33 (Pichia pastoris tipo salvaje), dos cepas de expresión prolil 4-hidroxilasa: cepa P4H-2, y cepa \alpha\beta8, tal y como se describe en la
\hbox{Patente 
U.S No. 5,593,859, y en Vourela  et al . (1997) EMBO J
16:6702-6712.}
Los transformantes fueron seleccionados por resistencia para 500 \mug/ml zeocina. Se cultivaron 8 aislados de cada transformación y se provocaron tal y como se ha descrito, y la estabilidad de la gelatina recombinante human expresada se analizó mediante SDS-PAGE (Ver Figura 6). En cepa X-33 de Pichia pastoris tipo salvaje, se observaron cantidades aproximadamente equimolares de gelatina recombinante intacta y un fragmento proteolítico (que migraron justo debajo de la gelatina recombinante sobre el gel, indicado por la flecha a la derecha de la figura). (Figura 6, cepa X-33). En ambas cepas que co-expresan prolil 4-hidroxilasa, la cantidad de fragmentos proteolíticos fue significadamente reducido, demostrando que la co-expresión de prolil 4-hidroxilasa junto con gelatina recombinante humana incrementó la estabilidad reduciendo sustancialmente la proteólisis de la gelatina. (Figura 6, cepa P4H-2 y cepa \alpha\beta8).
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Ejemplo 6
Expresión de Gelatina Recombinante Humana Mejorada por la Complementación de Medio de Expresión
Los reporteros anteriores han indicado que el medio complementado con el ácido casamino disminuyó la cantidad de proteálisis vista durante la expresión de cierta proteínas en Pichia pastoris (Clare, J.J. et al., (1991) Gene 105:202-215). La descomposición de la presente gelatina recombinante humana expresada en Pichia pastoris se midió tras el enriquecimiento del medio de expresión con varios complementos. En este estudio en particular, se empleó la cepa \alpha\beta8 de Pichia pastoris descrita en el Ejemplo 5, que expresó fragmento SEQ ID NO: 20 de la gelatina recombinante humana. (Ejemplo 5 y Tabla 2). Las gelatina recombinante se produjo en un medio complementado con una variedad de concentraciones (0-2%) de varios componentes complementarios, induyendo ácidos casamino, casitona, extracto de levadura, peptona, peptamina, triptona, Gelatona, lactoalbúmina, y peptona de soja. Varias formulaciones, induyendo Iactoalbúmina hidrolizada, peptona de soja, casitona, y peptamina (Difco Laboratorios, Detroit, MI) aumentaron los niveles de expresión de gelatina recombinante. (Figura 7, lactoalbúmina y peptona de soja).
Estos resultados indican que los complementos específicos del medio empleados durante la expresión de gelatinas recombinantes puede dar lugar a una mayor producción. En un aspecto, el uso de peptona de soja como complemento en el medio produjo un componente de medio derivado de una planta (en lugar de derivado de un animal) que llevaron a una mayor expresión de gelatina recombinante. Esto proporcionaría un medio libre de materiales animales para la producción de gelatina recombinante que se emplearía en una variedad de aplicaciones.
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Ejemplo 7
(Síntesis)
Aglutinar Gelatinas Recombinantes Humanas
Se preparó un compuesto de colágeno humano recombinante (obtenido tal y como se describe en Patente U.S No. 5,593,859) disolviendo 10.8 mg de colágeno humano recombinante del tipo I en 5 ml e agua, seguido de una diálisis contra 20 mM fosfato sódico, pH 7.2. La concentración final de colágeno recombinante humano del compuesto fue aproximadamente 2 mg/ml. La preparación de gelatina recombinante humana aglutinada se llevó a cabo añadiendo 10 \mul o 5 \mul de una solución 20% 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida hidrodoruro (EDC, Pierce Chemical Co.) a 1 ml del compuesto de colágeno humano recombinante descrito anteriormente. La reacción de ligamento cruzado se dio durante la noche a temperatura ambiente. EDC que no reaccionó fue retirado mediante diálisis contra agua.
Las gelatinas recombinantes humanas aglutinadas fueron analizadas mediante análisis con 6% glicina SDS-PAGE. La Figura 8 muestra una comparación SDS-PAGE de gelatina recombinante humana (ruta 6, etiquetada UNL-5-4), gelatina recombinante humana aglutinada (ruta 5, etiquetada UNL-5-4, 0.1% EDC; ruta 4, etiquetada UNL 5-4, 0.2% EDC), gelatina con cápsula dura disponibles en el mercado (ruta 3), y gelatina disponible en el mercado (Tipo A, de piel porcina, aproximadamente 300 Bloom, ruta 2) obtenida de Sigma Chemical Co. Tal y como se muestra en el análisis SDS-PAGE de la Figura 8, la gelatina en cápsula comercial y la gelatina Sigma contenían cadena \alpha (peso molecular de aproximadamente 110 kDa) como principal componente, así como una mancha de componentes de mayor peso molecular (con peso molecular que oscilaba aproximadamente desde 200 a 250 kDa). La gelatina recombinante human sólo estaba compuesta por cadena \alpha. Sin embargo, tras el aglutinamiento, la gelatina recombinante aglutinada estaba compuesta por cadena \alpha y por una mancha de gelatinas de mayor peso molecular, similar a la observada en gelatina comercial en gelatina comercial en cápsulas. Esto indicó que las gelatinas recombinantes humanas mostraron una distribución del peso molecular similar a las gelatinas comerciales en cápsulas podían producir mediante aglutinamiento de colágeno humano recombinante. Las gelatinas recombinantes aglutinadas se usarían en aplicaciones en las que se deseen una mayor fuerza de gel y una mayor viscosidad.
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Ejemplo 8
Niveles de Endotoxinas de Gelatina Comercialmente Disponibles y Gelatina Recombinante Humana Soluble
Los niveles de gelatina soluble disponible en el mercado en Kina & Knox (K&K) y las gelatinas recombinantes humanas de la presente invención (hechas tal y como se describe en el Ejemplo 9) fueron determinados usando el test de Lisado de Amebocito Limulus, tal y como se conoce en la técnica (Ver, p. ej., Friberger, P. et al. (1987) Prog. Clin. Biol. Res. 231:149-169). Se examinaros tres concentraciones diferentes de gelatina. Tal y como se muestra en la Tabla 3, las gelatinas recombinantes humanas generadas por hidrólisis termal de colágeno recombinante humano del tipo I (rhcl) de la presente invención estaban virtualmente libres de endotoxinas. Los niveles de endotoxina de materiales disponibles en el mercado fueron aproximadamente desde 1 hasta 1.5 EU/mg de proteína. Los métodos para producir gelatina tal y como se describe en la presente invención dieron como resultado gelatinas que presentan niveles de endotoxina sustancialmente más bajos, por dos o tres órdenes de magnitud, que aquellas de las preparaciones comerciales. Dichos niveles bajos de endotoxina hacen que las gelatinas recombinantes de la presente invención sean especialmente atractivas para uso en ciertas aplicaciones, como en uso en estabilización
farmacéutica.
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TABLA 3
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4
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Ejemplo 9
(Comparativa)
Derivación de Gelatina por Hidrólisis Termal y Ácida
Se desarrollaron procedimientos de hidrólisis (ácida, termal y enzimática) para producir gelatinas recombinantes humanas solubles con distribución de peso molecular similar a aquellas de las gelatinas solubles derivadas de animales actualmente disponibles, empleadas, por ejemplo, como estabilizadores en la formulación de vacunas. Para estos experimentos, se emplearon colágeno intacto recombinante humano del tipo I y tipo III como materias iniciales. Variando las condiciones de hidrólisis, fue posible variar los pesos moleculares de los materiales finales, produciendo materiales de definidos pesos moleculares.
Distribución de peso molecular de gelatinas comercialmente disponibles
Estas gelatinas recombinantes humanas fueron comparadas con las gelatinas disponibles en el mercado. Se obtuvieron para caracterización cuatro muestras de gelatina de bajo peso molecular producidas por Leiner Davis, Great Lake, Kind & Knox, y Dynagel. Todas las gelatinas examinadas fueron solubles a temperatura ambiente. Las distribuciones del peso molecular de las gelatinas sobre un gel Tricina SDS-PAGE se muestran en la Figura 9 y se enumeran en la Tabla 4. Los perfiles de gel indicaron que las distribuciones de peso molecular de gelatinas comercialmente disponibles eran de aproximadamente 0-55 kDa, con la excepción de la muestra Dynagel-1, que presentó una distribución de peso molecular de 0-30 kDa. Los perfiles de gel también revelaron dos patrones de distribución de peso molecular. En un ejemplo, derivado de las muestras de Leiner Davis y Great Lake, se observaron varias bandas moleculares discretas mediante SDS-PAGE. El patrón en el segundo ejemplo, derivado de las muestras de Dynagel y Kind & Knox, mostró una continua distribución de material sobre el gel, sin bandas discretas. Las distribuciones de peso molecular de Dynagel-1 y Dynagel-2 fueron bastante diferentes, a pesar de producirse por parte del mismo fabricante y para la misma aplicación. Este resultado indicó que la variación lote-a-lote puede ser bastante significativa en gelatinas actualmente disponibles.
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TABLA 4
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5
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La hidrólisis por calor se llevó a cabo del siguiente modo. Las gelatinas secas disponibles en el mercado se disolvieron en agua a 40ºC-50ºC para hacer una solución 5% gelatina. El pH de la solución se ajustó a o.1N NaOH o 0.1N NCl en preparación para la hidrólisis por calor. Tanto los colágenos humanos recombinantes del tipo I como del tipo II se expresaron en Pichia pastoris y se purificaron, tal y como se describe en la Patente U.S No. 5,593,859. El colágeno humano recombinante final se disolvió en 10 mM HCl, se dializó contra agua, y se Liofilizó. El colágeno humano recombinante liofilizado se disolvió en agua a 40ºC-50ºC para hacer una solución 3%. El pH de la solución se ajustó tal y como se ha indicado antes de la hidrólisis por calor.
La hidrólisis por calor se llevó a cabo en 1 ml Reacti-Vials (Pierce). La temperatura de hidrólisis varió desde 100ºC a 150ºC, dependiendo del experimento. El pH de la solución de hidrólisis varió desde pH 2 a pH 7, tal y como se indica. El tiempo de hidrólisis también varió desde una a treinta y dos horas, dependiendo de la temperatura y del pH de la solución. Las partículas de hidrólisis fueron probadas en varios intervalos de tiempo y se analizaron por SDS-PAGE.
Hidrólisis de Gelatinas Comercialmente Disponibles a 120ºC
Las muestras de gelatinas de elevado peso molecular de Sigma (Tipo A de piel porcina, 250 kDa) se disolvieron en seis soluciones con diferentes pH (5% gelatina) y se hidrolizaron a 120ºC. Las soluciones con pH 2 y pH 3 se hidrolizaron durante dos horas y media y se probaron cada media hora. Las soluciones con pH 4 se hidrolizaron durante cinco horas y se probaron cada hora. Las soluciones con pH 5, pH 6 y pH 7 se hidrolizaron durante 24 horas y se probaron cada 2 horas tras 14 horas de hidrólisis.
Los patrones de hidrólisis fueron analizados en geles Tricina 10-20% SDS tal y como se muestra en las Figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E y 10F. Los perfiles de gel muestran que cuanto más bajo es el pH de la solución, más rápidamente ocurre la hidrólisis de la gelatina. Los perfiles de gel también revelaron dos patrones de hidrólisis entre las partículas de hidrólisis. Un patrón mostró varias bandas moleculares discretas sobre el gel (ver los resultados de hidrólisis ácida de las soluciones pH 2 y pH 3, Figura 10A y 10B), mientras que el otro patrón muestra una distribución continua del material sobre el gel (ver los resultados de hidrólisis de pH 4, pH 5, pH 6, y pH 7, Figura 10C, 10D, 10E, y 10F).
Estos resultados demostraron que el proceso arriba descrito, o variaciones del mismo, produjeron dos tipos diferentes de materia, tal y como se observa en el análisis de gelatinas disponibles comercialmente (bandas discretas vs. una distribución continua del material en SDS-PAGE). Estos resultados experimentales también indicaron que la degradación de calor de gelatina de alto peso molecular generó varios tamaños de gelatinas solubles. La Tabla 5 muestra las distribuciones de peso molecular obtenidas empleando Gelatina Sigma, tras hidrólisis a 120ºC en soluciones con pH 6.0.
TABLA 5
6
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Hidrólisis de Gelatinas Comercialmente Disponibles a 150ºC
Las muestras de gelatinas de elevado peso molecular de Sigma (Tipo A de piel porcina, 250 kDa) se disolvieron en cuatro soluciones con diferentes pH (5% gelatina) y se hidrolizaron a 150ºC durante hasta diez horas. Las partículas de hidrólisis se sometieron a pruebas cada dos horas durante el análisis. Los patrones de la hidrólisis fueron analizados por geles Tricina 10-20% SDS-PAGE tal y como se muestra en las Figuras 11A, 11B, 11 C y 11D. Los perfiles de gel indicaron que la degradación de gelatina ocurrió mucho más rápido a 150ºC que a 120ºC. Además, la hidrólisis de gelatinas producida a 150ºC produjo fragmentos de gelatina de menores pesos moleculares. La Tabla 6 muestra la distribución del peso molecular de Gelatina Sigma, tras hidrólisis a 150ºC en soluciones con pH 6.0.
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TABLA 6
7
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Ejemplo 10
(Comparativa)
Hidrólisis Ácida o Termal de Colágeno I y III Recombinante Humano
El colágeno recombinante humano tipo I fue hidrolizado a 120ºC durante hasta 8 horas bajo condiciones de pH neutro (pH 7), o hasta 3 horas en condiciones de pH ácido (pH 2). El colágeno recombinante humano de tipo III también fue hidrolizado a 120ºC durante hasta seis horas en condiciones neutras y ácidas. La hidrólisis se llevó a cabo tal y como se ha descrito en el Ejemplo 9. Las partículas sometidas a hidrólisis recombinantes humanas del tipo I y tipo III fueron analizadas por geles Tricina 10-20%, mostrados en las Figuras 12A y 12B. Los patrones del gel SDS-PAGE indicaron que la hidrólisis por calor de colágeno recombinante humano fue idéntica a los patrones de hidrólisis de gelatinas de elevado peso molecular derivadas de fuentes naturales (Figura 9, Figuras 10A hasta 10F, y Figuras 11A hasta 11D, y Figuras 12A y 12B). Al igual que la hidrólisis de gelatinas naturales (pH 7), las partículas de hidrólisis ácidas de colágeno recombinante humano mostraron varias bandas moleculares discretas, mientras que las partículas de hidrólisis neutrales mostraron una distribución de peso molecular más continua. La distribución del peso molecular de las partículas de hidrólisis neutrales de gelatina humana recombinante fue aproximadamente 0-70 kDa tras seis-ocho horas de degradación por calor. La hidrólisis bajo condiciones ácidas ocurrió mucho más rápido. Las distribuciones de peso molecular de las partículas ácidas de hidrólisis de gelatina humana recombinante fueron mucho más estrechas, alrededor de 0-10 kDa, tras dos-tres horas de tratamiento.
Como un refinamiento adicional de gelatinas humanas recombinantes hidrolizadas con calor, hemos demostrado la utilidad de una metodología de expresión recombinante multi-gen para la producción de gelatinas humanas con fragmentos discretos de la cadena \alpha1(I) de colágeno humano del tipo I. Esta tecnología nos permitió producir fragmentos de gelatina bien definidos y con alto grado de homogeneidad cuyo tamaño osciló entre 6 y 65 kDa. Esto representa una flexibilidad sin igual en términos de tamaño y propiedades biofísicas de la gelatina que puede emplearse para aplicaciones específicas.
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Ejemplo 11
Hidrólisis Enzimática de Colágeno Recombinante Humano del Tipo I
Colágeno recombinante humano del tipo I se hidrolizó enzimáticamente, usando proteasas establecidas en la Tabla 7. El colágeno recombinante humano del tipo I fue incubado con cada enzima a 37ºC, usando un sustrato para el radio de enzima (w/w) tal y como se indica en la Tabla 7. Los hidrosilatos recombinantes humanos del tipo I obtenidos por tratamiento fueron analizados por geles Tricina 10-20%. Los resultados obtenidos de tratamiento con papaína y proteasa X se muestran en la Figura 13. Los patrones de gel SDS-PAGE indicaron que la hidrólisis enzimática de colágeno recombinante humano condujo a diferentes distribuciones de peso molecular de las gelatinas. La hidrólisis enzimática que usó papaína dio como resultado un patrón continuo de hidrólisis, tal y como se indica en la Figura 13 y en la Tabla 7, mientras que la hidrólisis que usó proteasa X dio como resultado varias bandas de discreto peso molecular. Tal y como se indica en la Tabla 7, las gelatinas recombinantes producidas por este método presentaros diferentes patrones de hidrólisis como resultado del particular tratamiento con hidrólisis enzimática. Esto representa una gran flexibilidad en la producción de tamaños y propiedades biofísicas de la gelatina que puede emplearse para aplicaciones específicas.
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TABLA 7
8
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Ejemplo 12
Anticuerpos para colágeno recombinante humano tipo I dirigidos contra diferentes gelatinas recombinantes
El colágeno recombinante humano del tipo I en la levadura Pichia Pastoris fue sometido a pruebas para su reacción potencial alérgica como sensibilizador de contacto en cerdo de guinea, conocidos como Estudio de Maximización. Tras la duración del estudio, se recogieron sueros para investigar la inmunogenicidad de colágeno recombinante humano del tipo I en cerdo de guinea. Se introdujo un gramo de rhC I en 10 ml de 0.9% Inyección de Cloruro de Sodio (SCI) o aceite de sésamo, y se incubó durante 72 horas a 37ºC. A continuación, se centrifugó el extracto a 3000 rpm durante 15 minutos y se recogió el sobrenadante para dosis.
Los cerdos de Hartley fueron expuestos al artículo del test y a la solución del control por medio de una fase de inducción. Esta fase implicó tres pares de inyecciones intradérmicas (ID) en áreas esquiladas. El primer par de inyecciones ID (craneales) consistieron en emulsiones de Adyuvante Completo de Freíd (FCA) en un volumen igual de SCI. El segundo par de inyecciones ID (centrales) consistieron en el extracto del test (colágeno recombinante humano del tipo I). El tercer par (caudales) consistieron en una emulsión del artículo del extracto del test y un volumen igual de FCA. Los animales de control positivo y negativo fueron tratados de igual modo que los animales del test, excepto que el extracto del test no se incluyó en el segundo y tercer par de inyecciones.
El sexto día tras las inyecciones ID, los puntos del test fueron evaluados para evidencias de irritación. Los puntos del test fueron pre-tratados con 10% SLS en petróleo y se masajearon en la piel empleando una barra de cristal, y a continuación se dejaron sin cubrir durante 24 horas. El séptimo día, se administró una aplicación tópica en las zonas afeitadas de cada animal del test con un disco de 4.25 cm de diámetro de papel filtro Whatman #3 empapado con 0.4 ml del extracto del artículo del test. Trece días después de la aplicación por inducción tópica, se comprobó el estado de los animales. Se rasuró una zona en el costado derecho de cada animal. Al día siguiente, se aplicaron cámaras Hill Top que contenían 0.3 ml del extracto del test, extracto del vehículo control, o soluciones del control positivo en las zonas rasuradas y permanecieron en los animales durante 24 horas. Se realizaron unos cortes en las zonas de las dosis para eritema y edema 24, 48 y 72 horas después de la retirada de las cámaras.
Después de 72 horas, se recogió sangre y se dejo que coagulase, a continuación se centrifugó a 2800 rpm durante 15 minutos. El suero fue retirado de cada tubo y las muestras de suero fueron almacenadas a -70ºC hasta su uso.
A continuación, el suero de los cerdos de Guinea inmunizados fue analizado para la presencia de anticuerpos dirigidos contra colágeno recombinante humano tipo I (rhcl), colágeno recombinante humano tipo III (ncclll), vitrogen (vitr), y varios fragmentos de gelatinas recombinantes humanas de la presente invención, incluyendo fragmentos de 6 kDa (SEQ ID NO: 19), 18 kDa (SEQ ID NO: 20), 33 kDa (SEQ ID NO: 27), 50 kDa (SEQ ID NO: 22) y 65 kDa (SEQ ID NO: 33) (Ver Tabla 2 y Ejemplo 1). El colágeno recombinante humano y la gelatina recombinante fueron sometidos a electroforesis en 8% Tris-Glicina o en geles 10-20% Tricina SDS-PAGE. Se realizó el análisis Western Blot usando anti-suero de cada uno de los cerdos de Guinea empleados en el estudio. La Figura 14 muestra que los anticuerpos específicos de colágeno recombinante humano del tipo I estuvieron presentes en el suero de cerdos de Guinea inmunizados con colágeno recombinante humano del tipo I. No se observó reactividad de anticuerpo a ninguna gelatina recombinante analizada por análisis de Western Blot en ninguno de los sueros examinados. La Figura 14 muestra los resultados del Western Blot usando los antisueros de un cerdo de Guinea del estudio. Se analizaron los sueros de al menos cuatro cerdos diferentes de Guinea, y cada uno de los cuales demostró resultados idénticos a los mostrados en la Figura 14.
Fue deseable aclarar posibles epítopes del colágeno tipo I responsables de la respuesta antigénica observada tras la inyección de rhcl en cerdos de Guinea. El colágeno recombinante humano del tipo I fue separado en sus componentes \alpha1(I) y \alpha2(I) tras la desnaturalización y la cromatografía de columna. Se llevó a cabo una división de bromuro de cianógeno (CNVR) de la cadena \alpha1(I) de colágeno recombinante de tipo I y de la cadena \alpha2(I) del colágeno recombinante de tipo I tal y como se describe en Bornstein y Piez (1966) Biochemistry 5:3460. Las cadenas \alpha intactas y los fragmentos de péptido resultantes se separaron por SDS-PAGE y se analizaron a través de análisis de Western Blotpra reactividad hacia el suero del cerdo de Guinea tal y como se ha descrito anteriormente. La Figura 15A muestra SDS-PAGE tintado con azul de coomassie de cadenas \alpha1(I) y \alpha2(I) intactas y con división CNBr de colágeno recombinante humano del tipo I. El análisis Western Blot mostró que los antisueros del cerdo de Guinea reactivos a rhcl se dirigieron contra la cadena \alpha2(I) de colágeno de tipo I y fragmentos específicos CNBr de la misma. No se detectó reactividad contra la cadena \alpha1 de colágeno de tipo I. (Figura 15B).
El análisis Western Blot arriba descrito examinó la reactividad del suero del cerdo de Guinea para colágeno recombinante humano de tipo I, fragmentos CNBr, y gelatinas recombinantes humanas en virtud de separación electroforética sobre SDS-PAGE. Para examinar la reactividad de los antisueros del cerdo de Guinea con estos polipéptidos bajo condiciones no desnaturalizadas, se realizó un análisis ELISA directo. (Figura 16). Los datos mostraron que los antisueros del cerdo de Guinea reconocieron la conformación nativa de rhcl. Ninguna de las gelatinas recombinantes de la presente invención reaccionó con los antisueros del cerdo de Guinea por ELISA, con independencia de que los fragmentos de gelatina se presentaran antes o después de la desnaturalización termal. El rhcl fue incluso más reactivo en ELISA si se desnaturalizaba con calor antes del análisis (datos no mostrados). Esto indicó que los anticuerpos policlonales en el suero reconocieron en primer lugar los epítopes secuenciados en lugar de las estructuras helicoidales. En conjunto, estos resultados indicaron que las preocupaciones asociadas con el hecho de tener un punto (o puntos) antigénico presente en colágeno humano del tipo I, específicamente con la cadena \alpha2 tal y como se muestra en este ejemplo, podría evitarse a través de métodos de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para generar gelatinas recombinantes que carecen de puntos antigénico, que puede resultar útil para aplicaciones específicas en la que se desee gelatina con baja antigenicidad.
Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas descritos de la invención resultarán aparentes para aquellos expertos en la técnica. A pesar de que la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas preferentes, debería entenderse que la invención tal y como se reivindica no debe limitarse excesivamente a tales realizaciones específicas. Varias modificaciones de los modos descritos para realizar la invención que son obvios para aquellos expertos en la presente técnica y campos relacionados pretender situarse dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
<110> FIBROGEN. INC.
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<120> GELATINAS RECOMBINANTES EN VACUNAS
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<130> FG0224 PCT
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<140>
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<141>
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<160> 33
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 1
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9
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<210> 2
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 2
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10
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<210> 3
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 3
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11
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<210> 4
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 4
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12
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<210> 5
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<211> 54
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 5
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13
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<210> 6
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 6
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14
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<210> 7
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 7
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15
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<210> 8
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> humana
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<400> 8
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16
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<210> 9
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 9
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17
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<210> 10
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<211> 57
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 10
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18
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<210> 11
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<211> 64
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 11
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19
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<210> 12
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 12
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20
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<210> 13
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 13
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21
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<210> 14
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 14
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22
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<210> 15
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<211> 102
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 15
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23
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<210> 16
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<211> 261
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<212> PRT
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<213>
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<400> 16
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24
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25
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<210> 17
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<211> 501
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 17
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<212> PRT
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<213> humano
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<213> humano
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<213> humano
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<213> humano
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<210> 24
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<213> humano
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<210> 25
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<211> 416
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 25
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40
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<210> 26
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<211> 510
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<213> humano
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42
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<210> 27
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<211> 333
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 27
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\hskip0,9cm
43
\hskip1,1cm
44
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<210> 28
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 28
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\hskip0,9cm
45
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<210> 29
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<211> 100
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 29
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\hskip0,9cm
46
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<210> 30
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<211> 62
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 30
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\hskip0,9cm
47
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<210> 31
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<211> 251
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 31
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\hskip0,8cm
48
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<210> 32
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 32
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\hskip0,8cm
49
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<210> 33
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<211> 662
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 33
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51
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52

Claims (31)

1. Una formulación para vacuna que comprende gelatina, donde dicha gelatina es gelatina recombinante consistente en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénti-
cas.
2. La formulación para vacuna de la reivindicación 1, donde los polipéptidos tienen un peso molecular seleccionado del grupo consistente en aproximadamente 1 kDa, aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 8 kDa, aproximadamente 9 kDa, aproximadamente 14 kDa, aproximadamente 16 kDa, aproximadamente 22 kDa, aproximadamente 23 kDa, aproximadamente 44 kDa, y aproximadamente 65 kDa.
3. La formulación para vacuna de las reivindicaciones precedentes, donde dicha gelatina recombinante es gelatina recombinante humana.
4. La formulación para vacuna de las reivindicaciones precedentes, donde la gelatina recombinante se obtiene al expresar una secuencia de polinucleótido derivada de un tipo de colágeno, libre de secuencia codificadora para otro tipo de colágeno, en una célula huésped.
5. La formulación para vacuna de las reivindicaciones precedentes, donde la gelatina recombinante consiste en una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID Nos: 15, hasta 25, y 30, 31, y 33.
6. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es adecuada para envío mediante cualquier envío inyectable, envío nasal, envío oral, envío transdérmico y envío profundo pulmonar.
7. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es líquida.
8. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es seca.
9. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es en forma de polvos.
10. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es en forma de spray.
11. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es en forma de inhalante.
12. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna viva.
13. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna inactivada.
14. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna subunidad.
15. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una única dosis.
16. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende múltiples dosis.
17. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna conjugada.
18. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna de ácido nucleico.
19. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la vacuna de ácido nucleico es una vacuna ADN.
20. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna es una vacuna combinada.
21. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna acelular.
22. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la formulación para vacuna comprende una vacuna formulada para la prevención de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en virus vaccinia (viruela), virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola, difteria, tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes), tos ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG, tuberculosis), haemophilus influenzae meningitis, rabia, cólera, virus de encefalitis japonesa, Salmonella typhi, shigella, hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre amarilla, fiebre aftosa, virus herpes simples, virus sincitial respiratorio, rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus herpes del pavo (Enfermedad de Marek), gripe, y ántrax.
23. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la gelatina recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 1.000 EU/mg.
24. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la gelatina recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 0.500 EU/mg.
25. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la gelatina recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 0.050 EU/mg.
26. La formulación para vacuna de las reivindicaciones 1-5, donde la gelatina recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 0.005 EU/mg.
27. Un estabilizador para vacuna que está formado por gelatina, donde dicha gelatina es gelatina recombinante consistente en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.
28. Un método para producir una vacuna que está formada por gelatina, consistiendo el método en:
proporcionar una vacuna;
proporcionar gelatina;
y combinar la vacuna y la gelatina;
donde dicha gelatina recombinante consiste en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.
29. Uso de gelatina en la fabricación de una vacuna para producir una respuesta inmune en un sujeto, donde dicha gelatina recombinante consiste en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.
30. Un kit, comprendiendo el kit:
(i)
una vacuna que contiene gelatina; y
(ii)
un dispositivo de envío para el envío de la vacuna;
donde dicha gelatina es gelatina recombinante consistente en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.
31. El kit de vacunación de la reivindicación 30, donde el dispositivo de envío es un dispositivo para envío a través de envío inyectable; envío nasal; envío de la mucosa y envío por aerosol.
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