ES2315244T3 - Gelatina recombinante en vacunas. - Google Patents
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Abstract
Una formulación para vacuna que comprende gelatina, donde dicha gelatina es gelatina recombinante consistente en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.
Description
Gelatina recombinante en vacunas.
Esta invención hace referencia a vacunas, y
específicamente, a formulaciones para vacunas que contienen
gelatina recombinante.
Las vacunas son preparaciones de microorganismos
muertos o modificados, organismos vivos atenuados u organismos
vivos completamente virulentos, u otro agente infeccioso,
incluyendo, aunque sin limitar, péptidos, proteínas, macromoléculas
biológicas, o ácidos nucleicos, naturales, sintéticos o
semi-sintéticos, capaces de estimular una respuesta
inmune cuando se administran a un sujeto. Las vacunas son
suministradas con el fin de prevenir o atenuar la severidad de
posterior exposición o una infección con un microorganismo similar.
En vacunas con elementos vivos atenuados, el microorganismo ha sido
tratado normalmente para producir una cepa no virulenta capaz de
provocar inmunidad protectora. En vacunas inactivadas, los
componentes de ácido nucleico microbiales infecciosos son
destruidos antes de la administración, sin afectar la antigenicidad
o inmunogenicidad de la capa viral o las proteínas de la membrana
externa bacterial del microorganismo.
Las vacunas han sufrido cambios radicales en la
salud global. Por ejemplo, en 1980, La Organización Mundial de la
Salud declaró la viruela como erradicada como resultado de los
esfuerzos internacionales relativos a las vacunas. La difteria, tos
ferina, y sarampión, responsables de los elevados índices de
mortalidad infantil, son el centro de atención de los programas
establecidos para inmunización de niños y bebés en países
industrializados, y se realizan continuos esfuerzos por establecer
tales programas en países en vías de desarrollo. Las inmunizaciones
protegen a los niños contra la polio, sarampión, paperas, rubéola
(sarampión alemán), difteria, tos ferina, varicela, hepatitis B, y
Haemophilus influenzae tipo B. Los programas actuales de
inmunización pueden comenzar después de 12 horas tras el
nacimiento, y requieren múltiples inmunizaciones durante los dos
primeros años. La administración de vacunas puede darse en varios
puntos a lo largo de la vida de una persona, por ejemplo, vacunas
estacionales, por ejemplo, "vacuna de la gripe", y vacunas
administradas a los viajeros, etc.
Las vacunas pueden administrarse de varias
formas. Actualmente, las vacunas se administran principalmente a
través de inyección o administración oral. Las formulaciones de
vacunas pueden incluir, por ejemplo, adyuvantes para aumentar la
respuesta inmune, de modo que se precisa menos vacuna para producir
la respuesta inmune protectora deseada. También pueden
administrarse varios excipientes y portadores, contribuyendo a la
consistencia y a la liberación de la vacuna.
Las vacunas también incluyen varios componentes
incluidos en la formulación de la vacuna para mantener la
estabilidad de la vacuna. Tales estabilizadores pretenden mantener
la integridad de la vacuna, conservando la habilidad de la vacuna
para provocar una respuesta inmune protectora tras la
administración. Los estabilizadores empleado en formulaciones para
vacunas incluyen, aunque no se limitan a, agentes químicos y
biológicos que llevan a cabo una variedad de funciones, como, por
ejemplo, detergentes, búferes, sales, azúcares, y varios
componentes proteicos, incluyendo gelatina, y en concreto, gelatina
hidrolizada.
La gelatina es un derivado del colágeno, una
proteína principal estructural y conectora en animales. La gelatina
se deriva de la desnaturalización de colágeno y contiene secuencias
de polipéptidos que tienen repeticiones
Gly-X-Y, donde X e Y son
normalmente residuos de prolina e hidroxiprolina. Estas secuencias
contribuyen en la estructura triple helicoidal y afectan a la
habilidad para melificarse de los polipéptidos de gelatina. La
gelatina que se encuentra actualmente disponible se extrae a través
del procesamiento de pieles y huesos de animales, normalmente de
fuentes bovinas o porcinas. Las propiedades biofísicas de la
gelatina lo hacen un material versátil, comúnmente empleado en una
variedad de aplicaciones e industrias. La gelatina se emplea, por
ejemplo, en productos comestibles y en bebidas y en procesos de
manufactura. Por lo tanto, la gelatina es un producto
comercialmente valioso y versátil.
Normalmente, la gelatina se fabrica a partir de
colágeno que ocurre de manera natural en fuentes bovinas y
porcinas, en particular, a partir de pieles y huesos. En algunos
casos, la gelatina puede extraerse de, por ejemplo, peces, pollos,
o caballos. Las materias primas de la producción habitual de
gelatina, como pieles y huesos bovinos, se originan de animales
sometidos a inspección certificada por el gobierno y aptos para el
consumo por parte de humanos. Existe una preocupación sobre el
riesgo de infección de esta materia prima debido a la presencia de
agentes contaminantes como encefalopatías espongiformes
transmisibles (EETs), en particular encefalopatía espongiforme
bovina (EEB), y escrapie, etc. (Ver, por ejemplo, Rohwer, R. G.
(1996), Dev Biol Stand 88:247-256). Tales cuestiones
son especialmente críticas para la gelatina empleada en
aplicaciones farmacéuticas y médicas.
Recientemente, la preocupación sobre la
seguridad de estos materiales, derivándose una parte significativa
de fuentes bovinas, ha aumentando causando que varios productos con
gelatina se han convertido en el foco de atención de varias medidas
reguladoras para reducir el riesgo potencial de transmisión de
encefalopatía espongiforme bovina (EEB), unida a la nueva variante
de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (nvECJ), una
enfermedad neurológica fatal en humanos. Existe un interés basado
en que los pasos de purificación actualmente empleados en el
proceso de extracción de gelatina a partir de tejidos y huesos
animales pueden no ser suficientes para retirar el riesgo de
infección debido al tejido que transporta la EE contaminante (es
decir, el tejido cerebral, etc.). Los fabricantes de Estados Unidos
y Europa especifican que la materia prima para la gelatina que se
incluye en productos alimenticios para humanos o en aplicaciones
farmacéuticas, médicas o cosméticas no deben obtenerse de un número
creciente de países con EEB. Además, las regulaciones especifican
que ciertas materias, como el tejido cerebral bovino, no se emplean
en la producción de gelatina.
Los procesos actuales de producción incluyen
varios pasos de purificación y limpieza, y pueden requerir modos de
extracción duros y largos. Las pieles y los huesos de los animales
se tratan en un proceso de interpretación, y el material extraído
es sometido a varios tratamientos químicos, incluyendo la
exposición prolongada a soluciones altamente ácidas o alcalinas.
Los numerosos pasos de purificación pueden incluir lavado y
filtración y varios tratamientos con calor. La desmineralización y
los tratamientos con cal se emplean para retirar impurezas como
proteínas sin colágeno. Los huesos deben desgrasarse. Los pasos de
lavado y filtración adicionales, intercambios de ión, y otros
tratamientos químicos y esterilizadores se añaden al proceso para
purificar aún más el material. Además, las sustancias contaminantes
e impurezas pueden continuar tras el proceso, por lo que el
producto de gelatina resultante normalmente se aclara, purifica, y
con frecuencia se concentra antes de estar lista para su uso.
La gelatina comercial generalmente se clasifica
como tipo A o tipo B. Estas clasificaciones reflejan el
pretratamiento recibido en la fuente de extracción como parte del
proceso de extracción. Normalmente, el tipo A se deriva de
materiales procesados con ácido, normalmente pieles de cerdo, y el
tipo B normalmente se deriva de materiales procesados con alcalina
o cal, normalmente huesos (oseína) y pieles bovinas.
En la extracción de gelatina del tipo A, el
proceso normalmente implica someter a las pieles porcinas frescas o
congeladas a sucesivos lavados con agua y a tratamientos con
ácidos diluidos, Las pieles tratados con ácido se vuelven a lavar y
a continuación se someten a repetidos pasos de extracción en los
cuales se tratan con agua caliente, hidrolizando parcialmente el
colágeno presente. Los extractos resultantes, soluciones diluidas de
gelatina, se filtran y evaporan, y los concentrados resultantes se
dejan templar o enfriar hasta formar un gel. A continuación, el gel
se trata en túneles de secado, o con continuos secadores o con
otros dispositivos de secado.
En el proceso con cal, la gelatina de tipo B se
deriva de pieles y recortes de piel de los donantes lavados y
tratados posteriormente con cal. El tratamiento con cal puede
tardar desde un mes a tres meses, y normalmente alrededor de
sesenta días. Las pieles con cal se lavan y tratan con ácidos
diluidos. A continuación las pieles se hidrolizan con agua caliente
y los extractos resultantes se procesan tal y como se ha descrito
anteriormente para el proceso de tratamiento con ácido.
La gelatina de tipo B también puede procesarse a
partir de fuentes óseas. Los huesos duros se lavan, desgrasan, y
filtran con tratamientos sucesivos de ácidos diluidos, como ácido
hidroclórico. El tratamiento con ácido reacciona con los contenidos
minerales del hueso, que se retiran junto con la solución ácida,
dejando los huesos desmineralizados. Esta materia orgánica ósea,
lavada para eliminar el ácido residual, se seca y se abona con cal
inmediatamente. Tras el abono con cal, la oseína se trata a
continuación tal y como se ha descrito anteriormente para la
producción de gelatina a partir de pieles bovinas. En todos los
casos, tras los pasos finales de filtrado, desmineralización,
concentración y secado, el producto de gelatina resultante se divide
en dos lotes o grupos, sometidos a varias pruebas físicas, químicas
y bacteriológicas para determinar el grado y pureza, y el crudo y
la mezcla de acuerdo con los requisitos comerciales. Tanto en el
proceso de extracción del tipo A como el del tipo B, el producto de
gelatina resultante normalmente comprende una mezcla de moléculas
de gelatina, en tamaños que oscilan desde unos pocos miles hasta
varios cientos de miles daltons.
La gelatina del pescado, clasificada como tipo
formador de gel y no formador de gel, y normalmente se procesa como
la gelatina de Tipo A, también se emplea en ciertas aplicaciones
comerciales. Los tipos que forman gel normalmente se derivan de las
pieles de peces en agua caliente, mientras que los tipos que no
forman gel se derivan de peces en agua fría. Las gelatinas de los
pescados tiene composiciones ampliamente varias de aminoácidos, y
se diferencian de las gelatinas animales en que normalmente tienen
proporciones más bajas de residuos de prolina e hidroxipropolina. A
diferencia de las gelatinas animales, las gelatinas de los peces
normalmente se quedan líquidas a temperaturas mucho más bajas,
incluso en pesos moleculares medios comparables. Como otras
gelatinas de animales, la gelatina del pescado se extrae mediante
tratamiento y una posterior hidrolización de la piel del pescado. De
nuevo, como con otros procesos de extracción animal, el proceso de
extraer la gelatina del pescado da como resultado un producto que
carece de homogeneidad.
Se han presentado las reacciones anafilácticas
en las vacunas de sarampión, paperas y rubéola, y la vacuna
combinada sarampión-paperas-rubéola
(MMR). (Sakaguchi e Inouye, 2000, Vaccine,
18:2055-2058; Sakaguchi et al., 1999, J.
Allergy Clin Immunol, 104:695-699). A pesar de la
especulación de que estas reacciones alérgicas fueron causadas por
alergia a las proteínas de huevos presentes en las vacunas, las
reacciones anafilácticas han ocurrido tras la administración de la
vacuna MMR en niños que toleraban los huevos. Se ha descubierto que
la mayoría de las reacciones a vacunas vivas son provocadas por una
sensibilidad adquirida a la gelatina bovina incluida en estas
vacunas. (Ver, por ejemplo, Nakayam et al. (1999) J Allergy
Clin Immunol 103:321-325, y referencias aquí
indicadas; y Sakaguchi et al. (1999) Immunology,
96:286-290).
Estudios han revelado que la anafilaxis en niños
en respuesta a vacunas virales vivas atenuadas que contienen
gelatina es provocada por la gelatina, y que las vacunas
difteria-tétano-tos ferina acelular
(DTaP) que contienen gelatina parecen sensibilizar a los niños
hacia la gelatina. En concreto, se ha identificado una fuerte
relación entre vacunas DTaP que contienen gelatina, producción de
gelatina IgE, y el riesgo de anafilaxis tras la posterior
inmunización con vacunas virales vivas que contienen gelatina
bovina (Sakaguchi e Inouye, supra; Nakayama et al,
supra.).
Las reacciones anafilácticas a vacunas MMR que
incluyen gelatina como estabilizador han sido estudiadas y han
demostrado que son causadas por la gelatina bovina incluida en
estas vacunas. En concreto, la reactividad de IgE a las cadenas
\alpha1 y 2\alpha de colágeno bovino tipo I ha sido
identificada en niños con alergia a la gelatina bovina (Sakaguchi
et al., supra, y referencias aquí citadas). Las
numerosas reacciones anafilácticas y alguna reacciones urticariales
a vacunas de sarampión, paperas y rubéola que contienen gelatina se
han asociado con respuestas alergénicas mediadas por IgE a la
gelatina (Nakayama et al., supra). Se han
identificado anticuerpos IgG específicos de gelatina en niños con
reacciones de tipo sistémico inmediato y no inmediato a vacunas
MMR, lo que sugiere que la respuesta inmune a gelatina no humana
juega un papel en la patogénesis de reacciones sistémicas a vacunas
con virus vivos. (Miyazawa et al., (1999) Vaccine
17:2176-2180; y Celso (1999) J Aller. Clin Immunol.
103:200-202, y referencias aquí citadas).
Dichas reacciones específicas de la vacuna
provocadas por la gelatina son las más importantes en el contexto
de mayor preocupación en relación con el uso de materiales
derivados de animales, por ejemplo, derivados de vacas, con usos
animales o humanos, por ejemplo, en aplicaciones farmacéuticas, y
consumo. Dichas preocupaciones relativas a la seguridad de
materiales de origen bovino se encuentran dirigidas al riesgo de
exposición a agentes infecciosos que pueden sobrevivir o pueden
introducirse en el proceso de extracción y purificación de gelatina
de fuentes animales. (Ver, por ejemplo, Asher (1999) Dev. Biol.
Stand. 99:41-44; y Verdrager (1999) Lancet
354:1304-1305). Una cierta vacuna oral para la
polio empleada solamente en Reino Unido y en la República de
Irlanda ha sido recientemente retirada tras determinarse que se
empleó el suero fetal del ternero bovino procedente del Reino Unido
en la fabricación de la vacuna (Informe de Noticias de la BBC
"Polio vaccine in BSE scare", 20 octubre 2000; Organización
Mundial de la Salud, "WHO Position Statement on Recall of
Evans/Medeva Polio Vaccine in UK", 20 octubre 2000). Las
preocupaciones en torno a la presencia de agentes infecciosos, como
TSEs, así como bacterias y otros patógenos y endotoxinas que pueden
existir tras la extracción, han establecido la necesidad de una
materia seguro y no inmunogénica que pueda emplearse en lugar de
las materias actualmente derivadas de fuentes animales.
Los métodos actuales de extracción dan como
resultado un producto de gelatina que es una mezcla heterogenia de
proteínas, que contiene polipéptidos con distribuciones de peso
molecular de varios ámbitos. A veces es necesario mezclar varios
lotes de producto con el fin de obtener una mezcla de gelatina con
las propiedades físicas apropiadas para uso en una aplicación
deseada. Además, es virtualmente imposible, empleando métodos
actuales de extracción, obtener una gelatina libre de impurezas sin
gelatina, por ejemplo, proteína, lípido, polisacáridos, etc.
Un producto más homogéneo, y producido por
medios más reproducibles, podría ser deseable. La disponibilidad de
una materia homogénea con características físicas reproducibles
sería deseable, por ejemplo, en varios productos y procesos, donde
la disponibilidad de gelatina con características específicas, como
un registro fijo de peso molecular, permitiría una actuación
reproducible y controlada. Por lo tanto, existe la necesidad de un
medio fiable y reproducible para la producción de gelatina que
facilite un producto consistente con características
controladas.
Además, existen preocupaciones en torno a la
inmunogenicidad e infectividad de productos que contienen gelatina
que resultan de productos de fuente animal y métodos para su
preparación (Ver, por ejemplo, Sakaguchi e Inouye, supra;
Sakaguchi et al., supra; Nakayama et al.,
supra; Asher, supra; y Verdrager, supra.). Por
consiguiente, existe una necesidad por una fuente de gelatina
diferente a la actualmente extraída de vacas, cerdos, y otras
fuentes animales.
Los productores y consumidores finales de
gelatina han investigado y testado un número de sustitutos
naturales y sintéticos para la gelatina procedente de fuente animal
actualmente disponible. Se han identificado alternativas para unas
pocas aplicaciones, como el uso de materias primas de celulosa en
cápsulas VCAPS (CAPSUGEL; Morris Plains, NJ), o el uso propuesto de
proteínas del tipo de la gelatina no naturales de secuencias de
colágeno de ratas y ratones en emulsiones fotográficas (Ver, por
ejemplo, Werten, M. W. et al. (1999) Yeast
15:1087-1096; y De Wolf, Anton et al.,
Solicitud Europea Nº EP10141764A2). Sin embargo, para la mayoría de
los productos y procesos con base de gelatina, las características
de actuación de este material no se han duplicado y se han adoptado
sustitutos. Por lo tanto, existe la necesidad de un medio para
producir gelatina de una manera sintética y reproducible donde el
producto resultante puede servir como sustituto racional con las
características de actuación deseadas.
Existe una necesidad de un producto de gelatina
versátil procedente de una fuente no animal que se adapte
fácilmente a diferentes usos y que solucione los problemas
existentes en salud. En particular, con respecto a las vacunas,
existe una necesidad de una materia que minimice de manera seguro
los riesgos de inmunogenicidad, antigenicidad, y/o infectividad de
productos derivados de animales, mientras sirve como un
estabilizador y componente efectivo en formulaciones para
vacunas.
La presente invención responde a las necesidades
proporcionando una materia de sustitución universal, obtenido de
manera recombinante, apropiado para uso en el espectro
extraordinariamente diverso de aplicaciones en las cuales la
gelatina se emplea actualmente. En particular, la presente invención
proporciona gelatina recombinante para uso en formulaciones para
vacunas. Las materias presentes pueden diseñarse para poseer
propiedades y características deseadas para aplicaciones
específicas, y pueden por lo tanto sustituir a las gelatinas
procedentes de fuentes animales actualmente disponibles así como
proporcionar nuevas propiedades y usos previamente no
disponibles.
La presente invención está dirigida al uso de
gelatina en vacunas. La gelatina de la presente invención es
gelatina recombinante consistente en polipéptidos de peso molecular
uniforme, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas
idénticas. Por consiguiente, en una realización, la presente
invención proporciona una formulación para vacuna que comprende la
gelatina recombinante. En una realización preferente, la gelatina
recombinante es gelatina humana. Un aspecto adicional de la
presente invención indica que la gelatina recombinante no es
inmunogénica.
En una realización, la presente invención
proporciona una formulación para vacuna que comprende la gelatina
recombinante, donde la gelatina recombinante confiere estabilidad a
temperatura ambiente. En otra realización, la gelatina se deriva de
secuencia de colágeno no nativa.
Se consideran formulaciones que contiene
gelatinas específicas recombinantes. En ciertas realizaciones, la
gelatina recombinante tiene un peso molecular seleccionado del
grupo consistente en aproximadamente 1 kDa, aproximadamente 5 kDa,
aproximadamente 8 kDa, aproximadamente 9 kDa, aproximadamente 14
kDa, aproximadamente 16 kDa, aproximadamente 22 kDa,
aproximadamente 23 kDa, aproximadamente 44 kDa, y aproximadamente
65 kDa.
La presente invención proporciona, en una
realización, una formulación para vacuna que comprende la gelatina
recombinante, donde la gelatina recombinante se obtiene expresando
una secuencia de polipéptido derivada de un tipo de colágeno, sin
la secuencia codificadora de cualquier otro tipo de colágeno, en
una célula huésped. En varios aspectos, se administra una
formulación para vacuna que contiene la gelatina recombinante,
donde la gelatina recombinante se produce directamente desde un
constructo alterado de colágeno.
En realizaciones específicas, la presente
invención engloba formulaciones para vacunas que comprenden una
secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID Nos:15 a
través de 25, 30, 31, y 33.
Las formulaciones para vacunas de la presente
invención pueden ser adecuadas para varios modos de envío,
incluyendo el envío por inyección, envío nasal, envío oral, envío
transdérmico, y envío pulmonar profundo. Las formulaciones para
vacunas de la presente invención pueden formularse en un número de
modos, por ejemplo, en forma líquida, seca, polvos, spray y
mediante inhalador. En varias realizaciones, las presentes
formulaciones para vacunas pueden comprender por vacunas vivas,
inactivadas, subunidades, dosis únicas, dosis múltiples,
conjugados, ácido nucleico, ADN, vacunas combinadas y acelulares.
Se consideran vacunas específicas, incluyendo, aunque sin limitar,
vacunas formuladas para la prevención de una enfermedad
seleccionada del grupo consistente en virus vaccinia (viruela),
virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola, difteria,
tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes), tos
ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG,
tubercuolosis), haemophilus influenzae, meningitis, rabia,
cólera, virus de encefalitis japonesa, salmonella, shigella,
hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre amarilla, fiebre
aftosa, virus herpes simples, virus sincitial respiratorio,
rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus herpes del pavo
(Enfermedad de Marek), gripe, y ántrax.
En algunas realizaciones, la presente invención
proporciona formulaciones para vacunas que consisten en la gelatina
recombinante, donde la gelatina recombinante tiene niveles de
endotoxina inferiores a 1.000 EU/mg, 0.500 EU/mg, 0.050 EU/mg, y
0.005 EU/mg. En un aspecto, la presente invención engloba una
formulación para vacuna que comprende la gelatina recombinante
donde la gelatina recombinante es proteolíticamente estable. Se
considera un estabilizador de vacuna que comprende la gelatina
recombinante. La presente invención proporciona métodos para
producir formulaciones para vacunas que comprenden la gelatina
recombinante. En una realización, el método comprende administrar
la gelatina recombinante y administrar una vacuna, y combinar la
gelatina recombinante y la vacuna. También se facilita el uso de la
gelatina recombinante en la fabricación de una vacuna para provocar
una respuesta inmune en un sujeto. Además, también se contemplan
kits que comprenden una vacuna constituida por la gelatina
recombinante y un dispositivo de envío para la vacuna. En varias
realizaciones, el dispositivo de envío es un dispositivo adecuado,
por ejemplo, para envío inyectable, nasal, a través de la mucosa o
mediante aerosol.
La Figura 1 expone los resultados que muestran
la expresión de gelatinas recombinantes.
Las Figuras 2A y 2B exponen los resultados que
demuestran que las gelatinas recombinantes mantienen la unión
celular.
La Figura 3 expone los resultados que demuestran
la producción de gelatinas recombinantes proteolíticamente
estables.
La Figura 4 expone resultados que demuestran la
producción de gelatinas recombinantes hidroxiladas.
La Figura 5 expone resultados que muestran la
purificación de gelatina recombinante después de la hidroxilación
in vitro.
La Figura 6 expone resultados que muestran la
estabilidad de gelatinas recombinantes expresadas en la presencia o
ausencia de
prolil-4-hidroxilasa.
La Figura 7 expone resultados que muestran la
expresión mejorada de gelatina recombinante por la suplementación
de medios de expresión.
La Figura 8 expone resultados comparando las
gelatinas comercialmente disponibles con la gelatina recombinante
cruzada.
La Figura 9 expone resultados comparando la
distribución del peso molecular de gelatinas comercialmente
disponibles.
Las Figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, y 10F
exponen resultados que muestran la hidrólisis de gelatinas
comercialmente disponibles llevada a cabo a 120ºC.
Las Figuras 11A, 11B, 11C y 11D exponen
resultados que muestran la hidrólisis de gelatinas comercialmente
disponibles llevada a cabo a 150ºC.
Las Figuras 12A y 12B exponen resultados
mostrando la hidrólisis ácida y termal de colágeno humano
recombinante del tipo I y tipo III.
La Figura 13 expone resultados que muestran la
hidrólisis enzimática de colágeno humano recombinante de tipo I.
La Figura 14 expone un análisis Western Blot de
colágenos humanos recombinantes y gelatinas humanas recombinantes
usando antisuero de cerdos de Guinea inmunizados con colágeno
humano recombinante del tipo I.
Las Figuras 15 A y 15B exponen resultados
mostrando que el antisuero de cerdos de Guinea inmunizados con
colágeno humano recombinante del tipo I es reactivo con fragmentos
específicos de bromuro de cianógeno de colágeno del tipo I.
La Figura 16 expone resultados ELISA que
muestran que el antisuero de cerdos de Guinea inmunizados con
colágeno humano recombinante del tipo I no es reactivo con
gelatinas humanas recombinantes.
Antes de describir las presentes proteínas,
secuencias de nucleótidos, y métodos, debe entenderse que esta
invención no se limita a la particular metodología, protocolos,
líneas celulares, vectores y reagentes aquí descritos, ya que estos
pueden variar. También debe entenderse que la terminología aquí
empleada tiene el fin de describir únicamente realizaciones
particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente
invención.
Debe observarse que tal y como aquí se emplean,
y en las reivindicaciones ajuntas, las formas singulares "un",
"una", "uno" y "el", "la" incluyen referencias
plurales a menos que se indique claramente lo contrario. Por lo
tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula huésped" hace
referencia a una o más células huésped y equivalentes de las mismas
conocidos por aquellos expertos en la técnica, y la referencia a
"un anticuerpo" hace referencia a uno o más anticuerpos y
equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en la
técnica, y etcétera.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos aquí empleados tienen los
significados comúnmente entendidos por un experto en la técnica a
la que la invención pertenece. A pesar de que algunos métodos y
materiales similares a los aquí descritos pueden emplearse en la
práctica o en las pruebas de la presente invención, a continuación
se describen los métodos, dispositivos y materiales preferentes.
Todas las publicaciones aquí mencionadas de incorporan como
referencia con el propósito de describir y exponer las líneas
celulares, vectores, y metodologías, etc, que se incluyen en las
publicaciones que pueden emplearse en relación con esta invención.
Nada aquí descrito debe interpretarse como un reconocimiento de que
la invención no merece preceder a tal exposición por virtud de la
invención anterior. Cada referencia aquí citada se incorpora por
referencia en su
totalidad.
totalidad.
La práctica de la presente invención empelará, a
menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de
química, bioquímica, biología molecular, inmunología y
farmacología, en la técnica en cuestión. Tales técnicas se explican
completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Gennaro, A.R.,
ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack
Publishing Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In
Enzymology, Academic Prss, Inc.; Handbook of Experimental
Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C.
Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications);
Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Vols. I-III, Cold
Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds.
(1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, John Wiley
& Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology
Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR
(Introduction to Biotechniques Series) 2ª ed. (Newton & Graham
eds., 1997, Springer Verlag).
El término "colágeno" se refiere a
cualquiera de los tipos conocidos de colágeno, incluyendo colágeno
de tipo I hasta tipo XX, así como otros colágenos, ya sean
naturales, sintéticos, semi-sintéticos o
recombinantes. El término también engloba procolágenos. El término
colágeno engloba cualquier polipéptido de cadena sencilla
codificado por un polinucleótido sencillo, así como unidades
homotriméricas y heterotriméricas de cadenas de colágeno. El
término "colágeno" engloba específicamente variantes y
fragmentos de los mismos, y equivalentes funcionales y derivados de
los mismos, que preferiblemente retienen al menos una
característica estructural y funcional de colágeno, por ejemplo, un
dominio (Gly-X-Y)_{n}.
El término "procolágeno" se refiere a un
procolágeno correspondiente a cualquier tipo de colágeno desde el
tipo I hasta el tipo XX, así como a un procolágeno correspondiente
a otros colágenos, ya sean naturales, sintéticos,
semi-sintéticos o recombinantes, que posean
propéptidos o telopéptidos adicionales de
terminal-C y/o terminal-N que ayuden
en el montaje, solubilidad, purificación, o cualquier otra función,
y que a continuación se parten por N-proteinasa,
C-proteinasa, u otras enzimas, por ejemplo, enzimas
proteolíticas asociadas con la producción de colágeno. El término
procolágeno engloba específicamente variantes y fragmentos del
mismo, y equivalentes y derivados funcionales del mismo, que
preferiblemente retienen al menos una característica estructural y
funcional de colágeno, por ejemplo, un dominio
(Gly-X-Y)_{n}.
"Gelatina" tal y como aquí se emplea hace
referencia a cualquier gelatina, ya sea extraída mediante método
tradicional o de origen recombinante o biosintético, o a cualquier
molécula que tenga al menos una característica estructural y/o
funcional de la gelatina. Actualmente, la gelatina se obtiene
mediante extracción de colágeno derivado de fuentes animales (por
ejemplo, ganado bovino, ganado porcino, roedores, pollos, caballos,
peces, etc.), por ejemplo, huesos y tejidos. El término gelatina
engloba tanto la composición de más de un polipéptido incluido en
un producto de gelatina, así como un polipéptido individual que
contribuye en el material de gelatina. Por lo tanto, el término
gelatina recombinante tal y como aquí se emplea en referencia a la
presente invención engloba tanto un material de gelatina
recombinante que contiene los presentes polipéptidos de gelatina
como un polipéptido individual de gelatina de la presente
invención.
Los polipéptidos de los cuales la gelatina se
puede derivar son polipéptidos tales como colágenos, procolágenos,
y otros polipéptidos que tienen al menos una característica
estructural y/o funcional de la gelatina. Dicho polipéptido podría
incluir una cadena sencilla de colágeno, o un homotrimero o
heterotrimero de colágeno, o fragmentos, derivados, oligómeros,
polímeros, o subunidades de los mismos, conteniendo al menos un
dominio de colágeno (una región
Gly-X-Y). Específicamente, el
término contempla secuencias injertadas no encontradas en la
naturaleza, como construcciones de colágeno alteradas, etc. Una
construcción de colágeno alterada es un polinucleótido que
comprende una secuencia que está alterada, por medio de
eliminaciones, adiciones, sustituciones, u otros cambios,
procedente de un gen de colágeno que ocurre de manera natural.
Un "adyuvante" es un agente añadido a un
fármaco o vacuna para aumentar, mejorar o sino ayudar en su
eficacia. Un adyuvante empleado en una formulación para una vacuna
podría ser un agente inmunológico que mejora la respuesta inmune
produciendo un estimulador no específico de la respuesta inmune.
Los adyuvantes se emplean con frecuencia en vacunas no vivas.
Los términos "alelo" o "secuencia
alélica" se refieren a formas alternativas de secuencias
genéticas. Los alelos pueden resultar de al menos una mutación en
la secuencia de ácido nucleico y pueden dar como resultado mARNs o
polipéptidos alterados cuya estructura o función puede o no estar
alterada. Cualquier gen natural o recombinante puede tener ninguna,
una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que
otorgan una mejora a los alelos generalmente se atribuyen a
eliminaciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos.
Cada uno de estos tipos de cambio puede ocurrir solo, o en
combinación con otros, una o más veces en una secuencia dada.
Secuencias de polinucleótidos "alterados"
incluyen aquellas con eliminaciones, inserciones o sustituciones de
diferentes nucleótidos que resultan en un polinucleótido que
codifica el mismo polipéptido o un polipéptido funcionalmente
equivalente. Se incluyen en esta definición secuencias que muestran
polimorfismos que pueden o no detectarse fácilmente usando
cebadores particulares para oligonucleótidos o a través de la
eliminación de hibridización impropia o inesperada de alelos, con
un locus diferente al locus cromosomal normal para la secuencia de
polinucleótido del sujeto.
Polipéptidos "alterados" pueden contener
eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos de
aminoácido que producen un cambio silencioso y que dan como
resultado un polipéptido funcionalmente equivalente. Las
sustituciones intencionadas de aminoácido pueden realizarse en base
a la similitud, polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad,
hidrofilicidad, y/o la naturaleza antipática de los residuos
siempre y cuando la actividad biológica e inmunológica del
polipéptido codificado se retenga. Por ejemplo, los aminoácidos con
carga negativa pueden incluir ácido aspártico y ácido glutámico;
los aminoácidos con carga positiva pueden incluir lisina y guanina;
y los aminoácidos con grupos polares sin carga que tienen similares
valorasen hidrofilicidad pueden incluir leucina, isoleucina, y
valina, glicina y alanina, asparagina y glutamina, serina y
treonina, y fenilalanina y tirosina.
Las secuencias de "aminoácido" o
"polipéptido" o "polipéptidos", ya que aquí se emplean
estos términos, hacen referencia a secuencias de oligopéptido,
péptido, polipéptido y proteína, y fragmentos de las mismas, y a
moléculas que ocurren naturalmente o sintéticas. Los fragmentos de
polipéptido o aminoácido son una parte de un polipéptido que
retiene al menos una característica estructural y/o funcional del
polipéptido. En al menos una realización de la invención, los
fragmentos de polipéptido son aquellos que retienen al menos una
región (Gly-X-Y)_{n}.
El término "animal" tal y como se emplea en
referencia, por ejemplo en "colágenos animales" engloba
cualquier colágeno, derivado de fuentes animales, ya sea natural,
sintético, semi-sintético o recombinante. Las
fuentes animales incluyen, por ejemplo, fuentes mamíferas,
incluyendo, pero sin limitar, fuentes de ganado bovino, porcino,
roedores, caballos y ganado ovino, y otras fuentes animales,
incluyendo, pero sin limitar, pollos y fuentes de peces, y fuentes
de animales no vertebrados.
"Antigenicidad" hace referencia a la
habilidad de una sustancia para, cuando se introduce en el cuerpo,
estimular una respuesta inmune y la producción de un anticuerpo. Un
agente que muestra la propiedad de antigenicidad es denominado
antigénico. Los agentes antigénicos pueden incluir, pero sin
limitación, una variedad de macromoléculas como, por ejemplo,
proteínas, lipoproteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos,
bacterias y componentes bacteriano, y virus y componentes
virales.
Los términos "complementario" y
"complementariedad", tal y como aquí se emplean, se refieren
al enlace natural de polinucleótidos mediante emparejamiento de
bases. Por ejemplo, la secuencia
"A-G-T" se enlaza con la
secuencia complementaria
"T-C-A". La complementariedad
entre dos moléculas de cadena sencilla puede ser "parcial",
sólo cuando algunos de los ácidos nucleicos se enlazan, o pueden
ser completas cuando existe una total complementariedad entre las
moléculas de cadena sencilla. El grado de complementariedad entre
cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativo sen la
eficacia y fuerza de hibridización entre cadenas de ácido nucleico.
Esto es particularmente importante en reacciones de amplificación,
que dependen del enlace entre cadenas de ácido nucleico, y en el
diseño y uso, por ejemplo, de moléculas de ácido nucleico péptido
(PNA).
Una "eliminación" es un cambio en una
secuencia de aminoácido o nucleótido que da como resultado la
ausencia de uno o más residuos de aminoácido o nucleótidos.
El término "derivado", tal y como se aplica
a polinucleótidos, hace referencia a la modificación química de un
polipéptido codificador de un polipéptido en particular o
complementario con un polinucleótido codificador de un polipéptido
en particular. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo,
sustitución de hidrógeno por un alquilo, acilo, o grupo amino. Tal
y como aquí se emplea con referencia a polipéptidos, el término
"derivado" se refiere a un polipéptido que se modifica, por
ejemplo, mediante hidroxilación, glicosilación, pegilación, o
mediante otro proceso similar. El término "derivados" engloba
aquellas moléculas que contienen al menos una característica
estructural y/o funcional de la molécula de la cual se deriva.
Se dice que una molécula es un "derivado
químico" de otra molécula cuando contiene fracciones químicas
adicionales que normalmente no constituyen una parte de la
molécula. Tales fracciones pueden mejorar la solubilidad de la
molécula, la absorción, la esperanza de vida biológica y efectos
similares. Las fracciones, de manera alternativa, pueden hacer
descender la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier
efecto secundario no deseado de la molécula, y efectos similares.
Las fracciones capaces de mediar tales efectos generalmente están
disponibles en la técnica y pueden encontrarse por ejemplo en
Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Los
procedimientos para enlazar tales fracciones o radicales son bien
conocidos en la técnica.
Un "excipiente", tal y como se emplea aquí
el término, es cualquier sustancia inerte empleada como diluyente o
vehículo en la formulación de un fármaco, una vacuna, u otra
composición farmacéutica, con el fin de conferir una consistencia o
forma adecuada al fármaco, vacuna, o composición farmacéutica.
El término "equivalente funcional", tal y
como aquí se emplea, hace referencia a un polipéptido o
polinucleótido que posee al menos una característica funcional y/o
estructural de un polipéptido o polinucleótido particular. Un
equivalente funcional puede contener modificaciones que permitan la
actuación de una función específica. El término "equivalente
funcional" pretende incluir fragmentos, mutantes, híbridos,
variantes, análogos, o derivados químicos de una molécula.
Una "proteína fusión" es una proteína en la
que las secuencias péptidas de diferentes proteínas están unidas de
manera operable.
El término "hibridización" se refiere al
proceso por el cual la secuencia de ácido nucleico se enlaza con la
secuencia complementaria por medio del emparejamiento de bases. Las
condiciones para la hibridización pueden definirse, por ejemplo,
mediante concentraciones de sal de formamida en la prehibridización
y soluciones de hibridización, o mediante temperatura de
hibridización, y son bien conocidas en la técnica. La hibridización
puede darse bajo varias condiciones rigurosas.
En particular, la rigurosidad o exactitud puede
aumentar reduciendo la concentración de sal, aumentando la
concentración de formadita, o elevando la temperatura de
hibridización. Por ejemplo, para propósitos de la presente
invención, la hibridización bajo condiciones de alta rigurosidad
ocurre en aproximadamente 50% formadida a aproximadamente 37ºC a
42ºC, y bajo condiciones de baja rigurosidad en aproximadamente 35%
a 25% formadida a aproximadamente 30ºC a 35ºC. En particular, la
hibridización ocurre en condiciones de elevada rigurosidad a 42ºC
en 50% formadida, 5X SSPE, 0.3% SDS, y 200 \mug/ml ADN de esperma
de salmón cortado y desnaturalizado.
El rango de temperatura correspondiente a un
nivel particular de rigurosidad puede limitarse además por medio de
métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, calculando la purina
con el radio de pirimidina del ácido nucleico de interés y
ajustando la temperatura al respecto. Para retirar las señales no
específicas, a continuación se pueden lavar las manchas, por
ejemplo, a temperatura ambiente bajo condiciones rigurosas de hasta
0.1X SSC y 0.5% SDS. Variaciones en los rangos y condiciones
mencionadas son bien conocidas en la técnica.
"Inmunogenicidad" se refiere a la habilidad
para producir una respuesta inmune en un organismo. Un agente que
demuestra la propiedad de inmunogenicidad es referido como
inmunogénico. Los agentes pueden incluir, aunque sin limitar, una
variedad de macromoléculas como, por ejemplo, proteínas,
lipoproteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, bacterias y
componentes bacterianos, y virus y componentes virales. Los agentes
inmunogénicos tienen a menudo un peso molecular bastante alto
(normalmente superior a 10 kDa).
"Infectividad" hace referencia a la
habilidad para ser infeccioso o la habilidad para producir
infección, en referencia a la invasión y multiplicación de
microorganismos, como bacterias o virus en el cuerpo.
Los términos "inserción" o "adición"
se refieren a un cambio en una secuencia de polipéptido o
polinucleótido que da como resultado la adición de uno o más
residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en
comparación con la molécula que ocurre de manera natural.
El término "aislado" tal y como aquí se
emplea, hace referencia a una molécula separada no sólo de
proteínas, etc., que están presentes en la fuente natural de la
proteína, sino también de otros componentes en general, y
preferiblemente hace referencia a una molécula encontrada en la
presencia de, si hay algo, únicamente un disolvente, búfer, ión, u
otro componente normalmente presente en una solución de este tipo.
Tal y como aquí se emplean, los términos "aislado" y
"purificado" no engloban moléculas presentes en su fuente
natural.
El término "micromatriz" se refiere a una
disposición de ácidos nucleicos, aminoácidos, anticuerpos, etc., en
un sustrato. El sustrato puede ser cualquier soporte adecuado, por
ejemplo, gotas, cristal, papel, nitrocelulosa, nylon, o cualquier
membrana apropiada, etc. Un sustrato puede ser cualquier soporte
rígido o semi-rígido, incluyendo, pero sin limitar,
membranas, filtros, láminas, pastillas, portaobjetos, fibras,
gotas, incluyendo gotas magnéticas y no magnéticas, geles, tubos,
placas, polímeros, micropartículas, capilares, etc. El sustrato
puede proporcionar una superficie para cubrir y/o puede tener una
variedad de formas superficiales, como pozos, anillas, zanjas,
canales, y poros, e los cuales se colocan los ácidos nucleicos,
aminoácidos, etc.
El término "microorganismo" puede incluir,
aunque sin limitación, virus, bacterias, clamidia, rickettsia,
micoplasmas, ureaplamas, hongos, y parásitos, incluyendo parásitos
infecciosos como los protozoanos.
Los términos secuencias de "ácido nucleico"
o de "polinucleótido" o "polinucleótidos" se refieren a
oligonucleótidos, nucleótidos, o polinucleótidos, o fragmentos de
los mismos, y a ADN o ARN de origen natural o sintético que puede
ser de cadena sencilla o de cadena doble y pueden representar la
cadena de sentido o antisentido, con el ácido nucleico péptido
(PNA), o con material similar a ADN o ARN de origen natural o
sintético. Los fragmentos de polinucleótido son cualquier porción
de una secuencia de polinucleótido que retiene al menos una
característica estructural o funcional del polinucleótido. En una
realización de la presente invención, los fragmentos de
polinucleótido son aquellos que codifican al menos una región
(Gly-X-Y)_{n}. Los
fragmentos de polinucleótido pueden tener longitudes variables, por
ejemplo, más de 60 nucleótidos en longitud, al menos 100
nucleótidos en longitud, al menos 1000 nucleótidos en longitud, o
al menos 10,000 nucleótidos en longitud.
La frase "similitud porcentual" (similitud
%) hace referencia al porcentaje de similitud secuencial encontrada
en una comparación de dos o más secuencias de polipéptido o
polinucleótido. La similitud porcentual entre secuencias de
aminoácido puede calcularse usando el método Clustal. (Ver, por
ejemplo, Higgins, D. G. y P. M. Sharp (1988) Gene
73:237-244). El algoritmo Clustal agrupa secuencias
en grupos examinando las distancias entre todas las parejas. Los
grupos se alinean en parejas y posteriormente en grupos. La
similitud porcentual entre dos secuencias de aminoácido, por
ejemplo, secuencia A y secuencia B, se calcula dividiendo la
longitud de la secuencia A, menos el número de residuos de
separación en la secuencia A, menos el número de residuos de
separación en la secuencia B, y sumando las coincidencias de
residuos entre la secuencia a y secuencia B, y multiplicándolo por
cien. Los espacios de poca o nula homología entre las dos
secuencias de aminoácido no se incluyen en la determinación de
similitud porcentual. La similitud porcentual puede calcularse
mediante otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo,
variando las condiciones de hibridización, y puede calcularse
electrónicamente usando programas tales como el programa MEGALIGN
(DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin).
Tal y como aquí se emplea, el término
"planta" incluye una referencia a una o más plantas, es decir,
cualquier organismo autotrófico eucariótico, como angiospermas y
gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas, etc., incluyendo,
pero sin limitar, soja, algodón, alfalfa, lino, tomate, azúcar,
remolacha, girasol, tabaco, maíz, trigo, arroz, lechuga, plátano,
mandioca, alazor, oleaginosa, colza, mostaza, canola, cáñamo,
algas, alga parda, etc. El término "planta" también engloba
una o más células de plantas. El término "células de plantas"
incluye, pero sin limitar, tejidos vegetales y órganos tales como
las semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones
meristemáticas, tejidos de callos, hojas, raíces, brotes,
gametofitos, esporofitos, polen, tubérculos, bulbos, flores,
frutos, piñas, microesporas, etc.
El término "enzima
post-traslacional" se refiere a una enzima que
cataliza una modificación post-traslacional de, por
ejemplo, un colágeno o procolágeno. El término engloba, pero sin
limitarse a, por ejemplo, prolil hidroxilasa, peptidil prolil
isomerasa, colágeno galactosil hidroxililisil glucosil transferasa,
hidroxilisil galactosil transferasa, C-proteinasa,
N-proteinasa, lisil hidroxilasa, y lisil
oxidasa.
Tal y como aquí se emplea, el término
"promotor" generalmente se refiere a una región reguladora de
secuencia de ácido nucleico capaz de iniciar, dirigir y mediar la
trascripción de una secuencia de polinucleótido. Los promotores
pueden comprenden adicionalmente secuencias de reconocimiento, como
elementos ascendentes y descendentes del promotor, que pueden
influir en la velocidad de la trascripción.
El término "promotor
no-constitutivo" hace referencia promotores que
provocan trascripción a través de un tejido específico, o sino bajo
controles ambientales o de desarrollo, e incluye promotores
contenibles e inducibles como el preferente de tejido, el
específico del tejido, y los promotores específicos del tipo
celular. Tales promotores incluyen, aunque no se limitan a, el
promotor AdH1, que puede provocarse mediante hipoxia o tensión fría,
el promotor Hsp70, que puede provocarse mediante tensión de calor,
y el promotor PPDK, que puede provocarse mediante luz.
Los promotores que son "preferentes de
tejido" son promotores que preferentemente inician la
trascripción en ciertos tejidos. Los promotores que son
"específicos de tejido" son promotores que inician la
trascripción solamente en ciertos tejidos. Los promotores
"específicos de tipo celular" son promotores que
principalmente conducen la expresión en ciertos tipos de células en
al menos un órgano, por ejemplo, células vasculares.
Los promotores "inducibles" o
"contenibles" son aquellos bajo el control del medio ambiente,
de tal modo que se efectúe la trascripción, por ejemplo, por una
condición medioambiental como condiciones anaeróbicas, la presencia
de luz, fuerzas bióticas, etc, o en respuesta de señales interna,
químicas o biológicas, por ejemplo, glicerlaldehído fosfato
dehidrogenasa, promotores AOX1 y AOX2 que se producen por la acción
de metanol, o al daño físico.
Tal y como aquí se emplea, el término
"promotores constitutivos" se refiere a promotores que
inician, dirigen, o median la trascripción y son activos bajo
concisiones ambientales y estados del desarrollo o diferenciación
celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, aunque no
se limitan a, el virus del mosaico de la coliflor (CaMv) 35S, el
promotor 1' o 2' derivado de T-ADN de
Agrobacterivam turnefaciens, el promotor ubiquitina 1, el
promotor Smas, el promotor cinamil alcohol dehidrogenasa, el
promotor gliceraldehído dehidrogenasa, y el promotor Nos,
etc.
El término "purificado" tal y como aquí se
emplea denota que la molécula indicada está presente en la ausencia
sustancial de otras macromoléculas biológicas, por ejemplo,
polinucleótidos, proteínas, y similares. El término preferentemente
considera que la molécula de interés está presente en una solución
o composición de al menos 80% por peso; preferentemente, al menos
85% por peso; más preferentemente, al menos 95% por peso; y, más
preferentemente, al menos 99.8% por peso. Agua, búferes, y otras
moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso
molecular inferior a aproximadamente un kDa, pueden estar
presentes.
El término "sustancialmente purificado",
tal y como aquí se emplea, se refiere a secuencias de aminoácidos
que se retiran de sus medio natural, se aíslan o separan, y son al
menos 60% libres, preferiblemente 75% libres, y mas preferentemente
90% libres de otros componentes con los que se asocian de manera
natural.
Una "sustitución" es el reemplazo de uno o
más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o
nucleótidos, respectivamente.
El término "transfección" tal y como aquí
se emplea hace referencia al proceso de introducir un vector de
expresión en una célula. En la técnica se conocen varias técnicas
de transfección, por ejemplo, microinyección, lipofección, o el uso
de una pistola de gen.
"Transformación", tal y como aquí se
define, describe un proceso por el cual las secuencias exógenas de
ácido nucleico, por ejemplo, ADN, entran y cambian una célula
recipiente. La transformación puede ocurrir bajo condiciones
naturales o artificiales usando varios métodos conocidos en la
técnica. La transformación puede basarse en cualquier método
conocido para la inserción de secuencias exteriores de ácido
nucleico en una célula procariótica o eucariótica. El método se
selecciona en base al tipo de célula huésped que se está
transformando y puede incluir, aunque no se limita a, infección
viral, electroporación, descarga de calor, lipofección, y bombardeo
de partículas. Tales células "transformadas" incluyen células
establemente transformadas en las cuales el ADN insertado es capaz
de reproducirse, ya sea reproduciendo plásmido de manera autónoma o
como parte de un cromosoma huésped, y también incluye células que
expresan de manera pasajera el ácido nucleico insertado durante
periodos limitados de tiempo.
Tal y como aquí se emplea, el término
"vacuna" se refiere a la preparación de microorganismos
muertos o modificados, organismos vivos atenuados, u organismos
vivos completamente virulentos, u otros agentes, incluyendo, aunque
sin limitar, péptidos, proteínas, macromoléculas biológicas, o
ácidos nucleicos, naturales, sintéticos, o
semi-sintéticos, administrados para producir una
mayor inmunidad artificial hacia una enfermedad en particular, con
el fin de prevenir una futura infección con una entidad similar.
Las vacunas pueden contener microorganismos o agentes vivos o
inactivos, que incluyen virus y bacterias, así como subunidades,
sintéticas, semi-sintéticas, o basadas en ADN
recombinante.
Las vacunas pueden ser monovalentes (una vacuna
para una única cepa/microorganismo/enfermedad) consistente en un
microorganismo o agente (por ejemplo, vacuna para el virus de la
polio) o los antígenos de un microorganismo o agente. Las vacunas
también pueden ser multivalentes, por ejemplo, divalente,
trivalente, etc. (una vacuna combinada), consistente en más de un
microorganismo o agente (por ejemplo, la vacuna
sarampión-paperas-rubéola (MMR) o
los antígenos de más de un microorganismo o agente.
Las vacunas vivas se preparan a partir de
microorganismos vivos. Las vacunas atenuadas son vacunas vivas
preparadas a partir de microorganismos que han sufrido alteración
física (como radiación o preparaciones con temperatura) o pasos en
serie en huéspedes animales de laboratorio o cultivos infectados de
tejido/célula, tales como los tratamientos que producen cepas no
virulentas o de virulencia reducida, pero manteniendo la capacidad
de provocar inmunidad protectora. Ejemplos de vacunas vivas
atenuadas incluyen sarampión, paperas, rubéola y distémper canino.
Las vacunas inactivadas son vacunas en las que se han destruido los
componentes microbiales infecciosos, por ejemplo, mediante
tratamiento químico o físico (como con formalina,
beta-propiolactona, o radiación gamma), sin afectar
la antigenicidad o inmunogenicidad de la capa viral o las proteínas
de la membrana externa bacterial. Ejemplos de vacunas inactivadas o
con subunidades incluyen la vacuna de la gripe, Hepatitis A, y
poliomielitis (IPV).
Las vacunas de subunidades están compuestas por
macromoléculas clave de, por ejemplo, agente viral, bacterial, u
otro agente responsable de producir una respuesta inmune. Estos
componentes pueden obtenerse en un número de modos, por ejemplo, a
través de purificación de microorganismos, generación usando
tecnología de ADN recombinante, etc. Las vacunas de subunidades
pueden contener miméticos sintéticos de cualquier agente infectivo.
Las vacunas de subunidades pueden incluir macromoléculas como
toxinas de proteína bacteriales (por ejemplo, tétano, difteria),
proteínas virales (por ejemplo, del virus de la gripe),
polisacáridos de bacterias encapsuladas (por ejemplo, de
Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumonia), y
partículas similares a los virus producidas mediante tecnología de
ADN recombinante (por ejemplo, antígenos superficial de Hepatitis
B), etc.
Las vacunas sintéticas son las vacunas hechas de
pequeños péptidos sintéticos que mimetizan los antígenos
superficiales de patógenos y son inmunogénicos, o pueden ser
vacunas fabricadas con la ayuda de técnicas de ADN recombinante,
que incluyen virus completos cuyos ácidos nucleicos han sido
modificados.
Las vacunas semi-sintéticas, o
vacunas conjugadas, consisten en antígenos polisacáridos de
microorganismos unidos a moléculas portadoras de proteínas.
Las vacunas ADN contienen vectores de ADN
recombinante que codifican antígenos que, después de que la
expresión del antígeno codificado en las células huésped ha ocupado
el ADN, provocan respuestas inmunes humorales y celulares contra
los antígenos codificados.
Se han desarrollado vacunas para una variedad de
agentes infecciosos. La presente invención está dirigida a
gelatinas recombinantes que pueden emplearse en formulaciones para
vacunas con independencia del agente involucrados, y por lo tanto
no se limitan a las vacunas aquí descritas de manera particular
como modo de ejemplo. Las vacunas incluyen, aunque no se limitan a,
vacunas para virus vaccinia (viruela), virus polio (Salk y Sabin),
paperas, sarampión, rubéola, difteria, tétano,
Varicela-Zoster (varicela/herpes), tos ferina,
Bacilo Calmette-Guerin (BCG, tubercuolosis),
haemophilus influenzae, meningitis, rabia, cólera, virus de
encefalitis japonesa, salmonella, shigella, hepatitis A, hepatitis
B, adenovirus, fiebre amarilla, fiebre aftosa, virus herpes
simples, virus sincitial respiratorio, rotavirus, Dengue, virus del
Oeste del Nilo, virus herpes del pavo (Enfermedad de Marek), gripe,
y ántrax. El término vacuna, tal y como aquí se emplea, se refiere a
vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes y
cánceres que han sido desarrollados o se desarrollarán, por
ejemplo, vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes
y cánceres, por ejemplo, vacunas para VIH, HCV, malaria, y vacunas
para cáncer de pecho, pulmón, colon, riñón o vejiga y de
ovarios.
Un polipéptido o variante de aminoácido es una
secuencia de aminoácido que se altera por uno o más aminoácidos
desde una secuencia particular de aminoácido. Una variante de
polipéptido puede tener cambios conservadores, donde un aminoácido
sustituto tiene propiedades estructurales o químicas similares al
del aminoácido sustituido, por ejemplo, sustitución de leucina por
isoleucina. Una variante también puede tener cambios no
conservadores, en los cuales el aminoácido sustituto tiene
propiedades físicas diferentes a las del aminoácido sustituido, por
ejemplo, sustitución de una glicina por un triptófano. Las
variaciones menores análogas pueden también incluir eliminaciones o
adiciones de aminoácidos, o ambas. Preferentemente, las variantes
de aminoácido retienen ciertas características estructurales o
funcionales de un polipéptido en particular. La guía para determinar
qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse, o
eliminarse puede encontrarse, por ejemplo, usando programas de
ordenador bien conocidos en la técnica, como software LASERGENE
(DNASTAR Inc., Madison, WI).
Una variante de polinucleótido es una variante
de una secuencia de polinucleótido particular que preferentemente
tiene aproximadamente 80%, más preferentemente al menos
aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente
95% similitud de secuencia de polinucleótido con la particular
secuencia de polinucleótido. Aquellos expertos en la técnica
apreciarán que como resultado de la degeneración del código
genético, se pueden producir una multitud de secuencias variantes
de polinucleótido codificadoras de una proteína particular, algunas
manteniendo una mínima homología con las secuencias de
polinucleótido de cualquier gen conocido y que ocurra de manera
natural. Por lo tanto, la invención contempla cada una de las
posibles variaciones de secuencia de polinucleótido que podría
realizarse seleccionando combinaciones basadas en posibles opciones
de codón. Estas combinaciones se realizan de acuerdo con el código
genético estándar del codón de trillizos, y se considerarán todas
las variaciones por describirse de manera específica.
La presente invención muestra gelatinas
recombinantes y métodos para producir estas gelatinas. La gelatina
recombinante de la presente invención consiste en polipéptidos de
uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea
de moléculas idénticas. Las gelatinas recombinantes de la presente
invención proporcionan una actuación reproducible y mejorada, y
responde a varios intereses relacionados con la salud y con otras
materias. Usando el presente método, la gelatina puede fabricarse
directamente, en lugar de extraerse de fuentes animales por medio
de procesos largos y duros. La gelatina recombinante de la presente
invención no tiene patógenos, por ejemplo, bacterias patogénicas,
encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), etc. Los
presentes métodos minimizan la variabilidad y permiten un grado de
reproducibilidad inalcanzable en métodos actuales de
extracción.
Los asuntos de seguridad, como la preocupación
sobre la inmunogenicidad potencial, por ejemplo, las respuestas
antigénicas y alergénicas, han surgido con respecto al uso de
productos derivados de animales. La inhabilidad para caracterizar,
purificar, o reproducir completamente mezclas con gelatina
procedentes de fuentes animales empleadas actualmente es una
preocupación que continúa en las comunidades farmacéuticas y
médicas. Existen intereses adicionales en relación a la seguridad
con respecto a la contaminación bacteriana y las cantidades de
endotoxina que resultan de los procesos de extracción y
purificación.
Las gelatinas recombinantes de la presente
invención se dirigen a estos intereses o preocupaciones ya que se
encuentran virtualmente libres de contaminación o endotoxinas.
Además, las gelatinas humanas recombinantes de la presente
invención ofrecerán diferentes ventajas sobre sus homólogas
derivadas de animales actualmente en uso, ya que el uso de
gelatinas derivadas de secuencia nativa humana puede eliminar el
riesgo de respuesta inmune debido al uso de proteínas no humanas,
derivadas de animales.
Además, las presentes gelatinas pueden
producirse como varios y diferentes materiales, con características
optimizadas para aplicaciones particulares. Los productos
resultantes son internamente más consistentes y uniformes que las
gelatinas actualmente disponibles procedentes de fuentes
animales.
La gelatina recombinante de la presente
invención puede producirse usando secuencias procedentes de varias
especies incluyendo, pero sin limitar, especie humana, bovina,
porcina, equina, y peces. La gelatina de la presente invención ha
incrementado su pureza en comparación con los productos de gelatina
de métodos actuales de fabricación, y ha reducido la cantidad de
proteína y reducido los niveles de endotoxinas y otros
contaminantes, incluyendo ácidos nucleicos, polisacáridos, priones,
etc. Por lo tanto, la presente gelatina es más segura de usar que la
gelatina fabricada por medio de métodos actuales, y puede
administrarse o ingerirse por humanos y animales en una dosis más
elevada mientras los riesgos de efectos secundarios negativos se
minimizan.
Las gelatinas de la presente invención han
incrementado su actividad y funcionabilidad en comparación con las
gelatinas comerciales, ya que la presente gelatina puede producirse
directamente con características optimizadas para usos específicos,
mejorando su habilidad para usa y formular la gelatina. Mientras
las gelatinas actualmente extraídas de fuentes animales son
productos heterogéneos con una amplia variedad de pesos moleculares
en un lote o muestra dada, las gelatinas de la presente invención
incluyen productos consistentes, homogéneos y reproducibles.
Las gelatinas recombinantes de la presente
invención pueden producirse por medio de una variedad de métodos. En
un método, la gelatina recombinante se produce directamente a partir
de la expresión de construcciones alteradas de colágeno, es decir,
construcciones que contienen un polinucleótido que codifica al menos
un dominio de colágeno, pero que no codifica el colágeno que ocurre
de manera natural (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1, 4, y 6). En otro
aspecto, la gelatina recombinante se deriva de polipéptidos que no
son colágeno o procolágeno de longitud completa que ocurre de manera
natural, pero que contiene al menos un dominio de colágeno. (Ver,
por ejemplo, SEQ ID Nos: 15 hasta 25, 30, 31, y 33). Las gelatinas
recombinantes también pueden estar formadas por secuencias que
contienen polipéptidos adicionales de N-terminal y
C-terminal. (Ver, por ejemplo, SEQ ID Nos: 26 hasta
29).
Las moléculas de colágeno generalmente son el
resultado del ensamblaje trimérico de cadenas de polipéptido que
contienen repeticiones
(Gly-X-Y-)_{n} que permiten la
formación de dominios triples helicoidales bajo condiciones
biológicas normales. (Ver, por ejemplo, van der Rest et al.,
(1991), FASEB J. 5:2814-2813). En el presente, se
han identificado aproximadamente veinte tipos distintos de colágeno
en vertebrados, incluyendo colágenos bovinos, ovinos, porcinos, de
pollos y humanos. Una descripción detallada de funciones
estructurales y biológicas de los diferentes tipos de colágenos que
se dan de manera natural puede encontrarse, por ejemplo, en Ayad
et al., The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press,
San Diego, CA; Burgeson, R. E. y Nimmi (1992) "Collagen types:
Molecular Structure and Tissue Distribution", Clin. Orthop.
282:250-272; Kielty, C. M., et al. (1993)
"The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The
Extracellular Matriz", en Connective Tissue And Its Heritable
Disorders, Molecular Genetics And Medical Aspects, Royce, P. M. y
Steinmann, B. Eds. Wiley-Liss, NY, pp.
103-147; y Prockop y Kivirikko (1995) "Collagens:
Molecular biology, diseases, y potentials for therapy". Annu Rev
Biochem 64:403-434.
El colágeno tipo I es el principal colágeno
fibrilar de hueso o piel, que contiene aproximadamente
80-90% del colágeno total del organismo. El
colágeno tipo I es la principal macromoléculas estructural presente
en la matriz extracelular de organismos multicelulares y constituye
aproximadamente el 20% de la masa proteica total. El colágeno tipo
I es una molécula heterotrimérica que comprende dos cadenas
\alpha1(I) y una cadena \alpha2(I), que están
codificadas por los genes COL1A1 y COL1A2, respectivamente. Otros
tipos de colágenos son menos abundantes que el tipo I y muestran
diferentes patrones de distribución. Por ejemplo, el colágeno tipo
II es el colágeno predominantes en el cartílago y humor vítreo,
mientras que el colágeno tipo III se encuentra en elevados niveles
en los vasos sanguíneos y, en menor grado, en la piel.
El colágeno tipo III es el principal colágeno
fibrilar encontrado en la piel y en tejidos vasculares. El colágeno
tipo III es un colágeno homotrimérico que contiene tres cadenas
idénticas de \alpha1(III) codificadas por el gen COL3A1.
Los métodos para purificar varios colágenos de tejidos pueden
encontrarse, por ejemplo, en Byers et al. (1974)
Biochemistry 13:5243-5248; y Miller y Rhodes (1982)
Methods in Enzymology 82:33-64.
Las enzimas post-traslacionales
son importantes en la biosíntesis de procolágenos y colágenos. Por
ejemplo, prolil-4-hidroxilasa es una
enzima post-traslacional necesaria para la síntesis
de procolágeno o colágeno mediante células. Esta enzima hidroxila
residuos prolil en la posición Y- de secuencias repetitivas
Gly-X-Y con
4-hidroxiprolina (Ver, por ejemplo, Prockop et
al. (1984) N. Engl. J. Med. 311:376-386). A
menos que se hidroxilen un número apropiado de residuos prolil en
posición Y- con 4-hidroxiprolina mediante
4-hidroxilasa, las cadenas recién sintetizadas no
pueden mantener una conformación estable con tres hélices. Además,
si no tiene lugar hidroxilación o sub-hidroxilación,
los polipéptidos no se segregan apropiadamente y pueden
degenerarse.
El
prolil-4-hidroxilasa vertebrado es
un tetrámero \alpha_{2}\beta_{2}. (Ver, por ejemplo Berg y
Prockop (1973) J. Biol. Chem. 248:1175-1192; y
Tuderman et al. (1975) Eur. J. Biochem.
52:9-16). Las subunidades a contiene los puntos
catalíticos incluidos en la hidroxilación de los residuos prolil,
pero son insolubles en ausencia de subunidades \beta. Las
subunidades \beta, proteína disulfuro isomerasa, catalizan los
intercambios tiol/disulfuro, provocando la formación de enlaces de
disulfuro esenciales para establecer una proteína estable. Las
subunidades \beta retienen el 50% de la actividad de la proteína
disulfuro isomerasa cuando parten del tetrámero
prolil-4-hidroxilasa. (Ver, por
ejemplo, Pihlajaniemi et al. (1987) Embo J.
6:643-649; Parkkonen et al. (1988) Biochem.
J. 256:1005-1011; y Koivu et al. (1987) J.
Biol. Chem. 262-6447-6449.).
Se ha producido cualquier prolil
4-hidroxilasa humana recombinante activa en, por
ejemplo, células de insectos Sf9 y en células de levadura,
expresando simultáneamente las subunidades \alpha y (Ver, p.ej.,
Vuori et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89-7467-7470; Patente U,S. No.
5,593,859). Además de prolil 4-hidroxilasa, se han
identificado otras enzimas de colágeno
post-traslacionales y se han introducido en la
bibliografía, incluyendo C-proteinasa,
N-proteinasa, Iisil oxidasa, lisil hidroxilasa, etc.
(Ver, por ejemplo, Olsen et al. (1991) Cell Biology of
Extracellular Matriz, 2ª ed., Hay editor, Plenum Press, New
York).
La presente invención particularmente contempla
el uso de un compuesto, biológico o químico, que confiere
hidroxilación, por ejemplo, hidroxilación de prolina y/o
hidroxilación de lisil, etc., como se desee, a las presentes
gelatinas recombinantes. Esto incluye, por ejemplo,
prolil-4-hidroxilasa de cualquier
especie, suministrada endógenamente o exógenamente, incluyendo
varias isoformas de prolil 4-hidroxilasa y
variantes o fragmentos de subunidades de prolil
4-hidroxilasa que poseen la actividad deseada, ya
sean nativas, sintéticas, o semi-sintéticas, y
otras hidroxilasas como prolil 3-hidroxilasa, etc.
(Ver, por ejemplo, Patente U.S Nº 5,928,922, aquí incorporada como
referencia en su totalidad). En una realización, la actividad de
prolil hidroxilasa se confiere por una prolil hidroxilasa derivada
de la misma especie que el polinucleótido que codifica la gelatina
recombinante o que codifica un polipéptido desde el que la gelatina
recombinante se deriva. En una realización adicional, prolil
4-hidroxilasa es humana y el polinucleótido
codificador se deriva de una secuencia humana.
La presente invención proporciona métodos para
manipular la termoplasticidad de gelatina con el fin de producir un
material con las características físicas deseadas. En un método,
los polinucleótidos codificadores se expresan en un sistema huésped
que tiene prolil hidroxilasa endógena o hidroxilasas alteradas,
como ciertas células de mamíferos e insectos, o animales
transgénicos o plantas o células de plantas. En dicho sistema, la
presente invención proporciona métodos para producir una mezcla de
gelatinas recombinantes que tienen un rango de porcentajes de
hidroxilación, es decir, partes no hidroxiladas, parcialmente
hidroxiladas, y completamente hidroxiladas. Por ejemplo, en un
método para producir gelatinas recombinantes con porcentajes
variados de hidroxilación, la hidroxilación se confiere por medio de
prolil hidroxilasa endógena en, por ejemplo, una animal
transgénico, y la distribución de rangos porcentuales de
hidroxilación desde no hidroxilado hasta completamente hidroxilado,
y las temperaturas de fusión del material producido oscilan entre
28ºC y 36ºC, con un valor medio T_{m} de aproximadamente 30ºC a
32ºC. Si se desea, las diferentes fracciones del material pueden
aislarse junto con un gradiente de temperatura, ya que puede ser
necesario si los usos descendentes requieren, por ejemplo,
materiales más hidroxilados, como aquellos suficientemente
hidroxilados como para retener una estructura
triple-helicoidal en, por ejemplo, la temperatura
corporal (37ºC).
En otra realización, las gelatinas recombinantes
se producen en un sistema, por ejemplo, un animal transgénico, en
el cual la hidroxilación se complementa con prolil hidroxilasa
exógena. En un aspecto, dicho método para producir gelatinas
recombinantes proporciona gelatinas recombinantes que están
comprendidas entre no hidroxiladas y completamente hidroxiladas. La
fracción de gelatinas recombinantes más hidroxiladas será
sustancialmente más grande en material recombinante producido en la
presencia de prolil hidroxilasa exógena que en material
recombinante producido solamente en presencia de prolil hidroxilasa
endógena. Por lo tanto, las temperaturas de fusión del material
producido pueden oscilar desde, por ejemplo, 28ºC a 40ºC, teniendo
un valor medio T_{m} de aproximadamente 34ºC a 36ºC. Dicha mezcla
de gelatina podría ser apropiada para uso en una variedad de
aplicaciones, como la fabricación de cápsulas de gel, sin la
necesidad de fraccionar o separar porciones hidroxiladas de manera
diferente.
Los métodos arriba citados proporcionados para
la producción de materiales recombinantes con una variedad de
temperaturas de fusión, que pueden dividirse fácilmente, por
ejemplo, empleando un gradiente de temperatura para separar los
materiales sólidos a una temperatura particular, por ejemplo, 36ºC,
de aquellos líquidos a una temperatura particular. Además, la
presente invención proporciona métodos de bajo coste para producir
un material que, sin separación, es adecuado para uso en
aplicaciones al por mayor. Por ejemplo, la fabricación de cápsulas
de gel podría implicar el uso de gelatina recombínate producida a
través de los métodos citados, donde el material recombinante,
teniendo un rango de temperaturas de fusión, tiene una temperatura
deseable de fusión de aproximadamente 33ºC, fundiéndose dicha
gelatina a temperatura corporal, y siendo por lo tanto adecuada
para su consumo y digestión. En el presente método, la gelatina
recombinante puede producirse directamente en el sistema deseado,
por ejemplo, un animal transgénico, o puede derivarse, por ejemplo,
a través de hidrólisis, por ejemplo, ácida, termal, o enzimática,
de colágenos recombinantes producidos en el sistema deseado.
En un aspecto, la gelatina de la presente
invención comprende triple hélices desnaturalizadas, y consiste al
menos en una subunidad de colágeno, cadena de colágeno, o fragmento
de la misma. Las unidades Gly-X-Y
en una cadena de colágeno particular, subunidad, o fragmento de la
misma pueden ser las mismas o diferentes. Preferiblemente, X e Y
son bien prolina o hidroxiprolina, y la glicina aparece en
aproximadamente cada tercera posición en el residuo de la cadena
componente. Los aminoácidos de X e Y son prolina o hidroxiprolina,
y cada unidad Gly-X-Y es la misma o
diferente. En otra realización, la gelatina recombinante está
formada por una secuencia de aminoácido de
(Gly-X-Y)_{n},
donde X e Y son cualquier aminoácido.
donde X e Y son cualquier aminoácido.
Los métodos presentes para producir gelatina
recombinante tiene un número de ventajas sobre métodos
tradicionales de extracción de gelatina. De manera más relevante,
los métodos presentes proporcionan una fuente fiable sin tejido de
gelatina que contiene secuencia de colágeno nativo. Además, los
métodos actuales de extracción no tienen en cuenta ninguna fuente
natural de gelatina humana, de modo que puede resultar ventajoso
para uso en varias aplicaciones médicas. Concretamente, la presente
invención proporciona gelatinas recombinantes derivadas de
secuencias humanas, composiciones que contienen gelatinas humanas
recombinantes, y métodos para producir estas gelatinas. La gelatina
recombinante humana es no imunogénica cuando se aplica en procesos
farmacéuticos y médicos, y también se consideran varios usos de los
mismos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona la producción de la gelatina presente a partir de
construcciones fabricadas capaces de expresar gelatina de varias
formas. Esta invención particularmente considera métodos para
producir gelatina usando prolil hidroxilasa recombinante y varias
construcciones sintéticas, incluyendo construcciones de colágeno no
nativo. Además, la presente invención proporciona gelatinas
recombinantes que pueden diseñarse para poseer las características
específicas necesarias para una aplicación particular. También se
consideran los métodos para producir estas gelatinas. Usando los
métodos actuales, se puede producir una gelatina con la deseada
fuerza de gel, viscosidad, características de fusión, perfil
isoeléctrico, pH, grado de hidroxilación, composición de aminoácido,
olor, color, etc. En un método de acuerdo con la presente
invención, se produce gelatina no-hidrolizada, y si
se desea, se puede producir completamente o parcialmente
hidrolizada.
Las diferentes propiedades físicas de la
gelatina definen su utilidad en aplicaciones particulares. La
gelatina proporciona una única actuación en base a, por ejemplo, su
naturaleza anfotérica, su habilidad para formar geles
termo-reversibles, sus propiedades activas
superficiales y coloidales protectoras, y su contribución a la
viscosidad y estabilidad. En un número de aplicaciones, la gelatina
se emplea, por ejemplo, como un emulsionante, espesante, o
estabilizador; como un agente para la formación de una capa o
cubierta; como un agente de enlace; como un adhesivo o pegamento; o
como un agente floculante.
Las materias primas, los tipos de
pre-tratamiento y los procesos de extracción llevan
a cabo la composición de polipéptidos de gelatina obtenidos durante
la fabricación convencional. Por lo tanto, los productos animales
actualmente disponibles son mezclas heterogéneas de proteínas desde
unos pocos a varios cientos kDa. La distribución del peso molecular
de gelatina en un conjunto en particular puede ser crítica, ya que
la distribución del peso puede influir en, por ejemplo, la
viscosidad y/o fuerza de gel de una muestra de gelatina.
En general, la viscosidad de una solución de
gelatina aumenta con el aumento de la concentración y con el
descenso de la temperatura. Se preferiría una solución con mayor
viscosidad, por ejemplo, para gelatina empleada como un
estabilizador o espesante. En algunas aplicaciones, las gelatinas
líquidas son preferentes, como en varios fluidos emulsionantes,
etc. La viscosidad de una solución de gelatina aumenta con el
aumento del peso molecular de los componentes de la gelatina. Una
solución de elevada viscosidad podría consistir, por ejemplo, en
una elevada concentración de gelatinas de bajo peso molecular, o de
una concentración más baja de gelatinas de alta peso molecular. La
viscosidad también afecta a las propiedades del gel incluyendo el
punto de posición y fusión. Las soluciones de gelatina de elevada
viscosidad proporcionan geles con índice más elevados de posición y
fusión que las soluciones de gelatina con baja viscosidad.
La termoreversibilidad y termoplasticidad de la
gelatina son propiedades explotadas en un número de aplicaciones,
por ejemplo, para la fabricación de cápsulas o pastillas de gel. La
gelatina puede calentarse, moldearse o dar la forma apropiada, y
enfriarse para formar una cápsula o una cubierta para pastilla que
tenga propiedades únicas a temperaturas homeostáticas. La gelatina
comenzará a fundirse con la temperatura de la boca, se ingerirá de
manera sencilla y se transformará en líquido a temperatura
corporal.
Las gelatinas de varias fuerzas de gel son
adecuadas par uso en diferentes aplicaciones. La firmeza o fuerza
del gel normalmente se mide calculando el valor Bloom, que puede
determinarse usando estándares y metodologías internacionales. En
resumen, la fuerza Bloom es la medida de la fuerza de un gel
formado por una solución 6.67% de gelatina en un baño a temperatura
constante durante 18 horas. Se emplea un Analizador de Textura
estándar para medir el peso en gramos requerido para reducir un
émbolo estándar de AOAC (Asociación de Químicos Agrícolas
Oficiales) de 4 milímetros en un gel. Si el peso en gramos
requerido para el descenso del émbolo es 200 gramos, la gelatina en
particular tiene un valor Bloom de 200. (Ver, por ejemplo,
Farmacopea de Estados Unidos y Métodos Oficiales de Análisis de
AOAC Internacional, 17ª edición, Volumen II).
Las gelatinas comerciales pueden por lo tanto
clasificarse y venderse en fuerza Bloom. Los diferentes rangos de
valores Bloom son apropiados para diferentes usos de gelatinas; por
ejemplo, gelatinas para uso en varias aplicaciones industriales,
por ejemplo, estabilización concreta, vaciado de arena, moldes,
pegamentos, revestimientos, etc., se seleccionarán a partir de una
amplia variedad de diferentes fuerza Bloom, dependiendo de las
características de acción deseadas. Las gelatinas con varias fuerzas
Bloom también se desean en la fabricación de varios productos
farmacéuticos. Por ejemplo, cápsulas blandas de gel normalmente se
fabrican usando oseína o gelatina de piel con un valor Bloom de
aproximadamente 150 a 175 y/o gelatina derivada de ganado porcino
con un valor Bloom de aproximadamente 190 a 210, o mezclas de los
mismos, mientras que las cápsulas durad de gel podrían usar una
gelatina con un valor Bloom de aproximadamente 220 a 260. En
aplicaciones para comidas, la gelatina empleada, por ejemplo, como
espesante en malvaviscos u otros productos de confitería podrían
tener un valor Bloom de aproximadamente 250. Varias aplicaciones,
incluyendo ciertos fluidos emulsionantes en aplicaciones
fotográficas, y varios revestimientos industriales, implican el uso
de gelatinas que no se han convertido en gel.
La presente invención proporciona la producción
de gelatinas recombinantes con diferentes fuerzas Bloom. En un
aspecto, la presente invención proporciona, por ejemplo, la
fabricación de gelatinas con fuerzas Bloom de aproximadamente 50,
100, 150, 200, 250, y 300. En una realización, la presente
invención proporciona la producción de una gelatina recombinante
que tiene una fuerza Bloom de aproximadamente 400. Dicha gelatina
puede usarse, por ejemplo, en la fabricación de cápsulas de gel, y
puede considerar la fabricación de una cápsula más ligera y más
fina, ya que se necesitaría emplear menos material para
proporcionar un gel con suficiente fuerza. También se consideran
las gelatinas recombinantes con fuerzas Bloom de menos de 100, y
desde 0 a 100, ambos incluidos.
La presente invención proporciona métodos para
diseñar gelatinas recombinantes con las propiedades físicas
deseadas para aplicaciones particulares. La presente invención hace
que el uso de gelatinas recombinantes consista en polipéptidos de
peso molecular uniforme. Dichos materiales homogéneos y uniformes
son ventajosos por el hecho de que facilitan una fuente fiable de
producto con actuación predecible, minimizando la variabilidad en la
actuación del producto y en los parámetros de fabricación. En la
actualidad, gelatina de diferentes grupos pueden mezclarse en
ocasiones para producir una mezcla con las características físicas
deseadas, como viscosidad o fuerzas de gel, etc., proporcionadas
por un peso molecular en particular o una variedad de pesos
moleculares.
La presente invención hace uso de gelatinas
recombinantes de peso molecular uniforme, eliminando la
variabilidad y impredictibilidad, y permite afinar los procesos y
predecir el comportamiento. Los presentes métodos permiten la
producción de gelatinas recombinantes de cualquier peso molecular
deseado. Por ejemplo, en una realización, la gelatina recombinante
tiene un peso molecular superior a 300 kDa.
En otro aspecto, podría producirse gelatina
recombinante con un peso molecular similar al de algunas gelatinas
disponibles en el mercado, de desde 10 a 70 kDa.
En una realización particular, se administra una
gelatina recombinante con una longitud de cadena que confiere
propiedades específicas apropiadas para la aplicación que se
pretende. En varias realizaciones de la presente invención, las
gelatinas recombinantes con pesos moleculares uniformes de
aproximadamente 1 kDa, 5 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 22 kDa,
23 kDa, y 24 kDa son consideradas (Ver, por ejemplo, Tabla 2).
En particular, en un método de la presente
invención, se produce gelatina a partir de secuencias acortadas de
colágeno, por ejemplo, las secuencias identificadas en la Tabla 2.
Estas secuencias representan dominios específicos de colágeno y
codifican formas cortad de gelatina.
Las presentes gelatinas son capaces de retener
características físicas valiosas de la gelatina, por ejemplo,
habilidades para formar capas, mientras poseen pesos moleculares
medios inferiores o superiores a aquellas gelatinas convencionales
derivadas de animales. Se pueden realizan varias modificaciones de
secuencias de colágeno, incluyendo, por ejemplo, desnaturalización
del colágeno, cadena de colágeno, subunidad o fragmentos de los
mismos, o variar los grados de hidroxilación, lo que producirá
gelatina con propiedades físicas específicas, es decir, mayor o
menos punto de fusión en comparación con la gelatina convencional,
diferentes composiciones de aminoácido, pesos moleculares
específicos o rangos de pesos moleculares, etc., y aquí se
consideran de manera particular estas
variaciones.
variaciones.
El peso molecular de una molécula de colágeno
formadora de fibril, como el colágeno de tipo I, es 300 kDa. En
algunas aplicaciones, como aquellas en las que se emplean gelatinas
de elevado peso molecular, podría ser deseable producir una
gelatina con mayor peso molecular que el de la gelatina extraída
actual. Por lo tanto, en una realización de la presente invención,
puede producirse gelatina que contiene moléculas más grandes que el
colágeno del que se extrae en la actualidad la gelatina
convencional. El producto de gelatina resultante con mayor peso
molecular puede emplearse directamente en varias aplicaciones en
las cuales se deseen sus propiedades físicas, o puede dividirse y
tratarse posteriormente para producir moléculas de tamaños más
pequeños.
En una realización, la gelatina puede producirse
usando colágenos más grandes que aquellos disponibles en las
fuentes animales convencionales. Por ejemplo, los presentes métodos
de producción podrían adaptarse para producir colágenos de
cutículas solubles en ácido derivados de paredes corporales de
gusano de tubo de clase vestimentifera Riftia pachyptila
(peso molecular \sim 2600 kDa) y anélidos Alvinella
pompejana (peso molecular \sim 1700 kDa). Estos colágenos
podrían adaptarse para los presentes métodos de producción para
producir moléculas más grandes que aquellas de las cuales se extrae
la gelatina actualmente disponible, y el producto resultante podría
tratarse para producir las gelatinas deseadas.
En particular, se considera que las gelatinas de
varios pesos moleculares pueden producirse por medio de una
variedad de métodos de acuerdo con la presente invención. Por
ejemplo, las características de la presente gelatina recombinante,
por ejemplo, hidroxilación porcentual, grados de aglutinamiento,
etc., pueden variar para producir gelatinas recombinantes con los
deseados pesos moleculares. En un aspecto, por ejemplo, la presente
invención proporciona un método para producir gelatinas
recombinantes de mayor peso molecular mediante agentes aglutinantes
conocidos en la técnica para aglutinar polipéptidos de gelatina
(Ver documento, infra.).
En otro aspecto de la presente invención, los
polipéptidos desde los que las gelatinas podrían derivarse se
expresan a partir de construcciones realizadas que contienen
múltiples copias de todos los fragmentos de secuencia nativa de
colágeno. Por ejemplo, en una realización, la presente invención
proporciona una construcción de colágeno alterado que comprende
copias del dominio de colágeno del tipo I. En otra realización, la
construcción comprende copias de dominios de colágeno del tipo III.
En una realización adicional, la construcción comprende copias de
dominios de colágeno del tipo I y tipo III. La presente invención
proporciona el uso de copias sencilla o múltiples de todas las
secuencias, o de partes de ellas, codificadoras de cualquier
colágeno, incluyendo los colágenos del tipo I hasta el tipo XX,
ambos incluidos. Particularmente, se considera que los presentes
métodos permiten la producción de gelatinas derivadas de más de un
tipo de colágeno. En una realización, las gelatinas recombinantes
derivadas de más de un tipo de colágeno se
co-expresan en un sistema de expresión, por ejemplo,
una célula huésped, animal transgénico, etc., de modo que se
produzca una mezcla de gelatinas.
En otra realización, la presente invención
proporciona un método para producir gelatina sin la derivación de
la fase de colágeno o procolágeno triple helicoidal. En un aspecto,
esto implica la producción de gelatina recombinante mediante
expresión de varias construcciones en un sistema de expresión a
elevada temperatura, como aquel basado en organismos termofílicos,
que no permite la formación de estructuras triples helicoidales,
pero permite la actividad de prolil hidroxilasa. La presente
gelatina también podría derivarse de construcciones de colágeno que
contienen mutaciones, adiciones, o eliminaciones que evitan la
formación triple helicoidal. En otro aspecto, esto implica la
producción de gelatina a partir de construcciones acortadas que no
permiten la formación de hélices triples a temperaturas regulares,
es decir, 37ºC. De manera alternativa, la gelatina puede producirse
en presencia de inhibidores de formación de triple hélice, por
ejemplo, polianiones, que se expresan junto con las construcciones
biosintéticas de colágeno. De manera adicional, la gelatina
biosintética de la presente invención podría derivarse de cadenas
de colágeno producidas de manera recombinante que no forman hélices
triples.
La presente invención comprende gelatinas
completamente hidroxiladas, parcialmente hidroxiladas, y no
hidroxiladas. En otra realización, le método de la presente
invención consiste en la producción de una gelatina o un precursor
de gelatina que tiene un grado específico de hidroxilación. En un
aspecto adicional, la invención hace referencia a un método para
producir gelatina que tiene un porcentaje de hidroxilación que
oscila entre 20 y 80, preferentemente un porcentaje de
hidroxilación entre 30 y 60, y, más preferentemente, un porcentaje
de hidroxilación de aproximadamente 40. (Ver Ejemplos 4 y 5). Las
gelatinas recombinantes parcialmente hidroxiladas de la presente
invención pueden obtenerse mezclando porcentajes específicos de
gelatinas recombinantes con diferentes grados de hidroxilación, o
pueden obtenerse directamente. (Ver Ejemplos 4 y 5). Además, la
invención facilita métodos para lograr hidroxilación parcial de
gelatinas recombinantes administrando propil hidroxilasa a
gelatinas recombinantes no hidroxiladas in vitro, y
controlando la extensión de la reacción.
Existen límites en el alcance en el que las
características termales de gelatinas de fuente animal actualmente
disponibles pueden alterarse. Particularmente, la presente
invención proporciona método para producir gelatina recombinante,
donde la gelatina recombinante tiene las características termales
específicas deseadas para una aplicación en particular. Empleando
los métodos de la presente invención, por ejemplo, el punto de
fusión y/o fuerza de gel, la gelatina recombinante puede
manipularse de varias formas. La estabilidad de la temperatura y/o
fuerza de gel de la gelatina recombinante puede medirse mediante
una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.
Generalmente, el punto de fusión de la gelatina
aumenta cuando el grado de hidroxilación aumenta. Usando los
métodos de la presente invención, es posible producir gelatinas de
elevado peso molecular que, debido a la manipulación de
hidroxilación y/o aglutinamiento, etc., tienen una menor fuerza de
gel y/o punto de fusión más bajo que el de las gelatinas
actualmente disponibles procedentes de fuentes animales. Por lo
tanto, la presente invención proporciona una gelatina recombinante
con propiedades inalcanzables en varios productos comerciales,
adecuadas para uso en aplicaciones donde se desea una gelatina con
peso molecular más elevado, con el fin de proporcionar una mayor
fuerza de capa, etc., pero se desea un producto de baja fuerza de
gel o sin gel. En una realización, la presente invención
proporciona gelatina recombinante que tiene estabilidad a
temperatura más baja debido a la hidroxilación incompleta de los
residuos de prolina.
Dicha gelatina recombinante podría ser útil en
una variedad de aplicaciones. En la gelatina producida mediante
métodos actuales de extracción, solamente la gelatina del pescado
proporciona una proteína formadora de capa de elevado peso medio
molecular que no se hace gel. Las características basadas en la no
gelificación y la solubilidad en agua fría ofrecidas por la
gelatina de pescado sin gelificación pueden ajustarse por las
gelatinas hidrolizadas bovinas y porcinas actualmente disponibles,
peor con la correspondiente pérdida de fuerza de capa y
flexibilidad, ya que las gelatinas hidrolizadas tienen menor peso
medio molecular. Por lo tanto, en una realización, la presente
invención proporciona una gelatina recombinante parcialmente
hidroxilada con menor fuerza de gel y mayor peso molecular que el
provisto por las materias procedentes de fuentes animales
actualmente disponibles.
Una gelatina con elevado peso molecular y baja
fuerza de gel también puede resultar útil en aplicaciones
farmacéuticas, en las que se desea estabilidad, pero también la
propiedad de baja gelificación o de falta de gelificación, con el
fin de mantener la maleabilidad e integridad del producto
farmacéutico. Dicha gelatina recombinante podría usarse, por
ejemplo, como un extensor de plasma, ya que su peso molecular
proporcionaría estabilidad, aumentando el tiempo de residencia en
circulación, y el punto de posición alterado evitaría que el
material se transformase en gel a temperatura ambiente, permitiendo
que el extensor se pueda administrar sin calentamiento. En una
realización, la presente invención proporciona una gelatina
parcialmente hidroxilada adecuada para uso en aplicaciones
farmacéuticas, por ejemplo, como un extensor de plasma.
En otro aspecto, la gelatina recombinante
parcialmente hidroxilada se obtiene a través de expresión de
gelatina recombinante, o expresión de polipéptidos desde los que la
presente gelatina recombinante se deriva, en ausencia de prolil
hidroxilasa, por ejemplo, en un sistema de expresión de un insecto
sin prolil hidroxilasa (Ver, por ejemplo, Myllyharju et al.
(1997) J. Biol. Chem. 272, 21824-21830). La
hidroxilación puede ocurrir en el momento de la producción o puede
imponerse a continuación por medio de, por ejemplo, modificación
biológica o química in vitro. En un método de la presente
invención, las gelatinas recombinantes se derivan de colágeno
parcialmente hidroxilado o completamente hidroxilado.
Las gelatinas derivadas de fuentes naturales por
medio de métodos actualmente disponibles se refuerzan en gran
medida por la existencia de aglutinantes covalentes entre los
residuos de lisina de las moléculas de colágeno constituyente. El
aglutinamiento ocurre de manera natural en el espacio extracelular
tras la secreción de colágeno y formación fibril, y antes de la
secreción, ciertos residuos se hidroxilan por la enzima de lisil
hidroxilasa. A continuación, la enzima extracelular lisil
hidroxilasa determina ciertos residuos de lisina e hidroxilisina en
las moléculas de colágeno, produciendo grupos de aldehído
elevadamente reactivos que reaccionan de manera espontánea par
formar enlaces covalentes. Los colágenos aglutinantes resultantes
producen gelatinas de elevada fuerza de gel y elevada viscosidad.
Específicamente, un grado más alto de aglutinamiento da como
resultado gelatinas con temperaturas de fusión más elevadas y una
mayor fuerza de gel.
En un aspecto, la presente invención proporciona
gelatinas recombinantes que están aglutinadas, dando como resultado
gelatinas de mayor peso molecular (Ver Ejemplo 7). El
aglutinamiento puede imponerse por medio de diferentes métodos,
como por medio de modificación biológica o química. Por ejemplo, en
una realización, la gelatina recombinante o un polipéptido del cual
se deriva la gelatina se expresa en presencia de lisil hidroxilasa
y lisil oxidasa. En otra realización, el polipéptido se modifica
mediante aglutinamiento tras la expresión. En un aspecto adicional,
la presente invención proporciona la imposición del aglutinamiento
por medio de medios químicos, tales como aglutinantes químicos
reactivos, por ejemplo,
1-etil-3-(dimetilaminopropil)
carbodiimida hidrocloruro (EDC) (Ver Ejemplo 7). Otros agentes
aglutinantes químicos, como bis(sulfosuccinimidil) suberato
(BS3), 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidil)
propionato (DTSSP), y Tris- sulfosuccinimidil aminotriacetato
(Sulfo-TSAT) también pueden usarse, como lo pueden
hacer otros agentes conocidos en la técnica. De manera adicional,
la presente invención proporciona métodos para producir gelatinas
recombinantes con varios grados de aglutinamiento, útiles para
obtener gelatinas recombinantes con los deseados puntos de fusión,
fuerza de gel y viscosidad.
La presente invención proporciona métodos para
manipular el peso molecular, el nivel de hidroxilación, y el grado
de aglutinamiento de las gelatinas recombinantes para permitir la
creación de gelatinas recombinantes de diferentes y específicas
fuerzas Bloom, así como gelatinas recombinantes de diferentes y
específicos niveles de viscosidad.
La hidroxilación de prolina juega un papel
central en la formación de colágeno natural. La hidroxilación de
residuos específicos de lisil en la secuencia
X-Lys-Gly también cumple una
función importante en la síntesis de colágeno y en la formación de
fibril. Los grupos de hidroxil sobre los residuos modificados de
lisina funcionan tanto como puntos de unión para carbohidratos como
puntos esenciales para la formación de aglutinantes
intermoleculares estables. Estas modificaciones requieren la
expresión de enzimas específicas, lisil hidroxilasa y lisil
oxidasa.
Por lo tanto, en un aspecto de la invención, se
considera la co-expresión de estas enzimas con los
polipéptidos de la presente invención. El gen que codifica lisil
hidroxilasa (Hautala et al. (1992) Genomics
13:62-69) se expresa en la célula huésped, que a
continuación es modificada por la introducción de una secuencia
codificadora de una gelatina o polipéptido del cual la gelatina
puede derivarse, tal y como se describe en la presente invención.
Las gelatinas recombinantes de la presente invención pueden por lo
tanto modificarse de manera post-traslacional por la
actividad de lisil hidroxilasa y lisil oxidasa expresadas de modo
endógeno. Las gelatinas recombinantes de la presente invención
también pueden modificarse por la expresión de de lisil hidroxilasa
y lisil oxidasa exógenas. En una realización, las gelatinas
recombinantes producidas son no-hidroxiladas, y
como consecuencia se alteran imponiendo el grado deseado de
hidroxilación de residuos de lisina mediante la actividad
enzimática de lisii hidroxilasa. La habilidad para alterar el grado
de hidroxilación de tisis es deseable para producir gelatinas, y
los polipéptidos desde los cuales la gelatina puede derivarse, con
varios grados de aglutinantes que llevan a las fuerzas deseadas de
gel y viscosidades.
En realizaciones adicionales, un polipéptido que
contiene residuos de hidroxilisina puede expresarse en, por
ejemplo, una célula de levadura, en la cual la hidroxiprolina se
produce a través de la actividad de prolil hidroxilasa. (Ver
Ejemplos 1 y 4). En algunas realizaciones, la gelatina recombinante
modificada o polipéptido del cual se deriva la gelatina puede
formularse y administrarse a un animal o humano, sirviendo por lo
tanto de sustrato para las actividades de enzimas endógenas, como
lisil oxidasa, permitiendo por lo tanto que el polipéptido de
colágeno se incorpore a los tejido en forma de aglutinante
estabilizado. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención
proporciona la producción de gelatinas recombinantes de fuerzas de
gel y viscosidad deseable para uso comercial, sin la necesidad de
las actividades de de lisil hidroxilasa o lisil oxidasa.
La invención también proporciona la producción
de gelatina que tiene un punto particular de gelificación. En una
realización, los métodos presentes proporcionan la producción de
gelatina que tiene un punto de posición o gelificación de desde 15ºC
a 35ºC. En otras realizaciones, la gelatina recombinante tiene un
punto de posición de desde 15 a 25ºC, desde 25 a 35ºC, y desde 20 a
30ºC.
En varios aspectos, la presente invención
proporciona gelatina recombinante que es no está hidrolizada, que
está completamente hidrolizada o que se encuentra hidrolizada en
varios grados, como las gelatinas que son una mezcla de productos
hidrolizados y no hidrolizados. Además, la presente invención
proporciona métodos para producir gelatinas recombinantes con varios
grados de hidrólisis (Ver Ejemplos 9 y 10). Los hidroxilatos de
gelatina normalmente son solubles en agua fría y se emplean en una
variedad de aplicaciones, particularmente en las industrias
farmacéutica y alimenticia, en las cuales se desea una gelatina con
propiedades no gelificadoras. Los hidroxilatos de gelatina se
emplean en la industria farmacéutica para formar agentes formadores
de capas, procesos para microencapsulación, fórmulas para alivio de
artritis y articulaciones, fabricación de pastillas, y varias
fórmulas nutricionales. En la industria cosmética, los hidroxilatos
de gelatina se emplean en champúes y condicionadores, lociones y
otras formulaciones, incluyendo barras de labios, y en fórmulas para
uñas, etc. Los hidroxilatos de gelatina aparecen como suplementos
nutricionales en bebidas y comidas que aportan energía y proteína;
se emplean como agentes afinadores en la clarificación de vino,
cerveza y zumo; y se emplean en la microencapsulación de aditivos
como saborizantes y colorantes alimenticios. Los hidroxilatos de
gelatina se emplean en aplicaciones industriales por sus
características capaces de formar capas, como en revestimientos de
elementos en la fabricación de semiconductores, etc.
En una realización de la presente invención, la
gelatina se produce a partir de secuencias de colágeno en las
cuales se han eliminado a añadido dominios nativos particulares. La
invención además contempla métodos para producir gelatina
recombinante donde la gelatina se produce directamente a partir de
una construcción alterada de colágeno, sin la producción de un
colágeno intacto con triple hélice. En particular, la presente
invención contempla métodos para producir gelatina recombinante que
consisten en la expresión de varias construcciones que no codifican
el colágeno estándar de triple hélice. Por ejemplo, las
eliminaciones específicas pueden eliminar regiones responsables de
colagenasa, y varias regiones que provocan respuestas
inmunogénicas, por ejemplo, antigénicas o alergénicas.
Los dominios específicos de varios colágenos han
sido asociados con actividades específicas. (Ver, por ejemplo,
Shahan et al. (1999) Con. Tiss. Res.
40:221-232; Raff et al. (2000) Human Genet
106:19-28, cuyas referencias aquí se incorporan como
referencia en su totalidad). En particular, la presente invención
proporciona específicamente métodos para producir gelatinas
recombinantes derivadas de colágeno, construcciones alteradas para
eliminar o reducir o aumentar las regiones específicas de un gen de
colágeno asociado con una actividad específica. En particular,
dichas regiones pueden eliminarse completamente o en parte para
producir una gelatina sin actividad específica o con reducida
actividad específicas, o pueden añadirse copias adicionales de la
región específica para producir una gelatina con una actividad
mejorada. Por ejemplo, se han identificado secuencias en colágeno
de tipo I y III reconocidas por el receptor integrina
\alpha2\beta1 en la superficie celular de la plaqueta. (Knight
et al. (1998) J. Biol. Chem.
273:33287-33294; y Morton et al. (1997) J.
Biol. Chem. 272:11044-11048, cuyas referencias aquí
se incorporan como referencia en su totalidad).
En un aspecto de la presente invención, se desea
crear una gelatina homogénea compuesta por fragmentos sintetizados
a partir de construcciones de colágeno sin regiones de activación
de plaquetas. Dicha gelatina puede incluirse, por ejemplo, en
productos asociados con anastomosis e injertos vasculares, etc.,
incluyendo cubiertas para prótesis y dispositivos de injerto. Dichos
productos pueden asociarse con efectos secundarios perjudiciales,
por ejemplo, trombosis, que pueden desarrollarse en asociación con
le uso de tales productos como resultado de regiones agregadas a
paletas presentes en el producto con colágeno. En un aspecto, la
presente invención proporciona un método par producir una gelatina
recombinante que puede proporcionar apoyo para la unión celular
cuando se emplea en una prótesis o en un dispositivo similar, pero
que no incluye regiones reactivas a las plaquetas, lo que minimiza
le riesgo de agregación de plaquetas (Ver Ejemplo 2). Por lo tanto,
la presente invención proporciona en una realización una cubierta
de prótesis consistente en gelatina recombinante. En una
realización preferente, la gelatina recombinante es gelatina
recombinante humana. En algunos casos, como varias aplicaciones en
la cura de heridas, puede se deseable proporcionar gelatina
recombinante que comprenda dominios capaces de provocar actividades
específicas de agregación.
Una gelatina de la presente invención puede
expresarse a partir de construcciones de colágeno que no
codificaron las regiones reconocidas por el receptor
\alpha2\beta1, o a partir de construcciones con una o con
múltiples copias de dichas regiones, proporcionando de este modo un
producto de gelatina homogéneo y consistente sin o con reducida
agregación y activación de plaquetas. En un aspecto, la presente
invención facilita la producción de gelatina recombinante, mediante
la expresión directa de gelatina, mediante el uso de expresión
recombinante elevadamente eficiente. Los métodos de la presente
invención, en oposición a los métodos actuales de extracción,
ofrecen flexibilidad extrema, de modo que cualquier sistema de
expresión puede emplearse. El material de producción es accesible,
por ejemplo, en biomasa de levadura o plantas. La secreción en
ciertos sistemas de producción pueden optimizarse, por ejemplo, por
medio del establecimiento de un tamaño uniforme de moléculas
particulares de gelatina que se producirán de acuerdo con los
presentes métodos, En varias realizaciones, las presentes gelatinas
o los polipéptidos de los que las gelatinas se derivan, se producen
en sistemas de expresión incluyendo, aunque sin limitar, sistemas
de expresión procariótica, sistemas de expresión bacterial, y
sistemas de expresión eucariótica, incluyendo sistemas de expresión
de levadura, animales, plantas e insectos. Se consideran os
sistemas de expresión tales como los de los animales transgénicos y
las plantas transgénicas.
La presente invención proporciona la expresión
de al menos un polinucleótido que codifica una gelatina o un
polipéptido del cual la gelatina puede derivarse en una célula. En
una realización, la presente invención proporciona la expresión de
más de un polinucleótido que codifica una gelatina o un polipéptido
del cual la gelatina puede derivarse en una célula, de tal modo que
se produce la gelatina recombinante que tiene polipéptidos
homogéneos o heterogéneos. La presente invención además proporciona
la expresión de un polinucleótido que codifica una enzima
procesadora de colágeno o post-traslacional o
subunidad de la misma en una célula. Diferentes modificaciones
post-traslacionales, y diferentes enzimas
post-traslacionales, por ejemplo, prolil
hidroxilasa, lisil hidroxilasa, etc., pueden influir en, por
ejemplo, fuerza Bloom y otras características físicas de las
presentes gelatinas.
Las gelatinas recombinantes de la presente
invención pueden derivarse de secuencias colagenosas. Las
secuencias de las cuales se derivan los polinucleótidos
codificadores de la invención pueden seleccionarse de secuencias
humanas o no humanas, dependiendo de las características deseadas
para el uso buscado del producto final de gelatina. Para uso
farmacéuticos y médicos, es preferible la gelatina humana
recombinante. Las fuentes no humanas incluyen fuentes mamíferas no
humanas, tales como fuente bovina, porcina, y equina, y otras
fuentes animales, como pollos y peces. Se consideran de manera
particular las secuencias no nativas.
Las secuencias de ácido nucleico han sido
descritas a modo general en la técnica. (Ver, por ejemplo, Fuller
and Boedtker (1981) Biochemistry 20:996-1006;
Sandell et al. (1984) J Biol Chem
259:7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem
259:13668-13673; French et al. (1985) Gene
39:311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol
Chem 266:16862-16869; Metsaranta et al.
(1991) Biochim Biophys Acta 1089:241-243; Wood
et al. (1987) Gene 61:225-230; Glumoff et
al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217:41-48;
Shirai et al. (1998) Matrix Biology
17:85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J
253:919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem
J 252:633-640; and Ala-Kokko et
al. (1989) Biochem J 260:549-516). Ver también
la solicitud co-pendiente y comúnmente reconocida
WO 01/34647.
Las secuencias de ácido nucleico de la invención
pueden construirse con el fin de alterar las secuencias
codificadoras empleadas para producir gelatina recombinante, o
polipéptidos de los cuales puede derivarse la gelatina
recombinante, para una variedad de finalidades incluyendo, pero sin
limitación, alteraciones que modifican procesos y expresión del
producto gen. Por ejemplo, las señales segregadoras alternativas
pueden sustituirse por otras señales segregadoras nativas. Las
mutaciones pueden introducirse usando técnicas bien conocidas en el
campo, por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida,
mutagénesis PCR-dirigida, mutagénesis de casete, y
otras técnicas bien conocidas en la técnica para insertar nuevos
sitios o puntos de restricción, o para alterar los patrones de
glicosilación, fosforilización, pérdida/descomposición proteolítica,
etc. Además, cuando se produce gelatina en un sistema de expresión
usando células particulares huésped, los polinucleótidos de la
invención pueden modificarse en la posición silenciosa de cualquier
codón de aminoácido trillizo para que se ajuste mejor a la
preferencia de codón de un organismo huésped en particular.
Las secuencias alteradas de polinucleótido que
pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen secuencias que
contienen eliminaciones, adiciones o sustituciones de residuos de
nucleótido en secuencias de colágeno nativo. Tales polinucleótidos
pueden codificar el mismo producto gen o uno funcionalmente
equivalente. El propio producto puede contener eliminaciones,
adiciones o sustituciones de residuos de aminoácido en una
secuencia de colágeno.
Las secuencias de polinucleótido de la invención
se dirigen además a secuencias que codifican variantes de los
polipéptidos codificadas. La variantes de aminoácidos codificadas
pueden prepararse por medio de varios métodos conocidos en la
técnica para la introducción de cambios apropiados de nucleótido
para codificar variantes de polipéptidos. Dos variables importantes
en la construcción de variantes en secuencias de aminoácidos son la
localización de la mutación y la naturaleza de la mutación. Las
variantes de secuencia de aminoácido de las gelatinas de la presente
invención, o de los polipéptidos de los cuales se derivan las
presentes gelatinas, se construyen preferentemente mutando el
polinucleótido para dar una secuencia de aminoácido que no ocurra
en la naturaleza. Estas alteraciones en los aminoácidos pueden
realizarse en varios puntos que se diferencian en, por ejemplo,
colágenos de diferentes especies (posiciones variables), o en
regiones elevadamente conservadas (regiones constantes). Los puntos
en tales localizaciones se modificarán normalmente en serie, por
ejemplo, sustituyendo en primer lugar con las opciones
conservadoras (por ejemplo, aminoácido hidrofóbico por un
aminoácido hidrofóbico diferente) y a continuación opciones más
distantes (por ejemplo, aminoácido hidrofóbico por un aminoácido
cargado), y posteriormente pueden realizarse eliminaciones e
inserciones en el punto objetivo.
Debido a la degeneración inherente del código
genético, pueden emplearse otras secuencias de aminoácido que
codifican sustancialmente la misma o secuencia de aminoácido u otra
funcionalmente equivalente o un polipéptido, natural, sintético,
semi-sintético, o recombinante en origen, en la
práctica de la invención reivindicada. Particularmente, la presente
invención considera las variantes degeneradas, incluyendo las
secuencias optimizadas por el codón. Además, la presente invención
proporciona de manera específica polinucleótidos que son capaces de
hibridizar una secuencia en particular bajo condiciones
rigurosas.
Los métodos presentes se aplican de manera
adecuada a una variedad de sistemas de expresión disponibles para
aquellos profesionales en la técnica. Mientras se describen a
continuación un número de estos sistemas de expresión, debe
entenderse que la aplicación de los métodos presentes no se limita
a las realizaciones específicas aquí establecidas.
Pueden utilizarse una variedad de sistemas de
expresión para contener o expresar secuencias codificadoras de
gelatinas recombinantes de la presente invención o polipéptidos
desde lo cuales se derivan estas gelatinas. Estos incluyen, pero no
se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas
con bacteriófago recombinante, plásmido, o vectores cósmidos de
expresión de ácido nucleico; levadura transformada con vectores de
expresión de levadura; sistemas celulares de insectos infectados con
vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); hongos
filamentosos transformados con vectores de hongos; sistemas
celulares de plantas transformados con vectores de expresión de
virus (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus
del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterial
(por ejemplo, plásmidos pET o Pbr322); o sistema celulares de
animales.
Los elementos de control o secuencias
reguladoras adecuadas para uso en la expresión de polinucleótidos
de la presente invención son aquellas regiones no traducidas del
vector, incluyendo procesadores, promotores, y regiones no
traducidas 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares
huésped para llevar a cabo la trascripción y traducción. Dichos
elementos pueden variar en fuerza y especificidad. Dependiendo del
sistema de vector y huésped empleado, pueden emplearse una variedad
de elementos adecuados de trascripción y traducción.
Los promotores son secuencias no traducidas
localizadas en dirección ascendente desde el codón de inicio del
gen estructural que controlan la trascripción del ácido nucleico
bajo su control. Los promotores inducibles son los promotores que
alteran su nivel de iniciación de trascripción en respuesta a un
cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o
ausencia de un nutriente. Un experto en la técnica conocerá un gran
número de promotores que podrían reconocerse en células huésped
adecuadas para uso en los métodos de la presente invención.
El promotor, procesador, y otros elementos de
control pueden seleccionarse como adecuados por un experto en la
técnica. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacteriales, se
pueden emplear los promotores inducibles como el promotor híbrido
lacZ del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o
plásmido pSPORT1 (GIBCO BRL) y similares. En sistemas de plantas,
los promotores o procesadores derivados de los genomas de células
de plantas (por ejemplo, promotor de corriente de calor, el
promotor para la pequeña subunidad de RUBISCO; el promotor para la
proteína de enlace clorofil a/b; promotores para varios genes de
almacenaje de proteínas, etc.) o de virus de plantas (por ejemplo,
promotores virales o secuencias líder, el promotor 35S ARN de CaMV,
el promotor de proteína de cubierta de TMV, etc.) pueden clonarse
en el vector. En sistemas celulares de mamíferos, los promotores
procedentes de genes mamíferos (por ejemplo, promotor
metalotioneína, promotor-actina, etc.) o de virus
mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío adenovirus, CMV, SV40,
LTR, TK, y los promotores del virus vaccinia 7.5 K, etc) son
preferibles. Si es necesario generar una línea celular que contiene
múltiples copias de la secuencia que codifica el polipéptido
deseado, pueden emplearse vectores basados en SV40 o EBV con un
marcador seleccionable apropiado.
Tales promotores pueden unirse de manera
operativa con los polinucleótidos codificadores de gelatina o con
los precursores de gelatina de la presente invención, retirando el
promotor de su gen nativo y colocando el polinucleótido codificador
en el extremo 3' de la secuencia promotora. Promotores útiles en la
presente invención incluyen, pero no se limitan a, promotores
procarióticos, que incluyen, por ejemplo, promotor de lactosa,
promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de
triptófano, y promotores híbridos como el promotor tac; promotores
de levadura, incluyendo, por ejemplo, el promotor para
3-fosfoglicerato quinasa, otros promotores
glicolíticos de enzima (hexoquinasa, piruvato decarboxilasa,
fosfofructosequinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa, etc.),
el promotor para dehidrogenasa de alcohol, los promotores 1 o 2
oxidasa de alcohol (AOX, el promotor metalotioneína, el promotor de
maltosa, y el promotor de galactosa; y promotores eucarióticos, que
incluyen, por ejemplo, promotores de los virus polioma, difteria
aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de sarcoma
aviar, citomegalovirus, retrovirus, SV40, y promotores desde la
eucariota objetivo, por ejemplo, el promotor glucoamilasa de
Apergillus, promotores de actina y ubiquitina, un promotor
de inmunoglobulina de un mamífero y promotores de colágeno nativo
(Ver, por ejemplo, de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80:21-25; Hitzeman et al. (1980) J.
Biol. Chem. 255:2073); Fiers et al. (1978) Nature 273:113;
Mulligan and Berg (1980) Science 209:1422-1427;
Pavlakis et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:7398-7402; Greenway et al. (1982) Gene
18:355-360; Gray et al. (1982) Nature 295:
503-508; Reyes et al. (1982) Nature
297:598-601; Canaani and Berg (1982) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79:5166-5170; Gorman et al.
(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781; and
Nunberg et al. (1984) Mol. and Cell. Biol.
11(4):2306-2315).
Las secuencias de polinucleótido que codifican
la gelatina y precursores de gelatina de la presente invención
pueden estar bajo control trascripcional de un promotor
constitutivo, que dirigen la expresión de manera general. De modo
alternativo, los polinucleótidos empleados en los métodos presentes
se expresan en un tipo específicos de tejido o célula, o bajo
condiciones ambientales más precisas o controles de desarrollo. Los
promotores que dirigen la expresión en estos casos son conocidos
como promotores inducibles. En el caso en el que se emplea un
promotor específico de tejido, la expresión de proteína es
particularmente elevada en el tejido desde el cual se desea la
extracción de la proteína. En plantas, por ejemplo, dependiendo del
tejido deseado, la expresión puede estar dirigida al endoesperma,
capa aleurona, embrión (o sus partes como escutelo y cotiledones),
pericarpio, tallo, tubérculos de hojas, raíces, etc. Ejemplos de
conocidos promotores específicos de tejido en plantas incluyen el
promotor patatina clase I dirigido al tubérculo, los promotores
asociados con los genes ADPGPP del tubérculo de la patata, el
promotor de soja de \beta-conglicinina (proteína
7S), que conduce a la trascripción dirigida al tallo, y los
promotores dirigidos al tallo procedentes de los genes de zeína de
endoesperma de maíz (Ver, por ejemplo, Bevan et al. (1986)
Nucleic Acids Res. 14: 4625-4638; Muller et
al. (1990) Mol. Gen. Genet 224: 136-146; Bray
(1987) Planta 172:364-370; and Pedersen et
al. (1982) Cell 29:1015-1026).
La trascripción de las secuencias codificadoras
de gelatinas o precursores de gelatina de la presente invención
procedente del promotor a menudo aumenta introduciendo una
secuencia potenciadota en el vector. Los potenciadores son
elementos que actúan con cis, normalmente desde aproximadamente 10
a 30 bp, que actúan para aumentar la velocidad en la iniciación de
trascripción en un promotor. Se conocen muchos potenciadores tanto
para eucarióticas como para procarióticas, y un experto en la
técnica podrá seleccionar un potenciador apropiado para la célula
huésped que interese (Ver, por ejemplo, Yaniv (1982) Nature
297:17-18).
Las gelatinas o precursores de gelatina de la
presente invención pueden expresarse como proteínas segregadas.
Cuando las células construidas empleadas para la expresión de la
proteínas son células huésped no humanas, a menudo resulta
ventajoso sustituir el péptido señalizador segregador de la
proteína de colágeno por un péptido señalizador segregador
alternativo que sea reconocible de manera más eficiente por la
maquinaría segregadora de la célula. La secuencia señalizadora
segregadora adecuada resulta particularmente importante para
obtener expresión óptima de hongos de genes en mamíferos (Ver, por
ejemplo, Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:4642). Otras secuencias señalizadoras para células
procarióticas, de levadura, hongos, insectos o mamíferos son bien
conocidas en la técnica, y un experto en la materia podrá
seleccionar de manera sencilla una secuencia señalizadora apropiada
para la célula huésped en cuestión.
La eficiencia de expresión puede aumentar por
medio de la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema
celular particular que se emplea, tal y como los descritos en la
bibliografía. (Ver, por ejemplo, Scharf, D. et al. (1994)
Results Probl. Cell Differ. 20:125-162). Además,
puede elegirse una variedad de célula huésped por su habilidad para
modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar
la proteína expresada en el modo adecuado. Dichas modificaciones
del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación,
carboxilación, glicosilación, fosforolización, Iipidación,
prenilación, y acilación. Los procesos
post-traslacionales que parten formas "prepro"
de la proteína pueden también emplearse para facilitar la inserción
correcta, y/o la función de plegamiento. Diferentes células huésped
como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, que tienen maquinaría celular
específica y mecanismos característicos para tales actividades
post-traslacionales, pueden elegirse para asegurar
una correcta modificación y procesamiento de la proteína
externa.
De acuerdo con la invención, las secuencias de
polinucleótidos que codifican gelatinas recombinantes o
polipéptidos de los cuales pueden derivarse las gelatinas pueden
expresarse en células huéspedes apropiados. En realizaciones
preferentes de la invención, las secuencias de polinucleótido se
derivan de la secuencia de colágeno de tipo I, libre de secuencia
codificadora para cualquier otro tipo de colágeno, del colágeno de
tipo II, libre de secuencia codificadora para cualquier otro tipo
de colágeno, o del colágeno de tipo III, libre de secuencia
codificadora para cualquier otro tipo de colágeno. En otra
realización, los polinucleótidos codificadores se derivan de
colágeno de tipo I y II en cantidades específicas, de tal modo que
la gelatina se produce o se deriva de los polipéptidos codificados
que contienen una mezcla de colágenos del tipo I y II en cantidades
definidas.
Con le fin de expresar las secuencias que
conducen a la producción de la gelatina presente, las secuencias de
nucleótidos, por ejemplo, una secuencia acortada de colágeno, como
las presentadas en la Tabla 2, se insertan en un vector de
expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos
necesarios para la trascripción y traducción de la secuencia
codificara insertada, o en caso de un vector viral de ARN, los
elementos necesarios para la réplica o traslación.
Los métodos bien conocidos por los expertos en
la técnica pueden emplearse para construir vectores de expresión
que contengan la secuencia codificadora deseada y las señales
apropiadas para el control trascripcional/traslacional. Estos
métodos incluyen técnicas estándar de clonación de ADN, por
ejemplo, técnicas recombinantes in vitro, técnicas
sintéticas, y recombinación in vivo. Ver, por ejemplo, las
técnicas descritas en Maniatis et al., supra; Ausubel
et al., supra; y Ausubel, F. M. (1997) Short Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York,
NY.
NY.
Pueden emplearse varios vectores de expresión
para expresar los polipéptidos presentes. Por ejemplo, un vector de
expresión típico contiene elementos codificadores para un origen de
réplica; un punto de clonación para la inserción de una secuencia
de nucleótido exógeno; elementos que controlan la iniciación de
trascripción del gen exógeno, como un promotor, y elementos que
controlan el proceso de trascripciones, como las secuencia de
trascripción/terminación/poliadenilación. Un vector de expresión
para uso en la presente invención también puede contener las
secuencias que son necesarias para la integración final del vector
en el cromosoma. Además, un gen que codifica el marcador de
selección que está funcionalmente unido con los promotores que
controlan la iniciación de trascripción también puede encontrarse
en el vector de expresión, por ejemplo, un gen de resistencia a
antibióticos para facilitar el crecimiento y selección del vector
de expresión en el huésped.
Los vectores de esta invención pueden replicarse
de manera autónoma en la célula huésped, o pueden integrare en el
cromosoma huésped. Los vectores adecuados con secuencias
replicadoras autónomamente son bien conocidos por una variedad de
bacterias, levaduras, y varias secuencias virales de réplica tanto
para células procariotas como para eucariotas. Los vectores pueden
integrarse en el genoma de la célula huésped cuando tienen una
secuencia de ADN que es homóloga a la secuencia encontrada en el
ADN genómico de la célula huésped.
Para producción a gran escala a y a largo plazo
de proteínas recombinantes, es preferible la expresión estable. Por
ejemplo, líneas celulares que expresan establemente los presentes
polipéptidos pueden transformarse usando vectores de expresión que
contienen orígenes virales de réplica o elementos apropiados de
expresión (p.ej., promotores, potenciadores, terminadores de
trascripción, puntos de poliadenilación, etc.) y un gen marcador
seleccionable sobre el mismo vector o sobre un vector separado.
Tras la introducción de los vectores, se deja que las células
crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y
a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador
seleccionable en el plásmido recombinante ofrece resistencia a la
selección, permitiendo el crecimiento y la recuperación de las
células que expresan de manera correcta las secuencias
introducidas. Los clones resistentes de las células establemente
transformadas pueden proliferar usando técnicas de cultivo de
tejido apropiadas para el tipo de célula. Este método puede
emplearse de manera ventajosa para producir líneas celulares que
expresan un polipéptido deseado.
La expresión de varias secuencias empleadas en
los métodos de la presente invención provocada por, por ejemplo,
promotores de galactosa puede inducirse por el cultivo de un
cultivo en azúcar que no sea capaz de contener ni provocar de modo
que una rápida inducción vaya a continuación de la adición de
galactosa; cultivando el cultivo en un medio de glucosa y a
continuación retirando la glucosa mediante centrifugación y lavando
las células antes de la resuspensión en medio de galactosa; y
cultivando las células en un medio que contiene tanto glucosa como
lactosa de modo que la glucosa se metaboliza preferentemente antes
de que se de la inducción de la galactosa.
Puede emplearse un gran número de sistemas de
selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos
incluyen, aunque no se limitan a, el gen de la timidina quinasa del
virus herpes simple y el gen adenina
fosforibosil-transferasa que pueden emplearse en
células tk o aprf, respectivamente. (Ver, por ejemplo,
Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32;
Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23). Así
mismo, la resistencia a los antimetabolito, antibiótico o
herbicidas puede emplearse como base para la selección. Por lo
tanto, la presente invención contempla el uso de dichos marcadores
seleccionables, por ejemplo: dhfr, que confiere resistencia a
metotrexato; npt, que confiere resistencia a aminoglicósidos
neomicina y G-418; y als o pat, que
confieren resistencia a clorsulfurón y a fosfinotricin
acetiltransferasa, respectivamente. (Ver, p. ej., Wigler, M. et
al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570;
and Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol.
Biol. 150:1-14).
Se han descrito gentes seleccionables
adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células
utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite
que las células utilicen histinol en lugar de histidina. (Ver, p.
ej., Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. 85:8047-51). Recientemente, el uso de
marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como
antocianinas, \beta-glucuronidasa y sus sustrato
GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, ahora ampliamente
empleada no sólo para identificar transformantes, sino también para
cuantificar la cantidad de expresión proteica pasajera o estable
atribuible a un sistema específico de vector. (Ver, p. ej., Rhodes,
C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol.
55:121-131).
Tal y como se ha señalado anteriormente, los
vectores de expresión para uso en los métodos de la presente
invención de producción pueden consistir normalmente en un gen
marcador que confiere un fenotipo seleccionable en células.
Generalmente, el gen marcador seleccionable codificará la
resistencia antibiótica, con genes adecuados que incluyen al menos
un conjunto de genes codificadores de la resistencia a antibiótico
espectinomicina, fosfotransferasa estreptomicina (SPT) gen
codificador de resistencia a estreptomicina, fosfotransferasa
neomicina (NPTH) gen codificador de kanamicina o resistencia a
geneticina, el gen de resistencia a higromicina, genes
codificadores de la resistencia a herbicidas que actúan para
inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS), en particular, los
herbicidas del tipo sulfonilurea (por ejemplo, el S4 y/o mutaciones
Hra), genes codificadores de la resistencia a herbicidas que actúan
para inhibir la acción de glutamina sintasa, como fosfinotricina o
basta (por ejemplo, el gen barra), u otros genes similares
conocidos en la técnica. El gen barra codifica la resistencia al
herbicida basta, el gen nptII codifica la resistencia a los
antibióticos kanamicina y geneticina, y el gen ALS codifica la
resistencia al herbicida
clorsulfurón.
clorsulfurón.
Otros métodos para determinar qué células
huésped, tras la transformación, contienen los polinucleótidos de
interés incluyen una variedad de procedimientos conocidos por
aquellos expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen,
pero sin limitación, hibridizaciones con ácido nucleico, incluyendo
hibridizaciones ADN-ADN o ADN-ARN,
y varias técnicas de inmunoensayos y bioensayos con proteínas que
incluyen tecnologías basadas en membrana, solución o chip para
detectar y/o cuantificar los polinucleótidos o polipéptidos.
Además, puede elegirse una variedad de célula
huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o que
modifique o procese el producto gen en el modo específico deseado.
Tales modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesos (p. ej.,
partición) de productos de proteína puede ser importante para la
función de la proteína. Diferentes células huésped tienen
características y mecanismos específicos para el proceso y
modificación post-traslacional de proteínas. Se
pueden elegir líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para
asegurar una modificación y un procesamiento correcto de la
proteína externa expresadas. Con este fin, pueden emplearse células
huésped eucarióticas poseen la maquinaria celular para procesar de
manera óptima la trascripción primaria, incluyendo varias
modificaciones como el plegamiento de proteína, la formación de
enlace disulfuro, glicosilación, y fosforilación del producto gen.
Dichas células huésped de mamíferos incluyen, pero sin limitar a,
CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc.
Las señales específicas de iniciación también
pueden emplearse para conseguir traslación más eficiente de los
polinucleótidos de la presente invención. Tales señales incluyen el
codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los
que las secuencias codificadoras de los polipéptidos presentes,
junto con las secuencias de iniciación y de ascendencia requeridas
para la traslación, etc., se insertan en el vector de expresión
apropiado, no son necesarias señales de control transcripcional o
traslacional. Sin embargo, en casos en los que solamente se
insertan secuencias codificadoras, o porciones de las mismas,
debería proporcionarse señales exógenas de control traslacional que
incluyen el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación
debería estar en el correcto marco de lectura para asegurar la
traslación de todo el objeto insertado. Los elementos exógenos
traslacionales y los codones de iniciación pueden ser de varios
orígenes, tanto naturales como sintéticos. (Ver, p. ej., Bittner
et al. (1987) Meth. En Enzymol. 153:
516-544).
516-544).
Una célula huésped de la presente invención
puede infectarse, trasfectarse o transformarse con al menos un
polinucleótido codificador de una enzima
post-traslacional, además de al menos un
polinucleótido codificador de una gelatina de la presente invención
o de un polipéptido del cual la gelatina puede derivarse. Tales
polinucleótidos incluyen aquellos codificadores de enzimas de
colágeno post-traslacional, como prolil
4-hidroxilasa, colágeno glicosil transferasa,
C-proteinasa, N-proteinasa, lisil
oxidasa, o lisil hidroxilasa, y pueden insertare en células que no
producen de manera natural enzimas
post-traslacionales, por ejemplo, en células de
levadura, o células que no producen de manera natural cantidades
suficientes de enzimas post-traslacionales, por
ejemplo, células de varios insectos y mamíferos, de modo que la
enzima exógena puede ser necesaria para producir ciertos efectos
post-traslacionales. En una realización de la
presente invención, la enzima post-traslacional es
prolil 4-hidroxilasa, y el polinucleótido codifica
la subunidad \alpha y la subunidad \beta de prolil hidroxilasa.
En una realización preferente, los polinucleótidos que codifican la
subunidad \alpha y la subunidad \beta de prolil
4-hidroxilasa se insertan en una célula para
producir enzima prolil 4-hidroxilasa biológicamente
activa, co-expresada con un polinucleótido
codificador de una gelatina o un polipéptido del cual puede
derivarse la gelatina.
Los polinucleótidos que codifican enzimas
post-traslacionales pueden derivarse de cualquier
fuente, ya sea natural, sintética o recombinante. En una
realización preferente, la enzima post-traslacional
se deriva de la misma especie que la gelatina recombinante a
producir. En una realización, la gelatina recombinante a producir
es gelatina recombinante humana, y la enzima
post-traslacional es prolil
4-hidroxilasa humana.
Las gelatinas o los precursores de gelatina
expresados de la presente invención se segregan preferentemente en
medio de cultivo y pueden purificarse para conseguir homogeneidad
por medio de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por
medio de cromatografía. En una realización, la gelatina
recombinante o precursores de gelatina se purifican a través de
cromatografía de exclusión por tamaños. Sin embargo, otras técnicas
de purificación conocidas en la técnica también pueden emplearse,
incluyendo, pero sin limitar a, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y
cromatografía en fase reversa. (Ver, p. ej., Maniatis et
al., supra; Ausubel et al., supra; y
Scopes (1994) Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag New York, Inc.,
NY.).
NY.).
En sistemas procarióticos, como los sistemas
bacteriales, puede seleccionarse cualquier número de vectores de
expresión, dependiendo del uso que se pretenda dar al
polinucleótido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes
cantidades de gelatinas recombinantes de la presente invención, o
péptidos de los que se derivan estas gelatinas, pueden emplearse
vectores que dirigen la expresión con nivel alto de proteínas de
fusión que pueden purificarse fácilmente. Dichos vectores incluyen,
pero no se limitan a, vectores de clonación y expresión de E.
coli multifuncional, como BLUESCRIPT (Stratagene), en el cual
la secuencia codificadora está ligada al vector insertado con
secuencias para la amino-terminal Met y los
siguientes siete residuos de \beta-galactosidasa
de modo que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van
Heeke, G., y S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem.
264:5503-5509); y similares. Los vectores pEX
(Promega, Madison, Wis.) y pET (Invitrogen) también pueden
emplearse para expresar polipéptidos externos como proteínas de
fusión con glutationa S-transferasa (GST). En
general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden
purificar fácilmente a partir de células lisadas por medio de una
variedad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante
absorción para gotas de glutationa-agarosa seguido
de elución en la presencia de glutationa libre. Las proteínas
realizada mediante este sistema pueden diseñarse para incluir
heparina, trombina, o puntos de partición de factor XA proteasa de
modo que el polipéptido clonado de interés puede liberarse del
radical
GST.
GST.
En realizaciones preferentes, la presente
invención proporciona métodos para producir gelatina recombinante
usando un sistema de expresión de levadura. En realizaciones
preferentes, la gelatina se produce directamente a partir de
construcciones alteradas de colágeno. Un número de vectores que
contienen promotores constitutivos,
no-constitutivos, o promotores inducibles pueden
emplearse en sistemas de levaduras. (Ver, p. ej., Ausubel et
al., supra, Capítulo 13). En algunos aspectos, se emplean
los vectores que contienen secuencias que dirigen la integración de
ADN en el cromosoma para la expresión en S. cerevisiea.
En una realización, las gelatinas recombinantes
de la invención, o los polipéptidos de los que se derivan estas
gelatinas, se expresan usando células huéspedes a partir de
levadura Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces
cerevisiae puede usarse con un gran número de vectores de
expresión disponibles en la técnica, incluyendo un número de
vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles como
factor \alpha, AOX, GAL1-10, y PGH. (Ver, p. ej.,
Ausubel et al., supra, y Grant et al. (1987)
Methods Enzymol. 153:516-544). Los vectores de
expresión comúnmente empleados son los vectores lanzadera que
contienen el origen 2 \mu de réplica para la propagación en
levadura en el origen ColE1 para E. coli, incluyendo un
promotor de levadura y un terminador para la trascripción eficiente
del gen externo. Los vectores que incorporan 2 \mu plásmido
incluyen, pero no se limitan a, pWYG4 y pYES2, que tienen los
elementos 2 \mu ORI-STB, el
GAL1-10, etc. En un método de la presente invención,
en el cual se desea un producto hidroxilado, implica la
co-expresión de una enzima de colágeno
post-traslacional, por ejemplo, prolil
4-hidroxilasa. En dicho método, usando el vector
pWYG4, el punto de clonación NcoI se emplea para insertar el gen
bien para la subunidad \alpha o para \beta de prolil
4-hidroxilasa, y para proporcionar el codón de
inicio ATG bien para la subunidad \alpha o para \beta. En un
método, se emplean plásmidos de expresión que dirigen la
integración hacia el cromosoma del
huésped.
huésped.
El vector de expresión pWYG7L, que tiene ORI,
STB, REP1 y REP2 intactos, el promotor GAL7, y el terminador FLP,
también pueden usarse. Cuando se desea la
co-expresión de una enzima
post-traslacional, por ejemplo, prolil
4-hidroxilasa, el gen para para la subunidad
\alpha o \beta de prolil 4-hidroxilasa se
inserta en el polienlace con sus extremos 5' en el punto BamHI o
NcoI. El vector que contiene el gen prolil
4-hidroxilasa se transforma en S. cerevisiae
bien antes o después de la retirada de la pared celular para
producir esferoplastos que toman el ADN en el tratamiento con
calcio y glicol polietileno o mediante el tratamiento de células
intactas con iones de litio. De manera alternativa, ADN puede
introducirse por medio de electroporación. Los transformantes
pueden seleccionarse usando células huésped de levadura que son
auxotróficos para leucina, triptófano, uracil o histidina junto con
los genes marcadores seleccionables como LEU2, TRP1, URA3, HIS3 o
LEU2-D.
En otra realización preferente, los métodos para
producir gelatina recombinante de acuerdo con la presente invención
usan células huésped de la levadura Pichia pastoris, o de
otras especies de levadura
non-Saccharomyces, que poseen ventajas para
producir grandes cantidades de proteína recombinante a gran escala.
Los sistemas de expresión Pichia incluyen ventajas de
sistemas de expresión procarióticos (p. ej., E. coli) - alto
nivel de expresión, fácil ampliación, y crecimiento económico - y
sistemas de expresión eucarióticos - procesamiento de proteínas,
plegamiento, y modificaciones post-traslacionales.
Tales sistemas de expresión pueden construirse usando varios
métodos y kits disponibles para aquellos expertos en la técnica,
los kits PICHIA EXPRESSION disponibles en Invitrogen Corporation
(San Diego, CA).
Existen un número de genes receptivos de metanol
en levaduras metilotróficas como Pichia pastoris, o
Pichia methanolica, etc., estando cada expresión controlada
por las regiones reguladoras receptivas de metanol (también
referidas como promotores). Cualquiera de estos promotores
receptivos a metanol es adecuado para uso en la práctica de la
presente invención. Ejemplos de regiones reguladoras específicas
incluyen el promotor para el principal gen de alcohol oxidasa de
Pichia pastoris AOX1, el promotor para el gen secundario de
alcohol oxidasa de Pichia pastoris AOX2, el promotor FLD1,
el promotor para el gen dihidroxiacetona sintasa de Pichia
pastoris (DAS), el promotor para el gen P40, etc. Normalmente,
la expresión en Pichia pastoris se obtiene a través del
promotor del gen AOX1 rigurosamente controlado (Ver, p. ej., Ellis
et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1111; y Patente U.S Nº
4,855,231). La expresión constitutiva también puede conseguirse
usando, por ejemplo, el promotor GPH.
Otra expresión de levadura preferente para uso
en los métodos de la presente invención emplea la levadura
metilotrófica Hansenula polymorpha. Este sistema puede
emplearse, por ejemplo, en un método de producción de la presente
invención donde se desea una alta producción. El cultivo en metanol
da como resultado la inducción de enzimas clave en MOX (metanol
oxidasa), DAS (dihidroxiacetona sintasa), y FMHD (formato
dehidrogenasa). Estas enzimas pueden formar hasta el
30-40% de la proteína total celular. Los genes
codificadores de la producción de MOX, DAS, y FMDH son controlados
por promotores fuertes inducidos por el cultivo de metanol y
reprimidos por el cultivo en glucosa. Cualquiera de estos tres
promotores o los tres pueden obtener una expresión de alto nivel de
secuencias heterólogas en H. polymorpha, de acuerdo con los
métodos conocidos en la técnica.
En un método de la presente invención, los
polinucleótidos codificadores se clonan en un vector de expresión
bajo el control de un promotor inducible H. polymorpha. Si
se desea secreción del producto, un polinucleótido codificador de
una secuencia señalizadora de la secreción en levadura, como
MF\alpha1, se fusiona en la estructura con la secuencia
codificadora para los polipéptidos de la invención. El vector de
expresión preferentemente contiene un gen marcador auxotrófico,
como URA3 o LEU2, u otro marcador conocido en la técnica, que puede
emplearse para complementar la deficiencia de un huésped
autotrófico. De manera alternativa, pueden emplearse marcadores
seleccionables dominantes como zeocina o blastacina.
El vector de expresión se emplea a continuación
para transformar célula huésped H. polymorpha usando
técnicas conocidas por el experto en la materia. Una característica
interesante y útil de la transformación de H. polymorpha es
la integración espontánea de hasta 100 copias del vector de
expresión en el genoma. En la mayor parte de los casos, las
secuencias integradas forman multímeros que muestran una
disposición "de cabeza a cola". El ADN externo integrado ha
demostrado ser mitóticamente estable en varias variedades
recombinantes, incluso bajo condiciones no selectivas. Este
fenómeno de elevada integración en copia añade además potencial de
productividad del
sistema.
sistema.
La presente invención contempla además la
producción de la gelatina recombinante de la presente invención, o
polipéptidos de los que se deriva la gelatina recombinante, en
sistemas de expresión de plantas, incluyendo células huésped de
plantas y plantas transgénicas (Ver, p. ej., Transgenic Plants: A
Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen
y Pen, eds., John Wiley & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun
y Breiman, eds., Imperial College Press, 1997; and Applied Plant
Biotechnology, Chopra et al. eds., Science Publishers, Inc.,
1999). En caso en los que se emplean vectores de expresión de
plantas, la expresión de las secuencias puede estar conducida por
cualquier número de promotores. Por ejemplo, promotores virales
tales como promotores 35S y 19S de CaMV pueden usarse solos o en
combinación con la secuencia líder de colágeno de TMV. (Ver, p.
ej., Brisson et al. (1984) Nature
310:511-514; and Takamatsu, N. (1987) EMBO
J.6:307-311). Los vectores de expresión de plantas y
genes reporteros son generalmente conocidos en la técnica. (Ver, p.
ej., Gruber et al. (1993) en Methods of Plant Molecular
Biology and Biotechnology, CRC Press).
De manera alternativa, pueden emplearse los
promotores de plantas tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o
los promotores de impacto de calor, por ejemplo, soja
hsp17.5-E o hsp17.3-B (Ver, p. ej.,
Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J.
3:1671-1680; Broglie, R. et al.(1984) Science
224:838-843; Winter, J. et al. (1991)
Results Probl. Cell Differ. 17:85-105; and Gurley
et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565).
Estas construcciones pueden introducirse en células de plantas
usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas,
transformación directa de ADN, microinyección, electroforación,
transfección mediada por patógenos, bombardeo de partículas, o
cualquier otro medio conocido en la técnica, como los descritos en
un número de publicaciones generalmente disponibles. (Ver, p. ej.,
Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and
Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y., pp.
191-196; Weissbach and Weissbach (1988) Methods for
Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp.
421-463; and Grierson and Corey, Plant Molecular
Biology, 2ª Ed., Blackie, London, Ch.
7-9).
7-9).
En varias realizaciones, la gelatina
recombinante de la presente invención, o polipéptidos de los que se
deriva la presente gelatina recombinante, se produce a partir de
semillas por medio de técnicas de producción disponibles basadas en
semillas usando, por ejemplo, semillas de canola, maíz, soja, arroz
y cebada. En dichas realizaciones, la pretina es recubierta durante
la germinación/cambio de la raíz. En otras realizaciones, la
proteína se expresa directamente en el endoesperma o en otra partes
de la planta de moto que la gelatina no se puede extraer, y la
propia planta puede servir por sí misma, por ejemplo, como
suplemente dietético como si fuera una fuente de proteínas.
Los promotores que pueden emplearse para dirigir
la expresión de los polinucleótidos pueden ser heterólogos o no
heterólogos. Estos promotores también pueden usarse para conducir
la expresión de los ácidos nucleicos antisentido hacia la
reducción, aumento, o alteración de la expresión tal y como se
desee. Pueden realizarse otras modificaciones para aumentar y/o
maximizar la trascripción de secuencias en una planta o en células
de plantas que son estándar y conocidas para aquellos expertos en
la técnica. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido
operativamente unidas con un promotor pueden además consistir en al
menos un factor que modifica la velocidad de trascripción de los
polipéptidos codificados, como, por ejemplo, la secuencia
señalizadora de exportar un péptido, el uso de codones, intrones,
señales de poliadenilación, y puntos de terminación de trascripción.
Los métodos de modificación de construcciones de ácido nucleico
para aumentar los niveles de expresión en plantas son generalmente
conocidos por aquellos expertos en la técnica. (Ver, p. ej.,
Roberts et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3731; Cornejo et
al., (1993) Plant Mol Biol 23:567-568). Al
llevar a cabo un sistema de planta que afecte la velocidad de
trascripción de los polinucleótidos, pueden emplearse varios
factores conocidos en la técnica, incluyendo secuencias reguladoras
como las secuencias que actúan positivamente o negativamente,
potenciadores y silenciadores, estructura de cromatina,
etc.
etc.
Los vectores típicos útiles para la expresión de
genes externos en plantas son bien conocidos en la técnica,
incluyendo, pero sin limitar a, vectores derivados del plásmido que
induce tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens. Estos
vectores son vectores integradores de plantas, que tras la
transformación, integran una porción del ADN en el genoma de la
planta huésped. (Ver, p. ej., Rogers et al. (1987) Meth. In
Enzymol. 153:253-277; Schardl et al. (1987)
Gene 61:1-11; and Berger et al. (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:8402-8406).
Los procedimientos para transformar células de
plantas se encuentran disponibles en la técnica, incluyendo, por
ejemplo, transferencia directa de gen, transformación protoplasto
in vitro, transformación mediada por virus de planta,
transformación mediada por liposoma, microinyección,
electroforación, transformación mediada por Agrobacterium, y
aceleración de partícula balística. (Ver, p. ej., Paszkowski et
al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; Patente U.S.
No. 4,684,611; European Application No. 0 67 553; Patente No.
4,407,956; Patente U.S. No. 4,536,475; Crossway et al.
(1986) Biotechniques 4:320-334; Riggs et al.
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:5602-5606;
Hinchee et al. (1988) Biotechnology
6:915-921; and U.S. Patent No. 4,945,050). Métodos
estándar para la transformación de arroz, trigo, maíz, sorgo, y
cebada se describen en la técnica. (Ver p. ej., Christou et
al. (1992) Trends in Biotechnology 10:239; Casas et al.
(1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11212; Wan et al.
(1994) Plant Physiol. 104:37; and Lee et al. (1991) Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA 88: 6389). El trigo puede transformarse
mediante técnicas similares a las empleadas para transformar maíz o
arroz. (Ver, p. ej., Fromm et al. (1990) Bio/Technology
8:833; y Gordon-Kamm et al.,
supra).
supra).
Métodos adicionales que pueden emplearse para
generar plantas o células de plantas que pueden expresar las
gelatinas recombinantes presentes o polipéptidos de los que pueden
derivarse estas gelatinas recombinantes están bien establecidos en
la técnica (Ver, p. ej., Patente U.S. No. 5,959,091; Patente U.S.
No. 5,859,347; Patente U.S. No. 5,763,241; Patente U.S. No.
5,659,122; Patente U.S. No. 5,593,874; U.S. Patente No. 5,495,071;
Patente U.S. No. 5,424,412; Patente U.S. No. 5,362,865; y Patente
U.S No. 5,229,112).
La presente invención comprende además un método
para producir polipéptidos proporcionando una biomasa a partir de
plantas o células de plantas que están formadas por al menos una
secuencia de polinucleótido que codifica una gelatina recombinante,
o un polipéptido del que la gelatina recombinante puede derivarse,
donde dicha secuencia de polipéptido está operativamente enlazada
con un promotor para efectuar la expresión del polipéptido. En una
realización adicional, el método además comprende la
co-expresión de al menos una secuencia de
polinucleótido que codifica una enzima que cataliza una
modificación post-traslacional, o una subunidad de
la misma, donde dicha secuencia de polipéptido está operativamente
enlazada con un promotor. En estos métodos, las gelatinas
recombinantes se extraen de biomasa.
Los hongos filamentosos también pueden emplearse
para producir los polipéptidos de la presente invención. Los
vectores para expresar y/o segregar proteínas recombinantes en
hongos filamentosos son bien conocidos en la técnica, y un experto
en la técnica podría, usando métodos y productos disponibles en la
técnica, usar estos vectores en los métodos ahora presentados.
(Ver, p. ej., Patente U.S No. 5,834,191).
Los sistemas celulares de insectos permiten que
los polipéptidos de la presente invención se produzcan en grandes
cantidades. En uno de estos sistemas, el virus de polihedrosis
nuclear Autographa californica (AcNPV) se emplea como un
vector para expresar genes externos en, por ejemplo, células
Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las
secuencias codificadoras de las gelatinas o precursores de gelatina
de la presente invención pueden clonarse en regiones no esenciales
del virus, por ejemplo, el gen poliedro, y colocarse bajo el control
de un promotor AcNPV, por ejemplo, el promotor poliedro. La
inserción correcta de una secuencia codificará dará como resultado
una inactivación del gen poliedro y la producción de virus
recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de capa
proteica codificada por el gen poliedro). Estos virus recombinantes
se emplean a continuación para infectar célula Spodoptera
frugiperda o Trichoplusia larvae en las que se expresan
los polinucleótidos codificadores de las gelatinas o precursores de
gelatina. (Ver, p. ej. Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc.
Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227; Smith et
al.(1983) J. Virol. 46:584; y Patente U.S. No. 4,215,051). Más
ejemplos de este sistema de expresión pueden encontrarse en, p.
ej., Ausubel et al. (1995), supra.
La producción recombinante de los polipéptidos
de la presente invención puede lograrse en células de insectos, por
ejemplo, a través de infección de vectores de baculovirus que
contienen las secuencias apropiadas de baculovirus, incluyendo
aquellas que codifican enzimas post-traslacionales
que puedan ser necesarias. Los baculovirus son vectores de
expresión muy eficientes para la producción a gran escala de varias
proteínas recombinantes en células de insectos. Pueden emplearse
varios métodos conocidos en la técnica para construir vectores de
expresión que contengan una secuencia codificadora de la gelatina o
un precursor de gelatina de la presente invención y las señales
adecuadas para control trascripcional/traslacional. (Ver, por
ejemplo, Luckow et al. (1989) Virology
170:31-39; y Gruenwald, S. y J. Heitz (1993)
Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods
Manual, Pharmingen, San Diego,
CA).
CA).
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La presente invención proporciona métodos para
expresar las gelatinas recombinantes de la presente invención, o
polipéptidos de los que las gelatinas recombinantes pueden
derivarse, en sistemas de animales. Dichos sistemas incluyen
células huésped de mamíferos e invertebrados y de animales
transgénicos. En células huésped de mamíferos, puede utilizarse un
número de sistemas de expresión. En casos en los que se emplea un
adenovirus como un vector de expresión, las secuencias codificadoras
de los polipéptidos de la presente invención pueden estar ligadas a
un complejo trascripción/traslación de adenovirus consistente en el
promotor tardío y en la secuencia líder tripartita. Este gen
quimérico pueden insertarse a continuación en el genoma adenovirus
por medio de una recombinación in vitro o in vivo. La
inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral puede
emplearse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar
los polipéptidos de la presente invención en células huésped. (Ver,
p. ej., Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
81:3655-3659). De manera alternative, puede
emplearse el promotor de vacuna 7.5 K. (Ver, p. ej., Mackett et
al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79:7415-7419 (1982); Mackett et al. (1984),
J. Virol. 49:857-864; and Panicali et al.,
(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931).
Además, varios potenciadores de trascripción conocidos en la
técnica, como el el potenciador del virus del Sarcoma de Rous
(RSV), puede emplearse para aumentar la expresión en, por ejemplo,
células huésped de mamíferos.
El virus de los bosques de Semliki es un sistema
de expresión preferente debido a que el virus tiene una amplia gama
de huéspedes de modo que la infección de líneas celulares en
mamíferos es posible. La infección de células huéspedes en
mamíferos, por ejemplo, células del riñón de un bebé hámster (BHK)
y las células de un ovario de un hámster chino (CHO), usando el
mencionado vector viral puede producir altos niveles de expresión
recombinante. Más específicamente, se considera que el virus de los
bosques de Semliki puede emplearse en una amplia variedad de
huéspedes, ya que el sistema no se basa en integración de
cromosomas, y por lo tanto será un modo rápido de obtener
modificaciones de las gelatinas recombinantes en estudios dirigidos
a la identificación de la relación
estructura-función y comprobar los efectos de
varias moléculas híbridas. Métodos para construir vectores del
virus de los bosques de Semliki para la expresión de proteínas
exógenas en células de mamíferos son conocidos en la técnica y se
describen en, por ejemplo, Olkkonen et al. (1994) Methods
Cell Biol 43:43-53.
Además, las células CHO deficientes en
dihidrofolato reductasa (dhfr) puede transfectarse con un plásmido
de expresión que contenga un gen dgfr y el polinucleótido deseado.
La selección de células CHO resistentes a las concentraciones
crecientes de metotrexato sufrirán una amplificación del gen,
proporcionando niveles de expresión más altos de la proteína
recombinante deseada, tal y como se conoce en la técnica.
Los sistema de animales transgénicos también
pueden emplearse para expresar las gelatinas de la presente
invención o los polipéptidos de los cuales estas gelatinas
recombinantes pueden derivarse. Dichos sistemas pueden construirse,
por ejemplo, en mamíferos enlazando operativamente un polipéptido
codificadora con un promotor y otras secuencias necesarias u
opcionales capaces de llevar a cabo la expresión en las glándulas
mamarias. De este modo, las enzimas
post-traslacionales requeridas u opcionales que
llevan a cabo modificaciones post-traslacionales,
pueden producirse simultáneamente en la células objetivo empleando
sistemas de expresión adecuados. Métodos para usar animales
transgénicos para producir proteínas de manera recombinante son
bien conocidos en la técnica. (Ver, p. ej., Patente U.S. No.
4,736,866; Patente U.S. No. 5,824,838; Patente U.S. No. 5,487,992;
y Patente U.S. No. 5,614,396; y Solicitud
co-pendiente U.S. Nº Serie 08/987,292).
La presente invención contempla particularmente
el uso de gelatinas recombinantes de la presente invención como
componentes de varios productos farmacéuticos, incluyendo vacunas.
(Ver, p. ej., Solicitud co-pendiente, comúnmente
apropiada, WO 01/34646). Por consiguiente, en un aspecto, la
presente invención proporciona una formulación para una vacuna
consistente en la gelatina recombinante. En una realización
preferente, la gelatina recombinante se deriva de fuentes humanas.
Las gelatinas recombinantes presentes ofrecen una ventaja que
previamente no se encontraba disponible en la técnica: usando
gelatinas derivadas de secuencia de colágeno humano nativo se
reduce por lo tanto el riesgo de inmunogenicidad y/o antigenicidad
de la propia gelatina. En una realización específica de la presente
invención, se proporciona una vacuna consistente en gelatina
recombinante no inmunogénica. (Ver Ejemplo 12). En una realización
adicional, la gelatina recombinante no inmunogénica se deriva de
fuentes animales, por ejemplo, de secuencias bovinas o porcinas. En
realizaciones adicionales, la gelatina recombinante no inmunogénica
comprende una secuencia no nativa.
Además, debido a que las gelatinas presentes se
producen de manera recombinante en un medio controlado, el riesgo
de infección, por parte de agentes infecciosos como TSEs, bacterias
patológicas, o virus, o el riesgo a la exposición a endotoxinas y
patógenos introducidos durante o después del proceso, se eliminan
de manera virtual. Es otro objeto de la invención proporcionar
agentes estabilizadores mejorados que incluyan gelatinas
recombinantes, y derivados, fragmentos, o equivalentes funcionales
de los mismos, teniendo cada uno características físicas y químicas
optimizadas para aplicaciones particulares.
La estabilidad es un factor crítico en el
desarrollo de la vacuna, donde debe dirigirse a la inestabilidad
relativa de la mayoría de los virus existentes. Las vacunas pueden
degradarse a medida que transcurre el tiempo, perdiendo potencia y
efectividad. Demás, las vacunas se distribuyen en todo el mundo, y
en una gran variedad de medios y condiciones. El envío de vacunas a
países en vías de desarrollo, por ejemplo, ha resultado
problemático en ocasiones debido a las condiciones imperfectas de
almacenamiento, incluyendo, por ejemplo, altas temperaturas en el
ambiente. Bajo ciertas condiciones de almacenaje y/o transporte, la
estabilidad de una formulación para vacuna puede cumplirse. (Ver,
p.ej., Chang, A. C. et al. (1996) J. Pharm. Sci.
85:129-132; Koyama, K. et al. (1996); Osame,
J., European Patent No. 0 568726 B1; y Patente U.S. No.
4,337,242).
La estabilización de vacunas hace referencia al
mantenimiento de la seguridad y efectividad de una vacuna. Por lo
tanto, los agentes estabilizadores son compuestos que llevan a cabo
una variedad de diferentes tareas. Por ejemplo, con vacunas vivas,
como sarampión, paperas, rubéola, y distémper canino, la
estabilidad implica el mantenimiento del título infeccioso/infección
de la vacuna y la habilidad para provocar la respuesta inmune
apropiada. Con vacunas inactivadas, como la de la gripe, Hepatitis
A, poliomielitis (IPV), y rabia, así como vacunas producidas a
partir de toxinas proteicas bacteriales purificadas, como la cólera
o tos ferina, la habilidad para producir la respuesta inmune
necesaria requiere el mantenimiento de la integridad estructural de
la vacuna, con el fin de preservar la estructura antigénica y la
correcta presentación estérica de epítopes relevantes. Por lo
tanto, existe una necesidad por una estabilización efectiva de
preparaciones de vacunas en previsión a varios tiempos de
almacenaje, y varias condiciones de almacenaje, transporte y
uso.
Los métodos actuales de estabilización buscan
mejorar el almacenaje y la estabilidad, impulsar las respuestas
inmunológicas hacia el agente infeccioso asegurando el envío
apropiado in vivo, y proporcionando formulaciones que
contienen el potencial para reducir el número de inmunizaciones
requeridas para la eficacia protectoras. Varios métodos de
estabilización, como el uso de bajas temperaturas, procesos de
liofilización, y estabilizadores químicos, han sido empleados en el
pasado. Las instalaciones de almacenaje a bajas temperaturas, por
ejemplo, ofreciendo condiciones de almacenaje de desde
aproximadamente -10ºC hasta -70ºC, pueden facilitar un método para
mantener la estabilidad de formulaciones para vacunas. Sin embargo,
estas facilidades no siempre se encuentran disponibles durante el
transporte o la distribución de vacunas. Mantener una adecuada
"cadena de frío" en servicios e instalaciones puede resultar
difícil a la vista de que la adecuada infraestructura requerida
para controlar y mantener el equipo necesario, y para proteger la
formulación de la vacuna desde su desarrollo hasta su
administración.
Otra técnica de estabilización incluye el uso de
varios procedimientos de liofilización y secado por congelación. La
liofilización es un procedimiento razonablemente eficaz pero caro.
El proceso de liofilización requiere tres fases distintas
(congelación, primer secado, y segundo secado), y cada una de los
cuales presenta dificultades para mantener la conformación nativa y
la actividad de macromoléculas y microorganismos biológicos. (Ver,
p. ej., Burke et al. (1999) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier
Syst. 16:1-83, y referencias aquí incluidas). Las
vacunas liofilizadas permanecen bastante estables en
aproximadamente 4º a 8º, pero sufren deterioración a lo largo del
periodo de almacenaje. Las vacunas liofilizadas se deterioran
lentamente hasta que, aproximadamente tras 12 a 24 meses de
almacenaje, la formulación para vacuna carece del suficiente título
como para conferir inmunización. Además, las formulaciones de
vacunas liofilizadas deben reconstituirse antes de su uso.
Añadidamente, la preparación líquida reconstituida pierde potencia
mientras se encuentra a temperatura ambiente. Esto puede resultar
en una respuesta inmune imperfecta y pueden llevar a aumentar el
número de inmunización requerida para conseguir una eficacia
protectora.
En otra técnica para conferir estabilidad, se
añaden los agentes estabilizadores a la formulación de la vacuna y
se emplean junto con métodos de almacenamiento a baja temperatura o
métodos de liofilización. Estos estabilizadores pueden llevar a
cabo una serie de funciones dirigidas al mantenimiento de la
estabilidad, incluyendo, por ejemplo, mantener el pH de la
formulación, contribuir a la viscosidad y/o tonicidad, asistir en
liberación controlada, minimizar la agregación y precipitación de
componentes en la formulación, y hidratar componentes de la
formulación, para prevenir daño causado por la deshidratación
durante la desecación y/o posterior almacenaje durante largos
periodos de tiempo, que pueden incluir hidratación preferencial de
constituyentes proteicos para mantener la conformación proteica
nativa. Con el fin de maximizar los efectos estabilizadores de
estos materiales, los estabilizadores a menudo se emplean en
combinación, de modo que el efecto estabilizador pueda aumentar
sinergísticamente o aditivamente.
Por lo tanto, los estabilizadores empleados en
la formulación de vacunas incluyen, pero no se limitan a, búferes;
sales, como cloruro sódico o cloruro magnésico; aminoácidos, como
glutamato sódico, arginina, lisina, y cisteína; monosacáridos, como
glucosa, galactosa, fructosa, y manosa; disacáridos, como sacarosa,
maltosa, y lactosa; alcoholes de azúcar, como sorbito y manitol;
polisacáridos, como oligosacáridos, almidón, celulosa, y derivados
de los mismos; albúmina de suero humano y albúmina de suero bovino;
diversos antioxidantes, como ácido ascórbico; y gelatina, como
gelatina hidrolizada.
La gelatina hidrolizada ha sido empleada como un
componente de vacunas, por ejemplo, como agente estabilizador para
formulaciones líquidas o liofilizadas. (Ver, p. ej., Patente U.S.
No. 4,985,244; Patente U.S. No. 4,147,772;. Patente U.S No.
4,338,335; and Makino, S. et al. Patente Europea No. 0 295
043 B1). Las gelatinas parcialmente hidrolizadas disponibles hoy en
día se derivan de gelatinas producidas por medio de métodos
convencionales de extracción a partir de materias primas animales.
(Ver p. ej., Asghar, A. (1982) Adv. Food Res.
28:231-372; y Miller, E. J. et al. (1982)
Methods in Enzymology 82:33-64).
La gelatina puede servir para estabilizar
vacunas, por ejemplo, vacunas liofilizadas, en diferentes fases. La
liofilización implica varios extremos, incluyendo extremos de
temperaturas, pH, concentraciones de sal, etc. Las reacciones Redox
pueden ocurrir cuando se retira el disolvente, y las sustancias
solubles se concentran y secan. Varias características de la
gelatina, incluyendo su superficie activa, propiedades para
adherir, emulsionar y potenciadoras de viscosidad, pueden
contribuir a sus efectos estabilizadores cuando se empelan en tales
circunstancias.
Mientras que las gelatinas liofilizadas de
fuente animal han sido empleadas con cierto éxito, éstas son
esencialmente proteínas externas para el sistema humano, y por lo
tanto capaces de causar respuestas antigénicas y/o inmunogénicas no
deseables. Además, los materiales actualmente disponibles son
plagados por problemas de variabilidad y pureza. La preocupación
por la presencia de agentes infectivos como TSEs en proteínas
derivadas de animales ha llevado a restricciones gubernamentales y
reguladoras en relación a la recuperación y uso de tales animales.
Por ejemplo, los niveles de endotoxina de materiales comerciales
normalmente oscilan entre 1.0 y 1.5 EU/mg de gelatina. (Ver, p.
ej., Schaegger, H. y G. von Jagow (1987) Anal. Biochem.
166:368-379; y Friberger, P. et al. (1987)
en "Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus
Ameobocyte Lysate Test," Prog. Clin. Biol. Res.
231:149-169).
Las gelatinas recombinantes de la presente
invención empleadas como componente de vacunas, y métodos para
producir dicha gelatina recombinante. En un aspecto, la gelatina
recombinante es gelatina recombinante humana. En los métodos de la
presente invención, los niveles de endotoxina pueden reducirse por
dos o tres órdenes de magnitud a partir de aquellos de las
gelatinas actualmente disponibles derivadas de fuentes animales.
(Ver Ejemplo 8). Por consiguiente, la presente invención
proporciona, en una realización, una gelatina recombinante que es
virtualmente libre de endotoxinas.
Además, la presente invención proporciona
particularmente una gelatina no inmunogénica. En una realización,
la presente invención proporciona una vacuna consistente en
gelatina recombinante, donde la gelatina recombinante es gelatina
humana. El uso de tal material como componente en formulaciones
para vacunas puede reducir el riesgo de inmunogenicidad actualmente
presente debido al uso de componentes de gelatina derivados de
animales. (Ver, p. ej., Sakaguchi e Inouye, supra; Sakaguchi
et al., supra; Nakayama et al., supra;
Asher, supra; y Verdrager, supra). El uso de gelatina
derivada de secuencias humanas nativas reducirá el riesgo de una
respuesta inmunogénica al producto de gelatina tras la
administración. En una realización, la presente invención
proporciona el uso de gelatinas recombinantes codificadas por
construcciones alteradas de colágeno, donde las gelatinas
codificadas son no inmunogénicas. (Ver Ejemplo 12). Tales gelatinas
recombinantes pueden construirse usando ensayos diseñados para
identificar regiones responsables de producir respuestas
inmunogénicas y antigénicas, y las gelatinas recombinantes de la
presente invención pueden construirse específicamente para evitar
estos dominios.
Además de proporcionar un material de gelatina
sin riesgos de antigenicidad, inmunogenicidad e Infectividad
asociados con el uso de materiales derivados de animales, la
presente invención permite una fuente reproducible de producto
consistente. Particularmente, las gelatinas presentes ofrecen una
mezcla homogénea de moléculas idénticas. Las características
físicas deseadas en una aplicación médica particular pueden
introducirse específicamente y lograrse consistentemente. Por
consiguiente, la presente invención es capaz de proporcionar un
producto fiable y consistente que minimizará la variabilidad
asociada con la disponibilidad y uso de productos de gelatina
actuales.
Las gelatinas recombinantes de la presente
invención pueden diseñarse para poseer propiedades físicas
específicas adecuadas para uso en aplicaciones particulares. La
presente invención proporciona métodos para variar fas
características tales como peso molecular, fuerza de gel, y pH de la
formulación final de gelatina para producir gelatinas con
propiedades específicas deseadas, y por lo tanto cumple los
requisitos del cliente hasta un grado inalcanzable por parte de
materiales actualmente disponibles. Además, dichas formulaciones
permiten que el cliente explore mejoras de procesos y formulaciones
existentes, y que desarrolle nuevas aplicaciones para las gelatinas
recombinantes presentes.
Con respecto al problema de pureza, la presente
invención proporciona gelatinas recombinantes que virtualmente están
libre de endotoxinas. (Ejemplo 8). Además, se eliminan virtualmente
los riesgos asociados con variabilidad y con los problemas en
reproducción y predicción de comportamiento ya que las gelatinas
recombinantes de la presente invención pueden contener polipéptidos
de gelatina con características y comportamientos muy bien
definidos. En una realización, la presente invención proporciona una
composición formada por una mezcla homogénea de polipéptidos de
gelatina recombinante. En una realización adicional, la presente
invención proporciona una mezcla heterogénea de polipéptidos de
gelatina recombinante.
En una realización, la invención comprende
gelatinas recombinantes con pesos moleculares específicos. (Ver
Ejemplo 1).
Las gelatinas recombinantes que están formadas
por polipéptidos uniformes de pesos moleculares específicos se
administran de manera específica. Las gelatinas actualmente
empleadas en vacunas son normalmente fragmentos hidrolizados de
aproximadamente 60 kDa o menos. Dichos fragmentos son preferentes,
por ejemplo, para reducir el riesgo de respuesta inmunogénica a la
gelatina. Las gelatinas presentes pueden proporcionarse como
polipéptidos de pequeños pesos moleculares. Además, usando los
métodos de la presente invención, las gelatinas recombinantes no
inmunogénicas específicas pueden construirse identificando regiones
en un colágeno o secuencia colagenosa responsables de la producción
de una respuesta inmunogénica, y produciendo una gelatina
recombinante que no contenga esa región. (Ver, p. ej., Ejemplo
12).
Debe tenerse en cuenta que la gelatina se emplea
en el proceso y preparación de vacunas y en la aparición como un
componente en las formulaciones para vacunas. Las gelatinas
recombinantes de la presente invención pueden emplearse en pasos de
preparación y procesamiento, y proporcionar diferentes ventajas
sobre los productos derivados de animales actualmente empleados.
Por ejemplo, las gelatinas de la presente invención pueden
producirse como moléculas consistentes con propiedades definidas y
caracterizadas, limitando la variabilidad en la actuación
permitiendo un refinamiento y una reproducción de los
procedimientos de fabricación.
Las distribuciones de peso molecular de las
gelatinas solubles derivadas de animales disponibles en el mercado
son aquellas empeladas en la formulación de vacunas, que oscilan
entre aproximadamente 0 y 30 kDa y entre aproximadamente 0 y 60
kDa. (Ver Ejemplo 9).
La presente invención proporciona múltiples
métodos para I producción de gelatina recombinante del peso
molecular apropiado par uso en una aplicación en concreto. Por
ejemplo, se obtiene gelatina recombinante con el tamaño apropiado a
través de la expresión de gelatina recombinante de una construcción
alterada de colágeno (Ver Ejemplo 1).
La presente invención proporciona la producción
de gelatinas recombinantes específicamente construidas, mediante la
manipulación de enlaces cruzados, hidroxilación, peso molecular, o
una combinación de los mismos, para poseer características termales
específicas adecuadas para aplicaciones particulares. En un
aspecto, la invención proporciona gelatina recombinante, adecuada
para uso como agente estabilizador o excipiente para vacunas, que
mejora la estabilidad termal, incluso cuando estas vacunas se
someten a elevadas temperaturas durante largos periodos de tiempo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona agentes
estabilizadores adecuados para uso en asociación con ciertas
vacunas cuyos componentes activos son sensibles al calor,
incluyendo vacunas virales como, por ejemplo, fiebre amarillas. En
una realización, la presente invención proporciona una gelatina
recombinante que estabiliza vacunas a temperatura bajo cero.
Hay que señalar que la presente invención
considera particularmente que las gelatinas recombinantes presentes
pueden facilitar una fuente aceptable de material para uso por
parte de poblaciones cuya religión u otros factores excluyan el uso
de materiales derivados de fuentes animales particulares, por
ejemplo, de fuentes bovinas o
porcinas.
porcinas.
En una realización, las vacunas de la presente
invención pueden fabricarse de forma
listo-para-usar, como en
jeringuillas rellenas o en forma de microcápsulas, eliminando la
necesidad de un posterior proceso antes del uso.
La gelatina hidrolizada se emplea como
estabilizador en las actuales formulaciones para vacunas. La
presente invención proporciona en una realización una gelatina
recombinante con características similares a la gelatina
hidrolizada procedente de fuente animal, por ejemplo, pesos
moleculares similares, temperaturas de fusión, etc. Estas gelatinas
recombinantes pueden producirse directamente a partir de
construcciones alteradas de colágeno. La presente invención
proporciona gelatinas que son reproducibles y proteínas bien
caracterizadas con propiedades definidas. Por lo tanto, las
gelatinas recombinantes empleadas, en la preparación y fabricación
de vacunas y/o estabilizadores y componentes de vacunas, pueden
producirse de acuerdo con los métodos presentes para que tengan
características controladas y particulares. El uso de las gelatinas
presentes permite por lo tanto que los marcadores de vacunas tengan
la oportunidad de afinarse y minimizar la variabilidad en sus
procesos de producción, así como usar gelatina recombinante de un
modo más efectivo y con unos costos más eficientes en comparación
con los productos de origen animal que actualmente se encuentran
disponibles.
Particularmente se contempla que las gelatinas
recombinantes de la presente invención pueden usarse en cualquier
tipo de vacuna. Por ejemplo, las presentes gelatinas recombinantes
pueden usarse en vacunas vivas atenuadas, inactivadas, y vacunas
subunidad, en dosis únicas o en vacunas de combinación, en vacunas
basadas en virus, basadas en bacterias, basadas en parásitos, y de
ácido nucleico, incluyendo vacunas sintéticas y semi-
sintéticas.
La presente invención puede formularse de
cualquier modo apropiado para la vacuna en particular, por ejemplo,
como formulaciones líquidas o secadas por congelación. Más en
particular, la invención hace referencia a composiciones que
estabilizan vacunas virales líquidas y liofilizadas y fármacos
basados en proteínas. Se tienen en consideración diferentes tipos
de vacunas, dirigidas a varios microorganismos, incluyendo virus,
bacterias y parásitos, etc. Por ejemplo, las gelatinas recombinantes
de la presente invención pueden emplease en la formulación de, p.
ej., vacunas vivas, inactivadas, o subunidad.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una vacuna subunidad consiste en la gelatina recombinante de la
presente invención. En una realización adicional, la vacuna
subunidad consiste en gelatina recombinante no inmunogénica. En
varias realizaciones, la gelatina recombinante se produce
directamente a partir de construcciones alteradas de colágeno, en
una mezcla homogénea de uniforme peso molecular, y tiene una
temperatura de fusión más apropiada para la formulación particular
de la vacuna y el mecanismo de envío. En otra realización, la
gelatina human recombinante consiste en una secuencia seleccionada
del grupo formado por SEQ ID NOS: 15 hasta 25, 30, 31 y
33.
33.
Las gelatinas recombinantes de la presente
invención pueden emplearse como estabilizadores en cualquier vacuna
dirigidas a un agente infectivo. Ejemplos de tales vacunas
incluyen, peor no se limitan a, vacunas para virus vaccinia
(viruela), virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola,
difteria, tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes),
tos ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG,
tubercuolosis), haemophilus influenzae meningitis, rabia,
cólera, plaga, virus de encefalitis japonesa, Salmonella
typhi, shigella, hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre
amarilla, fiebre aftosa, virus herpes simple, virus sincitial
respiratorio, rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus
herpes del pavo (Enfermedad de Marek), gripe, virus paragripal,
virus sincitial respiratorio (RSV), tifus, neumonía, enfermedad de
Lyme y ántrax. El término vacuna tal y como aquí se emplea, incluye
referencias a vacunas para varias enfermedades infecciosas y
autoinmunes y cánceres que han sido o serán desarrolladas, por
ejemplo, vacunas para varias enfermedades infecciosas y autoinmunes
y cánceres, p. ej., vacunas para el virus de la inmunodeficiencia
(VIH), virus de hepatitis C (VHC), y malaria, y vacunas para cáncer
de pecho, pulmón, colon, riñón, vejiga y
ovario.
ovario.
La presente invención engloba formulaciones
dirigidas a varios tipos de envío. Las vacunas pueden formularse
para inyección, incluyendo, por ejemplo, inyección subcutánea,
parenteral, p. ej., intramuscular, e intravenosa. En una
realización, la vacuna es formulada para envío a una superficie de
la mucosa, como para envío oral o nasal, en spray, líquido, u otra
forma. En un aspecto adicional, tales formulaciones incluyen
procesadores de absorción en mucosa cuando es apropiado. Las
vacunas formuladas como inhalantes, p. ej., para envío profundo al
pulmón, se consideran de manera específica. Dicha vacuna puede
formulare, por ejemplo, en forma de polvo fino. Las vacunas de la
presente invención también podrían formularse para envío
transdérmico y liposomal. Se contemplan de manera particular varias
formulaciones adecuadas para, p. ej., liberación entérica.
Las formulaciones para vacunas de la presente
invención pueden incluir vacunas que tienen como objetivo ser
vacunas comestibles, como vacunas alimenticias, en las cuales el
antígeno se envía en forma comestible, como plantas transgénicas,
p. ej., patatas, son capaces de inducir la respuesta protectora
apropiada. (Ver, p. ej., Tacket, C. O. et al. (2000) J.
Infect. Dis. 182:302-305; and Richter, L. J. et
al. (2000) Nat. Biotech. 18:1167-1171). Las
vacunas de la presente invención pueden facilitarse en forma de
plantas transgénicas, p. ej., frutas comestibles, como plátanos o
fresas.
La encapsulación de la presente invención, por
ejemplo, en microesferas, se considera de manera específica. (Ver,
p. ej., Moldoveanu, Z. et al. (1993) J. Inf. Dis.
167:85-90). Se contemplan específicamente las
tecnologías de liberación controlada disponibles para aquellos
expertos en la técnica pueden aplicarse para obtener formulaciones
apropiadas en, por ejemplo, varias formas de liberación, como p.
ej., formas de liberación trasndérmica, pulmonar y
polimérica.
polimérica.
Rutas adecuadas de administración pueden
incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal o
intestinal y envío parenteral, incluyendo inyecciones
intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones
intratecales, intraventricular directa, intravenosa,
intraperitoneal, intranasal, o intraocular. También se contemplan
formulaciones para liberación entérica, etc. La composición puede
administrarse de una manera local en lugar de sistémica.
Las técnicas para varias formulaciones y
sistemas de envío de fármacos están disponibles en la técnica y se
describen en numerosas fuentes. (Ver, p. ej., Remington's
Pharmaceutical Siences, supra). La ruta más efectiva y
convenientes de administración y la formulación más apropiada para
una situación particular puede determinarse sencillamente a través
de métodos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos explican la invención
con más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se
presentan para permitir que aquellos expertos en la técnica
comprendan más claramente pongan en práctica la presente invención.
Sin embargo, la presente invención no se limita al alcance dado por
las realizaciones ejemplificadas, que solamente pretenden ser
ilustraciones de aspectos únicos de la invención, y métodos que son
funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la
invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además
de las aquí descritas resultarán aparentes para aquellos expertos
en la técnica a partir de la precedente descripción y de las
figuras acompañantes. Dichas modificaciones pretenden situarse
dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique lo contrario, los
siguientes materiales y métodos se emplearon en los ejemplos de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se amplificaron fragmentos específicos de
\alpha1(1) ADN de colágeno humano del tipo I mediante PCR
y se clonaron en el plásmido pPICZ\alphaA o pPIC9K (Invitrogen
Corp., Carlsbad, CA). Los cebadores específicos PCR empleados en la
clonación se establecen en la Tabla 1 a continuación. Las gelatinas
recombinantes específicas se identifican en la Tabla 2 como SEQ ID
Nos: 15 hasta 25, y 30, 31 y 33. Estas gelatinas recombinantes se
identifican adicionalmente por referencia a colágeno humano prepro-
\alpha1(1). (Número de Acceso Genbank CAA98968). Los
plásmidos de expresión empleados contenían secuencias
\alpha1(1) cADN de diferentes tamaños fusionadas con la
secuencia prepro de secreción factor alpha de apareamiento de
levadura. También pueden emplearse otras secuencias señalizadoras
conocidas en la técnica, por ejemplo, invertasa de levadura (SUC2),
secuencias de fosfatasa ácida de levadura (PHO), la secuencia
señalizadora de pro-colágeno nativo, y la secuencia
señalizadora para albúmina de suero humano. Debe elegirse una
secuencia señalizadora que proporcione el nivel óptimo de expresión
para un fragmento específico de gelatina en un sistema específico
de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos de expresión se insertaron en
células Pichia pastoris por medio de electroporación, y las
partes transformadas fueron seleccionadas por complementación de
una auxotrofía his4 (vectores pPIC9K) o por resistencia a
zeocina (vectores pPICZ\alphaA). La expresión de gelatina
recombinante fue controlada por parte del promotor de alcohol
oxidasa inducible por metanol (P_{AOX1}). Las células huésped
Pichia pastoris contenían copias integradas de subunidades
\alpha y \beta de proli 4-hidroxilasa humana
(P4H), la enzima responsable de la síntesis
post-traslacional de hidroxiprolina en colágeno, y
que se han descrito previamente. (Ver, p. ej., Vuorela, M. et
al. (1997) EMBO J 16:6702-6712).
Las variedades de levadura se cultivaron en
medio de glicerol con búfer mínimo, y la expresión de proteína
recombinante se produjo usando el mismo medio con metanol (0.5%)
sustituido por glicerol como fuente de carbono, tal y como se
describe en el Manual de Expresión de Pichia de Invitrogen. Las
variedades que produjeron gelatina fueron identificadas por
10-20% análisis SDS-PAGE Tricina de
medio acondicionado y la actividad de prolil
4-hidroxilasa en extractos procedentes de cultivos
en un matraz de agitación. La co-expresión de
prolil 4-hidroxilasa y los fragmentos de colágeno
dieron como resultado las gelatinas recombinantes con secuencias
humanas nativas.
Los fragmentos se expresaron y segregaron en el
medio. Las gelatina recombinante fue cubierta y purificada del
medio por medio de precipitación con acetona, cromatografía de
intercambio de anión o catión, o una combinación de los mismos. La
precipitación con acetona se llevó a cabo a 4ºC a través de la
adición de acetona a los sobrenadantes del cultivo libres de
células hasta conseguir una concentración final del 40%. El
precipitado resultante, consistente principalmente en proteínas
endógenas de levaduras, fue recolectado por medio de
centrifugación. A continuación, se añadió acetona a este
sobrenadante hasta una concentración final del 80%, provocando que
la gelatina se precipitara, que a continuación se recogió mediante
centrifugación, se dializó durante la noche contra agua, y se
liofilizó. Se obtuvo gelatina con elevada pureza mediante una
combinación de cromatografía de intercambio de anión y catión. Las
purificaciones cromatográficas se llevaron a cabo en temperatura
ambiente.
La estimación de los tamaños de proteínas
colagenosas por medio de electroforesis, en comparación con el
cálculo de peso molecular en base a composición de aminoácido es
conocida en la técnica (Butkowski et al. (1982) Methods
Enzymol 82:410-423). El análisis de la secuencia
N-terminal de las gelatinas recombinantes demostró
un correcto procesamiento de la secuencia prepro que se fusionó con
los fragmentos de gelatina con el fin de dirigir la proteína hacia
la ruta segregadora de levadura. Las gelatinas producidas en este
sistema obtuvieron solamente secuencias derivadas de colágeno
humano. Además, las gelatinas recombinantes representaron el
principal componente del medio acondicionado, ya que la células
Pichia pastoris segregan muy pocas proteínas.
Las gelatinas recombinantes expresadas mostraron
tamaños discretos, desde aproximadamente 5 kDa hasta
aproximadamente 65 kDa tal y como lo midió
SDS-PAGE, correspondiendo a gelatinas de 5 kDa
(ruta 2, SEQ ID NO:18), 10 kDa (ruta 3, SEQ ID NO:19), 16 kDa (ruta
4, SEQ ID NO:24), 18 kDa (ruta 5, SEQ ID NO:20), 20 kDa (ruta 6,
SEQ ID NO:28) (también habiendo calculado el peso molecular de
17,914 Da, no mostrado en la Tabla 1), 33 kDa (ruta 7, SEQ ID
NO:27) (también habiendo calculado el peso molecular de 29,625 Da,
no mostrado en la Tabla 1), 41 kDa (ruta 8, SEQ ID NO:25), y 50 kDa
(ruta 9, SEQ ID NO:22), tal y como se indica en la Figura 1 (ruta
10 representa colágeno humano recombinante hidrolizado del tipo I,
preparado tal y como se describe en el Ejemplo 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los fragmentos de gelatina recombinante humana
de la presente invención demostraron actividad de unión celular
in vitro. En el siguiente ensayo, placas con 96 pozos
Maxisorp (Nunc) se cubrieron con los siguientes dominios de
gelatina recombinante humano procedentes de la cadena \alpha1 de
colágeno humano de tipo I, tal y como se describe en el Ejemplo 1 y
se lista en la Tabla 2: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:
21, y SEQ ID NO: 22. Colágeno bovino VITROGEN (Cohesion
Technologies; Palo Alto, A) y albúmina de suero bovino sirvieron
como controles positivo y negativo, respectivamente. Cada una de
las proteínas se diluyó a 0.1 mg/ml en 0.1 M NaHCO_{3}, pH 10.0,
y las placas de cubrieron durante toda la noche a 4ºC. Se
cultivaron células de fibroblastos del prepucio humano (HFF) o
células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, de Clonetics,
pasaje 5), en las placas cubiertas y se incubaron durante 60
minutos a 37ºC. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Le grado de unión celular se midió a
continuación usando el Reagente WST-1, cuya
absorción se leyó a 450 mM en un lector ELISA. La Figura 2A muestra
que las gelatinas humanas recombinantes ayudó en la unión HFF a
placas Maxisorp, y, para esas células, la unión fue directamente
proporcional al peso molecular de la gelatina humana recombinante
cubierta en cada pozo. Específicamente, las gelatinas recombinantes
de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 ayudaron en la
unión HFF en mayor medida que el observado con BSA. La Figura 2B
muestra que las diferentes gelatinas recombinantes humanas ayudaron
en la unión de célula endotelial. La actividad de unión celular
también se demostró con la gelatina recombinante humana preparada
por hidrólisis termal de colágeno humano recombinante (descrito a
continuación en el Ejemplo 9), usando gelatinas recombinantes de
pesos moleculares que oscilan entre 0-30 kDa y
0-50 kDa.
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Ejemplo
3
Los fragmentos de gelatina recombinante
resultaron estar proteolíticamente modificados durante su expresión
y acumulación en el medio de células recombinantes Pichia
pastoris. La expresión de varias porciones diferentes del
dominio helicoidal de la cadena \alpha1 de colágeno tipo I llevó
a la identificación de una gelatina recombinante que tenía
estabilidad superior con respecto a proteólisis. Se donaron tres
fragmentos diferentes de gelatina en plásmido pPICZ\alphaA, y sus
relativas estabilidades se evaluaron
\hbox{durante la expresión de proteína recombinante en células Pichia pastoris .}
La primera variedad empleada se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 2, correspondiente a la SEQ ID NO: 19.
Se crearon variedades adicionales usando plásmidos codificadores de
residuos aminoácidos de dominio helicoidal humano \alpha1 (1)
179-280 (SEQ ID NO: 15) y 615-715
(SEQ ID NO: 23). Estas gelatinas recombinantes se construyeron tal y
como se describe en el Ejemplo 1, usando cebadores SEQ ID NO: 5 y
SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7. Los productos PCR se
digirieron con XhoI y XbaI, se clonaron y prepararon para
electroforación tal y como se ha descrito anteriormente. Se
cultivaron las cepas, se provocó la expresión de proteína y los
fragmentos de gelatina expresados se compararon mediante
SDS-PAGE. La Figura 3 muestra que la gelatina
recombinante de SEQ ID NO: 15 (ruta 2) y la gelatina recombinante de
SEQ ID NO: 19 (ruta 3) sufrieron proteólisis, mientras que la
gelatina recombinante de SEQ ID NO: 23 (ruta 4) permaneció
completamente intacta. Este resultado demostró que los fragmentos
de gelatina recombinante de la presente invención podían producirse
con una estabilidad superior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
No se ha detectado actividad prolil
4-hidroxilasa en levadura. Se ha producido una
variedad de Pichia pastoris para expresarprolil
4-hidroxilasa activa y se ha empleado previamente
para producir colágeno hidroxilado (Ver, Patente U.S No. 5,593,859).
Para expresar gelatina recombinante humana hidroxilada, la variedad
se transformó con una cinta de expresión de gelatina que codificó
100 aminoácidos de un recombinante de colágeno humano
\alpha1(1) (SEQ ID NO: 19, Tabla 2), generado por PCR
usando los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. El producto de
ADN PCR (\sim 330 bp) se asimiló con XhoI-XbaI y
se ligó con los puntos XhoI-XbaI de pPICZ\alphaA
(Invitrogen), creando plásmido pDO7.
Un fragmento 1048 bp Cel II-Agel
se aisló de pDO7 que contenía la porción 3' de la región promotora
AOX1, la señal de secreción facto alpha de apareamiento, la
gelatina recombinante de SEQ ID NO. 19, la secuencia polienlace de
pPICZ\alphaA y 56 parejas base del terminador de trascripción
AOX1. Este fragmento fue ligado en los puntos Cel
II-Agel de pPIC9K (Invitrogen) para crear pDO41. La
cepa \alpha\beta38 de Pichia pastoris (his4) se
transformó con plásmido linearizdo StuI pDO41 por medio de
electroforación, se emplató sobre placas con mínima dextrosa, y se
seleccionaron las partículas transformadas que se complementaban la
auxotrofía his4. Se cultivaron aproximadamente 20
transformantes his^{+} y se inducieron con metanol tal y como se
describe en el Ejemplo 1. Las variedades que expresaron SEQ ID NO:
19 fueron identificadas a través de análisis
SDS-PAGE del medio acondicionado (Figura 4).
Los fragmentos de gelatina recombinante de
variedades positivas fueron purificados del medio por medio de
precipitación con acetona, y además se analizaron mediante análisis
de aminoácido, tal y como se describe, por ejemplo, en Hare, PE.
(1977) Methods of Enzymology 47:3-18. El análisis de
aminoácido del producto de gelatina de una de las variedades
demostró la presencia de hidroxiprolina en las gelatinas
recombinantes segregadas. Se determinó que el radio de
hidroxiprolina en prolina fue 0.29 en gelatina aislada de la
variedad mostrada en la Figura 4, aislada #2, indicando la
co-expresión de gelatina y prolil
4-hidroxilasa.
Las gelatinas recombinantes
no-hidroxiladas se expresaron y purificaron de una
cepa Pichia pastoris que no expresa prolil
4-hidroxilasa. Los residuos de prolina en el
interior de esta gelatina recombinante se convirtieron a
continuación en residuos de hidroxiprolina in vitro usando
actividad de enzima prolil 4-hidroxilasa. Se creó un
plásmido de expresión de gelatina a través de PCR usando los
cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, llevando a la expresión de
gelatina recombinante de SEQ ID NO: 24. El producto PCR con 525
parejas base fue purificado y asimilado con
XhoI-XbaI y se ligó con XhoI-XbaI
para asimilar pPICZ\alphaA. El plásmido fue linearizado con PmeI y
se sometió a electroporación en cepa X-33 Pichia
pastoris (Invitrogen). Los transformantes fueron seleccionados
por el cultivo sobre placas YDP que contenían 500 \mug/ml
zeocina. Las cepas se testaron para localizar expresión de gelatina
tal y como se ha descrito anteriormente y la gelatina recombinante
no hidroxilada fue purificada del medio de un aislado positivo. El
medio acondicionado fue concentrado 10 veces mediante diálisis con
presión usando una membrana de corte de 10 kDa de peso molecular, y
la muestra fue dializada contra Búfer A (50 mM
Tris-HCl pH 9.0, 50 mM NaCl). El material dializado
fue sometido a cromatografía en una columna
Q-sefarosa equilibrada en Búfer A. La gelatina no se
une con la columna bajo estas condiciones, y por lo tanto, estuvo
presente en la fracción a través del flujo. La mayor parte de las
proteínas contaminantes de la levadura unidas a la columna eluyeron
con Búfer B (Búfer A + 0.5 M NaCl).
Se dializó la fracción que atravesó el flujo
contra 0.5 mM acetato sódico, pH 4.5, y a continuación la gelatina
se purificó sobre una columna Q-sefarosa
equilibrada en el mismo búfer. La gelatina recombinante se unió a
la columna y se eluyó con 0.2 M NaCl. La gelatina purificada, a 1
mg/ml, se desnaturalizó con calor (100ºC durante 10 minutos) y se
mezcló con P4H purificado en una enzima a un radio de sustrato de
1:30 en presencia de los siguientes componentes: 50 mM
Tris-HCl pH 7.8, 2 mM ascorbato, 2 mM
\alpha-ketoglutarato, 0.1 mM FeSO_{4}, 10 \muM
DTT, 10 mg/ml albúmina de suero bovino, y 100 unidades de catalasa
(Sigma Chemical Co., St Louis, MO). (Ver, p. ej., Kivirikko, K.I. y
Myllyla, R. (1982) Methods in Enzymology 82:245-304;
and Vuori, K., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
89:7467-7470). Se dejó que la reacción actuara a
37ºC durante 16 horas.
A continuación, la gelatina recombinante fue
purificada mediante cromatografía sobre Q-sefarosa
tal y como se ha descrito anteriormente. Las proteínas unidas se
eluyeron de la columna con 0.5 M NaCl y se recolectaron (Figura 5,
rutas 7, 8 y 9). Las fracciones que atravesaron el flujo y que se
eluyeron fueron analizadas por medio de SDS-PAGE
para demostrar la pureza de la gelatina recuperada (Figura 5). El
análisis de aminoácido de la gelatina se llevó a cabo tras la
diálisis de las fracciones que atravesaron el flujo. (Figura 5,
rutas 3 hasta 6). El análisis de aminoácido demostró que la
gelatina estaba 87% hidroxilada. La hidroxilación del 100% se
consigue cuando el número de moles de hidroxiprolina/moles de
prolina + moles de hidroxiprolina en gelatina es igual a 0.5.
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Ejemplo
5
Una gelatina recombinante de 18 kDa (SEQ ID NO:
20) se expresó de acuerdo con los métodos anteriormente descrito.
Los fragmentos expresados fueron analizados mediante electroforesis
con gel. La gelatina recombinante expresada en presencia de prolil
4-hidroxilasa tuvo una marcada mayor estabilidad que
la gelatina expresa en ausencia de prolil
4-hidroxilasa. (Ver Figura 6).
Un papel de la hidroxilación de prolina en la
estabilidad de gelatina recombinante humana y en un aumento de
estabilidad se encontró en prolil 4-hidroxilasa que
expresa las variedades de Pichia pastoris. Se construyó un
plásmido codificador de SEQ ID NO: 20 (pDO32) a través de PCR
usando los cebadores SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 7. El producto PCR
fue purificado, asimilado, y donado tal y como se ha descrito
anteriormente. El mismo fragmento \alpha1(1) cADN se
expresó en células huésped que carecían de prolil hidroxilasa, y en
células huésped que contenían las subunidades \alpha y \beta de
prolil 4-hidroxilasa. Tres variedades de Pichia
pastoris se sometieron a electroforesis con
PmeI-linearizado pDO32: cepa X-33
(Pichia pastoris tipo salvaje), dos cepas de expresión prolil
4-hidroxilasa: cepa P4H-2, y cepa
\alpha\beta8, tal y como se describe en la
\hbox{Patente U.S No. 5,593,859, y en Vourela et al . (1997) EMBO J 16:6702-6712.}
Los transformantes fueron seleccionados por
resistencia para 500 \mug/ml zeocina. Se cultivaron 8 aislados de
cada transformación y se provocaron tal y como se ha descrito, y la
estabilidad de la gelatina recombinante human expresada se analizó
mediante SDS-PAGE (Ver Figura 6). En cepa
X-33 de Pichia pastoris tipo salvaje, se
observaron cantidades aproximadamente equimolares de gelatina
recombinante intacta y un fragmento proteolítico (que migraron
justo debajo de la gelatina recombinante sobre el gel, indicado por
la flecha a la derecha de la figura). (Figura 6, cepa
X-33). En ambas cepas que
co-expresan prolil 4-hidroxilasa,
la cantidad de fragmentos proteolíticos fue significadamente
reducido, demostrando que la co-expresión de prolil
4-hidroxilasa junto con gelatina recombinante
humana incrementó la estabilidad reduciendo sustancialmente la
proteólisis de la gelatina. (Figura 6, cepa P4H-2 y
cepa \alpha\beta8).
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Ejemplo
6
Los reporteros anteriores han indicado que el
medio complementado con el ácido casamino disminuyó la cantidad de
proteálisis vista durante la expresión de cierta proteínas en
Pichia pastoris (Clare, J.J. et al., (1991) Gene
105:202-215). La descomposición de la presente
gelatina recombinante humana expresada en Pichia pastoris se
midió tras el enriquecimiento del medio de expresión con varios
complementos. En este estudio en particular, se empleó la cepa
\alpha\beta8 de Pichia pastoris descrita en el Ejemplo
5, que expresó fragmento SEQ ID NO: 20 de la gelatina recombinante
humana. (Ejemplo 5 y Tabla 2). Las gelatina recombinante se produjo
en un medio complementado con una variedad de concentraciones
(0-2%) de varios componentes complementarios,
induyendo ácidos casamino, casitona, extracto de levadura, peptona,
peptamina, triptona, Gelatona, lactoalbúmina, y peptona de soja.
Varias formulaciones, induyendo Iactoalbúmina hidrolizada, peptona
de soja, casitona, y peptamina (Difco Laboratorios, Detroit, MI)
aumentaron los niveles de expresión de gelatina recombinante.
(Figura 7, lactoalbúmina y peptona de soja).
Estos resultados indican que los complementos
específicos del medio empleados durante la expresión de gelatinas
recombinantes puede dar lugar a una mayor producción. En un
aspecto, el uso de peptona de soja como complemento en el medio
produjo un componente de medio derivado de una planta (en lugar de
derivado de un animal) que llevaron a una mayor expresión de
gelatina recombinante. Esto proporcionaría un medio libre de
materiales animales para la producción de gelatina recombinante que
se emplearía en una variedad de aplicaciones.
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Ejemplo
7
(Síntesis)
Se preparó un compuesto de colágeno humano
recombinante (obtenido tal y como se describe en Patente U.S No.
5,593,859) disolviendo 10.8 mg de colágeno humano recombinante del
tipo I en 5 ml e agua, seguido de una diálisis contra 20 mM fosfato
sódico, pH 7.2. La concentración final de colágeno recombinante
humano del compuesto fue aproximadamente 2 mg/ml. La preparación de
gelatina recombinante humana aglutinada se llevó a cabo añadiendo
10 \mul o 5 \mul de una solución 20%
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida hidrodoruro (EDC, Pierce Chemical Co.) a 1 ml del
compuesto de colágeno humano recombinante descrito anteriormente.
La reacción de ligamento cruzado se dio durante la noche a
temperatura ambiente. EDC que no reaccionó fue retirado mediante
diálisis contra agua.
Las gelatinas recombinantes humanas aglutinadas
fueron analizadas mediante análisis con 6% glicina
SDS-PAGE. La Figura 8 muestra una comparación
SDS-PAGE de gelatina recombinante humana (ruta 6,
etiquetada UNL-5-4), gelatina
recombinante humana aglutinada (ruta 5, etiquetada
UNL-5-4, 0.1% EDC; ruta 4,
etiquetada UNL 5-4, 0.2% EDC), gelatina con cápsula
dura disponibles en el mercado (ruta 3), y gelatina disponible en
el mercado (Tipo A, de piel porcina, aproximadamente 300 Bloom,
ruta 2) obtenida de Sigma Chemical Co. Tal y como se muestra en el
análisis SDS-PAGE de la Figura 8, la gelatina en
cápsula comercial y la gelatina Sigma contenían cadena \alpha
(peso molecular de aproximadamente 110 kDa) como principal
componente, así como una mancha de componentes de mayor peso
molecular (con peso molecular que oscilaba aproximadamente desde
200 a 250 kDa). La gelatina recombinante human sólo estaba
compuesta por cadena \alpha. Sin embargo, tras el aglutinamiento,
la gelatina recombinante aglutinada estaba compuesta por cadena
\alpha y por una mancha de gelatinas de mayor peso molecular,
similar a la observada en gelatina comercial en gelatina comercial
en cápsulas. Esto indicó que las gelatinas recombinantes humanas
mostraron una distribución del peso molecular similar a las
gelatinas comerciales en cápsulas podían producir mediante
aglutinamiento de colágeno humano recombinante. Las gelatinas
recombinantes aglutinadas se usarían en aplicaciones en las que se
deseen una mayor fuerza de gel y una mayor viscosidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Los niveles de gelatina soluble disponible en el
mercado en Kina & Knox (K&K) y las gelatinas recombinantes
humanas de la presente invención (hechas tal y como se describe en
el Ejemplo 9) fueron determinados usando el test de Lisado de
Amebocito Limulus, tal y como se conoce en la técnica (Ver, p. ej.,
Friberger, P. et al. (1987) Prog. Clin. Biol. Res.
231:149-169). Se examinaros tres concentraciones
diferentes de gelatina. Tal y como se muestra en la Tabla 3, las
gelatinas recombinantes humanas generadas por hidrólisis termal de
colágeno recombinante humano del tipo I (rhcl) de la presente
invención estaban virtualmente libres de endotoxinas. Los niveles
de endotoxina de materiales disponibles en el mercado fueron
aproximadamente desde 1 hasta 1.5 EU/mg de proteína. Los métodos
para producir gelatina tal y como se describe en la presente
invención dieron como resultado gelatinas que presentan niveles de
endotoxina sustancialmente más bajos, por dos o tres órdenes de
magnitud, que aquellas de las preparaciones comerciales. Dichos
niveles bajos de endotoxina hacen que las gelatinas recombinantes
de la presente invención sean especialmente atractivas para uso en
ciertas aplicaciones, como en uso en estabilización
farmacéutica.
farmacéutica.
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Ejemplo
9
(Comparativa)
Se desarrollaron procedimientos de hidrólisis
(ácida, termal y enzimática) para producir gelatinas recombinantes
humanas solubles con distribución de peso molecular similar a
aquellas de las gelatinas solubles derivadas de animales actualmente
disponibles, empleadas, por ejemplo, como estabilizadores en la
formulación de vacunas. Para estos experimentos, se emplearon
colágeno intacto recombinante humano del tipo I y tipo III como
materias iniciales. Variando las condiciones de hidrólisis, fue
posible variar los pesos moleculares de los materiales finales,
produciendo materiales de definidos pesos moleculares.
Estas gelatinas recombinantes humanas fueron
comparadas con las gelatinas disponibles en el mercado. Se
obtuvieron para caracterización cuatro muestras de gelatina de bajo
peso molecular producidas por Leiner Davis, Great Lake, Kind &
Knox, y Dynagel. Todas las gelatinas examinadas fueron solubles a
temperatura ambiente. Las distribuciones del peso molecular de las
gelatinas sobre un gel Tricina SDS-PAGE se muestran
en la Figura 9 y se enumeran en la Tabla 4. Los perfiles de gel
indicaron que las distribuciones de peso molecular de gelatinas
comercialmente disponibles eran de aproximadamente
0-55 kDa, con la excepción de la muestra
Dynagel-1, que presentó una distribución de peso
molecular de 0-30 kDa. Los perfiles de gel también
revelaron dos patrones de distribución de peso molecular. En un
ejemplo, derivado de las muestras de Leiner Davis y Great Lake, se
observaron varias bandas moleculares discretas mediante
SDS-PAGE. El patrón en el segundo ejemplo, derivado
de las muestras de Dynagel y Kind & Knox, mostró una continua
distribución de material sobre el gel, sin bandas discretas. Las
distribuciones de peso molecular de Dynagel-1 y
Dynagel-2 fueron bastante diferentes, a pesar de
producirse por parte del mismo fabricante y para la misma
aplicación. Este resultado indicó que la variación
lote-a-lote puede ser bastante
significativa en gelatinas actualmente disponibles.
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La hidrólisis por calor se llevó a cabo del
siguiente modo. Las gelatinas secas disponibles en el mercado se
disolvieron en agua a 40ºC-50ºC para hacer una
solución 5% gelatina. El pH de la solución se ajustó a o.1N NaOH o
0.1N NCl en preparación para la hidrólisis por calor. Tanto los
colágenos humanos recombinantes del tipo I como del tipo II se
expresaron en Pichia pastoris y se purificaron, tal y como
se describe en la Patente U.S No. 5,593,859. El colágeno humano
recombinante final se disolvió en 10 mM HCl, se dializó contra
agua, y se Liofilizó. El colágeno humano recombinante liofilizado
se disolvió en agua a 40ºC-50ºC para hacer una
solución 3%. El pH de la solución se ajustó tal y como se ha
indicado antes de la hidrólisis por calor.
La hidrólisis por calor se llevó a cabo en 1 ml
Reacti-Vials (Pierce). La temperatura de hidrólisis
varió desde 100ºC a 150ºC, dependiendo del experimento. El pH de la
solución de hidrólisis varió desde pH 2 a pH 7, tal y como se
indica. El tiempo de hidrólisis también varió desde una a treinta y
dos horas, dependiendo de la temperatura y del pH de la solución.
Las partículas de hidrólisis fueron probadas en varios intervalos
de tiempo y se analizaron por SDS-PAGE.
Las muestras de gelatinas de elevado peso
molecular de Sigma (Tipo A de piel porcina, 250 kDa) se disolvieron
en seis soluciones con diferentes pH (5% gelatina) y se
hidrolizaron a 120ºC. Las soluciones con pH 2 y pH 3 se
hidrolizaron durante dos horas y media y se probaron cada media
hora. Las soluciones con pH 4 se hidrolizaron durante cinco horas y
se probaron cada hora. Las soluciones con pH 5, pH 6 y pH 7 se
hidrolizaron durante 24 horas y se probaron cada 2 horas tras 14
horas de hidrólisis.
Los patrones de hidrólisis fueron analizados en
geles Tricina 10-20% SDS tal y como se muestra en
las Figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E y 10F. Los perfiles de gel
muestran que cuanto más bajo es el pH de la solución, más
rápidamente ocurre la hidrólisis de la gelatina. Los perfiles de
gel también revelaron dos patrones de hidrólisis entre las
partículas de hidrólisis. Un patrón mostró varias bandas
moleculares discretas sobre el gel (ver los resultados de
hidrólisis ácida de las soluciones pH 2 y pH 3, Figura 10A y 10B),
mientras que el otro patrón muestra una distribución continua del
material sobre el gel (ver los resultados de hidrólisis de pH 4, pH
5, pH 6, y pH 7, Figura 10C, 10D, 10E, y 10F).
Estos resultados demostraron que el proceso
arriba descrito, o variaciones del mismo, produjeron dos tipos
diferentes de materia, tal y como se observa en el análisis de
gelatinas disponibles comercialmente (bandas discretas vs.
una distribución continua del material en
SDS-PAGE). Estos resultados experimentales también
indicaron que la degradación de calor de gelatina de alto peso
molecular generó varios tamaños de gelatinas solubles. La Tabla 5
muestra las distribuciones de peso molecular obtenidas empleando
Gelatina Sigma, tras hidrólisis a 120ºC en soluciones con pH
6.0.
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Las muestras de gelatinas de elevado peso
molecular de Sigma (Tipo A de piel porcina, 250 kDa) se disolvieron
en cuatro soluciones con diferentes pH (5% gelatina) y se
hidrolizaron a 150ºC durante hasta diez horas. Las partículas de
hidrólisis se sometieron a pruebas cada dos horas durante el
análisis. Los patrones de la hidrólisis fueron analizados por geles
Tricina 10-20% SDS-PAGE tal y como
se muestra en las Figuras 11A, 11B, 11 C y 11D. Los perfiles de gel
indicaron que la degradación de gelatina ocurrió mucho más rápido a
150ºC que a 120ºC. Además, la hidrólisis de gelatinas producida a
150ºC produjo fragmentos de gelatina de menores pesos moleculares.
La Tabla 6 muestra la distribución del peso molecular de Gelatina
Sigma, tras hidrólisis a 150ºC en soluciones con pH 6.0.
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Ejemplo
10
(Comparativa)
El colágeno recombinante humano tipo I fue
hidrolizado a 120ºC durante hasta 8 horas bajo condiciones de pH
neutro (pH 7), o hasta 3 horas en condiciones de pH ácido (pH 2).
El colágeno recombinante humano de tipo III también fue hidrolizado
a 120ºC durante hasta seis horas en condiciones neutras y ácidas.
La hidrólisis se llevó a cabo tal y como se ha descrito en el
Ejemplo 9. Las partículas sometidas a hidrólisis recombinantes
humanas del tipo I y tipo III fueron analizadas por geles Tricina
10-20%, mostrados en las Figuras 12A y 12B. Los
patrones del gel SDS-PAGE indicaron que la
hidrólisis por calor de colágeno recombinante humano fue idéntica a
los patrones de hidrólisis de gelatinas de elevado peso molecular
derivadas de fuentes naturales (Figura 9, Figuras 10A hasta 10F, y
Figuras 11A hasta 11D, y Figuras 12A y 12B). Al igual que la
hidrólisis de gelatinas naturales (pH 7), las partículas de
hidrólisis ácidas de colágeno recombinante humano mostraron varias
bandas moleculares discretas, mientras que las partículas de
hidrólisis neutrales mostraron una distribución de peso molecular
más continua. La distribución del peso molecular de las partículas
de hidrólisis neutrales de gelatina humana recombinante fue
aproximadamente 0-70 kDa tras
seis-ocho horas de degradación por calor. La
hidrólisis bajo condiciones ácidas ocurrió mucho más rápido. Las
distribuciones de peso molecular de las partículas ácidas de
hidrólisis de gelatina humana recombinante fueron mucho más
estrechas, alrededor de 0-10 kDa, tras
dos-tres horas de tratamiento.
Como un refinamiento adicional de gelatinas
humanas recombinantes hidrolizadas con calor, hemos demostrado la
utilidad de una metodología de expresión recombinante
multi-gen para la producción de gelatinas humanas
con fragmentos discretos de la cadena \alpha1(I) de
colágeno humano del tipo I. Esta tecnología nos permitió producir
fragmentos de gelatina bien definidos y con alto grado de
homogeneidad cuyo tamaño osciló entre 6 y 65 kDa. Esto representa
una flexibilidad sin igual en términos de tamaño y propiedades
biofísicas de la gelatina que puede emplearse para aplicaciones
específicas.
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Ejemplo
11
Colágeno recombinante humano del tipo I se
hidrolizó enzimáticamente, usando proteasas establecidas en la
Tabla 7. El colágeno recombinante humano del tipo I fue incubado
con cada enzima a 37ºC, usando un sustrato para el radio de enzima
(w/w) tal y como se indica en la Tabla 7. Los hidrosilatos
recombinantes humanos del tipo I obtenidos por tratamiento fueron
analizados por geles Tricina 10-20%. Los resultados
obtenidos de tratamiento con papaína y proteasa X se muestran en la
Figura 13. Los patrones de gel SDS-PAGE indicaron
que la hidrólisis enzimática de colágeno recombinante humano
condujo a diferentes distribuciones de peso molecular de las
gelatinas. La hidrólisis enzimática que usó papaína dio como
resultado un patrón continuo de hidrólisis, tal y como se indica en
la Figura 13 y en la Tabla 7, mientras que la hidrólisis que usó
proteasa X dio como resultado varias bandas de discreto peso
molecular. Tal y como se indica en la Tabla 7, las gelatinas
recombinantes producidas por este método presentaros diferentes
patrones de hidrólisis como resultado del particular tratamiento con
hidrólisis enzimática. Esto representa una gran flexibilidad en la
producción de tamaños y propiedades biofísicas de la gelatina que
puede emplearse para aplicaciones específicas.
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Ejemplo
12
El colágeno recombinante humano del tipo I en la
levadura Pichia Pastoris fue sometido a pruebas para su
reacción potencial alérgica como sensibilizador de contacto en
cerdo de guinea, conocidos como Estudio de Maximización. Tras la
duración del estudio, se recogieron sueros para investigar la
inmunogenicidad de colágeno recombinante humano del tipo I en cerdo
de guinea. Se introdujo un gramo de rhC I en 10 ml de 0.9%
Inyección de Cloruro de Sodio (SCI) o aceite de sésamo, y se incubó
durante 72 horas a 37ºC. A continuación, se centrifugó el extracto
a 3000 rpm durante 15 minutos y se recogió el sobrenadante para
dosis.
Los cerdos de Hartley fueron expuestos al
artículo del test y a la solución del control por medio de una fase
de inducción. Esta fase implicó tres pares de inyecciones
intradérmicas (ID) en áreas esquiladas. El primer par de
inyecciones ID (craneales) consistieron en emulsiones de Adyuvante
Completo de Freíd (FCA) en un volumen igual de SCI. El segundo par
de inyecciones ID (centrales) consistieron en el extracto del test
(colágeno recombinante humano del tipo I). El tercer par (caudales)
consistieron en una emulsión del artículo del extracto del test y
un volumen igual de FCA. Los animales de control positivo y
negativo fueron tratados de igual modo que los animales del test,
excepto que el extracto del test no se incluyó en el segundo y
tercer par de inyecciones.
El sexto día tras las inyecciones ID, los puntos
del test fueron evaluados para evidencias de irritación. Los puntos
del test fueron pre-tratados con 10% SLS en
petróleo y se masajearon en la piel empleando una barra de cristal,
y a continuación se dejaron sin cubrir durante 24 horas. El séptimo
día, se administró una aplicación tópica en las zonas afeitadas de
cada animal del test con un disco de 4.25 cm de diámetro de papel
filtro Whatman #3 empapado con 0.4 ml del extracto del artículo del
test. Trece días después de la aplicación por inducción tópica, se
comprobó el estado de los animales. Se rasuró una zona en el
costado derecho de cada animal. Al día siguiente, se aplicaron
cámaras Hill Top que contenían 0.3 ml del extracto del test,
extracto del vehículo control, o soluciones del control positivo en
las zonas rasuradas y permanecieron en los animales durante 24
horas. Se realizaron unos cortes en las zonas de las dosis para
eritema y edema 24, 48 y 72 horas después de la retirada de las
cámaras.
Después de 72 horas, se recogió sangre y se dejo
que coagulase, a continuación se centrifugó a 2800 rpm durante 15
minutos. El suero fue retirado de cada tubo y las muestras de suero
fueron almacenadas a -70ºC hasta su uso.
A continuación, el suero de los cerdos de Guinea
inmunizados fue analizado para la presencia de anticuerpos
dirigidos contra colágeno recombinante humano tipo I (rhcl),
colágeno recombinante humano tipo III (ncclll), vitrogen (vitr), y
varios fragmentos de gelatinas recombinantes humanas de la presente
invención, incluyendo fragmentos de 6 kDa (SEQ ID NO: 19), 18 kDa
(SEQ ID NO: 20), 33 kDa (SEQ ID NO: 27), 50 kDa (SEQ ID NO: 22) y
65 kDa (SEQ ID NO: 33) (Ver Tabla 2 y Ejemplo 1). El colágeno
recombinante humano y la gelatina recombinante fueron sometidos a
electroforesis en 8% Tris-Glicina o en geles
10-20% Tricina SDS-PAGE. Se realizó
el análisis Western Blot usando anti-suero de cada
uno de los cerdos de Guinea empleados en el estudio. La Figura 14
muestra que los anticuerpos específicos de colágeno recombinante
humano del tipo I estuvieron presentes en el suero de cerdos de
Guinea inmunizados con colágeno recombinante humano del tipo I. No
se observó reactividad de anticuerpo a ninguna gelatina
recombinante analizada por análisis de Western Blot en ninguno de
los sueros examinados. La Figura 14 muestra los resultados del
Western Blot usando los antisueros de un cerdo de Guinea del
estudio. Se analizaron los sueros de al menos cuatro cerdos
diferentes de Guinea, y cada uno de los cuales demostró resultados
idénticos a los mostrados en la Figura 14.
Fue deseable aclarar posibles epítopes del
colágeno tipo I responsables de la respuesta antigénica observada
tras la inyección de rhcl en cerdos de Guinea. El colágeno
recombinante humano del tipo I fue separado en sus componentes
\alpha1(I) y \alpha2(I) tras la desnaturalización
y la cromatografía de columna. Se llevó a cabo una división de
bromuro de cianógeno (CNVR) de la cadena \alpha1(I) de
colágeno recombinante de tipo I y de la cadena \alpha2(I)
del colágeno recombinante de tipo I tal y como se describe en
Bornstein y Piez (1966) Biochemistry 5:3460. Las cadenas \alpha
intactas y los fragmentos de péptido resultantes se separaron por
SDS-PAGE y se analizaron a través de análisis de
Western Blotpra reactividad hacia el suero del cerdo de Guinea tal y
como se ha descrito anteriormente. La Figura 15A muestra
SDS-PAGE tintado con azul de coomassie de cadenas
\alpha1(I) y \alpha2(I) intactas y con división
CNBr de colágeno recombinante humano del tipo I. El análisis Western
Blot mostró que los antisueros del cerdo de Guinea reactivos a rhcl
se dirigieron contra la cadena \alpha2(I) de colágeno de
tipo I y fragmentos específicos CNBr de la misma. No se detectó
reactividad contra la cadena \alpha1 de colágeno de tipo I.
(Figura 15B).
El análisis Western Blot arriba descrito examinó
la reactividad del suero del cerdo de Guinea para colágeno
recombinante humano de tipo I, fragmentos CNBr, y gelatinas
recombinantes humanas en virtud de separación electroforética sobre
SDS-PAGE. Para examinar la reactividad de los
antisueros del cerdo de Guinea con estos polipéptidos bajo
condiciones no desnaturalizadas, se realizó un análisis ELISA
directo. (Figura 16). Los datos mostraron que los antisueros del
cerdo de Guinea reconocieron la conformación nativa de rhcl.
Ninguna de las gelatinas recombinantes de la presente invención
reaccionó con los antisueros del cerdo de Guinea por ELISA, con
independencia de que los fragmentos de gelatina se presentaran
antes o después de la desnaturalización termal. El rhcl fue incluso
más reactivo en ELISA si se desnaturalizaba con calor antes del
análisis (datos no mostrados). Esto indicó que los anticuerpos
policlonales en el suero reconocieron en primer lugar los epítopes
secuenciados en lugar de las estructuras helicoidales. En conjunto,
estos resultados indicaron que las preocupaciones asociadas con el
hecho de tener un punto (o puntos) antigénico presente en colágeno
humano del tipo I, específicamente con la cadena \alpha2 tal y
como se muestra en este ejemplo, podría evitarse a través de
métodos de la presente invención. Por lo tanto, la presente
invención proporciona métodos para generar gelatinas recombinantes
que carecen de puntos antigénico, que puede resultar útil para
aplicaciones específicas en la que se desee gelatina con baja
antigenicidad.
Varias modificaciones y variaciones de los
métodos y sistemas descritos de la invención resultarán aparentes
para aquellos expertos en la técnica. A pesar de que la invención
se ha descrito en relación con realizaciones específicas
preferentes, debería entenderse que la invención tal y como se
reivindica no debe limitarse excesivamente a tales realizaciones
específicas. Varias modificaciones de los modos descritos para
realizar la invención que son obvios para aquellos expertos en la
presente técnica y campos relacionados pretender situarse dentro
del alcance de las siguientes reivindicaciones.
<110> FIBROGEN. INC.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> GELATINAS RECOMBINANTES EN
VACUNAS
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<130> FG0224 PCT
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 3
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\hskip0,9cm
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<210> 4
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 4
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\hskip0,9cm
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<210> 5
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<211> 54
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 5
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\hskip0,9cm
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<210> 6
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> humana
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 57
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 10
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\hskip0,9cm
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<210> 11
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<211> 64
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 14
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213>
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,9cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
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<212> PRT
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<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip0,9cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
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\hskip0,9cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip0,9cm
\hskip0,5cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip1,1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
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<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 662
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (31)
1. Una formulación para vacuna que comprende
gelatina, donde dicha gelatina es gelatina recombinante consistente
en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha gelatina
una mezcla homogénea de moléculas idénti-
cas.
cas.
2. La formulación para vacuna de la
reivindicación 1, donde los polipéptidos tienen un peso molecular
seleccionado del grupo consistente en aproximadamente 1 kDa,
aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 8 kDa, aproximadamente 9
kDa, aproximadamente 14 kDa, aproximadamente 16 kDa,
aproximadamente 22 kDa, aproximadamente 23 kDa, aproximadamente 44
kDa, y aproximadamente 65 kDa.
3. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones precedentes, donde dicha gelatina recombinante es
gelatina recombinante humana.
4. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones precedentes, donde la gelatina recombinante se
obtiene al expresar una secuencia de polinucleótido derivada de un
tipo de colágeno, libre de secuencia codificadora para otro tipo de
colágeno, en una célula huésped.
5. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones precedentes, donde la gelatina recombinante
consiste en una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ
ID Nos: 15, hasta 25, y 30, 31, y 33.
6. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es adecuada para envío mediante cualquier envío inyectable,
envío nasal, envío oral, envío transdérmico y envío profundo
pulmonar.
7. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es líquida.
8. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es seca.
9. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es en forma de polvos.
10. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es en forma de spray.
11. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es en forma de inhalante.
12. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna viva.
13. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna inactivada.
14. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna subunidad.
15. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una única dosis.
16. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende múltiples dosis.
17. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna conjugada.
18. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna de ácido nucleico.
19. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la vacuna de ácido
nucleico es una vacuna ADN.
20. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna es una vacuna combinada.
21. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna acelular.
22. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la formulación para
vacuna comprende una vacuna formulada para la prevención de una
enfermedad seleccionada del grupo consistente en virus vaccinia
(viruela), virus polio (Salk y Sabin), paperas, sarampión, rubéola,
difteria, tétano, Varicela-Zoster (varicela/herpes),
tos ferina, Bacilo Calmette-Guerin (BCG,
tuberculosis), haemophilus influenzae meningitis, rabia,
cólera, virus de encefalitis japonesa, Salmonella typhi,
shigella, hepatitis A, hepatitis B, adenovirus, fiebre amarilla,
fiebre aftosa, virus herpes simples, virus sincitial respiratorio,
rotavirus, Dengue, virus del Oeste del Nilo, virus herpes del pavo
(Enfermedad de Marek), gripe, y ántrax.
23. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la gelatina
recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 1.000
EU/mg.
24. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la gelatina
recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 0.500
EU/mg.
25. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la gelatina
recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 0.050
EU/mg.
26. La formulación para vacuna de las
reivindicaciones 1-5, donde la gelatina
recombinante tiene un nivel de endotoxinas inferior a 0.005
EU/mg.
27. Un estabilizador para vacuna que está
formado por gelatina, donde dicha gelatina es gelatina recombinante
consistente en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo
dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas idénticas.
28. Un método para producir una vacuna que está
formada por gelatina, consistiendo el método en:
- proporcionar una vacuna;
- proporcionar gelatina;
- y combinar la vacuna y la gelatina;
donde dicha gelatina recombinante
consiste en polipéptidos de uniforme peso molecular, siendo dicha
gelatina una mezcla homogénea de moléculas
idénticas.
29. Uso de gelatina en la fabricación de una
vacuna para producir una respuesta inmune en un sujeto, donde dicha
gelatina recombinante consiste en polipéptidos de uniforme peso
molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas
idénticas.
30. Un kit, comprendiendo el kit:
- (i)
- una vacuna que contiene gelatina; y
- (ii)
- un dispositivo de envío para el envío de la vacuna;
donde dicha gelatina es gelatina
recombinante consistente en polipéptidos de uniforme peso
molecular, siendo dicha gelatina una mezcla homogénea de moléculas
idénticas.
31. El kit de vacunación de la reivindicación
30, donde el dispositivo de envío es un dispositivo para envío a
través de envío inyectable; envío nasal; envío de la mucosa y envío
por aerosol.
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