DE102020205703A1

DE102020205703A1 - Expression von Kollagenpeptid-Komponenten in prokaryotischen Systemen

Info

Publication number: DE102020205703A1
Application number: DE102020205703.6A
Authority: DE
Inventors: Severin Wedde; Joe Max Risse; Karl Friehs; Martin Hahn; Benjamin Ludwig
Original assignee: Gelita AG; Universitaet Bielefeld
Current assignee: Gelita AG; Universitaet Bielefeld
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2021-11-11
Also published as: US20230399379A1; EP4146687A1; WO2021224316A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptid-Komponenten in prokaryotischen Systemen, ein Verfahren zur Herstellung hydroxylierter Kollagenpeptide in prokaryotischen Systemen, ein Verfahren zur Herstellung hydroxylierter Kollagenpeptid-Komponenten sowie die aus diesen Verfahren erhaltenen Kollagenpeptide und Kollagenpeptidkomponenten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptid-Komponenten in prokaryotischen Systemen, ein Verfahren zur Herstellung hydroxylierter Kollagenpeptide in prokaryotischen Systemen, ein Verfahren zur Herstellung hydroxylierter Kollagenpeptid-Komponenten sowie die aus diesen Verfahren erhaltenen Kollagenpeptide und Kollagenpeptid-Komponenten.
Kollagen ist das am häufigsten auftretende Protein im menschlichen Körper und verleiht unterschiedlichen Geweben als Hauptkomponente der extrazellulären Matrix die charakteristische Flexibilität und Elastizität. Kollagen-Polypeptidketten bilden eine Helix-Struktur aus, welche durch die repetitive Konsensus-Sequenz der Aminosäuren (Gly-X-Y)_n hervorgerufen wird, wobei es sich bei „Gly“ für Glycin handelt und „X“ und „Y“ jeweils für eine beliebige Aminosäure stehen. Die am häufigsten auftretende repetitive Einheit in Kollagen ist Gly-Pro-Hyp, wobei „Pro“ für die Aminosäure Prolin steht und es sich bei „Hyp“ um Hydroxyprolin ((S)-(-)-trans-4-Hydroxyprolin) handelt. Der Hydroxylierungsgrad von Prolin in menschlichen Kollagenen variiert zwischen ca. 42-54 %. Bei Rinderkollagen liegt der Hydroxylierungsgrad im Bereich von 45 %.
Kollagen ist eine wichtige Quelle für biologisch aktive Peptide mit vielfältigen Anwendungsgebieten. Aufgrund ihrer hohen antioxidativen und antihypertensiven Aktivität in Kombination mit ihrer geringen Antigenität eignen sich Kollagenpeptide besonders für die Anwendung als „Functional Food“. Unter dem Aspekt der Nachhaltigkeit ist es erstrebenswert Kollagenpeptide insbesondere aus Säugern wie dem Rind (Bos taurus) rekombinant herzustellen. Für die rekombinante Produktion von Kollagen-Polypeptidketten tierischen, insbesondere bovinen, Ursprungs, bevorzugt Peptide oder Fragmente aus der natürlichen Sequenz einer Kollagen-Polypeptidkette, insbesondere des α-1-Typ-I-Kollagens (Col1A1), kommen prinzipiell unterschiedliche zellbasierte Expressionssysteme in Frage: Prokaryoten, wie Escherichia coli (E. coli), sowie eukaryotische Organismen, wie Hefen, Pflanzen, Säugerzellen und Insektenzellen. Zwar besitzen Bakterien und Hefen keine natürlichen Mechanismen zur Hydroxylierung von Prolin, ermöglichen jedoch eine kosteneffiziente Produktion von rekombinanten Proteinen.
Die Verwendung von prokaryotischen Systemen, wie E. coli, für die industrielle Produktion von rekombinanten Kollagenpeptiden bietet den Vorteil, dass diese vielfältig charakterisiert sind, genetisch einfach zugänglich sind, eine geringe Komplexität besitzen, über eine hohe spezifische Wachstumsgeschwindigkeit verfügen, zu hohen Zelldichten angezogen werden können (Hochzelldichtefermentation), auf kostengünstigen Kulturmedien wachsen, eine schnelle Expression von rekombinanten Proteinen mit hohem Expressionsniveau ermöglichen und in prokaryotischen Systemen häufig hohe Raum-Zeit-Ausbeuten erzielt werden können.
Die rekombinante Expression der menschlichen α-Kette des Typ III Kollagens (hCol3A1) unter Einsatz des Wirtsorganismus Escherichia coli ist aus dem Stand der Technik bekannt (Shi et al., Protein J., 2017, 36, 322-331; Rutschmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014, 98, 4445-4455). Trotz des charakteristischen Kollagen-Sequenzmotivs (Gly-X-Y)_n weisen verschiedene Kollagene, insbesondere Kollagene unterschiedlichen Ursprungs, teils deutlich unterschiedliche Sequenzen und damit verbunden unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf die rekombinante Expression in prokaryotischen Systemen auf. So besitzt das bovine Col1A1 (bCol1A1) nur eine Sequenzidentität von 62,1 % und eine Sequenzähnlichkeit von 67,5 % zum humanen Col3A1, woraus sich ein anderes Verhalten hinsichtlich der Expression von bovinem Kollagen Col1A1 ergibt und sich der im Stand der Technik beschriebene cytosolische Expressionsansatz auf die rekombinante Expression des bovinen Kollagens Col1A1 in prokaryotischen Systemen nicht übertragen lässt. Die Produktion von rekombinanten Kollagenpeptiden, insbesondere Kollagenpeptiden bovinen Ursprungs, mit Hilfe prokaryotischer Systeme, beispielsweise mit dem Wirtsorganismus Escherichia coli, stellt eine besondere Herausforderung dar, da Kollagenpeptide neben der gewünschten biologischen Aktivität auch antimikrobielle Wirkung besitzen können. Einige natürlich vorkommende Kollagenpeptide, wie beispielsweise das bovine Col1A1, weisen im Vergleich zu anderen im Stand der Technik in E. coli bereits erfolgreich exprimierten Kollagenen - wie marine Kollagene, Kollagen-ähnlichen Proteinen (collagen-like proteins) bakteriellen oder künstlichen Ursprungs sowie sogenannten Designer-Kollagenen, beispielsweise bestehend aus repetitiven GEK (G: Glycin, E: Glutaminsäure, K: Lysin) und GDK-Abfolgen (D: Asparaginsäure) und nicht natürlich vorkommende Aminosäureabfolgen (keine 100 %-ige Übereinstimmung zu natürlichem Kollagen wie Col1A1) - eine höhere Hydrophobizität (33-43 %) und/oder einen höheren Prolingehalt (20-31 %) auf. Aufgrund der dadurch bewirkten antimikrobiellen Wirkung erweist sich die rekombinante Expression vieler Kollagenpeptide in prokaryotischen Systemen daher als problematisch.
Darüber hinaus besteht ein besonderes Problem in Hinblick auf die Herstellung rekombinanter hydroxylierter Kollagenpeptide darin, dass Prokaryoten im Unterschied zu vielen Eukaryoten natürlicherweise weder post-translational noch prä-translational zur Hydroxylierung von Prolin befähigt sind. Aus dem Stand der Technik sind bereits verschiedene Ansätze bekannt, den Wirtsorganismus E. coli zur post-translationalen Hydroxylierung von (S)-Prolin (L-Prolin) unter Verwendung von Sauerstoff, 2-Oxoglutarat und Ascorbat zu (2S,4R)-4-Hydroxyprolin (L-Hydroxyprolin) zu befähigen. So wurde die rekombinante Expression der humanen Prolyl-4-hydroxalse (P4H), bei welcher es sich um ein α₂β₂-Tetramer handelt, bereits in aktiver Form sowohl im Cytosol, als auch im Periplasma von E. coli beschrieben (Kersteen et al., Protein Expr. Purif., 2004, 38, 279-291; Neubauer et al., Matrix Biol., 2005, 24, 59-68). Darüber hinaus konnte die humane Prolyl-4-hydroxylase erfolgreich mit künstlichen Kollagensequenzen sowie einem human-ähnlichen Kollagen im Cytosol von E. coli co-exprimiert werden (Pinkas et al., ACS Chem. Biol., 2011, 6, 320-324; Tang et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 178, 1458-1470). Wenngleich die humane P4H in E. coli in aktiver Form exprimiert werden konnte, liegen keinerlei Berichte über die rekombinante Expression der bovinen Prolyl-4-hydroxylase (P4H) in E. coli vor. Zu berücksichtigen ist hierbei, dass die bovine P4H nur eine geringe Homologie zur humanen P4H besitzt. Die α-Untereinheit aus dem Rind weißt eine Sequenzidentität von ca. 37 % und eine Sequenzähnlichkeit von ca. 57 % zur humanen α-Untereinheit auf und die β-Untereinheit aus dem Rind besitzt eine Sequenzidentität von ca. 33 % und eine Sequenzähnlichkeit von ca. 50 % zur humanen β-Untereinheit. Problematisch bei der rekombinanten Expression aller P4Hs aus Vertebraten in Prokaryoten ist, dass ausschließlich das α₂β₂-Tetramer mit einem vergleichsweise sehr hohen Molekulargewicht von etwa 240 kDa katalytische Aktivität besitzt und für die Ausbildung der nativen Struktur der α-Untereinheit und die Assoziation zum Tetramer die Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken notwendig ist. Eine in vitro Assoziation der Untereinheiten zum Tetramer funktioniert nicht und die Co-expression der β-Untereinheit ist notwendig, um die α-Untereinheit in löslicher Form zu halten. Ein weiteres Problem ist, dass die Aktivität und Stabilität des Tetramers stark von der Verfügbarkeit von Kollagensubstraten abhängt, was den Produktionsprozess und die Expressions-/Induktionsstrategie sehr schwierig gestaltet. Aufgrund der multimeren Organisation und der begrenzten Stabilität der tierischen Prolyl-4-hydroxylasen, gepaart mit deren sehr begrenzter Aktivität gegenüber kurzen Kollagensubstraten, ist eine effiziente und korrekte Hydroxylierung von Kollagenpeptiden, insbesondere von bovinen Col1A1-Kollagenpeptiden, unter Einsatz der bovinen Prolyl-4-hydroxylase in E. coli nicht gewährleistet. Da zudem die Produktivität gewöhnlich mit steigender Anzahl an verschiedenen rekombinant zu exprimierenden Genen abnimmt, wäre eine monomere P4H mit einer Präferenz für die Kollagen-typische Hydroxylierung von Prolin in Y-Position wünschenswert. Bakterielle P4Hs werden zwar in verschiedenen Genomen vorhergesagt, allerdings sind bisher nur sehr wenige bakterielle P4Hs charakterisiert worden, insbesondere hinsichtlich ihres Hydroxylierungsmusters. Ein Beispiel hierfür stellt die P4H aus Bacillus anthracis dar, welche allerdings sowohl in der X als auch in der Y-Position der Kollagenmotivs (Gly-X-Y)_n hydroxyliert (Schnicker et al., J. Biol. Chem., 2016, 291, 13360-13374) und somit zur Erzeugung eines zum bovinen Col1A1 möglichst identischen Hydroxylierungsmuster nicht in Frage kommt.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinant hergestellten Kollagenpeptide-Komponente, insbesondere rekombinante Kollagenpeptide, bereitzustellen, das die vorgenannten Nachteile überwindet, das es insbesondere erlaubt rekombinante Kollagenpeptid-Komponenten, insbesondere rekombinante Kollagenpeptide, auch im größerem industriellen und kostengünstigen Maßstab in prokaryotischen Systemen herzustellen. Der vorliegenden Erfindung liegt auch das technische Problem zugrunde ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente mit Kollagen-typischem Hydroxylierungsmuster in prokaryotischen Systemen, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche, insbesondere durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen gemäß der vorliegenden Erfindung, eines Verfahrens zur Herstellung eines rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptids in prokaryotischen Systemen gemäß der vorliegenden Erfindung und eines Verfahrens zur Herstellung einer rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz, wobei die mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz mindestens eines Kollagenpeptids umfasst,
b) Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente zum Erhalt mindestens einer Kollagenpeptid-Komponente ermöglichen, wobei die Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid eine verringerte Hydrophobizität und/oder einen verringerten Prolingehalt aufweist,
c) Gewinnen der Kollagenpeptid-Komponente.

Die vorliegende Erfindung basiert insbesondere auf der Identifizierung der Kombination aus dem Prolingehalt und der Hydrophobizität als entscheidende Einflussfaktoren auf die antimikrobielle Wirksamkeit einiger Kollagenpeptide. Dabei führt der hydrophobe Charakter der Kollagenpeptide vermutlich zur Einlagerung der Peptide in die bakteriellen Membranen und damit zum Verlust der Membranintegrität, so wie es bei vielen extrazellulär applizierten antimikrobiellen Peptiden der Fall ist. Der hohe Prolingehalt der Kollagenpeptide führt vermutlich in Analogie zur Klasse der prolinreichen antimikrobiellen Peptide zu einer Störung des Zellmetabolismus auf Ebene der Proteinsynthese ohne Störung der Zellmembran. Das erfindungsgemäße Verfahren geht von einem prokaryotischen Expressionssystem, bevorzugt E. coli, aus, das mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz aufweist, wobei die mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz mindestens eines Kollagenpeptids umfasst, das heißt dass die mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz zumindest aus einer für ein Kollagenpeptid kodierende Sequenz besteht, jedoch von dieser auch zusätzliche Peptidreste N- und/oder C-terminal des mindestens einen Kollagenpeptids kodiert sein können, es sich bei der Kollagenpeptid-Komponente also auch um ein Kollagenfusionspeptid handeln kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist in der die Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz des prokaryotischen Expressionssystems die ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz mit mindestens einer Nukleotidsequenz fusioniert, die für mindestens einen, vorzugsweise hydrophilen, Peptidrest kodiert. Durch die Fusion des Kollagenpeptids mit dem mindestens einen Peptidrest, bevorzugt hydrophile Peptidrest, kommt es in dem prokaryotischen Expressionssystem zur Bildung eines insgesamt Hydrophobizitäts- und/oder Prolin-reduzierten Kollagenfusionspeptids.
Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform ist die Kollagenpeptid-Komponente ein Kollagenfusionspeptid, welches zusätzlich zu der Aminosäuresequenz des Kollagenpeptids mindestens einen Peptidrest, insbesondere ein hydrophiler Peptidrest, insbesondere mindestens einen Protein-tag, bevorzugt His-tag, ein Signalpeptid und/oder eine Kaschierungsdomäne aufweist.
Bevorzugt ist das mindestens eine Kollagenpeptid der mindestens einen Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids, von dem mindestens einen Peptidrest, insbesondere dem mindestens einen Protein-tag, dem mindestens einen Signalpeptid und/oder der mindestens einer Kaschierungsdomäne durch spezifische Erkennungssequenzen getrennt.
Besonders bevorzugt sind die spezifischen Erkennungssequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Faktor Xa (Ile-(Glu/Asp)-Gly-Arg), TEV (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)), Thrombin (Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser), Trypsin-Erkennungssequenz, Papain-Erkennungssequenz.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Kaschierungsdomäne eine N-terminale Aminosäuresequenz des Col1A1-Prokollagen aus Bos taurus oder eine V-Domäne des Kollagen-ähnlichen Proteins ScI2.28 aus Streptococcus pyogenes. Bevorzugt weist die N-terminale Aminosäuresequenz des Col1A1-Prokollagens aus Bos taurus die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 17 auf, bevorzugt besteht aus dieser. Bevorzugt weist die V-Domäne des Kollagen-ähnlichen Proteins ScI2.28 aus Streptococcus pyogenes die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 18 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Kollagenpeptid-Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem oder mit zwei Peptidresten fusioniert sein. Bevorzugt ist das Kollagenpeptid der die Kollagenpeptid-Komponente mit mindestens einem, bevorzugt mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, bevorzugt mindestens vier, Peptidresten, insbesondere hydrophilen Peptidresten, fusioniert.
In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem mindestens einen Peptidrest der Kollagenpeptidkomponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids, um Maltose-bindende Protein (MBP). Bevorzugt ist MBP an den N-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist MBP an den C-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. Bevorzugt weist MBP die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 7 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem mindestens einen Peptidrest der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids um Superfolder-Grün-Fluoreszierendes Protein (Superfolder-GFP). Bevorzugt ist Superfolder-GFP an den N-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Superfolder-GFP an den C-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. Bevorzugt weist Superfolder-GFP die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 5 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem mindestens einen Peptidrest der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids, um Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne. Bevorzugt ist Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne an den N-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne an den C-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. Bevorzugt weist Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 8 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
Bevorzugt handelt es sich bei dem mindestens einen Peptidrest der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids, um Mxe-GyrA-Intein mit C terminale Chitinbinde-Domäne und Superfolder-GFP. Bevorzugt ist Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne und Superfolder-GFP an den N-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne und Superfolder-GFP an den C-Terminus des Kollagenpeptids fusioniert. Bevorzugt weist Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne und Superfolder-GFP die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 9 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Kollagenpeptid der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids, am N-Terminus mit MBP fusioniert und am C-Terminus mit Superfolder-GFP, Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne oder Mxe-GyrA-Intein mit C-terminaler Chitinbinde-Domäne und Superfolder-GFP fusioniert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenfusionspeptid, ein Kollagenpeptid und mindestens ein N- und/oder C-terminales Sekretions-Signalpeptid, bevorzugt ein abspaltbares, insbesondere enzymatisch abspaltbares, N- und/oder C-terminales Sekretions-Signalpeptid. Bevorzugt umfasst die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenfusionspeptid, ein Kollagenpeptid, ein N- und/oder C-terminales Sekretions-Signalpeptid und mindestens einen weiteren Peptidrest, insbesondere mindestens einen weiteren hydrophilen Peptidrest. Besonders bevorzugt ist das N- und/oder C-terminales Sekretions-Signalpeptid ausgewählt aus HlyA, HlyAc und der katalytischen Domäne einer Cellulase aus Bacillus subtilis KSM-64.
Besonders bevorzugt enthält die HlyA-Signalpeptidsequenz die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, bevorzugt besteht aus dieser.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die HlyAc-Signalpeptidsequenz die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, bevorzugt besteht aus dieser.
Besonders bevorzugt ist die Kollagenpeptid-Komponente ein Kollagenfusionspeptid, bei dem das Kollagenpeptid am N-Terminus und/oder C-Terminus mit einem hydrophilen Peptidrest, fusioniert ist, insbesondere mit Superfolder-GFP am N-Terminus und mit einer HlyA-Signalsequenz oder einer HlyAc-Signalsequenz am C-Terminus.
Bevorzugt weist das Superfolder-GFP die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 5 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
Besonders bevorzugt ist die Kollagenpeptid-Komponente ein Kollagenfusionspeptid, bei dem das Kollagenpeptid am N-Terminus mit der katalytischen Domäne einer Cellulase aus Bacillus subtilis KSM-64 fusioniert ist. Bevorzugt weist die katalytische Domäne einer Cellulase aus Bacillus subtilis KSM-64 die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 6 auf, bevorzugt besteht aus dieser. In dieser bevorzugten Ausführungsform kann die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenfusionspeptid, neben der katalytischen Domäne einer Cellulase aus Bacillus subtilis KSM-64 noch weitere mit dem N-Terminus und/oder C-Terminus des Kollagenpeptids fusionierte Peptidreste aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das in Schritt a) bereitgestellte prokaryotische Expressionssystem zusätzlich mindestens eine HlyB und mindestens eine HlyD kodierende Nukleotidsequenz und wird in Schritt b) in dem Kulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente und von HlyB und HlyD ermöglichen. Durch die Co-Expression von HlyB, HlyD und einer das Sekretions-Signalpeptid umfassenden Kollagenpeptid-Komponente ist er vorteilhafterweise möglich, die Kollagenpeptid-Komponente in das Kulturmedium zu sezernieren.
Bevorzugt weist HlyB die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 3 auf, bevorzugt besteht aus dieser. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist HylD die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 4 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
Durch die Fusion des Kollagenpeptids der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenfusionspeptids, mit dem Sekretions-Signalpeptid, insbesondere mit der Signalsequenz HlyA, der Signalsequenz HlyAc oder mit der katalytischen Domäne einer Cellulase aus Bacillus subtilis KSM-64 gemäß den vorgenannten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhafterweise möglich, rekombinante Kollagenpeptid-Komponenten, insbesondere Kollagenpeptide oder Kollagenfusionspeptide, in einem prokaryotischen Expressionssystem zu bilden und diese unmittelbar in das Kulturmedium zu sezernieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenfusionspeptid, ein Kollagenpeptid und mindestens ein N-terminales Signalpeptid, bevorzugt ein abspaltbares, insbesondere enzymatisch abspaltbares, N-terminales Sec- oder TAT-spezifisches Signalpeptid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem prokaryotischen Expressionssystem um eine E.coli leaky-Mutante. Durch die über das N-terminale Sec- oder TAT-spezifische Signalpeptid vermittelte Translokation der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder des Kollagenfusionspeptids, in den periplasmatischen Raum ist es mit einer E. coli leaky-Mutante vorteilhafterweise möglich, die in den periplasmatischen Raum translozierte Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenfusionspeptid, über die teildurchlässige Außenmembran der leaky-Mutante in das Kulturmedium zu sekretieren.
Bei den vorgenannten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise vermieden werden, die Kollagenpeptid-Komponente aus dem Cytoplasma oder aus einem periplasmatischen Raum des prokaryotischen Systems isolieren zu müssen. Insbesondere kann so vermieden werden, dass die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenpeptid oder das Kollagenfusionspeptid, intrazellulär und somit mit einer Vielzahl von Wirtsproteinen vorliegt.
Gemäß diesen bevorzugten Ausführungsformen ist es vorteilhafterweise auch nicht mehr notwendig, die Zellen partiell oder vollständig aufzuschließen (periplasmatische Expression: selektiver Periplasma-Aufschluss; cytosolische Expression: vollständige Lyse der Zelle) wodurch auch vermieden wird, die Kollagenpeptid-Komponente aus einer komplexen Proteinmischung isolieren zu müssen. Insbesondere bei Expression im Cytoplasma besteht die Gefahr, dass die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente einer Proteolyse durch intrazelluläre Proteasen unterliegt. Durch die Translokation der synthetisierten Kollagenpeptid-Komponente in den periplasmatischen Raum einer leaky-Mutante oder durch direkte Sekretion in das Kulturmedium wird deren Aufreinigung erheblich vereinfacht und ökonomischer. Gleichzeitig ist die Kollagenpeptid-Komponente im Kulturmedium weitestgehend vor Proteolyse geschützt. Darüber hinaus können durch die Sekretion der Kollagenpeptid-Komponente in das Kulturmedium oftmals höhere Produkttiter erzielt werden als bei einer cytosolischen Expression. Da die Kollagenpeptid-Komponente gemäß dieser bevorzugten Ausführungsformen im Kulturmedium weitestgehend frei von Wirtsproteinen vorliegt, bedarf es zu deren Isolierung keiner affinitätschromatographischen oder mehrstufigen, komplexen Aufreinigung, sondern lediglich eines Ultra-/Diafiltrationsschrittes. Des Weiteren kann vorteilhafterweise auf den Prozessschritt des Zellaufschlusses verzichtet werden. Gegebenenfalls kann vor, nach oder während der Gewinnung der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder des Kollagenfusionspeptids, eine Abspaltung von C- und/oder N-terminalen Prokollagenfragmenten zur Gewinnung von einer Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere einem Kollagenpeptid oder einem Kollagenfusionspeptid, erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass im Anschluss an Verfahrensschritt b) und vor Verfahrensschritt c) oder im Anschluss an Verfahrensschritt c) in einem Verfahrensschritt d) eine Abspaltung, insbesondere enzymatische Abspaltung, des mindestens einen Peptidrests von der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere dem rekombinanten Kollagenfusionspeptid, erfolgt. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt b) erhaltene und in Schritt c) gewonnene Kollagenpeptid-Komponente mindestens eine an den N- und/oder C-Terminus des Kollagenpeptids fusionierte, insbesondere abspaltbare, bevorzugt enzymatisch abspaltbare, Peptid- oder Proteinsequenz auf. Diese mindestens eine an den N- und/oder C-Terminus des Kollagenpeptids fusionierte Peptid- oder Proteinsequenz verringert den Prolingehalt und/oder die Hydrophobizität des in dem prokaryotischen Expressionssystem exprimierten Kollagenfusionspeptids während der Expression im prokaryotischen Expressionssystem und wirkt somit der antimikrobiellen Wirksamkeit des Kollagenpeptids entgegen. Gemäß dieser Ausführungsform erfolgt nach Schritt b) und vor Schritt c) oder nach dem Gewinnen der Kollagenpeptid-Komponente in Schritt c) bevorzugt eine Abspaltung, insbesondere enzymatische Abspaltung, der mindestens einen an den N- und/oder C-Terminus des Kollagenpeptids fusionierten Peptidsequenz, um schließlich ein isoliertes Kollagenpeptid zu erhalten.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich oder alternativ zum Vorliegen eines N- und/oder C-terminal an das Kollagenpeptid fusionierten Peptidrests auch vorgesehen sein, dass die von der Nukleotidsequenz des prokaryotischen Expressionssystems kodierte rekombinante Kollagenpeptid-Komponente unter Bedingungen gebildet wird, die in Verfahrensschritt b) post-transkriptional, und zwar entweder i) post-transkriptional und prä-translational oder ii) post-transkriptional und post-translational, zu einer Reduzierung der Hydrophobizität und/oder des Prolingehalts der von der Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid führen.
Besonders bevorzugt wird in Schritt b) die von der Nukleotidsequenz des prokaryotischen Expressionssystems kodierte rekombinante Kollagenpeptid-Komponente unter Bedingungen gebildet, bei denen post-transkriptional und prä-translational, das heißt vor der Translation oder während der Translation der mRNA, mindestens eine niedrige Hydrophobizität aufweisende Aminosäure an Stelle einer durch das Basentriplett der mRNA vorgesehene hydrophoben Aminosäure, insbesondere Prolin, in die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere in das Kollagenpeptid oder das Kollagenfusionspeptid, eingebaut wird.
In bevorzugter Ausführungsform kann dies durch die Verwendung solcher prokaryotischen Expressionssysteme geschehen, die kein Prolin, insbesondere keine hydrophobe Aminosäure, sondern stattdessen die geringere Hydrophobizität aufweisende Aminosäure Hydroxyprolin herstellen und im Wege der Translation in die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenpeptid oder Kollagenfusionspeptid, einbauen, sodass die Hydrophobizität und/oder der Prolingehalt der gebildeten Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder Kollagenfusionspeptids, gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid verringert wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann eine Verringerung der Hydrophobizität und/oder des Prolingehalts der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder des Kollagenfusionspeptids, durch Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Hydroxyprolin-haltigen oder mit Hydroxyprolin angereicherten Kulturmedium in Schritt b) erfolgen. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Kultivierung in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Hydroxyprolin-haltigen oder mit Hydroxyprolinangereicherten Kulturmedium. Besonders bevorzugt wird das Hydroxyprolin-haltige oder mit Hydroxyprolin angereicherte Kulturmedium durch Inkubation eines Prolin-haltigen oder mit Prolin angereicherten Kulturmediums mit mindestens einer Prolin-4-hydroxylase (PIN4H) erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass es sich bei dem prokaryotischen Expressionssystem um eine Prolin-auxotrophe Wirtszelle handelt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass es sich bei dem prokaryotischen Expressionssystem um eine Prolin-auxotrophe und Hydroxyprolin-herstellende Wirtszelle handelt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass es sich bei dem prokaryotische Expressionssystem um eine Prolin-auxotrophe Wirtszelle handelt und das Kulturmedium Hydroxyprolin-haltig oder Hydroxyprolin-angereichert ist, insbesondere wobei das Hydroxyprolin-haltige oder mit Hydroxyprolin angereicherte Kulturmedium durch Inkubation eines Prolin-haltigen oder mit Prolin angereicherten Kulturmediums mit mindestens einer Prolin-4-hydroxylase (PIN4H) erhalten wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Verringerung der Hydrophobizität und/oder des Prolingehalts durch die Verwendung eines prokaryotischen Expressionssystems geschehen, das mindestens eine mindestens eine Prolin-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz exprimiert. Gemäß dieser Ausführungsform erfolgt die Verringerung der Hydrophobizität und/oder des Prolingehalts post-transkriptional und prä-translational unter Einsatz der vom prokaryotischen System exprimierten Prolin-4-hydroxylase (PIN4H) (EC 1.14.11.57). PIN4Hs setzen die natürliche Aminosäure L-Prolin unter Verwendung von Sauerstoff und 2-Oxoglutarat zu L-Hydroxyprolin um, welches von der Prolin-tRNA-Synthetase erkannt und statt L-Prolin in eine wachsende Polypeptidkette der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder des Kollagenfusionspeptids, eingebaut wird.
Besonders bevorzugt ist die Prolin-4-hydroxylase bakteriellen Ursprungs, insbesondere ist die Prolin-4-hydroxylase eine Prolin-4-hydroxylase aus Streptomyces griseoviridis, Dactylosporangium sp., Pseudomonas stutzeri, Bordetella bronchiseptica, Bradyrhizobium japonicum, Aeromonas caviae, Janthinobacterium sp. oder Achromobacter xylosoxidans. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Prolin-4-hydroxylase um eine monomere Prolin-4-hydroxylase. Besonders bevorzugt weist die Prolin-4-hydroxylase die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 10 auf, bevorzugt besteht aus dieser. Bevorzugt weist die Prolin-4-hydroxylase die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 11 auf, bevorzugt besteht aus dieser. Bevorzugt weist die Prolin-4-hydroxylase die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 12 auf, bevorzugt besteht aus dieser. Bevorzugt weist die Prolin-4-hydroxylase die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 13 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass in Schritt b) im Anschluss an die Transkription und Translation, also post-translational, die Hydrophobizität und/oder der Prolingehalt der exprimierten Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder Kollagenfusionspeptids, durch post-translationale Modifizierung, insbesondere Hydroxylierungen, insbesondere Prolinhydroxylierungen und/oder Glykosylierungen, gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid verringert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das in Schritt a) bereitgestellte prokaryotische Expressionssystem zusätzlich mindestens eine mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz und wird in Schritt b) in einem Kulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente und der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase ermöglichen, wobei die Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid eine verringerte Hydrophobizität und/oder einen verringerten Prolingehalt aufweist.
Bevorzugt handelt es sich bei dem in Schritt a) bereitgestellten prokaryotischen Expressionssystem um E. coli. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem in Schritt a) bereitgestellten prokaryotischen Expressionssystem um Bacillus subtilis.
Bevorzugt handelt es sich bei der mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz des prokaryotischen Expressionssystems um eine codon-optimierte Nukleinsäure, insbesondere um mindestens eine an die bevorzugte Codon-Verwendung des prokaryotischen Expressionssystems angepasste mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es in vorteilhafter Weise, ein generell für das prokaryotische Expressionssystem, insbesondere in E. coli, toxisches rekombinantes Kollagenpeptid mit hoher Effizienz und in hoher Reinheit herzustellen.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist insofern besonders vorteilhaft, als dass rekombinante Kollagenpeptide auch in einem industriellen oder großtechnischen Verfahrensweg hergestellt werden können. In besonders bevorzugter Ausführungsform sind die erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten Kollagenpeptid-Komponenten biologisch wirksam. Insbesondere zeigen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kollagenpeptid-Komponenten eine biologische Wirksamkeit auf die Biosynthese von Proteinen der extrazellulären Matrix, bevorzugt auf die Biosynthese von Kollagen, Elastin und/oder Proteoglykanen. Besonders bevorzugt zeigen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kollagenpeptid-Komponenten eine biologische Wirksamkeit auf Chondrozyten, Fibroblasten und/oder Osteoblasten.
Besonders bevorzugt ist die mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz codon-optimiert.
Bevorzugt weist das mindestens eine durch die mindestens eine Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid eine in Kollagen der Typen I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII, bevorzugt Typ I, II oder III, bevorzugt Typ I, bevorzugt Typ II, bevorzugt Typ III, vorkommende Aminosäuresequenz auf.
Bevorzugt weist das mindestens eine durch die mindestens eine Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid eine in Kollagen aus Wirbeltieren, insbesondere Fischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugetieren, insbesondere in humanem, bovinem, porcinem, equinem oder avianem Kollagen der Typen I, II oder III, bevorzugt Typ I, bevorzugt Typ II, bevorzugt Typ III, vorkommende Aminosäuresequenz auf.
Besonders bevorzugt weist das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid eine in bovinem Kollagen, insbesondere in bovinem Typ I Kollagen, bevorzugt in der α1-Kette des bovinen Typ I Kollagen, vorkommende Aminosäuresequenz auf.
Bevorzugt weist das Kollagenpeptid, insbesondere das Kollagenpeptid der Kollagenpeptid-Komponente oder das Kollagenpeptid des Kollagenfusionspeptids, mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 25, 26, 27, 28, 29, 30 und 31, auf, bevorzugt besteht aus mindestens einer dieser.
Bevorzugt ist das durch die mindestens eine Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid des Kollagenfusionspeptids ein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid des Kollagenfusionspeptids kein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid. Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid des Kollagenfusionspeptids ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid des Kollagenfusionspeptids ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid, bei dem mindestens eine Aminosäure der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids, bevorzugt mindestens eine nicht-essentielle Aminosäure, insbesondere Ala, Asn, Asp, Glu, Ser, der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids, durch mindestens eine ganz bestimmte Aminosäure, insbesondere durch mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, ersetzt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere die in Schritt c) gewonnene rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, das Kollagenfusionspeptid oder das Kollagenpeptid, insbesondere das nach Abspaltung des mindestens einen Peptidrests erhaltene Kollagenpeptid, eine Größe von 0,18 bis 110 kDa, bevorzugt 0,18 bis 100 kDa, bevorzugt 0,18 bis 90 kDa, bevorzugt 0,18 bis 80 kDa, bevorzugt 0,18 bis 70 kDa, bevorzugt 0,2 bis 60 kDa, bevorzugt 0,3 bis 50 kDa, bevorzugt 0,5 bis 50 kDa, bevorzugt 0,6 bis 50 kDa, bevorzugt 0,7 bis 50 kDa, bevorzugt 0,8 bis 50 kDa, bevorzugt 0,9 bis 50 kDa, bevorzugt 1 bis 50 kDa, bevorzugt 2 bis 50 kDa, bevorzugt 5 bis 50 kDa, bevorzugt 5 bis 40 kDa, bevorzugt 5 bis 30 kDa, bevorzugt 5 bis 20 kDa, bevorzugt 5 bis 10 kDa, auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere die in Schritt c) gewonnene rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, das Kollagenfusionspeptid oder das Kollagenpeptid, insbesondere das nach Abspaltung des mindestens einen Peptidrests erhaltene Kollagenpeptid, eine Größe von 0,18 bis 20 kDa, bevorzugt 0,2 bis 18 kDa, bevorzugt 0,3 bis 16 kDa, bevorzugt 0,5 bis 14 kDa, bevorzugt 0,6 bis 12 kDa, bevorzugt 0,8 bis 10 kDa, bevorzugt 1 bis 8 kDa, bevorzugt 1 bis 6 kDa, bevorzugt 1 bis 4 kDa, auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere die in Schritt c) gewonnene rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, das Kollagenfusionspeptid oder das Kollagenpeptid, insbesondere das nach Abspaltung des mindestens einen Peptidrests erhaltene Kollagenpeptid, eine Größe von 10 bis 80 kDa, bevorzugt 10 bis 70 kDa, bevorzugt 10 bis 60 kDa, bevorzugt 10 bis 50 kDa, bevorzugt 10 bis 40 kDa, bevorzugt 10 bis 30 kDa, bevorzugt 10 bis 20 kDa, auf.
Besonders bevorzugt ist die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere die in Schritt c) gewonnene rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, das Kollagenfusionspeptid oder das Kollagenpeptid, insbesondere das nach Abspaltung des mindestens einen Peptidrests erhaltene Kollagenpeptid, hydroxyliert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere die in Schritt c) gewonnene rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, das Kollagenfusionspeptid oder das Kollagenpeptid, insbesondere das nach Abspaltung des mindestens einen Peptidrests erhaltene Kollagenpeptid, nicht hydroxyliert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere die in Schritt c) gewonnene rekombinante Kollagenpeptid-Komponente, das Kollagenfusionspeptid oder das Kollagenpeptid, insbesondere das nach Abspaltung des mindestens einen Peptidrests erhaltene Kollagenpeptid, ein Verhältnis von Prolin zu Hydroxyprolin von 0% bis 45% Prolin zu 55% bis 100% Hydroxyprolin (bezogen auf Anzahl der Prolin- und Hydroxyprolinreste der Kollagenpeptid-Komponente) auf.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kollagenpeptid-Komponente, herstellbar, insbesondere hergestellt, durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptids in prokaryotischen Systemen, umfassend die Schritte:

aa) Bereitstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend mindestens eine mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz und mindestens eine mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz,
bb) Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des mindestens einen Kollagenpeptids und der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase zum Erhalt mindestens eines hydroxylierten Kollagenpeptids ermöglichen,
cc) Gewinnen mindestens eines hydroxylierten Kollagenpeptids,

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Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit vorteilhafterweise die Herstellung mindestens eines hydroxylierten Kollagenpeptids mit einem Kollagen-typischen Hydroxylierungsmuster in prokaryotischen Systemen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen mindestens 50%, bevorzugt mindestens 55%, bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70%, bevorzugt mindestens 75%, bevorzugt mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 100%, der Hydroxylierungen in dem mindestens einen Kollagenpeptid an einem Prolin Y-Position vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt das mindestens eine in Schritt cc) gewonnene Kollagenpeptid einen Hydroxylierungsgrad von 5 bis 100%, bevorzugt 5 bis 90%, bevorzugt 5 bis 80%, bevorzugt 10 bis 70%, bevorzugt 15 bis 60%, bevorzugt 20 bis 50%, bevorzugt 30 bis 50%, bevorzugt 35 bis 50%, bevorzugt 40 bis 50% (jeweils bezogen auf die Gesamtzahl der Prolin- und Lysinreste des Kollagenpeptids).
Bevorzugt besitzt das mindestens eine in Schritt cc) gewonnene Kollagenpeptid einen Hydroxylierungsgrad von mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 15%, bevorzugt mindestens 20%, bevorzugt mindestens 25%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugt mindestens 35%, bevorzugt mindestens 40%, bevorzugt mindestens 45%, bevorzugt mindestens 50% (jeweils bezogen auf die Gesamtzahl der Prolin- und Lysinreste des Kollagenpeptids). Bevorzugt weist das mindestens eine in Schritt cc) gewonnene Kollagenpeptid einen Hydroxylierungsgrad von höchstens 80%, bevorzugt höchstens 75%, bevorzugt höchstens 70%, bevorzugt höchstens 65%, bevorzugt höchstens 60%, bevorzugt höchstens 55%, bevorzugt höchstens 50%, auf (jeweils bezogen auf die Gesamtzahl der Prolin- und Lysinreste des Kollagenpeptids).
In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz, um eine natürlich vorkommende Nukleotidsequenz. Bevorzugt handelt es sich bei der mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz, um eine Nukleotidsequenz aus Säugetieren. Bevorzugt handelt es sich bei der mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz, um eine Nukleotidsequenz bovinen Ursprungs. Bevorzugt kodiert die Nukleotidsequenz ein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz, um keine natürlich vorkommende Nukleotidsequenz. Bevorzugt handelt es sich bei der mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz, um eine gentechnisch veränderte Nukleotidsequenz. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die Nukleotidsequenz kein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid. Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid, bei dem mindestens eine Aminosäure der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids, bevorzugt mindestens eine nicht-essentielle Aminosäure, insbesondere Ala, Asn, Asp, Glu, Ser, der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Kollagenpeptids, durch mindestens eine ganz bestimmte Aminosäure, insbesondere durch mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, ersetzt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, um eine Nukleotidsequenz bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs. Bevorzugt handelt es sich bei mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, um eine Nukleotidsequenz bakteriellen Ursprungs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelts es sich bei der mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, um eine Nukleotidsequenz pflanzlichen Ursprungs, bevorzugt um eine Nukleotidsequenz aus Arabidopsis thaliana. Bevorzugt ist die mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz pflanzlichen Ursprungs, bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, codon-optimiert.
Besonders bevorzugt weist die mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 14 auf. Bevorzugt weist die mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, bevorzugt mindestens 91%, bevorzugt mindestens 92%, bevorzugt mindestens 93%, bevorzugt mindestens 94%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 96%, bevorzugt mindestens 97%, bevorzugt mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, Sequenzidentität zu der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 14 auf.
Besonders bevorzugt kodiert die mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz mindestens eine Prolyl-4-hyroxylase aus Arabidopsis thaliana, insbesondere mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 15.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Prolyl-4-hydroxylase, insbesondere die Prolyl-4-hydroxylase aus Arabidopsis thaliana, ein Fusionsprotein. In bevorzugter Ausführungsform ist die Prolyl-4-hydroxylase, insbesondere die Prolyl-4-hydroxylase aus Arabidopsis thaliana, N-terminal mit MBP fusioniert. Besonders bevorzugt, weist die mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase, insbesondere die Prolyl-4-hydroxylase aus Arabidopsis thaliana, eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 16 auf, bevorzugt besteht aus dieser.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein hydroxyliertes Kollagenpeptid herstellbar, insbesondere hergestellt, durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptids in prokaryotischen Systemen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen, umfassend das Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das in Schritt a) bereitgestellte prokaryotische Expressionssystem zusätzlich mindestens eine mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz umfasst und das prokaryotische Expressionssystem in Schritt b) in einem Kulturmedium unter Bedingungen erfolgt, die die Expression des mindestens einen Kollagenpeptids und der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase ermöglichen.
Demnach umfasst die vorliegende Erfindung insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen, umfassend die Schritte:

i) Bereitstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz und mindestens eine mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, wobei die mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz mindestens eines Kollagenpeptids umfasst,
ii) Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente und der mindestens einer Prolyl-4-hydroxylase zum Erhalt mindestens einer hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente ermöglichen, wobei die Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid eine verringerte Hydrophobizität und/oder einen verringerten Prolingehalt aufweist,
iii) Gewinnen der hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die in Schritt iii) gewonnene Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenpeptid oder Kollagenfusionspeptid, das Aminosäuresequenzmotiv (Gly-X-Y)_n auf, wobei mindestens 50% der Hydroxylierungen in dem mindestens einen Kollagenpeptid an einem Prolin in Y-Position vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine hydroxylierte Kollagenpeptid-Komponente, herstellbar, insbesondere hergestellt, durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen.
Die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen getroffenen Aussagen und Ausführungsformen gelten mutatis mutandis auch für das Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptids in prokaryotischen Systemen und das Verfahren zur Herstellung rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen und umgekehrt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Kollagen“ in fachüblicher Weise verstanden, insbesondere so wie beispielsweise in der WO 01/34646 definiert. In bevorzugter Ausführungsform betrifft der Begriff „Kollagen“ die Kollagen-Typen I bis XXVII. In weiterer bevorzugter Ausführungsform wird unter dem Begriff „Kollagen“ ein die Sequenz Glycin-Prolin, Glycin-4-Hydroxyprolin oder Glycin-X-4-Hydroxyprolin, bevorzugt das repetitive Motiv (Gly-X-Y)_n, aufweisendes Peptid verstanden, wobei X und Y jede Aminosäure sein können, vorzugsweise Prolin und 4-Hydroxylprolin sind. Besonders bevorzugt wird unter dem Begriff „Kollagen“ ein das repetitive Motiv (Gly-Pro-Y)_n und/oder (Gly-X-Hyp)_m aufweisendes Peptid verstanden, wobei X und Y jede Aminosäure sein können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Kollagenpeptid“ ein Protein oder Peptid verstanden, das eine in Kollagen gemäß vorstehender Definition vorkommende Aminosäuresequenz aufweist, wobei es sich bei dem Protein oder Peptid mindestens um ein Dipeptid, bevorzugt um ein Oligopeptid oder Polypeptid, handelt. Dabei kann das Kollagenpeptid insbesondere in chemisch-modifizierter Form, insbesondere hydroxylierter und/oder glykosylierter Form, vorliegen oder nicht modifiziert sein.
Ein „Kollagenpeptid“ im Sinne der vorliegenden Erfindung kann auch ein Kollagenprotein sein. Insbesondere kann das Kollagenpeptid der vorliegenden Erfindung in einzelsträngiger Form vorliegen, das Kollagenpeptid der vorliegenden Erfindung kann allerdings auch als Di- oder Trimer, insbesondere Trimer, aus gleichen oder verschiedenen Kollagenpeptiden vorliegen, insbesondere auch als tripelhelikales Kollagenpeptid.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „natürlich vorkommenden Kollagenpeptid“ ein unmittelbar aus natürlichen Quellen isolierbares Kollagenpeptid verstanden, also ein solches, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen eines Organismus kodiert werden, insbesondere ohne dass in diesen Nukleotidsequenzen Mutationen vorkommen, insbesondere solche, die zu einem oder mehreren Aminosäure-Austäuschen führt. Insbesondere wird unter natürlich vorkommenden Kollagenpeptiden verstanden, dass diese natürlicherweise in einem Wirbeltier, insbesondere im Rind, oder einem Wirbellosen, insbesondere einer Qualle, vorkommen. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist ein natürlich vorkommendes Kollagenpeptid ein Kollagenpeptid, welches im Rind vorkommt.
Der Begriff „Kollagenpeptid-Komponente“ bezeichnet erfindungsgemäß ein mindestens die Aminosäuresequenz eines Kollagenpeptids umfassendes Peptid. Dabei kann die Kollagenpeptid-Komponente in einer bevorzugten Ausführungsform aus der Aminosäuresequenz des Kollagenpeptids bestehen, also ein Kollagenpeptid sein. Es ist in einer weiteren Ausführungsform jedoch auch denkbar, dass die Kollagenpeptid-Komponente die Aminosäuresequenz mindestens eines Kollagenpeptids und mindestens eine weitere Aminosäuresequenz umfasst, bei der es sich nicht um ein Kollagenpeptid handelt. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Kollagenpeptid-Komponente um ein Kollagenfusionspeptid. Bevorzugt weist die Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenfusionspeptid, mindestens einen N- und/oder C-terminal an die Aminosäuresequenz des Kollagenpeptids fusionierten Peptidrest, insbesondere hydrophilen Peptidrest, auf.
Unter einer „Wirtszelle“ wird erfindungsgemäß eine lebende Zelle verstanden, die zur Expression von in Fremd-DNA, insbesondere in rekombinanter DNA, kodierten Peptiden oder Proteinen, befähigt ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „rekombinanten Kollagenpeptid“ ein durch biotechnologische rekombinante Herstellung mittels eines Expressionssystems gewonnenes Kollagenpeptid verstanden. Erfindungsgemäß ist dem „rekombinanten Kollagenpeptid“ eigen, dass diese nicht aus natürlichen Quellen gewonnen werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Nukleotidsequenz“ die Abfolge der Nukleotide einer Nukleinsäure, insbesondere eines Polynukleinsäurestrangs, insbesondere eines DNA-Strangs, verstanden. Eine „Nukleotidsequenz“ ist daher sowohl als informatorische Einheit als auch als der diese Information physisch manifestierende DNA-Strang zu verstehen.
Unter den Begriffen „Codon-Optimierung“ und „codon-optimiert“ wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Anpassung der Nukleotidsequenz, insbesondere der für eine Aminosäure kodierenden Basentriplets, an die von dem gewählten Expressionssystem, insbesondere dem gewählten prokaryotischen Expressionssystem, bevorzugt verwendeten für eine bestimmte Aminosäure kodierenden Basentriplets, verstanden. Die „Codon-Optimierung“ basiert darauf, dass die verschiedenen für eine bestimmte Aminosäure kodierenden Basentriplets von unterschiedlichen Spezies bei der Proteinbiosynthese unterschiedlich häufig verwendet werden. Demnach führt eine „Codon-Optimierung“ zu einer Änderung der eine bestimmte Aminosäuresequenz kodierenden Nukleinsäure jedoch nicht zur Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz selbst.
Unter einer „Verringerung der Hydrophobizität“ wird erfindungsgemäß eine Reduktion der Gesamt-Hydrophobizität der betreffenden Kollagenpeptid-Komponente im Vergleich zur Gesamt-Hydrophobizität des Kollagenpeptids der Kollagenpeptid-Komponente verstanden. Die „Verringerung der Hydrophobiziät“ kann erfindungsgemäß beispielsweise durch Fusion des Kollagenpeptids mit mindestens einem Peptidrest, bevorzugt mit mindestens einem hydrophilen Peptidrest, erzielt werden. Ferner kann die Hydrophobizität der Kollagenpeptid-Komponente beispielsweise durch prä-translationale oder post-translationale Hydroxylierung von Prolin zu Hydroxyprolin verringert werden. Die Hydrophobizität des Peptids kann beispielsweise anhand des Eisenberg Consensus Scale (ECS), des Gunnar von Heijne Scale, des Kyte and Doolittle Scale, des Wimley-White Scale, des aWW Scale, des Engelman-Steitz Scale oder anderen dem Fachmann bekannten Bestimmungsverfahren ermittelt werden. Bevorzugt beträgt die Reduktion der Gesamt-Hydrophobizität der betreffenden Kollagenpeptid-Komponente im Vergleich zur Gesamt-Hydrophobizität des Kollagenpeptids der Kollagenpeptid-Komponente mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40%, bevorzugt mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%.
Die Bezeichnung „Verringerung des Prolingehalts“ bezeichnet erfindungsgemäß eine Reduktion des prozentualen Anteils der Prolinreste an der Gesamtzahl der Aminosäuren der betreffenden Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem prozentualen Anteil der Prolinreste an der Gesamtzahl der Aminosäuren in dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid. Eine „Verringerung des Prolingehalts“ der Kollagenpeptid-Komponente kann erfindungsgemäß beispielsweise dadurch erreicht werden, dass es sich bei der Kollagenpeptid-Komponente um ein Kollagenfusionspeptid handelt. Durch die Fusion mit mindestens einem Peptidrest wird der prozentuale Anteil an Prolinresten in der Kollagenpeptid-Komponente im Vergleich zum prozentualen Anteil in dem Prolin-reichen Kollagenpeptid gesenkt. Eine weitere Möglichkeit zur „Verringerung des Prolingehalts“ besteht in der prä- oder post-translationalen Hydroxylierung von Prolin zu Hydroxyprolin. Bevorzugt beträgt die Reduktion des prozentualen Anteils der Prolinreste an der Gesamtzahl der Aminosäuren der betreffenden Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem prozentualen Anteil der Prolinreste an der Gesamtzahl der Aminosäuren in dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40%, bevorzugt mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%.
Der Begriff „Hydroxylierungsgrad“ bezeichnet erfindungsgemäß den prozentualen Anteil der hydroxylierten Prolin- und Lysinreste an der Gesamtzahl der Prolin- und Lysinreste der Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere des Kollagenpeptids oder des Kollagenfusionspeptids.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Expressionssystem“ ein System verstanden, in dem eine gezielte und kontrollierte Proteinbiosynthese erfolgen kann. Unter einem „prokaryotischen Expressionssystem“ ist erfindungsgemäße ein zellbasiertes biologische System zu verstehen, das in der Lage ist, gezielt und kontrolliert Proteinbiosynthese zu betreiben, das heißt ausgehend von einer Nukleinsäure als Informationsträger Peptide oder Proteine zu synthetisieren.
Die „Expression“ einer Nukleotidsequenz umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung insbesondere die Transkription in mRNA (messenger-RNA) und die anschließende Translation in ein Peptid oder, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gleichbedeutend, auch Protein.
Unter „Bedingungen, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente zum Erhalt mindestens einer Kollagenpeptid-Komponente ermöglichen“, „Bedingungen, die die Expression des mindestens einen Kollagenpeptids und der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase zum Erhalt mindestens eines hydroxylierten Kollagenpeptids ermöglichen“ und „Bedingungen, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente und der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase zum Erhalt mindestens einer hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente ermöglichen“ werden erfindungsgemäß Bedingungen, wie insbesondere Temperatur, Druck, Zeit, Licht sowie An- oder Abwesenheit von Induktoren und/oder Repressoren, verstanden, die eine Expression des betreffenden Peptids und/oder Proteins aktivieren oder verstärken. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression des betreffenden Peptids und/oder Proteins in Rahmen einer Hochzelldichtefermentation, insbesondere unter Hochdruck, bevorzugt Luft-Hochdruck. Die konkreten Bedingungen, die eine Expression des betreffenden Peptids und/oder Proteins ermöglichen, sind dem Fachmann bekannt und hängen von dem verwendeten Expressionssystem und der verwendeten Expressionskassette, insbesondere des darin enthaltenen Promotors, ab. Bei der Expression des betreffenden Peptids und/oder Proteins kann es sich je nach Aufbau der Expressionskassette um eine konstitutive oder induzierbare Expression handeln.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Gewinnen eines rekombinanten Kollagenfusionspeptids“, „Gewinnen eines rekombinanten Kollagenpeptids“ oder „Gewinnen einen hydroxylierten rekombinanten Kollagenpeptids“ die Isolierung eines Kollagenpeptids oder eines Kollagenfusionspeptids aus einer mehrere Komponenten enthaltenden Zusammensetzung mittels bekannter Isolierungsverfahren, wie beispielsweise Zentrifugationsverfahren, insbesondere differenzielle Zentrifugation und/oder Dichtegradientenzentrifugation, chromatografischer Verfahren, insbesondere Gelfiltrations-, Ionenaustausch-, Affinitäts- und/oder Hochleistungsflüssigkeitschromatografie, Elektrophoreseverfahren, Filtrationsverfahren und/oder Extraktionsverfahren, verstanden, wobei eine Anreicherung und Reinigung der betreffenden Komponente aus der mehrere Komponenten enthaltenden Zusammensetzung bevorzugt durch sequenzielle Anwendung mehrerer Isolationsverfahren erzielt werden kann.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen „umfassend“ und „aufweisend“ verstanden, dass zusätzlich zu den von diesen Begriffen explizit erfassten Elementen noch weitere, nicht explizit genannte Elemente hinzutreten können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter diesen Begriffen auch verstanden, dass allein die explizit genannten Elemente erfasst werden und keine weiteren Elemente vorliegen. In dieser besonderen Ausführungsform ist die Bedeutung der Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „bestehend aus“. Darüber hinaus erfassen die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ auch Zusammensetzungen, die neben den explizit genannten Elementen auch weitere nicht genannte Elemente enthalten, die jedoch von funktionell und qualitativ untergeordneter Natur sind. In dieser Ausführungsform sind die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“.
Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die erste und zweite Nachkommastelle oder die zweite Nachkommastelle nicht angegeben sind/ist, sind/ist diese als 0 zu setzen.
Unter dem Begriff „und/oder“ wird in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verstanden, dass alle Mitglieder einer Gruppe, welche durch den Begriff „und/oder“ verbunden sind, sowohl alternativ zueinander als auch jeweils untereinander kumulativ in einer beliebigen Kombination offenbart sind. Dies bedeutet für den Ausdruck „A, B und/oder C“, dass folgender Offenbarungsgehalt darunter zu verstehen ist: a) A oder B oder C oder b) (A und B) oder c) (A und C) oder d) (B und C) oder e) (A und B und C).
Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen illustriert.
Beispiel 1:
Cytosolische Expression einer Kollagenpeptid-Komponente in E. coli
1. Transformation der Zellen
Für jede Expression wird 1 µL des Vektor pMAL-c5x (50-100 ng/µL) umfassend ein Tetracyclin-Resistenzgen und eine der SEQ ID No. 19 und 20, zu 50 µL auf Eis aufgetauten, chemisch kompetenten E. coli BL21 gegeben und für 30 min auf Eis gelagert. Anschließend erfolgt ein Hitzeschock für 30 s bei 42 °C, woraufhin die Zellen direkt für 5 min auf Eis gekühlt werden, bevor 950 µL SOC-Medium (20 g/L Sojapepton, 5 g/L Hefeextrakt, 0,6 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 10 mL/L 1 M MgCl2, 10 mL/L 1 M MgSO₂, 10 mL/L 2 M Glukose) zu den Zellen gegeben wird. Die Zellen werden in einem Überkopfschüttler für ca. 70 min bei 37 °C kultiviert. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird bis auf ca. 100 µL, in denen das Zellpellet resuspendiert wird, verworfen. Die Zellen werden anschließend auf einer bei 37 °C vorgewärmten LB Agarplatte mit 25 mg/L Tetracyclin ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C bebrütet.
2. Kultivierung und Induktion der Expression
Am nächsten Tag wird eine einzelne Kolonie gepickt und zur Inokulation von 30 mL LB-Medium (10 g/L NaCl, 10 g/L Sojapepton, 5 g/L Hefeextrakt, pH 7,4) mit 25 mg/L Tetracyclin in einem 300 mL Schüttelkolben mit Schikanen genutzt. Die Kultur wird bei 37 °C und 120 Umdrehungen pro Minute (Auslenkung 25 mm) auf einem Orbitalschüttler über Nacht kultiviert.
Am darauf folgenden Tag werden 200 mL TB-Medium (4 g/L Glycerin, 12 g/L Sojapepton, 24 g/L Hefeextrakt, 2,31 g/L KH₂PO₄, 12,54 g/L K2HPO4, pH 7,4) mit 25 mg/L Tetracyclin in einem 1 L Schüttelkolben mit Schikanen unter Verwendung der Vorkultur auf eine optische Dichte von OD600 = 0,1 angeimpft und bei 37 °C und 120 Umdrehungen pro Minute (Auslenkung 25 mm) auf einem Orbitalschüttler kultiviert. Für die Expression im Schüttelkolben wird bei einer optischen Dichte von OD600 = 2-3 mit 0,1 mM IPTG induziert und die Kultivierung bei 28 °C fortgesetzt, bevor nach 20-22 h die Kultivierung durch Zellernte abgebrochen wird.
Erfolgte die Expression nicht im Schüttelkolben sondern erst im Fermenter, so wird diese zuvor angesetzte Kultur nicht induziert und über Nacht bei 37 °C kultiviert und als die Vorkultur 2. Stufe verwendet.
Am nächsten Tag wird ein Bioreaktor mit 12 L TB-Medium und 25 mg/L Tetracyclin mit der Vorkultur 2. Stufe auf eine OD600 von ca. 0,1 eingestellt. Die Rührerdrehfrequenz startet bei 200 Umdrehungen pro Minute und steigt entsprechend einer Rührkaskade bei Unterschreitung des relativen pO₂-Werts von 60 % um jeweils 2 % bis die maximale Rührerdrehfrequenz von 1500 Umdrehungen pro Minute erreicht wird. Zur Begasung werden 12 Normliter Luft pro Minute verwendet und ein Druck von 0,2 bar eingestellt. Der pH-Wert wird mit 10 %-iger Phosphorsäure und 4 M Natriumhydroxid-Lösung konstant auf 7,0 gehalten. Die Kultivierung erfolgt bei 37 °C. Bei einer optischen Dichte von OD600 = 9,0-10,0 wird mit 0,1 mM IPTG induziert. Die Kultivierung wird nach Erreichen der stationären Phase beendet.
Beispiel 2:
Sekretorische Expression einer Kollagenpeptid-Komponente in E. coli mittels des Signalpeptids HlyA
1. Transformation der Zellen
Für jede Expression wird 1 µL des Vektors pBR322, umfassend ein Teracyclin-Resistenzgen und eine der SEQ ID No. 21, für die untersuchten Kollagenpeptid-Komponenten (50-100 ng/µL) und 1 (µL des pACYC_HlyB+D (50-100 ng/µL) zur bicistronischen Expression der Porenproteine zu 50 µL auf Eis aufgetauten, chemisch kompetenten E. coli BL21(DE3) gegeben und für 30 min auf Eis gelagert. Anschließend erfolgt ein Hitzeschock für 30 s bei 42 °C, woraufhin die Zellen direkt für 5 min auf Eis gekühlt werden, bevor 950 µL SOC-Medium (20 g/L Sojapepton, 5 g/L Hefeextrakt, 0,6 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 10 mL/L 1 M MgCl2, 10 mL/L 1 M MgSO₂, 10 mL/L 2 M Glukose) zu den Zellen gegeben wird. Die Zellen werden in einem Überkopfschüttler für ca. 70 min bei 37 °C kultiviert. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird bis auf ca. 100 µL, in denen das Zellpellet resuspendiert wird, verworfen. Die Zellen werden anschließend auf einer bei 37 °C vorgewärmten LB Agarplatte mit 20 mg/L Tetracyclin und 20 mg/L Chloramphenicol ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C bebrütet.
2. Kultivierung und Induktion der Expression
Am nächsten Tag wird eine einzelne Kolonie gepickt und zur Inokulation von 30 mL LB-Medium (10 g/L NaCl, 10 g/L Sojapepton, 5 g/L Hefeextrakt, pH 7,4) mit 20 mg/L Tetracyclin und 20 mg/L Chloramphenicol in einem 300 mL Schüttelkolben mit Schikanen genutzt. Die Kultur wird bei 37 °C und 120 Umdrehungen pro Minute (Auslenkung 25 mm) auf einem Orbitalschüttler über Nacht kultiviert.
Am darauf folgenden Tag werden 200 mL TB-Medium (4 g/L Glycerin, 12 g/L Sojapepton, 24 g/L Hefeextrakt, 2,31 g/L KH₂PO₄, 12,54 g/L K2HPO4, pH 7,4) mit 25 mg/L Tetracyclin in einem 1 L Schüttelkolben mit Schikanen unter Verwendung der Vorkultur auf eine optische Dichte von OD600 = 0,1 angeimpft und bei 37 °C und 120 Umdrehungen pro Minute (Auslenkung 25 mm) auf einem Orbitalschüttler kultiviert. Für die Expression im Schüttelkolben wird bei einer optischen Dichte von OD600 = 2-3 mit 0,1 mM IPTG induziert und die Kultivierung bei 37 °C fortgesetzt, bevor nach 20-22 h die Kultivierung durch Zellernte abgebrochen wird.
Beispiel 3:
Sekretorische Expression einer Kollagenpeptid-Komponente in E. coli mittels der katalytischen Domäne einer Cellulase aus Bacillus subtilis KSM-64
1. Transformation der Zellen
Für jede Expression wird 1 µL des Vektors pET28 (50-100 ng/µL) mit einem pBR322-ori, umfassend ein Kanamycin-Resistenzgen und eine der SEQ ID Nos. 22, zu 50 µL auf Eis aufgetauten, chemisch kompetenten E. coli BL21(DE3) gegeben und für 30 min auf Eis gelagert. Anschließend erfolgt ein Hitzeschock für 30 s bei 42 °C, woraufhin die Zellen direkt für 5 min auf Eis gekühlt werden, bevor 950 µL SOC-Medium (20 g/L Sojapepton, 5 g/L Hefeextrakt, 0,6 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 10 mL/L 1 M MgCl2, 10 mL/L 1 M MgSO₂, 10 mL/L 2 M Glukose) zu den Zellen gegeben wird. Die Zellen werden in einem Überkopfschüttler für ca. 70 min bei 37 °C kultiviert. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird bis auf ca. 100 µL, in denen das Zellpellet resuspendiert wird, verworfen. Die Zellen werden anschließend auf einer bei 37 °C vorgewärmten LB-Agarplatte mit 100 mg/L Kanamycin ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C bebrütet.
2. Kultivierung und Induktion der Expression
Am nächsten Tag wird eine einzelne Kolonie gepickt und zur Inokulation von 30 mL LB-Medium (10 g/L NaCl, 10 g/L Sojapepton, 5 g/L Hefeextrakt, pH 7,4) mit 100 mg/L Kanamycin in einem 300 mL Schüttelkolben mit Schikanen genutzt. Die Kultur wird bei 37 °C und 120 Umdrehungen pro Minute (Auslenkung 25 mm) auf einem Orbitalschüttler über Nacht kultiviert.
Am darauf folgenden Tag werden 200 mL TB-Medium (4 g/L Glycerin, 12 g/L Sojapepton, 24 g/L Hefeextrakt, 2,31 g/L KH₂PO₄, 12,54 g/L K2HPO4, pH 7,4) mit 100 mg/L Kanamycin in einem 1 L-Schüttelkolben mit Schikanen unter Verwendung der Vorkultur auf eine optische Dichte von OD600 = 0,1 angeimpft und bei 37 °C und 120 Umdrehungen pro Minute (Auslenkung 25 mm) auf einem Orbitalschüttler kultiviert. Für die Expression im Schüttelkolben wird bei einer optischen Dichte von OD600 = 2-3 mit 0,1 mM IPTG induziert und die Kultivierung bei 37 °C fortgesetzt, bevor nach 20-22 h die Kultivierung durch Zellernte abgebrochen wird.
Erfolgt die Expression nicht im Schüttelkolben sondern erst im Fermenter, so wird diese zuvor angesetzte Kultur nicht induziert und über Nacht bei 37 °C kultiviert und als die Vorkultur 2. Stufe verwendet.
Am nächsten Tag wird ein Bioreaktor mit 12 L TB-Medium (4 g/L Glycerin, 12 g/L Sojapepton, 24 g/L Hefeextrakt, 2,31 g/L KH₂PO₄, 12,54 g/L K2HPO4, pH 7,4) und 100 mg/L Kanamycin mit der Vorkultur 2. Stufe auf eine OD600 = von ca. 0,1 eingestellt. Die Rührerdrehfrequenz startet bei 200 Umdrehungen pro Minute und steigt entsprechend einer Rührkaskade bei Unterschreitung des relativen pO₂-Werts von 60 % um jeweils 2 % bis die maximale Rührerdrehfrequenz von 1500 Umdrehungen pro Minute erreicht wird. Bei Unterschreiten des relativen pO₂-Wertes von 30 % erfolgte eine Zufütterung des Zulaufes (insgesamt 3 L Volumen bestehend aus 600 g/L Glycerin, 90 g/L Hefeextrakt, 2 g/L MgCl₂·7H₂O). Zur Begasung werden 12 Normliter Luft pro Minute verwendet und ein Druck von 0,2 bar eingestellt. Der pH-Wert wird mit 10 %-iger Phosphorsäure und 4 M Natriumhydroxid-Lösung konstant auf 7,0 gehalten. Die Kultivierung erfolgt bei 37 °C. Bei einer optischen Dichte von OD600 = 9,0-10,0 wird mit 0,1 mM IPTG induziert. Die Kultivierung wird nach Erreichen der stationären Phase beendet.
Beispiel 4:
Gewinnung hydroxylierter rekombinanter Kollagenpeptid-Komponenten mittels E. coli
1. Post-translationale Prolinhydroxylierung
Zur post-translationen Hydroxylierung von Kollagenpeptid-Komponenten wurden in verschiedenen Ansätzen der Vektor pACYCDuet-1, umfassend ein Chloramphenicol-Resistenzgen und die SEQ ID No. 23, bzw. der Vektor pCDFDuet-1, umfassend ein Streptomycin-Resistenzgen und die SEQ ID No. 23, in eine Kollagenpeptid-Komponente exprimierende E. coli Zellen transformiert.
Je nach gewählter Kollagenpeptid-Komponente kann durch Co-Expression mit einer bevorzugt in Y-Position des Kollagenmotivs (Gly-X-Y)_n hydroxylierenden Prolyl-4-hydroxylase, wie der Prolyl-4-hydroxylase 1 aus Arabidopsis thaliana, sowohl die cytosolische Expression von hydroxylierten Kollagen-Komponenten (vgl. Beispiel 1) als auch die sekretorische Expression von hydroxylierten Kollagen-Komponenten (vgl. Beispiele 2 und 3) durch E. coli Zellen realisiert werden. Massenspektrometrisch konnte die post-translationale Hydroxylierung von Prolin nachgewiesen werden.
2. Prä-translationale Prolinhydroxylierung
Zur prä-translationalen Hydroxylierung von Kollagenpeptid-Komponenten wurden Kollagenpeptid-Komponente exprimierende E. coli Zellen mit einem Vektor, umfassend die SEQ ID No. 24 transformiert, um eine Co-Expression von zu hydroxylierenden KollagenpeptidKomponenten und einer Prolin-4-hydroxylase aus Streptomyces griseoviridis zu erzielen. Massenspektroskopisch konnte der Einbau von Hydroxyprolin in die exprimierten Kollagenpeptid-Komponenten nachgewiesen werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 0134646 [0078]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Shi et al., Protein J., 2017, 36, 322-331; Rutschmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014, 98, 4445-4455 [0005]
Kersteen et al., Protein Expr. Purif., 2004, 38, 279-291; Neubauer et al., Matrix Biol., 2005, 24, 59-68 [0006]
Pinkas et al., ACS Chem. Biol., 2011, 6, 320-324; Tang et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 178, 1458-1470 [0006]
Schnicker et al., J. Biol. Chem., 2016, 291, 13360-13374 [0006]

Claims

Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz, wobei die mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz mindestens eines Kollagenpeptids umfasst, b) Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente zum Erhalt mindestens einer Kollagenpeptid-Komponente ermöglichen, wobei die Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid eine verringerte Hydrophobizität und/oder einen verringerten Prolingehalt aufweist, c) Gewinnen der Kollagenpeptid-Komponente.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in der die Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz des prokaryotischen Expressionssystems die ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz mit mindestens einer Nukleotidsequenz fusioniert ist, die einen Peptidrest kodiert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Peptidrest mindestens einen Protein-tag, ein Signalpeptid und/oder eine Kaschierungsdomäne aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, wobei der Peptidrest abspaltbar ist, insbesondere enzymatisch abspaltbar.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei nach Schritt c) oder nach Schritt b) und vor Schritt c) eine Abspaltung des mindestens einen Peptidrests der Kollagenpeptid-Komponente erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Kollagenpeptid-Komponente ein Kollagenpeptid und mindestens ein N- und/oder C-terminales Sekretions-Signalpeptid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das durch die Nukleotidsequenz kodierte Kollagenpeptid eine in bovinem Kollagen, insbesondere in bovinem Typ I Kollagen, bevorzugt in der α1-Kette des bovinen Typ I Kollagen, vorkommende Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptids in prokaryotischen Systemen, umfassend die Schritte: aa) Bereitstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend mindestens eine mindestens ein Kollagenpeptid kodierende Nukleotidsequenz und mindestens eine mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, bb) Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des mindestens einen Kollagenpeptids und der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase zum Erhalt mindestens eines hydroxylierten Kollagenpeptids ermöglichen, cc) Gewinnen mindestens eines hydroxylierten Kollagenpeptids, wobei das mindestens eine Kollagenpeptid das Aminosäuresequenzmotiv (Gly-X-Y)_n aufweist und mindestens 50% der Hydroxylierungen in dem mindestens einen Kollagenpeptid an einem Prolin in Y-Position vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei mindestens 80% der Hydroxylierungen in dem mindestens einen Kollagenpeptid an einem Prolin in Y-Position vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das das mindestens eine in Schritt cc) gewonnene Kollagenpeptid einen Hydroxylierungsgrad von mindestens 5% aufweist (bezogen auf die Gesamtzahl der Prolin- und Lysinreste des Kollagenpeptids).
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei es sich bei der mindestens einen Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, um eine Nukleotidsequenz bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Prolyl-4-hydroxylase kodierenden Nukleotidsequenz um eine Nukleotidsequenz aus Arabidopsis thaliana handelt.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente in prokaryotischen Systemen, umfassend die Schritte: i) Bereitstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend mindestens eine mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz und mindestens eine mindestens eine Prolyl-4-hydroxylase kodierende Nukleotidsequenz, wobei die mindestens eine rekombinante Kollagenpeptid-Komponente kodierende Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz mindestens eines Kollagenpeptids umfasst, ii) Kultivieren des prokaryotischen Expressionssystems in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression der mindestens einen rekombinanten Kollagenpeptid-Komponente und der mindestens einer Prolyl-4-hydroxylase zum Erhalt mindestens einer hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente ermöglichen, wobei die Kollagenpeptid-Komponente gegenüber dem mindestens einen von der Kollagenpeptid-Komponente kodierenden Nukleotidsequenz kodierten Kollagenpeptid eine verringerte Hydrophobizität und/oder einen verringerten Prolingehalt aufweist, iii) Gewinnen der hydroxylierten Kollagenpeptid-Komponente.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die in Schritt iii) gewonnene Kollagenpeptid-Komponente, insbesondere das Kollagenpeptid oder Kollagenfusionspeptid, das Aminosäuresequenzmotiv (Gly-X-Y)_n aufweist und mindestens 50% der Hydroxylierungen in dem mindestens einen Kollagenpeptid an einem Prolin in Y-Position vorliegen.
Kollagenpeptid-Komponente, hergestellt durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
Hydroxyliertes Kollagenpeptid, hergestellt durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12.
Hydroxylierte Kollagenpeptid-Komponente, hergestellt durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 und 14.