KR20150136604A - 삼중 나선 단백질의 정제 - Google Patents

삼중 나선 단백질의 정제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산된 삼중-나선 또는 콜라겐-유사 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.

Description

삼중 나선 단백질의 정제{PURIFICATION OF TRIPLE HELICAL PROTEINS}
다른 출원에 대한 교차 참조
본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허원 및 다른 참조 문헌은, 각각의 개별의 공보, 특허, 특허원 또는 다른 참조문헌이 참조로 구체적으로 및 개별적으로 나타나 있는 경우와 같이 이들의 전문이 참조로 포함된다.
본 출원은 2013년 3월 21일자로 출원된 호주 특허원 제2013900990호로부터의 우선권을 청구한다. 당해 출원의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원되어 있다. 서열 목록의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
기재내용의 분야
본 발명은 세균, 효모 또는 식물 세포로부터 재조합적으로 생산된 삼중-나선 또는 콜라겐-유사 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
배경
콜라겐은 동물의 세포외 매트릭스내 주요 구조 단백질이며 (Gly-Xaa-Yaa)n 반복 서열을 필요로 하는 특징적인 삼중-나선 구조에 의해 정의된다. Xaa 및 Yaa 위치에서 발견된 아미노산은 흔히 프롤린이며, 여기서 Yaa 위치내 Pro는 삼중 나선 안전성을 향상시키는 하이드록시프롤린(Hyp)으로 후-해독적으로 변형된다. 사람에서는, 각각의 형태-특이적인 생물학적 및 구조적 기능을을 지닌, 적어도 28개의 콜라겐 형의 계열이 존재한다. 삼중 나선 모티프(motif)는 또한 대식구 스캐빈저 수용체(macrophage scavenger receptor)인 콜렉틴 및 C1q와 같은 다른 단백질 속에 존재한다.
가장 풍부한 콜라겐은 세포간, 피브릴-형성 콜라겐, 특히 제I 형 콜라겐이다. 이들 콜라겐은 특이적인 가교-결합에 의해 안정화된 섬유 다발 네트워크를 형성하여 조직에 대해 안전성 및 강도를 제공함을 통해 동물에서 주요(major) 조직 구조를 형성한다. '주요' 피브릴 형성 콜라겐(제I 형, 제II 형 및 제III형)과는 대조적으로 '소수의(minor)' 콜라겐은 일반적으로 거의 광범위하게 분포되어 있지 않으며 '소수의' 콜라겐은 일반적으로 거의 광범위하게 분포되어 있지 않고 주요 콜라겐이 유의적이고 중요한 성분인 특수한 조직 위치에서 전형적으로 발견되는데, 예를 들면, 비대성 연골에서는 제X형 콜라겐이 발견되거나 기저 막에서는 제IV형 콜라겐이 발견된다.
콜라겐은 다양한 임상 적용에서 다양한 의학적 생성물에 있어 안전하고 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: Ramshaw et al, J Materials Science, Materials in Science, (2009), 20(1) pg 3-8]. 의학적 적용을 위해, 콜라겐은 일반적으로 2개의 명확한 양식으로 사용된다. 하나에서, 대동맥 판막 대체에서의 용도와 같은, 글루타르알데하이드 고정된 돼지 심장 밸브와 같은 완전한 조직이 화학적 안정화 후 사용된다. 다른 것은 생성물에 대해 바람직한 유형 또는 지대(farm)를 제공하는 공정과 함께, 상처 드레싱, 부착 장벽(adhesion barrier) 또는 연골 봉합술용 장치에 유용한 무수의, 안정화된 쉬이트(sheat) 또는 압출 섬유와 같은 다양한 생성물내로 재구성된 정제된 가용성 콜라겐의 제조를 통한다. 필요할 경우, 콜라겐 장치는 화학적 고정, 예를 들면, 글루타르알데하이드에 의해, 또는 물리적 방법, 예를 들면, 탈수열 가교-결합(dehydrothermal cross-linking)에 의해 안정화될 수 있다. 정제된 가용성 콜라겐은 또한 연 조직 증강을 위해 및 또한 실금증의 치료를 위해 집중적으로 사용되어 왔다. 재구성된 생성물은 조직에서 생물학적 기능에 중요한 저 면역원성, 흔히 단기간에 걸친 조절된 매출량(tumover), 조절된 다공성 및 세포-매트릭스 상호작용의 보유에 의해 특성화된다.
동물 콜라겐 조직으로부터 콜라겐을 정제하기 위하여, 대표적인 방법은 삼중-나선을 완전하게 남기면서 가교-결합된 영역을 제거하는 효소 분해의 사용을 통한 조직의 초기 분해 및 가용화를 포함한다. 가용화된 콜라겐은 이후에 정제되어 잠재적인 면역원성 오염물질을 제거할 수 있다. 예를 들어, 제US6548077호는 콜라겐과 제1의 단백질분해 효소를 접촉시킨 후 환원제 및 제2의 단백질분해 효소를 접촉시킴을 포함하는 조직으로부터 콜라겐의 제조를 기술하고 있다.
애다드(Addad) 등의 문헌[참조: Mar. Drugs (2011), 9(6), 967-983]은 조직 추출물의 산-펩신 가용화를 사용하여 해파리로부터 콜라겐을 정제하는 것을 기술하고 있다. 그러나, 안정하고 유용한 최종 생성물을 수득하기 위하여 가교결합 단계가 요구되었다. 산, 및 특히 아세트산을 사용한 치료는 조직의 팽윤을 초래하며, 펩신 분해 후, 가용성 콜라겐을 제공한다. 수득되는 가용성 콜라겐 생성물은 많은 의학적 적용을 위한 불용성 양식으로의 재구성을 필요로 할 수 있다.
대안적인 발표된 방법은 콜라겐이 풍부한 천연의 동물 조직을 유용한 의학적 물질로 가공하기 전 또는 후에 불순물을 세척하여 정제할 수 있는 매우 미분된 입자로 분쇄함을 포함한다.
시판되는 양의 콜라겐의 대부분은 소 공급원과 같은 동물원으로부터 기원하여 왔지만 콜라겐의 재조합체 형태를 생산하는데 있어서 소비되는 전염성 질병, 특히 소 스폰지형태의 뇌병증['광우병(mad cow disease)'] 연구 노력의 관심이 있어왔다. 더욱이, 동물-기원한 콜라겐은, 추출된 콜라겐이 설계되어 특수한 생물학적 특성을 향상시키거나 변화시킬 수 없다는 점에서 제한된다. 콜라겐은 세포외 매트릭스내 침착 전 또는 후 둘다에서 집중적인 해독후 변형에 적용되고 있다. 특히, 섬유 콜라겐은 세포외 공간에서 분자의 생명에 걸쳐 지속되는 분가내 및 분자간 가교-결합에 적용된다. 따라서, 콜라겐 속에 존재하는 가교-결합의 양은 다른 것들 중에서도, 콜라겐이 수거되는 조직의 연령 및 생리학에 의해 영향받는다. 이들 차이는 조직으로부터 콜라겐의 추출률 및 이들 콜라겐의 생물리학적 특성 둘 다에 영향받는다. 그 결과, 조직으로부터 분리된 콜라겐은 유의적인 로트-대-로트(lot-to-lot) 가변성을 나타낸다.
따라서, 동물 콜라겐의 분리로부터 재조합체 콜라겐의 생산으로 관심이 이동되어 왔다.
또한, 재조합체 DNA 기술의 사용은, 이것이 예를 들면, 외인성의 생물학적으로 활성인 도메인(즉, 추가의 단백질 기능을 제공하기 위해) 및 다른 유용한 특성(예를 들면, 개선된 생접합성 및 안전성)을 포함할 수 있는 합성 콜라겐 및 콜라겐 단편의 잠재적인 생산을 허용한다는 점에서 바람직하다.
효모와 같은 숙주 시스템이 재조합적으로 생사된 사람 암호화된 콜라겐에 대해 시험되어 왔다. 그러나, 효모 시스템은 포유동물 콜라겐의 안정성에 요구되는 Hyp 잔기를 형성하기 위한 프롤린-4 하이드록실라제에 대한 유전자를 도입하기 이한 필요성에 의해 복잡해진다. 전형적으로, 재조합체 포유동물 암호화된 콜라겐은 키키아(Pichia) 내에서 발현되며, 이는 최대의 하이드록실화에 도달하기 위한 산소 첨가 뿐만 아니라 향상된, 잠재적으로 내화 가공을 생성하기 위한 메탄올 첨가를 필요로 한다.
해독 후 변형을 필요로 하지 않는 다른 콜라겐-유사 물질은 하이드록실화된 사람 콜라겐으로의 대체로서 고려되어 왔다. 최근에, 세균 게놈에 대한 연구는, 모든 제3의 잔기로서 Gly 및 고 프롤린 함량을 함유하는 많은 추정된 세균 단백질이 존재함을 나타내어 왔으며, 콜라겐-유사, 삼중-나선 구조물이 특정의 세균 기원한 단백질 속에 존재할 수 있음을 제안하고 있다[참조: Peng Y et al (2010) Bio aterials 31(10}:2755-2761 ; Yoshizumi A et al (2009) 단백질 Sci 18:1241-1251 ]. 또한, 수개의 이들 단백질은 Hyp의 부재에도 불구하고, 약 37℃에서 안정한 삼중-나선형을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 삼중 나선 조성물은 다수의 경우에서 확인되어 왔다. 예에는 특정의 세균 세포상의 세포 표면 단백질 및 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis) 포자 상의 필라멘트를 포함한다. 병원성 이. 콜라이(E. coli) 속에 존재하는 프로파아지(prophage) 속에서 이러한 콜라겐-유사 작제물의 발현은 감염을 통해 발병력 관련된 유전자의 전파에 관여하는 것으로 여겨진다.
그러나, 재조합체 기술의 사용은 여전히 이의 단점 및 장애물을 가지고 있다. 외부 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포의 사용은 목적한 단백질의 최종 제형 속의 이의 존재가 역 독성 또는 면역학적 반응을 초래할 수 있는 숙주 세포 단백질을 오염하는 것의 제거와 같은 시도을 부가시켜 왔다. 재조합체 단백질이 세포내에서 제조되는 경우, 정제 공정의 제1 단계는 세포의 분해 또는 파괴를 포함하며, 이는 세포 성분의 균질물내로의 방출을 포함하고, 또한 소세포 단편을 생산한다. 재조합체 단백질이 세포로부터 분비되는 경우, 세포의 천연적 사멸 및 세포내 숙주 세포 단백질의 상층액내로의 방출은 또한 독성 및 면역원성 오염을 유발할 수 있다. 이들 오염물질을 제거하기 위하여, 많은 상이한 정제 단계가 전형적으로 요구된다. 친화성 크로마토그래피는 고 순도 수준을 달성하기위해 일반적으로 채택된다. 당해 하부스트림(downstream) 과정은 일반적으로 대규모 상업적 생산을 위해 노동 및 자원 집약적이며 비용이 많이 든다.
재조합체 콜라겐-유사 단백질의 대규모 생산은 이의 유아기에 여전히 존재한다. 공정의 확장성, 생산 비용, 추출 방법의 복잡성, GMP 요구도와의 순응성, 조절 요건의 순응성, 숙주 세포 단백질 오염의 제거, 정제 방법의 복잡성, 숙주 세포의 적합성을 포함하는 대규모 생산에 촛점을 맞추어야 하는 특정의 챌린지가 존재한다. 예를 들면, 사람 세포주는 비용-효과적인, 대규모 생산에 맞지 않는 중간 수율만을 초래한다.
따라서, 재조합적으로 생산된 콜라겐의 정제 방법에 대한 요구가 존재하며, 여기서 이러한 방법은 비용 효과적이고 다양한 적용을 위한 고 수율 및 충분한 순도로 콜라겐을 생산한다.
기재내용의 요약
본 발명자들은 세균, 효모 또는 식물 세포와 같은, 비-동물 숙주 세포에 의해 발현된 재조합체 삼중-나선 단백질을 정제하는 방법을 개발하였다. 당해 방법은 정제 방법 전체에서 가용성으로 남는 가용성의 삼중-나선 단백질(들)의 정제를 제공한다. 또한, 당해 방법은 삼중-나선 단백질(들)의 변성, 분해 또는 가수분해를 초래하지 않는다.
본 기재내용의 방법은 안정하고, 오염 단백질(이는 삼중 나선 단백질의 안정성을 절충할 수 있다)이 없으며 공정 단계가 최소화되므로 고 수율로 생산될 수 있는 가용화된 삼중-나선 단백질(예를 들면, 콜라겐)의 생산을 초래하는 재조합체 삼중-나선 단백질(어떠한 공급원으로부터도)을 제공한다. 유리하게는, 당해 방법은 산성 조건 하에서 안정하고 다양한 상이한 적용에 대해 충분한 순도로 생산되는 삼중-나선 단백질(예를 들면, 콜라겐)의 정제에 비용 효과적인 시도를 제공한다.
따라서, 본 기재내용은 비-포유동물 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물 속에 함유된 재조합적으로 발현된 삼중-나선 단백질의 정제 방법을 제공하며, 당해 방법은:
(i) 삼중-나선 단백질로부터의 숙주 세포 물질을 산성 조건 하에 및 삼중-나선 단백질이 열적으로 안정하게 남아있는 온도에서 침전시키는 단계에 이어서;
(ii) 침전된 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물 속에 존재하는 숙주 세포 물질을 프로테아제를 첨가하여 분해시키는 단계(여기서, 삼중-나선 단백질은 프로테아제에 대해 내성이다); 및
(iil) 정제된 삼중-나선 단백질을 수집하는 단계를 포함하고;
임의로 불용성 숙주 세포 물질로부터 삼중-나선 단백질을 침전시키는 단계와 물리적으로 분리하는 분해 단계 사이에 추가의 분리 단계를 추가로 포함하며;
여기서 상기 삼중-나선 단백질은 적어도 단계 (i) 및 (ii) 전체에서 가용성으로 남는다.
하나의 예에서, 삼중-나선 단백질은 단계 (i) 내지 (iii) 전체에서 가용성으로 남는다
하나의 예에서, 숙주 세포 물질의 분해 단계는 산 프로테아제를 사용하여 수행한다.
하나의 예에서, 당해 방법은 숙주 세포를 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포이다. 본 기재내용의 숙주 세포를 배양하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 친숙할 것이며 본원의 어디에서든 기재되어 있다.
하나의 예에서, 산 조건은, pH가 7 미만, 바람직하게는 pH가 약 6 미만인 배양 추출물 또는 균질물의 pH를 말한다.
본 기재내용의 방법에 따라서, 삼중-나선 단백질은 유리하게는 열적으로 안정하게 남는다. 당해 분야의 숙련가는 삼중-나선 단백질의 열 안전성을 유지하는데 보조하는 배양 추출물 또는 균질물에 첨가될 수 있는 특정의 제제 또는 첨가물을 인지할 것이다. 예를 들면, NaCl과 같은 동결억제제를 첨가하거나, 예를 들면, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체, 메틸셀룰로즈, 아가로즈, 덱스트린, 하이드록시에틸 전분, 트리메틸아민 M-옥사이드(TMAO) 등과 같은 안정성을 제공하는 다른 첨가제를 가할 수 있다. 하나의 예에서, 삼중-나선 단백질의 열 안정성은, 침전 단계를 삼중-나선 단백질의 적어도 10℃ 이하의 Tm의 온도에서의 산성 침전 조건 하에 유지된다. 삼중-나선 단백질의 열 안정성을 측정하는 방법은 예를 들면, 제US 8,280,710호에 기재되어 있다.
본 기재내용의 방법은 숙주 세포 단백질 및/또는 숙주 세포 DNA와 같은 침전된 숙주 세포 물질로부터 삼중-나선 단백질을 분리하기 위한 임의의 중간 분리 단계를 포함한다. 어떠한 분리 공정(들)도 당해 임의의 단계에서 사용하여 이들 물질 중 하나 또는 둘 다를 제거할 수 있다. 이러한 공정은 바람직하게는 조 침전이거나 원심분리, 여과, 교차 유동 여과, 또는 침강과 같은 조악한 분리 또는 농축 기술이다.
다른 구현예에서, 추가의 pH 조절은 필수적으로 본 발명의 방법에 따른 소화 단계 전에 또는 동시에 이루어질 수 있다. 분해 단계에서 사용된 프로테아제에 따라서, pH는 상향 또는 하향으로 조절될 수 있으며 단 삼중-나선 단백질은 용액속에 유지되어야 한다. 예를 들어, 펩신이 프로테아제로서 사용되는 경우, 이는 펩신 첨가 전에 배양 추출물 또는 균질물의 pH를 강하시키는 것이 필수적일 수 있다. 이러한 조절은 당해 분야의 숙련가의 기술내에 있다.
삼중-나선 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합체 작제물로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포가 삼중-나선 단백질의 발현을 유발하기에 적합한 조건하에서 배양된다는 것은 당해 분야의 숙련가가 잘 인식할 것이다. 일부 예에서, 삼중-나선 단백질은 세포 내에서 생산될 것이며, 이 경우 세포로부터 삼중-나선 단백질을 추출하는 것이 필수적일 것이다. 추출 방법은 숙주 세포를 포획하는 것이 요구될 것이다. 추출은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기계적 또는 화학적(예를 들면, 효소적) 수단으로 달성할 수 있다. 기계적 추출 공정의 예는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 초음파 처리, 미세유동화, 프렌치 프레스(French Press) 또는 유사 장치 속에서 분해, 삼투압 쇼크, 및 유리, 세라믹 또는 강철 비드를 사용한 격렬한 교반/분쇄에 의한 파괴. 달리는, 또는 기계적 추출과 함께, 효소적 추출을 또한 사용할 수 있다. 효소 추출에 적합한 예는 라이소자임, 아이소트타핀, 자이몰라제, 셀룰로즈, 무타놀라이신, 글루카나제, 프로테아제, 만노즈 등을 포함한다.
일부 예에서, 삼중-나선 단백질은 숙주 세포(즉, 일부 효모 시스템의 경우에서와 같이 세포외적으로 생산된)로부터 분비된다. 이들 조건 하에서, 추출이 필수적이지는 않지만, 세포 배양 추출물을 농축하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 균질물 또는 여과물을 생성함으로써 회수된 가용성의 삼중-나선 단백질을 포함하는 용액을 수득할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 교차-유동 여과에 의해 삼중-나선 단백질과 함께 농축된다.
따라서, 본 기재내용의 방법은 삼중-나선 단백질을 함유하는 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물을 생산하는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
세포 배양 추출물 또는 균질물을 함유하는 재조합체 삼중-나선 단백질로부터의 세포 오염물 및 부스러기는 본 기재내용의 방법에 따른 산성 침전 단계에 의해 제거된다. 본 발명자들은, 용액의 pH를 삼중-나선 단백질이 열적으로 안정한 온도에서 산성 조건으로 조절함으로써, 재조합체 삼중-나선 단백질이 변성되지 않고 용액 속에 존재하면서 많은 오염(즉, 비-가용성) 물질이 침전됨을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 이러한 제1의 정제 단계에서 삼중-나선 단백질의 pH 안정성의 장점을 취한다.
바람직하게는, 온도는 방법 전체에서 일정하다. 하나의 예에서, 온도는 실온(즉, 약 18℃ 내지 24℃)에서 유지된다.
한 예에서, 온도는 산성 침전 단계 동안에 재조합체 삼중-나선 단백질의 적어도 10℃ 이상 내지 용융 온도(Tm) 이하이다.
재조합체 삼중-나선 단백질을 함유하는 용액의 산성화는 강산 또는 약산을 포함하는, 어떠한 적합한 산에 의해 달성될 수 있다. 단일 산을 사용하거나 달리는 상이한 산의 조합을 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 다른 산이 또한 적합할 수 있지만, 본 방법에 따른 적합한 산의 예는 염산, 황산, 아세트산, 포름산 또는 락트산을 포함한다. 따라서, 산성 용액의 pH에서 재조합체 단백질의 Tm에 따라 산화가 일어나는 온도는 4℃ 내지 30℃에서 변할 수 있다.
다양한 세균 종에 대한 삼중 나선의 콜라겐-유사(CL) 도메인의 용융 온도의 예는 하기 표에 제공된다.
콜라겐-유사(CL) 도메인의 용융 온도
종 도메인 Tm(중성 pH) ℃ Tm(산성 pH) ℃
클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens) CL 38.8 37.2
솔리박터 우시타투스(Solibacter usitatus) CL 38.5 27.0
메틸로박테리움 아종 4-46 CL 35.0 28.3
로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) CL 37.0 32.0
스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(Scl2) CL 35.9 25.7
스트렙토코쿠스 피오게네스(Scl2) CL-CL 36.5
산성 침전 단계 동안에, 재조합체 삼중-나선 단백질을 함유하는 세포 배양 추출물 또는 균질물의 조절된 pH는 숙주 세포 및 삼중-나선 단백질 서열에 의존할 것이다. 한 예에서, 삼중-나선 단백질을 포함하는 세포 배양 추출물 또는 균질물은 pH 7 미만으로 조절된다. 다른 예에서, 세균 숙주 세포의 경우, 2 내지 4의 pH가 바람직하고 효모 숙주 세포의 경우 4 내지 6의 pH가 바람직하다. 식물 숙주세포에 대한 추가의 예에서, 2 내지 4.5의 pH가 바람직하다.
특정의 예에서, 재조합체 삼중-나선 단백질의 식물 세포 발현을 위해, 산 침전 단계는 2개의 상이한 pH 값에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 추출물 중 대부분의 풍부한 식물 단백질은 리불로즈 비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제(Rubisco)이며, 이는 4.5 주위의 pH에서 가장 잘 침전된다. 그러나, 당해 pH는 전형적으로 모든 오염시키는 식물 단백질을 제거하는데 충분하지 않으며, 이 경우 이는 pH 2.5의 추가의 침전을 수반하는 것이 필수적일 수 있다.
따라서, 산성 침전 단계는 성공적인 오염 단백질이 침전될 추출물 속에 존재하도록 하는 ph 값의 조절이 필요할 수 있다. 바람직하게는, 침전된 단백질은 후속적인 pH 조절 사이에서 상술한 방법에 따라 제거될 것이다.
본 기재내용의 방법에 따라서, 분해 단계는 산 침전 단계를 수반한다. 본 발명자들은, 분해 단계가 추출 공정(여기서 배양 추출물 또는 균질물이 생산된다)에서 생성되거나 침전 단계에서 삼중-나선 단백질의 회수 동안 제거되지 않았던 숙주 세포 오염물질을 제거함을 알았다. 전형적으로, 분해 단계는 효소 분해하는 경향이 있는 오염시키는 숙주 세포 단백질, 예를 들면, 막 단백질의 제거를 초래하지 않을 것이다. 추가의 예에서, 분해 단계는 프로테아제, 바람직하게는 산 프로테아제를 사용하여 수행한다. 본 기재내용의 방법에 따라 사용하기 위한 산 프로테아제의 적합한 예는 펩신, 파파인, 브로멜라인, 피신 또는 악티니딘과 같은 파파인-유사 효소, 또는 아스퍼길러스 사이토이(Aspergillus saitoi) 산 프로테아제를 포함한다.
트립신 및 키모트립신과 같은, 비-산 프로테아제를 또한 본 기재내용의 분해 단계에서 사용할 수 있다. 사용된 프로테아제에 따라서, pH를 산성 조건 미만(예를 들면, 파파인과 같은 프로테아제)으로 조절하는 것이 필수적일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 전략에 익숙할 것이다.
일부 예에서, 프로테아제 분해는 배양 추출물 또는 균질물의 pH를 중성 pH로 조절함으로써 종결시킬 수 있다.
당해 방법은 단백질분해적으로 안정한 삼중-나선 단백질의 정제를 초래하는 것으로 인식될 것이다. 삼중 나선 단백질은 또한 단백질분해적으로 안정한 추가의 비-나선 단백질 서열 및/또는 천연적으로 또는 설계에 의해 숙주 단백질의 제거를 위해 선택된 효소에 대해 단백질분해적으로 안정한 비-삼중 나선 서열 삽입체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 방법은 또한 단백질분해적으로 불안정한 단백질보다 단백질분해적으로 안정한 단백질을 선택적으로 정제하는 장점을 지님으로써 비 삼중-나선 단백질보다 삼중-나선 단백질을 선택적으로 정제하는 장점을 갖는다.
프로테아제 분해물은, 이들이 완전한 가용성의 재조합체 삼중-나선 단백질보다 훨씬 더 적은 분자량을 지니므로 많은 오염시키는 단백질을 투석 또는 침전에 의해 제거될 수 있는 펩타이드로 분해한다. 수득되는 정제된 재조합체 삼중-나선 단백질은 이후에 수집된다. 이들 공정 둘 다는 재조합체 삼중-나선 단백질을 농축시키는 추가의 장점을 갖는다. 재조합체 삼중-나선 단백질의 침전은 황산암모늄의 첨가에 의해, pH의 조절에 의해 및/또는 온도의 조절에 의해, 또는 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)의 사용에 의해 달성될 수 있다.
다른 예에서, 오염시키는 숙주 세포 핵산을 또한 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수집된 삼중-나선 단백질로부터 제거할 수 있다.
삼중 나선 단백질의 최종 용도에 따라서, 수집된 삼중-나선 단백질의 마무리 단계(polishing step)를 사용하여 숙주 오염물질이 제거되면 재조합체 삼중-나선 단백질을 추가의 농축시키고/시키거나 정제할 수 있다. 크로마토그래피는 단백질 용액을 마루리하는데 일반적으로 사용된 한가지 이러한 기술이다. 채택될 수 있는 크로마토그래피 공정의 예는 이온 교환 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피, 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 재조합체 삼중-나선 단백질을 중성 중합체로 침전시키는 경우, 침전물은 염 속에서 낮으므로 추가의 마무리 정제가 요구되는 경우 이온 교환 크로마토그래피에 대해 직접 사용될 수 있다.
상기 방법은 정제된 삼중-나선 단백질의 생성을 초래하는 것으로 인지될 것이다. 하나의 예에서, 정제된 삼중-나선 단백질은 안정화되어 있다. 다른 예에서, 삼중-나선 단백질은 글루타르알데하이드에 의해 안정화되지만, 당해 분야에 공지된 다른 안정화제도 사용될 수 있다.
재조합체 삼중-나선 단백질을 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 세균, 효모 또는 식물 세포를 포함한다. 이들 세포에서 삼중-나선 단백질의 재조합 생산 방법은 당해 분야의 숙련가에게 친숙할 것이다.
세균 숙주 세포는 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 엔테로박터(Enterobacter), 아조토박터(Azotobacter), 에르위니아(Erwinia), 슈모모나스(Pseudomonas), 글렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 및 파라코쿠스(Paracoccus)로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 예에서, 세균 숙주는 에스케리키아 콜라이(Escherchia coli)이다. 적합한 이. 콜라이(E. coli) 숙주는 이. 콜라이 BL21 균주(공급원: Life Sciences), 이. 콜라이 W31 10(ATCC 27,325), 이. 콜라이 294(ATCC 31,446), 및 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537)를 포함한다.
효모 숙주 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 슈완니오리니세스 옥클덴티스(Schwanniornyces occldentis). 스키조 사카로마이세스 폼베(Schizo saccharomyces pombe), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 및 야로위아 리포립티카(Yarrowia lipolytica) 로부터 선택된다.
식물 숙주 세포는 담배, 옥수수, 밀, 귀리, 클로렐리아 불가리스(Chlorelia vulgaris)와 같은 조류와 같은 하등 식물로부터 선택될 수 있다.
본 기재내용의 방법에 따른 재조합체 삼중-나선 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물은 본원에 정의된 바와 같은 반복 모티프(Gly-X-Y)n 를 암호화하는 서열을 포함하는 것이다. 발현 작제물에 의해 암호화된 삼중-나선 단백질은 바람직하게는 포유동물 체온(즉, 35 내지 40℃)에서 열 안정성이거나 변형에 의한 정제 후 안정될 수 있다. n의 값은 5 내지 600 또는 1 내지 350일 수 있으며 (Gly-X-Y)는 세균 또는 동물(포유동물) 또는 곤충 기원한 삼중-나선 형성 도메인을 나타내며 X 및 Y는 독립적으로 각각의 반복 단위에 대해 어떠한 천연 또는 비천연의 이미노 또는 아미노산이다. 한가지 예에서, X 또는 Y는 하이드록시 프롤린이 아니다. 그러나, 일부 예에서 삼중-나선 도메인은 하이드록시프롤린을 포함할 수 있다. 삽입체 또는 링커 서열은 하나 이상의 CL 도메인을 포함하는 작제물 내에, 또는 개개의 CL 도메인내에 각각의 삼중-나선 형성 도메인(또한 본원에서 "콜라겐-유사(CL) 형성 도메인"으로 언급됨) 사이에 위치할 수 있다. 삽입체는 약 1 내지 50개의 이미노 또는 아미노 산으로 구성된다. 바람직하게는, 삽입체는 효소/프로테아제 불안정성이 아니다.
하나의 예에서, 삼중-나선 단백질은 콜라겐이다.
재조합체 삼중-나선 서열은, 세균, 효모, 식물, 곤충 또는 누에로부터에 상관없이 및 하이드록실화되거나 비-하이드록실화됨에 상관없이 어떠한 삼중-나선 또는 삼중-나선 함유 단백질로부터도 기원할 수 있다.
삼중-나선 단백질이 하이드록실화된 형태인 경우, 프롤린 잔기를 필요로 하는 추가의 단계를 본 방법을 취하기 전에 사용할 수 있다. 이러한 전략은 당해 분야의 숙련가에게 친숙할 것이다.
재조합체 삼중-나선 유사 단백질을 암호화하고 본 발명의 적절한 작제물을 설계하는데 사용될 수 있는 서열의 예는:
(i) 병원성 또는 비-병원성 세균 유기체로부터의 서열, 여기서, 예를 들면, 삼중-나선 서열은 이의 천연 상태에서 또는 화학적 가교-결합 에 의한 안정화 후 바람직한 열 안전성을 나타내는 하나 이상의 에스. 피로게네스(S. pyogenes), 메틸로박테리움 아종(Methylobacterium sp .) 4-46, 솔리박터 우시타투스(Solibacter usitatus), 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi) SclC, 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스리디움 페르프린겐스(Closridium perfringens), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) A로부터 기원한 CL 도메인을 포함할 수 있다. 서열은 또한 제US 6,953,839호에 정의된 삼중-나선 콜라겐-유사 서열을 포함할 수 있다.
(ii) 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 악티노박테리아(Actinobacteria)[예를 들면, 마이코박테리움 기트붐(Mycobacterium gitvum), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 반바알레니이(Mycobacterium vanbaalenii), 노카르디오이데스 종(Nocardioides species), 루브로박터 크실라노필루스(Rubrobacter xylanophilus), 살리니스포라 아레니콜라(Salinispora arenicola), 살리니스포라 트로피카(Salinispora tropica), 및 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species)], 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria)[예를 들면, 아나플라스마 종(Anaplasma species), 메트 옐로박테리움 라디오톨러란스(Met ylobacterium radiotolerans), 니트로박터 위니그라드스키이(Nitrobacter winogradskyi), 파라코쿠스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans), 리조비움 레구 이노사룸(Rhizobium leguinosarum), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 살루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 스핑고모나스 위티클리(Sphingomonas wittichli), 및 볼바키아 종(Wolbachia species)], 박테로이데스(Bacteroidetes)[예를 들면, 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)], 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)[예를 들면, 아조아르쿠스 종(Azoarcus species), 부르콜데리아 암비타리아(Burkholderia ambitaria), 부르콜데리아 세노셉파시아(Burkholderia cenocepacia), 부르콜데리아 파이마툼(Burkholderia phymatum), 부르콜데리아 베트나미엔시스(Burkholderia vietnamiensis), 데클로로모나스 아로마티카(Dechloromonas aromatica), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 랄스토니아 메탈리두란스(Ralstonia metallidurans), 랄스토니아 피케티이(Ralstonia pickettii), 및 로도페락스 테리레두센스(Rhodoferax terrireducens)], 시아노박테리아(Cyanobacteria)[예를 들면, 시아노테세 종(Cyanothece species), 시네코시스티스 종(Synechocystis species), 트리코데스뮴 에리트라에움(Trichodesmium erythraeum)], 데이노코쿠스(Deinococcus)[예를 들면, 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)], 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria)[예를 들면, 아나에로믹소박터 데할로게난스(Anaeromyxobacter dehalogenans)], 엡실론프로테오박테리아(Epsilonproteobacteria)[예를 들면, 캄필로박터 쿠르부스(Campylobacter curvus)], 피르미쿠테스(Firmicutes)[예를 들면, 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 파이토테르멘탄스(Clostridium phytotermentans), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 게오바실러스 카우스토필루스(Geobacillus kaustophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 라이시노바실러스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus), 스타필로코쿠스 해몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)], 및 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)[예를 들면, 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 엔테로박터 종(Enterobacter species), 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 포토라브두스 루미네스켄스(Photorhabdus luminescens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 피크로박터 크리오할로렌티스(Psychrobacter cryohalolentis), 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 프로테아마쿨란스(Serratia proteamaculans), 세와넬라 아마조넨시스(Shewanella amazonensis), 세와넬라 발티카(Shewanella baltica), 세와넬라 프리기디마리나(Shewanella frigidimarina), 세와넬라 할리팍센시스(Shewanella halifaxensis), 세와넬라 이오이히카(Shewanella loihica), 세와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis), 세와넬라 페알레아나(Shewanella pealeana), 세와넬라 푸트렐라시엔스(Shewanella putrelaciens), 세와넬라 세디미니스(Shewanella sediminis), 세와넬라 우디(Shewanella woody), 시겔라 보이디이(Shigella boydii), 시겔라 다이센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉네리(Shigella flexneri), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 및 비브리오 하르베이이(Vibrio harveyi)]로부터 선택되나 이에 제한되지 않는 유기체로부터 분리된 하나 이상의 DNA 서열;
(iii) C1q, 아세틸콜린 에스테라제, 대식구 스캐빈저 수용체(macrophage scavenger receptor), 폐 표면 단백질, 만노즈 결합 단백질, 동면 단백질, 미틸루스 바이수스(Mytilus byssus), 엑토디스플라신 A 또는 글리오메딘을 암호화하는 DNA 서열;
(iv) 하이메노프테란(Hymenopteran), 네마티니(Nematini)로부터: 헤이니크로아(Heinichroa) 내, 프리스티포라(Pristiphora), 파키네말루스(Pachynemalus), 피코네마(Pikonema) 및 네마투스 종(Nematus species)(아과 네마티나에(subfamily Nematinae)), 토모스테투스(Tomostethus) 및 테티다 종(Tethida species)(아과 브텐노캄피나에(subfamily Btennocampinae)) 기원한 잎벌 실크 단백질을 암호화하는 서열; 및
(v) 하나 이상의 콜라겐 제I형, 제II형, 제III형, 제IV형, 제V형, 제VI형, 제VII형, 제VIII형, 제IX형, 제X형, 제XI형, 제XII형, 제XIII형, 제XIV형, 제XV형, 제XVI형, 제XVII형, 제XVIII형, 제XIX형, 제XX형, 제XXI형, 제XXII형, 제XXIII형, 제XIV형, 제XXV형, 제XXVI형, 제XXVII형, 제XXVIII형을 포함하는 포유동물 콜라겐을 암호화하는 서열을 포함한다.
삽입체 서열은 재조합체 작제물 속에서 가공되어 삼중-나선 단백질의 탄성을 증진시키거나 천연의 결합 도메인 또는 생물학적 절단 서열로서 또한 제공할 수 있다. 사용하기에 적합한 작제물의 예는 제WO 2010/091251호에 개재되어 있다.
하나의 예에서, 발현된 삼중-나선 단백질 및/또는 이의 삼중-나선 도메인은 단독삼량체이며 여기서 동일한 쇄가 조립되어 삼중-나선을 형성한다.
추가의 예에서, 발현된 삼중-나선 단백질 및/또는 이의 삼중-나선 도메인은 예를 들면, 포유동물 제I 콜라겐에서 발견된 바와 같은, 삼중-나선을 형성한다.
추가의 예에서, 발현된 삼중-나선 단백질은 링커 서열을 통해 연결된 적어도 2개의 삼중-나선 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들면, 단백질을 암호화하는 키메라 작제물은 링커 서열에 의해 분리될 수 있는, 상이한 세균 콜라겐의 링커 또는 삼중-나선 형성 도메인에 의해 분리될 수 있는 포유동물 및/또는 세균 삼중-나선 서열의 2개 이상의 삼중 나선 형성 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 키메라는, 발현되는 경우 단백질 쇄의 생산을 초래하며, 이는 삼중-나선을 형성할 수 있고, 예를 들면 삼중 나선을 형성할 수 있는 단일 쇄내에서 함께 결합된 2개의 세균 기원한 쇄 분절 또는 1개의 세균 기원한 쇄 분절 및 하나의 포유동물 기원한 쇄 분절로 이루어질 수 있다.
각각의 삼중-나선 도메인 서열 반복체는 앞서 언급된 서열의 반복체, 단편, 변이체 또는 조합물을 포함할 수 있다.
이에 한정되지 않지만, 세균 발현 벡터는 콜드 쇽 벡터(cold shock vector)일 수 있으며 재조합체 삼중-나선 단백질은 37℃ 이하의 온도 및 특정 에에서는, 약 15 내지 23℃의 온도에서 미생물(예를 들면, 이. 콜라이) 속에서 발현될 수 있다. 추가의 예에서, 발현 벡터는 pET 벡터(제조원: Novagen)이다.
다른 예에서, 효모 발현 벡터가 선택된다. 효모 발현 벡터의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-SI, pPIC9, pPICZ, pA0815, pBlADE, pBLARG, YepFlagl, pAMH110 또는 pBLURA로부터 선택될 수 있다.
다른 예에서, 발현 벡터는 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, pBI121 , pCAmbia2301, pEAQ-HT-DEST, 또는 PVX 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 개재내용은 또한 본원에 기술된 방법으로 정제된 삼중-나선 단백질을 제공한다.
본 개재내용은 또한 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 수득된 정제된 삼중-나선 단백질을 제공한다.
하나의 예에서, 삼중-나선 단백질은 순도가 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97% 또는 약 98%이다.
본 개재내용의 방법에 따라 정제된 삼중-나선 단백질은, 필요할 경우 다양한 적용을 위해 유용할 수 있는 젤라틴으로 전환될 수 있다. 삼중-나선 단백질을 젤라틴으로 전환하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이며 전형적으로, 예를 들면, 열적 또는 화학적 변성 공정에 의해 단백질을 변성시킴을 포함한다. 따라서, 본 개재내용은 또한 열적 또는 화학적 변성에 의해 젤라틴으로 전환된 본 개재내용에 따라 정제된 삼중-나선 단백질을 포함한다.
도면의 설명
도 1은 본 개재내용의 하나의 구현예에 따른 정제 도식의 흐름도를 나타낸다.
도 2는 산 추출 및 pH의 조절 및 16시간 동안 평형화 후 숙주 단백질의 가용성을 나타낸다. (A) 세균, 이. 콜라이, (B) 효모, 사카로마이세스 세레비지아에, (C) 식물, 스피나키아 올레라세아(Spinacia oleracea).
도 3은 산 침전 및 이후에 프로테아제 분해 후 삼중-나선 단백질의 최종 정제를 나타내는 SDS PAGE를 나타낸다; S= 단백질 표준; F= 발효 추출 및 P= CL 및 CL-CL의 침전 및 단백질분해 후 생성물을 제공하는, 에스. 피로게네스 V-CL 및 V-CL-CL의 초기 DNA 작제물에 대한 pH 2.0 침전 및 펩신 분해 후, 생성물.
도 4는 (A) 안정화된 쉬이트(상부) 및 스폰지(하부) (B) 3시간째에 세포 부착, 및 (C) 16시간 후 세포 생존능을 나타내는, 에스. 피로게네스 콜라겐 스폰지 및 세포 평가를 나타낸다.
서열 목록에 대한 주요 사항
서열 번호 1 : 트롬빈/트립신 절단 부위
서열 번호 2: 에스. 피로게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl 단편의 DNA 서열
서열 번호 3: 에스. 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2 단편의 단백질 서열
서열 번호 4: 삽입체 서열
서열 번호 5: 전방 프라이머(forward primer)
서열 번호 6: 역방 프라이머(reverse primer)
서열 번호 7: 에스. 피오게네스로부터의 콜라겐 Scl2로부터의 CL 도메인의 세균 콜라겐 이량체를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 8: 에스. 피오게네스로부터의 콜라겐 Scl2로부터의 CL 도메인의 세균 콜라겐 이량체를 암호화하는 단백질 서열
서열 번호 9: 헤파린 결합 서열
서열 번호 10: 전방 프라이머
서열 번호 11 : 역방 프라이머
서열 번호 12: 전방 프라이머
서열 번호 13: 역방 프라이머
서열 번호 14: 전방 프라이머
서열 번호 15: 역방 프라이머
서열 번호 16: 헤파린 결합을 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2를 암호화하는 DNA 서열.
서열 번호 17: 헤파린 결합을 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2를 암호화하는 단백질 서열.
서열 번호 18: 인테그린 결합 서열
서열 번호 19: 전방 프라이머
서열 번호 20: 역방 프라이머
서열 번호 21 : 전방 프라이머
서열 번호 22: 역방 프라이머
서열 번호 23: 인테그린 결합을 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 24: 인테그린 결합을 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2를 암호화하는 단백질 서열
서열 번호 25: 헤파린 및 인테그린 결합 둘 다를 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 26: 헤파린 및 인테그린 결합 둘 다를 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2를 암호화하는 단백질 서열
서열 번호 27: 로도프슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)로부터의 V-도메인을 사용하여 솔리박터 우시타투스(Solibacter usitatus)로부터의 세균 콜라겐을 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 28: 로도프슈도모나스 팔루스트리스로부터의 V-도메인을 사용하여 솔리박터 우시타투스로부터의 세균 콜라겐을 암호화하는 단백질 서열
서열 번호 29: 잎벌 네마투스 올리고스필루스(Nematus oligospilus)로부터의 곤충 코라겐, 유전자 A를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 30: 잎벌 네마투스 올리고스필루스로부터의 곤충 콜라겐, 유전자 A를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 31: 프라이머
서열 번호 32: 프라이머
서열 번호 33: 프라이머
서열 번호 34: 프라이머
서열 번호 35: 프라이머
서열 번호 36: 프라이머
서열 번호 37: 사람 제III형 콜라겐의 단편의 3개의 반복체를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 38: 사람 제III형 콜라겐의 단편의 3개이 반복체를 암호화하는 단백질 서열
서열 번호 39: 사람 제I형 알파 I 쇄 CB3 단편을 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 40: 사람 제I형 알파 I 쇄 CB3 단편을 암호화하는 단백질 서열
서열 번호 41 : 사람 콜라겐 제I 및 제III형 쇄로부터의 분절로부터 제조된 키메라를 암호화하는 DNA 서열
서열 번호 42: 상이한 세균 콜라겐 쇄의 키메라를 암호화하는 DNA 서열, 여기서 2개의 상이한 콜라겐-유사 성분은 메틸로박테리움 아종(Methylobacterium sp.) 및 에스. 우시타투스 서열 번호 44로부터 존재하고; 상이한 세균 콜라겐 쇄의 키메라를 암호화하는 DNA 서열, 여기서 2개의 상이한 콜라겐-유사 성분은 케틸로박테리움 아종 및 에스. 우시타투스로부터 존재한다.
일반적인 기술 및 정의
달리 구체적으로 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야(예를 들면, 세포 배양물, 분자 유전학, 재조합 생물학, 실크 기술, 면역학, 단백질 화학, 및 생화학)의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에서 사용된 재조합체 단백질, 세포 배양물, 및 면역학적 기술은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 표준 과정이다. 이러한 기술은 문헌[참조: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (19S4), J. Sarnbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brawn (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and 8.D, Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), 및 P.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Oreene Pub. Associates and Wiley-Intersclence (1988, Including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan ei al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지 존재하는 모든 업데이트 포함)]과 같은 공급원에서 문헌 전체에 기술되고 설명되어 있다.
본 명세서 전체에서, 달리 구체적으로 기술하거나 달리 내용이 요구하지 않는 한, 문제의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹은 하나 및 다수(즉, 하나 이상)의 이들 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹을 포함하는 것으로 고려되어야 한다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서, 단수형("a", "an" 및 "the")은 내용에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 다수 국면을 포함한다. 예를 들어, 단수("a")에 대한 참조는 단일 및 2개 이상을 포함하며; 단수("an")에 대한 참조는 단일 및 2개 이상을 포함하고; 단수("the")에 대한 참조는 단일 및 2개 이상 등을 포함한다.
본원에 기술된 본 개재내용의 각각의 예는 달리 구체적으로 기술하지 않는 한 각각의 및 모든 다른 예에 대해 약간 수정하여 적용될 것이다.
당해 분야의 숙련가는, 본원의 개재내용이 구체적으로 기술된 것 외의 변화 및 변형에 민감함을 인식할 것이다. 본 개재내용은 모든 이러한 변화 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개재내용은 또한 본 명세서에 언급되거나 나타낸 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 총괄적으로, 및 상기 단계들 또는 특징들의 어떠한 및 모든 조합 또는 어떠한 2개 이상을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
본 개재내용은 단지 예시의 목적으로 의도된, 본원에 기술된 특수한 실시예에 의해 영역에서 한정되어야 하는 것이 아니다. 기능적으로 등가인 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 명확히 본 개재내용의 영역내에 있다.
용어 "및/또는", 예를 들면, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해될 것이며 의미 둘 다 또는 의미 하나를 분명하게 뒷받침하기 위해 제공된 것으로 고려될 것이다. 또한, 두번째의 마지막과 마지막 특징 사이의 어구 "및/또는"을 포함하는 목록 또는 특징은, 어떠한 하나 이상의 나열된 특징이 어떠한 조합으로도 존재할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전체에서 단어 "포함하다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 기술된 성분, 정수 또는 단계, 또는 성분들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 내포하지지만 다른 어떠한 성분, 정수 또는 단계, 또는 성분들, 정수들 또는 단게들의 그룹을 배제하지 않음이 이해되어야 한다.
용어 "비-포유동물 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물내에 함유된"은 삼중-나선 단백질 서열을 암호화하는 작제물로 형질감염되거나 형질전환되어진 본 개재내용에 따른 숙주 세포로부터 제조된 세포 배양 추출물 또는 균질물을 언급하는 것으로 이해된다.
용어 "식물"은 전체 식물, 야채 구조물(예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리), 꼰 기관/구조물, 종자(배아, 배유, 및 종피 포함), 식물 조직(예를 들면, 혈관 조직, 분쇄된 조닉 등), 세포 및 이들의 후대세포를 포함한다.
"열적으로 안정한"에 의해 이는 삼중-나선 단백질(또는 단백질의 삼중-나선 부분)이 제공된 온도에서 이의 3차원 구조물을 유지하는 정도를 의미한다. 삼중-나선 구조물이 탈안정화되는 내성의 정도는 본 발명의 방법에 따라 허용되지만, 삼중-나선 단백질의 적어도 70%가 3차원 삼중 나선 형태 속에 유지되는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "삼중 나선 단백질"은 적어도 하나의 영역(본원에서 내용에 따라 "삼중-나선 도메인" 또는 "콜라겐-유사 도메인"으로 언급됨)을 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 동종삼량체, 키메라 또는 이종삼량체 단백질을 언급하는 것으로 이해된다. 용어 "삼중 나선 단백질"은 또한 본원에 언급된 바와 같은 "콜라겐-유사(CL) 단백질"을 포함한다. 당해 용어는 삼중-나선 단백질의 단편(들) 및 바람직하게는 적어도 하나의 구조적 또는 기능적 특징 또는 삼중-나선 또는 콜라겐-유사 단백질, (즉, Gly X Y)n 서열을 보유하는 삼중-나선 단백질 및 이의 기능성 등가물 및 유도체의 변이체 및 단편(들)을 포함한다. 본 개재내용의 삼중-나선 단백질은 단백질분해적으로 안정한 것으로 이해된다. 삼중-나선 단백질은 또한 숙주 단백질의 제거를 위해 선택된 프로테아제 효소에 대해 단백질분해적으로 안정한 비-삼중 나선 단백질 서열 및/또는 천연적으로 또는 설계에 의해 단백질분해적으로 안정한 비-삼중-나선 삽입물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "콜라겐-유사(CL)"는 Gly-X-Y(여기서, X 및 Y는 어떠한 아미노산일 수 있다) 삼중체(triplet)를 언급한다. 본 개재내용의 실크 단백질은 용어 "콜라겐-유사" 및 천연적으로 존재하는 세균 콜라겐내에 포함된다. 본 개재내용의 콜라겐-유사 실크 단백질은 어떠한 하이드록시프롤린을 가지지 않는다. 하나의 예에서, 콜라겐-유사 실크 단백질은 적어도 약 40개, 보다 바람직하게는 적어도 약 50개의, Gly-X-Y 삼중체를 포함한다. 또한, 다른 예에서 Gly-X-Y 삼중체는 적어도 약 40%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%의 단백질의 제1의 아미노산 서열을 구성한다. 다른 예에서, 콜라겐-유사 실크 폴리펩타이드는 적합한 조건 하에서 삼중 나선 구조를 가지거나 형성할 수 있다. 또한, 재조합 삼중-나선 단백질 속에 포함된 어떠한 삽입체 또는 링커도 프로테아제에 대해 내성인 것으로 이해될 것이다.
용어 "삼중-나선 도메인" 또는 "콜라겐-유사 도메인"은 일반적인 펩타이드 식(Gly X Y)n(여기서, Gly는 글리신이고, X 및 Y는 동일하거나 상이한 아미노산을 나타낸다)을 포함하는 단백질을 말하며(이의 정의는 Gly X Y 삼중체로부터 Gly X Y 삼중체로 변할 수 있다), 여기서 n은 5 내지 600일 수 있다. 삼중-나선 도메인은 삼중 나선 단백질 구조로 폴딩되는 반복된 (Gly X Y)n 모티프에 의해 특징화된 3개의 쇄로 이루어진다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "삼중 나선 형성 도메인" 또는 "콜라겐-유사 형성 도메인"은 폴딩 또는 2개의 다른 쇄와 연합하여 삼중 나선을 형성할 수 있는, (Gly-X-Y)n(여기서, X 및 Y는 어떠한 다른 아미노산 잔기이다) 모티프를 포함하는, 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다.
용어 "단독삼량체"는 동일한 삼중 나선의 모든 3개의 쇄를 함유하는 삼중-나선 단백질 및/또는 이의 삼중-나선 도메인을 말한다.
용어 "이종삼량체성"은 삼중 나선을 형성하는 적어도 2개의 상이한 쇄를 함유하는 삼중 나선 단백질 및/또는 이의 삼중-나선 도메인을 말한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "배양물"은 이들의 성장 및 모든 후속적인 아배양을 이끄는 배지 속의 숙주 세포의 증식을 말한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "숙주 세포 배양 작제물"은, 삼중-나선 단백질이 배양 배지내로 분비된 숙주 세포 배양물을 말한다. 숙주 세포 배양 추출물은 예를 들면, 삼중-나선 단백질로 형질전환/형질감염/형질유도된 숙주 세포가 성장하는 농축된 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 완전한 숙주 세포는 본원에 기술된 바와 같은 분비된 삼중-나선 단백질로부터 제거되거나 분리될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "숙주 세포 배양 균질물"은, 삼중-나선 단백질이 숙주 세포내에서 유지되고 파괴 또는 추출 공정에 의해 방출되는 숙주 세포 배양물을 말하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 내용에서 균질물에 의해 이는, 세포가 파괴되어 숙주 세포 배양물 균질물이 파괴된 숙주 세포 및 파괴된 세포로부터 방출된 삼중-나선 단백질을 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "작제물"은 삼중-나선 형성 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 카세트를 말한다. 작제물은 또한 V-도메인 및 히스티딘 태그를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 발현 카세트 속에 존재하는 DNA를 발현할 수 있는 벡터에 연장된다. DNA는 이들의 발현에 영향을 미칠 수 있는 다른 서열, 예를 들면, 프로모터 서열과 기능적으로 고나련된다. 일반적으로, 재조합체 DNA 기술에 일반적으로 사용된 발현 벡터는 "플라스미드"의 형태로 존재한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "단편"은 천연의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 유전 서열의 부위, 및 특히 삼중 나선 단백질의 기능성 유도체를 말한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "변이체"는 동일하거나 기능적으로 등가의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 상이한 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 지닌 서열을 말한다.
용어 "정제된"은 본원에 기술된 단백질 정제 공정에 의해, 다른 단백질(예를 들면, 특수한 숙주 세포 단백질) 또는 오염제가 실질적으로 없도록 된 삼중-나선 단백질을 의미하도록 의도된다. 상기 단백질은 다른 단백질 또는 오염제가 실질적으로 없도록 할 수 있는, 예를 들면, 적어도 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99%의 다른 단백질 또는 오염제가 없도록 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 개재내용의 방법은 비-포유동물 숙주 세포에서의 어떠한 공급원으로부터의 어떠한 재조합적으로 생산된 삼중-나선 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.
삼중-나선 서열
본 개재내용의 방법에서 유용한 재조합체 삼중-나선 단백질 서열은 생물물질로서, 화장품 또는 식품 첨가물 제조용 물질로서 유용하다. 삼중-나선 단백질을 암호화하는 서열은 하나 이상의 삼중-나선 형성 또는 콜라겐-유사(CL) 형성 도메인으로 구성되며, 여기서 각각의 CL 도메인은 비-콜라겐-유사, 프로테아제 내성 삽입체 영역에 의해 임의로 분리된다. 삽입체 영역은 많은 사람 콜라겐 내에서 발견된 삼중 나선 구조물내 천연적 파괴를 모사하도록 채택될 수 있거나 바람직한 생물학적 기능성(예를 들면, 세포/조직 결합(예를 들면, 헤파린 또는 인테그린), 프로테아제 절단 부위 등)을 제공할 수 있다. 삽입체 영역은 재조합체 삼중-나선 서열의 개개의 CL 도메인 사이 또는 CL 도메인내에서 발생할 수 있다. 재조합체 단백질의 삼중 나선 영역의 적절한 폴딩을 보증하기 위하여, 후 해독적으로, 구형 폴딩 도메인은 바람직하게는 재조합체 작제물의 N- 또는 C-말단에서 삽입된다. 이러한 구형 폴딩 도메인은 바람직하게는 재조합체 작제물의 N- 또는 C-말단에서 삽입된다. 당해 구형 폴딩 도메인은 후속적인 프로테아제 분해 단계 동안 제거될 수 있다.
하나의 예에서, 본 개재내용의 방법에서 사용하기에 적합한 삼중 나선 서열은 병원성 또는 비-병원성 세균 유기체로부터 재조합적으로 기원할 수 있다. 예를 들면, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 세균 콜라겐-유사 단백질(Scll 또는 Scl2)은 하이드록시프롤린을 형성하기 위한 해독-후 변형에 대한 필요성없이 안정한 삼중-나선 구조를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 추가의 예에서, 장관출혈성 이. 콜라이 0157:H7 균주의 게놈 서열은 일반적인 실험실 균주 K-12로부터 부재하는 콜라겐-유사 서열을 지닌 다중 개방-판독 프레임을 나타낸다[참조: Ghosh N et al. (2012) PLoS one e37872].
재조합적으로 생산될 수 있는 천연적으로 존재하는 세균 콜라겐-유사 단백질의 대안적인 공급원은 메틸로박테리움 sp4-46, 솔리박터 우시타투스, 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi) SclC, 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 로도프세우도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) A에서 발견될 수 있다. 따라서, 본 개재내용은 이러한 공급원으로부터 수득된 서열 또는 이의 단편으로 확장된다.
다른 예에서, 삼중 나선 단백질은 각각의 삼중-나선 도메인을 분리하는 삽입체 서열을 포함하는 재조합체 단백질이며, 여기서 삽입체 서열은 약 1 내지 50개의 아미노산 또는 아미노산의 단백질분해적으로 안정한 비-콜라겐 펩타이드 서열이다. 이들 서열은 수득되는 생물물질, 화장품, 식품 첨가물 또는 다른 생성물(예를 들면, 제조용)에 유용한 일부 생물학적 기능성을 제공한다.
삼중 나선 단백질의 바람직한 생물학적 기능성은 표적화된 세포 형에 대해 삼중-나선 단백질의 결합을 촉진하거나 달리는 체내에서 분해를 위한 천연 절단 부위를 제공하는 서열로부터 기원할 수 있다. 결합 서열은 제I형 콜라겐으로부터의 인테그린 결합 서열(GERGFPGERGVE) 및 아세틸콜린 에스테라제의 콜라겐 꼬리로부터의 하나의 헤파린 결합 서열(GRPGKRGKQGQK)을 포함한다. 절단 서열은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 도메인의 계열, 예를 들면, 제I, II 및 Ml 콜라겐을 절단하는 MMP-I, MMP-2, MMP-8, MMP-13 및 P-18, 및 변성된 콜라겐을 절단하는 MMP-2 및 MMP-9내의 하나 이상의 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이러한 기능성을 달성하는 것으로 공지된 추가의 서열이 또한 본 개재내용에 의해 고려된다. 이러한 서열은 5 또는 6개의 트리펩타이드 서열이 가능하지만 이에 한정되지 않는 최적의 절단을 지닌 4, 5, 6 또는 8개의 트리펩타이드 반복 단위로 제공될 수 있다.
재조합체 기술의 사용은 하전 쌍(charge pair)에 있어서의 변화와 같은 보다 큰 안정성을 부여하는 특수한 안정한 삼중-나선 모티프 서열, 또는 단백질 변성 온도에 영향을 미치는 서열 또는 궁극적으로 이것이 의약에서 사용될 수 있는 방법에 영향을 미치는 pI의 도입을 허용한다.
기능성 도메인은 삼중-나선 형성 도메인내에 또는 성공적인 삼중-나선 형성 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 또한, 하나 이상의 기능성 도메인이 첨가될 수 있으며, 이는, 동일하거나 상이한 기능이 포함될 수 있는 경우 삼중-나선 도메인내 다수의 반복체내에, 또는 삼중-나선 도메인의 수개의 반복체를 따라 다수의 반복체를 포함할 수 있다. 유사하게, 다수의 기능성 반복체가 삼중-나선 도메인 반복체 사이에 포함될 수 있거나, 보다 많은 복합체 조합을 서열 내에 및 서열 사이에서 삽입체를 사용하여 달성될 수 있다. 이와 함께, 이들 모든 시도는 발현된 삼중-나선 단백질의 설계 및 조작을 허용하여 향상된 생물의학적 생성물을 제공할 수 있는 특이적인 생물학적 기능을 제공한다.
추가의 예에서, 키메라 삼중-나선 단백질이 또한 본 개재내용에 포함된다. 예를 들면, 2개 이상의 상이한 세균 서열 사이, 2개 이상의 동물 또는 동물 및 비-동물(예를 들면, 세균) 서열 사이의 키메라는 벡터내에서 함께 다양한 도메인 동족체로부터 기원한 특이적인 서열의 선택에 의해 용이하게 가공되어 키마레 삼중-나선 단백질의 발현을 초래할 수 있다.
본 개재내용에 의해 고려되고 발현된 재조합체일 수 있는 다른 삼중 나선 단백질은 C1q, 아세틸콜린 에스테라제, 대식구 스캐빈저 수용체, 폐 표면 단백질, 만노즈 결합 단백질, 동면 단백질, 마이틸루스 바이수스, 엑토디스플라신 A 및 글리오메딘 또는 이의 단편을 포함한다.
숙주 세포
본 개재내용에 따른 숙주 세포는 세균, 효모 및 식물 기원의 세포를 포함하는 어떠한 편리한 비-동물 세포을 포함하는 어떠한 통상의 비-동물 세포이다. 본 발명의 숙주 세포는 천연적으로 존재하는 유기체 또는 삼중-나선 또는 콜라겐-유사 단백질을 발현할 수 있는 천연적으로 존재하는 유기체 또는 돌연변이된 유기체일 수 있다. 하나의 예에서, 숙주 유기체는 삼중-나선 단백질의 생산을 위해 암호돠된 이종 DNA 서열의 생산을 위해 암호화된 이종 DNA 서열을 사용한 재조합체 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 유기체 또는 이의 후대세포이다.
삼중-나선 서열의 발현
재조합체 삼중-나선 단백질을 위한 발현 작제물은 당해 분야에 공지된 어떠한 편리한 방법에 의해서도 숙주 세포내로 도입될 수 있다.
재조합체 삼중-나선 단백질을 발현하는 방법은 문헌[참조: Molecular Cloning (Sambrook and Russell (2001)]에 기술된 것과 같이, 당해 분야에 일번적으로 공지된 표준 발현 방법을 포함한다.
삼중-나선 단백질의 생산을 위한 발현 시스템은, 예를 들면, 제US 20120116053호에 기술되어 있다.
피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 형질전환, 양성 형질전환체 선택 및 배양 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제4,837,148호; 제4,855,231호; 제4,882,279호; 제4,929,555호; 제5,122,465호; 제5,324,639호; 제5,593,859호 및 제6,472,171호에 기재되어 있다.
삼중-나선 단백질을 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 제US 20120282817호, 제EP1809751호 및 제WO 2012/117406호에 기술되어 있다.
삼중-나선 단백질의 생산을 위한 발현 시스템은, 예를 들면, 제US 20120116053호에 기술되어 있다.
발현된 삼중-나선 단백질의 회수
발현 후, 배양된 세포는 당해 분야에 공지된 기술에 의해 수거하고/수집할 수 있다. 하나의 예에서, 세포는 원심분리에 의해 수거하여 적합한 배지 속에 재현탁시킴으로써 발효 브로쓰/용액(즉, 세포 배양 추출물) 또는 균질물을 수득할 수 있다.
발현된 재조합체 삼중-나선 단백질의 정확한 회수 방법은 숙주 세포 및 발현 작제물에 의존할 것이다. 미생물 숙주 세포에서, 삼중-나선 단백질은, 이것이 세포질 외부로 수송된다고 해도, 숙주 세포의 세포벽내에 트랩핑(trapping)될 것이다. 당해 예예서, 숙주 세포는 파괴되어 삼중-나선 단백질이 회수된다. 달리는, 세포벽은 제거되거나 약화되어 주변세포질 속에 위치하는 단백질을 방출할 수 있다. 파괴는 초음파처리, 미세유동화, 프렌치 프레스 또는 유사 장치 속에서의 분해, 격렬한 진탕/유리 비드를 사용한 분쇄에 의한 파괴, 삼투압적으로 취약한 돌연변이체 효모 균주의 분해, 또는 효소적 처리(들)을 포함하는, 당해 분야에 공지된 어떠한 수단으로 달성될 수 있다. 삼중 나선형 단백질이 재조합체 숙주 세포의 분해 또는 파괴에 의해 회수되는 경우, 분해 또는 파괴는 전형적으로 삼중 나선 단백질이 가용성 형태로 잔류하도록 하는 충분한 이온 강도의 완충제 속에서 수행된다. 이러한 기계적 및 효소적 파괴 방법은 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있는 소세포 단편을 생산함으로써 균질물을 수득할 것이다.
삼중-나선 단백질이 세포외적으로, 즉, 가용성의 분비된 단백질로서 생상되는 경우, 세포는 여전히 세포 상층액으로부터 제거될 필요가 있다. 정화는 일반적으로 원심분리에 의해 달성되지만, 또한 침강 및/또는 여과에 의해 달성될 수 있다.
삼중-나선 단백질의 정제
가용성 재조합체 삼중-나선 단백질을 함유하는 브로쓰/용액(예를 들면, 세포 배양 추출물) 또는 균질물은 이후에 본 개재내용의 방법에 따라 산 침전 단게에 적용된다. 이는 브로쓰/용액 또는 균질물의 pH를 조절하는 산 용액을 첨가하여 달성된다. 산 용액은 어떠한 약산 또는 강산, 또는 둘 다의 혼합물일 수 있다. 염화수소산, 황산, 아세트산, 포름산 및 락트산이 모두 적합하다. 콜라겐을 팽윤시키고 가용화하는데 사용되는, 천연의 콜라겐-함유 포유동물 조직 물질의 앞서의 산성 처리와는 달리, 본 개재내용의 방법에서 사용된 산성화 단계는 삼중-나선 담백질을 용액 속에 여전히 유지시키면서 오염시키는 숙주 세포 단백질을 침전시키는 것으로 밝혀졌다. 산성화 단계는 또한 삼중-나선 단백질을 변성시키지 않는다. 따라서, 당해 방법은 가용성 삼중-나선 단백질로부터 숙주 세포 오염물질을 효과적으로 분리하기에 편리한 과정을 나타낸다.
산 용액은 농축 용액으로서 첨가될 수 있다. 산성화는, 4℃의 온도에서 수행할 수 있지만 30℃와 같이 높은 온도도 또한 작제물에 따라 가능하다. 가장 적절한 온도는 선택된 뉴클레오타이드 서열로부터 형성된 삼중-나선 단백질의 용융 온도에 의존할 것이다. 삼중-나선 단백질의 용융 온도(Tm) 이하의 온도, 바람직하게는 적어도 10℃ 이상 내지 Tm 이하의 온도의 사용은, 삼중 나선이 변형되지 않도록 보증할 것이다. 예를 들면, pH 2.2에서 스트렙토코쿠스 피오게네스는, Tm이 25.7℃인 Gly-Xaa-Yaa 모티프를 지닌 234개의 긴 작제물을 갖는다. 147개의 아미노산 길이의 작제물을 지닌 메틸로박테리움, 아종 4-46은, Tm이 28.3℃이고, 클로스트리디움 페르트링겐스는, 189개 아미노산 길이의 작제물이며, Tm이 37.2℃이다.
산성 조건의 pH는, 선택되는 숙주 시스템의 종류 및 콜라겐-유사 단백질을 생성하기 위해 사용된 서열의 종류에 따라 변할 것이다. 이. 콜라이와 같은 세균 숙주 세포를 사용하는 경우, 2 내지 3 사이의 pH가 바람직하다. 효모 숙주 세포가 사용되는 경우 4 내지 6의 pH가 바람직하다. 식물 숙주 세포가 사용되는 경우 2 내지 5의 pH가 바람직하다.
산 침전 단계는 이후에 분해 단계에 의해 프로테아제 분해에 대해 조절될 수 있는 숙주 세포 단백질을 제거할 수 있다. 삼중-나선 단백질은 프로테아제에 대해 내성으로 남는다. 하나의 예에서, 분해 단계는 산 프로테아제를 사용하여 수행된다. 본 개재내용의 방법에 따라 사용하기 위한 산 프로테아제의 적합한 예는 펩신, 파파인, 파파인-유사 효소, 예를 들면, 브로멜라인, 피신 또는 악티니딘, 또는 아스퍼길러스 사이토이 산 프로테아제를 포함한다. 사용된 프로테아제에 따라, pH 조건(예를 들면, 파파인과 같은 프로테아제의 경우)을 조절하는 것이 필수적일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 전략에 친숙할 것이다. 트립신 또는 키모트립신과 같은 프로테아제를 사용할 경우 pH를 중성 또는 심지어 염기성 조건으로 조절하는 것이 필수적일 수 있다.
프로테아제는 많은 오염시키는 단백질을, 이들이 완전한 가용성의 재조합체 삼중-나선 단백질보다 훨씬 더 작은 분자량을 가지므로 한외여과에 의해 제거될 수 있는 펩타이드로 분해한다. 수득되는 재조합체 삼중-나선 단백질은 이후에 수집할 수 있다. 한외여과를 통한 수집은 재조합체 삼중-나선 단백질을 농축시키는 추가의 장점을 갖는다. 또한, 특정의 상황하에서, 수집은 삼중-나선 단백질을 침전시켜, 이를 용액밖으로 이동시킴으로써 촉진할 수 있다. 재조합체 삼중-나선 단백질의 침전에 의한 수집은 pH의 조절, 온도의 조절, 또는 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)의 첨가에 의해 이온성 강도(예를 들면, 황산암모늄 또는 염화나트륨)의 조절을 추가하여 달성할 수 있다.
본 발명의 단계 (i)에서 사용된 추출 방법에 따라서, 산 침전 단계와 프로테아제 분해 단계, 예를 들면, 침전된 숙주 세포 물질로부터 삼중-나선 단백질의 물리적 분리를 위해 제공된 정제 단계 사이의 중간 분리/정제 단계를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 숙주 세포 물질은 단백질 및/또는 DNA를 포함할 수 있다. 따라서, 어떠한 조악한 분리 공정도 사용하여 이들 물질 하나 또는 둘 다를 제거할 수 있다. 이러한 공정들은 당해 분야의 숙련가에게 친숙할 것이다. 하나의 예에서, 공정은 원심분리, (초(ultra)) 여과, 교차 유동 여과 및 침강을 포함한다.
마무리
삼중-나선 단백질이 의학적 용도를 위해 요구되는 경우, 산성화되고 프로테아제 처리된 생성물을 마무리 정제 단계에 의해 정제하여 90% 이상의 순도를 달성하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 겔 여과, 소수성, 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는, 어떠한 마무리 정제도 본 개재내용에 따라 적합하다. 추가의 침전 단계를 또한 사용할 수 있지만 이들은 일반적으로 요구되는 고 순도 정제 수준을 달성하지 않을 것이다.
안정화
정제된 삼중-나선 단백질이 생의학적 물질로서 사용되어야 하는 경우, 이들은 적절한 양식으로 제작될 수 있어야 한다. 삼중-나선 작제물은 스폰지 및 쉬이트(sheet)로 형성될 수 있다. 이들 양식을 달성하기 위하여, 정제된 삼중-나선 단백질을 의학적 적용에서 요구될 경우 이들의 장기간의 안정성 및 의학적 강도를 개선시키기 위해 의학적 적용에서 사용하기 전에 안정화시킬 수 있다. 광범위한 적합한 안정화 전략이 가능하다. 글루타르알데하이드가 가교-결합에 적합한 시약이며 콜라겐 물질의 생체내 안정화를 개선시키기 위해 광범위하게 사용된다. 조사는 다른 물리적 안정화 기술이다.
본 개재내용의 방법에 따라 정제된 삼중-나선 단백질은 저장, 재생 및 화장품 공정, 혈관 공정, 골생성 및 연골생성 공정, 연골 재구성, 골 이식 치환, 지혈, 상처 치료 및 유지, 조직의 보강 및 지지, 다양한 적용 및 공정, 실금 등을 포함하는 다양한 적용 및 공정에 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합체 단백질의 응집 및 이들의 가능한 적용으로부터 생산될 수 있는 생물의학적 생성물의 비-제한적 예는 피부 이식체에서 사용하기 위한 것과 같은 가용성 재조합체 콜라겐, 약물 담체, 의학 장치용 피복물, 이식체 피복(정형외과 및 혈관), 형태-형성 물질, 점조수술법(viscosurgery), 혈관 실란트(vascular sealant), 화장품, 삼차원 세포 배양에서 사용하기 위한 것과 같은 스폰지-유사 물질, 조직 및 기관 가공, 지혈제, 및 상처 치료요법(인공 피부 및 상처 드레싱; 수술적 봉합 및 지혈제에서 사용하기 위한 것과 같은 섬유; 조직 이식체에서 사용하기 위한 것과 같은 겔-유사 물질, 콘택트렌즈, 및 세포 배양을 위한 매트릭스; 및 항-부착 막, 약물 전달 시스템, 인공 피부 등에서 사용하기 위한 것과 같은 막-유사 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다수의 변화 및/또는 변형이 본 기재내용의 광범위한 일반적인 영역에서 벗어남이 없이, 상술한 구현예에 대해 이루어질 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 친숙할 것이다. 따라서, 본 구현예는 모든 국면에서 나열하지만 제한하지 않는 것으로서 고려되어야 한다.
실시예
하기 실시예 1 내지 11은 본원에 기술된 방법에 따라 정제될 수 있는 상이한 삼중-나선 작제물을 기술한다.
실시예
실시예 1 - 에스 . 피오게네스(S. pyogenes )로부터의 세균 콜라겐 Scl2 단편의 DNA
Scl2.28 단백질의 결합된 구형 및 콜라겐-유사 부위를 암호화하지만 C-말단 부착 도메인을 결여하고 있는 Scl2.28 대립형질(Q8RLX7)의 단편에 대한 DNA 서열을 생물기술 정보 데이타베이스에 대한 국립 센터(National Center for Biotechnology Information database)(미국 메릴랜드주 20894 베제스다 소재의 국립 보건 연구원)(진뱅크( GenBank): AY069936.1.)에서 제공한 데이타로부터 수득하였다. 당해 서열에 His6 태그를 서열의 N-말단에 도입하고 트롬빈/트립신 절단 서열 LVPRGSP(서열 번호 1)를 N-말단 구형 도메인(V)과 다음의 (Gly-Xaa-Yaa)n 콜라겐-유사 도메인(CL) 서열 사이에 도입하였다. 삼중 서열 GKY를 CL 도메인에 이어, Ndel 및 SamHI 클로닝 부위를 지닌 정지 코돈에 포함시켰다. 당해 설계를 위한 DNA를 어떠한 코돈 최적화없이 상업적으로 합성하였다. 서열 번호 2는 최종 작제물이다.
DNA 및 단백질 서열: (서열 번호 2 및 3)
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2; 에스 . 피오게네스로부터의 콜라겐 Scl2로부터의 CL 도메인의 세균 콜라겐 이량체에 대한 DNA
구형 및 콜라겐-유사 부위를 포함하지만, C-말단 부착 도메인을 결여하고 있는 에스. 피오게네스로부터의 scl2.28 대립형질의 단편에 대한 DNA 서열은 실시예 1에 기술된 바와 같았다. 이는 또한 추가의 N-말단 His6 태그 서열, N-말단 구형 도메인 (V)과 다음의 (Gly-Xaa-Yaa)n 콜라겐-유사 도메인(CL) 서열 사이의 트롬빈/트립신 절단 서열 LVPRGSP(서열 번호 1), CL 도메인의 C 말단에 포함된 삼중 서열 GKY에 이어, 정지 코돈을 포함한다. 삽입체, GAAGVM(서열 번호 4)을 함유하는 제2의 작제물을 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 CL 도메인의 출발 전에 부위 지시된 돌연변이유발을 사용하여 Sc/2 유전자에 가하였다:
5' ACGCGGTAGTCCCGGGGCAGCGGGTGTTATGGGGCCCAGAGG 3' 전방(서열 번호 5) 및
3' CCTCTGGGCGCCATAACAGCCGCTGCCCCGGGACTACCGCGT 5' 역방(서열 번호 6)
GAAGVM 삽입체를 함유하는 제2의 작제물을 이어서 5' Smal(평활 말단) 및 3' SspI(평활 말단)으로 분해하였다. 당해 분해된 삽입물을 이어서 원래(실시예 1)의 작제물의 말단에서 Smal 부위에서 원래의 Scl2 유전자내로 역 삽입하였다. 최종의 서열 작제물은 서열 번호 7에 나타낸다. 삽입체는 평활 말단으로 클로닝되었으므로, 콜로니를 선택하여, 1xYT 속에 성장시키고 미디 제조(midi preps)를 수행하여 추가의 서열을 포함하고 제2의 서열이 정확한 배향으로 삽입된 클론을 선택하였다.
DNA 및 단백질 서열: (서열 번호 7 및 8).
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 3: 헤파린 결합을 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 에스 . 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2로부터의 DNA
실시예 1에 제공된 것으로서, Scl2 유전자를 셔틀 벡터(shuttle vector) pSL 80내로 제한 부위 5' Ndel 및 3' SamHI을 사용하여 클로닝하였다. 당해 클론을 이후에 사용하여 부위 지시된 돌연변이유발을 수행함으로써 서열 내에 신규의 결합 모티프를 도입하였다. 헤파린 삽입체는 12개의 아미노산이고 삽입 부위 주변의 서열은 매우 반복성이었으므로, 헤파린 결합 서열(GRPGKRGKQGQK: 서열 번호 9)을 염기쌍 561에서 3개의 서열 부위 지시된 돌연변이유발 PCR 반응을 사용하여 Scl2에 첨가하였다. 제1 반응을 위해, 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다:
5' TGAAGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTCCAATGGGTCCTGCTG 3' 전방(서열 번호 10) 및
3' CAGCAGGACCCATTGGACCGGCGTGCCTTGAGCACCAGCTTCA 5' 역방(서열 번호 11)
제2의 반응을 위해, 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다:
5' CAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTCCTGCTGGTGAGCG 3' 전방(서열 번호 12) 및
3' CGCTCACCAGCAGGACCC^fiSTTACCCGGCCTGCCTTG 5' 역방(서열 번호 13)
제3의 반응을 위해, 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다:
5' CCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACCTGG 3'(서열 번호 14) 및
3' CCAGGTTCTCCTTTTTCACCCTTCTG GCCCTGTTTACCCCGGTTACCCGG 5'(서열 번호: 15)
PCR 생성물을 효소 DpnI으로 처리하여 모든 모 DNA를 분해하고, 후속적으로 이. 콜라이 숙주 균주 XLI-BLUE내로 형질전환시켰다. 최종 서열 작제물은 서열 번호 16으로 기술되어 있다. 콜로니를 선택하여 항생제 선택성 배지 속에서 성장시키고, 퀴아젠 미니 제조를 수행하였다. 도입된 헤파린 부위를 함유한 콜로니를 확인하고 -20℃에서 저장하였다.
DNA 및 단백질 서열:(서열 번호 16 및 17).
Figure pct00005
실시예 4: 인테그린 결합을 위한 치환된 기능성 서열을 포함하는 에스 . 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2로부터의 DNA
실시예 1에 제공된 것으로서, Scl2 유전자를 제한 부위 5' Ndel 및 3' SamHI를 사용하여 셔틀 벡터 pSL1 180내로 클로닝하였다. 이후에, 당해 클론을 사용하여 부위 지시된 돌연변이유발을 수행하여 서열 내에 신규의 결합 모티프를 도입시켰다. 인테그린 결합 서열(GERGFPGERGVE: 서열 번호 18)을 염기쌍 705에서 PCR 지시된 통합을 통해, 2개의 연속 단계를 사용하여 Scl2 유전자에 첨가하였다. 단계 1에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
Figure pct00006
전방(서열 번호 19) 및
Figure pct00007
후방(서열 번호 20)
단계 2에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다;
Figure pct00008
전방(서열 번호 21) 및
Figure pct00009
후방(서열 번호 22)
PCR 생성물을 효소 DpnI로 처리하여 모든 모 DNA가 분해되도록 하고, 후속적으로 이. 콜라이 숙주 균주 XLI-BLUE내로 형질전환시켰다. 최종 서열 작제물은 서열 번호 23으로 기술된다. 콜로니를 선택하고, 항생제 선택 배지 속에서 성장시키고 퀴아겐 미니 제조를 수행하였다. 도입된 인테그린을 함유한 콜로니를 확인하고 -20℃에 저장하였다.
DNA 및 단백질 서열: (서열 번호 23 및 24)
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 5: 헤파린 및 인테그린 결합 둘 다에 대한 치환된 기능성 서열을 포함하는 에스. 피오게네스로부터의 세균 콜라겐 Scl2로부터의 DNA
실시예 3에 기술된 바와 같은, 도입된 헤파린 결합 부위를 함유하는 Scl2 유전자를 사용하였다. 확인된 도입된 헤파린 부위를 함유한 선택된 클론을 제2 라운드의 부위 지시된 돌연변이유발에 도입하여 인테그린 결합 도메인(GERGFPGERGVE; 서열 번호 18)을 실시예 4에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 Sc72 유전자의 염기쌍 705에 도입하였다. PCR 생성물을 효소 DpnI로 처리하여 모든 모 DNA가 분해되도록 하고, 후속적으로 이. 콜라이 숙주 균주 XLI-SLUE내로 형질전환시켰다. 최종 서열 작제물은 서열 번호 25에 기술되어 있다. 콜로니를 선택하여, 항생제 선택 배지에서 성장시키고 퀴아겐 미니 제조를 수행하였다. 도입된 인테그린 부위 및 헤파린 결합 부위를 함유하는 콜로니를 확인하고 -20℃에서 저장하였다.
DMA 및 단백질 서열:(서열 번호 25 및 26)
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 6: 로도슈도모나스 팔루스트리스( Rhodooseudomonas palustris )로부터의 V-도메인을 사용하여 솔리박터 우시타투스로부터의 세균 콜라겐으로부터의 DNA
칸디다투스 솔리박터 우시타투스 Ellin6076으로부터의 삼중 나선 반복체-함유 콜라겐에 대한 DNA 서열을 생물기술 정보 데이타베이스에 대한 국립 센터(미국 메릴랜드주 20894 베데스다 소재의 국립 보건 연구원)에서 YP_001993084로서 제공된 데이타로부터 수득하였다. 단백질 서열을 명목 DNA 서열내로 해독하고 에스. 우시타투스로부터의 Met 개시 시그날에 이어 CL 도메인에 이어 알. 팔루스트리스(R. palustris)로부터의 v-도메인에 이어, 최종적으로 C-말단 His6-태그 및 정지 코돈을 지닌, 정확한 암호화 골격을 유지한 복합체 유전자를 설계하였다. 암호화 서열 외부의 정지 제한 부위를 5' 말단을 위한 NdeI 및 EcoRI로서 가하고 3'를 위해 SslI 및 HindIII로서 가하였다. 당해 작제물을 원래의 아미노산 서열을 보유하지만, 바람직한 숙주 시스템, 이. 콜라이내에서의 발현을 위해 최적화된 DNA 서열을 사용하여 합성하였다(GeneArt® Gene Synthesis, 독일 레겐스부르크 소재). 최종 서열 작제물은 서열 번호 27에 기술되어 있다.
DNA 및 단백질 서열:(서열 번호 27 및 26)
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 7: 잎벌 , 네마투스 올리고스필루스로부터의 곤충 콜라겐에 대한 DNA, 유전자 A
엔. 올리고스필루스 실크 선으로부터의 삼중 나선 콜라겐-유사 실체에 대한 DNA를 제A형 쇄(A279)에 대해 보고된 서열로부터 앞서 기술된 바와 같이(제US61/615745호) 수득하였다. 유전자 작제물을 합성(GeneArt® Gene Synthesis, 독일 레겐스부르크 소재)하였으며, 이는 NdeI 및 EcoRI 제한 부위, 및 원래의 아미노산 서열을 보유하지만 바람직한 숙주 시스템, 이. 콜라이내에서 발현을 위해 최적화하면서 도입된 보존적인 염기 치환과 함께 포함하였다.
최종 서열 작제물은 서열 번호 29에 기술되어 있다.
DNA 및 단백질 서열:(서열 번호 29 및 30)
SF21 (A279)-잎벌 콜라겐 제A형 유전자
Figure pct00016
실시예 8: 사람 제III형 콜라겐의 단편의 3개의 반복체에 대한 DNA
PCR 반응용 주형은 cDNA 클론 GC:39848(image 5405119)(ATCC, 버지니아주 마나사스 소재)를 기본으로 하며, 이는 사람 COL3A1 유전자를 함유하고, 아미노산 서열을 변화시키지 않지만 제2의 구조 형성의 가능성을 감소시키는 제한된 염기 변화가 도입되어 있다.
PCR 생성물은 전기영동으로 분리하고 절개된 밴드를 퀴아퀵 겔(QIAquick Gel) 추출 키트(제조원: Qiagen)를 사용하여 추출하였다.
이들 별개의 클로니용 단편의 PCR 생성을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
Figure pct00017
(서열 번호 31)
Figure pct00018
(서열 번호 32)
Figure pct00019
(서열 번호 33)
Figure pct00020
(서열 번호 34)
Figure pct00021
(서열 번호 35)
Figure pct00022
PCR 단편을 쌍을 이룬 제한 효소 분해(EcoRl 및 Xmal, XmaI 및 BamHI, BamHI 및 SacII)에 적용하고, 단편을 아가로즈 겔로부터의 추출로 정제하였다. 3개의 반복체 DNA 분절의 생산을 벡터 YepFlagI(Eastman Kodak/181, 코넥티컷주 뉴 해븐 소재)내로의 후속적인 연결과 함께 달성하였다. 벡터 DNA를 적절한 효소를 사용하여 제조하였다. 정제된 PCR 단편을 각각 1mol의 벡터당 3mol의 삽입체의 비율로, 후속적인 벡터 삽입체내로 연결하였다. 연결 혼합물을 사용하여 표준 과정을 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 에스케리키아 콜라이 균주 XL1 블루(제조원: Stratagene, 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 통상적으로 플라스미드의 유지, 증식 및 형질전환에 사용하였다. 별도의 DNA를 경우에 따라 당해 벡터로부터 분리할 수 있다. 최종 서열 작제물은 서열 번호 37에 나타낸다.
DNA 및 단백질 서열: (서열 번호 37 및 36)
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 9: 사람 제I형 알파 1 쇄 CB3 단편에 대한 DNA
사람 제I형 알파 1 쇄의 CB3 단편에 대한 DNA 서열을 생물기술 정보 데이타베이스에 대한 국립 센터(국립 보건원, 미국 메릴랜드주 20894 베데스타 소재)에서 제공한 데이타로부터 기록 #(진뱅크: Z74615.1)로서 수득하였다. 서열을 C-말단 His6-태그 및 말단 코돈을 가함으로써 변형시키고 5' NdeI 및 3' EcoRI를 가졌으며 HndIII 제한 부위를 가하여 pCold IV 벡터내로 삽입하기에 적합한 작제물을 제조하였다. 당해 DNA로부터 생산된 삼중 나선 단백질의 안정성은, 모든 조작이 4℃에서 수행되어야 함을 의미한다. 작제물을 원래의 아미노산을 보유하지만 바람직한 숙주 시스템, 이. 콜라이내에서 발현을 위해 최적화시킨 보존적 치환을 지니도록 합성(GeneArt® Gene Synthesis, 독일 레겐스부르크 소재)하였다.
최종 서열 작제물은 서열 번호 39에 기술되어 있다.
DNA 및 단백질 서열: (서열 번호 39 및 40)
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 10: 사람 콜라겐 제I 및 제III형 쇄로부터의 단편으로 제조된 키메라에 대한 DNA
ATCC 수탁 번호 95498을 지닌 사람 콜라겐 제I형, 알파 Ic-DNA 및 ATCC 수탁 번호 95502를 지닌 사람 콜라겐 제III형, 알파 Ic-DNA를 키메라 DNA의 생산에 사용하였다.
초기에, 콜라겐 제I형 및 제III형 유전자를 암호화하는 10ng의 c-DNA를 50μl의 이. 콜라이 숙주 균주내로, 열 쇼크 방법을 사용하여 42℃에서 형질전환시켰다. 암피실린에 대해 내성인 콜로니를 회수하여 150ml의 YT 배지 속에서 밤새 성장시켰다.
모 클론의 제한 분해를 수행한 후 1% 아가로즈 겔 전기영동 상에서 분석하고, 콜라겐 밴드를 분리하여 정제하였다. 벡터 및 정제된 삽입물 제제를 T4 DNA 리가제 키트(제조원: Invitrogen)을 사용하여 연결하였다. 연결 혼합물을 Top10 세포내로 형질전환시키고 암피실린 선택 배지 상에 플레이팅하였다. 콜로니 PCR을 사용하여 가공된 키메라를 함유한 클론을 검출하였다. 잠재적으로 가공된 클론을 함유하는 PCR 생성물을 1% 아가로즈 전기영동 상에서 분석하였다. 4.5kb 콜라겐 제I형 유전자 삽입물을 이의 모 벡터 pUC19로부터 제한 부위 XbaI(5') 및 Sspl(3')을 사용하여 아-클로닝하고 세균 셔틀 벡터 pBiuescript II KS+(제조원: Stratagene)내로 부위 Xbal(5') 및 Smal(3')을 사용하여 클로닝하였다. 당해 클로닝은 염기쌍 2929 내지 2934에서 콜라겐 제I형내 내부 BamHI 부위를 허용하여 당해 벡터내에 유일한 부위로서 작용하도록 하였다. 콜라겐 제I형의 2개의 트렁케이션(truncation(N 및 C) 말단을 작제하였다. 콜라겐 N 말단 트렁케이션은 Xbal(5') 및 BamHI(3') 부위에서 pBiuescript II KS+내로 클로닝된 콜라겐의 2.7kb 단편을 함유한 반면, 크기가 1.8kb인 C 말단 트렁케이션은 셔틀 벡터 pUC19내로 제한 부위 SamHI(5') 및 HlndIII(3')를 사용하여 아-클로닝하였다. 당해 C 말단 트렁케이션에, NaeI 제한 부위(사일런트 돌연변이(silent mutation))를 QuickChange II 부위-지시된 돌연변이유발 키트(제조원: Invitrogen)을 사용하여 C 텔로펩타이드의 염기 쌍 3706 내지 3711에서 도입하였다. HindIII 부위(GTCAAC)를 완전한 길이의 키메라의 벡터 시스템내로의 용이한 클로닝을 위해 콜라겐 I 정지 코돈 직 후에 가하였다. 당해 N 말단 트렁케이션에, PCR을 사용하여 개시 메티오닌 잔기의 상부의 코작 서열(kozak sequence)을 도입하였다. 스플라이스 오버랩(Splice overlap) PCR을 사용하여 콜라겐 제I형 나선의 영역을 콜라겐 제III형 나선의 것으로 상호교환하였다. Coll Iα 나선의 염기 쌍 3288 내지 3711을 스패닝한 오버랩을 Coll III α 나선의 3283 내지 3708DML의 것과 상호교환시켰다. 5' 오버랩 올리고는 도입된 SamHI 부위를 함유하였고 3' 올리고는 도입된 NaeI 부위를 함유하였다. PCR 생성물을 pTOPO 벡터내로 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(제조원: Invitrogen)를 사용하여 클로닝하였다. 오버랩을 pTOPO로부터 SamHI(5') 및 Nael(3')을 사용하여 분해하고 pUC19내에서 도입된 NaeI 부위를 함유하는 콜라겐 I의 야생형(WT) C 말단 클론으로 상호교환시켰다. 콜라겐 I으로부터의 N-프로펩타이드, 잔기 193 내지 609의 제거를 N-말단 트렁케이트된 작제물에서 결실 돌연변이유발을 사용하여 수행하였다. 이후에 유전자를 콜라겐의 C 말단 소-단편내로 클로닝하여 N-프로펩타이드를 결여하는 완전한 길이의 유전자를 생성하였다. 최종 서열은 서열 번호 41로 나타낸다.
DNA 서열: 서열 번호 41
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 11: 2개의 상이한 콜라겐-유사 성분이 메틸로박테리움 아종 및 에스 우시타투스로부터 존재하는 상이한 세균 콜라겐 쇄의 키메라에 대한 DNA
칸디다투스 솔리박터 우시타투스(Candictatus Solibacter usitatus) Ellin6076 및 메틸로박테리움 아종으로부터의 삼중 나선 박복물-함유 콜라겐에 대한 DNA 서열은 생물기술 정보 데이타베이스에 대한 국립 센터(국립 보건원, 미국 메릴랜드주 20894 베데스타 소재)에서 에스. 우시타투스의 경우 기록 ABJ82342로서 및 메틸로박테리움의 경우 기록 ACA18713.1로서 제공된 데이타로부터 입수하였다.
단백질 서열을 명목 DNA 서열내로 해독하고 Met 개시 시그날에 이어 메틸로박테리움으로부터의 V 및 CL 도메인에 이어, 에스. 우시타투스로부터의 CL 도메인에 이어, 최종적으로 말간 코돈을 지닌 정확하게 암호화된 단편을 유지하는 복합체 유전자를 설계하였다. 암호화 서열 외부의 말단 제한 부위를 5'에 대해 Nde 및 EcoRI로서 및 3'에 대해 SalI 및 HindIII로서 가하였다. 이후에, 당해 작제물을 숙주 시스템내에서 발현을 위해 최적화하고 원래의 아미노산 서열을 유지하지만 바람직한 숙주 시스템, 이. 콜라이내에서 발현을 위해 최적화한 DNA 서열을 사용하여 합성(GeneArt® Gene Synthesis, 독일 레겐스부르그 소재)하였다.
최종 서열은 서열 번호 42에 기술되어 있다.
DNA 서열: 서열 번호 42 및 43
Figure pct00029
Figure pct00030
실시예 12 내지 17은 수개의 상이한 작제물에 대한 상이한 발현 숙주 세포 시스템을 기술한다.
실시예 12: 삼중 나선 단백질에 대한 DNA 작제물의 발현
예를 들면, 서열 번호 2, 6, 14, 20, 21의 상술한 DNA 작제물 중의 어느 하나를 이. 콜라이내로 삽입하여 다음의 방법에 따라 삼중-나선 단백질을 발현하도록 제조할 수 있다.
DNA 서열을 이. 콜라이 발현 벡터 시스템 pColdIII내로 독특한 부위 5' Nde 및 3' BamHI을 사용하여 아-클로닝시켰다. PCR 콜로니 스크리닝 기술을 이후에 사용하여 양성 클론을 검출하였다. 이들 클론을 100ml의 배양 용적까지 성장시키고 퀴아겐 미디 제조를 수행하여 벡터 양을 확장시켰다. 발현을 위해, 선택된 양성 클론을 이. 콜라이 숙주 BL21 - DE3내로 형질전환시켰다. 세포를 2 x YT 배지(또는 정의된 배지를 또한 리터당 16g의 트립신, 10g의 효모 추출물 및 5g의 NaCl을 함유하는 서열 번호 2를 사용하는 것과 같은 일부 상황에서 사용할 수 있다)에서 성장시켰다. 사용된 정의된 배지(DM)는 리터당 다음을 함유하였다: KH2P04, 10.6g; (NH4)2HP04. 4g; 시트르산, 1.7g; 글루코즈, 25g; MgS04.7H20, 1.23g; 암피실린(50 pg/ml), 200mg; 티아민 하이드로클로라이드, 4.4mg; 및 미량의 염 용액 5mL. 미량의 염 용액은 리터당 다음을 함유하였다: CuS04.5H20, 2.0g; Nal, 0.08g; MnS04.H20, 3.0g; Na2Mo04.2H20, 0.2g; 붕산, 0.02g; CoCl2.6H20, 0,5g; ZnCl2, 7g; FeS04.7H20, 22g; CaS04.2H20, 0.5g 및 H2S04, 1mL. 경우에 따라 글루코즈, 마그네슘, 미량의 염, 티아민 및 암피실린을 농축 스톡 용액으로서 멸균 후 배지에 혐기적으로 가하였다.
세포를 37℃에서 24시간 동안 성장시키면 A600에서 세포 배양물 광학 밀도는 대략 3 내지 6에 도달하였다. 이후에, 배양물을 25℃에서 항온처리하고 1mM 이소프로필 베타-D-티아갈락토피라노사이드(IPTG)를 가하여 단백질 발현을 유도하였다. 10시간 항온배양 후, 온도를 15℃로 다른 14시간 항온처리 동안 감소시켰다. 24시간 후 세포를 원심분리로 수거하였다.
CB3 단편의 서열 번호 31의 작제물의 경우, 발현 후, 세포를 14시간 동안 4℃에서 유지시키고, 모든 후속 공정은 또한 15℃대신 4℃에서 유지하였다.
실시예 13: 이. 콜라이내에서 삼중 나선 단백질에 대한 DNA 작제물 , 알. 팔루스트리스로부터의 V-도메인을 지닌 에스 . 우시타투스로부터의 세균 콜라겐 단편의 pET 벡터를 사용한 발현
DNA를 실시예 6에 기술된 바와 같이 취하였다. 복합 유전자를 pET21a 벡터내로 5' EcoRl 및 3' HindIII 부위내로 클로닝하였다. 클론의 서열분석을 완전한 이. 콜라이 숙주 세포주 BL21 DE3내로 형질전환시키기 전에 수행하였다. 형질전환된 세포를 YT 플러스 암피실린 플레이트내에서 플레이팅하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 단일 콜로니를 플레이트로부터 집어서 YT 플러스 암피실린 배지 속에서 37℃로 밤새 성장시켰다.
재조합체 세균 콜라겐을 바이오스타트(Biostat) 8(제조원: Sartorius Stedim, 독일 소재) 조절 시스템에 연결된 2L의 교반 탱크 생반응기 속에서 생산하였다. 발효기 속의 배지의 초기 용적은 1.6L이었으며 글루코즈를 탄소원으로서 사용하였다. 제2의 종균 배양물의 용적을 생반응기에 가하여 0.25의 초기 광학 밀도(600 nm에서 측정한 것으로서)를 수득하였다. 발포를 10%(v/v)의 폴리프로필렌 글리콜 2025의 자동 첨가를 통해 조절하고; 3mL의 소포제 용액을 접종 전에 가하였다. pH 설정점은 7.0이었으며, 10%(v/v) H3P04 또는 10%(v/v) 30 NH2 용액의 자동 첨가로 조절하였다. 용존 산소 설정점은 20%의 포화도이었으며 2-단계 캐스케이드 조절을 사용하여 용존 산소를 규정된 설정점 이상으로 유지시켰다. 교반기 속도는 500rpm 내지 1200rpm이었으며 기류(5%의 순수한 O2로 보충함)는 0.3L/분 내지 1.5L/분의 범위였다. 고 세포 밀도 공급-배취 공정을 위해, 공급 용액은, 40mL의 1M MgS047H2O가 첨가된 400mL의 660 g/L 글루코즈 용액을 포함하였다. 공급물 유동 속도는 15 mL/hr이었으며 공급은 접종 후 8.5시간째에 개시하였다. 개별 실험을 위한 접종 시간 및 온도는 다른 것들 중에서도, 작제물, 숙주 세포 시스템에 따라 변하였다. 배양물을 요구된 온도로 접종 후 24시간째까지 냉각(20분의 기간에 걸쳐)시켜 1mM(배양물 속에서 최종 농도)의 IPTG의 첨가로 유도된 벡터 및 단백질 발현의 냉 쇼크 성분을 활성화시켰다. 이후에, 세포를 원심분리로 수거하였다.
실시예 14: 이. 콜라이내에서 pCold 벡터를 사용하여 삼중 나선 단백질, 잎벌 실크 콜라겐에 대한 DNA 작제물의 발현
서열 번호 23의 잎벌 DNA 분리물내로 제한 효소 분해 부위의 도입은 잎벌 실크 유전자에 대한 DNA의 분리 및 이의 삽입물의 발현 벡터내로의 삽입을 허용한다. 잎벌 콜라겐-유사 실크 A 유전자를 pColdl 벡터내로 Ndei 및 EcoRI 부위를 통해 삽입하였다. PCR 콜로니 스크리닝 기술을 사용하여 양성 클론을 검출하였다. 이들 클론을 100ml의 배양 용적속에서 성장시키고 퀴아겐 미디 제조를 수행하여 벡터 양을 확장시켰다. 발현을 위해, 선택된 양성 클론을 상보성 이. 콜라이 BL21 세포내로 형질전환시켰다. 잎벌 실크 단백질 유전자내의 발현을 위해, 세포의 하나의 콜로니를 100ml의 출발 배양 배지, 2x YT-Amp를 가하고 37℃에서 200rpm으로 밤새 진탕시키면서 배양하였다. 이후에 당해 배양물은 첨가된 100ml의 신선한 2x YT-2 글루코즈-Amp를 가졌으며, 1mM IPTG로 25℃에서 10시간 동안 유도한 후, 20℃에서 다른 16시간 동안 유도하였다. 세포 페이스트를 원심분리(3000xg에서 30분 동안)에 의해 수거하였다. 단백질은 세포 펠렛과 연합되었다.
실시예 15: 사카로마이세스 세레비지아에 속에서 삼중 나선 단백질, 제III 콜라겐으로부터의 단편의 반복체에 대한 DNA 작제물의 발현
효모 형질전환을 실시예 8에서와 같이(여기서, DNA 작제물은 α-인자 시그날 α-프로 서열/FLAG 태그/콜라겐 III 단편의 3개의 반복체의 골격내 융합물을 포함한다) DNA/벡터(YepFlagl)를 사용하여 에스. 세레비지아에 효모 균주 BJ5462(α ura3-52 trpl Ieu2_1 his3_200 pep4::HIS3 prbj .6R)(효모 유전 스톡 센터, 캘리포니아주 버클리 소재)내로 전기영동하여 수행하였다. 형질전환체를 통기하면서 28℃에서 48시간 동안 SDahl 플러스 Ura 배지 속에서 성장시켰다. 선택 후, 부위를 비-선택성 YPHSM 배지(1% 덱스트로즈, 1% 효모 추출물, 8% 펩톤, 3% 글리세롤, 20mM CaCl2)내로 희석시키고 96시간 동안 28℃에서 격렬하게 진탕시키면서 성장을 지속시켰다. 세포 펠렛을 12,000xg에서 20분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. FLAG의 존재는 단백질 확인을 위한 선택을 제공한다.
사람 콜라겐 제I형 및 제III형에 대한 DNA 작제물의 발현은 동일한 방법을 따를 수 있다.
실시예 16: 피키아 파스토리스를 사용하여, 알. 팔루스트리스로부터의 V-도메인을 사용한, 삼중 나선 단백질, 에스 . 우시타투스로부터의 세균 콜라겐 단편에 대한 DNA 작제물의 발현
세균 콜라겐 유전자를 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조하였다. 임의로, 유전자는 피키아 발현을 위해 추가로 최적화시킬 수 있었다. 유전자 작제물을 이. 콜라이내에서 조립하였다.
콜라겐 유전자 작제물을 적절한 벡터 시스템, pA0815 HIS4내로 도입하여 유전자 작제물의 효모 숙주 세포, 피. 파스토리스내로의 염색체 통합을 허용하였다. 임의로, 다른 벡터 시스템, 예를 들면, pA0815-SX HIS4, pPIC9 HIS4, pPICZ ZeoR, pPICZa ZeoR, pBLADE-IX AOEI, pBLARG-IX ARG4, pBLA G-SX ARG4 또는 pBLURA URA3을 사용할 수 있었다. 당해 시스템은 메틸로트로프 발현에 의해 특징화되며, 여기서 강력한 구성적 프로모터(GAP) 및 강한 유도성 프로모터(바람직하게는 AOXI-알코올 옥시다제)가 존재한다. 단독의 탄소원으로서 사용될 수 있는 메탄올의 첨가는 단순하고, 완전한 유도를 허용한다. 당해 시스템은 삽입된 유전자의 염색체 통합을 사용하여 발효 동안 연속적인 선택(예를 들면, 항생제)에 대한 요구성을 제거한다. 콜라겐 유전자를 포함하는 벡터 pA0815를 BamHI으로 선형화하였다. 선형화된 플라스미드를 피. 파스토리스내로 전기영동에 의해 형질전환시켰다. GSI15 his4를 포함하는, 다양한 피키아 균주가 적합하다. 형질전환제를 콜라겐 작제물의 발현을 위한 His+ 세포로서 선택하였다. 선택된 세포를 진탕 플라스크 속에서 글리세롤, pH 5.0이 들어있는 기본 염 배지 속에서 성장시켰다. 적절한 습윤 세포 밀도가 달성되면, 메탄올을 가하고 발효를 추가로 72시간 동안 지속하였다.
실시예 17: 니코티니아 아종( Nicotinia sp .)에서 일시적인 발현을 사용하여, 알. 팔루스트리스로부터의 V-도메인을 사용한, 삼중 나선 단백질인, 에스 . 우시타투스로부터의 세균 콜라겐 단편에 대한 DNA 작제물의 발현
서열을 니코티니아 아종에서 발현을 위해 최적화시키고 5' AgeI 및 3' XhoI에 대한 제한 부위를 도입하는 것을 제외하고는, 실시예 4에 기술된 바와 같은, 에스. 우시타투스로부터의 세균 콜라겐 CL 도메인 및 알. 팔루스트리스로부터의 V-도메인을 암호화하는 합성 유전자를 사용한다. 유전자를 PGR 증폭시키고 pEMTR DTOPO내로 클로닝한다. 이후에, 서열의 강직도를 확인하였다. pENTR DTOPO 작제물을 BspHI 분해하고 정제하여 가나마이신 내성 유전자를 제거함으로써, 유전자의 이원 pEAQ-HT-DEST GATEWAY 분해 벡터[참조: Salnsbury et al. (2009) Plant Biotechnol J 7(7):682-93]내로 LR 클로나제 재조합 후 가나마이신을 사용한 적절한 선택을 허용한다. 이원 플라스미드를 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 균주 LBA4404로 형질전환시키고 이 속에 유지시켰다. 작제물을 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지 속에서, 정지 상에 도달할 때까지 성장시켰다. 배양물을 원심분리하고 펠렛을 10m MES, 10mM MgCl2, 20mM 아세토시린곤을 포함하는 여과 배지내로 0.5의 OD 600까지 재현탁시켰다. 배양물을 암실 속에서 실온으로 4시간 동안 항온처리한 후 5엽 단계로 성장한 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)내로 주사기 여과[참조: Sainsbury et al. (2009) Plant Biotechnol J 7(7):682-93]하였다. 잎들을 여과 후 5일째에 수거하였다.
실시예 18 내지 32는 도 1의 흐름도에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 정제 단계를 기술한다.
실시예 18: 초음파를 사용한, 세균 세포, 이. 콜라이로부터 삼중 나선 단백질의 추출
추출을 위해, 상기 실시예 12 내지 17로부터의 실시예로부터 기원한, 각각 1g의 세포 페이스트를 20ml의 50mM 아세트산/HCl 완충액 pH 2 속에 재현탁시키고, Enhance Booster #1 프로브가 장착된, Misonix S4000 장치를 30A(장치 규모)에서 5분 동안 사용하여, 초음파로 세포를 파열하였다. 임의로, 세포 분해물 혼합물을 원심분리(12,000xg에서 60분 동안)에 의해 투명하게 하고 삼중 나선 단백질을 함유하는 선명한 상층액을 보유하였다.
실시예 19: 프렌치 프레스를 사용하여, 세균 세포, 이. 콜라이로부터 삼중 나선 단백질의 추출
실시예 12 내지 17로부터의 예로부터 기원한 동결된 세포 페이스트를 해동시키고 50mM 아세트산 pH 2를 사용하여 1:10 w/w로 혼합하였다. 당해 혼합물을 Apv2000 프렌치 프레스 균질화기를 통해 700bar 압력으로 추가의 수행들 사이에 1시간 냉각 기간을 사용하여 3회 통과시켰다. 가공 후, 페이스트를 12,000xg에서 60분 동안 원심분리하여 임의로 투명하게 하고 추출된 삼중-나선 단백질을 함유하는, 선명한 상층액을 보유시켰다.
실시예 20: 효모 세포, 에스. 세레비지아에로부터 삼중 나선 단백질의 추출
효모 발현 시스템중의 어느 것으로부터 수득된, 세포 페이스트를 파괴 완충액(50mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4, 0.5m EDTA, 2mM PMSF, 5% 글리세롤, 0.1% 트리톤 X-100) 속에 20ml의 완충액 당 1g의 세포 페이스트의 비로 재현탁시키고 동 용적의 유리 비드(시그마 유리 비드 #G8772)를 가하였다. 혼합물을 이후에 와동(1400rpm)시키고 혼합물을 30분 동안, 추가의 30초 동안 두었다. 와동을 10회 이상 반복하였다. 전체 추출 공정을 5℃에서 유지하였다. 이후에, 혼합물을 1분 동안 10,000xg에서 원심분리하여 가용성 추출물을 수집하였다.
실시예 21: 식물 잎, 니코티니아 아종으로부터 삼중 나선 단백질의 추출
바람직하게는 ~20℃에서 동결시킨, 실시예 17로부터와 같은 잎 물질을 20mM 아세트산나트륨 완충액, pH 4.5내로 1:10 w/w의 잎 대 완충액의 비로 도입하고 와링 블렌더(Waring Blender) 속에서 최대 속도로 추출하였다.
실시예 22: 발현 및 분비 또는 추출 후 가용성 삼중-나선 단백질의 확인
실시예 12 내지 17에서와 같은 발현, 및 실시예 18 내지 21에서와 같은 추출 후 가용성 삼중 나선 단백질 또는, 실시예 16에서와 같이, 가용성 생성물로서 발현된 삼중 나선 단백질의 존재를 세포 물질의 원심분리에 이은 SDS-PAGE로 확립하였다. His3-태그, 또는 Flag 태그와 같은 어떠한 태그가 발현에 사용된 작제물에 존재하는 경우, 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)을 가용성 단백질의 검출을 위한 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 모노클로날 항-폴리-히스티딘과 같은 적절한 항체와 함께 사용할 수 있다.
실시예 23: 세포 추출을 위한 침전용 pH의 선택
발현 숙주 세포를 실시예 18 및 19에 기술된 바와 같이, 기계적으로 추출하고, 당해 추출물을 선택된 pH, pH 2 내지 pH 8에서 항온처리하였다. 이후에, 임의로 세포 부스러기 물질을 제거하였다. 추출된 세포 분해물의 샘플을 선택된 다양한 pH를 사용하여, 1 pH 단위 간격으로, 또는 바람직하게는 0.5 pH 단위 간격으로 침전 pH로 조절하고, 샘플을 4℃에서 16시간 동안 유지시켰다. 이후에, 침전물을 원심분리로 제거하고 상층액의 단백질 함량을 280nm에서의 흡수로 평가하였다. 삼중 나선 작제물의 가용성의 보유는 실시예 22에서와 같이 다시 확인하였다.
실시예 24: 가용성 삼중 나선 단백질을 유지하면서, 이. 콜라이로부터 발현 세포 숙주 단백질의 침전
실시예 1에서와 같이, 에스. 피오게네스로부터의 가용성 콜라겐-유사 단백질을 함유하는, 이. 콜라이로부터의 단백질을 추출하여 원심분리에 의해 선명하게 한 후, pH2.2로 조절하고, 4℃에서 16시간 동안 두어 침전되도록 하였다. 이후에, 샘플을 30분 동안 및 15,000xg에서 원심분리하고, 삼중-나선 단백질을 함유하는 상층액을 보유하였다.
실시예 25: 사람 제III형 콜라겐의 반복 처리로부터의 가용성 삼중 나선 단백질을 보유하면서 에스. 세레비지아에로부터의 발현 세포 숙주 단백질의 침전
가용성 삼중-나선 단백질을 함유하는, 정화된 상층액을 아세트산 또는 NaOH 용액을 사용하여 pH 5.0으로 조절하고 4℃에서 16시간 동안 두었다. 수득되는 침전물을 10,000xg에서 30분 동안 원심분리하여 제거하고 상층액을 유지시켰다.
실시예 26: 에스 . 우시타투스로부터의 가용성 삼중 나선 단백질을 유지하면서, 니코티니아 아종으로부터 발현 세포 숙주 단백질의 침전
가용성 삼중-나선 단백질을 함유하는 정화된 상층액을 아세트산 또는 NaOH 용액을 사용하여 pH 4.5로 조절하고 4℃에서 16시간 동안 둔다. 수득되는 침전물을 10,000xg에서 30분 동안 원심분리하여 제거한다. 이후에, 상층액을 아세트산 및 HCl을 사용하여 pH 2.5로 조절하고 추가로 20시간 동안 둔다. 당해 용액을 10,000xg에서 30분 동안 원심분리하여 정화하고, 상층액을 유지하였다.
실시예 27: 침전 후 잔류 가용성 숙주 세포 오염물의 분해
상기 실험에서와 같이, 산 침전된 단백질의 제거 후 수득된 상층액을 다음의 조건 중 어느 하나에 따라 조절하였다.
·4℃에서 16시간 동안 pH 2.5 및 펩신(0.01 mg/ml)에 이어 보화물의 pH를 pH 7로 조절함으로써 임의로 종결하였다.
·pH 6.5 및 Na EDTA( 50 mM) 및 시스테인(50 mM), 파파인(0.01 mg/ml)을 16시간 동안 4℃에서 pH 3.0 및 진균 산 프로테아제 XIII(0.01 mg/ml)를 4℃에서 16시간 동안 및 이어서 분해물의 pH를 pH 7. pH 8.0으로 조절함으로써 임의로 종결시키고 트립신 및 키모트립신 둘 다를 0.01mg/ml에 16시간 동안 4℃에서 가한 후, 분해물의 pH를 pH 4로 조절함으로써 임의로 종결시켰다.
다음 실시예는 본 발명의 정제 단계를 수반하며 단백질의 수집, 농축 및 가능한 최종 마무리 및 정제에 관한 것이다.
실시예 28: 황산암모늄 침전에 의한 삼중 나선 단백질 생성물의 분리
앞서의 실시예에 논의된 바와 같이, 산 침전에 이은 프로테아제 처리에 의한 불순물의 제거 후 재조합체 삼중-나선 단백질을 함유하는 분획을 혼주(pooling)시키고, 용액의 pH를 pH 4.0 내지 7.0로 조절하고 삼중-나선 단백질을 고체 황산암모늄을 첨가하여 침전시켰다. 모든 단계를 삼중 나선의 용융 온도 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 수행하였다. 침전에 필요한 고체 황산암모늄의 양에 이어서 샘플을 원심분리하고, 침전을 위해 육안으로 검사하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 에스. 피오게네스와 같은 작은 비-동물 콜라겐의 경우, 황산암노늄의 35% 포화도가 요구된다.
실시예 29: 중합체 침전에 의한 삼중 나선 단백질 생성물의 분리
앞서의 실시예에서 논의된 바와 같이, 산 침전에 이은 프로테아제 처리에 의한 불순물의 제거 후 재조합체 삼중-나선 단백질을 함유하는 분획을 혼주시키고 용액의 pH를 pH 7.0 + 1.0으로 조절하고 삼중-나선 단백질을 40% 수성 스톡 용액으로부터, 폴리에틸렌 글리콜-4000의 첨가를 통해 침전시켰다. 모든 단계를 삼중-나선의 용융 온도 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 수행하였다. 침전을 위해 요구되는 폴리에틸렌 글리콜의 양은 샘플의 원심분리, 침전을 위한 육안 실험 및 SDS-PAGE에 의한 분석에 의해 수반되었다. 에스. 피오게네스로부터와 같은, 작은 비-동물 콜라겐의 경우, 10 %w/v의 폴리에틸렌 글리콜-4000이 요구된다.
수득된 단백질의 순도는 도 3에 나타낸다.
실시예 30: 한외여과에 의한 삼중 나선 단백질의 분리
앞서의 실시예에서 논의된 바와 같이, 산 침전에 이어 프로테아제 처리에 의한 불순물의 제거 후 재조합체 삼중-나선 단백질을 혼주시킨 후 농축시키고 10kDa 교차-유동 여과막 장치(제조원: Pall Life Sciences)를 사용하여, 20mM 인산나트륨 완충액, pH 8.0으로 교환하였다. 모든 단계를 삼중-나선의 용융 온도 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 수행하였다.
실시예 31: 흡수에 의한 삼중 나선 단백질의 분리
앞서의 실시예에서 논의된 바와 같이, 산 침전에 이은 프로테아제 처리에 의한 불순물의 제거 후 재조합체 삼중-나선 단백질을 함유하는 분획을 혼주시키고 용액의 pH를 트리스를 사용하여 pH 8.0 ± 0.5로 조절하였다. 에스. 피오게네스로부터의 삼중-나선 단백질의 경우, 혼주된 샘플을 이후에 하전된 그룹으로서 CH2-Ν+(CH3)3을 갖는 모노-Q 컬럼(제조원: GE HealthCare) 상에 흡착시키고, 50mM 트리스/HCI 완충액, pH 8.0 속에서 예비-평형화시켰다. 로딩(loading) 후, 컬럼을 5 컬럼 용적의 평형 완충액으로 세척한 후, 선형 NaCl 구배에 의해 동일한 완충액 속에서 0 내지 1mM로 용출시켰다. 단백질을 214nm에서 흡착시켜 검출하고 SDS-PAGE로 확인하였다.
다음 실시예는, 정제된 삼중 나선 단백질이 임상 적용에 사용될 수 있는 방법을 나타낸다.
실시예 32: 제작-생체내 용도를 위한 세균 콜라겐-유사 샘플의 제조
정제된 콜라겐 단백질이 생의학 물질로서 사용되는 경우, 이는 대부분 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용한 추가의 "마무리"를 필요로 하는 경향이 있다. 또한 단백질은 의학적 적용에서 사용하기 전에, 동물 콜라겐의 경우에서와 같이, 안정화될 필요가 있을 수 있다.
당해 실시예에서 스폰지는 20℃에서 18시간 동안 밀폐된 용기 속에서 글루타르알데하이드 증기에 의해 안정화된 에스. 피오게네스 콜라겐을 동결 건조시켜 제조한다. 당해 시도는 >37℃에서 안정성인 단백질 스폰지를 생성한다. 수축 온도에 있어서의 증가는 안정화 정도에 의존하였지만, ~25℃ 이하에서 초과의 안전성이 수득될 수 있었다. 안정화된 샘플의 열 안정성은 PBS 속에서 차등 주사 열량계(DSC)로 시험하였다.
세포 부착의 평가를 위해, 안정화된, PBS 세척된 CL 샘플을 2시간 동안 MEM 중 120㎍/ml 페니실린 및 200μg/ml 스트렙토마이신으로 처리한 후 1% NEAA 및 10% FCS가 보충된 MEM 중의 샘플당 1 x 104개의 L929 세포를 96 웰 플레이트 속에서 씨딩(seeding)하였다. 부착은 샘플을 PBS 속에서 2회 세척한 후 3시간 및 16시간째에 평가하였다. 세포 생존능을 37℃에서 Live/Dead® 생존능/세포독성 키트(Molecular Probes) 검정을 사용하여 16시간 후 시험하였다.
이들 데이타는, 콜라겐 스폰지 물질이 소 섬유 및 보다 큰 응집물의 혼합물이었음을 나타내었다. L929 세포의 금 부착은 3시간 째에 보다 작은 섬유 및 응집물 둘 다에 대해 관찰되었다. 16시간 후, L929 세포는 Live/Dead™ 검정에서 탁월한 생존능을 나타낸다. 확산 정도는 당해 시점에서 매우 제한적이며, '블랭크 슬레이트(blank slate)' 관찰과 일치한다. GA 안정화된 매트릭스는 약간 자가-형광성이다(도 4).
<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation <120> Purification of triple helical proteins <130> 515030 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thrombin/trypin cleavage site <400> 1 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro 1 5 <210> 2 <211> 978 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 2 atgcatcacc atcaccatca cgctgatgaa caagaagaga aagctaaagt tagaactgaa 60 ttaattcaag agttagctca gggactaggg ggtattgaga aaaaaaattt tccaactcta 120 ggtgatgaag atttagatca tacttatatg acaaagctat taacatacct acaggaacga 180 gaacaagctg agaatagttg gcgaaaaaga ctactaaagg gtatacaaga tcatgccctt 240 gatctggtgc cacgcggtag tcccgggctg ccagggccca gaggggaaca aggaccaaca 300 ggtccaaccg gacctgctgg tccacgaggt ctacaaggtc tacaaggtct acaaggtgaa 360 agaggggaac aaggaccaac aggtcccgct ggtccacgag gtctacaagg tgaaagaggg 420 gaacaaggac caacaggtct cgctggtaaa gccggtgaag ctggagccaa aggcgaaacc 480 ggccccgctg gtccacaggg tccacgtggt gaacaaggcc cgcaaggtct tccaggtaaa 540 gatggtgaag 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gaggggaaca aggaccaaca 300 ggtccaaccg gacctgctgg tccacgaggt ctacaaggtc tacaaggtct acaaggtgaa 360 agaggggaac aaggaccaac aggtcccgct ggtccacgag gtctacaagg tgaaagaggg 420 gaacaaggac caacaggtct cgctggtaaa gccggtgaag ctggagccaa aggcgaaacc 480 ggccccgctg gtccacaggg tccacgtggt gaacaaggcc cgcaaggtct tccaggtaaa 540 gatggtgaag ctggtgctca aggcaggccg ggtaagcggg gtaaacaggg ccagaagggt 600 gaaaaaggag aacctggtac ccaaggcgct aaaggtgatc gcggtgaaac cggtccagta 660 ggtccacgtg gtgagcgagg cgaagccggt cccgctggaa aagatggtga acgtggtttc 720 ccgggtgaga ggggcgtcga gggccaaaac ggccaagatg gtcttccagg taaagacggt 780 aaggacggcc aaaacggtaa agatggtctt ccaggtaaag acggtaagga cggccaaaac 840 ggtaaagatg gtcttccagg taaagacggt aaggacggtc aagatggtaa agacggcctc 900 ccaggtaaag acggtaaaga tggcctccca ggtaaggacg gtaaggacgg tcaaccaggt 960 aaaccgggta aatattaa 978 <210> 26 <211> 325 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 26 Met His His His His His His Ala Asp Glu Gln Glu Glu Lys Ala Lys 1 5 10 15 Val Arg Thr Glu Leu Ile Gln Glu Leu Ala 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Phe 225 230 235 240 Pro Gly Glu Arg Gly Val Glu Gly Gln Asn Gly Gln Asp Gly Leu Pro 245 250 255 Gly Lys Asp Gly Lys Asp Gly Gln Asn Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly 260 265 270 Lys Asp Gly Lys Asp Gly Gln Asn Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly Lys 275 280 285 Asp Gly Lys Asp Gly Gln Asp Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly Lys Asp 290 295 300 Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Lys Asp Gly Gln Pro Gly 305 310 315 320 Lys Pro Gly Lys Tyr 325 <210> 27 <211> 1017 <212> DNA <213> Candidatus solibacter usitatus <400> 27 atgggcccgg cgggcccggc gggcccgcag ggcccggcgg gcccggcggg cgcgcagggc 60 ccggcgggcc cggcgggccc gcagggcccg gcgggcccgc agggcagcgc gggcgcgcag 120 ggcccgaaag gcgataccgg cgcggcgggc ccggcgggcg aagcgggccc gaaaggcgaa 180 accggcgcgg cgggcccgaa aggcgatacc ggcgcggcgg gcccggcggg cccgaaaggc 240 gataccggcg cggcgggccc ggcgggcccg aaaggcgata ccggcgcggc gggcgcgacc 300 ggcccgaaag gcgaaaaagg cgaaaccggc gcggcgggcc cgaaaggcga taaaggcgaa 360 accggcgcgg cgggcccgaa aggcgataaa ggcgaaaccg gcgcggcggg cccgaaaggc 420 gaaaaaggcg aaaccggcgc ggtgggcccg aaaggcgata aaggcgaaac cggcgcggcg 480 ggcccgaaag gcgatcgcgg cgaaaccggc gcggtgggcc cgaaaggcga taaaggcgaa 540 accggcgcgg tgggcccgaa aggcgataaa ggcgaaaccg gcgcgattgg cccgaaaggc 600 gataaaggcg ataaaggcga taaaggcgat gcgggcgtgg cgggcccgca gggcattcag 660 ggcgtgaaag gcgataccgg cctgcagggc ccgaaaggcg atgcgggccc gcagggcgcg 720 ccgggcaccc cgggcggccc gagcattgaa caggtgatgc cgtggctgca tctgattttt 780 gatgcgtatg aagattataa agcgcagcgc gcgcgcgaag cgcgcgaact ggaagaacgc 840 ctggcggcgg aagcgctgga acaggcggcg cgcgaagcgg cggaacgcga agtggcggcg 900 gcgattgaag cggcgaacgc ggaagcggaa attatgctgg atgatgaaac ccatgcggaa 960 ggcggcaaaa aaaaaaaaaa acgcaaacat aaagatcacc accatcacca tcattaa 1017 <210> 28 <211> 338 <212> PRT <213> Candidatus Solibacter usitatus <400> 28 Met Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Ser Ala Gly Ala Gln Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Ala 35 40 45 Ala Gly Pro Ala Gly Glu Ala Gly Pro Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala 50 55 60 Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly 65 70 75 80 Asp Thr Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Ala 85 90 95 Ala Gly Ala Thr Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala 100 105 110 Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Lys Gly 115 120 125 Asp Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Glu 130 135 140 Thr Gly Ala Val Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala 145 150 155 160 Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Ala Val Gly Pro Lys Gly 165 170 175 Asp Lys Gly Glu Thr Gly Ala Val Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu 180 185 190 Thr Gly Ala Ile Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys 195 200 205 Gly Asp Ala Gly Val Ala Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Lys Gly 210 215 220 Asp Thr Gly Leu Gln Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Pro Gln Gly Ala 225 230 235 240 Pro Gly Thr Pro Gly Gly Pro Ser Ile Glu Gln Val Met Pro Trp Leu 245 250 255 His Leu Ile Phe Asp Ala Tyr Glu Asp Tyr Lys Ala Gln Arg Ala Arg 260 265 270 Glu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Arg Leu Ala Ala Glu Ala Leu Glu Gln 275 280 285 Ala Ala Arg Glu Ala Ala Glu Arg Glu Val Ala Ala Ala Ile Glu Ala 290 295 300 Ala Asn Ala Glu Ala Glu Ile Met Leu Asp Asp Glu Thr His Ala Glu 305 310 315 320 Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys His Lys Asp His His His His 325 330 335 His His <210> 29 <211> 860 <212> DNA <213> N. oligospilus <400> 29 ggtaccatat gcgtcaggtt agctatttta tcctggcagc agttgcactg tttgcaattt 60 ttgcagaagc agttccggtt gcaaccccga gcaaaggtag caaaagcggt catggtggtg 120 aaagcggtaa ttatggtcat ggtggccgtg gtggtgatgg ttctgatggt ggtgccggtg 180 gtgttggtgg tggtcgtagc ggtggtagcg gttgggcagg tccgcaaggt ccgcgtggtg 240 cagatggtaa aattggtccg gctggtccgc agggtccttc tggtccggca ggtccaacag 300 gtccggtggg tcctcgtggt gatgcaggtc gtccgggtgc aaccggtgct acaggtccgg 360 atggtccgaa aggtgaattt ggtcctcagg gtccgagcgg tccacgtggt gcaccaggtc 420 cacagggtcc tgcaggtcct accggtcgtg atggtcctaa aggcgcagca ggtccggcag 480 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Gly Ala Thr 100 105 110 Gly Ala Thr Gly Pro Asp Gly Pro Lys Gly Glu Phe Gly Pro Gln Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro 130 135 140 Thr Gly Arg Asp Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Ala Ala 145 150 155 160 Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Glu Thr Gly Asp Arg Gly 165 170 175 Asp Arg Gly Leu Lys Gly Asp Val Gly Ala Gln Gly Gly Lys Gly Ile 180 185 190 Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Gln Thr Gly Pro Asn Gly Leu Pro 195 200 205 Gly Ala Lys Gly Glu Thr Gly Pro Lys Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly 210 215 220 Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Asp Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro 225 230 235 240 Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Lys Asp Ile Ile Ile 245 250 255 Trp Lys Gly Gln Lys Gly Trp Arg Ser Pro Ser Glu Arg Lys Ser Tyr 260 265 270 His His His His His His 275 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ccggaattcg gtgccatggg tgctccaggt gctccaggt 39 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tccccccggg agcacctggt ggacctggtg gac 33 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tccccccggg gatgccggtg gtaaggttga cgctggt 37 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgcggatcca cctggtggac ctggtggacc a 31 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ccgggatccg gtggtaaggg tgacgctggt gctcca 36 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ctccccgcgg ttaaggtggc cctggtggac ctgga 35 <210> 37 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> repeats of a fragment of human type III collagen <400> 37 gactacaagg atgacgatga caaggaattc ggtgccatgg gtgctccagg tgctccaggt 60 ggtaagggtg acgctggtgc tccaggtgaa agaggtccac caggtttggc tggtgctcca 120 ggtttgagag gtggtgctgg tccaccaggt ccagaaggtg gtaagggtgc tgctggtcca 180 ccaggtccac caggtgctcc cggtggtaag ggtgacgctg gtgctccagg tgaaagaggt 240 ccaccaggtt tggctggtgc tccaggtttg agaggtggtg ctggtccacc aggtccagaa 300 ggtggtaagg gtgctgctgg tccaccaggt ccaccaggtg gatccggtgg taagggtgac 360 gctggtgctc caggtgaaag aggtccacca ggtttggctg gtgctccagg tttgagaggt 420 ggtgctggtc caccaggtcc agaaggtggt aagggtgctg ctggtccacc aggtccacca 480 gggccacctt aaccgcggta a 501 <210> 38 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> repeats of a fragment of human type III collagen <400> 38 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Ser Gly Ala Met Gly Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly 20 25 30 Pro Pro Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro 35 40 45 Pro Gly Pro Glu Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro 50 55 60 Gly Ala Pro Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly 65 70 75 80 Pro Pro Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro 85 90 95 Pro Gly Pro Glu Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly 115 120 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tcgtggtctc cctggccccc ctggtgcacc 180 tggtccccaa ggcttccaag gtccccctgg tgagcctggc gagcctggag cttcaggtcc 240 catgggtccc cgaggtcccc caggtccccc tggaaagaat ggagatgatg gggaagctgg 300 aaaacctggt cgtcctggtg agcgtgggcc tcctgggcct cagggtgctc gaggattgcc 360 cggaacagct ggcctccctg gaatgaaggg acacagaggt ttcagtggtt tggatggtgc 420 caagggagat gctggtcctg ctggtcctaa gggtgagcct ggcagccctg gtgaaaatgg 480 agctcctggt cagatgggcc ctaggggcct gcctggtgag agaggtcgcc ctggagcccc 540 tggccctgct ggtgctcgtg gaaatgatgg tgctactggt gctgccgggc cccctggtcc 600 caccggcccc gctggtcctc ctggcttccc tggtgctgtt ggtgctaagg gtgaagctgg 660 tccccaaggg ccccgaggct ctgaaggtcc ccagggtgtg cgtggtgagc ctggcccccc 720 tggccctgct ggtgctgctg gccctgctgg aaaccctggt gctgatggac agcctggtgc 780 taaaggtgcc aatggtgctc ctggtattgc tggtgctcct ggcttccctg gtgcccgagg 840 cccctctgga ccccagggcc ccggcggccc tcctggtccc aagggtaaca gcggtgaacc 900 tggtgctcct ggcagcaaag gagacactgg tgctaaggga gagcctggcc ctgttggtgt 960 tcaaggaccc cctggccctg ctggagagga aggaaagcga ggagctcgag gtgaacccgg 1020 acccactggc ctgcccggac cccctggcga gcgtggtgga cctggtagcc gtggtttccc 1080 tggcgcagat ggtgttgctg gtcccaaggg tcccgctggt gaacgtggtt ctcctggccc 1140 tgctggcccc aaaggatctc ctggtgaagc tggtcgtccc ggtgaagctg gtctgcctgg 1200 tgccaagggt ctgactggaa gccctggcag ccctggtcct gatggcaaaa ctggcccccc 1260 tggtcccgcc ggtcaagatg gtcgccccgg acccccaggc ccacctggtg cccgtggtca 1320 ggctggtgtg atgggattcc ctggacctaa aggtgctgct ggagagcccg gcaaggctgg 1380 agagcgaggt gttcccggac cccctggcgc tgtcggtcct gctggcaaag atggagaggc 1440 tggagctcag ggaccccctg gccctgctgg tcccgctggc gagagaggtg aacaaggccc 1500 tgctggctcc cccggattcc agggtctccc tggtcctgct ggtcctccag gtgaagcagg 1560 caaacctggt gaacagggtg ttcctggaga ccttggcgcc cctggcccct ctggagcaag 1620 aggcgagaga ggtttccctg gcgagcgtgg tgtgcaaggt ccccctggtc ctgctggtcc 1680 ccgaggggcc aacggtgctc ccggcaacga tggtgctaag ggtgatgctg gtgcccctgg 1740 agctcccggt agccagggcg cccctggcct tcagggaatg cctggtgaac gtggtgcagc 1800 tggtcttcca gggcctaagg gtgacagagg tgatgctggt cccaaaggtg ctgatggctc 1860 tcctggcaaa gatggcgtcc gtggtctgac tggccccatt ggtcctcctg gccctgctgg 1920 tgcccctggt gacaagggtg aaagtggtcc cagcggccct gctggtccca ctggagctcg 1980 tggtgccccc ggagaccgtg gtgagcctgg tccccccggc cctgctggct ttgctggccc 2040 ccctggtgct gacggccaac ctggtgctaa aggcgaacct ggtgatgctg gtgctaaagg 2100 cgatgctggt ccccctggcc ctgccggacc cgctggaccc cctggcccca ttggtaatgt 2160 tggtgctcct ggagccaaag gtgctcgcgg cagcgctggt ccccctggtg ctactggttt 2220 ccctggtgct gctggccgag tcggtcctcc tggcccctct ggaaatgctg gaccccctgg 2280 ccctcctggt cctgctggca aagaaggcgg caaaggtccc cgtggtgaga ctggccctgc 2340 tggacgtcct ggtgaagttg gtccccctgg tccccctggc cctgctggcg agaaaggatc 2400 ccctggtgct gatggtcctg ctggtgctcc tggtactccc gggcctcaag gtattgctgg 2460 acagcgtggt gtggtcggcc tgcctggtca gagaggagag agaggcttcc ctggtcttcc 2520 tggcccctct ggtgaacctg gcaaacaagg tccctctgga gcaagtggtg aacgtggtcc 2580 ccctggtccc atgggccccc ctggattggc tggaccccct ggtgaatctg gacgtgaggg 2640 ggctcctggt gccgaaggtt cccctggacg agacggttct cctggcgcca agggtgaccg 2700 tggtgagacc ggccccgctg gaccccctgg tgctcctggt gctcctggtg cccctggtcc 2760 tgtcggtcca gctggaaaga gtggtgacag aggagaaagt ggccctgctg gccctgctgg 2820 tgctcccggt cctgctggtt cccgaggtgc tctggtcctc aaggcccacg tggtgacaaa 2880 ggtgaaacag gtgaacgtgg agctgctggc atcaaaggac atcgaggatt ccctggtaat 2940 ccaggtgccc caggttctcc aggccctgct ggtcagcagg gtgcaatcgg cagtccagga 3000 cctgcaggcc ccagaggacc tgttggaccc agtggacctc ctggcaaaga tggaaccagt 3060 ggacatccag gtcccattgg accaccaggg cctcgaggta acagaggtga aagaggatct 3120 gagggctccc caggccaccc agggcaacca ggccctcctg gcttgctgta cctcctggtg 3180 cccctggtcc ttgctgtgcc ggcttcgact tcagcttcct gccccagcca cctcaagaga 3240 aggctcacga tggtggccgc tactaccggg ctgatgatgc caatgtggtt cgtgaccgtg 3300 acctcgaggt ggacaccacc ctcaagagcc tgagccagca gatcgagaac atccggagcc 3360 cagagggcag ccgcaagaac cccgcccgca cctgccgtga cctcaagatg tgccactctg 3420 actggaagag tggagagtac tggattgacc ccaaccaagg ctgcaacctg gatgccatca 3480 aagtcttctg caacatggag actggtgaga cctgcgtgta ccccactcag cccagtgtgg 3540 cccagaagaa ctggtacatc agcaagaacc ccaaggacaa gaggcatgtc tggttcggcg 3600 agagcatgac cgatggattc cagttcgagt atggcggcca gggctccgac cctgccgatg 3660 tggccatcca gctgaccttc ctgcgcctga tgccaccgag gcctcccaga acatcaccta 3720 ccactgcaag aacagcgtgg cctacatgga ccagcagact ggcaacctca agaaggccct 3780 gctcctccag ggctccaacg agatcgagat ccgcgccgag ggcaacagcc gcttcaccta 3840 cagcgtcact gtcgatggct gcacgagtca caccggagcc tggggcaaga cagtgattga 3900 atacaaaacc accaagacct cccgcctgcc catcatcgat gtggccccct tggacgttgg 3960 tgccccagac caggaattcg gcttcgacgt tggccctgtc tgcttcctgt aagtcgac 4018 <210> 42 <211> 1500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimera of Methylobacterium sp. and S usitatus <400> 42 catatgggtg aagcagcacc ggcaccggca gcaccgaaac ctgaagcacc gcgtggtgca 60 gcacgtaaac cggcaagcag cgcaattcag atttgggatg cacgtattga aggtggtgat 120 ctgcgtatta gcggtaatgt tggtaaagcc ggtgttaccg ttagcctgga tgatgaagtt 180 gcagttcaga gcgatcgtcg tggtcgtttt gcaattaaag ttccgtatgt tccgcagacc 240 tgtgttgcaa ccctgaccgc aggcgaagaa agccgtgaag ttgccgttgc aaattgtgca 300 ccgcagcgtg caggtcagcc tggtccggca ggtcaaccgg gtcctacagg tccgcagggt 360 gttgccggtc tgccaggtcc gaaaggtgat ccgggtccgc aaggtcctgc gggtcctaaa 420 ggcgaaccgg gaccaaaagg tgaacctggt ccgaaaggcg agcctggccc taaaggtgag 480 ccagggccaa aaggcgaacc aggtcctaaa ggtgaaccag gccctaaagg tgagcctgga 540 ccgaaaggtg aaccgggacc tcgtggtgaa gccggtcctc agggtgcact gggaccgaaa 600 ggcgaagcag gtagccgtgg tgaaccaggt ccgcgtggcg aaccaggccc aaaaggcgag 660 gcaggtctgg caggcgcacc tggacctaaa ggcgaagccg gtccgcgtgg tccgcagggc 720 gaacgtggtc ctcctggtgc tccgggtgca gcaggtccgg ctggtcctgc aggtccgcag 780 ggtccagccg gtccagctgg tgcacaaggt ccagcaggcc ctgccggtcc tcaaggtcct 840 gctggcccac agggtagtgc cggtgcccag ggtccgaaag gtgataccgg tgcagcaggt 900 cctgcgggtg aagcgggtcc taaaggcgaa acaggcgcag cgggaccaaa aggtgacact 960 ggcgctgcgg gtccggcagg accgaaaggc gacacaggtg ctgcaggccc agcaggtcca 1020 aaaggcgata cgggtgccgc tggtgcaaca ggccctaaag gtgagaaagg tgaaacaggt 1080 gcggctggtc 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Ala Gly Glu Glu Ser Arg Glu Val Ala Val 85 90 95 Ala Asn Cys Ala Pro Gln Arg Ala Gly Gln Pro Gly Pro Ala Gly Gln 100 105 110 Pro Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys 115 120 125 Gly Asp Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly 130 135 140 Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu 145 150 155 160 Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Lys 165 170 175 Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly 180 185 190 Pro Gln Gly Ala Leu Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Ser Arg Gly Glu 195 200 205 Pro Gly Pro Arg Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Leu Ala 210 215 220 Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Pro Arg Gly Pro Gln Gly 225 230 235 240 Glu Arg Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro 245 250 255 Ala Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gln Gly Pro Ala 260 265 270 Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Ser Ala Gly 275 280 285 Ala Gln Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Glu 290 295 300 Ala Gly Pro Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Lys Gly Asp Thr 305 310 315 320 Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Ala Ala Gly 325 330 335 Pro Ala Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Pro 340 345 350 Lys Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Lys Gly Asp Lys 355 360 365 Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly 370 375 380 Ala Ala Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Val Gly Pro 385 390 395 400 Lys Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Lys Gly Asp Arg 405 410 415 Gly Glu Thr Gly Ala Val Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly 420 425 430 Ala Val Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Ala Ile Gly Pro 435 440 445 Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Lys Gly Asp Ala Gly Val Ala 450 455 460 Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Lys Gly Asp Thr Gly Leu Gln Gly 465 470 475 480 Pro Lys Gly Asp Ala Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gly 485 490 495 Gly Val Asp

Claims (27)

  1. (i) 삼중-나선 단백질로부터의 숙주 세포 물질을 산성 조건 하에 및 삼중-나선 단백질이 열적으로 안정하게 남아있는 온도에서 침전시키는 단계에 이어서;
    (ii) 침전된 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물 속에 존재하는 숙주 세포 물질을 프로테아제를 첨가하여 분해시키는 단계(여기서, 삼중-나선 단백질은 프로테아제에 대해 내성이다); 및
    (iil) 정제된 삼중-나선 단백질을 수집하는 단계를 포함하고;
    여기서 상기 삼중-나선 단백질은 적어도 단계 (i) 및 (ii) 전체에서 가용성으로 남는, 비-포유동물 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물내에 함유된 재조합적으로 발현된 삼중-나선 단백질의 정제 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 삼중-나선 단백질이 단계 (i) 내지 (iii) 전체에서 가용성으로 남는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 분해가 산 프로테아제를 사용하여 수행되는 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균, 효모 또는 식물 숙주 세포인 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 한 항에 있어서, 산 조건이 pH 7 미만을 언급하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 침전 단계가 삼중-나선 단백질의 용융 온도 미만인 온도에서 수행되는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 한 항에 있어서, 침전 단계와, 침전된 숙주 세포 물질로부터의 삼중-나선 단백질을 물리적으로 분리하는 분해 단계 사이에 추가의 분리 단계를 포함하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 중간 분리 단계가 하나 이상의 원심분리, 여과, 교차 유동 여과, 또는 침강으로부터 선택되는 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 발현된 삼중-나선 단백질이 숙주 세포내에서 세포내적으로 생산되는 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 발현된 삼중-나선 단백질이 숙주 세포로부터 분비되는 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 있어서, 삼중-나선 단백질을 함유하는 숙주 세포 배양 추출물 또는 균질물을 생산하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중의 어느 한 항에 있어서, 재조합체 삼중-나선 단백질의 용융 온도(Tm)에서 수행되는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 온도가 재조합체 삼중-나선 단백질의 Tm의 적어도 10℃ 이하인 방법.
  14. 청구항 5에 있어서, 상기 pH가 2 내지 4이고 상기 숙주 세포가 세균 숙주 세포인 방법.
  15. 청구항 5에 있어서, 상기 pH가 4 내지 6이고 상기 숙주 세포가 효모 숙주 세포인 방법.
  16. 청구항 5에 있어서, 상기 pH가 2 내지 4.5이고 상기 숙주 세포가 식물 숙주 세포인 방법.
  17. 청구항 3 내지 청구항 16 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중-나선 단백질이 단백질분해적으로 안정한 방법.
  18. 청구항 3 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질분해적으로 불안정한 단백질보다 단백질분해적으로 안정한 단백질을 선택적으로 정제하는 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 핵산이 수집된 삼중-나선 단백질로부터 제거되는 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중-나선 단백질의 침전이 황산암모늄의 첨가에 의해, pH의 조절 또는 온도의 조절에 의해, 및/또는 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)의 사용에 의해 달성되는 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 수집된 삼중-나선 단백질이 안정화제에 의해 안정화되는 방법.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중-나선 단백질이 반복된 (Gly-X-Y)n(여기서, n은 5 내지 600이다) 모티프를 포함하는 방법.
  23. 청구항 1 내지 청구항 22 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중-나선 단백질이 콜라겐인 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 23 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중-나선 단백질 서열이 세균 효모, 식물, 곤충, 또는 누에로부터 기원하는 방법.
  25. 청구항 1 내지 청구항 24 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 정제된 삼중-나선 단백질.
  26. 청구항 1 내지 청구항 24 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 정제된 삼중-나선 단백질.
  27. 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 열적 또는 화학적 변성에 의해 젤라틴으로 전환되는 삼중-나선 단백질.
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