JPH0823979A - ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明の目的は、精製分離の容易な、生体内に
存するのと同一の３本鎖構造を持つヒト・コラーゲンタ
ンパク質を製造する方法およびそれに使用する発現ベク
ターを提供することにある。 【構成】ヒト・コラーゲン遺伝子を挿入して作製される
組換えウイルスであって、コラーゲン分子中のプロリン
を水酸化する能力を備えた昆虫細胞に対して感染力を有
する発現ベクターである。また該発現ベクターを、コラ
ーゲン分子中のプロリン残基を水酸化する能力を有する
昆虫細胞に感染させることにより、ヒト生体内に存する
のと同等な３本鎖構造を有するコラーゲン分子を該細胞
に生産させることを特徴とするヒト・コラーゲンの製造
方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・コラーゲンの製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンは生体タンパク質としては最
も存在量の多いタンパク質であり、生体組織・器官の構
造維持など、生体において重要な機能を担っていること
は良く知られているところである。このことからコラー
ゲンは生体の損傷を修復するための生物素材（バイオマ
テリアル）として有用なものであると考えられている。
例えばバイオマテリアルとしてコラーゲンは、熱傷など
の皮膚損傷部位の被覆材として用いられ、治癒改善が報
告されている（Surg. Forum ,10,303(1960)，J. Surg.
Res., 10,485-491(1960)）。コラーゲンはこの様な移植
用の代用皮膚として利用されるばかりでなく、経口摂取
する事により関節リューマチが抑制されるという用途へ
の可能性（II型コラーゲン）（Lancet, 342,799(1993)
および Science, 261,1727-1730(1993)）なども指摘さ
れている。また、細胞や器官の培養技術においても有用
な素材として利用されている。このようなバイオマテリ
アルとしてのコラーゲンの原材料としてはこれまで主に
ブタ、ウシなどの大型動物の皮革が用いられてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】コラーゲンは生体移植
用のバイオマテリアルとして有用な物質であるが、従来
用いられているコラーゲンはブタ・ウシなどヒト以外の
大型動物由来のものである。コラーゲンは免疫原性の低
いタンパク質ではあるが、異種動物のコラーゲンをヒト
生体内に移植、埋入あるいは投与した場合には免疫反応
が低頻度ながら惹起されると報告されている（J.Immuno
l. 136,877-882(1986)，Biomaterials 11,176-180(199
0)）。従って人体に直接適用するバイオマテリアルとし
ては、ヒト由来のコラーゲンを用いることが望ましいと
考えられる。しかしながら、コラーゲンを直接ヒト組織
から得ることには以下のような問題が指摘される。まず
第一にヒト組織を扱うという倫理的な問題がある。また
その問題が解決されたとしても、直接ヒト生体組織から
コラーゲンを大量に得ることは容易ではなく、さらに得
られたコラーゲンはその分子間に様々な架橋結合などの
修飾が見られるため、精製操作が煩雑であるという問題
点がある。

【０００４】上記の問題を解決する手段として遺伝子工
学的手法によるコラーゲン製造法が可能であると推定さ
れるが、これまでに報告された例は少ない。その理由と
しては以下の様なことが推定される。第一にコラーゲン
は分子量が１０万を超える分子であって、通常高分子で
あるほど外来遺伝子を宿主細胞に導入するための発現ベ
クターの作製が煩雑となり、また生産量としても低いと
言われていること。第二にタンパク質の構造の問題が指
摘される。コラーゲンは繊維状分子であり、しかも３本
のポリペプチド鎖が会合して「らせん」構造をとってい
る。このような構造は遺伝子から翻訳された一次産物が
さらに複数の修飾を受けることによって形成されるが
（N.Engl.J. Med. 311, 376-386(1984)）、コラーゲン
を修飾する反応を行う能力は、どのような細胞にも備わ
っているとは推定されない。従って、これまでに報告さ
れた例では、動物体における主要なコラーゲン生産細胞
である線維芽細胞あるいはそれに類似した性質を持つ細
胞を宿主として用いることが遺伝子組み換え技術による
コラーゲンの生産には適切であると考えられている。例
えばSchniekeらは（Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 84,764-7
68(1987))マウス繊維芽細胞Mov13株を宿主としてヒトI
型α１鎖の遺伝子を導入し、その遺伝子産物を生産させ
ることに成功している。そして合成されたコラーゲン分
子は生体内の分子と同様３本鎖「らせん」構造をとって
いることが示された。

【０００５】しかしこの例において得られるコラーゲン
は分子構造としては正常であるが、ヒト、マウスそれぞ
れのコラーゲン遺伝子産物からなるハイブリッドのコラ
ーゲン分子であった。またV型α１コラーゲンを生産し
ているハムスター肺細胞を宿主として、ヒトV型α２コ
ラーゲンを生産した例も報告されているが（J.Biol.Che
m. 264, 20683-20687(1989)）この例においても得られ
たコラーゲンは、α１鎖がハムスター由来で、α２鎖が
ヒト由来であるハイブリッド分子であった。純粋にヒト
由来のコラーゲン分子から構成される３本鎖分子を生産
した例としては、I型コラーゲンについてはGeddisらの
報告がある（Matrix, 13,399-405(1990)）。彼らはヒト
線維芽肉腫細胞HT1080株を宿主として、ヒトI型α1遺伝
子発現ベクターを導入し、ヒトI型コラーゲンタンパク
質を３本鎖構造をもつ分子として生産出来ることを報告
した。ここに得られたコラーゲン分子は純粋にヒト型で
あるが、この分子は生体内では希にしか見られないI型
α１鎖の３本鎖であって、正常な生体内に見られるα１
鎖２分子とα２鎖１分子からなるI型３本鎖分子とは異
なる。

【０００６】II型コラーゲンについてはFertalaらが同
じくHT1080細胞を宿主とし、ヒトII型α１遺伝子を導入
した例を報告している(Biochem.J. 298, 31-37(199
4)）。この例においては生産された組換えコラーゲンは
３本鎖構造を取っておりしかも、「らせん」構造が形成
され、その安定性も生体内に見られるのと同様の特性を
備えている。さらにこの報告では培養液１ｌあたり０．
５〜１ｍｇという従来の生産量をはるかに超える生産量
が達成されている。しかしながら、以上の２例で用いら
れている宿主HT1080細胞は、本来IV型コラーゲンを合成
しており、導入した遺伝子由来のII型コラーゲンを、内
在性のIV型コラーゲンから分離精製する必要がある。

【０００７】以上の如くこれまでに、３本鎖構造をもつ
ヒトコラーゲンを遺伝子組換えで製造する手法として
は、線維芽細胞などのコラーゲン生産細胞を宿主とする
方法により達成されているが、その方法においては宿主
細胞に由来する内在性コラーゲンと導入された遺伝子に
よって合成されるコラーゲンとが共存する事になり、そ
れらを分離する操作が必要となるという問題点が指摘さ
れる。これに対して導入したコラーゲン遺伝子を優先的
に発現させ、宿主細胞において選択的にヒトコラーゲン
を生産させるというコラーゲンの製造方法についてはこ
れまでに知見がない。よって、本発明の課題は、コラー
ゲン遺伝子を導入した宿主細胞において、導入遺伝子に
由来するヒトコラーゲンタンパク質のみが選択的に合成
され、かつ天然型に近い分子構造をもつ分子として生成
されるよう製造する方法を開発する事にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め種々検討した結果、線維芽細胞などのコラーゲン生産
細胞に見られるコラーゲンタンパク質分子に対する翻訳
後修飾機能と類似の機能が備わっている昆虫細胞を見い
だし、この細胞を宿主として、コラーゲン遺伝子を組み
込んだウイルス発現ベクターを感染させることにより、
３本鎖構造をもつヒト型コラーゲンを製造させる方法を
考案し、本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明の要旨は上記の発現ベクター
を用いて、コラーゲンの翻訳後修飾機能の一つであるプ
ロリン水酸化酵素活性を有する昆虫細胞に、このベクタ
ーを感染させ、次のような特性〜、即ちバクテリ
アコラーゲナーゼに対して感受性である、３本鎖分子
である、ペプシンに耐性なポリペプチド配列を有す
る、３本鎖分子間に共有結合性の架橋結合を有しな
い、を備えたタンパク質分子を生成させることにあり、
以下の１）〜７）の手段のいずれかによって達成され
る。

【００１０】１） 宿主にヒト・コラーゲン産生能を与
える発現ベクターであって、コラーゲン分子中のプロリ
ン残基を水酸化する能力を備えた昆虫細胞に対し感染可
能なウイルスＤＮＡ配列と、ヒト・コラーゲンｃＤＮＡ
とを共に有するヒト・コラーゲン発現ベクター。 ２） 上記宿主がＳｆ９細胞である１）に記載のヒト・
コラーゲン発現ベクター。 ３） 上記宿主がＴＮ５細胞である１）に記載のヒト・
コラーゲン発現ベクター。 ４） 上記ウイルスがバキュロウイルスである１）〜
３）のいずれかに記載のヒト・コラーゲン発現ベクタ
ー。 ５） 上記ヒト・コラーゲンがIII型コラーゲンである
１〜４）のいずれかに記載のヒト・コラーゲン発現ベク
ター。

【００１１】６） 上記１）に記載の発現ベクターを、
コラーゲン分子中のプロリン残基を水酸化する能力を有
する昆虫細胞に感染させることにより、タンパク質を生
産させるヒト・コラーゲンの製造方法。 ７） 上記６）に記載のタンパク質が以下の特性〜
を有するヒト・コラーゲンの製造方法。 バクテリアコラゲナーゼによって消化される ３本のポリペプチド鎖が会合した３本鎖分子である ３本鎖分子内に、ペプシンに耐性のポリペプチド部分
を有する ３本鎖分子間に共有結合性の架橋構造を有しない

【００１２】以下に本発明を詳しく説明する。 Ａ．宿主細胞の選択 生体内のコラーゲンは一つ、また二つのコラーゲン遺伝
子の産物であるポリペプチドが３分子会合しかつ互いに
巻き付いてその分子内に「らせん」構造を有する、３本
鎖を単位分子とするタンパク質として生体内に存在す
る。この分子内の「らせん」構造は３本鎖分子としての
安定性を高めている。すなわち、「らせん」構造部分は
タンパク質分解酵素であるペプシン、トリプシン、キモ
トリプシンによって分解されない。そしてこの３本鎖分
子はコラゲナーゼによってのみ特異的に酵素消化され
る。昆虫Spodoptera frugiperda由来の細胞であるＳｆ
９株及びTrichoplusia ni由来の細胞ＴＮ５株について
検討した結果、これらの細胞がコラーゲンを製造するた
めの宿主細胞として適切であることが明かとなった。即
ち本発明者らは、これらの細胞がコラーゲン分子中のプ
ロリン残基を水酸化してヒドロキシプロリンに変換する
能力を持つことを明らかにした。この反応は、コラーゲ
ン３本鎖分子の形成ならびにその内部に形成される「ら
せん」構造の安定化に寄与していると言われており、プ
ロリン水酸化酵素（proryl-4-hydroxylase）という酵素
によって行われる。

【００１３】プロリンを水酸化する酵素の活性は、次の
ような状態のコラーゲン分子、即ち ³Ｈ−プロリンで標
識され、かつそのプロリン残基が水酸化されていないコ
ラーゲン分子を基質として反応させ、その結果生成され
る³Ｈ₂０を測定することによって示すことができる。上
記の方法によって測定した結果、昆虫細胞Ｓｆ９株およ
びＴＮ５株は、プロリン水酸化酵素の活性を有している
ことが示され、コラーゲン分子を遺伝子工学的手法によ
り製造させるための宿主細胞として適切であることが明
かとなった。

【００１４】Ｓｆ９細胞ならびにＴＮ５細胞は、バキュ
ロウイルウスの宿主細胞として広く用いられている細胞
である。しかしながらこれらの細胞が、コラーゲン分子
の修飾反応を行う機能を有することについてはこれまで
に知見されていなかった。よって本発明においてこれら
の昆虫細胞を用いることは、バキュロウイルスの宿主と
して適切であるという公知の事実に立脚するものではな
く、コラーゲンを合成させる為に好適な宿主であるとい
う未知の事象を解明した事によって成立する概念であ
る。従って、本発明において用いられる宿主は上記した
Ｓｆ９およびＴＮ５細胞に限られるものではなく、コラ
ーゲン分子のプロリン残基を水酸化する能力を持つ細胞
であればどのような細胞でも良い。

【００１５】Ｂ．組換ウイルスの作製方法 本発明において、コラーゲン遺伝子を有する発現ベクタ
ーを作製するために用いるウイルスは、上記のプロリン
水酸化酵素活性を有する細胞に対して感染力を持つウイ
ルスであれば、それらを用いることができる。その一例
として、例えばバキュロウイルス（Baculoviridae）に
属するAutographa californica nuclearpolyhedrosis v
irus; ＡｃＭＮＰＶ）は上記酵素活性を有するＳｆ９細
胞ならびにＴＮ５細胞に感染する能力を持つため、発現
ベクターを作製するためのウイルスとして本発明のコラ
ーゲンの製造法に用いることができる。バキュロウイル
スとしてはこの他にBombyx mori nuclear polyhedorsis
virusなども利用することが出来ると考えられる。

【００１６】バキュロウイルスをベクターとする遺伝子
組み換え技術は近年盛んに研究され、真核生物のタンパ
ク質を大量に製造する系として非常に有用であるとされ
ている（Mol.Cell Biol. 3, 2156-2165(1983)）。コラ
ーゲン遺伝子を有するウイルス発現ベクターを作製する
方法は、例えばＡｃＭＮＰＶを用いて以下のように行う
ことができる。即ち、ＡｃＭＮＰＶの構造遺伝子である
ポリヘドリン遺伝子配列の全てまたはその一部と適切な
ウイルス遺伝子のプロモーター配列をともに有するプラ
スミドに、常法に従いそのプロモーター直下に転写方向
をそろえてヒトコラーゲン遺伝子ｃＤＮＡ配列を挿入す
る。ここに作製された組換えプラスミドはトランスファ
ーベクターと称される。トランスファーベクターのＤＮ
Ａと野生型バキュロウイルスＤＮＡを同時に遺伝子導入
法（トランスフェクション）によってＳｆ９細胞あるい
はＴＮ５細胞に導入することができる。

【００１７】トランスファーベクターＤＮＡとウイルス
ＤＮＡは、それらが導入された細胞内においてそれぞれ
が有するポリヘドリン遺伝子配列間で相同組み換えを引
き起こすことができ、結果としてウイルスＤＮＡにコラ
ーゲン遺伝子配列が挿入された組み換えウイルス、即ち
コラーゲン発現ベクターが生成される。この組み換えウ
イルスにおいてはコラーゲン遺伝子が挿入されたことに
よってポリヘドリン遺伝子は分断され、ポリヘドリンタ
ンパク質を合成する能力を失うが、ポリヘドリンタンパ
ク質はウイルスの感染能力には関与しないため、得られ
た組換えウイルスは、野生型ウイルスが感染できる細胞
に対しては同じように感染させることができる。

【００１８】コラーゲンには十数種類の型が知られてお
り、それらをコードする遺伝子はそれぞれクローニング
され、塩基配列が解明されている（「Connective Tissu
e and Its Heritable Disorders」 pp145-165, Weily-L
iss Inc.発行(1992)）。そして、これらの遺伝子はいず
れも通常の遺伝子組換え技術（例えば「Molecular Clon
ing」第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press発
行(1989)）によって上記のトランスファーベクターを作
製することが可能であり、かつ組換ウイルスを取得する
ことが可能であるので、本発明で用いるコラーゲン遺伝
子はこれらのクローニングされたコラーゲン遺伝子のど
れであってもよい。なお、以上のような組み換えウイル
スの作製方法については、コラーゲン遺伝子以外の種々
な遺伝子について、その方法がすでに報告されており
（例えば 「Baculovirus Expression Vetors」 W.H.Fre
eman and Company発行(1992)）、本発明においても原理
的に同様の方法を用いている。

【００１９】Ｃ．コラーゲンの生産と産物の特性解析 上記の組換えウイルス発現ベクターが感染した細胞にお
いてコラーゲンが組換えタンパク質として合成されてい
ることは以下の（１）、（２）によって調べることがで
きる。 （１）発現ベクターによるコラーゲン産物の確認 ヒトおよび動物体内のコラーゲンは通常ペプシン処理等
によって３本鎖分子間の架橋結合を破壊する事によって
可溶化され抽出される。この操作によって抽出されるコ
ラーゲンには次の主に４種類の分子状態のコラーゲンが
認められる。

【００２０】即ち、 分子間の架橋結合が一部残存するために３本鎖分子を
単位とする分子が２分子以上結合した高分子。その分子
量は３００ＫＤａ以上である。 γコラーゲン：分子内のペプシンに耐性な領域である
「らせん」構造に対応する分子で、アテロコラーゲンと
も称される分子。プロコラーゲン３本鎖分子からプロペ
プチドおよびテロペプチド配列が分解除去された構造に
等しい（分子量約３００ＫＤａ）。 αコラーゲン：上記の分子が単量体に解離した分子
（分子量約１００ＫＤａ）。 βコラーゲン：上記の分子の２量体（分子量約２０
０ＫＤａ）。 の４種類である。

【００２１】コラーゲンはＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Nature, 227, 680-685(1970)）において
は、分子量通りには泳動されないため、上記の分子種を
含む生体から抽出されたコラーゲンをマーカーとして同
時に泳動し、上記の分子のそれぞれの移動度との比較か
ら発現ベクターによって生産される組換えコラーゲンの
分子量およびその会合状態を同定する。コラーゲン発現
ベクターを感染させた宿主細胞およびコラーゲン遺伝子
が挿入されていない野生型ウイルスを感染させた宿主細
胞を約２日培養した後、それぞれの細胞から抽出される
タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によ
って解析した。その結果、還元状態（メルカプトエタノ
ール存在下）で電気泳動を行った場合には、発現ベクタ
ーを感染させた細胞に分子量約１５０ＫＤａのタンパク
質が認められた。このタンパク質は野生型ウイルスの感
染細胞には認められないことから、導入したコラーゲン
遺伝子に由来することが明らかである。またこのタンパ
ク質はその分子量からプロコラーゲンであると考えられ
る。

【００２２】これらのコラーゲンと推定される分子は細
胞内、および細胞外の培養液中何れにも検出される。さ
らに、これらのタンパク質試料を電気泳動後、Matsudai
raらの方法（J Biol. Chem. 261, 10035-10038(1987)）
に従ってナイロン膜あるいはニトロセルロース膜に転写
し、抗コラーゲン抗体との反応性を調べることができ
る。そして、上記の分子量１５０ＫＤａの分子はこの抗
体と特異的に結合することが示される（４図Ｂ参照）。

【００２３】（２）コラーゲナーゼ感受性 上記（１）のタンパク質試料をバクテリアコラーゲナー
ゼで処理し、コラーゲナーゼに対する感受性を調べるこ
とが出来る。その結果、上記（１）において発現ベクタ
ーによって導入されたコラーゲン遺伝子に由来すると推
定される分子量１５０ＫＤａの分子は、コラーゲナーゼ
処理によって消化されるタンパク質であることが示され
る。以上（１）、（２）の結果によって、本発明の発現
ベクターは宿主細胞にヒト・コラーゲンを合成させる能
力を有することが示される。さらに発現ベクターによっ
て生産された組換えコラーゲン産物の中に、「らせん」
構造を有する３本鎖分子が存在することは以下の（３）
のようにして調べることができる。

【００２４】（３）ペプシン処理 上記（１）のタンパク質試料を酸性条件下にてペプシン
消化し、ペプシン耐性な構造を有するかを調べることに
より、このタンパク質試料に３本鎖分子が存在している
ことを示すことができる。即ち、ペプシン処理を施した
タンパク質試料を、非還元および還元条件下のＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、上
記（１）のタンパク質試料にはペプシン処理前に非還元
状態で分子量が４５０ＫＤａである分子が認められ、こ
の分子はペプシン処理後消失し、新たに分子量約３００
ＫＤａの分子が出現する。この分子量約３００ＫＤａの
分子はラットのγコラーゲンと電気泳動度が一致した。
また還元条件下ではこの分子量３００ＫＤａの分子は解
離しており、分子量約１００ＫＤａの分子のみが検出さ
れた。即ちこの結果はペプシン処理前に検出される分子
量約４５０ＫＤａの分子はプロコラーゲン３本鎖分子で
あって、その内部にペプシン耐性な領域、即ち３重「ら
せん」構造を有していることを示す（図６参照）。以上
の結果から、本発明の発現ベクターは、宿主細胞におい
て生体内に見られるのと同等な特性即ち、３本鎖分子で
あってその内部にペプシン耐性な「らせん」構造を有す
るコラーゲンを合成させる能力を持つことが示される。

【００２５】（４）組換えコラーゲンが生体内に見られ
るような３本鎖分子間に共有結合的な架橋構造を有しな
い事は以下の結果によって示される。即ち、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動においては、ラット組織か
ら抽出された架橋を有するコラーゲン分子に相当する分
子は、発現ベクターを感染させた細胞からは検出されな
かった（図７参照）。

【００２６】Ｄ．組換えコラーゲンの精製方法 本発明で用いられるＳｆ９細胞あるいはＴＮ５細胞は、
懸濁培養することにより大量培養化が可能である。例え
ば、２×１０⁸ないし２×１０⁹個のＳｆ９細胞を発現ベ
クターに感染させた後、１００ｍｌ〜１ｌの培養液でス
ピナーフラスコで培養することが可能である。これを適
当な時間培養した後、細胞を集めタンパク質を大量に抽
出することが出来る。

【００２７】前項（３）に記載のとおり、発現ベクター
を感染させた宿主細胞においては、「らせん」構造を有
する３本鎖コラーゲン分子が合成されているが、同時に
正常な３本鎖分子を形成しなかったコラーゲンも存在し
た。即ち、例えば図６のＢに示すようにペプシン処理後
その非還元条件下における分子量が約１００ＫＤａであ
る分子が認められる。この分子はペプシン耐性ではある
が正常な３本鎖コラーゲンとは異なり、非還元条件下に
おいても解離しており正常な「らせん」構造を持たない
分子と推定される。本発明が目的とする「らせん」構造
を有する３本鎖コラーゲン分子は、それ以外の状態のコ
ラーゲン分子から以下の原理に従って簡単に分離精製す
ることが出来る。即ち、生体内と同等の「らせん」構造
を有する分子はペプシンに耐性であるが、３重「らせ
ん」構造を有しない分子はペプシンによって消化される
ため、正常な３本鎖分子以外のコラーゲン分子は分解除
去することができる。この処理は同時にコラーゲン以外
の細胞タンパク質も分解除去する。さらに正常な３本鎖
分子は適当な塩濃度では３本鎖分子同士が集合して繊維
化する能力を有する。以上の性質を利用して、発現ベク
ター感染細胞から抽出された全タンパク質をはじめに直
接ペプシン処理し非コラーゲン性タンパク質を分解除去
するとともに、「らせん」構造を有しないコラーゲンも
分解除去する。

【００２８】ついでこの試料溶液を適当な塩濃度溶液に
変え、これによって３本鎖コラーゲンを繊維化させる。
これを遠心分離操作によって沈澱物として回収する。さ
らにこの沈澱を酸性溶液に溶かした後、中性緩衝液に対
して透析することによって再び３本鎖コラーゲンを繊維
化させ沈澱させることができる。そして以上の溶解・繊
維化・沈澱の操作をさらに繰り返すことによって、ペプ
シンに耐性な３重「らせん」構造を有するアテロコラー
ゲンを高度に純化することができる。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明する。 Ａ．宿主細胞のプロリン水酸化酵素活性の測定 （１）酵素活性測定用基質の調製 Kivirikkoらの方法（Methods in Enzymology, 82,245-3
04(1982)）に従って、ニワトリ１６日胚（６６個）より
頭蓋骨を摘出し、これを終濃度で０．３Ｍのα,α’−
ジピリジル（和光純薬）を含む２０ｍｌのModified Kre
bs' Medium(15.7mM Na₂HPO₄/1.6mM KH₂PO₄/111.2mM NaC
l/5.4mM KCl/1.3mM MgCl₂/4.0mM NaHCO₃/13.0mM glucos
e, pH7.4)を培養液として３０分間培養し、Ｌ-[4-³H]pr
oline（アマシャム社）０．５ｍＣｉを添加し、さらに
４時間培養した。培養された上記頭蓋骨から基質コラー
ゲンは以下の様に抽出された。

【００３０】頭蓋骨をＥＤＴＡとソイビーントリプシ
ンインヒビターをそれぞれ終濃度で１ｍＭおよび０．０
１％含む０．１Ｍ酢酸にいれポリトロンにて破砕し、さ
らにこれを４℃で２４時間撹拌して、コラーゲンを抽出
した。 次に上記の抽出液を０．１Ｍ酢酸に対して透析したの
ち、不溶性物質を遠心分離で除去し、さらに０．４ＭＮ
ａＣｌ／０．１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対
して４℃で透析した。 上記の液に硫酸アンモニウムを液量１ｍｌ当たり１
６６．７ｍｇ加えて溶解し３０％飽和とし、４℃で２４
時間静置したのち、１２，０００ｇ３０分遠心して、コ
ラーゲンを沈澱として回収した。 上記の沈澱物を０．２ＭＮａＣｌ／５０ｍＭＴｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に懸濁し、同組成の溶液に対
して透析した後、３７℃で１．５時間静置した。プロリ
ン残基が既に水酸化されているコラーゲンはこの操作に
よって繊維化するため、これを遠心して除去した。以上
の操作によって、プロリンが³Ｈによって標識され、か
つ水酸化されていないコラーゲン基質溶液が得られた。

【００３１】（２）細胞抽出液の調製 １×１０⁷個の昆虫細胞Ｓｆ９を牛胎児血清およびアス
コルビン酸それぞれを終濃度で１０％および５０μg／
ｍｌ含むグレース培養液（ギブコ社）中に２８℃で２４
時間培養した。また６．６×１０⁶個のヒト皮膚線維芽
細胞を牛胎児血清を１０％、およびアスコルビン酸を５
０μg／ｍｌ含むイーグルＭＥＭ（ギブコ社）中に３７
℃で１６時間培養した。これらの細胞を１０００ｇ１５
分の遠心によって集め、それぞれを氷冷した細胞溶解液
（０．２Ｍ ＮａＣｌ／ ０．１Ｍグリシン／５０μMジ
チオスレイトール／０．０１％ソイビーントリプシンイ
ンヒビター／２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５））に懸濁した。この懸濁液の凍結溶解操作を３回繰
りかえした後、この懸濁液を２５０ｇ６分間遠心した。
その上清１容積に対し上記の細胞溶解液を１９容積加え
たものを酵素活性測定用の細胞抽出液とした。この抽出
液のタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ法によって求めた。

【００３２】（３）水酸化酵素活性の測定：下表１に示
す溶液を表記の通り混合し、３７℃で酵素反応を行っ
た。

【００３３】 表 １ 蒸留水 ８８０μl Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８） １００μl ウシ血清アルブミン（２０ｍｇ／ｍｌ） ２００μl カタラーゼ １００μl ２ｍＭジチオスレイトール １００μl ２０ｍＭアスコルビン酸 ２００μl １ｍＭ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １００μl 細胞抽出液（上記（２）） ２００μl 基質コラーゲン溶液（上記（１）） ２０μl １０ｍＭ α−ケトグルタル酸 １００μl 計 ２ｍｌ

【００３４】３０分後、トリクロロ酢酸を終濃度で５％
となるように加え反応を停止させた。これを４℃で４時
間おいた後、１０００ｇ５分間遠心し上清を回収した。
この上清をあらかじめ５％ＴＣＡで平衡化したＤｏｗｅ
ｘカラム（ＡＧ５０Ｗ Ｘ８,200-400mesh、Ｈ+form）
にかけ、素通りで溶出される³Ｈ₂Ｏの放射活性を測定し
た。その結果Ｓｆ９細胞は０．６３×１０⁶ｃｐｍ／ｍ
ｇ ｐｒｏｔｅｉｎのプロリン水酸化酵素活性を有して
いた。この値はヒト線維芽細胞に匹敵する値である。

【００３５】Ｂ．コラーゲン発現ベクターの作製 （１）ヒトIII型α１鎖ｃＤＮＡの単離 ヒトIII型α１鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニン
グされその塩基配列が報告されている（Biochem.J. 26
0,509-516(1989) およびＥＭＢＬ遺伝子データベース登
録名HSCOL3AI／Accession Number:X14420）。その配列
を配列番号６に示す。本発明においてはヒトIII型α１
ｃＤＮＡは以下のようにしてヒト胎盤由来ｃＤＮＡライ
ブラリーより単離された。すなわち、ヒト・線維芽細胞
からChomcynski and Sacchi（Anal.Biochem. 162, 156-
159(1987)）の方法に従い全ＲＮＡを調製し、ファルマ
シア社製ｃＤＮＡ合成キットを用いてその全ＲＮＡから
ｃＤＮＡを合成した。そしてこのｃＤＮＡを鋳型として
配列番号６の塩基番号５６１から１１５１の間の配列を
polymerase chain reaction法（「PCR Technology」、S
tockton Press 発行(1989)）により増幅した。その結果
得られた５９０ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして、λ
gt11をベクターとするヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー
（クロンテック社、Code No. CLHL1008b）を常法（「Mo
lecular Cloning」第２版, Cold Spring Harbor Labora
tory Press発行(1989)）に従ってスクリーニングした。
そしてプローブによって検出された陽性クローンとして
５．４ＫｂのｃＤＮＡ配列を有するファージクローンを
得た。

【００３６】このｃＤＮＡ配列の制限酵素地図は、配列
番号６の配列から予測される図１に示す制限酵素地図と
一致した。さらにこのｃＤＮＡ配列の両末端の塩基配列
を決定したところ、この５．４ＫｂＤＮＡ断片は配列番
号６に示す塩基配列の塩基番号３９番から５４６０まで
を含むことが示された。即ち、このｃＤＮＡ配列は、ヒ
トIII型α１コラーゲンのｃＤＮＡであり、図１の下に
矢印で示す通りそのｃＤＮＡのタンパク質翻訳領域を全
て含むと推定された。

【００３７】（２）メリチンシグナルを含むプラスミド
ベクターの作製 トランスファーベクターｐＡｃＹＭ１（J.Gen.Virol.,
173,674-682(1987)）が有するポリヘドリンプロモータ
ーの３’端に、ミツバチ（Apis melifica）のタンパク
質メリチンのシグナルペプチド配列（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA．79, 2260-2263(1982)）に対応する合成塩
基配列を挿入し、分泌シグナル配列を付与した新たなト
ランスファーベクターを構築した。その構築方法は図２
に示す通りである。即ちメリチンのシグナルペプチド配
列をコードする塩基配列を２部分に分けて、以下の４種
類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーにより
合成した。

【００３８】5'ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴ
ＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＣＧ3'（配列番号１） 5'ＴＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＡＣＴＡ
ＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＧＧ 3'（配列番号２） 5'ＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴ
ＡＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧ3'（配列番号３） 5'ＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴ
ＡＣＡＣＧＴＣＣＡ3'（配列番号４）

【００３９】そして、オリゴヌクレオチドとの５’
末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績）によ
りリン酸化した後、と、とをそれぞれ混合し、
６５℃で５分間インキュベートした後、３７℃で３０分
間放置することによりそれぞれのオリゴヌクレオチドを
アニーリングさせて２本鎖ＤＮＡに変換した。次に、こ
れら２種類の２本鎖ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋
紡績）により連結した。得られたＤＮＡは、両末端に制
限酵素ＢａｍＨＩ切断部位と連結可能な配列を持つが、
その５’側末端は連結した後、再びＢａｍＨＩで切断す
ることが出来ない。このようにして〜のオリゴヌク
レオチドを結合させて得られるＤＮＡ配列をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、あらかじ
め制限酵素ＢａｍＨＩで消化しかつ切断末端をアルカリ
フォスファターゼ（ベーリンガー社）により脱リン酸化
したｐＡｃＹＭ１ベクターと連結することによりプラス
ミドｐＡｃ−Ｍｅｌを得た。

【００４０】（３）組換えトランスファーベクターの作
製 図３に示すようにヒトIII型コラーゲン遺伝子を挿入し
た組換えトランスファーベクターを以下の（ａ）〜
（ｆ）の手順によって作製した。 （ａ）上記（１）で得られた陽性ファージクローンＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロース電気泳動
により目的とする５．４ｋｂのヒトIII型コラーゲンα
１ｃＤＮＡ断片を分離・精製した。 （ｂ）このＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化しかつ、アルカリフォスファターゼでリン酸基を
除去したプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造）と混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してプラスミドｐ３Ａ１を得
た。 （ｃ）オリゴヌクレオチド5'ＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡ
ＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧ3'（配
列番号５）をＤＮＡシンセサイザーにより合成した。こ
の配列は、配列番号６のヒトIII型α１鎖・ｍＲＮＡ
（ｃＤＮＡ）の塩基番号１６０から１８８の塩基配列に
対応し、さらに下線で示すように制限酵素ＢｇｌIIによ
って認識される配列を挿入したものである。このオリゴ
ヌクレオチドの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化し、これをプライマーとして、イン
ビトロミュータジェネシスキット（アマシャム社）を用
いて、部位特異的突然変異法（Nucleic Acids Researc
h, 14, 9679 (1986)）により、プラスミドｐ３Ａ１に制
限酵素ＢｇｌIIの切断部位を導入した。

【００４１】（ｄ）次に、上記（ｃ）で作製されたプラ
スミドｐ３Ａ１−Ｂを制限酵素ＫｐｎＩで切断した後、
配列番号６の配列の塩基番号４５５０の制限酵素Ｎｄｅ
Ｉ切断部位に対応する部位のみが消化されるようにＮｄ
ｅＩによって部分消化を行った。これによって生ずる
７．６６ＫｂのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によっ
て分離・精製し、さらにその両末端をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（東洋紡績）で平滑末端にした後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼにより環状化してプラスミドｐ３Ａ１−３Ｄを得
た。このプラスミドｐ３Ａ１−３Ｄはプラスミドｐ３Ａ
１からｃＤＮＡの３’非翻訳領域の大部分を除いたもの
となる。 （ｅ）得られたプラスミドｐ３Ａ１−３Ｄを制限酵素Ｂ
ｇｌIIで消化した後、プラスミドｐＵＣ１１８に由来す
る制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位のみが切断されるように
部分消化を行い、アガロース電気泳動により４．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を分離・精製した。 （ｆ）上記（ｅ）の４．４ＫｂＤＮＡ断片を、あらかじ
め制限酵素ＢａｍＨＩで切断しリン酸基を除去したｐＡ
ｃ−Ｍｅｌと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合した。
その結果ヒトIII型α１ｃＤＮＡ断片がｐＡｃ−Ｍｅｌ
のポリヘドリンプロモーターと同一の転写方向でその直
下に挿入されたプラスミドｐＡｃ３Ａ１を得た。ここに
得られたトランスファーベクターｐＡｃ３Ａ１は、ヒト
III型α１鎖のシグナル配列を除くアミノプロペプチド
からカルボキシルプロペプチドまでの領域をコードする
塩基配列を有する。

【００４２】（４）組換えウイルスの作製 上記（３）で得られたプラスミドｐＡｃ３Ａ１のＤＮＡ
１μｇと野生型ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡ１００ｎｇを８μ
ｌの滅菌水に溶解した後、８μｌのリポフェクチン（ギ
ブコ社）と混合し、室温で１５分放置した。これを、あ
らかじめ１０％ウシ胎児血清を含むグレイス培地（ギブ
コ社）で培養した後培養液を無血清培地・ＳＦ９００−
ＩＩ（ギブコ社）に交換した１×１０⁶個のＳｆ９細胞
に添加した。この細胞をさらに２８℃で３日間培養した
後、培養上清を回収した。この培養上清の一部を、別途
培養してあるＳｆ９細胞に感染させたのち、１％寒天を
含む上記培地を細胞上に重層し固化させた。培養３日
後、ウイルスの感染部位にプラークが生じる。ｐＡｃ３
Ａ１とＡｃＭＮＰＶとの間に相同組換えのおきたプラー
クはそのプラーク内の細胞が多角体を形成しないため透
明に見え、多角体が形成されて細胞が濁って見える野生
型ウイルス感染プラークと区別できる。この組換えのお
きたウイルスプラークの寒天部位を切り出して、組換ウ
イルスを回収した。ここに得られた組換えウイルスＡｃ
３Ａ１をさらに１×１０⁶個のＳｆ９細胞に感染させ、
２８℃で３日間培養し、この間に増殖して培養上清中に
遊離したＡｃ３Ａ１ウイルスを回収した。この感染操作
をもう一度繰り返して最終的に１×１０⁸個／ｍｌの組
換えウイルスＡｃ３Ａ１の懸濁液を得た。

【００４３】（５）ヒトIII型コラーゲンの発現 得られたＡｃ３Ａ１ウイルスを多重感染率が１０になる
ように１×１０⁶個のＳｆ９細胞に感染させ、さらにこ
の細胞を１０％牛胎児血清を含むグレイス培地中で、２
８℃において４２時間培養した後、細胞および培養液そ
れぞれよりタンパク質試料を調製した。 （ａ）培養器よりピペッティングで細胞をはがし、５，
０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を沈澱さ
せ培養上清から分別した。沈澱させた細胞をさらに燐酸
緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１００μｌの蒸留水に
懸濁した後、凍結融解により細胞を破砕し、タンパク質
を抽出した。 （ｂ）細胞を沈澱させた培養上清を回収し、これに３０
％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加えて溶解させ
た。これを４℃で３時間静置した後、１０，０００ｇ、
３０分４℃で遠心分離し、タンパク質の沈澱物を得た。
この沈澱物をさらに０．５Ｍ酢酸に溶解して０．５Ｍ酢
酸に対して透析した後凍結乾燥した。この乾燥物に１０
０μlの蒸留水を加えて溶解した。

【００４４】（ｃ）上記（ａ）、（ｂ）に用いたのと同
数の細胞に、野生型ＡｃＭＮＰＶを感染させ上記と同様
の方法で細胞、および培養上清からタンパク質を調製し
た。 上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質試料２０μｌにそれぞ
れ２０μｌの２×ＳＤＳ−サンプル緩衝液（０．２５Ｍ
トリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８／４％ ＳＤＳ／１０
％ ２−メルカプトエタノール／２０％ グリセロー
ル）を加えて混合し５分間１００℃で熱処理した。そし
て熱処理された上記試料の１５μｌをＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（Nature 227, 680-685(1970)）
に供し、泳動後ゲルをクマシーブリリアントブルーによ
って蛋白染色した。同時にラット皮膚よりペプシンで抽
出されたIII型コラーゲンを分子量マーカーとして泳動
した。 分子量マーカー：αコラーゲン（［α１（III）］、分
子量100KDa βコラーゲン（［α１（III）］₂）、分子量200KDa γコラーゲン（［α１（III）］₃）、分子量30KDa）。

【００４５】その結果、図４に示す様に分子量１５０ｋ
Ｄａの位置に発現ベクターに由来すると推定されるタン
パク質のバンドを認めた。このタンパク質はその分子量
から、III型プロコラーゲン（プロα１（III））と推定
された。そしてこのタンパク質は細胞内にも培養上清中
にも認められたが、その量は細胞中に多かった。一方、
野生型ＡｃＭＮＰＶウイルスを感染させた細胞からは、
このタンパク質を検出来なかった。また、上記の試料を
同様に電気泳動した後、Matsudairaらの方法（J.Biol.C
hem. 261,10035-10038(1987）の方法に準じて、泳動さ
れたタンパク質をニトロセルロース膜ＢＡ８５（Ｓ＆Ｓ
社）に転写した。 次に、タンパク質が転写されたニト
ロセルロース膜をブロッキング液（３％ ＢＳＡ／５０
ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ７．５／１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で４℃において１６時間処理した後、ブロッキ
ング液で５００倍に希釈した抗ヒト／ウシ・III型コラ
ーゲン抗体（ＬＳＬ社）と室温で１時間反応させた。こ
の抗体が反応するタンパク質をベクタステイン社のＡＢ
Ｃキットで検出したところ、上記の１５０ｋＤａのタン
パク質がこの抗体と反応することが確認された。

【００４６】さらに、このタンパク質を高純度のバクテ
リア・コラゲナーゼ（アドバンス・バイオファクチャー
社）で消化することを試みた。即ち上記の（ａ）〜
（ｃ）のタンパク質試料の１０μｌを凍結乾燥し、コラ
ゲナーゼ反応液（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ
７．５／２ｍＭ ＣａＣｌ₂）に溶解した後、２単位の
コラゲナーゼを加え３７℃で２時間処理した。処理後の
試料をＳＤＳ電気泳動に供し、タンパク質をクマシーブ
リリアントブルーにで染色をした結果、図５に示すよう
に細胞ならびに培養液中に認められた１５０ｋＤａのタ
ンパク質はコラゲナーゼにより消化されたことが示され
た。以上の結果より、組換えウイルスＡｃ３Ａ１を感染
させたＳｆ９細胞中に検出される１５０ｋＤａのタンパ
ク質は、ヒトIII型α1ｃＤＮＡの翻訳産物であるIII型
プロコラーゲンであると判断された。加えて野生型ウイ
ルスが感染した細胞にはコラーゲナーゼによって消化さ
れるタンパク質が検出されなかったことから、宿主細胞
Ｓｆ９はコラーゲン様タンパク質を全くあるいはごく微
量しか合成していないことが示され、本発明の発現ベク
ターによって導入されたコラーゲン遺伝子は優先的に翻
訳されることが示唆された。

【００４７】（６）組換えコラーゲンにおける３重「ら
せん」構造の確認 生体内に存する正常なIII型コラーゲン分子は、ペプシ
ンやトリプシンなどのプロテアーゼによる消化を受けな
い「らせん」構造領域（分子量約１００ＫＤａ）を有す
る。「らせん」領域にはジスルフィド結合が存在するた
め、非還元状態（メルカプトエタノール非存在下）で電
気泳動するとコラーゲン分子は３本鎖のまま泳動され分
子量が約３００ＫＤａの分子として検出される。また還
元状態（メルカプトエタノール存在下）では３本鎖が解
離した単量体の分子（分子量約１００ＫＤａ）として検
出されるはずである。この原理を利用して組換えコラー
ゲンにおける３重「らせん」構造の確認を行った。

【００４８】即ち、上記（５）の（ａ）のタンパク質試
料を凍結乾燥した後、これに０．５Ｍ酢酸に１００μｇ
／ｍｌの濃度で溶解したペプシンを加え、４℃で１６時
間処理した。処理後試料を凍結乾燥して酢酸を除き、Ｓ
ＤＳ−サンプルバッファー（還元条件）あるいは、メル
カプトエタノールを含まないＳＤＳサンプルバッファー
（非還元条件）に溶解した。これらのタンパク質試料を
上記（５）に記載の方法で電気泳動し、クマシーブリリ
アントブルーによるタンパク質染色を行った。その結果
図６のＡに示す通り、還元条件で電気泳動を行った場合
には、ペプシン処理前に１５０ＫＤａであったバンドが
ペプシン処理によって消失し新たに１００ＫＤａのバン
ドが出現した。

【００４９】この分子量の変化はプロα1（III）からプ
ロペプチドおよびテロペプチドが分解除去されてα１
（III）分子に変換されたことを示す。そして、コラー
ゲン分子が１本鎖で存在する場合はプロペプチド、テロ
ペプチド以外の配列も全てペプシンで完全に消化される
ことが知られているから、以上の結果は、発現ベクター
によって合成されたコラーゲンは１本鎖ではなく、また
その分子内部にペプシンに耐性な分子構造、即ち３重
「らせん」構造を有していることが推定される。さらに
図６のＢに示すように非還元状態において電気泳動を行
うと実際に３本鎖分子が検出された。そしてこの３本鎖
分子はペプシンによりその分子量が４５０ＫＤａから３
００ＫＤａへ変化した。この変化はプロコラーゲン３本
鎖（[プロα1(III)]₃）がアテロコラーゲン３本鎖（[α
1(III)]3に変換されたことを意味する。以上の結果か
ら、本発明の発現ベクターはそれが感染した細胞におい
て、生体内と同等な３本鎖構造を有するコラーゲンを生
産させる能力を持つことが示された。

【００５０】（７）組換えコラーゲンの精製 上記（６）において本発明の発現ベクターが生体内と同
等な３本鎖コラーゲンを合成する能力を有することを示
したが、上記ベクターが感染したＳｆ９細胞においては
それ以外の分子構造を持つ、おそらく修飾反応を不完全
に受けたコラーゲン分子も存在すると推定される。すな
わち図６のＢに示す非還元状態では、３本鎖分子以外に
１５０ＫＤａ（ペプシン未処理）および１００ＫＤａ
（ペプシン処理後）のバンドが検出されている。そこ
で、本発明が目的とする３本鎖状態のコラーゲンは次の
ようにして簡単に精製することができる。

【００５１】２×１０⁸個のＳｆ９細胞に多重感染率が
２−１０になるようにＡｃ３Ａ１ウイルスを感染させ、
１００ｍｌのグレイス培地（１０％牛胎児血清及び０．
１％プルロニックＦ−６８を含む）に懸濁し、スピナー
フラスコに移した。これを４０−５０ｒｐｍで、２８℃
において４２時間スピナー培養した。遠心により細胞を
集め、ＰＢＳで２回洗浄した後、１０ｍｌの０．５Ｍの
酢酸に懸濁した。そして超音波処理により細胞を破砕
し、１ｍｇのペプシンを加え４℃で２４時間消化した。
次にこの溶液を１０、０００ｇ ３０分遠心して不溶性
物質を除去し上清を得た。この上清に、最終濃度で０．
７ＭとなるようにＮａＣｌを加え、４℃で１６時間放置
した後、遠心操作によりコラーゲンの沈澱を集めた。コ
ラーゲンの沈澱を２ｍｌの０．５Ｍの酢酸に溶解し、さ
らに０．０２ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄に対して透析することに
よりコラーゲンを再び沈澱させた。遠心によりコラーゲ
ンを集め、再び０．５Ｍの酢酸に溶解した。以上の沈澱
と溶解のサイクルをもう一度繰り返し、最終的に２×１
０⁸個の細胞から１００〜５００μｇのコラーゲン標品
を得た。

【００５２】この標品を非還元条件化でＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動したところ、図７に示すよう
に、分子量の指標となる精製ラットIII型コラーゲンの
３本鎖分子と一致する分子量のコラーゲンが検出され
た。そして低分子のコラーゲンは除去された。またラッ
ト生体組織から抽出されたコラーゲンに見られる架橋を
有するコラーゲンも上記精製物には検出されなかった。
即ち以上の精製操作により、ほとんどの分子がジスルフ
ィド結合によって結合している３本鎖分子であることが
示された。よって、生体内に存するのと同等な３本鎖コ
ラーゲンが比較的簡単な操作により、大量に得ることが
可能であることが示された。

【００５３】

【発明の効果】本発明は次のような効果を有する。 （１）本発明において用いられる昆虫細胞は、ヒト線維
芽様細胞と類似したコラーゲンタンパク質の翻訳後修飾
能力を備えているため、導入された遺伝子によって合成
されるコラーゲンが生体内と同様な安定な３本鎖分子と
して形成されることを可能とする。 （２）本発明において用いられる宿主細胞由来のコラー
ゲンの合成は殆ど認められない。従って、ウイルスベク
ターによって導入された遺伝子に由来するコラーゲンの
みが選択的に宿主細胞で合成され、異種動物のコラーゲ
ンとの分離・精製が不要になるという従来の方法にはみ
られない効果を有する。 （３）本発明の方法によって合成される３本鎖コラーゲ
ンは、細胞外に分泌されるばかりでなく多量に細胞内に
蓄積される。従来の方法で用いられる線維芽細胞では殆
どの３本鎖コラーゲンは分泌されるため、培養液中に分
泌され希釈された少量のコラーゲンを濃縮後精製する必
要があった。さらに、発現されたコラーゲンは３本鎖分
子間に共有結合性の架橋結合を持たないため、精製に先
だって不溶化したコラーゲンを可溶化するという操作を
省くことができる。よって、コラーゲンを細胞内から直
接抽出することが可能となり、目的物の精製操作を簡便
化出来るという効果がある。

【００５４】

【配列表】

【００５５】配列番号：１ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCACCATG AAATTCTTAG TCAACGTTGC CCTCG 35

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAAAACAAG GGCAACGTTG ACTAAGAATT TCATGG 36

【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTTTTATGGT CGTGTACATT TCTTACATCT ATGCG 35

【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCCGCATA GATGTAAGAA ATGTACACGT CCA 33

【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧ ＣＡＣＡＡＧＡＴＣＴ ＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴ ＧＴＴ
Ｇ ３４

【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：５４６０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDANA to mRNA 配列 CGGGCCCGGT GCTGAAGGGC AGGGAACAAC TTGATGGTGC TACTTTGAAC TGCTTTTCTT 60 TTCTCCTTTT TGCACAAAGA GTCTCATGTC TGATATTTAG ACATGATGAG CTTTGTGCAA 120 AAGGGGAGCT GGCTACTTCT CGCTCTGCTT CATCCCACTA TTATTTTGGC ACAACAGGAA 180 GCTGTTGAAG GAGGATGTTC CCATCTTGGT CAGTCCTATG CGGATAGAGA TGTCTGGAAG 240 CCAGAACCAT GCCAAATATG TGTCTGTGAC TCAGGATCCG TTCTCTGCGA TGACATAATA 300 TGTGACGATC AAGAATTAGA CTGCCCCAAC CCAGAAATTC CATTTGGAGA ATGTTGTGCA 360 GTTTGCCCAC AGCCTCCAAC TGCTCCTACT CGCCCTCCTA ATGGTCAAGG ACCTCAAGGC 420 CCCAAGGGAG ATCCAGGCCC TCCTGGTATT CCTGGGAGAA ATGGTGACCC TGGTATTCCA 480 GGACAACCAG GGTCCCCTGG TTCTCCTGGC CCCCCTGGAA TCTGTGAATC ATGCCCTACT 540 GGTCCTCAGA ACTATTCTCC CCAGTATGAT TCATATGATG TCAAGTCTGG AGTAGCAGTA 600 GGAGGACTCG CAGGCTATCC TGGACCAGCT GGCCCCCCAG GCCCTCCCGG TCCCCCTGGT 660 ACATCTGGTC ATCCTGGTTC CCCTGGATCT CCAGGATACC AAGGACCCCC TGGTGAACCT 720 GGGCAAGCTG GTCCTTCAGG CCCTCCAGGA CCTCCTGGTG CTATAGGTCC ATCTGGTCCT 780 GCTGGAAAAG ATGGAGAATC AGGTAGACCC GGACGACCTG GAGAGCGAGG ATTGCCTGGA 840 CCTCCAGGTA TCAAAGGTCC AGCTGGGATA CCTGGATTCC CTGGTATGAA AGGACACAGA 900 GGCTTCGATG GACGAAATGG AGAAAAGGGT GAAACAGGTG CTCCTGGATT AAAGGGTGAA 960 AATGGTCTTC CAGGCGAAAA TGGAGCTCCT GGACCCATGG GTCCAAGAGG GGCTCCTGGT 1020 GAGCGAGGAC GGCCAGGACT TCCTGGGGCT GCAGGTGCTC GGGGTAATGA CGGTGCTCGA 1080 GGCAGTGATG GTCAACCAGG CCCTCCTGGT CCTCCTGGAA CTGCCGGATT CCCTGGATCC 1140 CCTGGTGCTA AGGGTGAAGT TGGACCTGCA GGGTCTCCTG GTTCAAATGG TGCCCCTGGA 1200 CAAAGAGGAG AACCTGGACC TCAGGGACAC GCTGGTGCTC AAGGTCCTCC TGGCCCTCCT 1260 GGGATTAATG GTAGTCCTGG TGGTAAAGGC GAAATGGGTC CCGCTGGCAT TCCTGGAGCT 1320 CCTGGACTGA TGGGAGCCCG GGGTCCTCCA GGACCAGCCG GTGCTAATGG TGCTCCTGGA 1380 CTGCGAGGTG GTGCAGGTGA GCCTGGTAAG AATGGTGCCA AAGGAGAGCC CGGACCACGT 1440 GGTGAACGCG GTGAGGCTGG TATTCCAGGT GTTCCAGGAG CTAAAGGCGA AGATGGCAAG 1500 GATGGATCAC CTGGAGAACC TGGTGCAAAT GGGCTTCCAG GAGCTGCAGG AGAAAGGGGT 1560 GCCCCTGGGT TCCGAGGACC TGCTGGACCA AATGGCATCC CAGGAGAAAA GGGTCCTGCT 1620 GGAGAGCGTG GTGCTCCAGG CCCTGCAGGG CCCAGAGGAG CTGCTGGAGA ACCTGGCAGA 1680 GATGGCGTCC CTGGAGGTCC AGGAATGAGG GGCATGCCCG GAAGTCCAGG AGGACCAGGA 1740 AGTGATGGGA AACCAGGGCC TCCCGGAAGT CAAGGAGAAA GTGGTCGACC AGGTCCTCCT 1800 GGGCCATCTG GTCCCCGAGG TCAGCCTGGT GTCATGGGCT TCCCCGGTCC TAAAGGAAAT 1860 GATGGTGCTC CTGGTAAGAA TGGAGAACGA GGTGGCCCTG GAGGACCTGG CCCTCAGGGT 1920 CCTCCTGGAA AGAATGGTGA AACTGGACCT CAAGGACCCC CAGGGCCTAC TGGGCCTGGT 1980 GGTGACAAAG GAGACACAGG ACCCCCTGGT CCACAAGGAT TACAAGGCTT GCCTGGTACA 2040 GGTGGTCCTC CAGGAGAAAA TGGAAAACCT GGGGAACCAG GTCCAAAGGG TGATGCCGGT 2100 GCACCTGGAG CTCCAGGAGG CAAGGGTGAT GCTGGTGCCC CTGGTGAACG TGGACCTCCT 2160 GGATTGGCAG GGGCCCCAGG ACTTAGAGGT GGAGCTGGTC CCCCTGGTCC CGAAGGAGGA 2220 AAGGGTGCTG CTGGTCCTCC TGGGCCACCT GGTGCTGCTG GTACTCCTGG TCTGCAAGGA 2280 ATGCCTGGAG AAAGAGGAGG TCTTGGAAGT CCTGGTCCAA AGGGTGACAA GGGTGAACCA 2340 GGCGGCCCAG GTGCTGATGG TGTCCCAGGG AAAGATGGCC CAAGGGGTCC TACTGGTCCT 2400 ATTGGTCCTC CTGGCCCAGC TGGCCAGCCT GGAGATAAGG GTGAAGGTGG TGCCCCCGGA 2460 CTTCCAGGTA TAGCTGGACC TCGTGGTAGC CCTGGTGAGA GAGGTGAAAC TGGCCCTCCA 2520 GGACCTGCTG GTTTCCCTGG TGCTCCTGGA CAGAATGGTG AACCTGGTGG TAAAGGAGAA 2580 AGAGGGGCTC CGGGTGAGAA AGGTGAAGGA GGCCCTCCTG GAGTTGCAGG ACCCCCTGGA 2640 GGTTCTGGAC CTGCTGGTCC TCCTGGTCCC CAAGGTGTCA AAGGTGAACG TGGCAGTCCT 2700 GGTGGACCTG GTGCTGCTGG CTTCCCTGGT GCTCGTGGTC TTCCTGGTCC TCCTGGTAGT 2760 AATGGTAACC CAGGACCCCC AGGTCCCAGC GGTTCTCCAG GCAAGGATGG GCCCCCAGGT 2820 CCTGCGGGTA ACACTGGTGC TCCTGGCAGC CCTGGAGTGT CTGGACCAAA AGGTGATGCT 2880 GGCCAACCAG GAGAGAAGGG ATCGCCTGGT GCCCAGGGCC CACCAGGAGC TCCAGGCCCA 2940 CTTGGGATTG CTGGGATCAC TGGAGCACGG GGTCTTGCAG GACCACCAGG CATGCCAGGT 3000 CCTAGGGGAA GCCCTGGCCC TCAGGGTGTC AAGGGTGAAA GTGGGAAACC AGGAGCTAAC 3060 GGTCTCAGTG GAGAACGTGG TCCCCCTGGA CCCCAGGGTC TTCCTGGTCT GGCTGGTACA 3120 GCTGGTGAAC CTGGAAGAGA TGGAAACCCT GGATCAGATG GTCTTCCAGG CCGAGATGGA 3180 TCTCCTGGTG GCAAGGGTGA TCGTGGTGAA AATGGCTCTC CTGGTGCCCC TGGCGCTCCT 3240 GGTCATCCAG GCCCACCTGG TCCTGTCGGT CCAGCTGGAA AGAGTGGTGA CAGAGGAGAA 3300 AGTGGCCCTG CTGGCCCTGC TGGTGCTCCC GGTCCTGCTG GTTCCCGAGG TGCTCCTGGT 3360 CCTCAAGGCC CACGTGGTGA CAAAGGTGAA ACAGGTGAAC GTGGAGCTGC TGGCATCAAA 3420 GGACATCGAG GATTCCCTGG TAATCCAGGT GCCCCAGGTT CTCCAGGCCC TGCTGGTCAG 3480 CAGGGTGCAA TCGGCAGTCC AGGACCTGCA GGCCCCAGAG GACCTGTTGG ACCCAGTGGA 3540 CCTCCTGGCA AAGATGGAAC CAGTGGACAT CCAGGTCCCA TTGGACCACC AGGGCCTCGA 3600 GGTAACAGAG GTGAAAGAGG ATCTGAGGGC TCCCCAGGCC ACCCAGGGCA ACCAGGCCCT 3660 CCTGGACCTC CTGGTGCCCC TGGTCCTTGC TGTGGTGGTG TTGGAGCCGC TGCCATTGCT 3720 GGGATTGGAG GTGAAAAAGC TGGCGGTTTT GCCCCGTATT ATGGAGATGA ACCAATGGAT 3780 TTCAAAATCA ACACCGATGA GATTATGACT TCACTCAAGT CTGTTAATGG ACAAATAGAA 3840 AGCCTCATTA GTCCTGATGG TTCTCGTAAA AACCCCGCTA GAAACTGCAG AGACCTGAAA 3900 TTCTGCCATC CTGAACTCAA GAGTGGAGAA TACTGGGTTG ACCCTAACCA AGGATGCAAA 3960 TTGGATGCTA TCAAGGTATT CTGTAATATG GAAACTGGGG AAACATGCAT AAGTGCCAAT 4020 CCTTTGAATG TTCCACGGAA ACACTGGTGG ACAGATTCTA GTGCTGAGAA GAAACACGTT 4080 TGGTTTGGAG AGTCCATGGA TGGTGGTTTT CAGTTTAGCT ACGGCAATCC TGAACTTCCT 4140 GAAGATGTCC TTGATGTGCA GCTGGCATTC CTTCGACTTC TCTCCAGCCG AGCTTCCCAG 4200 AACATCACAT ATCACTGCAA AAATAGCATT GCATACATGG ATCAGGCCAG TGGAAATGTA 4260 AAGAAGGCCC TGAAGCTGAT GGGGTCAAAT GAAGGTGAAT TCAAGGCTGA AGGAAATAGC 4320 AAATTCACCT ACACAGTTCT GGAGGATGGT TGCACGAAAC ACACTGGGGA ATGGAGCAAA 4380 ACAGTCTTTG AATATCGAAC ACGCAAGGCT GTGAGACTAC CTATTGTAGA TATTGCACCC 4440 TATGACATTG GTGGTCCTGA TCAAGAATTT GGTGTGGACG TTGGCCCTGT TTGCTTTTTA 4500 TAAACCAAAC TCTATCTGAA ATCCCAACAA AAAAAATTTA ACTCCATATG TGTTCCTCTT 4560 GTTCTAATCT TGTCAACCAG TGCAAGTGAC CGACAAAATT CCAGTTATTT ATTTCCAAAA 4620 TGTTTGGAAA CAGTATAATT TGACAAAGAA AAATGATACT TCTCTTTTTT TGCTGTTCCA 4680 CCAAATACAA TTCAAATGCT TTTTGTTTTA TTTTTTTACC AATTCCAATT TCAAAATGTC 4740 TCAATGGTGC TATAATAAAT AAACTTCAAC ACTCTTTATG ATAACAACAC TGTGTTATAT 4800 TCTTTGAATC CTAGCCCATC TGCAGAGCAA TGACTGTGCT CACCAGTAAA AGATAACCTT 4860 TCTTTCTGAA ATAGTCAAAT ACGAAATTAG AAAAGCCCTC CCTATTTTAA CTACCTCAAC 4920 TGGTCAGAAA CACAGATTGT ATTCTATGAG TCCCAGAAGA TGAAAAAAAT TTTATACGTT 4980 GATAAAACTT ATAAATTTCA TTGATTAATC TCCTGGAAGA TTGGTTTAAA AAGAAAAGTG 5040 TAATGCAAGA ATTTAAAGAA ATATTTTTAA AGCCACAATT ATTTTAATAT TGGATATCAA 5100 CTGCTTGTAA AGGTGCTCCT CTTTTTTCTT GTCATTGCTG GTCAAGATTA CTAATATTTG 5160 GGAAGGCTTT AAAGACGCAT GTTATGGTGC TAATGTACTT TCACTTTTAA ACTCTAGATC 5220 AGAATTGTTG ACTTGCATTC AGAACATAAA TGCACAAAAT CTGTACATGT CTCCCATCAG 5280 AAAGATTCAT TGGCATGCCA CAGGGATTCT CCTCCTTCAT CCTGTAAAGG TCAACAATAA 5340 AAACCAAATT ATGGGGCTGC TTTTGTCACA CTAGCATAGA GAATGTGTTG AAATTTAACT 5400 TTGTAAGCTT GTATGTGGTT GTTGATCTTT TTTTTCCTTA CAGACACCCA TAATAAAATA 5460

【図面の簡単な説明】

【図１】 III型コラーゲンｃＤＮＡの制限酵素地図を
示す図である。

【図２】 プラスミドｐＡｃ−Ｍｅｌの作製方法を示す
図である。

【図３】 トランスファーベクターｐＡｃ３Ａ１の作製
方法を示す図である。

【図４】 組換えコラーゲンの電気泳動像を示す図であ
る。Ａはタンパク質染色である。Ｂは抗体との反応性を
示す図である。

【図５】 コラーゲナーゼ処理した組み替えコラーゲン
の電気泳動像を示す図である。

【図６】 ペプシン消化した組換えコラーゲンの電気泳
動像を示す図である。Ａは還元条件下、Ｂは非還元条件
下で泳動した結果である。

【図７】 精製された組換えコラーゲンの電気泳動像を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 加藤 俊康 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地 テルモ株式会社内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主にヒト・コラーゲン産生能を与える
   発現ベクターであって、コラーゲン分子中のプロリン残
   基を水酸化する能力を備えた昆虫細胞に対して感染可能
   なウイルスＤＮＡと、ヒト・コラーゲンｃＤＮＡとを有
   することを特徴とするヒト・コラーゲン発現ベクター。
2. 【請求項２】 上記宿主がＳｆ９細胞である請求項１に
   記載のヒト・コラーゲン発現ベクター。
3. 【請求項３】 上記ウイルスがバキュロウイルスである
   請求項１または２に記載のヒト・コラーゲン発現ベクタ
   ー。
4. 【請求項４】 上記ヒト・コラーゲンがIII型コラーゲ
   ンである請求項１〜３のいずれかに記載のヒト・コラー
   ゲン発現ベクター。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の発現ベクターを、コラ
   ーゲン分子中のプロリン残基を水酸化する能力を有する
   昆虫細胞に感染させることにより、タンパク質を生産さ
   せることを特徴とするヒト・コラーゲンの製造方法。
6. 【請求項６】 上記タンパク質が以下の特性〜を有
   する請求項５に記載のヒト・コラーゲンの製造方法。 バクテリアコラゲナーゼによって消化される ３本のポリペプチド鎖が会合した３本鎖分子である ３本鎖分子内に、ペプシンに耐性のポリペプチド部分
   を有する ３本鎖分子間に共有結合性の架橋構造を有しない