JP2002315580A - ヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコ - Google Patents
ヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えヒト・コラーゲンを繭に含まれるタン
パク質の一部として生産する形質転換カイコと、このカ
イコが生産する組換えヒト・コラーゲンの製造方法を提
供する。 【解決手段】 ヒト・コラーゲンをコードするポリヌク
レオチドをゲノムDNA内に有し、組換えヒト・コラーゲ
ンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生す
る形質転換カイコと、この形質転換カイコから組換えヒ
ト・コラーゲンを製造する方法、並びに形質転換カイコ
の作成に使用する組換えベクターセット。
パク質の一部として生産する形質転換カイコと、このカ
イコが生産する組換えヒト・コラーゲンの製造方法を提
供する。 【解決手段】 ヒト・コラーゲンをコードするポリヌク
レオチドをゲノムDNA内に有し、組換えヒト・コラーゲ
ンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生す
る形質転換カイコと、この形質転換カイコから組換えヒ
ト・コラーゲンを製造する方法、並びに形質転換カイコ
の作成に使用する組換えベクターセット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この出願の発明は、組換えヒト・
コラーゲンを産生する形質転換カイコに関するものであ
る。さらに詳しくは、この出願の発明は、組換えヒト・
コラーゲンを産生する形質転換カイコと、この形質転換
カイコを作製するための組換えベクター、並びに組換え
ヒト・コラーゲンの製造方法に関するものである。
コラーゲンを産生する形質転換カイコに関するものであ
る。さらに詳しくは、この出願の発明は、組換えヒト・
コラーゲンを産生する形質転換カイコと、この形質転換
カイコを作製するための組換えベクター、並びに組換え
ヒト・コラーゲンの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】コラーゲンは細胞外基質を構成する代表
的タンパク質であり、細胞の足場となって生体の構造を
維持するといった機械的機能の他、細胞の増殖、分化、
移動などを制御する様々な生理的機能を有している。そ
のためコラーゲンは生体の損傷を修復するためのバイオ
マテリアルとして（J.Surg.Res. 10:485-491, 1970）、
またある種の薬剤を徐放するためのキャリアーとして
（J.Controlled Release 33:307-315, 1995）、医療分
野で広く利用されている。しかし、現在用いられている
コラーゲンの大部分はウシやブタ等の動物組織由来のも
のであり、これらのコラーゲンをヒトに移植した場合、
約３％の患者にアレルギー反応が生じることが知られて
いる（J.Immunol.136:877-882, 1986；Biomaterials 1
1:176-180, 1990）。また、動物組織由来コラーゲンに
おけるウイルスやブリオン等病原体混入の危険性は近年
大きな問題となっている。そのため抗原性が無く、また
病原体混入の危険性が無い組換え型ヒト・コラーゲンを
産生するシステムが望まれている。そこで、この出願の
発明者らの一部は、ヒト・コラーゲンをコードするｃＤ
ＮＡを挿入した組換えウイルスを昆虫細胞に感染させる
ことにより、ヒト生体内のものと同等な三重らせん構造
を有する組換えヒト・コラーゲンを製造する方法を発明
し、特許出願している（特開平８−２３９７９号公
報）。また、哺乳動物細胞や酵母を用いてヒト・コラー
ゲンを製造する方法も考案されている（特表平７−５０
１９３９公報）。
的タンパク質であり、細胞の足場となって生体の構造を
維持するといった機械的機能の他、細胞の増殖、分化、
移動などを制御する様々な生理的機能を有している。そ
のためコラーゲンは生体の損傷を修復するためのバイオ
マテリアルとして（J.Surg.Res. 10:485-491, 1970）、
またある種の薬剤を徐放するためのキャリアーとして
（J.Controlled Release 33:307-315, 1995）、医療分
野で広く利用されている。しかし、現在用いられている
コラーゲンの大部分はウシやブタ等の動物組織由来のも
のであり、これらのコラーゲンをヒトに移植した場合、
約３％の患者にアレルギー反応が生じることが知られて
いる（J.Immunol.136:877-882, 1986；Biomaterials 1
1:176-180, 1990）。また、動物組織由来コラーゲンに
おけるウイルスやブリオン等病原体混入の危険性は近年
大きな問題となっている。そのため抗原性が無く、また
病原体混入の危険性が無い組換え型ヒト・コラーゲンを
産生するシステムが望まれている。そこで、この出願の
発明者らの一部は、ヒト・コラーゲンをコードするｃＤ
ＮＡを挿入した組換えウイルスを昆虫細胞に感染させる
ことにより、ヒト生体内のものと同等な三重らせん構造
を有する組換えヒト・コラーゲンを製造する方法を発明
し、特許出願している（特開平８−２３９７９号公
報）。また、哺乳動物細胞や酵母を用いてヒト・コラー
ゲンを製造する方法も考案されている（特表平７−５０
１９３９公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、組換え
ヒト・コラーゲンを生産する方法として、昆虫細胞、哺
乳動物細胞、酵母を用いる方法等が考案されているが、
昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いる方法では医療分野で用
いることが可能なほどの高い生産量を上げることは難し
い。また、酵母を用いる方法は、組換え産物が菌体内に
産生されるため、組換えヒト・コラーゲンの精製は必ず
しも容易ではない。
ヒト・コラーゲンを生産する方法として、昆虫細胞、哺
乳動物細胞、酵母を用いる方法等が考案されているが、
昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いる方法では医療分野で用
いることが可能なほどの高い生産量を上げることは難し
い。また、酵母を用いる方法は、組換え産物が菌体内に
産生されるため、組換えヒト・コラーゲンの精製は必ず
しも容易ではない。
【０００４】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消
し、高い生産性と精製の容易さを兼ね備えた組換えヒト
・コラーゲン生産法と、そのための遺伝子工学材料を提
供することを課題といている。
鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消
し、高い生産性と精製の容易さを兼ね備えた組換えヒト
・コラーゲン生産法と、そのための遺伝子工学材料を提
供することを課題といている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決する第１の発明として、ヒト・コラーゲンをコー
ドするポリヌクレオチドをゲノムDNA内に有し、組換え
ヒト・コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一
部として産生する形質転換カイコを提供する。
を解決する第１の発明として、ヒト・コラーゲンをコー
ドするポリヌクレオチドをゲノムDNA内に有し、組換え
ヒト・コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一
部として産生する形質転換カイコを提供する。
【０００６】またこの出願は、第２の発明として、ヒト
・コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドをゲノムDNA内に有し、
前記融合タンパク質を繭または絹糸腺内のタンパク質の
一部として産生する形質転換カイコを提供する。
・コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドをゲノムDNA内に有し、
前記融合タンパク質を繭または絹糸腺内のタンパク質の
一部として産生する形質転換カイコを提供する。
【０００７】なお、これら第１発明および第２発明の形
質転換カイコには、カイコ成虫、幼虫、蛹および卵が含
まれる。これら第１発明および第２発明の形質転換カイ
コは、さらに、プロリン水酸化酵素αサブユニットおよ
びβサブユニットの少なくとも一方をコードするポリヌ
クレオチドをゲノムDNA内に有すること、そしてプロリ
ン水酸化酵素αサブユニットをコードするポリヌクレオ
チドが、配列番号１の塩基配列を有することをそれぞれ
好ましい態様としている。
質転換カイコには、カイコ成虫、幼虫、蛹および卵が含
まれる。これら第１発明および第２発明の形質転換カイ
コは、さらに、プロリン水酸化酵素αサブユニットおよ
びβサブユニットの少なくとも一方をコードするポリヌ
クレオチドをゲノムDNA内に有すること、そしてプロリ
ン水酸化酵素αサブユニットをコードするポリヌクレオ
チドが、配列番号１の塩基配列を有することをそれぞれ
好ましい態様としている。
【０００８】この出願はさらに第３の発明として、前記
第１発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換え
ヒト・コラーゲンを単離、精製することを特徴とする組
換えヒト・コラーゲンの製造方法を提供する。
第１発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換え
ヒト・コラーゲンを単離、精製することを特徴とする組
換えヒト・コラーゲンの製造方法を提供する。
【０００９】また、第４の発明として、前記第２発明の
形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒト・コラ
ーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離
し、この融合タンパク質から組換えヒト・コラーゲンを
分離、精製することを特徴とする組換えヒト・コラーゲ
ンの製造方法を提供する。
形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒト・コラ
ーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離
し、この融合タンパク質から組換えヒト・コラーゲンを
分離、精製することを特徴とする組換えヒト・コラーゲ
ンの製造方法を提供する。
【００１０】また、第５の発明として、前記第２発明の
形質転換カイコが産生する組換えヒト・コラーゲンとカ
イコ絹タンパク質との融合タンパク質を提供する。この
出願はさらにまた、第６の発明として、少なくとも以下
の組換えベクター： (1) 昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反
復配列に挟まれた ヒト・コラーゲン発現カセットを
有する組換えベクター；および (2) トランスポゾンのトランスポゼースをコードする
ポリヌクレオチド を有する組換えベクターからなる
組換えベクターセットを提供する。
形質転換カイコが産生する組換えヒト・コラーゲンとカ
イコ絹タンパク質との融合タンパク質を提供する。この
出願はさらにまた、第６の発明として、少なくとも以下
の組換えベクター： (1) 昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反
復配列に挟まれた ヒト・コラーゲン発現カセットを
有する組換えベクター；および (2) トランスポゾンのトランスポゼースをコードする
ポリヌクレオチド を有する組換えベクターからなる
組換えベクターセットを提供する。
【００１１】この第６発明のベクターセットにおいて
は、さらに以下の組換えベクタ ー： (3) 外来性のプロリン水酸化酵素αサブユニットおよ
びβサブユニット の少なくとも一方をコードするポ
リヌクレオチドを有する組換えベク ターを含むこ
と、そしてプロリン水酸化酵素αサブユニットをコード
するポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列を有す
ることをそれぞれ好ましい態様としている。
は、さらに以下の組換えベクタ ー： (3) 外来性のプロリン水酸化酵素αサブユニットおよ
びβサブユニット の少なくとも一方をコードするポ
リヌクレオチドを有する組換えベク ターを含むこ
と、そしてプロリン水酸化酵素αサブユニットをコード
するポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列を有す
ることをそれぞれ好ましい態様としている。
【００１２】さらにこの第６発明のベクターセットにお
いては、ヒト・コラーゲン発現カセットが、カイコ絹タ
ンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒト・コラー
ゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリ
ヌクレオチド、またはカイコ絹タンパク質遺伝子の発現
制御配列の支配下に、カイコ絹タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドとヒト・コラーゲンをコードするポリ
ヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであるこ
とを具体的な態様としている。
いては、ヒト・コラーゲン発現カセットが、カイコ絹タ
ンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒト・コラー
ゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリ
ヌクレオチド、またはカイコ絹タンパク質遺伝子の発現
制御配列の支配下に、カイコ絹タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドとヒト・コラーゲンをコードするポリ
ヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであるこ
とを具体的な態様としている。
【００１３】この出願は、またさらに第７の発明とし
て、配列番号１の塩基配列を含み、カイコ由来のプロリ
ン水酸化酵素αサブユニットをコードする新規cDNA断片
をも提供する。
て、配列番号１の塩基配列を含み、カイコ由来のプロリ
ン水酸化酵素αサブユニットをコードする新規cDNA断片
をも提供する。
【００１４】以下、実施形態を示し、これらの発明につ
いてさらに詳しく説明する。
いてさらに詳しく説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】コラーゲンには現在までにＩ型か
らXIX型までの19種の異なった型のものが存在すること
が知られている。これらのコラーゲンはいずれも三つの
サブユニット（α鎖）から形成される三量体分子で、そ
の分子内に三重らせん構造をもつことが特徴である。コ
ラーゲンの中には、先ず前駆体であるプロコラーゲンと
して合成された後、成熟型のコラーゲン分子に変換され
るものがある。例えばＩ、II、III型コラーゲン等の線
維性コラーゲンは、その本体である三重らせん領域のア
ミノ末端側およびカルボキシル末端側に非三重らせん構
造のアミノプロペプチドおよびカルボキシルプロペプチ
ドを有したプロコラーゲンとして合成され、両方のプロ
ペプチドが特異的なプロテアーゼにより切断された後、
成熟したコラーゲンとなる。また、コラーゲンはその生
合成過程で、プロリンの水酸化、リジンの水酸化、リジ
ンおよび水酸化リジンの酸化（アルデヒド化）等を含む
様々な翻訳後修飾を受ける。特にプロリン水酸化酵素に
よるプロリンの水酸化は、コラーゲンが生理的温度での
安定性を獲得する上で非常に重要である。
らXIX型までの19種の異なった型のものが存在すること
が知られている。これらのコラーゲンはいずれも三つの
サブユニット（α鎖）から形成される三量体分子で、そ
の分子内に三重らせん構造をもつことが特徴である。コ
ラーゲンの中には、先ず前駆体であるプロコラーゲンと
して合成された後、成熟型のコラーゲン分子に変換され
るものがある。例えばＩ、II、III型コラーゲン等の線
維性コラーゲンは、その本体である三重らせん領域のア
ミノ末端側およびカルボキシル末端側に非三重らせん構
造のアミノプロペプチドおよびカルボキシルプロペプチ
ドを有したプロコラーゲンとして合成され、両方のプロ
ペプチドが特異的なプロテアーゼにより切断された後、
成熟したコラーゲンとなる。また、コラーゲンはその生
合成過程で、プロリンの水酸化、リジンの水酸化、リジ
ンおよび水酸化リジンの酸化（アルデヒド化）等を含む
様々な翻訳後修飾を受ける。特にプロリン水酸化酵素に
よるプロリンの水酸化は、コラーゲンが生理的温度での
安定性を獲得する上で非常に重要である。
【００１６】この出願の発明が対象とするヒト・コラー
ゲンは、Ｉ型からXIX型コラーゲンを含むすべてのコラ
ーゲンであり、これらコラーゲンの部分アミノ酸配列も
含む。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分
を改変したものや、コラーゲンに由来しないアミノ酸配
列を付加したものも含む。また、成熟したコラーゲンに
加え、前駆体であるプロコラーゲンやプロペプチドの一
部が切断されたのもの含む。さらに、この出願の発明で
は、プロリンの水酸化を含む翻訳後修飾が不完全であっ
たり、三重らせん構造が不完全である未成熟なコラーゲ
ン分子も対象とする。
ゲンは、Ｉ型からXIX型コラーゲンを含むすべてのコラ
ーゲンであり、これらコラーゲンの部分アミノ酸配列も
含む。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分
を改変したものや、コラーゲンに由来しないアミノ酸配
列を付加したものも含む。また、成熟したコラーゲンに
加え、前駆体であるプロコラーゲンやプロペプチドの一
部が切断されたのもの含む。さらに、この出願の発明で
は、プロリンの水酸化を含む翻訳後修飾が不完全であっ
たり、三重らせん構造が不完全である未成熟なコラーゲ
ン分子も対象とする。
【００１７】カイコは吐糸期にはいると、大量の絹糸を
吐き出して繭を作る。この絹糸の主成分はフィブロイ
ン、P25およびセリシンを含む絹タンパク質であり、こ
れら絹タンパク質の合成量は１頭のカイコあたり平均で
約0.5gにも達するほど莫大である。絹タンパク質は絹糸
腺と呼ばれる器官で合成される。絹糸腺は後部絹糸腺、
中部絹糸腺および前部絹糸腺より構成され、後部絹糸腺
ではフィブロインおよびP25が、中部絹糸腺ではセリシ
ンがそれぞれ特異的に合成・分泌される。フィブロイン
はH鎖およびL鎖から構成される複合体で、さらにこの複
合体にP25が会合している（J. Biol. Chem. 275, 40517
-40528, 2000）。後部絹糸腺から分泌されたフィブロイ
ンおよびP25は、絹糸腺の蠕動運動によって徐々に中部
絹糸腺へと送られ、そこで分泌されたセリシンによって
周りを被覆され、さらに前部絹糸腺へと送られ絹糸とし
て吐糸される。このように、カイコ絹糸腺は優れたタン
パク質合成能力を有した器官であり、この器官で組換え
ヒト・コラーゲンを発現させた場合、非常に高い生産性
が期待できる。さらに、絹糸は体外に排出されること、
絹糸を構成する絹タンパク質の種類が少ないこと、およ
び絹タンパク質の中で最も存在量の多いフィブロインは
水溶液に不溶性であることから、合成された組換えヒト
・コラーゲンをカイコが吐き出した繭から、または絹糸
腺内のタンパク質から回収および精製することは著しく
容易である。
吐き出して繭を作る。この絹糸の主成分はフィブロイ
ン、P25およびセリシンを含む絹タンパク質であり、こ
れら絹タンパク質の合成量は１頭のカイコあたり平均で
約0.5gにも達するほど莫大である。絹タンパク質は絹糸
腺と呼ばれる器官で合成される。絹糸腺は後部絹糸腺、
中部絹糸腺および前部絹糸腺より構成され、後部絹糸腺
ではフィブロインおよびP25が、中部絹糸腺ではセリシ
ンがそれぞれ特異的に合成・分泌される。フィブロイン
はH鎖およびL鎖から構成される複合体で、さらにこの複
合体にP25が会合している（J. Biol. Chem. 275, 40517
-40528, 2000）。後部絹糸腺から分泌されたフィブロイ
ンおよびP25は、絹糸腺の蠕動運動によって徐々に中部
絹糸腺へと送られ、そこで分泌されたセリシンによって
周りを被覆され、さらに前部絹糸腺へと送られ絹糸とし
て吐糸される。このように、カイコ絹糸腺は優れたタン
パク質合成能力を有した器官であり、この器官で組換え
ヒト・コラーゲンを発現させた場合、非常に高い生産性
が期待できる。さらに、絹糸は体外に排出されること、
絹糸を構成する絹タンパク質の種類が少ないこと、およ
び絹タンパク質の中で最も存在量の多いフィブロインは
水溶液に不溶性であることから、合成された組換えヒト
・コラーゲンをカイコが吐き出した繭から、または絹糸
腺内のタンパク質から回収および精製することは著しく
容易である。
【００１８】カイコにおける一過性の外来遺伝子発現シ
ステムはカイコ核多角体ウイルス（BmNPV）をベクター
として利用する方法が確立されている（特公平７−９７
９９５号公報）。しかし、この方法ではウイルスの感染
によりカイコは致死するため、次世代以降に外来遺伝子
を伝達することはできず、有用タンパク質の発現は一代
限りである。そのため、外来遺伝子を発現させる度にウ
イルス接種を行う必要がある。一方、田村ら（Nat. Bio
technol. 18, 81-84, 2000）は、鱗翅目昆虫Trichoplus
ia niに由来するDNA型トランスポゾンであるpiggyBacを
組み込んだプラスミドベクターをカイコ卵に微量注射す
ることにより、世代を通じて永続的に外来遺伝子が組み
込まれた形質転換カイコを作製することに成功してい
る。
ステムはカイコ核多角体ウイルス（BmNPV）をベクター
として利用する方法が確立されている（特公平７−９７
９９５号公報）。しかし、この方法ではウイルスの感染
によりカイコは致死するため、次世代以降に外来遺伝子
を伝達することはできず、有用タンパク質の発現は一代
限りである。そのため、外来遺伝子を発現させる度にウ
イルス接種を行う必要がある。一方、田村ら（Nat. Bio
technol. 18, 81-84, 2000）は、鱗翅目昆虫Trichoplus
ia niに由来するDNA型トランスポゾンであるpiggyBacを
組み込んだプラスミドベクターをカイコ卵に微量注射す
ることにより、世代を通じて永続的に外来遺伝子が組み
込まれた形質転換カイコを作製することに成功してい
る。
【００１９】この出願の発明では、ヒト・コラーゲン発
現カセットをDNA型トランスポゾンをもとに作製したプ
ラスミドベクターへ組み込み、このベクターをカイコ卵
へ微量注入するとことによりカイコ染色体内にヒト・コ
ラーゲン発現カセットを挿入し、世代を通じて永続的に
組換えヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコを作
製する。
現カセットをDNA型トランスポゾンをもとに作製したプ
ラスミドベクターへ組み込み、このベクターをカイコ卵
へ微量注入するとことによりカイコ染色体内にヒト・コ
ラーゲン発現カセットを挿入し、世代を通じて永続的に
組換えヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコを作
製する。
【００２０】ヒト・コラーゲンをコードするポリヌクレ
オチドは、ヒト・コラーゲンのゲノムDNA、mRNAまたはm
RNAから合成したcDNA等を用いることができるが、好ま
しくはcDNAを使用する。
オチドは、ヒト・コラーゲンのゲノムDNA、mRNAまたはm
RNAから合成したcDNA等を用いることができるが、好ま
しくはcDNAを使用する。
【００２１】ヒト・コラーゲンcDNAはＩ型からXIX型コ
ラーゲンのいずれのcDNAであってもよい。これらのcDNA
の塩基配列は文献（例えば、Essays Biochem. 27:49-6
7, 1992；Annu. Rev. Biochem. 64:403-434, 1995）に
記載された情報から入手可能であり、例えば、これらの
cDNA配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとしてヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする
方法や、あるいはcDNA配列の両端に対応するオリゴヌク
レオチドをプライマーとし、ヒトの遺伝子を鋳型とする
ＰＣＲ法、またはヒト細胞から抽出したRNAを鋳型とす
るRT-PCR法によって、ヒトＩ型〜XIX型コラーゲンの各c
DNAを得ることができる。
ラーゲンのいずれのcDNAであってもよい。これらのcDNA
の塩基配列は文献（例えば、Essays Biochem. 27:49-6
7, 1992；Annu. Rev. Biochem. 64:403-434, 1995）に
記載された情報から入手可能であり、例えば、これらの
cDNA配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとしてヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする
方法や、あるいはcDNA配列の両端に対応するオリゴヌク
レオチドをプライマーとし、ヒトの遺伝子を鋳型とする
ＰＣＲ法、またはヒト細胞から抽出したRNAを鋳型とす
るRT-PCR法によって、ヒトＩ型〜XIX型コラーゲンの各c
DNAを得ることができる。
【００２２】カイコ絹糸腺細胞にてヒト・コラーゲンcD
NAを発現させるために、ヒト・コラーゲンcDNAの上流に
フィブロインH鎖、フィブロインL鎖、P25およびセリシ
ンを含む絹タンパク質遺伝子由来の発現制御配列（プロ
モーターおよびエンハンサー）を組み込む。これら絹タ
ンパク質のプロモーターおよびエンハンサーを利用する
ことにより、組換えヒト・コラーゲンを絹糸腺特異的に
大量に発現させることができる。例えば、フィブロイン
H鎖、フィブロインL鎖、P25のプロモーターおよびエン
ハンサーを利用すれば、ヒト・コラーゲンを後部絹糸腺
で発現させることができ、セリシンのプロモーターおよ
びエンハンサーを利用すれば、ヒト・コラーゲンを中部
絹糸腺で発現させることができる。また、絹糸腺細胞か
らの分泌や吐糸を容易にするために、ヒト・コラーゲン
cDNAとフィブロインH鎖、フィブロインL鎖、P25および
セリシンを含む絹タンパク質cDNAとの融合ポリヌクレオ
チドを作製し、この融合ポリヌクレオチドをカイコ・ゲ
ノム配列内に組み込むことにより、ヒト・コラーゲンと
カイコ絹タンパク質の融合タンパク質を合成させても良
い。この場合、融合させるタンパク質は絹タンパク質の
部分アミノ酸配列であっても良いし、全長アミノ酸配列
であっても良い。例えば、ヒト・コラーゲンのシグナル
ペプチドを絹タンパク質のシグナルペプチドと置換した
融合タンパク質を合成させれば、ヒト・コラーゲンの絹
糸腺細胞からの分泌を容易にすることができる。また、
例えばフィブロインL鎖全長とヒト・コラーゲンの融合
タンパク質を合成させれば、合成されたフィブロインL
鎖とヒト・コラーゲンの融合タンパク質は、フィブロイ
ンH鎖とジスルフィド結合により複合体を形成し、より
効率良く分泌させることができる。
NAを発現させるために、ヒト・コラーゲンcDNAの上流に
フィブロインH鎖、フィブロインL鎖、P25およびセリシ
ンを含む絹タンパク質遺伝子由来の発現制御配列（プロ
モーターおよびエンハンサー）を組み込む。これら絹タ
ンパク質のプロモーターおよびエンハンサーを利用する
ことにより、組換えヒト・コラーゲンを絹糸腺特異的に
大量に発現させることができる。例えば、フィブロイン
H鎖、フィブロインL鎖、P25のプロモーターおよびエン
ハンサーを利用すれば、ヒト・コラーゲンを後部絹糸腺
で発現させることができ、セリシンのプロモーターおよ
びエンハンサーを利用すれば、ヒト・コラーゲンを中部
絹糸腺で発現させることができる。また、絹糸腺細胞か
らの分泌や吐糸を容易にするために、ヒト・コラーゲン
cDNAとフィブロインH鎖、フィブロインL鎖、P25および
セリシンを含む絹タンパク質cDNAとの融合ポリヌクレオ
チドを作製し、この融合ポリヌクレオチドをカイコ・ゲ
ノム配列内に組み込むことにより、ヒト・コラーゲンと
カイコ絹タンパク質の融合タンパク質を合成させても良
い。この場合、融合させるタンパク質は絹タンパク質の
部分アミノ酸配列であっても良いし、全長アミノ酸配列
であっても良い。例えば、ヒト・コラーゲンのシグナル
ペプチドを絹タンパク質のシグナルペプチドと置換した
融合タンパク質を合成させれば、ヒト・コラーゲンの絹
糸腺細胞からの分泌を容易にすることができる。また、
例えばフィブロインL鎖全長とヒト・コラーゲンの融合
タンパク質を合成させれば、合成されたフィブロインL
鎖とヒト・コラーゲンの融合タンパク質は、フィブロイ
ンH鎖とジスルフィド結合により複合体を形成し、より
効率良く分泌させることができる。
【００２３】形質転換カイコ作成のための組換えベクタ
ーには、ヒト・コラーゲン発現カセットを挟むようにし
て、昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の反復配列を
組み込む。昆虫由来DNA型トランスポゾンとしては、pig
gyBac、mariner（Insect Mol. Biol. 9, 145-155, 200
0）、およびMinos（Insect Mol. Biol. 9, 277-281, 20
00）等が知られている。これらのトランスポゾンは、カ
イコ細胞内で転移活性を示すことことから、これらのDN
A型トランスポゾンをもとに作製したベクターによりカ
イコを形質転換させることが可能である。特にpiggyBac
をもとに作製したプラスミドベクターは、カイコ卵に微
量注入することにより、実際にカイコを形質転換させる
ことに成功している（Nat. Biotechnol. 18, 81-84 , 2
000）。以下にpiggyBacを例に挙げて、その性質および
ヒト・コラーゲン遺伝子を導入する方法を説明するが、
この発明で使用する昆虫由来DNA型トランスポゾンはpig
gyBacに限定するものではなく、marinerおよびMinosを
含む他のDNA型トランスポゾンであっても良い。これらp
iggyBac以外のトランスポゾンを用いた場合のヒト・コ
ラーゲン遺伝子を導入する方法は、以下に記したpiggyB
acを用いた方法と基本的に同様である。
ーには、ヒト・コラーゲン発現カセットを挟むようにし
て、昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の反復配列を
組み込む。昆虫由来DNA型トランスポゾンとしては、pig
gyBac、mariner（Insect Mol. Biol. 9, 145-155, 200
0）、およびMinos（Insect Mol. Biol. 9, 277-281, 20
00）等が知られている。これらのトランスポゾンは、カ
イコ細胞内で転移活性を示すことことから、これらのDN
A型トランスポゾンをもとに作製したベクターによりカ
イコを形質転換させることが可能である。特にpiggyBac
をもとに作製したプラスミドベクターは、カイコ卵に微
量注入することにより、実際にカイコを形質転換させる
ことに成功している（Nat. Biotechnol. 18, 81-84 , 2
000）。以下にpiggyBacを例に挙げて、その性質および
ヒト・コラーゲン遺伝子を導入する方法を説明するが、
この発明で使用する昆虫由来DNA型トランスポゾンはpig
gyBacに限定するものではなく、marinerおよびMinosを
含む他のDNA型トランスポゾンであっても良い。これらp
iggyBac以外のトランスポゾンを用いた場合のヒト・コ
ラーゲン遺伝子を導入する方法は、以下に記したpiggyB
acを用いた方法と基本的に同様である。
【００２４】piggyBacは、鱗翅目昆虫Trichoplusia ni
由来の培養細胞であるTN-368から単離されたDNA型トラ
ンスポゾンである。中央部にあるトランスポゼースORF
と、その両端に存在する13 bpの逆向き反復配列から構
成されており、長さは約2.5 kbである。トランスポゼー
スORFからはトランスポゼースタンパク質が合成され、
この酵素の作用により、逆向き反復配列にはさまれた領
域（piggyBac自体）を標的配列であるTTAAに転移させる
（Virology 161, 8-17, 1989）。このようなpiggyBacの
性質を利用してカイコ・ゲノム配列内にヒト・コラーゲ
ン発現カセットを挿入するには、例えば田村らの方法
（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）と同様な方法に
よって行うことができる。即ち、piggyBacの一対の逆向
き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、ヒ
ト・コラーゲン発現カセットを一対の逆向き反復配列で
夾むように挿入する。そしてこのプラスミドベクター
を、piggBacのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパ
ープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘ
ルパープラスミドは、piggyBacの逆向き反復配列の片方
または両方を欠いた、実質的にはpiggyBacのトランスポ
ゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラス
ミドベクターである。このヘルパープラスミドにおい
て、トランスポゼースを発現させるためのプロモーター
は、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま
利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモ
ーターやショウジョウバエHSP70プロモーター等を利用
してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にす
るために、コラーゲン発現カセットを組み込んだベクタ
ー内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともで
きる。この場合、マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ
・アクチンプロモーターやショウジョウバエHSP70プロ
モーター等のプロモーター配列を組み込み、その作用に
よりマーカー遺伝子を発現させるようにする。
由来の培養細胞であるTN-368から単離されたDNA型トラ
ンスポゾンである。中央部にあるトランスポゼースORF
と、その両端に存在する13 bpの逆向き反復配列から構
成されており、長さは約2.5 kbである。トランスポゼー
スORFからはトランスポゼースタンパク質が合成され、
この酵素の作用により、逆向き反復配列にはさまれた領
域（piggyBac自体）を標的配列であるTTAAに転移させる
（Virology 161, 8-17, 1989）。このようなpiggyBacの
性質を利用してカイコ・ゲノム配列内にヒト・コラーゲ
ン発現カセットを挿入するには、例えば田村らの方法
（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）と同様な方法に
よって行うことができる。即ち、piggyBacの一対の逆向
き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、ヒ
ト・コラーゲン発現カセットを一対の逆向き反復配列で
夾むように挿入する。そしてこのプラスミドベクター
を、piggBacのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパ
ープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘ
ルパープラスミドは、piggyBacの逆向き反復配列の片方
または両方を欠いた、実質的にはpiggyBacのトランスポ
ゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラス
ミドベクターである。このヘルパープラスミドにおい
て、トランスポゼースを発現させるためのプロモーター
は、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま
利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモ
ーターやショウジョウバエHSP70プロモーター等を利用
してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にす
るために、コラーゲン発現カセットを組み込んだベクタ
ー内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともで
きる。この場合、マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ
・アクチンプロモーターやショウジョウバエHSP70プロ
モーター等のプロモーター配列を組み込み、その作用に
よりマーカー遺伝子を発現させるようにする。
【００２５】ベクターを微量注入したカイコ卵から孵化
した幼虫（F0世代）を飼育する。このF0世代のカイコの
うち一部カイコには、ヒト・コラーゲン発現カセットが
組み込まれている。しかし、この世代のカイコでは、カ
イコ体内の全細胞のうちの一部分の細胞にのみにヒト・
コラーゲン発現カセットが組み込まれており、全細胞に
ヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれたカイコを
得るためには、F0カイコを交配し、生殖細胞を通じてヒ
ト・コラーゲン発現カセットが伝達された形質転換カイ
コを得なければならない。即ち、得られた全F0世代のカ
イコを野生型カイコと、あるいはF0カイコ同士で交配
し、次世代（F1世代）のカイコからヒト・コラーゲン発
現カセットを有した形質転換カイコを選抜する必要があ
る。F1世代のカイコからの形質転換カイコの選抜は、例
えばＰＣＲ法やサザンブロット法を用いて行う。また、
マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を
利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺
伝子としてGFP等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場
合には、F1世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍
光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うこ
とができる。このようにして選抜されたカイコは、その
染色体内にヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれ
ている形質転換カイコである。従って、これらのカイコ
を野生型カイコと、あるいは形質転換カイコどうしで交
配させた子孫においてもヒト・コラーゲン発現カセット
は消失することなく伝達され、世代を通じてヒト・コラ
ーゲンまたはコラーゲンと絹タンパク質との融合タンパ
ク質を産生させることができる。
した幼虫（F0世代）を飼育する。このF0世代のカイコの
うち一部カイコには、ヒト・コラーゲン発現カセットが
組み込まれている。しかし、この世代のカイコでは、カ
イコ体内の全細胞のうちの一部分の細胞にのみにヒト・
コラーゲン発現カセットが組み込まれており、全細胞に
ヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれたカイコを
得るためには、F0カイコを交配し、生殖細胞を通じてヒ
ト・コラーゲン発現カセットが伝達された形質転換カイ
コを得なければならない。即ち、得られた全F0世代のカ
イコを野生型カイコと、あるいはF0カイコ同士で交配
し、次世代（F1世代）のカイコからヒト・コラーゲン発
現カセットを有した形質転換カイコを選抜する必要があ
る。F1世代のカイコからの形質転換カイコの選抜は、例
えばＰＣＲ法やサザンブロット法を用いて行う。また、
マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を
利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺
伝子としてGFP等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場
合には、F1世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍
光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うこ
とができる。このようにして選抜されたカイコは、その
染色体内にヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれ
ている形質転換カイコである。従って、これらのカイコ
を野生型カイコと、あるいは形質転換カイコどうしで交
配させた子孫においてもヒト・コラーゲン発現カセット
は消失することなく伝達され、世代を通じてヒト・コラ
ーゲンまたはコラーゲンと絹タンパク質との融合タンパ
ク質を産生させることができる。
【００２６】上記のヒト・コラーゲン発現カセットを有
する形質転換カイコに、さらにプロリン水酸化酵素をコ
ードするポリヌクレオチドを絹糸腺で発現しうる形態で
導入すれば、生理的温度において完全に熱安定なヒト・
コラーゲンを生産させることができる。導入するプロリ
ン水酸化酵素ポリヌクレオチド（例えばcDNA）は、ヒト
や他の動物に由来するポリヌクレオチドであっても良い
し、カイコ由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチド
でも良い。プロリン水酸化酵素はαサブユニットとβサ
ブユニットの複合体であり、この複合体を形成しなけれ
ば酵素活性は生じない。αサブユニットは触媒活性を有
するサブユニットであり、本来コラーゲンを産生する細
胞に存在する。一方、βサブユニットはタンパク質のジ
スルフィド結合の構造変換を触媒する酵素であるプロテ
インジスルフィドイソメラーゼと同一のポリペプチドで
あり、全ての細胞に普遍的にかつ比較的多量に存在す
る。カイコ絹糸腺細胞は、コラーゲンを多量に産生する
細胞ではないのでαサブユニットの存在量はわずかであ
るが、βサブユニットは比較的多量に存在する。カイコ
にプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入し、カイ
コ絹糸腺にてプロリン水酸化酵素を発現させるには、上
記のようにヒト等の動物由来のプロリン水酸化酵素ポリ
ヌクレオチドを用いる方法と、カイコのプロリン水酸化
酵素ポリヌクレオチドを用いる方法がある。ヒト等動物
由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場
合、αサブユニットおよびβサブユニットのそれぞれを
コードする２種類のポリヌクレオチドが必要である。昆
虫のβサブユニットはヒト等動物由来のαサブユニット
とほとんど活性型の複合体を形成しないため、ヒト等動
物由来のαサブユニットの発現のみでは活性型の酵素を
合成させることができない。一方、カイコのプロリン水
酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合は、αサブユニ
ットのものだけでよい。絹糸腺にて発現するαサブユニ
ットは、比較的多量に存在する内在性のβサブユニット
と活性型の複合体を形成することができるからである。
する形質転換カイコに、さらにプロリン水酸化酵素をコ
ードするポリヌクレオチドを絹糸腺で発現しうる形態で
導入すれば、生理的温度において完全に熱安定なヒト・
コラーゲンを生産させることができる。導入するプロリ
ン水酸化酵素ポリヌクレオチド（例えばcDNA）は、ヒト
や他の動物に由来するポリヌクレオチドであっても良い
し、カイコ由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチド
でも良い。プロリン水酸化酵素はαサブユニットとβサ
ブユニットの複合体であり、この複合体を形成しなけれ
ば酵素活性は生じない。αサブユニットは触媒活性を有
するサブユニットであり、本来コラーゲンを産生する細
胞に存在する。一方、βサブユニットはタンパク質のジ
スルフィド結合の構造変換を触媒する酵素であるプロテ
インジスルフィドイソメラーゼと同一のポリペプチドで
あり、全ての細胞に普遍的にかつ比較的多量に存在す
る。カイコ絹糸腺細胞は、コラーゲンを多量に産生する
細胞ではないのでαサブユニットの存在量はわずかであ
るが、βサブユニットは比較的多量に存在する。カイコ
にプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入し、カイ
コ絹糸腺にてプロリン水酸化酵素を発現させるには、上
記のようにヒト等の動物由来のプロリン水酸化酵素ポリ
ヌクレオチドを用いる方法と、カイコのプロリン水酸化
酵素ポリヌクレオチドを用いる方法がある。ヒト等動物
由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場
合、αサブユニットおよびβサブユニットのそれぞれを
コードする２種類のポリヌクレオチドが必要である。昆
虫のβサブユニットはヒト等動物由来のαサブユニット
とほとんど活性型の複合体を形成しないため、ヒト等動
物由来のαサブユニットの発現のみでは活性型の酵素を
合成させることができない。一方、カイコのプロリン水
酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合は、αサブユニ
ットのものだけでよい。絹糸腺にて発現するαサブユニ
ットは、比較的多量に存在する内在性のβサブユニット
と活性型の複合体を形成することができるからである。
【００２７】この出願は、カイコ・プロリン水酸化酵素
αサブユニットをコードする新規なポリヌクレオチドと
して、配列番号１の塩基配列を含むcDNAを提供する。こ
のcDNAをカイコ染色体内に導入するには、カイコ絹糸腺
でcDNAを発現させることができるプロモーターをcDNAの
上流に連結して発現カセットを構築する。この条件を満
たすプロモーターとしては、例えば絹糸腺だけで遺伝子
を発現させることができるフィブロイン、P25、および
セリシンを含む絹タンパク質のプロモーターや、どの組
織でも発現可能なプロモーターであるカイコ・アクチ
ン、ショウジョウバエHSP70、AcNPVのIE1等のプロモー
ターを挙げることができる。このようにして構築したプ
ロリン水酸化酵素発現カセットをカイコ染色体に導入す
る方法は、前記のヒト・コラーゲンを導入する方法と同
じ方法を用いればよい。即ち、プロリン水酸化酵素発現
カセットをpiggyBac等のDNA型トランスポゾンの一対の
逆向き反復配列で夾むようにしてプラスミドベクターに
挿入し、このプラスミドとヘルパープラスミドをカイコ
卵に微量注入する。ヒト・コラーゲンとプロリン水酸化
酵素の両方の発現カセットを有するカイコを作製するた
めには、ヒト・コラーゲン発現カセットを有する形質転
換カイコにプロリン水酸化酵素発現カセットを導入して
も良いし、逆にプロリン水酸化酵素発現カセットを有す
る形質転換カイコにヒト・コラーゲン発現カセットを導
入しても良い。あるいは、ヒト・コラーゲン発現カセッ
トのみを有する形質転換カイコと、プロリン水酸化酵素
発現カセットを有する形質転換カイコを別々に作製し、
これらを交配させることによって、両方の発現カセット
を有する形質転換カイコを選抜しても良い。
αサブユニットをコードする新規なポリヌクレオチドと
して、配列番号１の塩基配列を含むcDNAを提供する。こ
のcDNAをカイコ染色体内に導入するには、カイコ絹糸腺
でcDNAを発現させることができるプロモーターをcDNAの
上流に連結して発現カセットを構築する。この条件を満
たすプロモーターとしては、例えば絹糸腺だけで遺伝子
を発現させることができるフィブロイン、P25、および
セリシンを含む絹タンパク質のプロモーターや、どの組
織でも発現可能なプロモーターであるカイコ・アクチ
ン、ショウジョウバエHSP70、AcNPVのIE1等のプロモー
ターを挙げることができる。このようにして構築したプ
ロリン水酸化酵素発現カセットをカイコ染色体に導入す
る方法は、前記のヒト・コラーゲンを導入する方法と同
じ方法を用いればよい。即ち、プロリン水酸化酵素発現
カセットをpiggyBac等のDNA型トランスポゾンの一対の
逆向き反復配列で夾むようにしてプラスミドベクターに
挿入し、このプラスミドとヘルパープラスミドをカイコ
卵に微量注入する。ヒト・コラーゲンとプロリン水酸化
酵素の両方の発現カセットを有するカイコを作製するた
めには、ヒト・コラーゲン発現カセットを有する形質転
換カイコにプロリン水酸化酵素発現カセットを導入して
も良いし、逆にプロリン水酸化酵素発現カセットを有す
る形質転換カイコにヒト・コラーゲン発現カセットを導
入しても良い。あるいは、ヒト・コラーゲン発現カセッ
トのみを有する形質転換カイコと、プロリン水酸化酵素
発現カセットを有する形質転換カイコを別々に作製し、
これらを交配させることによって、両方の発現カセット
を有する形質転換カイコを選抜しても良い。
【００２８】ヒト・コラーゲン発現カセットを有する形
質転換カイコは、５齢期に達すると、内在性の絹タンパ
ク質と共にヒト・コラーゲンを合成し、絹糸の一部とし
て繭中にヒト・コラーゲンを分泌する。繭中のヒト・コ
ラーゲンは例えば0.5M酢酸等によって簡単に抽出するこ
とができる。また、例えばヒト・コラーゲンをカイコ・
フィブロインL鎖との融合タンパク質として合成させた
場合には、還元状態にすることにより融合タンパク質と
フィブロインH鎖間のジスルフィド結合を切断し抽出す
ることができる。また、繭中に含まれるヒト・コラーゲ
ンが線維性コラーゲンであり、三重らせん領域部分（ア
テロコラーゲン）のみを精製する場合には、繭のタンパ
ク質をペプシン等のタンパク質分解酵素で処理する。こ
の操作によりタンパク質分解酵素で消化されることのな
いアテロコラーゲンが抽出でき、かつ他の多くのタンパ
ク質はペプシンの消化を受けるため、その後の精製を容
易に行うことができる。また、ヒト・コラーゲンを形質
転換カイコの絹糸腺から繭の場合と同様の方法で抽出・
精製することもきる。絹糸腺はカイコを解剖することに
より簡単に分離することができ、含まれるタンパク質の
ほとんどが絹タンパク質であるため、繭の場合同様、容
易にヒト・コラーゲンを抽出・精製することが可能であ
る。
質転換カイコは、５齢期に達すると、内在性の絹タンパ
ク質と共にヒト・コラーゲンを合成し、絹糸の一部とし
て繭中にヒト・コラーゲンを分泌する。繭中のヒト・コ
ラーゲンは例えば0.5M酢酸等によって簡単に抽出するこ
とができる。また、例えばヒト・コラーゲンをカイコ・
フィブロインL鎖との融合タンパク質として合成させた
場合には、還元状態にすることにより融合タンパク質と
フィブロインH鎖間のジスルフィド結合を切断し抽出す
ることができる。また、繭中に含まれるヒト・コラーゲ
ンが線維性コラーゲンであり、三重らせん領域部分（ア
テロコラーゲン）のみを精製する場合には、繭のタンパ
ク質をペプシン等のタンパク質分解酵素で処理する。こ
の操作によりタンパク質分解酵素で消化されることのな
いアテロコラーゲンが抽出でき、かつ他の多くのタンパ
ク質はペプシンの消化を受けるため、その後の精製を容
易に行うことができる。また、ヒト・コラーゲンを形質
転換カイコの絹糸腺から繭の場合と同様の方法で抽出・
精製することもきる。絹糸腺はカイコを解剖することに
より簡単に分離することができ、含まれるタンパク質の
ほとんどが絹タンパク質であるため、繭の場合同様、容
易にヒト・コラーゲンを抽出・精製することが可能であ
る。
【００２９】
【実施例】以下に、ヒトIII型プロコラーゲンのアミノ
酸配列のうち、三重らせん領域の一部を欠いたヒト・ミ
ニIII型コラーゲンの製造方法に関する実施例を挙げて
この出願の発明をより具体的に説明するが、この出願の
発明はこの例に限定されるものではない。 1．ミニコラーゲンベクターの作製 ヒトIII型プロコラーゲンcDNA（塩基番号92-4550 : Gen
eBankデータベース登録番号X14420）をXhoIで消化して
塩基番号1075-3545の領域を取り除いた後、切断末端を
セルフライゲーションにより繋ぐことにより、ミニIII
型コラーゲンcDNAを作製した。このミニコラーゲンcDNA
は、アミノプロペプチド、三重らせん領域の一部（全長
コラーゲン三重らせん領域の約1/5）、およびカルボキ
シルプロペプチドをコードする塩基配列から構成される
ものであり、これをもとにして、以下の３種類のベクタ
ーを構築した。 (1) pMOSRA-4B このベクターに含まれるインサートDNA断片は、カイコ
・セリシンプロモーター、ミニコラーゲンcDNA、および
カイコ・フィブロインL鎖polyA付加シグナルより構成さ
れる。カイコ・セリシンプロモーター（塩基番号1299-1
622 : GeneBankデータベース登録番号AB007831）を5'末
端にBglII切断配列を付加したプライマー（配列番号2）
およびプライマー（配列番号3）を用いたカイコ・ゲノ
ムDNAを鋳型とするPCRによって単離し、これをミニコラ
ーゲンcDNA上流に連結した。また、カイコ・フィブロイ
ンL鎖polyA付加シグナル（塩基番号14141 - 14624 : Ge
neBankデータベース登録番号M76430）をプライマー（配
列番号4）および5'末端にBglII切断配列を付加したプラ
イマー（配列番号5）を用いたカイコ・ゲノムDNAを鋳型
とするPCRによって単離し、ミニコラーゲンcDNAの下流
に連結した（図１）。このようにして得られたインサー
トDNA断片の両末端をBglIIで切断し、さらに切断末端を
T4DNAポリメラーゼで平滑化した後、XhoIで切断した後
切断末端を平滑化したpPIGA3GFPベクター（Nat. Biotec
hnol. 18, 81-84, 2000）に挿入した。なお、pPIGA3GFP
ベクターには、マーカーとしてのEGFP cDNAとこのcDNA
を発現させるためのカイコ・アクチン（A3）プロモータ
ーが組み込まれている。 (2) pMOSRA-5 このベクターに含まれるインサートDNA断片は、カイコ
・フィブロインL鎖プロモーター、カイコ・フィブロイ
ンＬ鎖シグナルペプチドcDNA、ミニコラーゲンcDNA、お
よびカイコ・フィブロインL鎖polyA付加シグナルより構
成される。カイコ・フィブロインL鎖シグナルペプチドc
DNA（塩基番号28-160 : GeneBankデータベース登録番号
X17291）をプライマー（配列番号6）および5'末端にXho
I切断配列を組み込んだプライマー（配列番号7）を用い
たカイコ絹糸腺由来cDNAを鋳型とするPCRによって単離
した。また、ミニコラーゲンcDNAのアミノプロペプチド
をコードする塩基配列内に、クロンテック社のMutagene
sis Kitを用いた部位特異的突然変異法により、制限酵
素XhoIのサイトを導入した。突然変異導入に用いたプラ
イマー（配列番号8）の塩基配列は、III型プロコラーゲ
ンcDNAの塩基番号292から324に対応し、制限酵素XhoI部
位（配列番号8の位置17−22）が挿入されている。次
に、上記XhoI切断配列を導入したミニコラーゲンcDNAの
5'末端から、導入したXhoI切断部位までの領域を、フィ
ブロインL鎖シグナルペプチドcDNAと置換した。さら
に、カイコ・フィブロインL鎖プロモーター（塩基番号4
28-1061 :GeneBankデータベース登録番号M76430）を5'
末端にXbaIおよびBglII切断配列を付加したプライマー
（配列番号9）およびプライマー（配列番号10）を用い
たカイコ・ゲノムDNAを鋳型とするPCRによって単離した
後、これをカイコ・フィブロインL鎖シグナルペプチドc
DNAの上流に連結し、また、カイコ・フィブロインL鎖po
lyA付加シグナルをミニコラーゲンcDNAの下流に連結し
た（図１）。このようにして得られたインサートDNA断
片の両末端をBglIIで切断し、さらに切断末端をT4DNAポ
リメラーゼで平滑化した後、XhoIで切断した後切断末端
を平滑化したpPIGA3GFPベクターに挿入した。 (3) pMOSRA-6 このベクターに含まれるインサートDNA断片は、カイコ
・フィブロインL鎖プロモーター、カイコ・フィブロイ
ンＬ鎖全長cDNA、ミニコラーゲンcDNA、およびカイコ・
フィブロインL鎖polyA付加シグナルより構成される。カ
イコ・フィブロインL鎖全長cDNA（塩基番号30-820 : Ge
neBankデータベース登録番号X17291）は、プライマー
（配列番号11）および5'末端にXhoI切断配列を組み込ん
だプライマー（配列番号12）を用いたカイコ絹糸腺由来
cDNAを鋳型とするPCRによって単離した。次にこのcDNA
を、pMOSRA-5の場合と同様にして、ミニコラーゲンcDNA
の5'末端からアミノプロペプチド内に導入したXhoI切断
部位までの領域と置換した。さらに、カイコ・フィブロ
インL鎖cDNAの上流にカイコ・フィブロインL鎖プロモー
ターを、ミニコラーゲンcDNAの下流にカイコ・フィブロ
インL鎖polyA付加シグナルを連結した（図１）。このよ
うにして得られたインサートDNA断片の両末端をXbaIで
切断し、さらに切断末端をT4DNAポリメラーゼで平滑化
した後、XhoIで切断した後切断末端を平滑化したpPIGA3
GFPベクターに挿入した。 2．プラスミドベクターのカイコ卵への微量注入 上記の３種類のミニコラーゲンベクター（pMOSRA-4B, p
MOSRA-5, pMOSRA-6）を塩化セシウム超遠心法で精製し
た後、この３種類のベクターとヘルパープラスミドであ
るpHA3PIG（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）を混
合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ミニコラーゲ
ンベクターそれぞれの濃度が66.7μg/ml（合計で200μg
/ml）、pHA3PIGの濃度が200μg/mlなるようにインジェ
クションバッファー（0.5 mMリン酸バッファー pH 7.0,
5 mM KCl）に溶解した。このDNA溶液を、産卵後２〜８
時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵
あたり約15〜20 nlの液量で微量注入した。合計1078個
の卵に微量注入を行った。 ３．F1幼虫のスクリーニング ベクターDNAを微量注入した卵を25℃でインキュベート
したところ518個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼
育を続け、413頭の生殖可能な成虫が得られたためこれ
らを交配し、213グループのF1卵塊を得た。次に、これ
らF1卵を孵化させ、孵化した幼虫をグループ毎に蛍光顕
微鏡で観察した。その結果、26グループから緑色蛍光を
発する幼虫を得ることができた。陽性グループに含まれ
る陽性カイコの数は、１グループあたり1頭〜30頭であ
り、これらを合計すると240頭であった。これら陽性F1
カイコを飼育し野生型カイコと交配させ、さらに次の世
代（F2）カイコを得た。F2カイコのうち約1/2のカイコ
は緑色蛍光を発しており、組み込まれたEGFPおよびミニ
コラーゲン遺伝子は、脱落することなく、メンデルの法
則に従って次世代へ伝達されることが確認された。さら
に、産卵後のF1カイコ成虫からゲノムDNAを抽出し、プ
ライマー（配列番号13）およびプライマー（配列番号1
4）を用いたPCRによりミニコラーゲンDNA断片を、また
プライマー（配列番号15）およびプライマー（配列番号
16）を用いたPCRによりEGFP断片を増幅したところ、緑
色蛍光を発する陽性カイコからミニコラーゲンおよびEG
FP DNA断片を検出することができた（図２）。さらにサ
ザンブロット解析を行い、これら外来遺伝子がカイコ・
ゲノムDNA内に組み込まれていることを確認した。 ４．ミニコラーゲンmRNAおよび組換えミニコラーゲンの
検出 ５齢期に達した陽性F1幼虫を解剖して絹糸腺を取りだ
し、酸グアニジンフェノールクロロホルム法によりtota
lRNAを抽出し、そのうちの200ng分のRNAを逆転写して得
られたcDNAを鋳型としPCRを94℃1分、6℃1分、72℃1
分、の反応条件で30サイクル行った（RT-PCR）。プライ
マーは、上記のプライマー（配列番号13）およびプライ
マー（配列番号14）を用いた。その結果、ミニコラーゲ
ンmRNAを検出することができ、カイコ・ゲノムDNAに組
み込まれたミニコラーゲン遺伝子が、絹糸腺細胞内で発
現していることが確かめられた（図３）。
酸配列のうち、三重らせん領域の一部を欠いたヒト・ミ
ニIII型コラーゲンの製造方法に関する実施例を挙げて
この出願の発明をより具体的に説明するが、この出願の
発明はこの例に限定されるものではない。 1．ミニコラーゲンベクターの作製 ヒトIII型プロコラーゲンcDNA（塩基番号92-4550 : Gen
eBankデータベース登録番号X14420）をXhoIで消化して
塩基番号1075-3545の領域を取り除いた後、切断末端を
セルフライゲーションにより繋ぐことにより、ミニIII
型コラーゲンcDNAを作製した。このミニコラーゲンcDNA
は、アミノプロペプチド、三重らせん領域の一部（全長
コラーゲン三重らせん領域の約1/5）、およびカルボキ
シルプロペプチドをコードする塩基配列から構成される
ものであり、これをもとにして、以下の３種類のベクタ
ーを構築した。 (1) pMOSRA-4B このベクターに含まれるインサートDNA断片は、カイコ
・セリシンプロモーター、ミニコラーゲンcDNA、および
カイコ・フィブロインL鎖polyA付加シグナルより構成さ
れる。カイコ・セリシンプロモーター（塩基番号1299-1
622 : GeneBankデータベース登録番号AB007831）を5'末
端にBglII切断配列を付加したプライマー（配列番号2）
およびプライマー（配列番号3）を用いたカイコ・ゲノ
ムDNAを鋳型とするPCRによって単離し、これをミニコラ
ーゲンcDNA上流に連結した。また、カイコ・フィブロイ
ンL鎖polyA付加シグナル（塩基番号14141 - 14624 : Ge
neBankデータベース登録番号M76430）をプライマー（配
列番号4）および5'末端にBglII切断配列を付加したプラ
イマー（配列番号5）を用いたカイコ・ゲノムDNAを鋳型
とするPCRによって単離し、ミニコラーゲンcDNAの下流
に連結した（図１）。このようにして得られたインサー
トDNA断片の両末端をBglIIで切断し、さらに切断末端を
T4DNAポリメラーゼで平滑化した後、XhoIで切断した後
切断末端を平滑化したpPIGA3GFPベクター（Nat. Biotec
hnol. 18, 81-84, 2000）に挿入した。なお、pPIGA3GFP
ベクターには、マーカーとしてのEGFP cDNAとこのcDNA
を発現させるためのカイコ・アクチン（A3）プロモータ
ーが組み込まれている。 (2) pMOSRA-5 このベクターに含まれるインサートDNA断片は、カイコ
・フィブロインL鎖プロモーター、カイコ・フィブロイ
ンＬ鎖シグナルペプチドcDNA、ミニコラーゲンcDNA、お
よびカイコ・フィブロインL鎖polyA付加シグナルより構
成される。カイコ・フィブロインL鎖シグナルペプチドc
DNA（塩基番号28-160 : GeneBankデータベース登録番号
X17291）をプライマー（配列番号6）および5'末端にXho
I切断配列を組み込んだプライマー（配列番号7）を用い
たカイコ絹糸腺由来cDNAを鋳型とするPCRによって単離
した。また、ミニコラーゲンcDNAのアミノプロペプチド
をコードする塩基配列内に、クロンテック社のMutagene
sis Kitを用いた部位特異的突然変異法により、制限酵
素XhoIのサイトを導入した。突然変異導入に用いたプラ
イマー（配列番号8）の塩基配列は、III型プロコラーゲ
ンcDNAの塩基番号292から324に対応し、制限酵素XhoI部
位（配列番号8の位置17−22）が挿入されている。次
に、上記XhoI切断配列を導入したミニコラーゲンcDNAの
5'末端から、導入したXhoI切断部位までの領域を、フィ
ブロインL鎖シグナルペプチドcDNAと置換した。さら
に、カイコ・フィブロインL鎖プロモーター（塩基番号4
28-1061 :GeneBankデータベース登録番号M76430）を5'
末端にXbaIおよびBglII切断配列を付加したプライマー
（配列番号9）およびプライマー（配列番号10）を用い
たカイコ・ゲノムDNAを鋳型とするPCRによって単離した
後、これをカイコ・フィブロインL鎖シグナルペプチドc
DNAの上流に連結し、また、カイコ・フィブロインL鎖po
lyA付加シグナルをミニコラーゲンcDNAの下流に連結し
た（図１）。このようにして得られたインサートDNA断
片の両末端をBglIIで切断し、さらに切断末端をT4DNAポ
リメラーゼで平滑化した後、XhoIで切断した後切断末端
を平滑化したpPIGA3GFPベクターに挿入した。 (3) pMOSRA-6 このベクターに含まれるインサートDNA断片は、カイコ
・フィブロインL鎖プロモーター、カイコ・フィブロイ
ンＬ鎖全長cDNA、ミニコラーゲンcDNA、およびカイコ・
フィブロインL鎖polyA付加シグナルより構成される。カ
イコ・フィブロインL鎖全長cDNA（塩基番号30-820 : Ge
neBankデータベース登録番号X17291）は、プライマー
（配列番号11）および5'末端にXhoI切断配列を組み込ん
だプライマー（配列番号12）を用いたカイコ絹糸腺由来
cDNAを鋳型とするPCRによって単離した。次にこのcDNA
を、pMOSRA-5の場合と同様にして、ミニコラーゲンcDNA
の5'末端からアミノプロペプチド内に導入したXhoI切断
部位までの領域と置換した。さらに、カイコ・フィブロ
インL鎖cDNAの上流にカイコ・フィブロインL鎖プロモー
ターを、ミニコラーゲンcDNAの下流にカイコ・フィブロ
インL鎖polyA付加シグナルを連結した（図１）。このよ
うにして得られたインサートDNA断片の両末端をXbaIで
切断し、さらに切断末端をT4DNAポリメラーゼで平滑化
した後、XhoIで切断した後切断末端を平滑化したpPIGA3
GFPベクターに挿入した。 2．プラスミドベクターのカイコ卵への微量注入 上記の３種類のミニコラーゲンベクター（pMOSRA-4B, p
MOSRA-5, pMOSRA-6）を塩化セシウム超遠心法で精製し
た後、この３種類のベクターとヘルパープラスミドであ
るpHA3PIG（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）を混
合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ミニコラーゲ
ンベクターそれぞれの濃度が66.7μg/ml（合計で200μg
/ml）、pHA3PIGの濃度が200μg/mlなるようにインジェ
クションバッファー（0.5 mMリン酸バッファー pH 7.0,
5 mM KCl）に溶解した。このDNA溶液を、産卵後２〜８
時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵
あたり約15〜20 nlの液量で微量注入した。合計1078個
の卵に微量注入を行った。 ３．F1幼虫のスクリーニング ベクターDNAを微量注入した卵を25℃でインキュベート
したところ518個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼
育を続け、413頭の生殖可能な成虫が得られたためこれ
らを交配し、213グループのF1卵塊を得た。次に、これ
らF1卵を孵化させ、孵化した幼虫をグループ毎に蛍光顕
微鏡で観察した。その結果、26グループから緑色蛍光を
発する幼虫を得ることができた。陽性グループに含まれ
る陽性カイコの数は、１グループあたり1頭〜30頭であ
り、これらを合計すると240頭であった。これら陽性F1
カイコを飼育し野生型カイコと交配させ、さらに次の世
代（F2）カイコを得た。F2カイコのうち約1/2のカイコ
は緑色蛍光を発しており、組み込まれたEGFPおよびミニ
コラーゲン遺伝子は、脱落することなく、メンデルの法
則に従って次世代へ伝達されることが確認された。さら
に、産卵後のF1カイコ成虫からゲノムDNAを抽出し、プ
ライマー（配列番号13）およびプライマー（配列番号1
4）を用いたPCRによりミニコラーゲンDNA断片を、また
プライマー（配列番号15）およびプライマー（配列番号
16）を用いたPCRによりEGFP断片を増幅したところ、緑
色蛍光を発する陽性カイコからミニコラーゲンおよびEG
FP DNA断片を検出することができた（図２）。さらにサ
ザンブロット解析を行い、これら外来遺伝子がカイコ・
ゲノムDNA内に組み込まれていることを確認した。 ４．ミニコラーゲンmRNAおよび組換えミニコラーゲンの
検出 ５齢期に達した陽性F1幼虫を解剖して絹糸腺を取りだ
し、酸グアニジンフェノールクロロホルム法によりtota
lRNAを抽出し、そのうちの200ng分のRNAを逆転写して得
られたcDNAを鋳型としPCRを94℃1分、6℃1分、72℃1
分、の反応条件で30サイクル行った（RT-PCR）。プライ
マーは、上記のプライマー（配列番号13）およびプライ
マー（配列番号14）を用いた。その結果、ミニコラーゲ
ンmRNAを検出することができ、カイコ・ゲノムDNAに組
み込まれたミニコラーゲン遺伝子が、絹糸腺細胞内で発
現していることが確かめられた（図３）。
【００３０】次に、組換えミニコラーゲンタンパク質の
検出を試みた。陽性F1カイコを吐糸期まで飼育し、吐き
出した繭中のタンパク質をＳＤＳ−サンプル緩衝液（0.
125Mトリス塩酸緩衝液、pH 6.8／４%ＳＤＳ／10%２−メ
ルカプトエタノール／20%グリセロール）を加えて混合
し５分間100℃で熱処理することにより抽出した。この
試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Nature
227:680-685, 1970）に供し、Matudairaらの方法（J.
Biol. Chem. 261:10035-10038, 1987）に準じて、泳動
されたタンパク質をニトロセルロース膜ＢＡ８５（Ｓ＆
Ｓ社）に転写した。次に、タンパク質が転写されたニト
ロセルロース膜をブロッキング液（３%ＢＳＡ／50 mMト
リス塩酸緩衝液 pH 7.5／150 mM NaCl）で４℃において
16時間処理した後、ブロッキング液で200倍に希釈した
抗ヒト／ウシ・III型コラーゲン抗体と室温で１時間反
応させた。これらの抗体が反応するタンパク質をベクタ
ステインＡＢＣキット（ベクターラボラトリー社）で検
出した。その結果、繭中から組換えミニコラーゲンタン
パク質を検出することが出来た。 ５．カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットcDNAの
クローニング 先ず、混合プライマーを用いたdegenerate PCR法によっ
て、カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットcDNAの
部分配列をクローニングした。すでに報告されているヒ
ト、ショウジョウバエ、および線虫のプロリン水酸化酵
素αサブユニット遺伝子のアミノ酸配列を比較し、種間
で保存されている領域をもとに、アミノ酸配列から推定
される塩基配列をもつ混合プライマーP3(配列番号１
７)、P5II(配列番号１８)を設計した。なお、混合プラ
イマー配列中、nはa、c、gまたはt、rはaまたはg、yはc
またはt、sはcまたはg、wはaまたはｔであることを示
す。続いてPCRの鋳型とするため、カイコ培養細胞であ
るBmN4細胞とカイコ2齢幼虫からそれぞれtotal RNAを抽
出した。そのうちの200ng分のRNAを逆転写して得られた
cDNAを鋳型としPCRを94℃1分、58℃1分、72℃1分、の反
応条件で40サイクル行った。その結果、BmN4細胞とカイ
コ2齢幼虫ともに電気泳動で約150bpの増幅産物が確認で
き、その増幅産物をインビトロジェン社pCR2.1にサブク
ローニングし、ジデオキシ法によって塩基配列を決定し
たところ、このcDNA断片は塩基配列レベル、そこから予
想されるアミノ酸配列レベルともに他動物のプロリン水
酸化酵素αサブユニットと高い相同性をもち、カイコ・
プロリン水酸化酵素cDNAの部分断片であることが明らか
になった。
検出を試みた。陽性F1カイコを吐糸期まで飼育し、吐き
出した繭中のタンパク質をＳＤＳ−サンプル緩衝液（0.
125Mトリス塩酸緩衝液、pH 6.8／４%ＳＤＳ／10%２−メ
ルカプトエタノール／20%グリセロール）を加えて混合
し５分間100℃で熱処理することにより抽出した。この
試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Nature
227:680-685, 1970）に供し、Matudairaらの方法（J.
Biol. Chem. 261:10035-10038, 1987）に準じて、泳動
されたタンパク質をニトロセルロース膜ＢＡ８５（Ｓ＆
Ｓ社）に転写した。次に、タンパク質が転写されたニト
ロセルロース膜をブロッキング液（３%ＢＳＡ／50 mMト
リス塩酸緩衝液 pH 7.5／150 mM NaCl）で４℃において
16時間処理した後、ブロッキング液で200倍に希釈した
抗ヒト／ウシ・III型コラーゲン抗体と室温で１時間反
応させた。これらの抗体が反応するタンパク質をベクタ
ステインＡＢＣキット（ベクターラボラトリー社）で検
出した。その結果、繭中から組換えミニコラーゲンタン
パク質を検出することが出来た。 ５．カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットcDNAの
クローニング 先ず、混合プライマーを用いたdegenerate PCR法によっ
て、カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットcDNAの
部分配列をクローニングした。すでに報告されているヒ
ト、ショウジョウバエ、および線虫のプロリン水酸化酵
素αサブユニット遺伝子のアミノ酸配列を比較し、種間
で保存されている領域をもとに、アミノ酸配列から推定
される塩基配列をもつ混合プライマーP3(配列番号１
７)、P5II(配列番号１８)を設計した。なお、混合プラ
イマー配列中、nはa、c、gまたはt、rはaまたはg、yはc
またはt、sはcまたはg、wはaまたはｔであることを示
す。続いてPCRの鋳型とするため、カイコ培養細胞であ
るBmN4細胞とカイコ2齢幼虫からそれぞれtotal RNAを抽
出した。そのうちの200ng分のRNAを逆転写して得られた
cDNAを鋳型としPCRを94℃1分、58℃1分、72℃1分、の反
応条件で40サイクル行った。その結果、BmN4細胞とカイ
コ2齢幼虫ともに電気泳動で約150bpの増幅産物が確認で
き、その増幅産物をインビトロジェン社pCR2.1にサブク
ローニングし、ジデオキシ法によって塩基配列を決定し
たところ、このcDNA断片は塩基配列レベル、そこから予
想されるアミノ酸配列レベルともに他動物のプロリン水
酸化酵素αサブユニットと高い相同性をもち、カイコ・
プロリン水酸化酵素cDNAの部分断片であることが明らか
になった。
【００３１】続いて、cDNA全長をクローニングするた
め、得られたカイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニッ
トcDNA断片の上流、下流をRACE (Rapid Amplification
cDNA Ends)法によって単離した。cDNA断片の塩基配列か
ら5'RACE用プライマーGSP1(配列番号１９)、3'RACE用プ
ライマーGSP2(配列番号２０)を設計した。RACEはクロン
テック社SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitを使用
して行った。RACEの結果、電気泳動で、5'領域約1.7k
b、3'領域約1.2kbのcDNA断片を確認することができた。
これらのcDNA断片を上記同様にサブクローニングし、そ
の塩基配列を解析したところ、カイコ・プロリン水酸化
酵素αサブユニットをコードする配列を全て含んでい
た。その塩基配列の一部を配列番号１に示す。
め、得られたカイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニッ
トcDNA断片の上流、下流をRACE (Rapid Amplification
cDNA Ends)法によって単離した。cDNA断片の塩基配列か
ら5'RACE用プライマーGSP1(配列番号１９)、3'RACE用プ
ライマーGSP2(配列番号２０)を設計した。RACEはクロン
テック社SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitを使用
して行った。RACEの結果、電気泳動で、5'領域約1.7k
b、3'領域約1.2kbのcDNA断片を確認することができた。
これらのcDNA断片を上記同様にサブクローニングし、そ
の塩基配列を解析したところ、カイコ・プロリン水酸化
酵素αサブユニットをコードする配列を全て含んでい
た。その塩基配列の一部を配列番号１に示す。
【００３２】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、組換えヒト・コラーゲンを繭または絹糸
腺に含まれるタンパク質の一部として生産する形質転換
カイコと、このカイコが生産する組換えヒト・コラーゲ
ンが提供される。組換えヒト・コラーゲンは、形質転換
カイコの吐き出す繭または絹糸腺から回収するため、抽
出しやすく、純度の高いコラーゲンを容易に得ることが
できる。また、形質転換カイコの生産する組換えヒト・
コラーゲンは、ウイルスやプリオン等の病原体混入の危
険が無く、またヒトに対して抗原性の無い安全ヒト・コ
ラーゲンであるため、医療、食品、化粧品等の様々な産
業分野で利用することが可能である。
発明によって、組換えヒト・コラーゲンを繭または絹糸
腺に含まれるタンパク質の一部として生産する形質転換
カイコと、このカイコが生産する組換えヒト・コラーゲ
ンが提供される。組換えヒト・コラーゲンは、形質転換
カイコの吐き出す繭または絹糸腺から回収するため、抽
出しやすく、純度の高いコラーゲンを容易に得ることが
できる。また、形質転換カイコの生産する組換えヒト・
コラーゲンは、ウイルスやプリオン等の病原体混入の危
険が無く、またヒトに対して抗原性の無い安全ヒト・コ
ラーゲンであるため、医療、食品、化粧品等の様々な産
業分野で利用することが可能である。
【００３３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technolkogy Corporation, TERUMO CORPORATION, KOKEN CO., LTD., and Hiroshima Industrial Technology Organization <120> A transformed silkworm producing human collagen <130> NP01178-YS <140> <141> <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1121 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 1 tggcataggg ggacactacg aaccgcactt cgacttcgct aggaaacgtg agaatccatt 60 cacgaaattc ggcggcaaca gaatagccac cgtcctcttc tacatgtccg acgtggcgca 120 ggtcggcgct acagtgttca ccgaacttgg actcagtttg tttccaataa aacgagctgc 180 ggcgttctgg ttgaacctgc acgcgtcggg cgaaggagac ctcgccacca ggcatgccgc 240 ctgccccgtg ctccagggat ccaagtgggt gtcaaataaa tggatacatc aaggcaggca 300 agagctgttg aggccctgcg accttgagta ccaggaggag ggcatcatcc gcaagattcc 360 tcgtccagtg ccgaagacat ccaggtagac tccgagcaac gtgtgaccga acggaactga 420 tcataaattg ttcggtatag tgcatttttt ttaaataaaa tagattaaat attacatagt 480 ataatagaat gttgggtctg tgtagtacac gtattcgact tccgtgtctc gtgcgatttt 540 acgaataacc acaagcataa tcgactagaa tgcataattc taattagtta tgggtcaaga 600 aagaagattc tcattatgaa agacgccaag gaaattacgc caactaactt ttaggagatg 660 ttttaaataa ccaataattt gagtgcaatt tatactatac ttttaatata tttattaaat 720 tgttccaatt tctttacttt cccctattta gaacgtatag tttaagttaa cgttgatttg 780 tttgattgta aaatattaac agtaaactca caccaggcac acacaaaaaa ccatctattg 840 ttgcgaacaa attcacaaat aaacatatct aataaaaaaa atgttaaata ataaataagt 900 tgcaatgaaa cactaatata ttttaacata ttatatatta tagtgatatc ttagaataaa 960 ccatcgtggc tcgatggctc gtggcattag tggtatcatg ccctaatagt tcaagaagtc 1020 ccaagtactt tatttaaaac aggcatagct ttcatgaata gttttaattg ttatggtaat 1080 gctgaaaaaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1121 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 2 agatctagtc gaatttcgac tctgcg 27 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 3 cccgatgata agacgactat g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 4 ccaggttcac gtctaaataa g 21 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 5 agatctcatg acaacagtac cgaaatc 27 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 6 taacagacca ctaaaatgaa g 21 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 7 ctcgagtagc ttttccatca tcaatgt 27 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 8 gacataatat gtgacgctcg agaattagac tgc 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 9 tctagaagat ctggtacggt tcgtaaagtt cac 33 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 10 gtctgttatg tgaccaatcg g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 11 acagaccact aaaatgaagc c 21 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 12 ctcgagcctg gctggctgct tgtgcaa 27 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 13 tgttccacgg aaacactggt g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 14 catcctccag aactgtgtag g 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 15 cacaacgtct atatcatggc cg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 16 atgttgtggc ggatcttgaa g 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 17 tncargtngc naaytaygg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 18 cnccnccngc nswnacrtc 19 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 19 gaggacggtg gctattctgt tgccg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <213> Synthesized oligonucleotide <400> 20 ggcatagggg gacactacga accgc 25
【図１】piggyBacプラスミドベクターに組み込まれたミ
ニコラーゲン遺伝子（pMOSRA-4B, pMOSRA-5, pMOSRA-
6）の制限酵素地図である。
ニコラーゲン遺伝子（pMOSRA-4B, pMOSRA-5, pMOSRA-
6）の制限酵素地図である。
【図２】陽性F1カイコ成虫から抽出したゲノムDNAを鋳
型としてPCRを行い、その増幅産物の電気泳動像を示す
図である。１および２は陽性カイコの番号を表す。レー
ンMは100bpラダーマーカーである。
型としてPCRを行い、その増幅産物の電気泳動像を示す
図である。１および２は陽性カイコの番号を表す。レー
ンMは100bpラダーマーカーである。
【図３】陽性F1カイコ５齢幼虫の絹糸腺から抽出したRN
Aを用いてRT-PCRを行い、その増幅産物の電気泳動像を
示す図である。レーン１および２には陽性カイコのRT-P
CR産物を、レーンCには野生型カイコのRT-PCR産物を泳
動した。レーンMは100bpラダーマーカーである。
Aを用いてRT-PCRを行い、その増幅産物の電気泳動像を
示す図である。レーン１および２には陽性カイコのRT-P
CR産物を、レーンCには野生型カイコのRT-PCR産物を泳
動した。レーンMは100bpラダーマーカーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/02 5/00 Ｂ (71)出願人 591071104 株式会社高研 東京都豊島区目白３丁目14番３号 (72)発明者 冨田 正浩 広島県東広島市西条中央５−１−19 Ａ− 302 (72)発明者 吉里 勝利 広島県東広島市八本松南７−22−13 (72)発明者 田村 俊樹 茨城県つくば市大わし１−２ 独立行政法 人農業生物資源研究所内 (72)発明者 佐藤 勉 広島県東広島市西条中央７−21−36−207 (72)発明者 安達 敬泰 広島県東広島市西条町下見4215−１−106 (72)発明者 宗綱 洋人 広島県東広島市西条町寺屋1956 グリーン コーポ Ｅ103 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA08 BA10 BA80 CA04 CA07 CA12 CA20 DA02 FA02 FA10 FA18 GA12 GA25 HA11 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B065 AA90X AA90Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BA04 BA16 BA25 CA43 CA44 CA50 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 CA51 EA15 EA20 FA74
Claims (15)
- 【請求項１】 ヒト・コラーゲンをコードするポリヌク
レオチドをゲノムDNA内に有し、組換えヒト・コラーゲ
ンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生す
る形質転換カイコ。 - 【請求項２】 プロリン水酸化酵素αサブユニットおよ
びβサブユニットの少なくとも一方をコードするポリヌ
クレオチドを、さらにゲノムDNA内に有する請求項１の
形質転換カイコ。 - 【請求項３】 プロリン水酸化酵素αサブユニットをコ
ードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列を
有する請求項２の形質転換カイコ。 - 【請求項４】 ヒト・コラーゲンとカイコ絹タンパク質
との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲ
ノムDNA内に有し、前記融合タンパク質を繭または絹糸
腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイ
コ。 - 【請求項５】 プロリン水酸化酵素αサブユニットおよ
びβサブユニットの少なくとも一方をコードするポリヌ
クレオチドをさらにゲノムDNA内に有する請求項１の形
質転換カイコ。 - 【請求項６】 プロリン水酸化酵素αサブユニットをコ
ードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列を
有する請求項５の形質転換カイコ。 - 【請求項７】 請求項１、２または３の形質転換カイコ
の繭または絹糸腺から組換えヒト・コラーゲンを単離、
精製することを特徴とする組換えヒト・コラーゲンの製
造方法。 - 【請求項８】 請求項４、５または６の形質転換カイコ
の繭または絹糸腺から組換えヒト・コラーゲンとカイコ
絹タンパク質との融合タンパク質を単離し、この融合タ
ンパク質から組換えヒト・コラーゲンを分離、精製する
ことを特徴とする組換えヒト・コラーゲンの製造方法。 - 【請求項９】 請求項４、５または６の形質転換カイコ
が産生する組換えヒト・コラーゲンとカイコ絹タンパク
質との融合タンパク質。 - 【請求項１０】 少なくとも以下の組換えベクター： (1) 昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反
復配列に挟まれた ヒト・コラーゲン発現カセットを
有する組換えベクター；および (2) トランスポゾンのトランスポゼースをコードする
ポリヌクレオチド を有する組換えベクターからなる
組換えベクターセット。 - 【請求項１１】 さらに以下の組換えベクター： (3) プロリン水酸化酵素αサブユニットおよびβサブ
ユニットの少なく とも一方をコードするポリヌクレ
オチドを有する組換えベクターを含む請求項１０の組換
えベクターセット。 - 【請求項１２】 プロリン水酸化酵素αサブユニットを
コードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列
を有する請求項１１の組換えベクターセット。 - 【請求項１３】 ヒト・コラーゲン発現カセットが、カ
イコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒト
・コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した
融合ポリヌクレオチドである請求項１０、１１または１
２の組換えベクターセット。 - 【請求項１４】 ヒト・コラーゲン発現カセットが、カ
イコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下に、カ
イコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒト
・コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した
融合ポリヌクレオチドである請求項１０、１１または１
２の組換えベクターセット。 - 【請求項１５】 配列番号１の塩基配列を含み、カイコ
由来のプロリン水酸化酵素αサブユニットをコードする
cDNA断片。
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|---|---|---|---|---|
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| CN104313053B (zh) * | 2014-10-24 | 2017-01-18 | 华南农业大学 | 一种生产人源胶原蛋白ii型的方法 |
| AU2017283085B2 (en) | 2016-06-22 | 2021-01-28 | Amsilk Gmbh | Articles comprising a silk polypeptide for antigen delivery |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0823979A (ja) * | 1994-07-15 | 1996-01-30 | Terumo Corp | ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法 |
| WO1997038121A1 (en) * | 1996-04-10 | 1997-10-16 | Fibrogen, Inc. | α2 SUBUNIT OF PROLYL-4-HYDROXYLASE NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SUCH SUBUNIT AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1037278C (zh) * | 1992-05-08 | 1998-02-04 | 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 | 用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法 |
| CN1074296C (zh) * | 1997-11-05 | 2001-11-07 | 浙江农业大学 | 用蚕表达丙肝抗原制备口服药物的方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0823979A (ja) * | 1994-07-15 | 1996-01-30 | Terumo Corp | ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法 |
| WO1997038121A1 (en) * | 1996-04-10 | 1997-10-16 | Fibrogen, Inc. | α2 SUBUNIT OF PROLYL-4-HYDROXYLASE NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SUCH SUBUNIT AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006521802A (ja) | 2003-03-13 | 2006-09-28 | サートル ナショナル デ ラ レセルシュ シャティフィク（セアンアールエス） | 鱗翅目の後部絹糸腺における有用ポリペプチド発現を指令する核酸およびその応用 |
| WO2006041225A1 (ja) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Hiroshima Industrial Promotion Organization | カイコでの組換えタンパク質製造のためのポリヌクレオチド |
| JP2013230155A (ja) * | 2005-10-18 | 2013-11-14 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 抗体を産生するトランスジェニックカイコとその製造方法 |
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| JPWO2007046439A1 (ja) * | 2005-10-18 | 2009-04-23 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 抗体を産生するトランスジェニックカイコとその製造方法 |
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| WO2012118176A1 (ja) * | 2011-03-03 | 2012-09-07 | 日本製粉株式会社 | フィブリノゲンを産生するトランスジェニックカイコ |
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