WO2016125885A1 - 細胞死誘導ベクター及びそれを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統 - Google Patents

細胞死誘導ベクター及びそれを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統 Download PDF

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WO2016125885A1
WO2016125885A1 PCT/JP2016/053468 JP2016053468W WO2016125885A1 WO 2016125885 A1 WO2016125885 A1 WO 2016125885A1 JP 2016053468 W JP2016053468 W JP 2016053468W WO 2016125885 A1 WO2016125885 A1 WO 2016125885A1
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WO
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cell death
gene
promoter
site
silkworm
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/053468
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English (en)
French (fr)
Inventor
めぐみ 笠嶋
秀樹 瀬筒
Original Assignee
国立研究開発法人農業生物資源研究所
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/04—Silkworms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a cell death induction vector capable of inducing cell death in any cell or tissue of Lepidoptera insects and a site-specific cell death induction silkworm strain using the vector.
  • Apoptosis is a form of programmed cell death (PCD), which is a mechanism for generating organ formation and maintaining homeostasis, and removing damaged and unnecessary cells.
  • PCD programmed cell death
  • Mammalian apoptosis proceeds by activation of a group of proteases called caspases.
  • caspases a group of proteases called caspases.
  • cytochrome c released from the mitochondria into the cytoplasm by receiving apoptotic signals binds to the WD-40 domain of the adapter protein Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1), and apoptosome This is achieved by taking inactive caspase (pro-caspase-9) and then activating it (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the Bcl-2 protein family located in the mitochondrial outer membrane is known to regulate cytochrome c release via membrane permeability of the outer mitochondrial membrane after receiving apoptotic signals (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 4 there are a proapoptotic protein having a proapoptotic function and an antiapoptotic protein having an antiapoptotic function, and both proteins control the life and death of cells.
  • Bcl-2 protein families In mammals, more than 20 Bcl-2 protein families have been identified so far.
  • Bax (Bcl-2 associated X protein) protein and Bak (Bcl-2 homologous antagonist / killer) protein are pro-apoptotic proteins
  • Bcl-2 and Bcl-xL (Bcl-2 associated X protein large transcript) etc. Functions as an anti-apoptotic protein.
  • insects belonging to Arthropoda have only one or two genes in the genome that encode the Bcl-2 protein family.
  • Bcl-2 protein families For example, in Drosophila melanogaster belonging to the order Diptera, only genes encoding two Bcl-2 protein families of Buffy protein and Debcl protein exist.
  • Buffy protein is a Drosophila ortholog of Bcl-2 protein and functions as an anti-apoptotic protein.
  • Debcl protein is a Drosophila ortholog of Bax protein and functions as a pro-apoptotic protein (Non-patent Documents 5 and 6).
  • Drosophila melanogaster there are some differences from the mammalian apoptotic mechanism, such as that cytochrome c is not essential for aposome formation and that individuals are normally generated even if the Buffy gene or Debcl gene is knocked out.
  • Non-patent Document 9 Bombyx mori has only one gene encoding the Bcl-2 protein family in its genome. This gene is the silkworm ortholog BmBuffy of the Buffy gene, and it has been clarified from studies using cultured cells that the protein functions as an anti-apoptotic protein (Non-patent Document 10). In other words, silkworms do not have orthologs of pro-apoptotic proteins such as mammalian Bax protein or fly insect Debcl protein, and it is not clear what mechanism promotes apoptosis.
  • Non-patent Document 7 In Drosophila melanogaster, it is known that apoptosis is induced when the mammalian Bax gene is overexpressed (Non-patent Document 7). However, in a Debcl protein knockout individual, cell death is not induced even if the Bax gene is overexpressed (Non-patent Document 8). In other words, it has been suggested that the presence of the Debcl gene, a fly ortholog of the Bax gene, is necessary for the induction of cell death in Drosophila melanogaster cells by overexpression of the Bax gene.
  • the silkworm Lepidoptera
  • silkworm silk glands have the ability to synthesize large amounts of protein in a short period of time.
  • a large amount of useful protein can be produced in the silk gland by using the gene recombination technique.
  • These useful substances are superior to useful substance production systems using other microorganisms in that they can be recovered as soot. Accordingly, there has been a strong demand for the development of technologies and apoptosis effector factors that can freely induce cell death in specific cells and tissues even in Lepidoptera insects such as silkworms.
  • An object of the present invention is to develop and provide a cell or tissue-specific effector gene in order to establish a cell death induction system in Lepidoptera insects including silkworms.
  • the present inventors have over-expressed a gene encoding a mammalian pro-apoptotic protein in silkworm cells, thereby artificially producing it in any cell or tissue. It was found that cell death can be induced. This was a discovery that overturned the conventional theory in the field mentioned above.
  • the present invention is based on the novel findings, and specifically provides the following inventions. (1) A site-specific promoter and a DNA encoding a mammal-derived pro-apoptotic protein or an active fragment thereof in a state capable of being expressed in Lepidoptera insect cells, wherein the DNA is directly or indirectly by the promoter.
  • a cell death inducing vector arranged to receive proper expression control.
  • the cell death induction vector according to (4) wherein the gene encoding the transcriptional regulatory factor is a GAL4 gene, and the target promoter of the transcriptional regulatory factor is a UAS promoter.
  • a site-specific cell death-inducing silkworm strain comprising the cell death-inducing vector according to (3).
  • a site-specific cell death-inducing silkworm strain comprising the second expression unit according to (4) or (5).
  • a method for producing a site-specific cell death-inducing silkworm comprising selecting a site-specific cell death-inducing silkworm having a second expression unit.
  • the cell death inducing vector of the present invention By using the cell death inducing vector of the present invention, it becomes possible to easily create genetically modified strains of lepidopterous insects including site-specific cell death inducing silkworm strains.
  • a strain capable of inducing cell death in any cell or tissue can be maintained and managed, and a site-specific cell death-inducing silkworm can be easily produced. be able to.
  • A is a staining diagram with an anti-T7 antibody ( ⁇ T7-tag)
  • B is a staining diagram with an anti-cytochrome c antibody ( ⁇ cytoC).
  • C is a merged view of A and B, and the area where A and B overlap is brightly shining.
  • the scale bar in each figure indicates 10 ⁇ m. It is a figure which shows the form of the silk gland on the 4th day of the 5th instar larva in the MSG-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm individual expressing the Bax gene in the middle silk gland.
  • A is a transmission image of a silk gland in a silkworm individual MSG-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm that expresses the Bax gene in the middle silk gland
  • B is a control MSG- that expresses the EGFP gene in the middle silk gland
  • C is fluorescence image of B
  • D is site-specific cell death induction silkworm strain UAS-T7-mBax strain containing only the second subunit
  • the transmission image figure by the stereoscopic microscope of the silk gland in each silkworm individual is shown. The arrow in the figure indicates the middle silk gland.
  • A is a transmission image of a silk gland in a silkworm individual PSG-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm that expresses the Bax gene in the posterior silk gland
  • B is a control PSG- expressing EGFP gene in the posterior silk gland
  • C shows the fluorescence image of B, respectively.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the form of the fat body of the 5th instar larvae 4th day in the 30K-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm individual which expresses a Bax gene in a fat body.
  • A shows a transmission image of a fat body in a 30K-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm individual expressing the Bax gene in the fat body
  • B shows a 30K-GAL4 strain silkworm individual containing only the first subunit.
  • the transmission image figure of the fat body by the stereomicroscope is each shown. It is a figure which shows the result of the agarose gel electrophoresis of the genomic DNA extracted from the fat body.
  • A is a result of genomic DNA derived from silkworms on the second day of 5th instar larvae and B is 4th day of fifth instar larvae.
  • A is a diagram showing an apparatus for flapping behavior experiment.
  • B shows the time course of exposure to bombycol. It is the figure which graphed the reactivity (flapping action) of Oskaiko to Bombycall.
  • sumi4-4A / 1b is a male individual of the BmOR1-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm strain that expresses the Bax gene in pheromone receptor cells
  • 1b is a male individual of the pBmOR1-GAL4 strain that contains only the first subunit
  • w1 and pnd represent male individuals of a background strain that do not contain any of the first and second subunits.
  • the percentage (%) of individuals that reacted at each concentration is shown on the vertical axis, and the concentration of bombycol on the horizontal axis.
  • the expression level of BmOR1 gene in the antennal of the adult male silkworm is shown.
  • Lane 1 shows BmOR1-GAL4 silkworm individuals in the control group
  • Lane 2 shows BmOR1-GAL4 / UAS-T7-mBax silkworm individuals that express the Bax gene in pheromone recipient cells.
  • Lane M is a size marker.
  • the RpS3 gene was used as an internal control. It is a figure which shows the result of the mating experiment which showed that it will become embryo lethality when a Bax gene is expressed in the whole body. Red is an F1 embryo containing only the first expression unit, GFP is an F1 embryo containing only the second expression unit, double is an F1 embryo containing both the first and second expression units, and Negative is an F1 without any expression unit. It is an embryo. Those that were embryonic lethal were counted as lethal.
  • the 1st aspect of this invention is a cell death induction vector.
  • the cell death induction vector of the present invention is an expression vector, comprising a site-specific promoter and a DNA encoding a pro-apoptotic protein derived from a vertebrate under its control, preferably a mammal-derived pro-apoptotic protein, or an active fragment thereof.
  • cell death can be freely induced in a cell or tissue in which a promoter is activated by being introduced into a lepidopteran insect as a host.
  • Lepidoptera refers to insects belonging to the taxonomic Lepidoptera, Lepidoptera.
  • the butterfly includes insects belonging to Nymphalidae, Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, and Hesperiidae.
  • the moths include Saturniidae, Bombycidae, Brahmaeidae, Eupterotidae, Lasiocampidae, Psychidae, Geometridae, Tigere ), Insects belonging to Noctuidae, Pyralidae, Sphingidae and the like.
  • expression vector refers to an expression unit that contains a gene encoding a target protein or a DNA encoding an active fragment thereof in a state where it can be expressed and can control the expression of the gene or the like.
  • DNAs encoding genes of interest and their active fragments are collectively referred to as “target genes etc.”.
  • “expressible state” refers to placing a target gene or the like in an expression vector under the control of a promoter.
  • the cell death inducing vector of the present invention is configured so that a target gene or the like can be expressed in specific cells of the host.
  • various gene expression vectors that can replicate in the host cell can be used.
  • an autonomously replicable expression vector such as a plasmid or Bacmid, a viral vector, an expression vector capable of homologous or non-homologous recombination in a chromosome, or a part of a chromosome in which it is inserted into a host chromosome.
  • a shuttle vector that can replicate in E. coli, Bacillus subtilis, or yeast can also be used.
  • the cell death induction vector contains a site-specific promoter and a target gene as essential components.
  • a marker gene a transposon inverted terminal repeat, 5′UTR, 3′UTR, terminator, enhancer, insulator, multicloning site, and the like are included as selection components.
  • a transcription regulatory factor gene and a target promoter for the transcription regulatory factor are essential components. Include as an element.
  • each component in the cell death induction vector of the present invention will be specifically described.
  • Site-specific promoter refers to controlling the expression of a gene located downstream (3 ′ end side) in a specific cell or tissue of a host individual into which an expression vector has been introduced. It can be a promoter. In this specification, it uses as a term corresponding to the ubiquitous promoter (systemic promoter) which controls the expression in the whole host individual.
  • Site-specific promoters are classified into constitutively active promoters, expression-inducible promoters, or time-specific active promoters based on the timing of expression control.
  • a constitutively active promoter can constantly express a target gene or the like in a host cell.
  • An expression-inducible promoter can induce expression of a target gene or the like in a host cell at any time.
  • a time-specific active promoter can induce expression of a target gene or the like in a host cell only at a specific stage of development. Since any promoter can cause overexpression of a target gene or the like in a host cell, the site-specific promoter in the present specification can be interpreted as a site-specific overexpression promoter.
  • the site-specific promoter is derived from a promoter of a gene that is expressed only in a specific cell or a specific tissue.
  • a 3xP3 gene promoter (3xP3 promoter; SEQ ID NO: 21) that specifically expresses eyes
  • Ser3 promoter SEQ ID NO: 22
  • Promoter of sericin 1 gene that specifically expresses the middle silk gland (Ser1 promoter; SEQ ID NO: 23), promoter of fibroin H gene that specifically expresses the posterior silk gland (Fib H promoter; SEQ ID NO: 24), fibroin L gene Promoter (Fib L promoter; SEQ ID NO: 25), or p25 gene promoter (p25 promoter; SEQ ID NO: 26), 30K gene promoter (30K promoter; SEQ ID NO: 27) for fat body-specific expression, and specific for testis Promoter of elavlike gene (elavlike promoter; sequence) No. 40).
  • the cell or tissue specificity of a site-specific promoter depends on the gene that the promoter was originally controlled. For example, in the case of the Ser1 promoter described above, the Ser1 gene is specifically expressed in the middle silk gland, and thus becomes a middle silk gland-specific promoter.
  • a site-specific promoter specific to the cell or tissue to be induced for cell death may be selected. The selection of this promoter makes it possible to induce cell death freely in the host cell or tissue.
  • the donor species from which the site-specific promoter is derived is not particularly limited as long as it is operable in the recipient-side host cell into which the cell death inducing vector is introduced.
  • it is a species belonging to the same classification as the host into which the cell death induction vector is introduced. Species belonging to the same family are more preferable, and species belonging to the same genus are more preferable. Most preferred is the same species as the host. Since the host into which the cell death induction vector of the present invention is introduced is a lepidopteran insect, and a suitable host is a silkworm as described later, the promoter species of the promoter is preferably a lepidopteran insect.
  • the cell death induction vector of the present invention includes a DNA encoding a pro-apoptotic protein or an active fragment thereof (often referred to as “pro-apoptotic gene etc.”) as a target gene or the like.
  • Pro-apoptotic protein refers to a protein belonging to the Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) protein family and having a function of promoting apoptosis.
  • the pro-apoptotic gene contained in the cell death induction vector of the present invention is a vertebrate-derived gene, preferably a mammal-derived gene.
  • An endogenous pro-apoptotic gene does not exist in the lepidopteran insect which is a host into which the cell death induction vector of the present invention is to be introduced. That is, it is a feature of the cell death inducing vector of the present invention that a pro-apoptotic gene derived from another species in which no ortholog exists in the host is overexpressed in specific cells or tissues in the host.
  • mammal-derived pro-apoptotic proteins examples include Bax protein and Bak protein. Since proapoptotic proteins such as Bax protein and Bak protein are highly conserved among mammalian species, the type of mammal from which they are derived is not particularly limited.
  • the mouse (Mus musculus) Bax protein (mBax) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the rat (Rattus norvegicus) Bax protein (rBax) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • pro-apoptotic proteins derived from vertebrates other than mammals include zebrafish (Danio rerio) Bax protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 and flounder (Cynoglossus semilaevis) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • Bax protein Xenopus laevis Bax protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, Burma snake (Python bivittatus) regulator BAX-like protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, amino acid shown in SEQ ID NO: 19
  • Examples include the apoptosis-regulator-BAX-like protein of the zebra finch (Taeniopygia-guttata).
  • the pro-apoptotic protein is preferably a wild-type protein, but may be a mutant protein as long as it maintains the function of promoting apoptosis.
  • a mutant pro-apoptotic protein includes a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the wild-type pro-apoptotic protein, and the amino acid sequence of the wild-type pro-apoptotic protein.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 99% or more amino acid identity
  • the term “plurality” means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.
  • Amino acid identity refers to the alignment of two amino acid sequences (alignment) and introducing a gap in one of the amino acid sequences as necessary so that the amino acid identity between the two is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues of the wild type protein.
  • the pro-apoptotic gene consists of a base sequence encoding the wild-type or mutant pro-apoptotic protein described above.
  • the pro-apoptotic gene consisting of a base sequence encoding the wild-type or mutant pro-apoptotic protein described above.
  • the mBax gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 encoding the mBax protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 encoding the rBax protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 encoding the Xenopus Bax protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, the flounder Bax gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 encoding the flounder Bax protein consisting of the amino acid sequence shown
  • the active fragment refers to a polypeptide consisting of a part of a pro-apoptotic protein and consisting of an amino acid sequence having a function of promoting apoptosis.
  • the pro-apoptotic gene and the like are arranged so as to receive direct or indirect expression control by the promoter.
  • direct expression control refers to a case where a pro-apoptotic gene is arranged in a state that can be expressed downstream of a site-specific promoter and directly receives expression control of the site-specific promoter.
  • Indirect expression control refers to the case where a site-specific promoter indirectly controls the expression of a pro-apoptotic gene or the like via an intervening factor. For example, it corresponds to a transcriptional regulatory factor described later and expression control of the transcriptional regulatory factor via a target promoter.
  • Marker gene A “marker gene” is a gene encoding a labeled protein, also called a selection marker.
  • Labeled protein refers to a polypeptide that can determine the presence or absence of expression of a labeled gene based on its activity.
  • the marker gene is used for the purpose of discriminating a host having a cell death induction vector, that is, a transformant and / or for monitoring a target protein expressed from the cell death induction vector.
  • Inducible vectors may be used for any purpose. In either case, based on the activity of the labeled protein, the transformant can be identified and the target protein can be monitored.
  • “based on activity” means based on the detection result of activity.
  • the activity may be detected directly by the activity of the labeled protein itself or indirectly by a metabolite generated by the activity of the labeled protein such as a dye.
  • Detection can be biological detection (including detection by binding of peptides or nucleic acids such as antibodies and aptamers), chemical detection (including enzymatic reaction detection), physical detection (including behavioral analysis detection), or detection Any of human sensory detection (including detection by sight, touch, smell, hearing, and taste) may be used.
  • the type of labeled protein encoded by the labeled gene is not particularly limited as long as its activity can be detected by a method known in the art.
  • it is a labeled protein with low invasiveness to the transformant upon detection.
  • tag peptides, fluorescent proteins, chromogenic proteins, photoproteins, external secreted proteins, proteins that control external morphology, and the like can be mentioned.
  • Fluorescent proteins, chromogenic proteins, photoproteins, and exocrine proteins can be visually detected under certain conditions without changing the external form of the transformant, and therefore are less invasive to the transformant.
  • it is particularly suitable because it is easy to identify and select transformants.
  • a “tag peptide” is a short peptide consisting of several tens to several tens of amino acids that can label a protein, and is used for protein detection and purification. Usually, labeling is performed by linking a base sequence encoding a tag peptide to the 5 'end or 3' end of a gene encoding a protein to be labeled and expressing it as a fusion protein with the tag peptide. Although various types of tag peptides have been developed in the art, any tag peptide may be used. Specific examples of the tag peptide include FLAG, HA, His, and myc.
  • Fluorescent protein refers to a protein that emits fluorescence of a specific wavelength when irradiated with excitation light of a specific wavelength. Either a natural type or a non-natural type may be used. Further, the excitation wavelength and the fluorescence wavelength are not particularly limited. Specifically, for example, CFP, RFP, DsRed (including derivatives such as 3xP3-DsRed), YFP, PE, PerCP, APC, GFP (including derivatives such as EGFP and 3xP3-EGFP), etc. It is done.
  • Chrosome synthesis protein is a protein involved in pigment biosynthesis and is usually an enzyme.
  • the “dye” here is a low molecular compound or peptide capable of imparting a dye to a transformant, and the kind thereof is not limited.
  • a pigment that appears as an external color of an individual is preferable. Examples include melanin pigments (including dopamine melanin), omochrome pigments, and pteridine pigments.
  • photoprotein refers to a substrate protein that can emit light without the need for excitation light or an enzyme that catalyzes the light emission of the substrate protein.
  • luciferin or aequorin as a substrate protein and luciferase as an enzyme can be mentioned.
  • exocrine protein refers to a protein that is secreted extracellularly or externally, and includes exocrine enzymes, fiber proteins such as fibroin, and sericin. Exocrine enzymes include digestive enzymes in addition to enzymes that contribute to the degradation or inactivation of drugs such as blasticidin and impart drug resistance to the host.
  • the marker gene is arranged in a state in which it can be expressed downstream of the promoter in a state linked to the pro-apoptotic gene or the like in the cell death induction vector, or independently of the pro-apoptotic gene or the like.
  • ITRs Inverted terminal repeat sequences
  • the inverted terminal repeats are usually used in pairs, and piggyBac, mariner, minos, etc. can be used as transposons (Shimizu, K. et al., 2000, Insect Mol.
  • 5′UTR and 3′UTR are both polynucleotides consisting of untranslated regions that do not themselves encode proteins, fragments thereof, or functional nucleic acids.
  • the base sequence constituting each UTR is preferably, but not limited to, 5′UTR and 3′UTR derived from a pro-apoptotic gene.
  • 5 ′ UTR is located upstream (5 ′ end side) of the start codon such as the pro-apoptotic gene, and 3 ′ UTR is downstream (3 ′ end side) of the stop codon such as the pro-apoptotic gene. Placed in.
  • the 3 ′ UTR can contain a poly A signal.
  • Terminator is a base sequence arranged at the 3 ′ end side of the pro-apoptotic gene, preferably downstream of the stop codon, in the cell death induction vector of the present invention, and terminates transcription of the pro-apoptotic gene etc. It consists of a possible base sequence.
  • Enhancer “Enhancer” comprises a base sequence that can further enhance the expression of a pro-apoptotic gene and the like by controlling a site-specific promoter in the cell death induction vector of the present invention.
  • Insulator An “insulator” is a base sequence that can stably control the transcription of a gene sandwiched between sequences without being affected by chromatin of surrounding chromosomes. Examples include the cHS4 sequence of chicken and the gypsy sequence of Drosophila.
  • Multicloning site is a cluster sequence comprising a plurality of cloning restriction enzyme sites. There are no particular restrictions on the type and number of restriction enzyme sites to be included in the base sequence constituting the multicloning site. In addition, the number of multicloning sites and the positions where they are arranged in the cell death induction vector are not limited, but are preferably arranged within the control region of the site-specific promoter. This is because a pro-apoptotic gene or the like can be easily inserted into the cell death induction vector of the present invention by arranging at such a position. (10) Transcriptional Regulatory Factor Gene “Transcriptional regulatory factor gene” is an essential component of the first expression unit described below.
  • transcriptional regulatory factor refers to a protein factor that can bind to a target promoter described later and activate the target promoter.
  • examples thereof include GAL4 protein, which is a galactose metabolic activation protein of yeast, tTA, which is a tetracycline-regulated transactivator, and mutants thereof.
  • Target Promoter of Transcription Regulator “The target promoter of transcription regulator” is an essential element of the second expression unit described later, and the transcription regulator encoded by the first expression unit binds to it. A promoter capable of activating gene expression under its control. The transcriptional regulatory factor and its target promoter are in a corresponding relationship with the transcriptional regulatory factor.
  • a cell death induction vector may be composed of one gene expression unit or two gene expression units. Hereinafter, each case will be described. (1) In the case of being composed of one gene expression unit
  • the cell death induction vector contains all the components necessary for expressing a pro-apoptotic gene and the like in a host cell. Specifically, it includes a site-specific promoter that is an essential component, and a pro-apoptotic gene arranged in a state that can be expressed downstream of the promoter.
  • the cell death induction vector may contain two or more pro-apoptotic genes under the control of one promoter.
  • the cell death induction vector When the cell death induction vector is composed of one gene expression unit, a pro-apoptotic gene or the like can be overexpressed in the host cell simply by introducing the cell death induction vector into the host.
  • the cell death induction vector When the cell death induction vector is composed of two gene expression units, the first expression unit and the second expression unit, the essential components for the expression of pro-apoptotic genes, etc. Exists divided into units. In this configuration, the first and second expression units function as one cell death induction vector only when they coexist in the host cell.
  • a transcriptional regulatory factor is expressed from the first expression unit by the activation of the promoter contained in the first expression unit in the same cell, and the target pro-apoptotic gene is activated by activating the target promoter of the second expression unit.
  • Etc. can be expressed.
  • the first and second expression units have the following configuration.
  • the “first expression unit” comprises a site-specific promoter and a transcription regulatory factor gene linked in a state capable of expression downstream of the promoter. At this time, the same or different two or more transcriptional regulatory factors may be included under the control of one promoter.
  • the first expression unit can have two or more pairs each composed of a site-specific promoter and a gene of a transcriptional regulatory factor under its control.
  • each set may be the same set or different sets.
  • groups include a group in which the first expression unit is composed of a Ser3 promoter and a GAL4 gene, and a group in which a Fib H promoter and a GAL4 gene are used.
  • the promoter included in the first expression unit can use a known site-specific promoter, an existing gene expression vector comprising a site-specific promoter and a gene of a transcription regulatory factor under its control is used as the first expression unit. You can also
  • the “second expression unit” comprises a target promoter of a transcriptional regulatory factor encoded by the first expression unit and a pro-apoptotic gene functionally linked downstream of the target promoter.
  • the target promoter contained in the second expression unit is a promoter activated by the transcriptional regulatory factor encoded by the first expression unit. Therefore, in principle, the target promoter contained in the second expression unit is uniquely determined by the transcriptional regulatory factor encoded by the first expression unit.
  • the gene of the transcriptional regulatory factor contained in the target promoter first expression unit is a GAL4 gene
  • UAS is used for the GAL4 target promoter of the second expression unit.
  • the second expression unit may contain two or more identical or different pro-apoptotic genes and the like under the control of one target promoter.
  • the second expression unit corresponds to a case where two genes, mBax gene and mBak gene, are arranged under the control of one UAS.
  • the second expression unit may have two or more sets of a target promoter and a pro-apoptotic gene under the control of the target promoter.
  • each set may be the same set or different sets.
  • An example of a different set corresponds to the case where the second expression unit includes two UASs, the mBax gene is arranged under the control of one UAS, and the mBak gene is arranged under the control of another UAS.
  • the second expression unit may be composed of two or more identical or different units containing a pro-apoptotic gene or the like.
  • a transcriptional regulatory factor expressed from one first expression unit activates a target promoter of a plurality of second expression units to express a pro-apoptotic gene or the like contained in each second expression unit. Can do.
  • the cell death induction vector having this configuration can amplify the expression of a pro-apoptotic gene or the like of the second expression unit via a transcriptional regulatory factor encoded by the first expression unit. Therefore, it is suitable for overexpressing pro-apoptotic genes and the like in host cells.
  • the cell death-inducing expression vector of the present invention is an expression vector encoding an apoptosis effector factor, and freely induces cell death in a desired cell or tissue by introducing it into a lepidopteran insect host, particularly a silkworm. be able to.
  • the 2nd aspect of this invention is a site-specific cell death induction silkworm strain
  • the silkworm strain of this aspect is a silkworm having the cell death induction vector described in the first aspect and its progeny. By using this strain, it is possible to freely and easily produce a silkworm strain in which any cell or tissue is destroyed by cell death.
  • a “site-specific cell death-inducing silkworm strain” of the present invention has the cell death-inducing expression vector according to the first aspect, and has a potential for cell death induction in a specific cell or tissue. Recombinant or progeny. It does not matter whether pro-apoptotic proteins or the like are expressed in specific cells or tissues.
  • the “site-specific cell death-inducing silkworm” has the cell death-inducing expression vector according to the first aspect, and a pro-apoptotic protein or the like included in the vector is expressed in a specific cell or tissue. This is a genetically modified silkworm. In a site-specific cell death-inducing silkworm, cell death is induced in a specific cell or tissue in which the site-specific promoter is activated.
  • the cell death-inducing expression vector possessed by the site-specific cell death-inducing silkworm strain may be either composed of one gene expression unit or two gene expression units described in the first embodiment. Good.
  • the genetically modified line having the cell death induction vector corresponds to the site-specific cell death induction silkworm line of the present invention.
  • This site-specific cell death-inducing silkworm strain is also a site-specific cell death-inducing silkworm at the same time because pro-apoptotic proteins or the like are in an expressed state or can be expressed by induction treatment or the like.
  • a transgenic silkworm strain having only the second expression unit corresponds to the site-specific cell death-inducing silkworm strain of the present invention.
  • the site-specific cell death-inducing silkworm strain of the present invention includes Not applicable.
  • the cell death-inducing vector may be transiently present in silkworm cells, or may be present stably and continuously in a state of being inserted into the genome. Also good. Usually, it is preferably present in an inserted state in the genome.
  • the cell death induction vector is composed of two gene expression units composed of the first and second expression units, each of which is integrated on the silkworm chromosome, the first and second expression units are identical in the same silkworm individual. It may exist on a chromosome or may exist on a different chromosome of the same silkworm individual.
  • the first expression unit and the second expression unit are incorporated in different silkworm individuals or in different chromosomes from the viewpoints of passage, management and maintenance of site-specific cell death-inducing silkworm lines. Is desirable. Crossing a transgenic silkworm strain having only the first expression unit (preferably in a homozygote) with a site-specific cell death-inducing silkworm strain having only the second expression unit (preferably in a homozygote). Thus, a site-specific cell death-inducing silkworm having first and second expression units at F1 can be easily obtained.
  • the distance between the expression vectors is short so that they are not separated by recombination during the passaging process. It is preferable that they are linked. 2-3.
  • Method for producing site-specific cell death-inducing silkworm strain The method for producing a site-specific cell death-inducing silkworm strain of the present invention can be achieved by introducing a cell death-inducing vector into a host silkworm. A method for introducing a cell death induction vector into a silkworm will be specifically described below.
  • the host into which the cell death induction vector is introduced is a silkworm individual, a silkworm-derived cell (including cell lines), or a silkworm-derived tissue.
  • a silkworm individual is preferable.
  • the stage of development of the collected individual is not particularly limited.
  • the developmental stage or sex there are no particular limitations on the developmental stage or sex, and any stage of an embryo, larva, pupa, or adult can be used. Preferably, it is an embryonic time when a higher effect can be expected.
  • the cell death induction vector is composed of one gene expression unit
  • the cell death induction vector is used, and when the cell death induction vector is composed of two gene expression units of the first and second expression units.
  • the cell death induction vector introduction method may be performed by a method known in the art depending on the cell death induction vector to be introduced.
  • the cell death induction vector is a plasmid having a transposon inverted terminal repeat and the host to be introduced is a silkworm
  • the method of Tamura et al. Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81- 84
  • a cell death induction vector diluted to an appropriate concentration may be injected into an early embryo of a silkworm egg together with a helper vector having a transposon transferase gene.
  • pHA3PIG can be used as the helper vector.
  • the target transformant can be easily selected based on the expression of the gene or the like.
  • the obtained transgenic silkworm may be sibling or inbred as necessary to obtain a homozygote of the expression vector inserted into the chromosome.
  • Effect according to the genetically engineered silkworm strain of the present invention a site-specific cell death-inducing silkworm that destroys a specific cell or tissue by cell death can be easily produced and subcultured. 3. 3. Method for producing site-specific cell death-inducing silkworm 3-1. Outline
  • summary The 3rd aspect of this invention is a production method of the site-specific cell death induction silkworm.
  • a site-specific cell death-inducing silkworm in which specific cells or tissues are destroyed by cell death can be produced.
  • the site-specific cell death inducing silkworm strain having the cell death inducing vector simultaneously with the site-specific cell death inducing silkworm Become.
  • the transgenic silkworm having both gene expression units in one individual is also a site-specific cell death induction silkworm. .
  • the production method of the present invention includes a mating step and a selection step.
  • the “crossing step” is a step of crossing a transgenic silkworm strain having the first expression unit and a site-specific cell death-inducing silkworm strain having the second expression unit.
  • two silkworm lines may be mated based on a conventional method.
  • a transgenic silkworm having two expression units is preferably preliminarily sibling or inbred and made homozygous for each expression unit.
  • the “selection step” is a step of selecting a transgenic silkworm strain having the first and second expression units. This step can be achieved by selecting individuals having both gene expression units from the F1 individuals obtained after the mating step based on the activity of the labeled protein encoded by each expression vector.
  • Example 1 Cloning of T7-mBax fusion gene and confirmation of intracellular localization of mBax protein> (the purpose) The pro-apoptotic gene used for the construction of the cell death induction vector of the present invention is cloned, and the intracellular localization of the protein encoded by the gene is confirmed.
  • Method 1 A mouse-derived Bax gene (mBax gene) was selected as a pro-apoptotic gene. To clone the mBax gene, total RNA was extracted from mouse 3T3-L1 cells.
  • the PCR cycle conditions were 35 cycles with 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 40 seconds.
  • the obtained amplification product was digested with Bgl II restriction enzyme, then inserted into the BamHI site of pEF-BOS-T7 vector (Kasashima et al., 1999, Genes Cells 4: 667-683.), And cloned.
  • a mammalian cell expression vector “pEF-BOS-T7-mBax” was constructed.
  • HeLa cells were cultured in a culture solution in which 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin were added to Dulbeccos's modified eagle medium with high glucose (DMEM; WAKO) at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
  • DMEM Dulbeccos's modified eagle medium with high glucose
  • As a culture dish a 35 mm poly-L-lysine-coated glass bottom dish (Matsunami Glass Ind.) was used.
  • the introduction (transfection) of pEF-BOS-T7-mBax into cells using Lipofectamine (registered trademark) 2000 Transfection Reagent (Life Technologies; currently Thermo Fisher Scientific) was carried out according to the method described in the protocol attached to the reagent. I followed.
  • anti-cytochrome c antibody (PharMingen; mouse monoclonal; 1/150) was diluted in an antibody reaction solution and reacted at 4 ° C. for 12 to 15 hours. After the cells were washed with PBS, Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG (GE Healthcare UK Ltd; 1/1000) was diluted in an antibody reaction solution and allowed to react at room temperature for 1 hour. Axio Observer D1 system (Carl Zeiss) was used for taking fluorescent images.
  • FIG. 1 is an antibody staining diagram of HeLa cells transfected with pBOS-T7-mBax. T7-mBax expressed in the cells was detected as green fluorescence (indicated by white dots in the figure) by anti-T7 antibody ( ⁇ T7-tag; A).
  • Example 2 Construction of cell death induction vector> (the purpose) The cell death induction vector of the present invention is constructed. (Method) In this example, a cell death induction vector composed of two gene expression units, a first expression unit and a second expression unit, was constructed.
  • pBac Ser1-GAL4: 3xP3, which has a sericin 1 (Ser1) promoter derived from silkworm, a silkworm-specific promoter specific to the middle silk gland, and a GAL4 gene encoding the transcriptional regulatory factor GAL4 in a state that can be expressed downstream thereof.
  • Ser1-GAL4 3xP3
  • GAL4 gene encoding the transcriptional regulatory factor GAL4 in a state that can be expressed downstream thereof.
  • -DsRed pMSG-GAL4] (Tatematsu et al., 2010. Transgenic Res.
  • a fibroin (AyFib) promoter derived from Yamaga yuga, a posterior silk gland specific promoter, and can be expressed downstream PBac [AyFib-GAL4: 3xP3-DsRed (pPSG-GAL4)] (Sezutsu et al., 2009, J. Insect Biochem. Mol. Biol., 78: 1-10.), And fat body It is pBac [30K-GAL4: 3xP3-DsRed (p30 K-GAL4)] (H. Sezutsu, personal communication) having a GAL4 gene in a state that can be expressed downstream from a 30K promoter derived from a silkworm, which is a specific promoter.
  • a pUAS-mBax vector was constructed. Specifically, PCR was performed using the pEF-BOS-T7-mBax prepared in Example 1 as a template and a primer pair of in fusion-T7_F (SEQ ID NO: 32) and in fusion-mBax_R (SEQ ID NO: 33). The amplification product of T7-mBax ORF was obtained.
  • the T7-mBax ORF amplification product was transformed into the pBacMCS [UAS-SV40, 3xP3-EGFP] vector (Sakudoh et al), a gene expression vector for silkworm transformation. ., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104: 8941-8946.).
  • the specific insertion method followed the method attached to the kit.
  • the obtained second expression unit was pBacMCS [UAS-T7-mBax-SV40, 3xP3-EGFP] (in this specification, often abbreviated as “pUAS-T7-mBax”).
  • the target promoter of the transcription factor in the second expression unit is UAS, and the terminator is SV40 terminator.
  • the marker gene is 3xP3 EGFP that expresses EGFP in embryonic, larval and adult eyes. Further, piggyBacL and piggyBacR are included as transposon inverted terminal repeats (ITRs) upstream of UAS and downstream of the marker gene, respectively.
  • pUAS-EGFP UAS
  • pUAS-EGFP 3xP3-EGFP
  • the target promoter of the transcription factor in the second expression unit for control is UAS
  • the EGFP gene is linked downstream in such a state that it can be expressed.
  • the terminator is the SV40 terminator.
  • the marker gene is 3xP3 EGFP that expresses EGFP in embryonic, larval and adult eyes.
  • Example 3 Production of a site-specific cell death-inducing silkworm strain> (the purpose) Using the cell death induction vector constructed in Example 2, the site-specific cell death induction silkworm strain of the present invention is produced. (Method) The second expression unit pUAS-T7-mBax of the cell death induction vector constructed in Example 2 and its control second expression unit pUAS-EGFP were purified using Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen). The specific production method followed the protocol attached to the kit.
  • the purified pUAS-T7-mBax and pUAS-UAS are in a 1: 1 ratio with the piggyBac helper plasmid pHA3PIG (Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84) encoding transposon transferase, respectively. And then microinjected into eggs of the silkworm w1, pnd, which is a non-dormant strain, 4-8 hours after laying (Tamura et al. 2000; supra). Eggs after injection were incubated at 25 ° C. in a humidified state until hatched.
  • Example 4 Verification of site-specific cell death induction in site-specific cell death-induced silkworm (1)> (the purpose) In the site-specific cell death-inducing silkworm produced using the site-specific cell death-inducing silkworm strain of the present invention, it is verified that cell death is induced in cells or tissues in which the site-specific promoter is activated.
  • MSG-GAL4 strain is a transgenic silkworm strain (Tatematsu et al., 2010, Transgenic Res. 19: 473-) in which the first expression unit pMSG-GAL4 containing a promoter specific to the middle silk gland is integrated into the chromosome.
  • the PSG-GAL4 strain is a transgenic silkworm strain having the first expression unit pAyfib-GAL4 containing a posterior silk gland-specific promoter incorporated in the chromosome (literature name Tsubota et al., 2014, G3. 4). : 1347-1357), and the 30K-GAL4 strain is a genetically modified silkworm strain in which the first expression unit p30K-GAL4 containing a fat body-specific promoter is integrated into the chromosome (literature name H. Sezutsu, personal communication) It is. Furthermore, as a control, heterozygous individuals of the UAS-EGFP strain were crossed with heterogeneous individuals of the MSG-GAL4, PSG-GAL4, and 30K-GAL4 strains to obtain F1 individuals.
  • the 4-4A line and the UAS-GFP line are GFP, and the MSG-GAL4, PSG-GAL4, and 30K-GAL4 lines are DsRed, which is an individual selection marker gene.
  • the resulting embryo selection marker was examined and individuals expressing both EGFP and Red markers were selected.
  • the selected individuals were bred, and silk glands and fat bodies were removed from each larvae at the age of 5 days and 4 days, and the morphology of the middle silk gland, posterior silk gland, and fat body were observed. (result)
  • FIGS. 2 and 3 show the silk gland
  • FIG. 4 shows the fat body.
  • FIG. 2A shows an individual including the first expression unit and the second expression unit among F1 individuals obtained by crossing the MSG-GAL4 line containing the first expression unit and the 4-4A line containing the second expression unit.
  • the silk gland of (MSG-GAL4 / UAS-T7-mBax individual) is shown.
  • FIGS. 2B and 2C show the F1 individuals obtained by crossing the MSG-GAL4 line and the control UAS-EGFP line with the first expression unit and the control second expression unit (MSG-GAL4 / UAS-EGFP individual) silk gland.
  • FIG. 2A shows an individual including the first expression unit and the second expression unit among F1 individuals obtained by crossing the MSG-GAL4 line containing the first expression unit and the 4-4A line containing the second expression unit.
  • the silk gland of (MSG-GAL4 / UAS-T7-mBax individual) is shown.
  • FIGS. 2B and 2C show the F1 individuals obtained by crossing the MSG-GAL4
  • FIG. 2C shows a 4-4A strain silk gland having only the second subunit and not induced to express mBax protein. This individual also showed no regression of the middle silk gland.
  • FIG. 3A shows the silk thread of an individual (PSG-GAL4 / UAS-T7-mBax individual) having a first expression unit and a second expression unit among F1 individuals obtained by crossing PSG-GAL4 and 4-4A strains. Shows the gland. As shown in this figure, when the mBax gene was expressed in the posterior silk gland, disappearance of the posterior silk gland was confirmed.
  • FIG. 3B and FIG. 3C show individuals (PSG-GAL4 /) having a first expression unit and a control second expression unit among F1 individuals obtained by crossing a PSG-GAL4 strain and a control UAS-EGFP strain. UAS-EGFP individual) silk gland. As shown in the fluorescence diagram of FIG. 3C, in this F1 individual, the EGFP gene was expressed in the posterior silk gland, but no abnormality was observed in the morphology of the posterior silk gland (arrow).
  • FIG. 4A shows an individual having a first expression unit and a second expression unit among F1 individuals obtained by mating 30 K-GAL4 and 4-4A strains (30 K-GAL4 / UAS-T7-mBax individuals). Shows fat body. As shown in this figure, when the mBax gene was expressed in the fat pad, significant atrophy of the fat pad was confirmed. Moreover, in this F1 individual, the growth of larvae stopped at the age of 5 and all individuals died before spitting. On the other hand, as shown in FIG. 4B, in the 4-4A line, no abnormality was observed in the form of fat pad, and there was no problem in growth after 5 years of age.
  • Example 5 Verification of site-specific cell death by cell-inducing vector> (the purpose) It is verified that the site-specific cell death induced by the cell-inducing vector of the present invention is caused by apoptosis. (Method) Cell death due to apoptosis is characterized by fragmentation of the genome. Thus, it was confirmed by electrophoresis that the genome of the tissue that induced cell death was fragmented.
  • FIG. 5A shows electrophoresis of silkworm genomic DNA derived from 5th instar larvae
  • FIG. 5B from 5th instar 4th larvae.
  • the 30K-GAL4 / UAS that induced cell death was compared with the 30K-GAL4-derived genomic DNA of the control group, whereas only high molecular weight DNA with a low band mobility was observed.
  • the bands became smeared as a whole, and medium and low molecular genomic DNA was detected in a ladder shape. From the above results, it was suggested that cell death caused by site-specific cell death induced by the cell induction vector of the present invention is apoptosis.
  • Example 6 Verification of site-specific cell death induction in site-specific cell death-induced silkworm (2)> (the purpose) It is verified whether cell death induction by the site-specific cell death induction silkworm of the present invention is possible even in the adult stage.
  • Pheromone receptor cells present in the antenna were selected as cells that induce cell death.
  • BmOR1 protein is a receptor for the silkworm pheromone substance bombycol (BOL). Therefore, cell death was induced by pheromone-receptor cells, and it was verified whether or not an abnormal response behavior (flapping behavior) to a pheromone in a silkworm adult male individual was caused.
  • BmOR1-GAL4 strain (Sakurai et al., 2004, PLos Genetics 7: e1002115) in which the first expression unit pBac [BmOR1-GAL4: 3xP3-DsRed] (abbreviated as “pBmOR1-GAL4”) is integrated into the chromosome Used for.
  • pBmOR1-GAL4 is linked to the BmOR1 promoter (SEQ ID NO: 34) and the GAL4 gene in an expressible state downstream thereof.
  • the BmOR1-GAL4 line heterozygous individual was crossed with the 4-4A line heterozygous individual in the same manner as in Example 4 to obtain an F1 individual.
  • a male adult individual was selected from the F1 individuals having the first expression unit and the second expression unit (BmOR1-GAL4 / UAS-T7-mBax individual), and the flapping behavior was observed as a response behavior to the pheromone.
  • a normal silkworm male receives a pheromone emitted by a female, the male silkworm locates the female while flapping violently.
  • oscaico individuals 3 to 6 days after emergence were used.
  • FIG. 6A The apparatus for flapping behavior experiment is shown in FIG. 6A.
  • An adult oscaiko was set in a sealed cylindrical transparent chamber with a diameter of 150 mm.
  • the chamber has an air inlet (exhaust air) and an exhaust ventilation so that the inside of the chamber can be ventilated.
  • the upper part of the chamber has a hole in which a filter attached with bombycol can be set, and the opening and closing of the hole was adjusted to expose the bombycol (stimulus).
  • the method of flapping behavior experiment was performed according to Sakurai et al., 2011, PLoS Genet 7: e1002115.
  • the male individuals used in the experiment were 23 BmOR1-GAL4 / UAS-T7-mBax lines expressing the Bax gene in pheromone recipient cells, 19 pBmOR1-GAL4 lines containing only the first subunit as a control, and The behavior of 9 individuals of background strains that did not contain either the first or second subunit was examined.
  • the flapping behavior is as follows. The individual who continued flapping for 10 seconds after exposure to bombycol was counted as the responding individual, and the percentage (%) of the responding individual at each concentration was plotted on the vertical axis. Created.
  • BmOR1 gene in BmOR1-GAL4 / UAS-T7-mBax individuals was compared by semi-quantitative PCR.
  • the antennae was cut out from the adult male BmOR1-GAL4 / UAS-mBax, and total RNA was extracted according to the method described in Example 1, and then a cDNA library was synthesized.
  • BmOR1-GAL4 silkworm was used for control.
  • FIG. 7 shows the results of flapping behavior of oscaico, and FIG.
  • the expression level of BmOR1 gene was significantly decreased in BmOR1-GAL4 / UAS-mBax individuals that expressed mBax gene in pheromone recipient cells. This suggests that cell death was induced in pheromone recipient cells expressing the BmOR1 gene, and the number of pheromone recipient cells was reduced.
  • Example 7 Verification of cell death induction using a systemic promoter> (the purpose) When the first expression unit having a systemic promoter instead of the site-specific promoter is used, it is verified whether cell death can be induced in the whole individual.
  • PBac [Actin3-GAL4: 3xP3-DsRed] in which the actin 3 promoter (SEQ ID NO: 39), which is a systemic promoter, is linked to the GAL4 gene in an expression state downstream thereof (Uchino et al., 2006, J. Insect Biotechnol. Sericology 75: 89-97) (abbreviated as “pActin3-GAL4”) was used as the first expression unit. Heterogeneous individuals of the Actin3-GAL4 line (Uchino et al., 2008, Insect Biochem. Mol. Biol.
  • FIG. 9 shows the result. “GFP” indicates an embryo having only pUAS-mBax, and “Red” indicates an embryo having only pActin3-GAL4.
  • “Double” is an embryo having both the first expression unit pActin3-GAL4 and the second expression unit pUAS-mBax. “Lethal” indicates an embryo that was lethal in the early embryo, and “Negative” indicates an embryo that has neither pActin3-GAL4 nor pUAS-mBax.

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Abstract

　カイコをはじめとするチョウ目昆虫において細胞死誘導系の確立のために、細胞又は組織特異的エフェクター遺伝子を開発し、提供する。　部位特異的プロモーター、及びそのプロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受ける哺乳動物由来のプロアポトーシス遺伝子等をチョウ目昆虫細胞内で発現可能な状態で含む、細胞死誘導ベクターを提供する。

Description

細胞死誘導ベクター及びそれを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統
　本発明は、チョウ目昆虫の任意の細胞又は組織で細胞死を誘導することのできる細胞死誘導ベクター及びそれを用いた部位特異的細胞死誘導カイコ系統に関する。
　アポトーシスは、プログラム細胞死（PCD：programmed cell death）の一形態であり、器官形成等の発生や恒常性の維持、損傷した細胞や不要な細胞を除去する機構である。哺乳動物のアポトーシスは、カスパーゼと呼ばれるプロテアーゼ群の活性化によって進行する。この過程は、アポトーシスシグナルの受容によりミトコンドリアから細胞質中に放出されたシトクロムcが、アダプタータンパク質であるApaf-1（apoptotic protease activating factor-1）のWD-40ドメインに結合して、アポトソーム（apoptosome）を形成し、不活性型カスパーゼ（pro-caspase-9）を取り込んだ後、それを活性化させることによって達成される(非特許文献１～３)。
　ミトコンドリア外膜（MOM: mitochondrial outer membrane）に局在するBcl-2タンパク質ファミリーは、アポトーシスシグナルを受容した後、ミトコンドリア外膜の膜透過性を介してシトクロムcの放出を制御することが知られている（非特許文献４）。Bcl-2タンパク質ファミリーには、アポトーシス亢進機能を有するプロアポトーシス（proapoptotic）タンパク質と、アポトーシス抑制機能を有する抗アポトーシス（antiapoptotic）タンパク質が存在し、両タンパク質によって細胞の生死を制御している。
　哺乳動物では、これまでに20種を越えるBcl-2タンパク質ファミリーが同定されている。例えば、Bax（Bcl-2 associated X protein）タンパク質やBak（Bcl-2 homologous antagonist/killer）タンパク質等はプロアポトーシスタンパク質として、またBcl-2やBcl-xL（Bcl-2 associated X protein large transcript）等は抗アポトーシスタンパク質として機能する。
　一方、節足動物門（Arthropoda）に属する昆虫には、哺乳動物と異なり、Bcl-2タンパク質ファミリーをコードする遺伝子がゲノム中に1又は2種類しか存在しない。例えば、ハエ目（Diptera）に属するキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）には、Buffyタンパク質とDebclタンパク質の2種類のBcl-2タンパク質ファミリーをコードする遺伝子のみが存在する。Buffyタンパク質は、Bcl-2タンパク質のキイロショウジョウバエオルソログであり、抗アポトーシスタンパク質として機能する。またDebclタンパク質は、Baxタンパク質のキイロショウジョウバエオルソログであり、プロアポトーシスタンパク質として機能する（非特許文献５及び６）。しかし、キイロショウジョウバエでは、アポトソーム形成にシトクロムcが必須でないことや、Buffy遺伝子又はDebcl遺伝子をノックアウトしても個体は正常に発生する等、哺乳動物のアポトーシス機構と異なる点もみられる。
　同じ昆虫でもチョウ目昆虫のアポトーシス機構では、ハエ目昆虫以上に不明な点が多い。例えば、カイコ（Bombyx mori）は、ゲノム中にBcl-2タンパク質ファミリーをコードする遺伝子が1種類しか存在しない（非特許文献９）。この遺伝子は、Buffy遺伝子のカイコオルソログBmBuffyであり、そのタンパク質は抗アポトーシスタンパク質として機能することが培養細胞を用いた研究から明らかとなっている（非特許文献１０）。つまり、カイコには、哺乳動物のBaxタンパク質やハエ目昆虫のDebclタンパク質のようなプロアポトーシスタンパク質のオルソログが存在せず、どのような機構でアポトーシスを亢進させているのか明らかになっていない。
　特定の細胞や組織で人為的にアポトーシスを誘導させる技術は、個体発生や組織の分化、細胞分裂の制御等の機序を研究する上で有用であり、癌の治療にも応用可能なことから、世界各国で研究されている。また、昆虫のショウジョウバエでは、ヒトの癌と非常によく似た機序によって細胞が異常増殖することが報告されている（非特許文献１１）。そのため、癌の作製や癌治療方法の開発におけるモデル生物として利用されている。昆虫のアポトーシス誘導系は、癌モデルのみならず、例えば、生殖腺での細胞死誘導によって不妊虫の作製に応用することができる。不妊虫開発は、SIT（不妊虫放飼法：Sterile Insect Technique）や、昆虫制御の分野、例えば、生物農薬などの害虫防除方法に用いる天敵昆虫や外来種を用いた花粉媒介昆虫等の環境中への拡散防止において活用できる。上記の理由から、現在、昆虫における細胞死誘導が可能なアポトーシスエフェクター因子の開発が進められている。
　キイロショウジョウバエでは、哺乳類のBax遺伝子を過剰発現させると、アポトーシスが誘導されることが知られている（非特許文献７）。しかし、Debclタンパク質のノックアウト個体では、Bax遺伝子を過剰発現させても細胞死は誘導されない（非特許文献８）。つまり、Bax遺伝子の過剰発現によるキイロショウジョウバエ細胞の細胞死誘導には、Bax遺伝子のハエオルソログであるDebcl遺伝子の存在が必要であることが示唆されている。
　一方、チョウ目昆虫では、これまでにアポトーシスエフェクター因子は開発されていない。前述のように、チョウ目昆虫にはプロアポトーシスタンパク質をコードする内在性のオルソログ遺伝子が存在しない。それ故、ハエ目昆虫とはアポトーシス制御機構が本質的に異なり、キイロショウジョウバエと同様の方法では細胞死を誘導できないというのが当該分野での通説であった。
　ところで、チョウ目昆虫のカイコは、古くからシルク生産を行う産業上有用な昆虫である。また、近年の遺伝子組換え技術の躍進から、新素材の開発やバイオ医薬品などの有用生産物質生産系としても注目が集まっている。例えば、カイコの絹糸腺は、大量のタンパク質を短期間に合成する能力を有している。遺伝子組換え技術を用いることで、絹糸腺に大量の有用タンパク質を生産させることができる。これらの有用物質は、繭として回収可能な点で他の微生物を用いた有用物質生産系よりも優れている。したがって、カイコをはじめとするチョウ目昆虫においても、特定の細胞や組織で細胞死を自在に誘導できる技術やアポトーシスエフェクター因子の開発が強く求められていた。
Adams J.M., Cory S., 1998, Science, 281: 1322-1326 Green D.R. and Kroemer G., 2004, Science, 305: 626-629 Yuan S., et al., 2010, Structure, 18: 571-583 Youle R.J. and Strasser A., 2008, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 9: 47-59 Igaki T., et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 662-667 Quinn, L., et al., 2003, EMBO J. 22: 3568-3579 Gaumer S., et al., 2000, Cell Death Differ, 7: 804-814 Galindo K.A., et al., 2009, Development, 136(2): 275-283 Zhang, J.Y., et al., 2010, BMC Genomics. 11:611 Pan, C., et al., 2014, Biochem. Biophys. Res. Commun. 447:237-243 Nakamura et al., 2014, Nature communication 5: 5264.
　本発明の課題は、カイコをはじめとするチョウ目昆虫において細胞死誘導系の確立のために、細胞又は組織特異的エフェクター遺伝子を開発し、提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、カイコ細胞内で哺乳動物のプロアポトーシスタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることで、任意の細胞や組織で人為的に細胞死を誘導できることを見出した。これは、上述した当該分野における従来説を覆す発見であった。本願発明は、当該新規知見に基づくものであって、具体的には以下の発明を提供する。
（１）部位特異的プロモーター、及び哺乳動物由来のプロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNAをチョウ目昆虫細胞内で発現可能な状態で含み、前記DNAは、前記プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている細胞死誘導ベクター。
（２）前記プロアポトーシスタンパク質がBaxタンパク質又はBakタンパク質である、（１）に記載の細胞死誘導ベクター。
（３）部位特異的プロモーター及び該プロモーターの下流にプロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNAを機能的に連結した、（１）又は（２）に記載の細胞死誘導ベクター。
（４）部位特異的プロモーター及び該プロモーターの下流に機能的に連結した転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１発現ユニット、及び該転写調節因子の標的プロモーター及び該標的プロモーターの下流に機能的に連結したプロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNAを含む第２発現ユニットから構成される、（１）又は（２）に記載の細胞死誘導ベクター。
（５）前記転写調節因子をコードする遺伝子がGAL4遺伝子であり、該転写調節因子の標的プロモーターがUASプロモーターである、（４）に記載の細胞死誘導ベクター。
（６）（３）に記載の細胞死誘導ベクターを含む部位特異的細胞死誘導カイコ系統。
（７）（４）又は（５）に記載の第２発現ユニットを含む部位特異的細胞死誘導カイコ系統。
（８）（４）又は（５）に記載の第１発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコ系統と（７）に記載の部位特異的細胞死誘導カイコ系統とを交配させる工程、及び前記第１及び第２発現ユニットを有する部位特異的細胞死誘導カイコを選択する工程を含む部位特異的細胞死誘導カイコの作出方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-022652号の開示内容を包含する。
　本発明の細胞死誘導ベクターを用いることで、部位特異的細胞死誘導カイコ系統をはじめとするチョウ目昆虫の遺伝子組み換え系統を容易に作出することが可能となる。
　本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統によれば、任意の細胞や組織で細胞死を誘導することのできる系統を維持、及び管理できると共に、部位特異的細胞死誘導カイコを容易に作出することができる。
pBOS-T7-mBaxを過剰発現させたHeLa細胞の抗体染色を示す図である。Aは、抗T7抗体（αT7-tag)による染色図であり、Bは抗シトクロムc抗体（αcytoC）による染色図である。CはAとBを重ね合わせた図（merge）で、A及びBで重なり合う部位が明るく光っている。各図のスケールバーは10μmを示す。 中部絹糸腺でBax遺伝子を発現するMSG-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体における5齢幼虫4日目の絹糸腺の形態を示す図である。Aは中部絹糸腺でBax遺伝子を発現するMSG-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体における絹糸腺の実体顕微鏡による透過像図を、Bは中部絹糸腺でEGFP遺伝子を発現する対照区のMSG-GAL4/UAS-EGFPカイコ個体における絹糸腺の実体顕微鏡による透過像図を、CはBの蛍光画像を、Dは第２サブユニットのみを含む部位特異的細胞死誘導カイコ系統UAS-T7-mBax系統のカイコ個体における絹糸腺の実体顕微鏡による透過像図を、それぞれ示す。図中の矢印は、中部絹糸腺を示す。 後部絹糸腺でBax遺伝子を発現するPSG-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体における5齢幼虫4日目の絹糸腺の形態を示す図である。Aは後部絹糸腺でBax遺伝子を発現するPSG-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体における絹糸腺の実体顕微鏡による透過像図を、Bは後部絹糸腺でEGFP遺伝子を発現する対照用のPSG-GAL4/UAS-EGFPカイコ個体における絹糸腺の実体顕微鏡による透過像図を、CはBの蛍光画像を、それぞれ示す。図中の矢印は、後部絹糸腺を示す。 脂肪体でBax遺伝子を発現する30K-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体における5齢幼虫4日目の脂肪体の形態を示す図である。Aは脂肪体でBax遺伝子を発現する30K-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体における脂肪体の実体顕微鏡による透過像図を、Bは第１サブユニットのみを含む30K-GAL4系統のカイコ個体における脂肪体の実体顕微鏡による透過像図を、それぞれ示す。 脂肪体から抽出したゲノムDNAのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。Aは5齢幼虫2日目の、またBは5齢幼虫4日目のカイコ由来のゲノムDNAの結果である。 Aは、羽ばたき行動実験用の装置を示す図である。Bは、ボンビコールの暴露のタイムコースを示す。 ボンビコールに対するオスカイコの反応性（羽ばたき行動）をグラフ化した図である。sumi4-4A/1bはフェロモンレセプター細胞でBax遺伝子を発現するBmOR1-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ系統のオス個体を、1bは第１サブユニットのみを含むpBmOR1-GAL4系統のオス個体を、そしてw1,pndは第１及び第２サブユニットのいずれも含まないバックグラウンド系統のオス個体を示す。各濃度で反応した個体の割合（%）を縦軸に、横軸にはボンビコールの濃度を示した。 オス成虫カイコの触角におけるBmOR1遺伝子の発現量を示す。レーン1は対照区のBmOR1-GAL4カイコ個体を、レーン2はフェロモン受容細胞でBax遺伝子を発現するBmOR1-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ個体を示す。レーンMはサイズマーカーである。RpS3遺伝子は、内部対照用として用いた。 全身でBax遺伝子を発現した場合、胚致死となることを示した交配実験の結果を示す図である。Redは第１発現ユニットのみを含むF1胚、GFPは第２発現ユニットのみを含むF1胚、doubleは第１、第２発現ユニットの両方を含むF1胚、Negativeはいずれの発現ユニットも持たないF1胚である。胚致死であったものは、lethalとしてカウントした。
１．細胞死誘導ベクター
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、細胞死誘導ベクターである。本発明の細胞死誘導ベクターは、発現ベクターであり、部位特異的プロモーターとその制御下にある脊椎動物由来、好ましくは哺乳動物由来のプロアポトーシスタンパク質、又はその活性断片をコードするDNAを含むことを特徴とする。本発明の細胞死誘導ベクターによれば、宿主であるチョウ目昆虫に導入することで、プロモーターが活性化される細胞又は組織において、細胞死を自在に誘導することができる。
１－２．定義
　「チョウ目昆虫」とは、分類学上のチョウ目（鱗翅目：Lepidoptera）に属する昆虫であって、チョウ又はガをいう。チョウには、タテハチョウ科（Nymphalidae）、アゲハチョウ科（Papilionidae）、シロチョウ科（Pieridae）、シジミチョウ科（Lycaenidae）、及びセセリチョウ科（Hesperiidae）に属する昆虫が含まれる。ガには、ヤママユガ科（Saturniidae）、カイコガ科(Bombycidae)、イボタガ科(Brahmaeidae)、オビガ科(Eupterotidae)、カレハガ科（Lasiocampidae）、ミノガ科（Psychidae）、シャクガ科（Geometridae）、ヒトリガ科（Archtiidae）、ヤガ科（Noctuidae）、メイガ科（Pyralidae）、スズメガ科（Sphingidae）等に属する昆虫が含まれる。例えば、ガであれば、Bombyx属、Samia属、Antheraea属、Saturnia属、Attacus属、Rhodinia属に属する種、具体的には、カイコ、クワコ（Bombyx mandarina）、シンジュサン（Samia cynthia；エリサンSamia cynthia ricini及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む）、ヤママユガ（Antheraea yamamai）、サクサン（Antheraea pernyi）、ヒメヤママユ（Saturnia japonica）、オオミズアオ（Actias gnoma）等が挙げられる。
　本明細書で「発現ベクター」とは、目的のタンパク質をコードする遺伝子又はその活性断片をコードするDNAを発現可能な状態で含み、その遺伝子等の発現を制御できる、発現単位をいう。なお、本明細書では、目的のタンパク質をコードする遺伝子又はその活性断片をコードするDNAをまとめて、しばしば「目的の遺伝子等」と表記する。
　本明細書で「発現可能な状態」とは、発現ベクター内で目的の遺伝子等をプロモーターの制御下に配置することをいう。
１－３．構成
１－３－１．細胞死誘導ベクターの構成要素
　本発明の細胞死誘導ベクターは、宿主の特定の細胞内で目的の遺伝子等を発現できるように構成されている。
　細胞死誘導ベクターには、宿主細胞内で複製可能な様々な遺伝子発現ベクターを利用することができる。例えば、プラスミド若しくはバクミド（Bacmid）のような自律複製可能な発現ベクター、ウイルスベクター、又は染色体中に相同又は非相同組換え可能な発現ベクター若しくはそれを宿主の染色体中に挿入した染色体の一部が挙げられる。また、大腸菌、枯草菌又は酵母内でも複製可能なシャトルベクターを利用することもできる。
　細胞死誘導ベクターは、部位特異的プロモーター及び目的の遺伝子等を必須構成要素として含む。また、標識遺伝子、トランスポゾンの逆位末端反復配列、5’UTR、3’UTR、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、及びマルチクローニングサイト等を選択構成要素として含む。さらに、細胞死誘導ベクターが、後述する第１発現ユニットと第２発現ユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合には、転写調節因子の遺伝子及び該転写調節因子の標的プロモーターを必須の構成要素として包含する。以下、本発明の細胞死誘導ベクターにおける各構成要素ついて具体的に説明をする。
（１）部位特異的プロモーター
　「部位特異的プロモーター」とは、発現ベクターを導入した宿主個体の特定の細胞又は組織において、下流（3’末端側）に配置された遺伝子の発現を制御することのできるプロモーターである。本明細書では、宿主個体全体での発現を制御するユビキタスなプロモーター（全身性プロモーター）に対応する用語として使用する。
　部位特異的プロモーターは、その発現制御の時期に基づいて構成的活性型プロモーター、発現誘導型プロモーター又は時期特異的活性型プロモーターに分類される。構成的活性型プロモーターは、宿主細胞内で目的の遺伝子等を恒常的に発現させることができる。発現誘導型プロモーターは、宿主細胞内で目的の遺伝子等の発現を任意の時期に誘導することができる。時期特異的活性型プロモーターは、宿主細胞内で目的の遺伝子等を発生段階の特定の時期のみに発現誘導することができる。いずれのプロモーターも、宿主細胞内で目的の遺伝子等の過剰な発現をもたらし得るので、本明細書における部位特異的プロモーターは、部位特異的過剰発現型プロモーターと解することができる。
　部位特異的プロモーターは、特定の細胞又は特定の組織でのみ発現する遺伝子のプロモーターに由来する。例えば、カイコであれば、眼特異的発現をする3xP3遺伝子のプロモーター（3xP3プロモーター；配列番号２１）、中部絹糸腺の前部で特異的発現をするセリシン３遺伝子のプロモーター（Ser3プロモーター；配列番号２２）、中部絹糸腺特異的発現をするセリシン１遺伝子のプロモーター（Ser1プロモーター；配列番号２３）、後部絹糸腺特異的発現をするフィブロインH遺伝子のプロモーター（Fib Hプロモーター；配列番号２４）、フィブロインL遺伝子のプロモーター（Fib Lプロモーター；配列番号２５）、又はp25遺伝子のプロモーター（p25プロモーター；配列番号２６）、脂肪体特異的発現をする30K遺伝子のプロモーター（30Kプロモーター；配列番号２７）、及び精巣で特異的発現をするelavlike遺伝子のプロモーター（elavlikeプロモーター；配列番号４０）等が挙げられる。
　部位特異的プロモーターの細胞又は組織特異性は、そのプロモーターが本来制御していた遺伝子に依存する。例えば、前述のSer1プロモーターであれば、Ser1遺伝子は中部絹糸腺で特異的に発現することから、中部絹糸腺特異的プロモーターとなる。本発明の細胞死誘導ベクターでは、細胞死を誘導したい細胞又は組織に特異的な部位特異的プロモーターを選択すればよい。このプロモーターの選択によって、宿主の細胞又は組織で自在に細胞死を誘導することが可能になる。
　部位特異的プロモーターの由来となるドナー生物種は、細胞死誘導ベクターを導入するレシピエント側の宿主細胞内で作動可能である限り、特に限定はしない。好ましくは細胞死誘導ベクターを導入する宿主と分類学上で同目に属する種である。同科に属する種はより好ましく、同属に属する種はさらに好ましい。宿主と同じ種が最も好ましい。本発明の細胞死誘導ベクターを導入する宿主は、チョウ目昆虫であり、後述するように好適な宿主はカイコであることから、プロモーターのドナー生物種は、チョウ目昆虫であることが好ましく、カイコガ科(Bombycidae)に属する種であることがより好ましく、クワコ（Bombyx mandarina）のような同じBombyx属に属する種であることがさらに好ましい。最も好ましいドナー生物種は、同種のカイコである。
（２）プロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNA
　本発明の細胞死誘導ベクターは、目的の遺伝子等として、プロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNA（本明細書では、しばしば「プロアポトーシス遺伝子等」と表記する）を含む。
　「プロアポトーシス（pro-apoptotic）タンパク質」とは、Bcl-2（B-cell lymphoma 2）タンパク質ファミリーに属し、アポトーシス亢進機能を有するタンパク質をいう。
　本発明の細胞死誘導ベクターに含まれるプロアポトーシス遺伝子は、脊椎動物由来の遺伝子、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子である。本発明の細胞死誘導ベクターを導入すべき宿主であるチョウ目昆虫には内在性のプロアポトーシス遺伝子が存在しない。つまり、宿主にオルソログが存在しない、他種生物由来のプロアポトーシス遺伝子を宿主内の特定の細胞や組織で過剰発現することが本発明の細胞死誘導ベクターの特徴である。
　哺乳動物由来のプロアポトーシスタンパク質には、例えば、Baxタンパク質やBakタンパク質が挙げられる。Baxタンパク質やBakタンパク質等のプロアポトーシスタンパク質は、哺乳動物種間で高度に保存されていることから、由来する哺乳動物の種類は、特に限定しない。例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるマウス(Mus musculus)のBaxタンパク質（mBax）、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるラット(Rattus norvegicus)のBaxタンパク質（rBax）、配列番号５で示すアミノ酸配列からなるイヌ（Canis lupus familiaris）のBaxタンパク質（cBax）、配列番号７で示すアミノ酸配列からなるウシ（Bos Taurus）のBaxタンパク質（bBax）、又は配列番号９で示すアミノ酸配列からなるヒト(Homo sapiens)のBaxタンパク質（hBax）、が挙げられる。
　哺乳動物以外の脊椎動物由来のプロアポトーシスタンパク質には、例えば、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるゼブラフィッシュ（Danio rerio）のBaxタンパク質、配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるヒラメ（Cynoglossus semilaevis）のBaxタンパク質、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるアフリカツメガエル（Xenopus laevis）のBaxタンパク質、配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるビルマニシキヘビ（Python bivittatus）のregulator BAX-likeタンパク質、配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるキンカチョウ（Taeniopygia guttata）のapoptosis regulator BAX-likeタンパク質が挙げられる。
　プロアポトーシスタンパク質は、野生型タンパク質が好ましいがアポトーシス亢進機能を維持する限り変異型タンパク質であってもよい。このような変異型プロアポトーシスタンパク質には、野生型プロアポトーシスタンパク質のアミノ酸配列において1～複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、野生型プロアポトーシスタンパク質のアミノ酸配列に対して55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、98％以上又は99％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。本明細書において「複数個」とは、例えば、2～20個、2～15個、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個又は2～3個をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じていずれかのアミノ酸配列にギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、野生型タンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　プロアポトーシス遺伝子は、前述の野生型又は変異型プロアポトーシスタンパク質をコードする塩基配列からなる。例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるmBaxタンパク質をコードする配列番号２で示す塩基配列からなるmBax遺伝子、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるrBaxタンパク質をコードする配列番号４で示す塩基配列からなるrBax遺伝子、配列番号５で示すアミノ酸配列からなるcBaxタンパク質をコードする配列番号６で示す塩基配列からなるcBax遺伝子、配列番号７で示すアミノ酸配列からなるbBaxタンパク質をコードする配列番号８で示すbBax遺伝子、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるhBaxタンパク質をコードする配列番号１０で示す塩基配列からなるhBax遺伝子、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるゼブラフィッシュのBaxタンパク質をコードする配列番号１２で示す塩基配列からなるゼブラフィッシュのBax遺伝子、配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるヒラメのBaxタンパク質をコードする配列番号１４で示す塩基配列からなるヒラメのBax遺伝子、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるアフリカツメガエルのBaxタンパク質をコードする配列番号１６で示す塩基配列からなるアフリカツメガエルのBax遺伝子、配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるビルマニシキヘビのregulator BAX-likeタンパク質をコードする配列番号１８で示す塩基配列からなるビルマニシキヘビのregulator BAX-like遺伝子、又は配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるキンカチョウのapoptosis regulator BAX-likeタンパク質をコードする配列番号２０で示す塩基配列からなるキンカチョウのapoptosis regulator BAX-like遺伝子が挙げられる。
　「その活性断片」とは、プロアポトーシスタンパク質の一部からなり、アポトーシス亢進機能活性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。
　本発明の細胞死誘導ベクターにおいて、プロアポトーシス遺伝子等は、前記プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている。本明細書において「直接的な発現制御」とは、プロアポトーシス遺伝子が部位特異的プロモーターの下流に発現可能な状態で配置され、部位特異的プロモーターの発現制御を直接的に受ける場合をいう。また、「間接的な発現制御」とは、部位特異的プロモーターが介在因子を介して間接的にプロアポトーシス遺伝子等の発現を制御する場合をいう。例えば、後述する転写調節因子及びその転写調節因子の標的プロモーターを介した発現制御が該当する。
（３）標識遺伝子
　「標識遺伝子」は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。「標識タンパク質」とは、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。標識遺伝子は、細胞死誘導ベクターを保有する宿主、すなわち形質転換体を判別する目的、及び／又は細胞死誘導ベクターから発現した目的のタンパク質等をモニタリングする目的で用いられるが、本発明の細胞死誘導ベクターではいずれの目的で使用してもよい。いずれの場合にも、標識タンパク質の活性に基づいて形質転換体の判別や目的のタンパク等をモニタリングすることができる。ここで「活性に基づいて」とは、活性の検出結果に基づいて、という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、色素のような標識タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、生物学的検出（抗体、アプタマー等のペプチドや核酸の結合による検出を含む）、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
　標識遺伝子がコードする標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によりその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。好ましくは検出に際して形質転換体に対する侵襲性の低い標識タンパク質である。例えば、タグペプチド、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質、外部形態を制御するタンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質は、形質転換体の外部形態を変化させることなく特定の条件下で視覚的に検出可能なことから、形質転換体に対する侵襲性が非常に低く、また形質転換体の判別及び選抜が容易なため特に好適である。
　「タグペプチド」は、タンパク質を標識化することのできる十数アミノ酸～数十アミノ酸からなる短ペプチドであって、タンパク質の検出用、精製用として用いられる。通常は、標識すべきタンパク質をコードする遺伝子の5’末端側又は3’末端側にタグペプチドをコードする塩基配列を連結し、タグペプチドとの融合タンパク質として発現させることで標識化する。タグペプチドは、当該分野で様々な種類が開発されているが、いずれのタグペプチドを使用してもよい。タグペプチドの具体例として、FLAG、HA、His、及びmyc等が挙げられる。
　「蛍光タンパク質」は、特定波長の励起光を照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、CFP、RFP、DsRed（3xP3-DsRedのような派生物を含む）、YFP、PE、PerCP、APC、GFP（EGFP、3xP3-EGFP等の派生物を含む）等が挙げられる。
　「色素合成タンパク質」は、色素の生合成に関与するタンパク質であり、通常は酵素である。ここでいう「色素」とは、形質転換体に色素を付与することができる低分子化合物又はペプチドで、その種類は問わない。好ましくは個体の外部色彩として表れる色素である。例えば、メラニン系色素（ドーパミンメラニンを含む）、オモクローム系色素、又はプテリジン系色素が挙げられる。
　本明細書で「発光タンパク質」とは、励起光を必要とすることなく発光することのできる基質タンパク質又はその基質タンパク質の発光を触媒する酵素をいう。例えば、基質タンパク質としてのルシフェリン又はイクオリン、酵素としてのルシフェラーゼが挙げられる。
　本明細書で「外部分泌タンパク質」とは、細胞外又は体外に分泌されるタンパク質であり、外分泌性酵素の他、フィブロインのような繊維タンパク質やセリシンが該当する。外分泌性酵素には、ブラストサイジンのような薬剤の分解又は不活化に寄与し、宿主に薬剤耐性を付与する酵素の他、消化酵素が該当する。
　標識遺伝子は、細胞死誘導ベクターにおいてプロアポトーシス遺伝子等に連結した状態で、又はプロアポトーシス遺伝子等とは独立して、プロモーターの下流に発現可能な状態で配置される。
（４）トランスポゾンの逆位末端反復配列
　「トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRs:inverted terminal repeat sequence)」は、本発明の細胞死誘導ベクターをゲノムDNAに相同組換え可能な発現ベクターとする場合に含まれ得る選択構成要素である。逆位末端反復配列は、通常は2個1組で使用され、トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる（Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281；Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9（2）:145-55）。
（５）5’UTR（5’untranslated region）及び3’UTR（3’untranslated region）
　「5’UTR及び3’UTR」は、いずれもそれ自身がタンパク質やその断片、又は機能性核酸をコードしない非翻訳領域からなるポリヌクレオチドである。各UTRを構成する塩基配列は、限定はしないがプロアポトーシス遺伝子に由来する5’UTR及び3’UTRであることが好ましい。細胞死誘導ベクターにおいて5’UTRは、前記プロアポトーシス遺伝子等の開始コドンの上流（5’末端側）に配置され、3’UTRは、プロアポトーシス遺伝子等の終止コドンの下流（3’末端側）に配置される。なお、3’UTRは、ポリAシグナルを含むことができる。
（６）ターミネーター
　「ターミネーター」は、本発明の細胞死誘導ベクターにおいて、プロアポトーシス遺伝子等の3’末端側、好ましくは終止コドンの下流に配置される塩基配列で、プロアポトーシス遺伝子等の転写を終結できる塩基配列で構成されている。例えば、配列番号２８で示す塩基配列からなるhsp70ターミネーターや配列番号２９で示す塩基配列からなるSV40ターミネーターが挙げられる。
（７）エンハンサー
　「エンハンサー」は、本発明の細胞死誘導ベクターにおいて、部位特異的プロモーターの制御によるプロアポトーシス遺伝子等の発現をさらに増強することができる塩基配列からなる。
（８）インスレーター
　「インスレーター」は、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けることなく、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、安定的に制御できる塩基配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
（９）マルチクローニングサイト
　「マルチクローニングサイト」は、複数のクローニング用制限酵素部位からなるクラスター配列である。マルチクローニングサイトを構成する塩基配列や包含する制限酵素部位の種類及び数については、特に制限はしない。また、細胞死誘導ベクターにおけるマルチクローニングサイトの数や配置される位置についても、制限はしないが、前記部位特異的プロモーターの制御領域範囲内に配置することが好ましい。そのような位置に配置することで、プロアポトーシス遺伝子等を本発明の細胞死誘導ベクター内に容易に挿入できるからである。
（１０）転写調節因子の遺伝子
　「転写調節因子の遺伝子」は、後述する第１発現ユニットの必須構成要素である。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるGAL4タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるtTA及びその変異体等が挙げられる。
（１１）転写調節因子の標的プロモーター
　「転写調節因子の標的プロモーター」とは、後述する第２発現ユニットの必須要素であって、第１発現ユニットにコードされた転写調節因子が結合することによって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常は、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がGAL4タンパク質の場合には、UAS（Upstream Activating Sequence）が使用される。
１－３－２．細胞死誘導ベクターのユニット構成
　細胞死誘導ベクターは、1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合と、2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
（１）1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合
　細胞死誘導ベクターは、宿主細胞内でプロアポトーシス遺伝子等を発現させるのに必要な全ての構成要素を1つの細胞死誘導ベクター内に含む。具体的には、必須の構成要素である部位特異的プロモーター及びそのプロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたプロアポトーシス遺伝子等を含む。
　細胞死誘導ベクターは、1つのプロモーター制御下にプロアポトーシス遺伝子等を2以上含んでいてもよい。
　細胞死誘導ベクターが1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、細胞死誘導ベクターを宿主に導入するだけで、宿主細胞内でプロアポトーシス遺伝子等を過剰発現することができる。
（２）2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合
　細胞死誘導ベクターが第１発現ユニット及び第２発現ユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、プロアポトーシス遺伝子等の発現に必須の構成要素は各ユニットに分割されて存在する。本構成では、第１及び第２発現ユニットが宿主細胞内に併存してはじめて1つの細胞死誘導ベクターとして機能する。すなわち、同一細胞内で第１発現ユニットに含まれるプロモーターの活性化により第１発現ユニットから転写調節因子が発現し、それが第２発現ユニットの標的プロモーターを活性化することによって目的のプロアポトーシス遺伝子等を発現することができる。第１及び第２発現ユニットは、以下の構成を有する。
　「第１発現ユニット」は、部位特異的プロモーターとそのプロモーターの下流に発現可能な状態で連結された転写調節因子の遺伝子を含んでなる。このとき、1つのプロモーター制御下に同一の又は異なる2以上の転写調節因子を含んでいてもよい。
　また、第１発現ユニットは、部位特異的プロモーターとその制御下にある転写調節因子の遺伝子からなる組を2組以上有することもできる。この場合、各組は同一の組であっても、又は異なる組であってもよい。異なる組の例としては、第１発現ユニットがSer3プロモーターとGAL4遺伝子からなる組、及びFib HプロモーターとGAL4遺伝子からなる組が挙げられる。
　第１発現ユニットが包含するプロモーターは、既知の部位特異的プロモーターを利用できることから、部位特異的プロモーターとその制御下にある転写調節因子の遺伝子からなる既存の遺伝子発現ベクターを第１発現ユニットとして利用することもできる。
　「第２発現ユニット」は、前記第１発現ユニットにコードされた転写調節因子の標的プロモーターとその標的プロモーターの下流に機能的に結合したプロアポトーシス遺伝子等を含んでなる。第２発現ユニットに含まれる標的プロモーターは、第１発現ユニットにコードされる転写調節因子によって活性化されるプロモーターである。したがって、第１発現ユニットにコードされる転写調節因子によって第２発現ユニットに含まれる標的プロモーターは、原則として一義的に決定される。例えば、標的プロモーター第１発現ユニットに含まれる転写調節因子の遺伝子がGAL4遺伝子であれば、第２発現ユニットのGAL4標的プロモーターにはUASが使用される。第２発現ユニットは、1つの標的プロモーター制御下に同一の又は異なるプロアポトーシス遺伝子等を2以上含んでいてもよい。例えば、第２発現ユニットが1つのUASの制御下にmBax遺伝子とmBak遺伝子の2つの遺伝子を配置している場合が該当する。
　また、第２発現ユニットは、標的プロモーターとその制御下にあるプロアポトーシス遺伝子等からなる組を2組以上有していてもよい。この場合、各組は同一の組であっても、又は異なる組であってもよい。異なる組の例としては、第２発現ユニットが2つのUASを含み、1つのUASの制御下にmBax遺伝子を配置し、他のUASの制御下にmBak遺伝子を配置している場合が該当する。
　さらに、第２発現ユニットは、プロアポトーシス遺伝子等を含む同一の又は異なる2以上のユニットで構成されていてもよい。この場合、1つの第１発現ユニットから発現した転写調節因子は、複数の第２発現ユニットの標的プロモーターを活性化することによって、それぞれの第２発現ユニットに含まれるプロアポトーシス遺伝子等を発現することができる。
　本構成の細胞死誘導ベクターは、第１発現ユニットにコードされた転写調節因子を介して第２発現ユニットのプロアポトーシス遺伝子等の発現を増幅させることができる。したがって、プロアポトーシス遺伝子等を宿主細胞内で過剰発現させる上で好適である。
１－４．効果
　本発明の細胞死誘導発現ベクターは、アポトーシスエフェクター因子をコードする発現ベクターであり、チョウ目昆虫の宿主、特にカイコに導入することによって、所望する細胞又は組織において、細胞死を自在に誘導することができる。
２．部位特異的細胞死誘導カイコ系統
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、部位特異的細胞死誘導カイコ系統である。本態様のカイコ系統は、第１態様に記載の細胞死誘導ベクターを有するカイコ及びその後代である。本系統を用いることで、細胞死によって任意の細胞又は組織を壊滅させたカイコ系統を自在かつ容易に作出することができる。
２－２．構成
　本発明の「部位特異的細胞死誘導カイコ系統」は、第１態様に記載の細胞死誘導発現ベクターを有し、特定の細胞又は組織において細胞死誘導の潜在性を有する継代可能な遺伝子組換え体又はその後代をいう。特定の細胞又は組織においてプロアポトーシスタンパク質等が発現しているか否かは問わない。
　本明細書において「部位特異的細胞死誘導カイコ」とは、第１態様に記載の細胞死誘導発現ベクターを有し、そのベクターに包含されるプロアポトーシスタンパク質等が特定の細胞又は組織で発現している遺伝子組み換えカイコをいう。部位特異的細胞死誘導カイコでは、部位特異的プロモーターが活性化される特定の細胞又は組織で細胞死が誘導されている。
　部位特異的細胞死誘導カイコ系統が有する細胞死誘導発現ベクターは、第１態様で記載した1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合と2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合のいずれであってもよい。
　1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、その細胞死誘導ベクターを有する遺伝子組み換え系統が本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統に該当する。この部位特異的細胞死誘導カイコ系統では、プロアポトーシスタンパク質等が発現状態であるか、又は誘導処理等により発現可能な状態であることから、同時に部位特異的細胞死誘導カイコでもある。
　2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、第２発現ユニットのみを有する遺伝子組換えカイコ系統が本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統に該当する。一方、第１発現ユニットのみを有する遺伝子組換えカイコ系統は、特定の細胞又は組織において細胞死を誘導する直接的な潜在性はないことから、本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統には該当しない。第２発現ユニットのみを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統を、第１発現ユニットを含む遺伝子組換えカイコ系統と交配することによって、プロアポトーシス遺伝子等の発現を誘導することができる。つまり、この場合、第１及び第２発現ユニットの2つを有するカイコ個体が部位特異的細胞死誘導カイコとなる。
　部位特異的細胞死誘導カイコ系統において、細胞死誘導ベクターは、カイコ細胞内に一過的に存在してもよいし、またゲノム中に挿入された状態等で安定的かつ継続的に存在してもよい。通常は、ゲノム中に挿入された状態で存在することが好ましい。
　細胞死誘導ベクターが第１及び第２発現ユニットからなる2つの遺伝子発現ユニットで構成され、それぞれがカイコの染色体上に組み込まれている場合、第１及び第２発現ユニットは同一のカイコ個体の同一染色体上に存在していてもよいし、同一のカイコ個体の異なる染色体上に存在していてもよい。
　第１の発現ユニットと第２の発現ユニットは、部位特異的細胞死誘導カイコ系統の継代や管理及び維持の観点から、それぞれ互いに異なるカイコ個体に、又は異なる染色体に、組み込まれていていることが望ましい。第１発現ユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換えカイコ系統と、第２発現ユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統とを交配させることによって、F1で第１及び第２発現ユニットを有する部位特異的細胞死誘導カイコを容易に得ることができる。
　一方、第１発現ユニット及び第２発現ユニットが同一のカイコ個体の同一染色体上に存在する場合には、継代過程で組換えによってそれぞれが分離しないように、発現ベクター間の距離が近く、互いに連鎖している方が好ましい。
２－３．部位特異的細胞死誘導カイコ系統の作出方法
　本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統の作出方法は、細胞死誘導ベクターを宿主であるカイコに導入することで達成し得る。細胞死誘導ベクターのカイコ導入方法について以下で具体的に説明をする。
　細胞死誘導ベクターを導入する宿主は、カイコ個体、カイコ由来の細胞（株化細胞を含む）、又はカイコ由来の組織である。好ましくはカイコ個体である。細胞若しくは組織に導入する場合、採取された個体の発生ステージは、特に限定はしない。個体に導入する場合も、発生ステージや雌雄の限定は特になく、胚、幼虫、蛹、又は成虫のいずれのステージであってもよい。好ましくは、より高い効果が期待できる胚時期である。
　細胞死誘導ベクターが1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合には、その細胞死誘導ベクターを、また細胞死誘導ベクターが第１及び第２発現ユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合には、第２発現ユニットを、カイコに導入することで目的の部位特異的細胞死誘導カイコ系統を得ることができる。
　細胞死誘導ベクター導入方法は、導入する細胞死誘導ベクターに応じて当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、細胞死誘導ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列を有するプラスミドであり、導入する宿主がカイコであれば、Tamuraらの方法（Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84）を応用することができる。例えば、適当な濃度に希釈した細胞死誘導ベクターを、トランスポゾン転移酵素の遺伝子を有するヘルパーベクターと共にカイコ卵の初期胚にインジェクションすればよい。ヘルパーベクターには、例えば、pHA3PIGが利用できる。本発明の細胞死誘導ベクターが標識遺伝子を含む場合には、前述のように、その遺伝子等の発現に基づいて目的の形質転換体を容易に選抜することができる。得られた遺伝子組換えカイコを必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、染色体に挿入された発現ベクターのホモ接合体を得てもよい。
２－４．効果
　本発明の遺伝子組換えカイコ系統によれば、特定の細胞又は組織を細胞死によって壊滅させる部位特異的細胞死誘導カイコを容易に作出でき、また継代管理することができる。
３．部位特異的細胞死誘導カイコの作出方法
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、部位特異的細胞死誘導カイコの作出方法である。本方法によれば、細胞死によって特定の細胞又は組織を壊滅させた部位特異的細胞死誘導カイコを作出することができる。
３－２．作出方法
　前述のように、細胞死誘導ベクターが1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合には、細胞死誘導ベクターを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統が、同時に部位特異的細胞死誘導カイコとなる。また、細胞死誘導ベクターが第１及び第２発現ユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、両遺伝子発現ユニットを1個体内に有する遺伝子組換えカイコも部位特異的細胞死誘導カイコである。
　ここでは第１及び第２発現ユニットがそれぞれ異なるカイコ系統に存在する場合において、部位特異的細胞死誘導カイコを作出する方法について説明をする。
　本発明の作出方法は、交配工程と選択工程を含む。
　「交配工程」とは、第１発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコ系統と第２発現ユニットを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統とを交配させる工程である。交配は、二つのカイコ系統を常法に基づいて交配させればよい。2つの発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコは、予め兄妹交配又は同系交配を行い、各発現ユニットに関してホモ接合体にしておくことが好ましい。
　「選択工程」とは、前記第１及び第２発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコ系統を選択する工程である。本工程では、交配工程後に得られるF1個体から、それぞれの発現ベクターにコードされた標識タンパク質の活性に基づいて、両遺伝子発現ユニットを有する個体を選抜することによって達成し得る。
　以下に本発明の態様について、具体的な実施例を挙げて説明をするが、本実施例は本発明の一概念に過ぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１：T7-mBax融合遺伝子のクローニングとmBaxタンパク質の細胞内局在の確認＞
（目的）
　本発明の細胞死誘導ベクターの構築に使用するプロアポトーシス遺伝子をクローニングし、その遺伝子がコードするタンパク質の細胞内局在を確認する。
（方法）
　プロアポトーシス遺伝子として、マウス由来のBax遺伝子（mBax遺伝子）を選択した。mBax遺伝子をクローニングするために、マウス3T3-L1細胞から総RNAを抽出した。抽出は、Trizol（life technologies；現Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。具体的な手順は、キットに添付のプロトコルに従った。得られた総RNAの2μgを鋳型としてHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Roche-diagnostics）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。具体的な手順は、キットに添付のプロトコルに従った。作製したcDNAライブラリを鋳型にmBax-F（配列番号３０）及びmBax-R（配列番号３１）のプライマーペアを用いてmBax遺伝子をPCRで増幅した。PCRは、KOD plus（TOYOBO）を用いて行い、反応液組成は、添付のプロトコルに記載されたスタンダードな方法に従った。PCRサイクルの条件は、94℃15秒、55℃30秒、68℃40秒を1サイクルとして、35サイクル行った。得られた増幅産物を、Bgl II制限酵素で消化した後、pEF-BOS-T7 vector (Kasashima et al., 1999, Genes Cells 4: 667-683.)のBamHIサイトへ挿入してクローニングを行い、哺乳細胞発現用ベクター「pEF-BOS-T7-mBax」を構築した。
　HeLa細胞は、Dulbeccos’s modified eagle medium with high glucose (DMEM; WAKO)に10% fetal bovine serum、1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した培養液にて、37℃、5% CO2濃度の条件で培養した。培養のデッシュは、35mmのpoly-L-lysine被覆したガラスボトムデッシュ(Matsunami Glass Ind.)を用いた。細胞へのpEF-BOS-T7-mBaxの導入（トランスフェクション）は、Lipofectamine（登録商標） 2000 Transfection Reagent (Life Technologies；現Thermo Fisher Scientific)を用いて、試薬に添付のプロトコルに記載された方法に従った。トランスフェクションの48時間後、細胞を固定液（4%パラホルムアルデヒド、0.4% Triton X-100を含むPBS）で、室温で20分間固定した。免疫染色は次の順に行った。まず、抗T7-Tag抗体（Novus Biologicals; goat polyclonal; 1/1000）を抗体反応液（2% horse serum、0.05% Tween 20を含むPBS）に希釈し、室温で１時間反応させた。細胞をPBSで洗浄した後、Alexa Fluor（登録商標） 488-gonjugated rabbit anti-goat IgG (Life Technologies；現Thermo Fisher Scientific; 1/1000)を抗体反応液に希釈し、室温で１時間反応させた。次に抗シトクロムc抗体（PharMingen; mouse monoclonal; 1/150）を抗体反応液に希釈し、4℃、12～15時間反応させた。細胞をPBSで洗浄した後、Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG (GE Healthcare UK Ltd; 1/1000)を抗体反応液に希釈し、室温で1時間、反応させた。蛍光像の撮影は、Axio Observer D1 system (Carl Zeiss)を用いた。
　なお、T7-mBaxタンパク質の発現は、pEF-BOS-T7-mBaxをトランスフェクションしたHeLa細胞から常法により抽出したタンパク質をSDS-PAGEで分離後、抗T7抗体によるウエスタンブロットで検出して確認した（結果は図示せず）。
（結果）
　図１に結果を示す。図１は、pBOS-T7-mBaxをトランスフェクションしたHeLa細胞の抗体染色図である。細胞内で発現したT7-mBaxは、抗T7抗体（αT7-tag; A）によって緑色蛍光（図中、白点で示される）として検出された。同時に、抗シトクロムc抗体（αcytoC; B）も反応させ、ミトコンドリアを赤色蛍光（図中、白点で示される）で標識した。Cは、AとBを重ねた図で、AとBの蛍光が一致した部位が存在すれば白点となって現れる。図１CからT7-mBaxタンパク質とシトクロムcの局在が一致していることがわかる。この結果から、T7タグを融合したT7-mBaxタンパク質もミトコンドリアに局在することが確認された。
＜実施例２：細胞死誘導ベクターの構築＞
（目的）
　本発明の細胞死誘導ベクターを構築する。
（方法）
　本実施例では、第１発現ユニットと第２発現ユニットの2つの遺伝子発現ユニットからなる細胞死誘導ベクターを構築した。
　第１発現ユニットには3種の既知遺伝子発現ベクターを用いた。具体的には、中部絹糸腺特異的プロモーターであるカイコ由来のセリシン1（Ser1）プロモーターと、その下流に発現可能な状態で転写調節因子GAL4をコードするGAL4遺伝子を有するpBac[Ser1-GAL4: 3xP3-DsRed（pMSG-GAL4）]（Tatematsu et al., 2010. Transgenic Res. 19: 473-487）、後部絹糸腺特異的プロモーターであるヤママユガ由来のフィブロイン（AyFib）プロモーターと、その下流に発現可能な状態でGAL4遺伝子を有するpBac[AyFib-GAL4: 3xP3-DsRed（pPSG-GAL4）]（Sezutsu et al., 2009, J. Insect Biochem. Mol. Biol., 78: 1-10.）、及び脂肪体特異的プロモーターであるカイコ由来の30Kプロモーターとその下流に発現可能な状態でGAL4遺伝子を有するpBac[30K-GAL4: 3xP3-DsRed（p30 K-GAL4）]（H. Sezutsu, personal communication）である。
　第２発現ユニットには、pUAS-mBaxベクターを構築した。具体的には、実施例１で調製したpEF-BOS-T7-mBaxを鋳型として、in fusion-T7_F（配列番号３２）及びin fusion-mBax_R（配列番号３３）のプライマーペアを用いて、PCRを行い、T7-mBax ORFの増幅産物を得た。In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（Clontech）を用いて、T7-mBax ORFの増幅産物をカイコの形質転換用遺伝子発現ベクターであるpBacMCS[UAS-SV40, 3xP3-EGFP] ベクター(Sakudoh et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104: 8941-8946.)のBln I サイトに挿入した。具体的な挿入方法は、キットに添付の方法に従った。得られた第２発現ユニットをpBacMCS[UAS-T7-mBax-SV40, 3xP3-EGFP]（本明細書では、しばしば「pUAS-T7-mBax」と略記する）とした。第２発現ユニットにおける転写因子の標的プロモーターはUASであり、ターミネーターはSV40ターミネーターである。また、標識遺伝子は、胚、幼虫及び成虫の眼においてEGFPを発現する3xP3 EGFPである。さらに、UASの上流と標識遺伝子の下流に、トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRs)として、それぞれpiggyBacL及びpiggyBacRを含んでいる。
　また、第２発現ユニットの対照用として既知のpBac[UAS-EGFP/3xP3-EGFP]（本明細書では、しばしば「pUAS-EGFP」と略記する）を使用した（Uchino et al., 2006, J. Insect Biotech. Sericology 75: 89-97）。この対照用第２発現ユニットにおける転写因子の標的プロモーターはUASであり、その下流に発現可能な状態でEGFP遺伝子が連結されている。ターミネーターはSV40ターミネーターである。また、標識遺伝子は、胚、幼虫及び成虫の眼においてEGFPを発現する3xP3 EGFPである。さらに、UASの上流と標識遺伝子の下流に、トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRs)として、それぞれpiggyBacL及びpiggyBacRを含んでいる。
＜実施例３：部位特異的細胞死誘導カイコ系統の作出＞
（目的）
　実施例２で構築した細胞死誘導ベクターを用いて本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統を作出する。
（方法）
　実施例２で構築した細胞死誘導ベクターの第２発現ユニットpUAS-T7-mBaxとその対照用第２発現ユニットpUAS-EGFPを、Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen)を用いて精製した。具体的な生成方法は、キットに添付のプロトコルに従った。精製後のpUAS-T7-mBaxとpUAS-UASを、それぞれトランスポゾン転移酵素をコードするpiggyBacヘルパープラスミドpHA3PIG（Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84）と1:1の割合で混合し、非休眠系統であるカイコw1, pnd系統の産卵後4～8時間の卵に顕微注入した（Tamura et al. 2000；前述）。注入後の卵は、加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化後、12時間明期と12時間暗期の光条件で25℃の飼育室にて、全齢を人工飼料（シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工）で飼育した。人工飼料は2～3日毎に交換した（Uchino K. et al., 2006；前述）。羽化後、兄妹交配を行い、得られたF1卵を孵化させた後、3xP3-EGFPマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜して目的の遺伝子組換えカイコ系統を得た。遺伝子組換えカイコ系統は、休眠系統であるw-cと交配させて系統を維持した。
（結果）
　pUAS-T7-mBaxが染色体に組込まれた部位特異的細胞死誘導カイコ系統として「4-3D系統」及び「4-4A系統」の2系統を得た。この2系統について、pUAS-T7-mBaxの染色体への挿入は、サザンブロッティングにより確認した。その結果、いずれの系統もゲノム中への挿入は1コピーであることが明らかになった（図示せず）。また、4-3D系統と4-4A系統における細胞死誘導ベクターのゲノム挿入位置をインバースPCRによって検証したところ、4-3D系統は16番染色体に順方向で、また4-4A系統は26番染色体に逆方向で挿入されていることが明らかとなった。どちらも遺伝子間領域であり、ゲノム内の遺伝子を破壊する等といった挿入による影響はないと考えられた。
＜実施例４：部位特異的細胞死誘導カイコにおける部位特異的細胞死誘導の検証（１）＞
（目的）
　本発明の部位特異的細胞死誘導カイコ系統を用いて作出された部位特異的細胞死誘導カイコにおいて、部位特異的プロモーターが活性化される細胞又は組織で細胞死が誘導されることを検証する。
（方法）
　実施例３で樹立した4-4A系統のヘテロオス個体を、Ser1系統（MSG-GAL4系統）、AyFib431a系統（PSG-GAL4系統）、及びSS19-1系統（30K-GAL4系統）のヘテロメス個体とそれぞれ交配させてF1個体を得た。ここで、MSG-GAL4系統は中部絹糸腺特異的なプロモーターを含む第１発現ユニットpMSG-GAL4を染色体に組込んだ遺伝子組換えカイコ系統（Tatematsu et al., 2010, Transgenic Res. 19: 473-487）であり、PSG-GAL4系統は後部絹糸腺特異的なプロモーターを含む第１発現ユニットpAyfib-GAL4を染色体に組込んだ遺伝子組換えカイコ系統（文献名Tsubota et al., 2014, G3. 4: 1347-1357）であり、そして30K-GAL4系統は脂肪体特異的なプロモーターを含む第１発現ユニットp30K-GAL4を染色体に組込んだ遺伝子組換えカイコ系統（文献名H. Sezutsu, personal communication）である。さらに対照用として、UAS-EGFP系統のヘテロオス個体をMSG-GAL4系統、PSG-GAL4系統、及び30K-GAL4系統のヘテロメス個体とそれぞれ交配させてF1個体を得た。
　4-4A系統及びUAS-GFP系統はGFPが、またMSG-GAL4系統、PSG-GAL4系統、及び30K-GAL4系統はDsRedが、個体の選択マーカー遺伝子である。得られた胚の選択マーカーを調べてEGFP及びRedの両方のマーカーを発現する個体を選択した。選択個体を飼育し、5齢4日目の各幼虫から絹糸腺及び脂肪体を摘出して、中部絹糸腺、後部絹糸腺、及び脂肪体の形態を観察した。
（結果）
　図２～４に結果を示す。図２及び図３は絹糸腺を、図４は脂肪体を示している。
　図２Aは、第１発現ユニットを含むMSG-GAL4系統と第２発現ユニットを含む4-4A系統を交配させて得られたF1個体のうち、第１発現ユニットと第２発現ユニットを包含する個体（MSG-GAL4/UAS-T7-mBax個体）の絹糸腺を示している。この図が示すように中部絹糸腺でmBax遺伝子を発現させた場合、中部絹糸腺（矢印）の退縮が観察された。一方、図２B及びCは、MSG-GAL4系統と対照用のUAS-EGFP系統を交配させて得られたF1個体のうち第１発現ユニットと対照用第２発現ユニットを有する個体（MSG-GAL4/UAS-EGFP個体）の絹糸腺を示している。図２Cの蛍光図で示すように、このF1個体では、中部絹糸腺（矢印）でEGFP遺伝子が発現しているが、中部絹糸腺の退縮は認められなかった。また、図２Dは、第２サブユニットのみを有し、mBaxタンパク質の発現が誘導されない4-4A系統の絹糸腺を示している。この個体も中部絹糸腺の退縮は認められなかった。
　図３Aは、PSG-GAL4系統と4-4A系統を交配させて得られたF1個体のうち第１発現ユニットと第２発現ユニットを有する個体（PSG-GAL4/UAS-T7-mBax個体）の絹糸腺を示している。この図が示すように後部絹糸腺でmBax遺伝子を発現させた場合、後部絹糸腺の消失が確認された。一方、図３B及びCは、PSG-GAL4系統と対照用のUAS-EGFP系統を交配させて得られたF1個体のうち第１発現ユニットと対照用第２発現ユニットを有する個体（PSG-GAL4/UAS-EGFP個体）の絹糸腺を示している。図３Cの蛍光図で示すように、このF1個体では、後部絹糸腺でEGFP遺伝子が発現しているが、後部絹糸腺（矢印）の形態に異常は認められなかった。
　図４Aは、30 K-GAL4系統と4-4A系統を交配させて得られたF1個体のうち第１発現ユニットと第２発現ユニットを有する個体（30 K-GAL4/UAS-T7-mBax個体）の脂肪体を示している。この図が示すように脂肪体でmBax遺伝子を発現させた場合、脂肪体の著しい萎縮が確認された。また、このF1個体では、5齢で幼虫の生育が停止し、吐糸する前に全ての個体が死亡した。一方、図４Bで示すように、4-4A系統では、脂肪体の形態に異常は認められず、5齢以降の生育も問題はなかった。
　以上の結果から、本発明の細胞死誘導ベクターを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統を用いることで部位特異的プロモーターの活性により、任意の細胞や組織で細胞死を誘導できることが立証された。
＜実施例５：細胞誘導ベクターによる部位特異的細胞死の検証＞
（目的）
　本発明の細胞誘導ベクターによる部位特異的細胞死誘導カイコでの部位特異的細胞死がアポトーシスによる細胞死であることを検証する。
（方法）
　アポトーシスによる細胞死は、ゲノムが断片化する特徴がある。そこで、細胞死を誘導した組織のゲノムが断片化されていることを電気泳動法により確認した。30K-GAL4/UAS-T7-mBaxカイコ、及び対照区の30K-GAL4系統のカイコの5齢2日目幼虫及び4日目幼虫から脂肪体を摘出し、その脂肪体からフェノール法によりゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを1.8%のアガロースゲルで電気泳動を行い、30 K-GAL4/UAS-T7-mBaxと対照区の30K-GAL4間でゲノムDNAのサイズについて確認した。
（結果）
　図５に結果を示す。この図は脂肪体から抽出したカイコゲノムDNAのアガロース電気泳動の結果を示す図である。図５Aは5齢2日目幼虫由来の、また図５Bは5齢4日目幼虫由来の、カイコゲノムDNAの電気泳動を示す。
　2日目、4日目ともに、対照区の30K-GAL4由来のゲノムDNAでは、バンドの移動度が小さい高分子DNAのみが観察されたのに対して、細胞死を誘導した30K-GAL4/UAS-T7-mBax個体では、バンドが全体的にスメアーとなり、中低分子のゲノムDNAがラダー状に検出された。以上の結果から、本発明の細胞誘導ベクターによって誘導された部位特異的細胞死による細胞死はアポトーシスであることが示唆された。
＜実施例６：部位特異的細胞死誘導カイコにおける部位特異的細胞死誘導の検証（２）＞
（目的）
　本発明の部位特異的細胞死誘導カイコによる細胞死誘導が成虫段階でも可能か否かを検証する。
（方法）
　細胞死を誘導する細胞として、触角に存在するフェロモン受容細胞を選択した。フェロモン受容細胞では、成虫の体形成がほぼ完了した羽化3日前からBmOR1遺伝子の発現が始まる。BmOR1タンパク質は、カイコフェロモン物質ボンビコール(BOL)の受容体である。そこで、フェロモン受容細胞で細胞死を誘導させて、カイコ成虫のオス個体におけるフェロモンに対する応答行動（羽ばたき行動）に異常を生じるか否かを検証した。
　第１発現ユニットpBac[BmOR1-GAL4: 3xP3-DsRed]（「pBmOR1-GAL4」と略記する）を染色体に組込んだBmOR1-GAL4系統（Sakurai et al., 2004,PLos Genetics 7: e1002115）を交配に用いた。pBmOR1-GAL4は、BmOR1プロモーター（配列番号３４）と、その下流に発現可能な状態でGAL4遺伝子を連結している。BmOR1-GAL4系統のヘテロメス個体を、実施例４と同様に4-4A系統のヘテロオス個体と交配させてF1個体を得た。F1個体のうち第１発現ユニットと第２発現ユニットを有する個体（BmOR1-GAL4/UAS-T7-mBax個体）からオス成虫個体を選択し、フェロモンに対する応答行動として羽ばたき行動を観察した。正常なカイコのオスは、メスが発するフェロモンを受容すると、激しく羽ばたきながらメスの位置を探し出す。行動実験には羽化後、3～6日目のオスカイコ個体を用いた。
　羽ばたき行動実験の装置を図６Aに示した。密閉された直径150mmの円筒形の透明なチャンバー内に、オスカイコ成虫をセットした。該チャンバーには、空気の流入口（cleaned air）と排出口（exhaust ventilation）があり、チャンバー内部を換気することができる。また、チャンバー上部にはボンビコールを添付したフィルターをセットできる孔を有しており、この孔の開閉を調節して、ボンビコールの暴露（stimulus）を行った。羽ばたき行動実験の方法は、Sakurai et al., 2011, PLoS Genet 7: e1002115に従って行った。実験には、n-hexaneに溶解したボンビコールを0.01ng、0.1ng、1ng、10ng、及び100ngで添付したフィルターを準備した。チャンバー内部にオスカイコ成虫をセットしてチャンバー上部の孔を10秒間開き、ボンビコールを暴露した（図６B；斜線部）。その後、内部気体を30秒間排出し（図６B；黒塗部）、20秒間のインターバルを設けた（図６B；白抜部）。このように、１サイクルを60秒間とし、それぞれ0ng、0.01ng、0.1ng、1ng、10ng、100ng、及び1000 ngのボンビコールを連続的に暴露して、チャンバー内部のオス成虫の行動を記録した。実験で使用したオス個体は、フェロモン受容細胞でBax遺伝子を発現するBmOR1-GAL4/UAS-T7-mBax系統の23頭、対照区として第１サブユニットのみを含むpBmOR1-GAL4系統の19頭、及び第１、第２サブユニットのいずれも含まないバックグラウンド系統の体9個体の行動について調べた。羽ばたき行動は、ボンビコール暴露中から連続して10秒間羽ばたき続けた個体を反応個体としてカウントし、各濃度で反応した個体の割合（%）を縦軸にプロットして、図７に示すグラフを作成した。
　また、BmOR1-GAL4/UAS-T7-mBax個体におけるBmOR1遺伝子の発現を半定量的PCRにより比較した。BmOR1-GAL4/UAS-mBaxのオス成虫から触角を切り取り、実施例１に記載の方法に準じて総RNAを抽出した後、cDNAライブラリを合成した。対照用にはBmOR1-GAL4カイコオスを用いた。続いて、合成した各cDNAライブラリを鋳型に配列番号３５と配列番号３６のBmOR1増幅用プライマーペアと配列番号３７と配列番号３８のRpS3(ribosomal protein S3)増幅用プライマーペアを用いてPCRを行った。PCRの条件は、サイクル数を30回及び35回とした他は、実施例１に記載の条件に準じた。RpS3遺伝子は、恒常発現型の遺伝子で、PCRによる増幅の内部標準として用いた。増幅産物10μgを1.0％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
（結果）
　図７にオスカイコの羽ばたき行動の結果を、図８にオス触角におけるBmOR1の発現量の結果を示す。グラフの縦軸は反応した個体の割合（%）、横軸はボンビコール濃度を示す。図中、sumi4-4A/1bはBmOR1-GAL4/UAS-T7-mBax系統を、1bはpBmOR1-GAL4系統を、そしてw1,pndはバックグラウンド系統を示している。対照区の系統（1b及びw1,pnd）のどちらも0.1ngの濃度で反応する個体が見られ、10ng以上の濃度では、ほとんどすべての個体が反応した。一方、BmOR1-GAL4/UAS-T7-mBax系統のsumi4-4A/1bでは反応を示した個体の出現が1 ngであった。さらに、1000ngの暴露を行っても、一部の個体は全く反応しなかった。以上の結果からフェロモン受容細胞でmBaxを発現させたオスカイコ個体では、ボンビコールに対する反応性が著しく低下することが明らかとなった。
　また、図８から、フェロモン受容細胞でmBax遺伝子を発現するBmOR1-GAL4/UAS-mBax個体では、BmOR1遺伝子の発現量が著しく低下していた。これは、BmOR1遺伝子を発現するフェロモン受容細胞で細胞死が誘導され、フェロモン受容細胞数が減少していることを示唆している。
　これらの実験結果から、本発明の部位特異的細胞死誘導カイコは、成虫の体形成がほぼ完了した段階であっても細胞レベルで細胞死を誘導できることが明らかとなった。
＜実施例７：全身性プロモーターを用いた細胞死誘導の検証＞
（目的）
　部位特異的プロモーターに代えて全身性プロモーターを有する第１発現ユニットを用いた場合、個体全体でも細胞死を誘導できるか否かを検証する。
（方法）
　全身性プロモーターであるアクチン3プロモーター（配列番号３９）とその下流に発現可能な状態でGAL4遺伝子を連結したpBac[Actin3-GAL4: 3xP3-DsRed]（Uchino et al., 2006, J. Insect Biotechnol. Sericology 75: 89-97）（「pActin3-GAL4」と略称する）を第１発現ユニットとした。この第１発現ユニットのみを染色体に組込んだ遺伝子組換えカイコ系統であるActin3-GAL4系統（Uchino et al., 2008, Insect Biochem. Mol. Biol. 38: 116-1173）のヘテロメス個体を、実施例４と同様に第２発現ユニットのみを含む4-4A系統のヘテロオス個体と交配させて、得られたF1胚の選択マーカーを確認し、発現ユニットの有無や保有する発現ユニットの種類によってF1胚を分類した。なお、pUAS-mBaxは眼におけるEGFP遺伝子が、pActin3-GAL4はDsRed遺伝子が、個体の選択マーカー遺伝子である。
（結果）
　図９に結果を示す。「GFP」はpUAS-mBaxのみを、「Red」はpActin3-GAL4のみを有する胚を示す。「double」は第１発現ユニットpActin3-GAL4と第２発現ユニットpUAS-mBaxの両方を有する胚である。「lethal」は初期胚で致死となった胚を、また「Negative」はpActin3-GAL4及びpUAS-mBaxのいずれも有さない胚を示す。
　図９からも明らかなように、第１及び第２発現ユニットの両方を有する胚、すなわち全身でmBaxが発現した胚（double）は見いだせなかった。一方、分離比から胚発生初期で致死となった胚（lethal）が、第１及び第２発現ユニットの両方を有する胚と推察される。したがって、Actin3プロモーターのような全身性プロモーターを用いてBax遺伝子をカイコで発現させた場合、細胞死は全身レベルで誘導され、胚発生初期で致死となることが示唆された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (8)

  1. 　部位特異的プロモーター、及び哺乳動物由来のプロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNAをチョウ目昆虫細胞内で発現可能な状態で含み、
    　前記DNAは、前記プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている細胞死誘導ベクター。
  2. 　前記プロアポトーシスタンパク質がBaxタンパク質又はBakタンパク質である、請求項１に記載の細胞死誘導ベクター。
  3. 　部位特異的プロモーター及び該プロモーターの下流にプロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNAを機能的に連結した、請求項１又は２に記載の細胞死誘導ベクター。
  4. 　部位特異的プロモーター及び該プロモーターの下流に機能的に連結した転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１発現ユニット、及び
    　該転写調節因子の標的プロモーター及び該標的プロモーターの下流に機能的に連結したプロアポトーシスタンパク質又はその活性断片をコードするDNAを含む第２発現ユニットから構成される、請求項１又は２に記載の細胞死誘導ベクター。
  5. 　前記転写調節因子をコードする遺伝子がGAL4遺伝子であり、該転写調節因子の標的プロモーターがUASプロモーターである、請求項４に記載の細胞死誘導ベクター。
  6. 　請求項３に記載の細胞死誘導ベクターを含む部位特異的細胞死誘導カイコ系統。
  7. 　請求項４又は５に記載の第２発現ユニットを含む部位特異的細胞死誘導カイコ系統。
  8. 　請求項４又は５に記載の第１発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコ系統と請求項７に記載の部位特異的細胞死誘導カイコ系統とを交配させる工程、及び
    　前記第１及び第２発現ユニットを有する部位特異的細胞死誘導カイコを選択する工程
    を含む部位特異的細胞死誘導カイコの作出方法。
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