KR20220155584A - 곤충에서의 재조합 단백질 생산 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 곤충으로부터 유래된 약제학적 액체 또는 고체 조성물의 상업적 규모의 생산 및 가공 분야에 관한 것이며, 여기서, 조성물은 정제된 재조합 단백질, 백신, 항체, 펩타이드 또는 화학물질을 포함한다. 생물반응기 내에서 곤충 및 정제된 곤충-유래 재조합 단백질, 백신, 항체, 펩타이드, 살충제, 살진균제 또는 화학물질을 생산하기 위한 시스템 및 방법이 또한 기술된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2020년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/989,725호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 생명공학 분야, 특히 단백질 발현 분야에 관한 것이다. 본 발명은 곤충 유충(insect larvae) 또는 번데기(pupae)를 사용하여 배치 및/또는 연속 모드로 재조합 단백질을 효율적으로 생산하는 것에 관한 것이다. 특히, 이러한 것들은 통상적으로 검정 병정 파리(black soldier fly)로 공지된 헤르메티아 일루센스(Hermetia illucens), 통상적으로 열대 집 귀뚜라미(tropical house cricket)로 공지된 그릴로데스 시길라투스(Gryllodes sigillatus), 통상적으로 자메이카 전투용 귀뚜라미(Jamaican field cricket)로 공지된 그릴루스 아시밀리스(Gryllus assimilis), 통상적으로 집 귀뚜라미(house cricket)로 공지된 아체타 도메스티쿠스(Acheta domesticus), 통상적으로 황색 밀웜(yellow mealworm)으로 공지된 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 통상적으로 검정 밀웜(dark mealworm)으로 공지된 테네브리오 옵스쿠루스(Tenebrio obscurus), 통상적으로 작은 밀웜(lesser mealworms)으로 공지된 알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus)의 군에 속한다. 본 발명은 일반적으로 유전자 변형에 의해 숙주 유기체로부터 관심 단백질(protein of interest: POI)을 발현하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 곤충 자체에 관한 것이다.
재조합 DNA 기술의 출현은 다양한 이종 시스템에서 재조합 단백질의 생산을 가능하게 하는 주요 돌파구이다. 재조합 단백질은 식품, 음료, 화장품 및 제약 산업에서 광범위하게 적용된다(Puetz, J., et al. Processes 2019, 7, 476). 다양한 플랫폼은 박테리아, 효모, 진균, 식물, 포유류 및 곤충 세포를 포함하는 산업 및 치료 용도를 위한 재조합 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 상이한 숙주 시스템은 몇 가지 한계를 갖는다. 박테리아와 같은 원핵생물 배양 시스템은 작고 짧은 펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있지만, 글리코실화와 같은 폴딩 및 번역후 변형을 필요로 하는 복잡한 단백질을 생산할 수 없다(Puetz, J., et al. Processes 2019, 7, 476). 효모의 사용은 이러한 한계를 부분적으로 극복하고 생산된 단백질의 비교적 단순한 다운스트림 정제에 유리할 수 있다. 그러나, 효모의 사용은 포유류 또는 프로테아제-민감 단백질의 생산에 적합하지 않다(Palomares, L., et al. Methods in Molecular Biology 2004, 267). 포유류 세포 및 곤충 세포와 같은 동물 세포의 사용은 여러 한계를 극복할 수 있다. 특히, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell; CHO)는 포유류 치료 단백질의 생산을 위한 골드 스탠다드 플랫폼(gold standard platform)이다. 그럼에도 불구하고, 동물 세포를 배양하기 위한 배지의 고비용은 대규모 생산에서 문제가 되는 제약이다(Puetz, J., et al. Processes 2019, 7, 476). 생물반응기-기반 시스템(bioreactor-based system)의 생산 비용 및 선형 비용(linear cost)은 다른 산업에서 단백질-기반 제품의 잠재적 사용을 방해해 왔다. 이와 관련하여, 대규모의 재조합 단백질의 고속 및 비용-효율적 생산을 위한 혁신적인 플랫폼의 개발이 가장 중요하다. 따라서, 재조합 단백질을 생산하는 대안적인 방법이 필요하다.
본 발명은 관심 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 카피를 생성하고 이후에 숙주에서 이의 발현을 매개하기 위해 상이한 방식을 채택함으로써 관심 유전자를 곤충 신체에 전달하는 것을 포함하는, 헤르메티아 일루센스(Hermetia illucens), 그릴로데스 시길라투스(Gryllodes sigillatus), 그릴루스 아시밀리스(Gryllus assimilis), 아체타 도메스티쿠스(Acheta domesticus), 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 테네브리오 옵스쿠루스(Tenebrio obscurus), 알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus)에서 재조합 단백질의 상업적 생산 방법을 개시한다. 본 발명의 한 가지 목적은 곤충을 사용하여 상업적 가능성이 있는 재조합 단백질을 생성하기 위한 플랫폼을 제공하는 것이며, 이는 비용 효율적이고, 빠른 생산 주기 및 높은 생산 수율을 갖는 것과 같은 다수의 이점을 가질 것으로 예상된다. 따라서, 통상적으로 사용되는 플랫폼에 대한 유망한 대안을 나타낸다.
일 양상에서, 본 명세서에는 적어도 하나의 외인성 유전자를 포함하는 형질전환된 곤충이 개시되며, 여기서, 곤충은 헤르메티아, 그릴로데스, 그릴루스, 아체타, 테네브리오 및 알피토비우스로 이루어진 군으로부터 선택된 속(genus)의 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 외인성 유전자는 곤충의 체세포 내에 포함되거나 외인성 유전자는 곤충의 생식계열 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 외인성 유전자는 안정적으로 유전된다. 일부 실시형태에서, 곤충은 헤르메티아 일루센스, 그릴로데스 시길라투스, 그릴루스 아시밀리스, 아체타 도메스티쿠스, 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 또는 알피토비우스 디아페리누스로 이루어진 군으로부터 선택된 종 속(species genus)이며, 바람직하게는, 곤충은 헤르메티아 일루센스이다. 일부 실시형태에서, 곤충은 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 및 아체타 도메스티쿠스로 이루어진 군으로부터 선택된 밀웜(mealworm)이다. 일부 실시형태에서, 곤충은 배아, 유충, 번데기 또는 성체이다. 일부 실시형태에서, 곤충은 적어도 하나의 외인성 유전자에 의해 인코딩된 재조합 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 곤충은 적어도 2㎎, 5㎎, 10㎎, 15mg, 20㎎ 또는 25㎎의 재조합 단백질 또는 적어도 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎의 재조합 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 곤충에 의해 발현되는 총 단백질의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%이다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 항체, 항원, 항원-결합 분자, 효소, 호르몬, 백신의 성분, 및 바이러스-유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 외인성 유전자는 트랜스포존-매개 통합(transposon-mediated integration)에 의해 곤충 게놈 내로 통합된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 외인성 유전자는 드로소필라 멜라노가스터(drosophila melanogaster) hsp70 프로모터의 제어 하에 있다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충으로부터 유래된 사육 곤충이 개시되며, 여기서 사육 곤충은 적어도 하나의 외인성 유전자를 포함한다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 사육 곤충은 적어도 하나의 외인성 유전자에 의해 인코딩된 재조합 단백질을 발현한다. 사육 곤충은 형질전환된 곤충으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5세대까지 제거될 수 있거나, 형질전환된 곤충으로부터 5세대 이상 제거될 수 있다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충 또는 본 명세서에 기술된 사육 곤충으로부터 유래된 번데기가 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충 또는 본 명세서에 기술된 사육 곤충으로부터 유래된 유충이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충 또는 본 명세서에 기술된 사육 곤충으로부터 유래된 알(egg)이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충 또는 본 명세서에 기술된 사육 곤충으로부터 유래된 성충 곤충이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충 또는 본 명세서에 기술된 사육 곤충으로부터 생산된 바이오매스가 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 형질전환된 곤충 또는 본 명세서에 기술된 사육 곤충으로부터 단리된 재조합 단백질이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단백질은 항체, 항원, 항원-결합 분자, 효소, 호르몬, 백신의 성분, 및 바이러스-유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 a. 헤르메티아 일루센스, 그릴로데스 시길라투스, 그릴루스 아시밀리스, 아체타 도메스티쿠스, 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 또는 알피토비우스 디아페리누스로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충의 제1 스테이지를 형질전환시키는 단계로서, 상기 형질전환은 발현 카세트를 곤충의 게놈에 통합시키며, 발현 카세트는 이종 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하며, 이종 유전자는 열 충격 프로모터의 제어 하에 있는 단계; b. 제2 스테이지에서 형질전환된 곤충에 열-충격을 가하는 단계; 및 c. 형질전환된 곤충으로부터 단백질을 포함하는 바이오매스를 수확하는 단계를 포함하는, 단백질을 생산하는 방법이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 스테이지는 알 또는 배아이다. 일부 실시형태에서, 제2 스테이지는 유충, 번데기 또는 성체이다.
일 양상에서, 본 명세서에는 a. 헤르메티아 일루센스, 그릴로데스 시길라투스, 그릴루스 아시밀리스, 아체타 도메스티쿠스, 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 또는 알피토비우스 디아페리누스로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충을 형질전환시키는 단계로서, 형질전환은 발현 카세트를 곤충의 생식계열 내에 통합시키며, 발현 카세트는 이종 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는, 상기 형질전환시키는 단계, b. 형질전환된 곤충을 번식시켜 후속 세대 곤충을 생산하는 단계; 및 c. 후속 세대 곤충으로부터 단백질을 포함하는 바이오매스를 수확하는 단계를 포함하는, 단백질을 생산하는 방법이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 방법은 바이오매스를 수확하는 단계 전에, 후속 세대 곤충을 대량 사육하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질전환시키는 단계는 곤충 알 또는 배아 스테이지에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 바이오매스는 유충, 번데기 또는 성체 스테이지로부터 수확된다. 일부 실시형태에서, 이종 유전자는 열 충격 프로모터의 제어 하에 있으며, 방법은 바이오매스를 수확하기 전에 후속 세대 곤충에 열 충격을 가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 열 충격 프로모터는 드로소필라 멜라노가스터 hsp70 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 곤충은 적어도 2㎎, 5㎎, 10㎎, 15㎎, 20㎎ 또는 25㎎의 이종 단백질을 발현하거나, 곤충은 적어도 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎의 이종 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 곤충에 의해 발현되는 총 단백질의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%이다. 일부 실시형태에서, 방법은 바이오매스로부터 이종 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 바이오매스로부터 이종 단백질을 농축시키거나 부분적으로 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질전환시키는 단계는 발현 카세트의 트랜스포존-매개 통합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질전환시키는 단계는 곤충에서 활성인 트랜스포사제 효소를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 발현 카세트는 각각의 단부에 전이 가능한 요소에 의해 측면 배치된다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제 효소는 헬퍼 플라스미드 상의 코딩 영역 또는 핵산에 의해 인코딩되는 코딩 영역으로서 또는 트랜스포사제 단백질로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 곤충은 헤르메티아 일루센스이다. 일부 실시형태에서, 곤충은 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 및 아체타 도메스티쿠스로 이루어진 군으로부터 선택된 밀웜이다. 일부 실시형태에서, 형질전환시키는 단계는 발현 카세트의 물리적 또는 화학적 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질전환시키는 단계는 주사, DNA 입자 충돌, 전기천공, 주사 후 전기천공, 유체역학, 초음파, 또는 마그네토펙션(magnetofection)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 항체, 항원, 항원-결합 분자, 효소, 호르몬, 백신의 성분 및 바이러스-유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 바이오-제조된(bio-manufactured) 이종 단백질이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스-유사 입자(virus-like particle: VLP)를 발현한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 바이오-제조된 VLP가 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 바이오-제조된 백신 성분이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 방법은 형질전환된 유충의 전신으로부터 이종 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 형질전환된 유충의 혈액림프, 지방체, 또는 분비선으로부터 이종 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 단리된 이종 단백질이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 곤충에서 활성인 트랜스포사제 효소, 및 발현 카세트를 제공함으로써 헤르메티아 일루센스의 곤충 알 또는 배아를 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환된 곤충을 생산하는 방법으로서, 발현 카세트는 이종 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하며, 발현 카세트는 각 단부에 전이 가능한 요소에 의해 측면 위치되며, 이에 의해 형질전환은 발현 카세트의 곤충의 게놈 내로의 통합을 야기시키는 방법이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 트랜스포사제 효소는 헬퍼 플라스미드 상의 코딩 영역 또는 핵산에 의해 인코딩되는 코딩 영역으로서 또는 트랜스포사제 단백질로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 곤충의 체세포 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 곤충의 생식계열 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 곤충은 적어도 2㎎, 5㎎, 10㎎, 15㎎, 20㎎ 또는 25㎎의 이종 단백질을 발현하거나, 곤충은 적어도 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎의 이종 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 곤충에 의해 발현되는 총 단백질의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%이다. 일부 실시형태에서, 방법은 곤충으로부터 이종 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은: a. 형질전환된 곤충을 번식시켜 후속 세대 곤충을 생산하는 단계; 및 b. 후속 세대 곤충으로부터 이종 단백질을 포함하는 바이오매스를 수확하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 형질전환된 곤충이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 형질전환된 번데기가 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 형질전환된 배아가 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 형질전환된 유충이 개시된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 형질전환된 곤충의 집단이 개시되고, 여기서, 방법은 바이오매스를 수확하는 단계 전에, 형질전환된 곤충을 대량 사육하는 단계를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 추가로 제공된다.
도 1은 드로소필라 멜라노가스터 hsp70 프로모터의 제어 하에 피기백 트랜스포사제를 함유하는 헬퍼 플라스미드를 도시한다.
도 2는 기능적 프로모터의 제어 하에 관심 단백질을 코딩하는 cDNA를 함유하는 공여자 플라스미드를 도시한다.
도 3은 본 발명의 최근 발현 연구로부터 대조군(C) 및 형질전환(T) H. 일루센스(BSF) 5령 유충으로부터 획득된 이미지를 도시한다. 형질전환(T) 유충에서 mNeonGreen 형광은 클러스터로 존재하며, 이는 전체 유충 신체에 걸쳐 볼 수 있다(중간 섹션의 일부가 도시됨). 대조군(C) 유충에서는 형광이 관찰되지 않았다.
도 2는 기능적 프로모터의 제어 하에 관심 단백질을 코딩하는 cDNA를 함유하는 공여자 플라스미드를 도시한다.
도 3은 본 발명의 최근 발현 연구로부터 대조군(C) 및 형질전환(T) H. 일루센스(BSF) 5령 유충으로부터 획득된 이미지를 도시한다. 형질전환(T) 유충에서 mNeonGreen 형광은 클러스터로 존재하며, 이는 전체 유충 신체에 걸쳐 볼 수 있다(중간 섹션의 일부가 도시됨). 대조군(C) 유충에서는 형광이 관찰되지 않았다.
본 발명의 대표적인 실시형태를 기술함에 있어서, 명세서는 본 발명의 방법 및/또는 공정을 특정 순서의 단계로서 제시할 수 있다. 그러나, 방법 또는 공정이 본 명세서에 기술된 특정 순서의 단계에 의존하지 않는 정도까지, 방법 또는 공정은 기재된 특정 단계의 순서로 제한되지 않아야 한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 다른 순서의 단계가 가능할 수 있다. 따라서, 명세서에 기재된 단계의 특정 순서는 청구범위에 대한 제한으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 본 발명의 방법 및/또는 공정에 관한 청구항은 기재된 순서대로 이들의 단계의 수행으로 제한되지 않아야 하며, 당업자는 순서가 변할 수 있고 본 발명의 사상 및 범위 내에서 여전히 유지될 수 있음을 용이하게 이해할 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 재료, 시약, 및 물질 등으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이고, 청구범위/항목에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 발명에서, 헤르메티아 일루센스, 그릴로데스 시길라투스, 그릴루스 아시밀리스, 아체타 도메스티쿠스, 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스, 알피토비우스 디아페리누스가 상업적 가능성이 있는 재조합 단백질의 생산을 위한 플랫폼으로서 사용된다. 관심 단백질을 생산하는 방법은 관심 단백질을 발현할 수 있는 재조합 DNA를 함유하는 발현 시스템으로 곤충을 형질전환시키는 것을 포함한다. 본 발명에서, 숙주 곤충은 알 스테이지에서 번데기 스테이지까지의 범위에 이르는 상이한 발달 스테이지에서 관심 유전자에 의해 형질전환된다.
재조합 단백질을 위한 생산 플랫폼으로서 살아있는 곤충의 사용은 유망한 방식이다. 이러한 방식에서, 곤충은 원하는 단백질을 얻기 위해 미니-생물공장으로 사용된다. 곤충은 이들의 가속화된 대사로 인해 매우 효율적인 단백질 생산자이다. 곤충 세포주 및 다른 플랫폼과 비교할 때, 전체 곤충-매개 단백질 발현은 생산 비용의 상당한 감소와 결합된 더 많은 양의 재조합 단백질을 생산하는 곤충의 능력을 포함하는 다수의 이점을 제공한다. 살아있는 생물공장으로서의 곤충은 생산 다양성, 확장성, 자동화 가능성, 효율성 및 개발 속도 때문에 곤충 세포, 통상적인 발효 기술 및 또한 식물-유래 단백질에 대한 유망한 대안을 구성한다. 예를 들어, 살아있는 생물공장으로서의 곤충은 단백질의 발현을 위한 생물반응기의 필요성을 회피한다. 생물반응기는 비효율적이고, 비싸고, 기술적으로 복잡하기 때문에 신규 및 기존 재조합 단백질을 생산하기 위한 기술적 및 경제적 장벽이다(구축에 수년이 걸리고, 검증하기 어렵고, 이들의 조작에 대해 고도의 자격을 갖춘 인력이 필요하고, 오염되기 쉽고, 신뢰할 수 없음). 또한, 이러한 것들은 제한된 확장성의 문제에 직면한다. 밀리그램/리터의 재조합 단백질을 생산하는 곤충 세포 배양 시스템과 비교하여, 곤충 유충은 최대 그램 또는 수백 그램/재조합 단백질의 리터/리터를 생산할 수 있다.
검정 병정 파리(Black Soldier Fly)는 단백질 생산 공정을 훨씬 쉽게 만드는 병원성 박테리아를 중화시키면서 임의의 사료 공급원을 섭식하는 비선택적인 곤충이다. 집중적인 연구 후, 본 발명의 발명자들은 상기 문제에 대한 해결책, 즉, 디프테라 목, 더욱 바람직하게는, 다른 곤충 종보다 더욱 효율적인 헤르메티아 일루시온(Hermetia illusion) 종에 속하는 알, 유충 또는 번데기에서 단백질 발현 시스템을 발견하였고, 또한, 전례 없는 규모의 자동화(규모 확대)를 가능하게 하여, 특히 산업 규모에서 재조합 단백질 발현과 관련된 비용을 감소시키고 효율을 증가시킨다. 캐비지 루퍼(Cabbage looper) 및 누에는 사이클당 최대 1000개의 알을 생산할 수 있는 검정 병정 파리 또는 밀웜와 비교하여 사이클당 생산되는 알이 비교적 적다. 검정 병정 파리는(캐비지 루퍼 및 누에와 달리) 고치 형성 없이 근접하여 생산되며, 이는 이러한 것들이 작은 지역에서 생산될 수 있음을 의미한다. 이는 대량 생산을 위해 이러한 것들을 수직으로 기르고 적층하는 능력을 지지한다.
누에와 같은 일부 곤충 종의 특정 발달 스테이지의 유전자 변형과 관련된 기술적 문제는 검정 병정 파리의 알에서 발생하지 않는다. 드로소필라 및 마우스와 같은 다른 유기체에서 개발된 주입 방법은 알 융모막이 단단하고 강하고 얇은 유리 모세관의 첨단이 알을 관통할 수 없기 때문에 누에에서는 잘 작동하지 않는다. 그러나, 검정 병정 파리의 알은 표준 형질전환 기술에 의해 쉽게 침투될 수 있어, 생식계열 형질전환의 확립 과정을 누에보다 훨씬 더 용이하게 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 확장 가능한 재조합 단백질 생산을 위한 대량 사육 곤충, 바람직하게는 헤르메티아 일루센스 종에 속하는 곤충의 가능성을 이용하는 것에 관한 것이다. 이러한 곤충은 알 부화로부터 18일 이내에 길이가 대략 24배 및 체중이 9,000배 성장할 수 있다.
본 명세서의 명세서에서 사용되는 "하나(one, a/an)"는 달리 명시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미할 수 있다. 본 명세서의 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 단어와 함께, 단수 명사는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "다른"은 적어도 제2 또는 그 초과를 의미할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "유충"은 많은 곤충의 알로부터 부화하는 미성숙하고, 날개가 없고, 종종 벌레 같은 섭식 형태를 지칭한다. 이는 여러 탈피를 거치면서 주로 크기가 변하고, 최종적으로 성충이 나오는 번데기(pupa, chrysalis)로 변형된다.
용어 "번데기"는 형질전환을 겪는 일부 곤충의 생애 스테이지를 지칭한다. 번데기 스테이지는 4개의 생애 스테이지, 즉, 배아, 유충, 번데기 및 성체를 거치는, 완전한 변태를 겪는 완전 변태 곤충에서만 발견된다.
본 명세서에서 사용되는 "재조합 DNA"는 자연적으로 존재하지 않는 인공 DNA 형태를 지칭하며, 이는 하나 이상의 DNA 가닥의 조합 또는 삽입을 통해 조작되어 DNA를 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 "재조합 단백질"은 재조합 DNA로부터 비롯된 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질은 인간 및 동물의 이익을 위해 사용될 수 있고, 산업적, 상업적 또는 치료적 용도를 가질 수 있다.
곤충 바이오매스로부터 생산된 관심 재조합 단백질은 항체, 효소, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 신호전달 펩타이드, 구조 단백질, 수송 단백질, 저장 단백질, 융합 단백질, 인터루킨, 인공적으로 설계된 단백질, 서브단위 백신, 모노클로날 항체, 세포 표면 수용체, 호르몬 수용체, 막 수송 단백질, 사이클린, Fab 단편, 나노바디, 아피바디 및 다른 항체 모방체, 바이러스 항원, 바이러스-유사 입자, 바이러스 수용체, 형광 단백질, 융합체, 콜린에스테라제, 펩티다제, 키나제, 포스파타제, 인간 아데노신 데아미나제, 포스포리파제, 무척추동물 면역 단백질, RAS 이펙터, 항미생물 펩타이드 또는 임의의 다른 공지된 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 단백질 서열일 수 있다.
본 발명의 재조합 단백질의 기원에는 제한이 없다. 바람직하게는, 상기 단백질은 포유동물, 박테리아, 바이러스, 진균, 식물 또는 양식 단백질로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용되는 "발현 시스템"은 유전자 자체 및/또는 이러한 유전자의 발현을 조절하는 인자(예를 들어, 프로모터)와 같은 특정 유전자의 발현에 관여하는 재조합 DNA 요소를 포함한다.
형질전환 곤충의 성공적인 생산은 생식계열 또는 체세포 형질전환에 의해 달성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "형질전환 곤충"은 일시적 또는 안정적인 방식으로 외인성 핵산을 발현하는 곤충을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "안정한 발현"은 숙주 유기체의 게놈으로의 외인성 핵산의 통합으로 인해 발생하는 유전자 발현을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "일시적 발현"은 숙주 게놈으로의 통합 없이 숙주 유기체의 세포 내부에 외인성 핵산 비히클의 존재로 인해 발생하는 유전자 발현을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "생식계열 형질전환"은 유전되고 다음 세대로 전달되는 숙주 유기체의 생식 세포를 표적으로 함으로써 일어나는 유전적 형질전환을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "체세포 형질전환"은 숙주 유기체의 체세포에서 발생하는 유전적 형질전환을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 유전적 형질전환은 트랜스포존, 재조합효소, 인테그라제, ZFN, TALEN 및 CRISPR/Cas 기술을 포함하지만 이로 제한되지 않는 비-바이러스 발현 시스템에 의해 매개된다.
트랜스포존:
트랜스포존은 종의 게놈 내에서 하나의 위치에서 다른 위치로 "점프"하거나 전위할 수 있는 유전적 요소이다. 이러한 것들은 곤충을 포함하는 동물에 널리 분포되어 있다. 트랜스포존은 요소 자체에 의해 인코딩되거나 다른 수단에 의해, 예를 들어, 트랜스포사제-인코딩 mRNA의 주사, 트랜스포사제를 인코딩하는 제2 코딩 서열의 사용, 또는 트랜스포사제 단백질 자체의 첨가에 의해 제공되는, 트랜스포사제 단백질의 활성으로 인해 이들의 숙주 종 내에서 활성적이다. 전위 메커니즘의 이해의 발전은 유전자 전달에 사용될 수 있는 트랜스포존에 기반한 유전적 도구의 개발을 초래하였다.
원하는 곤충에서 활성인 임의의 전이 가능한 요소가 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 전이 가능한 요소는 미노스(Minos), 마리너(mariner), 헤르메스(Hermes), 슬리핑 뷰티(sleeping beauty) 및 피기백(piggyBac)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
피기백은 바쿨로바이러스 숙주 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni.)로부터 유래된 트랜스포존이다. 메드플라이(Medfly)의 생식계열 형질전환을 위한 이의 사용은 문헌[Handler et al., (1998) PNAS (USA) 95:7520-5]에 기술되어 있다.
미노스는 메드플라이에서 활성인 전이 가능한 요소이다. 이는 미국 특허 제5,840,865호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 곤충을 형질전환하기 위한 미노스의 사용은 상기 미국 특허에 기술되어 있다.
마리너는 원래 드로소필라로부터 단리된 트랜스포존이지만, 이후에 여러 무척추동물 및 척추동물 종에서 발견되었다. 유기체를 형질전환시키기 위한 마리너의 사용은 국제 특허 출원 WO99/09817호에 기술되어 있다.
헤르메스는 일반적인 집파리에서 유래된다. 형질전환 곤충을 생성하는 데 이의 용도는 미국 특허 제5,614,398호에 기술되며, 이러한 문헌은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
부위-특이적 재조합효소:
부위-특이적 재조합효소는 핵산 세그먼트의 삽입 또는 절제를 촉매한다. 이러한 효소는 인식 및 재조합 둘 모두에 작용하는 비교적 짧고 독특한 핵산 서열을 인식한다. 예는 Cre(Sternberg et al, J Mol Biol, 1981, 150:467-486), Flp(Broach, et al, cell 1982, 29:227-234; 미국 특허 제5,654,182호; 제5,885,386호; 제6,140,129호; 및 제6,175,058호) 및 R(Matsuzaki, et al, J Bacteriology, 1990, 172:610-618)을 포함한다. 핵산의 조작을 위한 부위-특이적 재조합효소의 사용의 예는 미국 특허 제5,527,695호; 제5,654,182호; 제5,677,177호; 제5,801,030호; 제5,919,676호; 제6,091,001호; 제6,110,736호; 제6,143,557호; 제6,156,497; 6,171,861호; 제6,187,994호; 및 제6,262,341호에 기술되어 있다. 이러한 시스템에 의한 재조합 메커니즘에 대한 이해의 발전은 유전자 전달에 사용될 수 있는, 이들을 기반으로 하는 유전적 도구의 개발을 초래하였다.
본 발명에 따르면, 재조합효소-매개 카세트 교환(RMCE) 기술이 사용될 수 있다. RMCE 기술은 큰 DNA 서열의 스와핑(swapping)을 가능하게 한다. 기술은 특정 재조합효소 부위(예를 들어, loxP, lox511)가 측면 배치된 이식 유전자로 조작된 부모 세포주의 생성에 기반한다. 이어서, 제2 이식 유전자(또한 특정 재조합효소 부위가 측면 배치됨)를 함유하는 교환 플라스미드가 도입될 수 있다. 교환 플라스미드+이식 유전자는 재조합효소(예를 들어, Cre)를 발현하는 헬퍼 플라스미드의 존재 하에 부모 세포주로 트랜스펙션된다. 재조합효소는 부모 세포주에 통합된 제1 이식 유전자와 교환 플라스미드 이식 유전자 사이의 교환을 촉매하여, 원하는 유전자 전달을 완료한다.
아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)
ZFN은 2개의 도메인, 즉, DNA-결합 아연-핑거 도메인 및 DNA-절단 도메인을 포함하는 인공 제한 효소의 부류에 속한다. 이러한 부류의 뉴클레아제는 게놈 조작을 위해 DNA의 특정 영역을 표적화하도록 조작될 수 있다. DNA-결합 도메인은 9-bp 표적을 인식할 수 있다. DNA-절단 도메인은 표적 게놈에서 이중 가닥 파손을 유도할 수 있도록 먼저 다이머화되어야 한다(Urnov, F. et al, Nat Rev Genet 2010, 11, 636-646).
전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)
TALEN은 ZFN과 유사하게 2개의 도메인, 즉, DNA-결합 도메인 및 DNA-절단 도메인으로 구성된, 또 다른 통상적으로 사용되는 유전자-편집 도구이다. DNA 결합 도메인은 특정 조절 요소와 결합 시에 숙주 식물 세포에서 이들의 개개 유전자를 조절하기 위해 박테리아로부터 분비된 전사 활성제-유사 이펙터(TALE)로부터 유래된다(Joung, JK et al, Molecular cell Biology 2013, 14(1), 49-55). TALEN은 표적 인식 시 이중 가닥 파손을 도입하는 유전자-편집 목적을 위해 특정 게놈 영역에 결합하도록 조작될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 Cas(CRISPR Associated Proteins) 기술은 최근에, 이의 유연성, 높은 충실도 및 설계 단순성으로 인해 게놈 편집 분야에 혁명을 일으킨 강력한 도구로 등장하였다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 엔도뉴클레아제 효소 및 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 RNA-가이드된 DNA 절단 시스템이다. gRNA는 tracrRNA 및 crRNA로 공지된 함께 결합된 2개의 짧은 RNA 분자로 구성된다. tracrRNA는 Cas 엔도뉴클레아제 효소의 결합을 담당하는 스캐폴드 서열을 형성하는 반면, crRNA는 프로토스페이서로 알려진 표적 DNA의 결합을 담당하는 가변 서열(스페이서)을 함유한다. CRISPR/Cas 작용 메커니즘은 Cas 효소에 의한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로 알려진 서열의 인식, 이후, Cas 엔도뉴클레아제 활성의 활성화를 초래하는 표적 영역에 대한 스페이서 결합에 의존한다. Cas 엔도뉴클레아제 활성은 표적 게놈 영역에서 이중 가닥 파손의 형성을 초래하며, 이는 이후 세포 복구 메커니즘에 의해 복구되어 게놈 조작을 가능하게 한다(Terns M. P., et al, Molecular cell, 2018, 72(3), 404-412).
본 발명에 따르면, 형질전환된 곤충의 생성은 발현 시스템이 당업계에 공지된 물리적 및 화학적 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 가능한 수단에 의해 숙주 곤충에 도입되는 것을 필요로 한다. 형질전환의 한 형태에서, DNA는 마이크로피펫의 사용을 통해 세포에 직접적으로 마이크로주입된다. 대안적으로, 고속 탄도는 작은 DNA 관련 입자를 세포로 추진하는 데 사용될 수 있다. 다른 형태에서, 세포는 폴리에틸렌 글리콜의 존재에 의해 투과되어, DNA가 확산을 통해 세포로 들어갈 수 있게 한다. DNA는 또한, DNA를 함유하는, 다른 독립체와 원형질체를 융합함으로써 세포에 도입될 수 있다. 이러한 독립체는 미니세포, 세포, 리소좀 또는 다른 융합 가능한 지질-표면체를 포함한다. 전기천공은 또한 세포에 DNA를 도입하는 허용되는 방법이다. 이러한 기술에서, 생체막을 가역적으로 투과시켜 외인성 DNA 서열의 진입을 허용하는 높은 전기장 강도의 전기 충격이 세포에 가해진다.
유전적 형질전환에 사용되는 플라스미드 DNA 농도는 성공적인 형질전환을 야기할 임의의 양을 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 농도는 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000 ㎍/㎖이다. 덜 통상적으로 낮은 농도, 예를 들어, 0.1 내지 0.2, 0.2 내지 0.3, 0.3 내지 0.4, 0.4 내지 0.5, 0.5 내지 0.6, 0.6 내지 0.7, 0.7 내지 0.8, 0.8 내지 0.9, 0.9 내지 1 ㎍/㎖가 사용된다.
다른 실시형태에서, 유전적 형질전환은 바쿨로바이러스, 덴소바이러스, FHV 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스, 레트로바이러스, 파보바이러스, 또는 단순 포진 바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않는 바이러스 벡터에 의해 매개된다.
본 발명에 따르면, "바쿨로바이러스 발현 벡터(BEV)"는 외래 유전자의 발현을 유도하도록 유전적으로 변형된 재조합 바쿨로바이러스를 지칭한다. BEV는 배양된 곤충 세포 및 곤충 유충에서 유전자를 발현시키는 데 널리 사용된다. 외래 유전자 발현에서 사용되는 가장 일반적인 단리물들 중 2개는 오토그라파 캘리포르니카(Autographa Californica) 다발성 핵 다면체증 바이러스(AcMNPV) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에) 핵 다면체증 바이러스(BmNPV)이다. BEV는 곤충에 도입되며, 이는 감염되며, 바이러스는 곤충 내에서 복제된다.
BEV에서, 외래 유전자 코딩 서열은 통상적으로 바이러스 프로모터의 전사 제어 하에 배치된다. 이러한 이유로, 통상적으로 외래 유전자의 전사를 위해 바이러스 인자가 필요하다.
본 발명에 따르면, BEV를 포함하는 바이러스 벡터는 상이한 방식을 통해 임의의 발달 스테이지에서 곤충에 도입될 수 있다. 한 가지 방법은 경구 투여, 개별 주사, 에어로졸 스프레이, 침지를 통해 또는 임의의 물리적 또는 화학적 방법에 의해 곤충 유충을 바이러스로 감염시키는 것이다.
본 발명에 따르면, 유충 또는 번데기는 BEV 또는 임의의 바이러스 벡터로의 감염 전에 스트레스를 받을 수 있다. 용어 "스트레싱(stressing)"은 죽음을 초래하지 않으면서 스트레스(예를 들어, 열 충격) 하에 놓이는 유충 또는 번데기를 지칭한다. 스트레스를 받은 후, 유충 또는 번데기는 정상적으로 회복되어 단백질을 발현할 것이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 스트레싱은 하기 수단에 의해, 단독으로 또는 조합하여 달성될 수 있다: 낮은 온도 또는 정상 성장 온도보다 높지만 허용 온도보다 낮은 온도에서 유충 또는 번데기를 유지시키거나, 유충 또는 번데기를 굶기거나, 유충 또는 번데기를 감소된 대기의 환경에 두거나, 유충 또는 번데기에 방사선을 조사하거나, 유충 또는 번데기를 화학 작용제로 처리함. 일부 실시형태에서, 유충 또는 번데기는 약 2℃ 내지 약 15℃, 바람직하게는 약 3℃ 내지 약 15℃, 더욱 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 15℃, 약 4℃. 약 12℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 또는 약 4℃ 내지 약 10℃, 가장 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 6℃, 약 4℃ 내지 약 8℃ 또는 약 4℃ 내지 약 10℃의 저온에서 유지된다. 다른 실시형태에서, 유충 또는 번데기는 약 30℃ 내지 45℃, 바람직하게는, 약 32℃ 내지 45℃, 약 32℃ 내지 42℃, 약 32℃ 내지 40℃, 약 35℃ 내지 45℃ 또는 약 35℃ 내지 40℃의 더 높은 온도에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 유충 또는 번데기는 저선량의 UV를 조사함으로써 처리된다. 다른 실시형태에서, 유충 또는 번데기는 감소된 대기의 환경에 놓임으로써 처리된다. 보다 바람직하게는, 대기는 5% 내지 50% 감소된다. 일부 실시형태에서, 유충 또는 번데기는 적어도 2일 동안 금식시킨다. 바람직하게는, 유충 또는 번데기는 2, 3 또는 4일 동안 금식시킨다.
유전적 형질전환에 사용되는 재조합 바이러스 벡터의 용량은 성공적인 감염 및 이식 유전자 발현을 달성할 수 있는 임의의 용량을 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 감염 다중도(MOI)는 0.001 내지 0.01 MOI, 0.01 내지 0.1 MOI, 0.1 내지 1 MOI, 1 내지 3 MOI, 3 내지 5 MOI, 5 내지 10 MOI, 10 내지 15 MOI, 15 내지 20 MOI, 20 내지 30 MOI, 30 내지 40 MOI, 40 내지 50 MOI, 50 내지 60 MOI, 60 내지 70 MOI, 70 내지 80 MOI, 80 내지 90 MOI 및 90 내지 100 MOI이다.
본 명세서에 기술된 "감염 다중도"는 감염 동안 세포당 첨가되는 비리온의 수를 지칭한다.
본 명세서에 기술된 "비리온"은 핵산의 코어 및 캡시드를 갖는, 숙주 세포 외부의 완전한 감염성 형태의 바이러스를 지칭한다.
외인성 핵산의 유전자의 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 숙주 유기체에서 기능성인 임의의 프로모터일 수 있으며, 여기서 프로모터는 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터이다. 사용될 수 있는 프로모터의 예는 HSP70, CMV, CAG, PGK, TRE, U6, UAS, T7, Sp6, lac, araBad, trp 또는 Ptac를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "유도성 프로모터"는 특정 상황에서만 활성이고 오프(OFF) 상태에서 온(ON) 상태로 스위칭될 수 있는 프로모터를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "구성적 프로모터"는 이의 관련 유전자의 지속적인 발현을 가능하게 하는 조절되지 않은 프로모터를 지칭한다.
바람직한 유도성 프로모터는 유충이 배양되는 온도를 증가시킴으로써 유도되는 열 충격 단백질 HSP70 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 발현 시스템이다(Heinrich et al, PNAS 2000, 97:8229-8232).
본 발명의 특정 실시형태에서, 열-충격은 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42℃의 상승된 온도에 의해 유도되는, HSP70의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다.
Mtn 프로모터, Tet-on, Tet-off 시스템과 같은 다른 적합한 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
사용된 구성적 프로모터는 종 자체 또는 임의의 다른 곤충 종으로부터 유래되든지 간에 숙주 곤충 종에서 기능성인 임의의 프로모터를 포함한다.
구성적 프로모터는 세포질 액틴 프로모터일 수 있다. D. 멜라노가스터 세포질 액틴 프로모터는 클로닝되었고(Act5C) 모기에서 매우 활성적이다(Huynh et al, J. Mol. Biol. 1999, 288:13-20). 세포질 액틴 유전자 및 이들의 프로모터는 또한 다른 곤충으로부터 단리될 수 있다.
다른 예는 폴리유비퀴틴 프로모터, 세포질 튜불린 프로모터, d. 멜라노가스터 코피아 LTR(d.melanogaster copia LTR), Ds47, OpIE1, OpIE2를 포함한다.
덜 통상적으로, D. 멜라노가스터 adh, 튜불린, PGK, CMV, UBC 또는 CAGG와 같은 다른 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 분비된 폴리펩타이드를 제어하는 프로모터는 용혈액림프에 대한 단백질의 분비를 유도하기 위해, 선택적으로 적절한 신호 서열과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 유충 혈청 단백질 프로모터가 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 생식계열 형질전환을 달성하기 위해 여러 방식이 사용될 수 있다. 이러한 방식은 숙주 곤충의 초기 스테이지 배아로의 요망되는 발현 시스템의 마이크로주사를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 초기 스테이지 배아는 0 내지 10, 10 내지 20, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120분의 산란으로 마이크로주사된다. 다른 실시형태에서, 갓 낳은 배아는 이들의 발달을 지연시키기 위해 특정 조건 하에 저장될 수 있고, 이후 마이크로주사를 위해 사용될 수 있다
또 다른 양상에서, 본 발명은 서브단위 백신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "백신"은 생물학적 제제로서 정의될 수 있고, 특정 질병에 대한 후천성 면역을 제공하는 생물학적 제제로서 정의될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "서브-단위 백신"은 번역 후 변형되고 면역원으로서 작용하도록 정확하게 폴딩된 서브바이러스 성분을 포함하는 백신으로 정의된다.
일부 실시형태에서, 서브단위 백신은 바이러스-유사 입자이다. 방법은 바이러스-유사 입자를 형성하기 위해 숙주 유기체에서, 자가-조립을 가능하게 하는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 발현시키는 것을 포함한다. 바이러스-유사 입자들(VLPs)은 표준 천연 바이러스의 조직 및 구조를 모방하지만, 바이러스 게놈이 부족하고 더 안전하고 저렴한 백신 후보물질을 생산할 수 있는 다중 단백질 구조이다.
일부 실시형태에서, 방법은 바이러스-유사 입자를 단리시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서, VLPs는 세포 상청액으로부터 회수되고, 바이러스를 정제하기 위해 사용되는 동일한 절차를 이용하여 정제될 수 있다. VLP는 면역 반응의 범위를 증가시키도록 조작될 수 있다. VLPs는 또한, 이의 면역 반응과 감염에 의해 유도된 면역 반응을 구별하도록 조작될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "자가-조립 가능한 입자"는 자발적으로 조립되는 적어도 하나의 성분에 의해 형성된 입자를 지칭한다. 성분은 폴리펩타이드 또는 비-펩타이드 화합물일 수 있다.
본 발명은 또한 표적의 유전자 발현이 육안으로 확인될 수 있게 하는, 곤충 유충에서 유전자 발현을 위한 리포터로서 dsRED와 같은 적색 형광 단백질의 용도에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, dsRED와 같은, 유충에서 발현된 산호 적색 형광 융합 단백질은 유충의 정상적인 실험실 광에서 인간의 눈에 의해 식별될 수 있다. 발현된 산호 적색 형광 단백질의 칼라는 적색 또는 분홍색이고, 임의의 보철 도구를 사용하지 않고 직사광선 하에서 육안으로 볼 수 있을 정도로 충분히 밝아서, 표적 융합 단백질을 발현하는 곤충을 어떠한 지루한 분자 분석 없이 용이하게 식별할 수 있게 한다.
본 발명의 방법은 또한 임의의 편리한 방법에 의해 곤충 유충 또는 번데기로부터 관심 재조합 단백질의 단리에 관한 것이다. 적합한 방법은 관심 재조합 단백질을 단리하기 위해 전체 곤충 유충/번데기 및/또는 절단된 곤충 유충/번데기를 다운스트림 처리를 위한 추출 완충제와 혼합하는 것을 포함한다.
전체 곤충 유충 및/또는 절단된 유충이 사용될 수 있지만, 본 발명은 통상적으로 절단되거나 달리 전체가 아니게 만들어진 유충으로 수행된다. 초기에, 유충은 분쇄되거나 부서질 수 있다.
분쇄 이전에, 수확된 유충은 세척하여 임의의 먼지 및 미립자를 제거하고, 유충에 병원체 또는 다른 오염물이 없도록 하기 위해 오염을 제거할 수 있으며, 이는 안전하고 고품질의 최종 생성물을 달성하기 위한 핵심 단계이다.
절단되기 전에, 유충은 냉동될 수 있다. 냉동은 유충의 균질화를 최소화하는 데 도움이 될 수 있다. 유충은 잘게 썰거나, 해머 또는 망치와 같은 충격에 의해 파쇄되거나, 밀링되거나, 달리 조각으로 부서지거나, 미분될 수 있다. 다른 실시형태에 따르면, 곤충은 동결 건조된다.
일부 실시형태에서, 곤충-유래 재조합 단백질, 백신, 항체, 펩타이드, 또는 화학물질은 크로마토그래피 정제, 증류, 증발, 흡착, 또는 결정화를 통해 정제된다.
일 예로서 본 발명에서 사용되는 검정 병정 파리(BSF)는 세계의 따뜻한 및 열대 온대 지역에서 통상적으로 발견되는 스트라이오미대(Straiomyidae) 과로부터의 쌍시류(dipteran)이다(Hoc, B., et al. PLoS One 2019). BSF의 높은 잠재력은 이의 탐욕스러운 식욕, 6 내지 7주 범위의 짧은 수명 주기, 및 바람직하지 않은 조건 하에서 번성할 수 있는 이들의 회복력과 같은 여러 인자에 기인한다(Joly, G., et al. IWMI 2019). 음식물 쓰레기, 주방 쓰레기, 볏짚, 동물 분뇨 및 분변 슬러지와 같은 광범위한 기질을 소비하는 이의 능력 이외에도, BSFL은 유해 박테리아 및 해충의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다(Wang, Y., et al. Foods 2017, 6). 또한, 성충 파리는 입 부분이 없으며, 이러한 것은 질병을 전염시키는 것으로 보고된 바 없으며, 이러한 것은 잘 먹지 않아서, 특별한 관리를 필요로 하지 않기 때문에 대량 생산에 큰 이점을 나타낸다(Rindhe, S., et al. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci 2019, 8, 1329-1342). 곤충은 알 부화로부터 18일 내에 길이가 대략 24배 및 체중이 9,000배로 성장한다.
본 발명에서 사용되는 열대성 집 귀뚜라미(Gryllodes sigillatus) 및 집 귀뚜라미(Acheta domesticus)는 오르소프테라(Orthoptera) 목, 그릴리대(Gryllidae) 과에 속한다. 많은 장점은 극한의 환경 조건에서의 회복력, 대량 사육에 대한 큰 잠재력 및 높은 집단 밀도를 견딜 수 있는 능력을 포함하는 열대 집 귀뚜라미의 사육에 있다. 또한, 유충에서 단백질 함량은 60% 내지 70%로 다양하다(Van Huis, A. et al. Wageningen Academic Publishers 2017). 자메이카 지역 귀뚜라미(Gryllus assimilis)는 동일한 특징을 나타내지만 더 낮은 정도로 나타내며, 단백질 함량은 50% 내지 65%로 다양하다.
본 발명은 또한 각각 황색 밀웜, 검정 밀웜 및 작은 밀웜으로 통상적으로 알려진 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 및 아체타 도메스티쿠스와 같은 상이한 밀웜 종의 유충을 포함한다. 이러한 종은 딱정벌레 목(order coleoptera), 테네브리오니대(Tenebrionidae) 과에 속한다. 귀뚜라미와 유사하게, 유충은 극한의 조건에서 번성하고, 대량 사육에 적합하고, 50% 내지 65% 범위의 높은 단백질 함량을 갖는다.
관심 유전자는 바이러스 또는 비-바이러스 전달 방법을 통해 숙주 곤충 종에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 세계가 현재 직면하고 있는 COVID-19 범유행을 유발하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 백신을 개발하는 데 사용될 수 있다. 백신 개발 공정은 2개의 주요 단계를 거친다. 첫 번째는 개발 및 승인이다. 제2 시기는 통상적인 방법으로 매우 어렵고 비용 효율적이지 않은 것으로서, 대규모 생산이다. 본 발명은 현재 기반 시설로 단 4일 만에 수 킬로그램의 백신을 생산할 가능성을 갖는다. 또한, 그 비용은 낮아서, 백신이 전 세계적으로 배포될 수 있게 한다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 항체, 효소, 사이토카인, 호르몬, 신호전달 펩타이드, 구조적 단백질, 수송 단백질, 저장 단백질, 융합 단백질, 인터루킨, 또는 인공적으로 설계된 단백질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 관심 유전자의 발현을 유도하는 데 사용되는 프로모터는 HSP70, CMV, CAG, PGK, TRE, U6, UAS, T7, Sp6, lac, araBad, trp 또는 Ptac일 수 있다.
본 발명의 실시를 용이하게 하기 위해, 예시적인 절차가 하기 비제한적인 실시예에 기술된다.
실시예
하기는 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 기술할 것이지만, 본 발명은 하기 실시예로 제한되지 않는다.
실시예 1: 곤충 사육
헤르메티아 일루센스
BSF를 사육하는 과정은 알(egg)로부터 시작된다. 알은 고품질 음식 공급원으로 채워진 부화 용기에서 며칠 후에 부화하였다. 부화 후, 유충은 5일 동안 70% 수분 함량을 갖는 음식 공급원을 섭식할 것이다. 5일령 유충을 이후 용기로부터 수확하고, 유충이 전번데기(prepupae)로 변형될 때까지 대략 2주 동안 유기 폐기물 상에서 사육하였다. 이후에, 번데기화가 일어나도록 하기 위해 전번데기를 수확하고대략 10일 동안 어두운 케이지에 배치하였다. 번데기화 후에, 성충 파리를 교미가 일어나는 러브 케이지(love cage)로 들어가게 하였다. 이러한 케이지에는 광원, 파리를 수화시키기 위한 습윤 천, 및 에지(eggie)로 불리워지는 산란에 적합한 배지가 공급되었다. 교미 시, 암컷은 에지에 알을 침착시켰으며, 사육 사이클을 종료하였다.
테네브리오 몰리토르
밀웜을 사육하는 과정은 알에서 시작된다. 교미 후 4 내지 17일에 알을 낳았다. 암컷 한 마리는 평균 500개의 알을 발생시킬 수 있다. 배아 발달은 4 내지 6일 동안 지속되었으며, 이는 약간의 온도 상승(25℃ 내지 27℃)과 함께 가속화될 수 있다. 유충 기간을 28℃ 및 60% RH, 8L16D에서 50% 귀리 플레이크, 2.5% 양조 효모, 및 47.5% 밀가루의 식사이로 사육하였다. 평균 성숙한 유충의 무게는 0.2 g이며, 길이는 25 내지 35㎜로 측정된다. 이러한 단계 후, 유충은 번데기로 변하며, 이러한 단계는 5 내지 6일 지속되고 성인 개체가 된다.
실시예 2: 특정 신체 부위에서 피기백 트랜스포존 시스템을 통한 체세포 형질전환
브란키오스토마 란세올라툼(Branchiostoma lanceolatum)으로부터의 mNeonGreen 단백질을 인코딩하는 유전자는 검은 병정 파리(black soldier fly; BSF)에서 발현된 것이다. 체세포 형질전환을 피기백 트랜스포존 시스템을 사용하여 달성하였다. 사용된 피기백 시스템은 2개의 벡터, 즉, 헬퍼 플라스미드 및 공여자 플라스미드를 포함하였다.
헬퍼 플라스미드(도 1)를 작제하였다. 이는 드로소필라 멜라노가스터 hsp70 프로모터의 제어 하에 있는 피기백 트랜스포사제(PBase)를 함유한다.
공여자 플라스미드(도 2)를 작제하였다. 이는 드로소필라 멜라노가스터 hsp70 프로모터의 제어 하에 mNeonGreen 형광 단백질을 코딩하는 cDNA를 함유한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 cDNA는 메신저 RNA로부터의 DNA 카피(copy)이다.
체세포 발현을 위해, 건강한 5령(fifth instar) BSF 유충(유충의 수는 55임)에 헬퍼 및 공여자 플라스미드로 구성된 500 nL의 혼합 DNA 용액을 주사하였다. 각 플라스미드의 농도는 혼합 후 500 ng/㎕였다. 주입 직후에, 전기 충격을 가하였다(15 V). 사용된 부피는 0.25 헬퍼 및 0.25 공여자였다. 사용된 고정화 방법은 2개의 슬라이드들 사이에서 기계적이었다. 트랜스포사제 발현을 활성화시키기 위해 유충을 30분 동안 37℃ 열 충격으로 후속 처리하였다.
형광 현미경으로 영상화하기 전에 37℃에서 30분 동안 열-충격 처리 후 유충의 조직에서 mNeonGreen-특이적 형광을 검출함으로써 mNeonGreen의 발현을 모니터링하였다. BSF 유충을 mNeonGreen 형광과 양립 가능한 필터 세트인 GFP2 필터 세트(Leica: 여기자 필터 480/40㎚, 배리어 필터 510LP)를 사용하여 Leica 형광 현미경으로 스크리닝하였다(도 3). 55 마리의 유충 중 86%가 생존하였으며, 55 마리의 유충 중 80%는 형광을 발현하였다.
실시예 3: 피기백 트랜스포존 시스템을 통한 헤르메티아 일루센스(BSF)의 생식계열 형질전환
A. 마이크로주사에 의한
생식계열 형질전환은 피기백 트랜스포존 시스템의 사용에 의해 달성된다. BSF 야생형 균주를 모든 실험에서 사용하였다; 파리를 표준 조건에서 사육하였다. 트랜스포사제를 발현하는 헬퍼 플라스미드와 함께 공여자 플라스미드의 DNA 주입을 이전에 기술된 바와 같이 전-배반엽 배아를 사용하여 수행하였다(Loukeris TG, et al. Science. 1995;270(5244):2002-5),(Rubin GM, et al. Science. 1982;218(4570):348-53).
사용된 피기백 시스템은 2개의 벡터, 즉, 헬퍼 플라스미드 및 공여자 플라스미드를 포함하였다. 공여자 플라스미드와 관련하여, 2개의 mNeonGreen 작제물을 사용하였다: 하나의 작제물은 mNeonGreen 발현을 유도하기 위해 유도성 프로모터(드로소필라 Hsp70)를 사용하는 반면, 다른 하나는 구성적 프로모터(드로소필라 액틴5C 프로모터)를 사용하였다. Hsp70/mNeonGreen 유전자를 갖는 BSF 유충은 정상 사육 온도(22, 23, 24, 25, 26, 27, 28℃)에서 낮은 수준의 형광을 나타내고, 10 내지 20분, 20 내지 30분, 30 내지 40분, 40 내지 50분, 50 내지 60분 동안 열충격 후에 상승된 형관을 나타낸다. 사용된 열충격 온도는 28 내지 29, 29 내지 30, 30 내지 31, 31 내지 32, 32 내지 33, 33 내지 34, 34 내지 35, 35 내지 36, 36 내지 37, 37 내지 38, 38 내지 39, 39 내지 40, 40 내지 41, 41 내지 42, 42 내지 43, 43 내지 44, 44 내지 45℃이다. 액틴 5C/mNeonGreen 유전자를 갖는 BSF 유충은 구성적 높은 수준의 mNeonGreen 형광을 나타낸다. mNeonGreen은 BSF의 모든 조직에서 발현된다. mNeonGreen 단백질은 또한, 면역블롯 검정을 이용하여 형질전환 곤충에서 검출된다.
통상적인 형질전환 실험에서, 공여자 플라스미드 DNA와 헬퍼 플라스미드 DNA의 혼합물을 전-배반엽(산란 후 0 내지 2시간) BSF 배아에 동시-주사하였다. 형질전환 BSF를 검출하기 위해, 주사된 배아로부터 유래된 파리(세대 G0)를 수용자 균주로 역교배시킴으로써 사육하였으며, 이들의 자손을 mNeonGreen의 발현에 대해 유충 스테이지에서 개별적으로 시험하였다. 표준 에피형광 현미경을 사용하여 1일로 분리된 유충(hsp-mNeonGreen 플라스미드에 의해 주사됨)의 하나 이상의 연속적인 열충격 처리 후 유충의 조직에서 mNeonGreen-특이적 형광을 검출함으로써 mNeonGreen의 발현을 모니터링하였다.
B. 전기천공에 의한:
비탈융모막화되거나 탈융모막화된 신선한 알을 500 ㎕ 전기천공 완충제를 갖는 0.2-cm 전극 갭 큐벳(Bio-Rad)에 넣었다. 다양한 전압(350 V/㎝ 내지 1700 V/㎝)을 사용하여 실험을 수행하였다. 탈융모막화된 알은 깨지기 쉬웠고, 건조되었다. 일부 비탈융모막화된 알을 30초 간격으로 분리된 2회의 펄스로 전기천공하였다. 성체로 출현한 생존한 전기천공된 BSF 파리를 야생형 곤충과 개별적으로 교배시켜 독립적인 파리 계통의 생성을 개시하였다.
갓 낳은 BSF 알을 EGFP 또는 DsRed를 함유하는 200 ng/㎕ 공여자 벡터 및 전기천공 완충제에서 피기백 트랜스포사제의 과잉활성 변이체를 코딩하는 300 ng/㎕ 헬퍼 플라스미드로 전기천공하였다.
BSF 유충을 GFP2 필터 세트(Leica: 여기자 필터 480/40㎚, 배리어 필터 510LP) 또는 DsRed 필터 세트(Leica: 여기자 필터 545/30㎚, 배리어 필터 620/60㎚)를 사용하여 Leica 형광 현미경으로 스크리닝하였다. 유충 및 성체 둘 모두를 스크리닝을 위해 사용하였다.
DsRed를 발현하는 전체 동결된 유충을 체질 스크린(sieving screen)이 제거되고 블레이드 측면이 전방에 위치된 Fitzmill 분쇄 장치에서 절단하였다. 유충을 3개의 상이한 속도로 절단하였다: 3000 rpm, 6000 rpm 및 9000 rpm. 분쇄된 유충 바이오매스를 엔드 오버 엔드 혼합(end over end mixing)을 이용하여 추출 완충제와 혼합하였다. 대략적인 추출 속도를 결정하고 전체 유충에 대한 전체 추출 수준을 결정하기 위해 샘플을 분석을 위한 추출 과정에 걸쳐 제거하였다. DsRed를 반-정성적 SDS-PAGE 쿠마시 염색된 겔 또는 DsRed 특이적 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 사용하여 검출하였다. 밴드에 대한 밀도계를 Kodak 1 영상화 시스템을 이용하여 수행하였다.
실시예 4: 피기백 트랜스포존 시스템을 통한 T. 몰리토르의 생식계열 형질전환
T. 몰리토르 배아를 밤새 산란(최대 24시간 에이징)으로부터 수집하고, 2.5% 표백제로 세척하고, 미세주입을 위해 유리 커버 슬라이드의 에지 상에 정위시켰다. 공여자 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 400 ㎍/㎖:100 ㎍/㎖의 비율로 주사하였다. 주사 후, 배아를 습도 챔버에서 인큐베이션하고, 번데기를 28℃ 및 60% R.H 둘 모두에서 T. 몰리토르 식이를 갖는 페트리 디스에서 배치시켰다. 알로부터 나온 유충을 T. 몰리토르 식이 상에 배치시키고, 이식 유전자 발현에 대해 스크리닝하였다. 번데기를 봉합하며, 성체를 이식 유전자 발현에 대해 스크리닝하였다.
실시예 5: 이식 유전자의 바쿨로바이러스-매개 전달 및 발현:
1. 바쿨로바이러스 발현 벡터의 생산:
관심 단백질을 코딩하는 외인성 유전자를 어셈블링한 직후에, 이를 바쿨로바이러스 전달 벡터에 패키징하였다. 전달 벡터는 관심 유전자를 바이러스 DNA의 원하는 부위로 통합하는 데 필요한 바이러스 게놈의 영역을 함유하는 플라스미드-기반 벡터이다. 전달 벡터의 작제 후에, 이를 재조합 바쿨로바이러스의 생산 및 증폭을 위해 바이러스 게놈과 함께 배양된 곤충 세포주에 공동-트랜스펙션하였다. 이후에, 재조합 바쿨로바이러스를 배양된 세포로부터 단리 및 정제하고, 이후에, 요망되는 역가로 숙주 곤충 종으로 전달하였다.
2. 재조합 바쿨로바이러스의 전달:
a. 유충로의 재조합 바쿨로바이러스의 주사:
관심 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스를 곤충 유충에서 유전자 발현을 구동할 수 있는 강력한 프로모터의 영향 하에 작제하였다. 바쿨로바이러스의 발아된 바이러스 형태 또는 박미드(bacmid) 형태를 5령 발달 스테이지에서 BSF 유충의 혈액낭에 주사하였다. 주사 전에, 유충을 얼음에 넣어 이들의 움직임을 제한하고 이들의 주사를 용이하게 하였다. 약 1×107 pfu/㎖의 역가를 갖는 5 내지 50㎕ 재조합 바쿨로바이러스를 미세바늘을 이용하여 주사용으로 사용하였다.
"박미드"는 세포에 트랜스펙션하였을 때 바쿨로바이러스를 생성하기에 충분한 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 작제물을 지칭한다.
b. 에어로졸 감염에 의한 재조합 바쿨로바이러스로의 곤충 유충의 감염:
폐색된 형태(ODV)의 재조합 바쿨로바이러스를 에어로졸 감염에 의해 5령 발달 스테이지에서 곤충 유충에 도입하였다. 에어로졸 스프레이는 1×107 pfu/㎖의 농도로 2㎖의 재조합 바쿨로바이러스 용액을 함유하였다.
c. 경구 접종에 의한 재조합 바쿨로바이러스로의 곤충 유충의 감염:
5령의 유충을 24시간 동안 굶주리게 하고, 이후에, 폐색된 형태(ODV)의 재조합 바쿨로바이러스와 혼합된 식이를 공급하였다.
3. 이식 유전자 발현의 분석:
상기 언급된 경로 중 하나에 의해 형광 단백질(mNeonGreen, EGFP 또는 DsRed)을 함유하는 재조합 바쿨로바이러스의 감염 후에, 유충을 특수 식이로 사육하고, 70% 습도, 23 내지 25℃에서 습윤화된 챔버에서 유지시키고, 16:8 광주기(L:D) 사이클 동안 노출시켰다. 발현을 형광 현미경에 의해 시각적으로 모니터링하였다. 이러한 것들을 접종하고 4일 동안 인큐베이션한 후에, 유충의 체액을 후속 분석을 위해 수집하였다. 체액에 함유된 단백질을 SDS PAGE 전기영동에 의해 분석하였다(Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, A8.40-A8.55). PVDF 막을 사용한 웨스턴 블롯 면역검정을 추가로 수행하였다.
실시예 6: CRISPR/Cas-매개된 안정한 통합
이러한 예에서, 관심 유전자(GOI)의 게놈 통합은 CRISPR/Cas 기술을 통해 달성된다. 이전에 언급된 바와 같이, CRISPR/Cas 기술은 gRNA 및 PAM 서열 인식에 의해 매개되는 정확하고 안정적인 게놈 통합을 위한 매력적인 대안적인 방법을 제공한다. 게놈 삽입을 위해 CRISPR를 사용하는 한 가지 방법은 문헌[(Hovemann BT, et al. Gene. 1998 Oct 9;221(1):1-9), (Bassett A, et al. Methods. 2014 Sep;69(2):128-36)]에 기술된 바와 같이, 표적 및 헬퍼 플라스미드를 사용하는 것이다.
CRISPR 표적 서열은 3-단계 공정을 통해 동정된다. 제1 단계는 BSF 참조 게놈을 기반으로 오프 타겟 데이터베이스를 생성하는 것이다. 데이터베이스는 Cas12a 효소의 PAM 서열, TTTN을 검색하는 전체 게놈을 루핑함으로써 생성된다. 제2 단계는 관심 영역에서 가능한 CRISPR 가이드 RNA 표적 서열을 발견하는 것이다. 액틴 5c 유전자(NCBI ID: LOC119646467) 및 유전자의 업스트림에 있는 2k 염기 영역 둘 모두는 발견을 위해 검색된다. 액틴 5c를 선택하는 이유는 BSF의 상이한 수명 주기 전반에 걸쳐 지속적으로 상위 1%의 고도로 발현된 유전자들 중 하나이기 때문이다. 또한, 유전자는 성공적인 CRISPR 통합에서 규정되는 특징인, DNA의 고도로 접근 가능한 영역에 의해 둘러싸여 있다. 유전자 영역에서의 발견은 22개의 가능한 Cas12a 가이드 RNA 표적 서열을 산출하는 반면, 업스트림 영역에서의 발견은 166개의 가능한 표적 서열을 산출하였다.
표적 서열 식별의 세 번째 시기는 적절한 성능 매트릭스에 따라 발견된 가능한 Cas12a 표적의 순위를 매기는 것이다. 이용된 주요 성능 매트릭스는 단계 1에서 생성된 오프-표적 데이터세트와의 매치의 최소화이다. 표적 서열 사이에 동점이 있는 경우, 폴딩의 자유 에너지가 가장 적고 GC 함량이 더 우수한 서열이 선택된다. 액틴 5c 유전자 내부에서 발견된 22개의 Cas12a 표적 서열 중, 3개는 BSF 오프-표적 데이터베이스에서 0개의 매치를 갖는다. 선택된 최상의 가이드 RNA인 TTTGGGTTGAGTGGAGCCTCGGTC는 59%의 GC 함량 및 -3.6의 자유 에너지를 갖는다. 영역 업스트림에서 발견된 166개의 표적 서열에 대해, 선택된 최상의 서열, TTTCAACGGTCGCCAGGCTAGGGT는 58%의 GC 함량 및 -3.2의 자유 에너지를 갖는다.
애쿼레아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터 단리된 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)은 두 가지 방식을 통해 BSF에서 발현된다. 첫 번째는 녹-인 유전자(knocked-in gene)가 액틴 5c의 전사 기구에 의존할 것이기 때문에 프로모터 없이 공여자 주형이 GOI를 인코딩하는 액틴 5c 유전자 내부의 통합이다. 이러한 경우, 유전자는 1 k 상동성 아암으로 둘러싸여 있을 것이다. 두 번째 방식은 유전자의 업스트림 영역에서의 통합이며, 이는 GOI 외에 적합한 프로모터, 드로소필라 액틴 5c를 갖는 공여자 주형을 필요로 한다. 공여자 주형에서 더 긴 삽입물은 삽입물을 둘러싸기 위해 1.5 k의 더 긴 상동성 아암을 필요로 한다.
헬퍼 플라스미드는 U6 프로모터 아래의 부위를 표적화하는 gRNA 서열 및 구성적 활성 프로모터인 폴리유비퀴틴 아래의 Cas 12a를 함유한다. 액틴5C/EGFP를 갖는 BSF 유충은 구성적으로 높은 수준의 EGFP 형광을 나타낸다. EGFP는 BSF의 모든 조직은 아니지만 대부분의 조직에서 발현된다. EGFP 단백질은 또한 상기 기술된 트랜스포존-기반 기술에 의해 조작된 곤충에 기술된 검정을 이용하여 형질전환 곤충에서 검출된다. 표적 부위로의 EGFP 게놈 통합을 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. 본 명세서에 기술된 용어 "프라이머"는 DNA 복제를 위한 출발점으로서 작용하는 핵산 가닥을 지칭한다.
실시예 7: 단백질 회수를 용이하게 하기 위한 분쇄
유충의 분쇄는 유충을 과립 혼합물로 형성시킴으로써 유충의 유동성을 증가시키고, 유충의 표면적을 증가시키고, 관심 단백질의 확산에 필요한 거리를 감소시키고, 유충으로부터 회수된 단백질의 수율을 증가시키고 그리고/또는 다른 혜택을 제공하기 위해 수행된다. 통상적으로, 유충은 약 1㎜ 내지 약 1 cm의 치수를 갖는 조각으로 부서진다. 공정은 임의의 곳에서 전체 유충에서 약 50 마이크론의 조각까지 이용할 수 있다. 약 0.5㎜ 내지 약 2.5㎜의 대략 직경을 갖는 과립으로 유리한 결과가 얻어질 수 있다. 대안적인 실시형태는 유충을 통상적으로 약 0.1㎜ 내지 약 5㎜ 및 더욱 통상적으로 약 0.5㎜ 내지 약 2㎜의 치수를 갖는 플레이크로 압축하는 것을 포함한다. 특정의 일 실시형태에 따르면, 유충은 약 2㎜ 정도의 과립으로 절단된다.
1. 밀링(milling)을 통한 분쇄:
한 가지 기술은 밀링 기계로 곤충 유충을 분쇄하는 것을 포함한다. 사용될 수 있는 특정 밀링 기계는 Fitzmill 밀링 기계이다. 하나의 기술에 따르면, 기계는 블레이드가 정방향으로 대면하여 과립 형태의 냉동된 유충을 생성하도록 작동될 수 있다. 밀(mill)은 유충을 다양한 정도로 절단하기 위해 다양한 속도로 작동될 수 있다. 예를 들어, 밀은 약 3000 내지 약 9000 rpm에서 작동될 수 있다. 특정 실시형태는 약 3000, 약 6000 또는 약 9000 rpm을 이용하였다. 분쇄는 감소된 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 분쇄는 약 -100℃ 내지 약 30℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 특정의 일 실시형태는 약 4℃에서 수행되었다.
2. 원뿔형 밀링을 통한 분쇄:
두 번째 기술은 원뿔형 밀(conical mill)을 이용한 분쇄를 포함한다. 사용될 수 있는 특정 밀링 기계는 Quadro Comil이다. 밀은 유충을 다양한 정도로 절단하기 위해 다양한 속도 및 다양한 구성으로 작동될 수 있다.
3. 충격을 통한 분쇄:
세 번째 기술은 충격에 의한 분쇄를 포함한다. 이러한 방법은 극도의 추운 조건 하에서 블레이드의 평평한 면, 해머 또는 망치로 유충을 공격한다.
4. 체질 또는 스크리닝을 통한 분쇄:
제4 기술은 "체질" 장치 또는 스크린을 통해 사이징하기 위해 물질을 스케일링하는 것을 포함한다. 스트라이커(striker)의 블레이드 또는 플랫(flat)은 유충 쪽으로 배향될 수 있다. 크기 감소는 스크린 또는 체 위로 유충을 스크레이핑하거나 끌어서 제어될 수 있다.
유충이 바쿨로바이러스에 감염되면, 처리된 유충 바이오매스는 감마선 조사에 노출됨으로써 추가로 처리된다. 이러한 조사의 목적은 바쿨로바이러스를 불활성화시키고 또한 분말을 멸균시키는 것이다. 감염이 발생하는 지의 여부를 시험하기 위해 곤충 유충에서 생물검정을 수행함으로써 바쿨로바이러스가 더 이상 활성이 아님을 입증하기 위해 각 로트를 시험하였다.
이후, 유충의 조각, 전체 유충, 전체 곤충 및/또는 곤충의 조각이 추출 완충제와 혼합될 수 있다. 추출 완충제는 표적 단백질(들)이 가용성인 임의의 성분을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 완충제는 4 내지 8의 pH를 갖는 50mM Tris, 0 내지 300nM NaCl, 및 0 내지 5mM 베타-머캅토에탄올을 포함한다.
완충제는 곤충과 또는 다양한 비율로 분쇄된 곤충 부분과 혼합될 수 있다. 비율은 수행되는 실행의 수에 의존할 수 있다. 예를 들어, 다중 실행이 수행되는 경우, 비율은 더 많은 곤충으로 왜곡될 수 있다. 이용될 수 있는 비율의 예는 1:3 곤충 대 완충제이다.
곤충/곤충 조각 및 완충제가 조합되면, 이들은 혼합될 수 있다. 혼합은 다수의 상이한 장비로 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 함께 혼합되는 것은 엔드 오버 엔드 혼합(end over end mixing)으로 또는 오버헤드 라이트닝 믹서(overhead lightening mixer)로 수행될 수 있다.
곤충 조각의 혼합 후, 관심 단백질(들)은 유충 또는 유충 조각으로부터 추출될 수 있으며, 조각은 완충제로부터 분리되며, 이는 관심 단백질(들)을 함유한다. 추출 및 정화는 별도로 또는 함께 수행될 수 있다. 추출 및 분리는 다수의 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 디켄팅, 체질, 스크리닝, 저속 원심분리, 역류 추출, 디켄터 원심분리, 중공 튜브 또는 큰 구멍 중공 섬유 또는 플레이트 및 프레임 접선 유동 여과, 및/또는 침투 추출이 이용될 수 있다. 하나 초과의 추출 및/또는 분리 단계가 수행될 수 있다. 또한, 하나 이상의 상이한 공정이 추출 및 분리에 이용될 수 있다. 이용되는 추출 및 분리 기술(들) 둘 모두는 다른 인자들 중에서 관련된 단백질(들) 및 곤충 조각의 크기에 적어도 부분적으로 의존할 수 있다. 추출은 약 15 내지 약 45분이 소요될 수 있다. 관심 단백질 또는 물질의 추출을 위한 시간 범위는 주로 관심 단백질 또는 물질 및 추출 공정에 사용되는 완충제에 의존하고, 15초 내지 최대 4시간의 범위일 수 있다.
제어될 수 있는 다른 추출 파라미터는 잠재적인 접선 흐름 여과 단계에 대한 온도, 원심분리 속도 및 공칭 분자량 컷-오프(NMWCO) 범위를 포함할 수 있다. 통상적으로, 추출은 약 4℃ 내지 약 45℃의 온도 범위에서 수행된다. 2개의 특정 실시형태에 따르면, 추출은 약 4℃ 또는 약 20℃의 온도에서 수행될 수 있다. 추출을 위한 원심분리는 약 2,000×g 내지 약 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다. 추출을 위한 잠재적 접선 흐름 여과 단계에 대한 공칭 분자량 컷-오프(NMWCO) 범위는 약 100 kDa NMWCO 내지 약 0.22 마이크론일 수 있다.
정화는 약 4℃ 내지 약 45℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 특정의 일 실시형태에 따르면, 정화를 약 4℃의 온도에서 수행하였다. 정화를 위해 수행될 수 있는 원심분리는 약 2,000×g 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 정화는 약 0.01㎜ 내지 약 1㎜의 스크린 크기로 수행될 수 있다. 특정의 일 실시형태는 약 0.5㎜의 스크린 크기로 수행되었다. 정화를 위한 잠재적 접선 흐름 여과 단계에 대한 공칭 분자량 컷-오프(NMWCO)는 약 100 kDa NMWCO 내지 약 0.22 마이크론의 범위일 수 있다.
본 발명은 관련된 유기체로부터 임의의 단백질 생성물 또는 다른 요망되는 물질 또는 성분을 단리하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 천연이든 재조합이든 곤충 유충에 의해 발현되거나 발현될 수 있는 임의의 단백질은 단리될 수 있다.
실시예 8: 재조합 단백질의 정제
다른 곤충 부분으로부터 단백질-함유 완충제를 분리한 후, 단백질(들)은 완충제로부터 분리된다. 이는 단백질을 단리하기 위한 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 예를 들어, 단백질은 접선 유동 여과, 액체-액체 추출, 칼럼 크로마토그래피, 침전, 막 결합, 및/또는 임의의 다른 공지된 공정의 임의의 조합에 의해 단리된다.
단리 공정(들)은 원하는 정도의 단백질 순도를 달성할 때까지 수행된다. 통상적으로, 단백질은 적어도 약 85% 순도에 도달할 때까지 처리된다. 보다 통상적으로, 단백질은 적어도 약 90% 순수하다. 일부 경우에, 단백질은 적어도 약 95% 순수하다. 단백질은 단백질이 이의 최종 용도에 효과를 갖는 데 통상적으로 필요한 정도의 순도를 가질 때까지 처리된다.
SARS-CoV2 스파이크 단백질의 정제
본 실시예는 검은 병정 파리, 헤르메티아 일루센스의 유충에서 전장 SARS-CoV2 스파이크 단백질의 최적화된 정제 공정을 설명한다. 95% 초과의 순도에 도달하기 위해서는 2개의 이온 교환 단계 및 1개의 중간 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 포함하는 3개의 크로마토그래피 단계가 필요하다.
간략하게, 수확된 유충은 재조합 단백질, 총 단백질, 및 프로테아제 검정을 위해 준비될 때까지 수집되고 -60℃에서 냉동된다. 냉동된 유충은 해동되고, 4 내지 8의 pH를 갖는 50mM Tris, 0 내지 300mM NaCl, 및 0 내지 5mM 마이크론 필터에서 균질화된다.
스파이크 단백질은 비이온성 세제로 세포막으로부터 추출되고, 10,000×g에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 물질이 제거된다. S 단백질 올리고머는 음이온 교환, 친화성 포획 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 공정을 사용하여 정제된다. 정제 공정 동안, 세제 농도가 낮아져 S 트라이머가 고차 단백질-단백질 마이셀 나노입자를 형성할 수 있다. 정제된 S 나노입자는 0.2 마이크로미터 필터를 통해 통과되고, -80℃에서 저장된다.
SARS-CoV 스파이크 단백질 샘플은 4 내지 12% 구배 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석되고, GelCode Blue 염색 시약(Pierce, 일리노이주 록퍼드 소재)으로 염색하고 OneDscan 시스템(BD Biosciences, 메릴랜드주 록빌 소재)을 이용하여 주사 농도계(scanning densitometry)에 의해 정량화된다. 정제된 스파이크 단백질의 총 단백질 농도는 (BCA 비신코닌산 단백질 검정, Pierce Biochemicals)를 사용하여 결정되며, S-단백질 입자 크기 및 샘플 균질성은 표준 제조업체 권장 방법인 베타-머캅토에탄올을 이용하여 ZETASizer Nano(Malvern Instruments, 펜실베이아주 소재)를 사용하여 동적 광 산란에 의해 시험된다. 균질물은 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원심분리되어 큰 파편을 제거한다. 원심분리 후, 상청액은 또한 0.22를 사용하여 추가로 정화된다.
재조합 단백질의 수율
재조합 단백질의 수율은 유충당 2㎎ 초과이다. 바람직하게는, 재조합 단백질의 수율은 유충당 30㎎ 내지 35㎎이다. 유충 중량은 40% 건조 매스(dry mass)를 갖는 약 0.3 gm이다. 건조 매스의 45%는 단백질이며, 재조합 단백질은 총 단백질 수율의 10 내지 50%에 도달할 수 있다. 곤충으로부터의 내인성 프로모터를 사용하고 코돈을 최적화함으로써, 수율은 60% 이상으로 증가한다(검은 병졍 파리의 경우 약 35㎎/유충).
실시예 9: 혈액림프로부터 재조합 단백질의 회수
곤충 출혈에 의해 용이하게 수행될 수 있는 곤충으로부터 혈액림프를 회수함으로써 단백질이 보유된 현탁액을 회수한다. 출혈 후, 혈액림프는 산화 반응을 거치고, 색이 어둡고 점성으로 변한다. 산화 반응은 샘플을 냉장 상태로 유지하고, 글루타티온과 같은 항산화제를 첨가함으로써 느려진다. 혈구는 원심분리를 통해 혈액림프로부터 펠릿화된다. 생성된 상청액은 검정되거나 나중에 사용하기 위해 냉동 보관된다. 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 결합 칼럼, 및 당업자에게 공지된 다른 유사한 기술을 포함하는 적합한 단백질 정제 시스템은 상청액으로부터 관심 단백질을 용이하게 추가로 단리하는 데 이용된다.
실시예 10: 곤충 유충에서 VLP의 생산
a. FMDV 타입 O/IND/R2/75의 VLP
FMDV 타입 O/IND/R2/75의 VLP는 검정 병정 파리의 곤충 유충에서 생산된다. 이러한 VLP를 코딩하는 재조합 BEV는 문헌[Kumer et al, 2016(Kumar, M., et al, 2016. Virusdisease, 27(1), 84-90)]에 기술된 방법에 따라 BSF 곤충 유충에 감염된다. 간략하게, 50㎕의 재조합 바쿨로바이러스는 각 유충의 혈액낭에 주입된다. 유충은 바쿨로바이러스 감염으로 인한 행동, 섭식 습관 및 폐사율의 변화에 대해 매일 관찰된다. 전체 유충 추출물의 제조 및 혈액림프의 수집은 감염 후 1 내지 8일(dpi)의 특정 시간 간격으로 수행된다.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 dpi에서 BSF로부터 수집된 혈액림프(2.5㎖)는 5㎖ 폴리알로머 튜브에서 4℃에서 16h 동안 120000×g에서 초원심분리에 의해 20 내지 60% 수크로스 구배(20, 30, 40, 50 및 60% 수크로스 각각 0.5㎖)를 통해 정제된다. 초원심분리 후, 각각 0.5㎖의 분획은 아래에서 위로 수집되고, S-ELISA에서 시험된다. S-ELISA는 혈액림프 및 전체 유충 추출물에 대해 수행된다. 간략하게, 96-웰 ELISA 플레이트는 카보네이트-바이카보네이트 완충제(pH 9.6)에서 1/1000 희석액으로 토끼에서 발생시킨 50 마이크로리터(㎕)의 FMDV 항-146S 혈청으로 코팅되고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션된다. 모든 시약은 각 웰에 대해 50 ㎕ 부피로 첨가된다. 인큐베이션 후, 플레이트는 PBST(0.05% Tween-20을 함유하는 포스페이트 완충된 염수(PBS))로 3회 세척된다. 샘플은 각각 양성(바이러스 항원) 및 음성(Sf9 세포 항원) 대조군에 대해 4개의 웰과 함께 이중으로 첨가된다. 플레이트는 인큐베이션되고 앞서 기재된 바와 같이 세척된다. 이후, 차단 완충제(PBST + 5% 성체 공여자 소 혈청)에서 1:4000으로 희석된 항-146S 기니피그 추적 항체는 각 웰에 첨가된다. 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척되며, 차단 완충액에서 1:3000 희석으로 호스 래디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-기니피그 IgG는 첨가되고, 인큐베이션된다. 세척 후, 새로 제조된 오르토페닐렌 디아민/과산화수소 기질은 첨가되고 발색을 위해 37℃에서 15분 동안 인큐베이션된다. 이후에, 1M H2SO4를 사용하여 반응이 중단된다. 플레이트 흡광도는 620㎚ 기준 파장을 갖는 ELISA 판독기에서 492㎚에서 판독된다. 양성-음성 컷오프 값은 4개의 중간 블랭크 웰의 평균±표준 편차의 2배로 계산되었다.
감염된 BSF 유충으로부터 수집된 혈액림프의 피크 분획의 재조합 단백질 함량과 관련하여 VLP의 양은 분광광도법에 의해 결정된다. 정제된 VLP는 260 및 280㎚에서 분광광도법 판독에 의해 정량화된다.
b. HIV Gag 1 VLP:
인간 코돈-최적화된 미리스토일화된 HIV-1 서브타입 C gag 유전자를 상이한 조절 요소에 커플링시키고, 피기백 플라스미드에 클로닝하였다. 이러한 플라스미드를 피기백 트랜스포사제 효소를 인코딩하는 헬퍼 플라스미드와 함께 BSF의 전-배반엽으로 공동-형질전환시켰다.
이후에, 문헌[Lynch et al, 2010](Lynch AG, et al, 2010, BMC Biotechnology, 10:30)에 기술된 바와 같이 형질전환 BSF 유충 또는 번데기(G1)로부터 VLP를 정제하였다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 명시된 것처럼 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 상충하는 경우, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선할 것이다.
등가물
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
Claims (69)
- 적어도 하나의 외인성 유전자를 포함하는 형질전환된 곤충으로서, 상기 곤충은 헤르메티아(Hermetia), 그릴로데스(Gryllodes), 그릴루스(Gryllus), 아체타(Acheta), 테네브리오(Tenebrio), 및 알피토비우스(Alphitobius)로 이루어진 군으로부터 선택된 속(genus)의 곤충인, 형질전환된 곤충.
- 제1항에 있어서, 상기 외인성 유전자는 상기 곤충의 체세포 내에 포함되어 있는, 형질전환된 곤충.
- 제1항에 있어서, 상기 외인성 유전자는 상기 곤충의 생식계열(germline) 내에 포함되어 있는, 형질전환된 곤충.
- 제3항에 있어서, 상기 외인성 유전자는 안정적으로 유전 가능한, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 헤르메티아 일루센스(Hermetia illucens), 그릴로데스 시길라투스(Gryllodes sigillatus), 그릴루스 아시밀리스(Gryllus assimilis), 아체타 도메스티쿠스(Acheta domesticus), 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 테네브리오 옵스쿠루스(Tenebrio obscurus), 또는 알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus)로 이루어진 군으로부터 선택된 종 속(species genus)인, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 헤르메티아 일루센스인, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 및 아체타 도메스티쿠스로 이루어진 군으로부터 선택된 밀웜(mealworm)인, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 배아(embryo), 유충(larva), 번데기(pupa) 또는 성체(adult)인, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 상기 적어도 하나의 외인성 유전자에 의해 인코딩된 재조합 단백질을 발현하는, 형질전환된 곤충.
- 제9항에 있어서, 상기 곤충은 적어도 2㎎, 5㎎, 10㎎, 15㎎, 20㎎ 또는 25㎎의 상기 재조합 단백질을 발현하는, 형질전환된 곤충.
- 제9항에 있어서, 상기 곤충은 적어도 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎의 상기 재조합 단백질을 발현하는, 형질전환된 곤충.
- 제9항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 곤충에 의해 발현된 총 단백질의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%인, 형질전환된 곤충.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체, 항원, 항원-결합 분자, 효소, 호르몬, 백신의 성분, 및 바이러스-유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 외인성 유전자는 트랜스포존-매개 통합(transposon-mediated integration)에 의해 곤충 게놈 내로 통합되는, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 외인성 유전자는 드로소필라 멜라노가스터(drosophila melanogaster) hsp70 프로모터의 제어 하에 있는, 형질전환된 곤충.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충으로부터 유래된 사육 곤충(reared insect)으로서, 상기 사육 곤충은 상기 적어도 하나의 외인성 유전자를 포함하는, 사육 곤충.
- 제16항에 있어서, 상기 사육 곤충은 상기 적어도 하나의 외인성 유전자에 의해 인코딩된 재조합 단백질을 발현하는, 사육 곤충.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 사육 곤충은 상기 형질전환된 곤충으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 세대까지 제거되는, 사육 곤충.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 사육 곤충은 상기 형질전환된 곤충으로부터 5세대 이상의 세대까지 제거되는, 사육 곤충.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 사육 곤충으로부터 유래된 번데기.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 사육 곤충으로부터 유래된 유충.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 사육 곤충으로부터 유래된 알(egg).
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 사육 곤충으로부터 유래된 성체 곤충(adult insect).
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 사육 곤충으로부터 생산된 바이오매스(biomass).
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 곤충 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 사육 곤충으로부터 단리된 재조합 단백질.
- 제25항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항원, 항원-결합 분자, 효소, 호르몬, 백신의 성분 및 바이러스-유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 단백질.
- 단백질을 생산하기 위한 방법으로서,
a. 헤르메티아 일루센스, 그릴로데스 시길라투스, 그릴루스 아시밀리스, 아체타 도메스티쿠스, 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 또는 알피토비우스 디아페리누스로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충의 제1 스테이지(stage)를 형질전환시키는 단계로서, 상기 형질전환은 상기 곤충의 게놈 내에 발현 카세트를 통합하며, 상기 발현 카세트는 이종 단백질(heterologous protein)을 인코딩하는 유전자를 포함하며, 이종 유전자는 열 충격 프로모터의 제어 하에 있는, 상기 형질전환시키는 단계;
b. 제2 스테이지에서 형질전환된 곤충을 열-충격시키는 단계; 및
c. 상기 형질전환된 곤충으로부터 상기 단백질을 포함하는 바이오매스를 수확하는 단계
를 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 제1 스테이지는 알 또는 배아인, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 제2 스테이지는 유충, 번데기 또는 성체인, 방법.
- 단백질을 생산하기 위한 방법으로서,
a. 헤르메티아 일루센스, 그릴로데스 시길라투스, 그릴루스 아시밀리스, 아체타 도메스티쿠스, 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 또는 알피토비우스 디아페리누스로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충을 형질전환시키는 단계로서, 상기 형질전환은 상기 곤충의 생식계열 내에 발현 카세트를 통합하며, 상기 발현 카세트는 이종 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는, 상기 형질전환시키는 단계,
b. 형질전환된 곤충을 번식시켜 후속 세대 곤충을 생산하는 단계; 및
c. 상기 후속 세대 곤충으로부터 상기 단백질을 포함하는 바이오매스를 수확하는 단계
를 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 방법은, 상기 바이오매스를 수확하는 단계 전에, 상기 후속 세대 곤충을 대량 사육하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 형질전환시키는 단계는 곤충 알(insect egg) 또는 배아 스테이지에서 수행되는, 방법.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오매스는 유충, 번데기 또는 성체 스테이지로부터 수확되는, 방법.
- 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 유전자는 열 충격 프로모터의 제어 하에 있으며, 상기 방법은, 상기 바이오매스를 수확하는 단계 전에, 후속 세대 곤충을 열 충격시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항 또는 제34항에 있어서, 상기 열 충격 프로모터는 드로소필라 멜라노가스터 hsp70 프로모터인, 방법.
- 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 적어도 2㎎, 5㎎, 10㎎, 15㎎, 20㎎ 또는 25㎎의 상기 이종 단백질을 발현하는, 방법.
- 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 적어도 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎의 상기 이종 단백질을 발현하는, 방법.
- 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질은 상기 곤충에 의해 발현된 총 단백질의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%인, 방법.
- 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 바이오매스로부터 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 바이오매스로부터 상기 이종 단백질을 풍부화시키거나 부분적으로 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환시키는 단계는 상기 발현 카세트의 트랜스포존-매개 통합을 포함하는, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 형질전환시키는 단계는 상기 곤충에서 활성인 트랜스포사제 효소를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 상기 발현 카세트는 전이 가능한 요소(transposable element)에 의해 각 단부에 측면 배치되어 있는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 트랜스포사제 효소는 헬퍼 플라스미드(helper plasmid) 상의 코딩 영역 또는 핵산에 의해 인코딩되는 코딩 영역으로서 또는 트랜스포사제 단백질로서 제공되는, 방법.
- 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 헤르메티아 일루센스인, 방법.
- 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 테네브리오 몰리토르, 테네브리오 옵스쿠루스 및 아체타 도메스티쿠스로 이루어진 군으로부터 선택된 밀웜인, 방법.
- 제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환시키는 단계는 상기 발현 카세트의 물리적 또는 화학적 전달을 포함하는, 방법.
- 제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환시키는 단계는 주사, DNA 입자 충돌, 전기천공, 주사 후 전기천공, 유체역학, 초음파, 또는 마그네토펙션(magnetofection)을 포함하는, 방법.
- 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질은 항체, 항원, 항원-결합 분자, 효소, 호르몬, 백신의 성분, 및 바이러스-유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
- 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 의해 바이오-제조된 이종 단백질.
- 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스-유사 입자(virus-like particle: VLP)를 발현하는, 방법.
- 제50항의 방법에 의해 바이오-제조된 VLP.
- 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 의해 바이오-제조된 백신 성분.
- 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 형질전환된 유충의 전신으로부터 상기 이종 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 형질전환된 유충의 혈액림프(hemolymph), 지방체(fat body), 또는 분비선(secretory gland)으로부터 상기 이종 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제53항 또는 제54항의 방법에 의해 생산된 단리된 이종 단백질.
- 형질전환된 곤충을 생산하는 방법으로서, 곤충에서 활성인 트랜스포사제 효소, 및 발현 카세트를 제공함으로써 헤르메티아 일루센스의 곤충 알 또는 배아를 형질전환시키는 단계를 포함하되, 상기 발현 카세트는 이종 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 발현 카세트는 전이 가능한 요소에 의해 각 말단에 측면 배치되며, 이에 의해, 상기 형질전환은 관심 게놈 내에 상기 발현 카세트를 통합시키는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 트랜스포사제 효소는 헬퍼 플라스미드 상의 코딩 영역 또는 핵산에 의해 인코딩되는 코딩 영역으로서 또는 트랜스포사제 단백질로서 제공되는, 방법.
- 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 곤충의 체세포 내에 포함되어 있는, 방법.
- 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 곤충의 생식계열 내에 포함되어 있는, 방법.
- 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 적어도 2㎎, 5㎎, 10㎎, 15㎎, 20㎎ 또는 25㎎의 상기 이종 단백질을 발현하는, 방법.
- 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충은 적어도 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎의 상기 이종 단백질을 발현하는, 방법.
- 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질은 상기 곤충에 의해 발현된 총 단백질의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%인, 방법.
- 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충으로부터 상기 이종 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은,
a. 상기 형질전환된 곤충을 번식시켜 후속 세대 곤충을 생산하는 단계; 및
b. 상기 후속 세대 곤충으로부터 상기 이종 단백질을 포함하는 바이오매스를 수확하는 단계.
를 추가로 포함하는, 방법.
- 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 형질전환된 곤충.
- 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 형질전환된 번데기.
- 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 형질전환된 배아.
- 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 형질전환된 유충.
- 제64항의 방법에 의해 생산된 형질전환된 곤충의 집단(population)으로서, 상기 방법은, 상기 바이오매스를 수확하는 단계 전에, 상기 형질전환된 곤충을 대량 사육하는 단계를 추가로 포함하는, 형질전환된 곤충의 집단.
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