JP6332585B2

JP6332585B2 - トランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法

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Publication number: JP6332585B2
Application number: JP2013145866A
Authority: JP
Inventors: 英敏寺本; 桂小島; 飯塚　哲也; 哲也飯塚
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2018-05-30
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: JP2015015927A

Description

本発明はトランスジェニックカイコ、および該カイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法に関する。

物理的強度が高く手術用縫合糸としても用いられるシルクは、人体に対する安全性が立証されている数少ない生物素材の１つである。近年の研究によりシルクを様々な形状（フィルム・スポンジ・ナノ繊維等）に加工することが可能となり、医療用材料として幅広い用途展開がなされつつある（非特許文献１〜３）。さらに、光学材料や電子材料としてもユニークな特性を持つことが報告されている（非特許文献４）。

シルクはそれ自身有用な特性を多く備えるが、その特性を改変することで、より有用な素材として産業上活用されると期待される。シルクの特性を改変する方法として、これまで「化学的方法」と「遺伝子工学的方法」の２つが用いられてきた。
「化学的方法」はシルクタンパク質の側鎖官能基に対する化学反応によりその特性を改変する方法である（非特許文献５）。化学的方法はシルクタンパク質の特性を大きく改変することが可能だが、反応部位・反応量の制御が困難、反応に伴う副生成物や残留試薬による毒性の懸念、といった問題がある。
一方「遺伝子工学的方法」は、カイコの遺伝子組換え技術を用いてシルクタンパク質の特性を改変させる方法である（非特許文献６）。遺伝子工学的方法は、化学的方法の重大な問題点である毒性等を回避できることからも極めて有効な手法であり、さらなる技術開発が望まれている。なかでも、タンパク質への非天然アミノ酸導入法は、非天然アミノ酸を構成要素として使用でき、天然にはない特性を有するタンパク質を創出できることから注目される。

タンパク質への非天然アミノ酸導入法には、二つの方法が知られている。一つは「部位特異的非天然アミノ酸導入法」である。この方法では、非天然アミノ酸の投与、及びターゲットタンパク質遺伝子配列の改変を必要とし、改変した配列のコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、及びそのｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化するためのａａＲＳ（アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素）を用いる。しかしながら、この部位特異的非天然アミノ酸導入法では、ターゲットタンパク質遺伝子と目的のａａＲＳ遺伝子の両方を改変させなければならず工程が煩雑である。また、ターゲットタンパク質遺伝子の配列が既知のものでなくてはならないという制限がある。
一方、二つ目の方法として「残基特異的非天然アミノ酸導入法」が知られている。この方法では、非天然アミノ酸の投与に加え、アミノ酸結合部位に変異を導入した変異型ａａＲＳの強制発現によって非天然アミノ酸の取り込み効率を向上させる。この残基特異的非天然アミノ酸導入法は、ターゲットタンパク質遺伝子の配列を改変させなくとも実施可能なため、部位特異的非天然アミノ酸導入法に比べ利用が簡便であり、ターゲットタンパク質遺伝子の配列が未知であっても利用可能という利点等があるため、利用価値の高い技術である。
これまでに残基特異的非天然アミノ酸導入法を実施した例として、大腸菌（非特許文献７）およびカイコ培養細胞（非特許文献８）において報告がある。

Ｒｏｃｋｗｏｏｄ, Ｄ.Ｎ. ,ｅｔ．ａｌ.,Ｎａｔ. Ｐｒｏｔｏｃ．, （２０１１）Ｖｏｌ．６，ｐｐ.１６１２−１６３１．Ｙａｇｉ，Ｔ．,ｅｔ．ａｌ．,Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ,（２０１１）Ｖｏｌ.１４，ｐｐ．８９−９９．Ｋａｗａｋａｍｉ, Ｍ. ,ｅｔ．ａｌ. ,Ｂｉｏｍｅｄ. Ｍａｔｅｒ. Ｅｎｇ. ,（２０１１）Ｖｏｌ．２１，ｐｐ．５３−６１．Ｏｍｅｎｅｔｔｏ, Ｆ.Ｇ. ａｎｄＫａｐｌａｎ, Ｄ.Ｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ ,（２０１０）Ｖｏｌ．３２９，ｐｐ．５２８−５３１．Ｍｕｒｐｈｙ, Ａ.Ｒ. ａｎｄＫａｐｌａｎ, Ｄ.Ｌ. ,Ｊ. Ｍａｔｅｒ. Ｃｈｅｍ. ,（２００９）Ｖｏｌ．１９,ｐｐ．６４４３−６４５０. 小島桂, 玉田靖,ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ,（２００７）Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１１−１８. Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｋ. ，ｅｔ.ａｌ. ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，（２００２）Ｖｏｌ．３,ｐｐ．２３５−２３７. Ｔｅｒａｍｏｔｏ, Ｈ. ,ｅｔ.ａｌ. ,ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ,（２０１２）,Ｖｏｌ．１３,ｐｐ．６１−６５. Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｈ. ａｎｄＫｏｊｉｍａ, Ｋ. Ｊ. , ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｅｒｉｃｏｌ．，（２０１０）Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５３−６５

しかし、過去に発表されているタンパク質への非天然アミノ酸導入の目的は、タンパク質の構造や機能を精密に解明することが主であり、産業利用を目的として繊維等の材料として機能するシルクタンパク質の有用性を飛躍的に増大させる手法については未だ検討の余地があった。また、カイコをはじめとした多細胞生物において残基特異的非天然アミノ酸導入法を用いることに成功した例は報告されていない。

また、上記のように、従来カイコ培養細胞において残基特異的非天然アミノ酸導入法が用いられていたが、カイコ培養細胞を用いた場合、非天然アミノ酸含有タンパク質の生産量が、非天然アミノ酸を含有しないタンパク質の生産量と比較し、大幅に減少するという問題があった。
また、変異型ａａＲＳによる認識がインビトロ実験で確認された非天然アミノ酸（例えばｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ）であっても、カイコ培養細胞でのタンパク質への取り込みが起こらないという問題があった(非特許文献９)。
また、一般的にカイコ培養細胞を培養する際には、培地に血清を添加する必要があるため、カイコ培養細胞を用いた系において、非天然アミノ酸をはじめとしたタンパク質材料成分の配合等を厳密に制御することは非常に困難であった。
これらの問題点のために、特に、天然アミノ酸と大きく構造が異なる非天然アミノ酸等のある種の非天然アミノ酸（例えばｐ‐Ｎ_３‐Ｐｈｅ）を含有するタンパク質をカイコ培養細胞において製造することは非常に困難であった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、非天然アミノ酸含有タンパク質を容易に製造できるトランスジェニックカイコ、及び該トランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供する。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを絹糸腺特異的に発現するトランスジェニックカイコを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記の特徴を有するトランスジェニックカイコ、及び該トランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供するものである。

（１）トランスジェニックカイコに非天然アミノ酸を投与する工程を有し、
前記トランスジェニックカイコは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４５０位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４０７位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有し、
前記非天然アミノ酸は、下記一般式（１）で表されるアミノ酸であることを特徴とする非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。

［式中、Ｒはアジド基又はエチニル基を表す。］
（２）前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ＤＮＡを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである（１）に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
（３）前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインＬ鎖由来のプロモーターである（１）又は（２）に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。

本発明のトランスジェニックカイコにより、非天然アミノ酸含有タンパク質を容易に製造できる。
また、本発明のトランスジェニックカイコを用いた本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法により、非天然アミノ酸を含有しない本来のタンパク質の特性が改変された非天然アミノ酸含有タンパク質を製造できる。

カイコＰｈｅＲＳのαサブユニット遺伝子を後部絹糸腺で発現するトランスジェニックカイコを作出するためのｐｉｇｇｙＢａｃベクターマップである。ＢｍＦＲＳ１に付けたアスタリスク（＊）は変異体遺伝子であることを示す。白Ｈ０１系統におけるＢｍＦＲＳ１^＊（Ａ４５０Ｇ）断片のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果である。ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重増加曲線である。ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅを投与したカイコ幼虫の５齢期総摂食量（１頭あたり）及び平均繭層重である。ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ投与アッセイで得られた繭層由来ＦｉｂＬ消化断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重増加曲線である。ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを投与したカイコ幼虫の５齢期総摂食量（１頭あたり）及び平均繭層重である。ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ投与アッセイで得られた繭層由来ＦｉｂＬ消化断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重増加曲線である。ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを投与したカイコ幼虫の５齢期総摂食量（１頭あたり）及び平均繭層重である。ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ投与アッセイで得られた繭層由来ＦｉｂＬ消化断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質とビオチン試薬とのクリック反応の模式図である。ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅへのクリック反応後のＦｉｂＬおよびＦｉｂＨに対するビオチン抗体によるウエスタンブロッティングの結果である。ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重増加曲線である。ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを投与したカイコ幼虫の５齢期総摂食量（１頭あたり）及び平均繭層重である。ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ投与アッセイで得られた繭層由来ＦｉｂＬ消化断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅへのクリック反応後のＦｉｂＬに対するビオチン抗体によるウエスタンブロッティングの結果である。

《トランスジェニックカイコ》
本発明のトランスジェニックカイコは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４５０位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４０７位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有することを特徴とするトランスジェニックカイコである。

ｔＲＮＡのアミノアシル化は、それぞれのアミノ酸に対応するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によって触媒される。ａａＲＳはタンパク質を構成する２０種のアミノ酸間で厳密な基質特異性を有している。例えば、フェニルアラニンに対応するａａＲＳは、フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）と呼ばれる。前記（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、カイコＰｈｅＲＳのαサブユニットに変異を有するＤＮＡであって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。このフェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質は、該活性を有していればよいのであって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの配列に加えて、タンパク質タグ等の任意の配列（例えば、ヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ等）をさらに有していてもよい。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを絹糸腺で発現させることで、絹糸腺で作られるタンパク質に対し本来のコドンとは通常は対応しないアミノ酸（非天然アミノ酸）を導入することが可能である。

前記絹糸腺で作られる非天然アミノ酸含有タンパク質は特に制限されることはなく、カイコが絹糸腺において生産するシルクタンパク質が好ましい。また、絹糸腺において任意のタンパク質をコードする外来性のＤＮＡを強制発現させ、任意のタンパク質を絹糸腺に生産させてもよい。

絹糸腺で作られるタンパク質は繭糸としてカイコ体外に分泌されるため、特別の回収方法を用いずとも回収が容易であり、また多量のタンパク質を容易に得ることができる。

また、前記ＤＮＡをトランスジェニックカイコ全体に発現させることによって生じる毒性を回避するという観点から、本発明においては、絹糸腺において前記ＤＮＡを発現させるプロモーターが用いられる。絹糸腺は、前部絹糸腺、中部絹糸腺及び後部絹糸腺に大別される。ここで前記（ａ）〜（ｄ）の配列のＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしては、前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させることができるプロモーターであれば特に制限されず、上記三つの部位のいずれか一つ又は二つ以上の組み合わせからなる部位で発現させることができるプロモーターであってもよい。
中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとして、例えば、セリシン１タンパク質またはセリシン２タンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、中部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの中部絹糸腺で生産されるタンパク質としてはセリシンが挙げられる。
また、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしてはフィブロインＬ鎖（ＦｉｂＬ）タンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、後部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの後部絹糸腺で生産されるタンパク質はフィブロインであり、フィブロインがカイコの繭糸タンパク質の大部分を占めているため、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることで、シルクタンパク質の性質の制御がより容易となる。

前記プロモーターを用いる際には、同時に、前記ＤＮＡの発現、その後のタンパク質への翻訳等を制御するための他の配列を用いてもよく、そのような配列としては例えば３’ＵＴＲ（非翻訳領域）、５’ＵＴＲ配列等が挙げられる。該配列は前記（ａ）〜（ｄ）の配列のＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させることができるものであれば、特に制限されない。

本発明のトランスジェニックカイコの作出に用いるホストのカイコとしては、後述する本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法において、非天然アミノ酸を含むタンパク質を製造できるカイコであれば特に制限されず、例えば、遺伝子組換え作成用として広く用いられるｗ１−ｐｎｄ等の系統を用いても構わないが、飼料として投与された非天然アミノ酸のカイコ個体への取り込み量を増加させるという観点から、人工飼料摂食性に優れたカイコを用いることが好ましい。例えば、日０１号、日６０３号、日６０４号、中６０４号、中６０５号等の品種が好ましく、非天然アミノ酸を含む合成飼料の１個体あたりの摂食量が多い白／ＣＳ（系統名：ＭＣＳ６０１）がより好ましい。

また、本発明のトランスジェニックカイコの作出に用いるカイコとしては、前述のとおり特に制限されず、非休眠卵を産下する性質のカイコまたは休眠卵を産下する性質のカイコの、どちらも用いることが可能である。休眠卵を産下する性質のカイコを用いる場合には、「低温暗催青法」を用いて非休眠卵を産下させることができる。すなわち、胚子を胸肢発生期以後、特に剛毛発生期以後を１５℃程度に保護する。この低温期間は、日数にして１０日以上必要である。胚の反転から頭部着色の頃までを暗黒に保つ。その後孵化した幼虫を飼育して得たカイコ蛾は非休眠卵を産下する。（蚕種総論著者：高見丈夫発行：全国蚕種協会（昭和４４年５月３１日））。

低温暗催青法以外の方法として、幼虫期の光条件をコントロールすることで非休眠卵を産下させる方法（特開２００３−８８２７４参照）を採択してもよい。

低温暗催青法等の方法を用いても非休眠卵が得られないカイコを使用する場合は、カイコ卵を浸酸処理することで、卵を休眠打破してもよい。前記浸酸処理の具体的な方法として、採卵から３〜４時間後のカイコ卵を室温で３０分間程度塩酸に浸漬させ、水洗により塩酸を洗い流した後、卵を風乾させることが挙げられる。前記塩酸は、例えば比重１．１１のものを用いることができる（Ａｉ−ＣｈｕｎＺｈａｏｅｔ.ａｌ．，ＩｎｓｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅ（２０１２）Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．１７２−１８２．参照）。

トランスジェニックカイコの作出方法としては、例えばカイコ卵へＤＮＡを導入する方法が挙げられる。カイコ卵へのＤＮＡの導入は、例えば、カイコの発生初期卵へ、トランスポゾンをベクターとして注射する方法（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ. ,ｅｔ．ａｌ.,ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,（２０００）Ｖｏｌ．１８, ｐｐ.８１−８４.参照）に従って行うことができる。

例えば、トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ.Ｍ.,ｅｔ．ａｌ., Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．,（１９９８）Ｖｏｌ．９５, ｐｐ.７５２０−７５２５.参照。）の間に上記ＤＮＡを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するベクター（ヘルパーベクター）をカイコ卵に導入する方法が挙げられる。ヘルパーベクターとしては、ｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ, Ｔ., ｅｔ．ａｌ., ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,（２０００）Ｖｏｌ．１８, ｐｐ.８１−８４.参照。）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明におけるトランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリーナ（ｍａｒｉｎｅｒ）、ミノス（ｍｉｎｏｓ）等を用いることもできる（Ｓｈｉｍｉｚｕ,Ｋ．，ＩｎｓｅｃｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（２０００）Ｖｏｌ．９，ｐｐ.２７７−２８１.参照。）。

また、本発明のトランスジェニックカイコの作出にはバキュロウイルスベクターを使用することもできる（Ｙａｍａｏ，Ｍ．,ｅｔ．ａｌ., ＧｅｎｅｓＤｅｖ．（１９９９）Ｖｏｌ．１３，ｐｐ.５１１−５１６.参照。）。

上述したトランスポゾンをベクターとして注射する方法、バキュロウイルスベクターを使用する方法、及びその他のカイコ卵へのＤＮＡの導入方法は前記（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡに対して用いてもよく、また、本発明のトランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造において、製造される任意のタンパク質をコードするＤＮＡに対して用いてもよい。

カイコ卵へのＤＮＡの導入は、当業者においては一般的な方法により実施することができる。例えば、以下のように、特開２０１２−１８７１２３号公報に記載の方法で実施することができる。
カイコ卵へＤＮＡ注入用の管を使用して直接卵内へＤＮＡを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的または化学的に卵殻に穴を空け、該穴からＤＮＡを導入する。

本発明において、物理的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば針、微小レーザー等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。中でも、針を用いた方法によって卵殻に穴を空ける方法が好ましい。用いられる針としては、カイコの卵殻に穴を空けることができるものであれば、その材質、強度等は、特に制限されない。一方、化学的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば薬品（次亜塩素酸等）等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。

本発明において、ＤＮＡ導入方法としては、上記のカイコ卵に物理的または化学的に穴を空け、ＤＮＡ注入用の管を該穴から卵内に挿入し、ＤＮＡを注入する工程を、針とＤＮＡ注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行うことが好ましい。マニュピュレーターを構成要素の１つとする装置を使用できる。

このような装置しては、解剖顕微鏡、照明装置、可動式のステージ、顕微鏡に金具で固定した粗動マニュピュレーター、このマニュピュレーターに付けたマイクロマニュピュレーター、ＤＮＡを注射するための空気圧を調整するインジェクターから構成されるものが挙げられる。なお、使用される装置としては、特許第１６５４０５０号公報に記載の装置または該装置を改良した装置が挙げられる。

カイコ卵にＤＮＡが導入されたか否かは、例えば、注射したＤＮＡを卵から再度抽出して測定する方法（Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｊ., ｅｔ．ａｌ., Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ.,（１９９６）Ｖｏｌ．３１,ｐｐ.５８９−５９８.参照。）や、注射した遺伝子としてのＤＮＡの卵内での発現を見る方法（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ.,（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．６５，ｐｐ.４０１−４１０.参照。）等によって確認することができる。カイコ卵に導入されたＤＮＡが、カイコの染色体に組込まれ、遺伝子組換えカイコが得られたか否かは、たとえばＤＮＡを注射した卵から育った成虫を交配し（相互に、あるいは非組換えカイコと）受精卵を得、その産卵後６〜１０日にマーカー遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰや、ＤｓＲｅｄ，ＣＦＰ，ＹＦＰなど）の発現を蛍光顕微鏡で観察することによって可能である。

カイコ卵に導入したＤＮＡがカイコにおいて発現しているかどうかは、インジェクションした卵（Ｇ０世代）から成長した個体が産んだ卵（Ｇ１世代）については、マーカー遺伝子の発現を蛍光顕微鏡で観察して確認する。なお、カイコからトータルＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡをテンプレートに、ＲＴ−ＰＣＲにより導入遺伝子の確認をしてもよい。

また、カイコに導入したＤＮＡがカイコ個体のどの部位で発現しているのかを確認する方法は、例えば、幼虫から組織を摘出し、各組織別に発現を確認する方法や、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲＥＤ等の既知のレポーター遺伝子等を用い、蛍光顕微鏡を用いてカイコ個体を観察する方法等によって確認することができる。

《非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法》
本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法は、本発明のトランスジェニックカイコに非天然アミノ酸を投与する工程を有する。ここで非天然アミノ酸とは、タンパク質を構成しないアミノ酸を意味する。タンパク質を構成するアミノ酸とは、２０種の標準天然アミノ酸、セレノシステイン、及びピロリジンを意味する。すなわち、本発明において、非天然アミノ酸とは、タンパク質を構成するこれらアミノ酸の類縁体（修飾アミノ酸）、又はタンパク質を構成するこれらアミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。

本発明のトランスジェニックカイコはフェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する。そのため、用いられる非天然アミノ酸はフェニルアラニン類縁体であることが好ましい。フェニルアラニン類縁体としては、フィニルアラニンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることが好ましく、フィニルアラニン側鎖のベンゼン環の水素原子が置換されていることがより好ましく、前記ベンゼン環のパラ位が置換されていることが特に好ましい。前記置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子；エチニル基；シアノ基；アジド基等の置換が挙げられる。
即ち、フェニルアラニン類縁体としては、下記一般式（１）で表されるアミノ酸が好ましい。

［式中、Ｒはハロゲン原子、アジド基、又はエチニル基を表す。］
中でも、前記Ｒはアジド基又はエチニル基が好ましい。

本発明のトランスジェニックカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造にあたって、タンパク質に含有される非天然アミノ酸の種類及び含有量を確認する方法としては、種々の方法を選択できるが、質量分析法による分析を行うのが好ましく、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法により質量スペクトルを測定する方法が特に好ましい。

本発明によれば、製造される非天然アミノ酸含有タンパク質に、本来のタンパク質の性質や機能を向上又は改変させることができる。更には、本来のタンパク質にない新たな性質や機能を付与することができる。例えば、非天然アミノ酸の導入手法をシルクタンパク質に適用することで、シルクタンパク質に非天然アミノ酸を含有させ、本来のシルクにはない性質や機能を付与することができる。

本発明の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を用いることで、従来の改変手法における問題点を解決できる。例えば、化学反応にともなう毒性の懸念が小さい、「後加工」であるため機能性分子が失活しないなどの利点があり、特異的な化学反応が可能な官能基の導入により、従来の「化学的方法」によらない精密かつクリーンなタンパク質の化学改変を行うことが可能である。例えば、アジド基又はエチニル基を有する非天然アミノ酸をシルクタンパク質にとりこませることで、エチニル基又はアジド基との反応を介して、任意のタンパク質、ペプチド、薬剤、色素、糖鎖、架橋分子、キレート分子等の分子をシルクに結合させることが可能である。このような改変により、シルクの物性そのものを変化させることが可能である。従って、カイコが絹糸腺において生産するタンパク質の有用性を飛躍的に増大させる。また、シアノ基やフッ素など特徴的な赤外吸収や核磁気共鳴を示す原子（団）を残基特異的に導入することで、これまで不可能であった局所的なシルクの構造情報が得られる。

前記シルク材料の形態は特に制限されず、例えば、パウダー状、繊維状、スポンジ状、フィルム状などの形態が挙げられる。

本発明で用いる非天然アミノ酸は、天然アミノ酸と同時に用いることができ、用いる非天然アミノ酸は１種類のみでもよく、２種類以上の非天然アミノ酸を同時に用いることもできる。

本発明におけるカイコの飼育方法は、当業者において一般的なカイコの飼育方法に従い、非天然アミノ酸を含有する飼料を与え、行うことができる。例えば、「文部省（１９７８）蚕種製造.ｐｐ１９３、実教出版社、東京」に記載の方法に従って飼育を行うことができる。

また、光によって化学反応が引き起こされる官能基を有する非天然アミノ酸をカイコに給餌する場合、非天然アミノ酸に光が照射されない条件下で、カイコを飼育することが好ましい。好ましい飼育方法として、光を一切照射しない連続暗期環境下でカイコを飼育する方法が挙げられる。または、カイコには光が照射されていてもよいが、前記の光によって化学反応が引き起こされる官能基を有する非天然アミノ酸には光が照射されない条件下で、カイコを飼育する方法が挙げられ、例えば、給餌する餌の周囲の空間を物理的に光源から遮蔽し、該非天然アミノ酸をカイコに与え、さらに、カイコが絹糸腺から該非天然アミノ酸を含有するタンパク質を生産する際に、該タンパク質に光が照射されない環境でカイコを飼育する等の方法が挙げられる。

本発明のトランスジェニックカイコに非天然アミノ酸を投与（給餌）する際に、餌に配合する天然アミノ酸（非天然アミノ酸と取り込みにおいて拮抗することが推定される天然アミノ酸）の割合を減らしてもよい。例えば前記天然アミノ酸の量を通常組成の餌に含まれる天然アミノ酸の量に対し４／５〜１／１０に減らした餌であることが好ましく、２／３〜１／１０に減らした餌であることがより好ましく、２／３〜１／８に減らした餌であることがさらに好ましく、１/２〜１/５に減らした餌であることが特に好ましい。

本発明のトランスジェニックカイコを用いたタンパク質製造方法は、残基特異的非天然アミノ酸導入法である。したがって、本発明によれば該カイコに投与する非天然アミノ酸の種類を変えるだけで、同一の系統のトランスジェニックカイコから任意の種類の非天然アミノ酸を含有するタンパク質を製造することができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［合成飼料の調製］
カイコの飼育に用いた通常組成の合成飼料（タンパク質を一切含まない飼料）を既報（渡辺喜二郎，堀江保宏，日蚕雑，（１９８０）ｖｏｌ．４９，ｐｐ．１７７−１８５；Ｈｉｒａｙａｍａ, Ｃ., ｅｔ．ａｌ.,Ｊ. ＩｎｓｅｃｔＰｈｙｓｉｏｌ.,（１９９６）ｖｏｌ．４２，ｐｐ．９８３−９８８.）を参考に調製した。通常組成の合成飼料の組成を表１に、合成飼料中のアミノ酸組成を表２に示す。

表２中の＊で表されたＬ−ＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅおよびＬ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅの含量は、実験内容に応じて変更してもよい。

［組換えホスト系統の選定］
本実施例で用いるホストに求められる条件として、以下の３つの条件
（１）合成飼料（後述）の摂食性に優れるカイコである
（２）限性系統である
（３）組換えマーカーの観察に適した白眼・白卵系統である
を設定した。
特に上記の条件（１）を満たすカイコでは、カイコに摂取させる非天然アミノ酸と天然アミノ酸との比率を厳密に制御することがより容易となることから、条件（１）は特に好ましい条件である。上記の条件（２）は、摂食量や繭重量が雌雄で異なると想定されるため、バラツキの少ない良質なデータを取るためには性別を揃えることが重要となる場合に好ましい条件である。上記の条件（３）は必ずしも必須でないが、組換え体のスクリーニングをより容易に行えることから好ましい条件である。

条件（１）を満たす系統を選定するため、上記表１および表２に示す組成で製造した合成飼料を数系統の５齢幼虫に投与（給餌）した。その結果、発明者らが所属する遺伝子組換えカイコ研究開発ユニットで開発・育成・継代されていた白／ＣＳ（系統名：ＭＣＳ６０１）が最も合成飼料の摂食性に優れていた。白／ＣＳ系統は（２）および（３）の条件も満たすため、これをホスト系統として選定した。

［組み換えベクターの作製］
当業者の常識の範囲である既存の手法に準じ、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（ＢｍＦＲＳ１^＊（Ａ４５０Ｇ））を有するｐｉｇｇｙＢａｃベクター（５塩基の５’ＵＴＲ配列を含む）（図１）を作製した。なお、上記ベクターにはフィブロインＬ鎖（ＦｉｂＬ）由来のプロモーターおよび３’ＵＴＲ配列をそれぞれ、上記変異型遺伝子配列ＢｍＦＲＳ１^＊（Ａ４５０Ｇ）の５’および３’側に付加した。ＦｉｂＬ由来のプロモーター配列を付加することにより、目的遺伝子を後部絹糸腺で特異的に発現させることが可能である。これにより、変異型遺伝子が幼虫の全身で発現することで生じると想定される幼虫の発育不全を回避することができた。

［トランスジェニックカイコの作出と組換え遺伝子の発現確認］
受精卵へのｐｉｇｇｙＢａｃベクターのインジェクションおよびその後の組換え体のスクリーニング等は、当業者の常識の範囲である既存の方法に準じて行った。なお、白／ＣＳ（系統名：ＭＣＳ６０１）は休眠卵を産下し、前述の低温暗催青法による非休眠化ができない系統であるため、前述の浸酸処理によって卵の休眠打破を行った。ゲノム中に挿入された変異型遺伝子のコピー数および挿入パターンをリアルタイムＰＣＲおよびサザンブロッティング法を用いて解析し、変異型遺伝子（ＢｍＦＲＳ１^＊（Ａ４５０Ｇ））をホモで有するトランスジェニックカイコの系統を確立した。このトランスジェニックカイコの系統を白Ｈ０１と名付けた。

５齢４日目の白Ｈ０１系統のカイコ幼虫（雄）から各部分（血球、前部絹糸腺、中部絹糸腺、後部絹糸腺、中腸、精巣、マルピーギ管、脂肪体）を摘出し、それぞれからトータルＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ各１μｇをテンプレートに、ＲＴ−ＰＣＲにより組換え遺伝子断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を電気泳動した結果を図２に示す。図２中のＲＴは逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ)を表す。図２中の上段の結果が示すように、ＲＴを使用しない場合、ＢｍＦＲＳ１^＊（Ａ４５０Ｇ）は増幅されない。図２下段は、内在性のＢｍＦＲＳ１の増幅断片である。図２中段に示す結果から明らかなように、組換え遺伝子（ＢｍＦＲＳ１^＊（Ａ４５０Ｇ））は後部絹糸腺特異的に発現していた。

［ｐ‐Ｃｌ‐Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の製造］
＜カイコの飼育＞
（実施例１）
実施例１で使用したカイコは、前記白／ＣＳ系統をホスト系統として作出した前記トランスジェニックカイコの系統である白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ‐Ｃｌ‐Ｐｈｅ（一般式（１）で表されるアミノ酸において、Ｒ＝Ｃｌ）を含む合成飼料（通常量のＰｈｅを含む）を給餌した。飼育方法は、雄３頭を蓋のできるプラスチック容器に飼料とともに入れ、２５℃に温度設定したインキュベーターに容器ごと入れて行った。飼料は一日一回新しいものに交換し、交換時の残量から３頭の平均摂食量を算出した。同時に、幼虫３頭分の体重を一日一回計測して平均体重を算出した（ｎ＝３）。

（比較例１）
比較例１で使用したカイコは、前記白／ＣＳ系統のカイコである。給餌方法および飼育方法は実施例１と同様である。
（比較例２）
比較例２で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。餌はｐ‐Ｃｌ-Ｐｈｅを含まない通常組成の合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例１と同様である。
（比較例３）
比較例３で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。餌はｐ‐Ｃｌ-Ｐｈｅを含まない通常組成の合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例１と同様である。

表３に、実施例１及び比較例１〜３に用いたカイコ系統、並びにカイコに給餌した餌中に含まれる非天然Ｐｈｅ種類および天然Ｐｈｅ量を示す。なお、表３中の非天然Ｐｈｅ種類における当量および天然Ｐｈｅ量は、前記通常組成の合成飼料中の天然Ｐｈｅ量に対するモル比を示す。

＜ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重の測定＞
実施例１及び比較例１〜３のカイコ幼虫の成長曲線を図３に、総摂食量と繭層重のグラフを図４に示す。

図３および図４の結果から、非天然アミノ酸ｐ‐Ｃｌ‐Ｐｈｅを投与した実施例１のトランスジェニックカイコは、比較例１〜３のカイコと同様の良好な成長を示し、実施例１のトランスジェニックカイコからは十分な重量の繭が得られることが確認された。

＜ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の分析＞
実施例１および比較例１〜３のカイコより繭を得た。各繭層を約５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８ＭＬｉＢｒ水溶液に３５℃で４０分間加熱して溶解させた。この溶解液を８Ｍ尿素水溶液に約４．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約３ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、室温で３０分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＦｉｂＬのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより３７℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液に溶解した。この溶解液をＨＣＣＡで飽和させた０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液と混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に滴下して乾燥させたものを試料としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを測定した。ＦｉｂＬの消化によって生じたＰｈｅを２残基含むペプチド断片（ＳＧＮＦＡＧＦＲ）近傍のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定データを図５に示す。実施例１の区においてのみＰｈｅからｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅへの置換に相当する質量増加（実測値：＋３３．９７Ｄａ、理論値：^３５Ｃｌ − ^１Ｈ＝＋３３．９６Ｄａ）が観察された。１置換体（ｍ／ｚ８８９．４０）に加えて２置換体（ｍ／ｚ９２３．３７）に相当するピークが観察された。

以上の結果から明らかなように、アミノ酸番号４５０位が置換したカイコＰｈｅＲＳαサブユニットをコードするＤＮＡが後部絹糸腺特異的に発現しているトランスジェニックカイコにｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅを含む餌を与えることで、ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅを含有するＦｉｂＬタンパク質を得ることができた。

［ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の製造］
＜カイコの飼育＞
（実施例２）
実施例２で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ（一般式（１）で表されるアミノ酸において、Ｒ＝Ｂｒ）を含む合成飼料を給餌した。カイコの飼育は前記実施例１と同様の方法で行った。
（実施例３）
実施例３で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを含み、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／２に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例２と同様である。
（実施例４）
実施例４で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを含み、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例２と同様である。

（比較例４）
比較例４で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを含まないが、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例２と同様である。
（比較例５）
比較例５で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを含み、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例２と同様である。
（比較例６）
比較例６で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。餌はｐ-Ｂｒ-Ｐｈｅを含まないが、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例２と同様である。

表３に、実施例２〜４及び比較例４〜６に用いたカイコ系統、並びにカイコに給餌した餌中に含まれる非天然Ｐｈｅ種類および天然Ｐｈｅ量を示す。

＜ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重の測定＞
実施例２〜４及び比較例４〜６のカイコ幼虫の成長曲線を図６に、総摂食量と繭層重のグラフを図７に示す。

図６に示すように、非天然アミノ酸ｐ‐Ｂｒ‐Ｐｈｅを投与した実施例２〜４のトランスジェニックカイコは、比較例４〜６のカイコと同様の良好な成長を示した。また、図７に示すように、実施例２〜４のトランスジェニックカイコから繭が得られることが確認された。

＜ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の分析＞
実施例２〜４および比較例４〜６のカイコより繭を得た。各繭層を約５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８ＭＬｉＢｒ水溶液に３５℃で４０分間加熱して溶解させた。この溶解液を８Ｍ尿素水溶液に約４．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約３ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、室温で３０分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＦｉｂＬのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより３７℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液に溶解した。この溶解液をＨＣＣＡで飽和させた０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液と混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に滴下して乾燥させた。これを試料として用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定データを図８に示す。白Ｈ０１にｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを投与した実施例２〜４においてＰｈｅからｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅへの置換にともなう質量増加（実測値：＋７７．９３Ｄａ、理論値：⁷⁹Ｂｒ − ^１Ｈ＝＋７７．９１Ｄａ）が観察された。Ｐｈｅ含有ペプチド断片に対するｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅ含有ペプチド断片の相対的ピーク強度は、通常量のＰｈｅを含む飼料で飼育した場合の実施例２よりも、１／２および１／５量のＰｈｅを含む飼料で飼育した場合の実施例３および４の方が強かった。

実施例２〜４の結果から明らかなように、アミノ酸番号４５０位が置換したＰｈｅＲＳαサブユニットをコードする遺伝子が絹糸腺特異的に発現しているカイコにｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを含む餌を与えることで、ｐ−Ｂｒ−Ｐｈｅを含有するＦｉｂＬタンパク質を得ることができた。

［ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の製造］
＜カイコの飼育＞
（実施例５）
実施例５で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ（一般式（１）で表されるアミノ酸において、Ｒ＝Ｎ_３）を含む合成飼料を給餌した。３日目までのカイコの飼育は前記実施例１と同様の方法で行い、３日目以降のカイコの飼育は、ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅの光反応を避けるため、遮光条件下にて行った。
（実施例６）
実施例６で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを含み、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／２に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例５と同様である。
（実施例７）
実施例７で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを含み、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例５と同様である。

（比較例７）
比較例７で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを含まないが、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例５と同様である。
（比較例８）
比較例８で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを含み、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例５と同様である。
（比較例９）
比較例９で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、ｐ-Ｎ_３-Ｐｈｅを含まないが、Ｐｈｅの含量を通常量のＰｈｅに対して１／５に低減させた合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例５と同様である。

表３に、実施例５〜７及び比較例７〜９に用いたカイコ系統、並びにカイコに給餌した餌中に含まれる非天然Ｐｈｅ種類および天然Ｐｈｅ量を示す。

＜ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重の測定＞
実施例５〜７及び比較例７〜９のカイコ幼虫の成長曲線を図９に、総摂食量と繭層重のグラフを図１０に示す。

図９に示すように、非天然アミノ酸ｐ‐Ｎ_３‐Ｐｈｅを投与した実施例５および６のトランスジェニックカイコは、比較例７〜９のカイコと同様の良好な成長を示した。実施例７のカイコでは成長がやや不良であったが、図１０に示すように、実施例５〜７のいずれのトランスジェニックカイコからも繭が得られることが確認された。

＜ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の分析＞
実施例５〜７および比較例７〜９のカイコより繭を得た。各繭層を約５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８ＭＬｉＢｒ水溶液に３５℃で４０分間加熱して溶解させた。この溶解液を８Ｍ尿素水溶液に約４．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約３ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、室温で３０分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＦｉｂＬのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより３７℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液に溶解した。この溶解液をＨＣＣＡで飽和させた０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液と混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に滴下して乾燥させた。これを試料として用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定データを図１１に示す。白Ｈ０１にｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ（０．５当量）を投与した実施例５〜７においてＰｈｅからｐ−ＮＨ_２−Ｐｈｅへの置換にともなう質量増加（実測値：＋１５．０６Ｄａ、理論値：^１４Ｎ^１Ｈ^１Ｈ − ^１Ｈ＝＋１５．０１Ｄａ）が観察された。Ｎ_３基はＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル調製時の還元処理でＮＨ_２基へ還元されたと考えられる。Ｐｈｅ含有ペプチド断片に対するｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ含有ペプチド断片の相対的ピーク強度は、通常量のＰｈｅを含む飼料で飼育した場合の実施例５よりも、１／２および１／５量のＰｈｅを含む飼料で飼育した場合の実施例６および７の方が強かった。

実施例５〜７の結果から明らかなように、アミノ酸番号４５０位が置換したＰｈｅＲＳαサブユニットをコードする遺伝子が絹糸腺特異的に発現しているカイコにｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを含む餌を与えることで、ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを含有するＦｉｂＬタンパク質を得ることができた。

［シルクタンパク質中に導入したｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅへのクリック反応］
実施例５〜７および比較例７〜９のカイコから得られた各繭層を８ＭＬｉＢｒに溶かし、エチニル基を有するビオチン試薬（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ４−Ａｌｋｙｎｅ）とのクリック反応を行った。反応スキームを図１２に示す。クリック反応後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離したＦｉｂＬおよびＦｉｂＨをＰＶＤＦメンブレンに転写し、ＨＲＰ修飾ストレプトアビジンを用いたウエスタンブロッティングを行った結果を図１３に示す。ＦｉｂＬについては白Ｈ０１にｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを投与した実施例５〜７において、ＦｉｂＨについては実施例６および７においてのみシグナルが見られた。また、いずれもＰｈｅの含量が減少するにしたがってより強いシグナルが観察された。
図１３に示した結果から、実施例５〜７のカイコにより得られるシルクタンパク質には、クリック反応によってビオチンが付加されたことが確認された。

ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅを導入したシルクの質量分析結果（図１１）からその導入量は比較的少ないと考えられたにもかかわらず、結合させたビオチンのシグナル（図１３）は非常に強かった。このことは、シルク分子中でのクリック反応が高効率に進行することを示唆している。Ｐｈｅは疎水性アミノ酸であるためＰｈｅ残基はシルク分子内部に位置している可能性が高く、これをｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ残基に置換しても当該ｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ残基をビオチンと反応させるのが困難であると想定されていたが、本発明のトランスジェニックカイコを用いて製造したｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ含有シルクは、シルク分子中でのｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ残基に対するクリック反応が高効率に進行しており、利用価値の極めて高いｐ−Ｎ_３−Ｐｈｅ含有シルクを得られることが確認された。

［ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の製造］
＜カイコの飼育＞
（実施例８）
実施例８で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。５齢起蚕から２日目まで通常組成の合成飼料を給餌した後、３日目以降、通常量のＰｈｅに対して０．５当量のｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ（一般式（１）で表されるアミノ酸において、Ｒ＝Ｃ≡ＣＨ）を含む合成飼料を給餌した。カイコの飼育は前記実施例１と同様の方法で行った。

（比較例１０）
比較例１０で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。給餌方法および飼育方法は実施例８と同様である。
（比較例１１）
比較例１１で使用したカイコは、トランスジェニックカイコである白Ｈ０１である。餌はｐ-Ｅｔｈ-Ｐｈｅを含まない通常組成の合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例８と同様である。
（比較例１２）
比較例１２で使用したカイコは、白／ＣＳ系統のカイコである。餌はｐ-Ｅｔｈ-Ｐｈｅを含まない通常組成の合成飼料を給餌した。飼育方法は実施例８と同様である。

表３に、実施例８及び比較例１０〜１２に用いたカイコ系統、並びにカイコに給餌した餌中に含まれる非天然Ｐｈｅ種類および天然Ｐｈｅ量を示す。

＜ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ投与時のカイコ幼虫の体重の測定＞
実施例８及び比較例１０〜１２のカイコ幼虫の成長曲線を図１４に、総摂食量と繭層重のグラフを図１５に示す。

図１４及び図１５に示したように、実施例８のカイコでは虫体重と平均繭重量が減少する傾向は見られたものの、実施例８のカイコにおいて十分な重量の繭が得られることが確認された。

＜ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ含有シルクタンパク質の分析＞
実施例８および比較例１０〜１２のカイコより繭を得た。各繭層を約５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８ＭＬｉＢｒ水溶液に３５℃で４０分間加熱して溶解させた。この溶解液を８Ｍ尿素水溶液に約４．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約３ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、室温で３０分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＦｉｂＬのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより３７℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液に溶解した。この溶解液をＨＣＣＡで飽和させた０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルの２：１混合液と混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に滴下して乾燥させた。白Ｈ０１にｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ（０．５当量）を投与した実施例８においてＰｈｅからｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅへの置換にともなう質量増加（実測値：＋２４．０１Ｄａ、理論値：^１２Ｃ^１２Ｃ^１Ｈ − ^１Ｈ＝＋２４．００Ｄａ）が観察された。

実施例８の結果から明らかなように、アミノ酸番号４５０位が置換したＰｈｅＲＳαサブユニットをコードする遺伝子が絹糸腺特異的に発現しているカイコにｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを含む餌を与えることで、ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを含有するＦｉｂＬタンパク質を得ることができた。

［シルクタンパク質中に導入したｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅへのクリック反応］
実施例８および比較例１０〜１２のカイコから得られた各繭層を８ＭＬｉＢｒに溶かし、アジド基を有するビオチン試薬（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ４−Ａｚｉｄｅ）とのクリック反応を行った。反応スキームは図１２においてアジド基とエチニル基を入れ替えたものに相当する。クリック反応後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離したＦｉｂＬをＰＶＤＦメンブレンに転写し、ＨＲＰ修飾ストレプトアビジンを用いたウエスタンブロッティングを行った結果を図１７に示す。白Ｈ０１にｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを投与した実施例８においてのみシグナルが見られた。
図１７に示した結果から、実施例８のカイコにより得られるシルクタンパク質は、クリック反応によってビオチンが修飾されたことが確認された。

図１６および図１７の結果から明らかなように、アミノ酸番号４５０位が置換したＰｈｅＲＳαサブユニットをコードする遺伝子が絹糸腺特異的に発現しているカイコにｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを含む餌を与えることで、ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを含有するＦｉｂＬタンパク質を得ることができた。

ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅを導入したシルクの質量分析結果（図１６）からその導入量は比較的少ないと考えられたにもかかわらず、結合させたビオチンのシグナル（図１７）を明瞭に観察できた。このことは、シルク分子中でのクリック反応が高効率に進行することを示唆している。Ｐｈｅは疎水性アミノ酸であるためＰｈｅ残基はシルク分子内部に位置している可能性が高く、これをｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ残基に置換しても当該ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ残基をビオチンと反応させるのが困難であると想定されていたが、本発明のトランスジェニックカイコを用いて製造したｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ含有シルクは、ｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ残基に対するクリック反応が高効率に進行しており、利用価値の極めて高いｐ−Ｅｔｈ−Ｐｈｅ含有シルクを得られることが確認された。

以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

本発明のトランスジェニックカイコを用いて製造された非天然アミノ酸含有タンパク質、例えば非天然アミノ酸含有シルクタンパク質は、テキスタイル・医療分野・機能性材料等の分野に広く適用可能であり、それぞれの用途により適した改変シルクを提供できる可能性を有している。また、本発明によって新たなシルクの用途を開拓できる可能性がある。

Claims

トランスジェニックカイコに非天然アミノ酸を投与する工程を有し、
前記トランスジェニックカイコは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４５０位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４０７位以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、フェニルアラニン特異的ｔＲＮＡに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、該ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有し、
前記非天然アミノ酸は、下記一般式（１）で表されるアミノ酸であることを特徴とする非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
［式中、Ｒはアジド基又はエチニル基を表す。］
前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ＤＮＡを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである請求項１に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
前記ＤＮＡを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインＬ鎖由来のプロモーターである請求項１又は２に記載の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。