JP2024000343A - カイコ、非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法、及びシルクタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【課題】チロシンをターゲットとする遺伝暗号拡張手法により、非天然アミノ酸含有タンパク質を製造可能なカイコを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列等の所定のアミノ酸配列を含み、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有する、アミノアシル-tRNA合成酵素。前記非天然アミノ酸は、チロシン類縁体であることが好ましい。【選択図】なし
Description
本発明は、カイコ、非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法、及びシルクタンパク質に関する。
シルクは、環境への負荷の低い循環型素材として、繊維素材としてのみならず医療素材、電子材料、産業用資材等として多方面での活用が期待されている。
バイオテクノロジーや化学的手法を利用して天然シルクの性質を改変する技術は、多方面への活用を進める上で重要な技術である。近年、天然には存在しない人工アミノ酸を一次構造中に直接導入する遺伝暗号拡張手法が、新たな形でのタンパク質改変を可能にするバイオテクノロジーとして発展している。
しかし、カイコ個体ではフェニルアラニン(Phe)又はメチオニン(Met)をターゲットとする遺伝暗号拡張手法が報告されているのみである(特許文献1~2、非特許文献1~3)。
しかし、カイコ個体ではフェニルアラニン(Phe)又はメチオニン(Met)をターゲットとする遺伝暗号拡張手法が報告されているのみである(特許文献1~2、非特許文献1~3)。
寺本英敏 "カイコの遺伝暗号拡張による非天然アミノ酸含有タンパク質素材の創製" 生化学 2021, 93, 298-304.
Teramoto H. et al. "Genetic Code Expansion of the Silkworm Bombyx mori to Functionalize Silk Fiber" ACS Synth. Biol. 2018, 7, 801-806.
Teramoto H. and Kojima K. "Incorporation of Methionine Analogues Into Bombyx mori Silk Fibroin for Click Modifications" Macromol. Biosci. 2015, 15, 719-727.
しかし、Pheはフィブロインの非結晶領域にのみ少量(35個/分子)存在し、大規模な化学修飾やバルク状態でのシルクの物性を改変するためのターゲットとしては適していない。Metも非結晶領域にのみ存在し、さらに少数(4個/分子)である。
一方、チロシン(Tyr)は、フィブロインの結晶領域と非結晶領域の双方に存在し、Phe及びMetに比べ存在量が多い(287個/分子)。
そこで本発明は、チロシン(Tyr)をターゲットとする遺伝暗号拡張手法により、非天然アミノ酸含有タンパク質を製造可能なカイコ、及び非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、チロシン類縁体を含有する、シルクタンパク質を提供することを目的とする。
また、本発明は、チロシン類縁体を含有する、シルクタンパク質を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、特定のチロシル-tRNA合成酵素を発現するカイコが、チロシン(Tyr)類縁体等の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造に優れるものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の態様を有する。
すなわち、本発明は以下の態様を有する。
<1> 以下の(a1)~(a3)のいずれか一つのアミノ酸配列を含み、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するアミノアシル-tRNA合成酵素を、絹糸腺に発現する、カイコ。
(a1)配列番号1に示されるアミノ酸配列
(a2)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、1~数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
(a3)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
<2> 前記非天然アミノ酸はチロシン類縁体である、前記<1>に記載のカイコ。
<3> 前記非天然アミノ酸は、下記一般式(1)で表されるアミノ酸である、前記<1>に記載のカイコ。
[式(1)中、Rはハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
<4> 前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する、前記<1>~<3>のいずれか一つに記載のカイコ。
<5> 前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ポリヌクレオチドを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである、前記<4>に記載のカイコ。
<6> 前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインL鎖、フィブロインH鎖、又はP25/fhx由来のプロモーターである、前記<4>に記載のカイコ。
<7> 前記<1>~<6>のいずれか一つに記載のカイコに、非天然アミノ酸を投与する工程を有する、非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
<8> 前記カイコが、前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する、前記<7>に記載の製造方法。
<9> 前記非天然アミノ酸はチロシン類縁体である、前記<7>又は<8>に記載の製造方法。
<10> 前記非天然アミノ酸は、下記一般式(1)で表されるアミノ酸である、前記<7>~<9>のいずれか一つに記載の製造方法。
[式(1)中、Rはハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
<11> 前記非天然アミノ酸含有タンパク質が、シルクタンパク質である、前記<7>~<10>のいずれか一つに記載の製造方法。
<12> チロシン類縁体を含有し、前記チロシン類縁体は、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子がアジド基によって置換されている、シルクタンパク質。
<13> 前記シルクタンパク質がフィブロインを含む、前記<12>に記載のシルクタンパク質。
(a1)配列番号1に示されるアミノ酸配列
(a2)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、1~数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
(a3)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
<2> 前記非天然アミノ酸はチロシン類縁体である、前記<1>に記載のカイコ。
<3> 前記非天然アミノ酸は、下記一般式(1)で表されるアミノ酸である、前記<1>に記載のカイコ。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
<4> 前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する、前記<1>~<3>のいずれか一つに記載のカイコ。
<5> 前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ポリヌクレオチドを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである、前記<4>に記載のカイコ。
<6> 前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインL鎖、フィブロインH鎖、又はP25/fhx由来のプロモーターである、前記<4>に記載のカイコ。
<7> 前記<1>~<6>のいずれか一つに記載のカイコに、非天然アミノ酸を投与する工程を有する、非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
<8> 前記カイコが、前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する、前記<7>に記載の製造方法。
<9> 前記非天然アミノ酸はチロシン類縁体である、前記<7>又は<8>に記載の製造方法。
<10> 前記非天然アミノ酸は、下記一般式(1)で表されるアミノ酸である、前記<7>~<9>のいずれか一つに記載の製造方法。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
<11> 前記非天然アミノ酸含有タンパク質が、シルクタンパク質である、前記<7>~<10>のいずれか一つに記載の製造方法。
<12> チロシン類縁体を含有し、前記チロシン類縁体は、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子がアジド基によって置換されている、シルクタンパク質。
<13> 前記シルクタンパク質がフィブロインを含む、前記<12>に記載のシルクタンパク質。
本発明によれば、チロシン(Tyr)をターゲットとする遺伝暗号拡張手法により、非天然アミノ酸含有タンパク質を製造可能なカイコ、及び非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を提供できる。
また、本発明によれば、チロシン類縁体を含有する、シルクタンパク質を提供できる。
また、本発明によれば、チロシン類縁体を含有する、シルクタンパク質を提供できる。
以下、本発明のカイコ、非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法、及びシルクタンパク質の実施形態を説明する。
≪カイコ≫
実施形態のカイコは、以下の(a1)~(a3)のいずれか一つのアミノ酸配列を含み、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するアミノアシル-tRNA合成酵素を、絹糸腺に発現する。
(a1)配列番号1に示されるアミノ酸配列
(a2)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、1~数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
(a3)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
実施形態のカイコは、以下の(a1)~(a3)のいずれか一つのアミノ酸配列を含み、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するアミノアシル-tRNA合成酵素を、絹糸腺に発現する。
(a1)配列番号1に示されるアミノ酸配列
(a2)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、1~数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
(a3)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
<アミノアシル-tRNA合成酵素>
tRNAのアミノアシル化は、それぞれのアミノ酸に対応するアミノアシル-tRNA合成酵素(aaRS)によって触媒される。aaRSはタンパク質を構成する20種のアミノ酸間で厳密な基質特異性を有している。例えば、チロシンに対応するaaRSは、チロシル-tRNA合成酵素(TyrRS)と呼ばれる。
前記(a1)~(a3)のアミノ酸配列を有するタンパク質は、カイコTyrRSのポリペプチド分子の全長に該当するものであって、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有する。
tRNAのアミノアシル化は、それぞれのアミノ酸に対応するアミノアシル-tRNA合成酵素(aaRS)によって触媒される。aaRSはタンパク質を構成する20種のアミノ酸間で厳密な基質特異性を有している。例えば、チロシンに対応するaaRSは、チロシル-tRNA合成酵素(TyrRS)と呼ばれる。
前記(a1)~(a3)のアミノ酸配列を有するタンパク質は、カイコTyrRSのポリペプチド分子の全長に該当するものであって、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有する。
即ち、より具体的には、実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素は、上記の(a1)~(a3)のいずれか一つのアミノ酸配列から構成され、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質であるといえる。
このチロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するタンパク質は、該活性を有していればよいのであって、前記(a1)~(a3)のいずれかの配列に加えて、タンパク質タグ等の任意の配列(例えば、ヒスチジンタグ、HAタグ、GFP等)をさらに有していてもよい。任意の配列は、タンパク質のC末端に付加されていることが好ましい。
配列番号2に、野生型のカイコチロシル-tRNA合成酵素のアミノ酸配列を示す。
本実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素は、配列番号1に示されるように、配列番号2のアミノ酸配列において、少なくとも、アミノ酸番号36位にアミノ酸置換を有する。
本実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素は、配列番号1に示されるように、配列番号2のアミノ酸配列において、少なくとも、アミノ酸番号36位にアミノ酸置換を有する。
配列番号1の、配列番号2のアミノ酸配列の36位のTyr(Y)からの置換は、以下である。
36位 Tyr(Y)からGly(G)への置換
36位 Tyr(Y)からGly(G)への置換
上記の(a2)のアミノ酸配列の、アミノ酸番号36位以外の部位において、欠失、挿入、置換若しくは付加されてよいアミノ酸の数としては、1~50個であってもよく、1~40個であってもよく、1~30個であってもよく、1~20個であってもよく、1~10個であってもよく、1~5個であってもよく、1~3個であってもよく、1~2個であってもよい。
上記の(a3)のアミノ酸配列の、アミノ酸番号36位以外の部位における同一性としては、80%以上であってもよく、85%以上であってもよく、90%以上であってもよく、95%以上であってもよく、99%以上であってもよい。
本実施形態のカイコが発現するアミノアシル-tRNA合成酵素は、カイコによる非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法において、高効率に非天然アミノ酸を含有させることを可能とする、非常に有用なものである。
実施形態のカイコが発現するアミノアシル-tRNA合成酵素は、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有する。当該非天然アミノ酸は、L体であってよい。
当該非天然アミノ酸としては、チロシン類縁体であることが好ましい。チロシン類縁体としては、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることが好ましく、チロシン側鎖のベンゼン環の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることがより好ましい。前記置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子;アセチル基等のアシル基;エチニル基;シアノ基;アジド基;ニトロ基等が挙げられ、ハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基が好ましく、ハロゲン原子又はアジド基がより好ましい。
当該非天然アミノ酸としては、チロシン類縁体であることが好ましい。チロシン類縁体としては、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることが好ましく、チロシン側鎖のベンゼン環の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることがより好ましい。前記置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子;アセチル基等のアシル基;エチニル基;シアノ基;アジド基;ニトロ基等が挙げられ、ハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基が好ましく、ハロゲン原子又はアジド基がより好ましい。
チロシン類縁体としては、下記一般式(1)で表されるチロシン類縁体が好ましい。
[式(1)中、Rはハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
nは1~3のいずれかの整数であってよく、1又は2であってよく、1であってよい。
式(1)中、Rはハロゲン原子、アセチル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基であることが好ましい。
式(1)中、Rはハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基であることがより好ましく、ハロゲン原子又はアジド基であることがさらに好ましい。
前記Rのハロゲン原子としては、塩素、臭素、又はヨウ素が好ましい。
前記Rのハロゲン原子としては、塩素、臭素、又はヨウ素が好ましい。
上記式(1)において、例えばnが2である場合のチロシン類縁体の一例として、3,5-ブロモチロシン、3-ブロモ-5-ニトロチロシン、2-フルオロ-3-アジドチロシン等を例示できる。
前記一般式(1)で表されるチロシン類縁体としては、下記一般式(1-1)で表されるチロシン類縁体であることが好ましい。
[式(1-1)中、R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。ただし、R1、R2及びR3の全てが水素原子となることはない。]
前記式(1-1)における前記R1、R2及びR3としては、それぞれ独立して、ハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基であることが好ましく、ハロゲン原子又はアジド基であることがより好ましい。
前記一般式(1-1)で表されるチロシン類縁体としては、下記一般式(1-2)で表されるチロシン類縁体であることが好ましい。
[式(1-2)中、R2はハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基を表す。]
前記式(1-2)における前記R2としては、ハロゲン原子、又はアジド基が好ましい。
<カイコ>
実施形態のカイコは、上記の実施形態に係るアミノアシル-tRNA合成酵素を絹糸腺に発現するものである。
実施形態のカイコは、上記の実施形態に係るアミノアシル-tRNA合成酵素を絹糸腺に発現するものである。
実施形態のカイコが絹糸腺に発現するアミノアシル-tRNA合成酵素としては、上記<アミノアシル-tRNA合成酵素>で例示したものが挙げられる。
実施形態のカイコによれば、絹糸腺で作られるタンパク質に対し本来のコドンとは通常は対応しないアミノ酸(非天然アミノ酸)を導入することが可能である。
実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素をカイコ全体に発現させることによって生じる毒性を回避するという観点からは、実施形態のカイコは、本発明の一実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素を絹糸腺特異的に発現するものであることが好ましい。
絹糸腺は、前部絹糸腺、中部絹糸腺及び後部絹糸腺に大別される。実施形態のカイコは、本発明の一実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素を後部絹糸腺に発現することが好ましく、後部絹糸腺特異的に発現することがより好ましい。
実施形態のカイコは、実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有するものであることが好ましい。実施形態のカイコは、当該ポリヌクレオチドをゲノム上に有するものであってよく、当該ポリヌクレオチド及びプロモーターがゲノム上に導入された遺伝子組換体、形質転換体、トランスジェニック動物等であってよい。ポリヌクレオチドとしてはDNAであることが好ましい。
実施形態のアミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、上記の(a1)~(a3)のいずれか一つのアミノ酸配列に対応するものであればよい。
一例として、配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列(実施例に示すカイコが有するもの)を、配列番号3に示す。
上記の絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしては、前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させることができるプロモーターであれば特に制限されず、絹糸腺の上記三つの部位のいずれか一つ又は二つ以上の組み合わせからなる部位で発現、好ましくは特異的に発現させることができるプロモーターであってもよい。
中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとして、例えば、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが挙げられる。中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、中部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの中部絹糸腺で生産されるタンパク質としてはセリシンが挙げられる。
また、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしては、フィブロインL鎖(FibL)タンパク質をコードするDNAのプロモーター、フィブロインH鎖(FibH)タンパク質をコードするDNAのプロモーター、P25/fhxタンパク質をコードするDNAのプロモーター等が挙げられ、フィブロインL鎖(FibL)タンパク質をコードするDNAのプロモーターが好ましい。後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、後部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの後部絹糸腺で生産されるタンパク質はフィブロインであり、フィブロインがカイコの繭糸タンパク質の大部分を占めているため、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることで、シルクタンパク質の性質の制御がより容易となる。
中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとして、例えば、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが挙げられる。中部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、中部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの中部絹糸腺で生産されるタンパク質としてはセリシンが挙げられる。
また、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターとしては、フィブロインL鎖(FibL)タンパク質をコードするDNAのプロモーター、フィブロインH鎖(FibH)タンパク質をコードするDNAのプロモーター、P25/fhxタンパク質をコードするDNAのプロモーター等が挙げられ、フィブロインL鎖(FibL)タンパク質をコードするDNAのプロモーターが好ましい。後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることにより、後部絹糸腺で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を導入することができる。カイコの後部絹糸腺で生産されるタンパク質はフィブロインであり、フィブロインがカイコの繭糸タンパク質の大部分を占めているため、後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを用いることで、シルクタンパク質の性質の制御がより容易となる。
前記プロモーターを用いる際には、同時に、前記ポリヌクレオチドの発現、その後のタンパク質への翻訳等を制御するための他の配列を用いてもよく、そのような配列としては例えば3’UTR(非翻訳領域)、5’UTR配列等が挙げられる。
実施形態のカイコの作出に用いるホストのカイコとしては、後述する実施形態の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法において、非天然アミノ酸を含むタンパク質を製造できるカイコであれば特に制限されず、例えば、遺伝子組換え作製用として広く用いられるw1-pnd等の系統を用いても構わないが、飼料として投与された非天然アミノ酸のカイコ個体への取り込み量を増加させるという観点から、人工飼料摂食性に優れたカイコを用いることが好ましい。例えば、日01号、日509号、日510号、日603号、日604号、中604号、中605号等の品種が好ましく、非天然アミノ酸を含む人工飼料の1個体あたりの摂食量が多い白/CS(系統名:MCS601)がより好ましい。
また、実施形態のカイコを実用系統と交配したF1交雑種を作出してもよい。実用系統としては、日137号、日202号、日509号、日510号、日509号×日510号、日603号×日604号、MNS1、MN2、MNS200、MN202、中146号、中509号×中510号、中604号×中605号、MCS4、日137号×中146号等が挙げられる。
また、実施形態のカイコを実用系統と交配したF1交雑種を作出してもよい。実用系統としては、日137号、日202号、日509号、日510号、日509号×日510号、日603号×日604号、MNS1、MN2、MNS200、MN202、中146号、中509号×中510号、中604号×中605号、MCS4、日137号×中146号等が挙げられる。
また、実施形態のカイコの作出に用いるカイコとしては、前述のとおり特に制限されず、非休眠卵を産下する性質のカイコまたは休眠卵を産下する性質のカイコの、どちらも用いることが可能である。休眠卵を産下する性質のカイコを用いる場合には、「低温暗催青法」を用いて非休眠卵を産下させることができる。すなわち、胚子を胸肢発生期以後、特に剛毛発生期以後を15℃程度に保護する。この低温期間は、日数にして10日以上必要である。胚の反転から頭部着色の頃までを暗黒に保つ。その後孵化した幼虫を飼育して得たカイコ蛾は非休眠卵を産下する。(蚕種総論 著者:高見丈夫 発行:全国蚕種協会(昭和44年5月31日))。
低温暗催青法以外の方法として、幼虫期の光条件をコントロールすることで非休眠卵を産下させる方法(特開2003-88274参照)を採択してもよい。
低温暗催青法等の方法を用いても非休眠卵が得られないカイコを使用する場合は、カイコ卵を浸酸処理することで、卵を休眠打破してもよい。前記浸酸処理の具体的な方法として、採卵から3~4時間後のカイコ卵を室温で30分間程度塩酸に浸漬させ、水洗により塩酸を洗い流した後、卵を風乾させることが挙げられる。前記塩酸は、例えば比重1.11のものを用いることができる(Ai-Chun Zhao et.al., Insect Science (2012) Vol.19, pp.172-182.参照)。
実施形態のカイコの作出方法としては、例えばカイコ卵へポリヌクレオチドを導入する方法が挙げられる。カイコ卵へのポリヌクレオチドの導入は、例えば、カイコの発生初期卵へ、トランスポゾンをベクターとして注射する方法(Tamura,T. ,et.al.,Nature Biotechnology,(2000)Vol.18, pp.81-84.参照)に従って行うことができる。
例えば、トランスポゾンの逆位末端反復配列(Handler,A.M.,et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,(1998)Vol.95, pp.7520-7525.参照。)の間に上記DNAを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクター(ヘルパーベクター)をカイコ卵に導入する方法が挙げられる。ヘルパーベクターとしては、pHA3PIG (Tamura, T., et.al., Nature Biotechnology,(2000)Vol.18, pp.81-84.参照。)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書におけるトランスポゾンとしては、piggyBacが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリナー(mariner)、ミノス(minos)等を用いることもできる(Shimizu,K.,Insect Mol.Biol.,(2000)Vol.9,pp.277-281.参照。)。
また、実施形態のカイコの作出にはバキュロウイルスベクターを使用することもできる(Yamao,M.,et.al., Genes Dev.(1999)Vol.13,pp.511-516.参照。)。
上述したトランスポゾンをベクターとして注射する方法、バキュロウイルスベクターを使用する方法、及びその他のカイコ卵へのポリヌクレオチドの導入方法は前記アミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して用いてもよく、また、実施形態のカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造において、製造される任意のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して用いてもよい。
カイコ卵へのポリヌクレオチドの導入は、当業者においては一般的な方法により実施することができる。例えば、以下のように、特開2012-187123号公報に記載の方法で実施することができる。
カイコ卵へポリヌクレオチド注入用の管を使用して直接卵内へポリヌクレオチドを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的または化学的に卵殻に穴を空け、該穴からポリヌクレオチドを導入する。
カイコ卵へポリヌクレオチド注入用の管を使用して直接卵内へポリヌクレオチドを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的または化学的に卵殻に穴を空け、該穴からポリヌクレオチドを導入する。
本実施形態において、物理的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば針、微小レーザー等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。中でも、針を用いた方法によって卵殻に穴を空ける方法が好ましい。用いられる針としては、カイコの卵殻に穴を空けることができるものであれば、その材質、強度等は、特に制限されない。一方、化学的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば薬品(次亜塩素酸等)等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。
本実施形態において、ポリヌクレオチド導入方法としては、上記のカイコ卵に物理的または化学的に穴を空け、ポリヌクレオチド注入用の管を該穴から卵内に挿入し、ポリヌクレオチドを注入する工程を、針とポリヌクレオチド注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行うことが好ましい。マニュピュレーターを構成要素の1つとする装置を使用できる。
このような装置しては、解剖顕微鏡、照明装置、可動式のステージ、顕微鏡に金具で固定した粗動マニュピュレーター、このマニュピュレーターに付けたマイクロマニュピュレーター、ポリヌクレオチドを注射するための空気圧を調整するインジェクターから構成されるものが挙げられる。なお、使用される装置としては、特許第1654050号公報に記載の装置または該装置を改良した装置が挙げられる。
カイコ卵にポリヌクレオチドが導入されたか否かは、例えば、注射したポリヌクレオチドを卵から再度抽出して測定する方法(Nagaraju,J., et.al., Appl.Entomol.Zool.,(1996)Vol.31,pp.589-598.参照。)や、注射した遺伝子としてのポリヌクレオチドの卵内での発現を見る方法(Tamura,T.,et.al.,(1990)Jpn. J. Genet.,Vol.65,pp.401-410.参照。)等によって確認することができる。カイコ卵に導入されたポリヌクレオチドが、カイコの染色体に組込まれ、遺伝子組換えカイコが得られたか否かは、たとえばポリヌクレオチドを注射した卵から育った成虫を交配し(相互に、あるいは非組換えカイコと)受精卵を得、その産卵後6~10日にマーカー遺伝子(たとえば、EGFPや、DsRed,CFP,YFPなど)の発現を蛍光顕微鏡で観察することや、体色マーカー遺伝子(たとえば、Bm-aaNATなど)の発現を目視で確認することによって可能である。
カイコ卵に導入したポリヌクレオチドがカイコにおいて発現しているかどうかは、インジェクションした卵(G0世代)から成長した個体が産んだ卵(G1世代)については、マーカー遺伝子の発現を蛍光顕微鏡で観察して確認する。なお、カイコからトータルRNAを抽出し、抽出したRNAをテンプレートに、RT-PCRにより導入遺伝子の確認をしてもよい。
また、カイコに導入したポリヌクレオチドがカイコ個体のどの部位で発現しているのかを確認する方法は、例えば、幼虫から組織を摘出し、各組織別に発現を確認する方法や、CFP、GFP、EGFP、YFP、DsRED等の既知のレポーター遺伝子等を用い、蛍光顕微鏡を用いてカイコ個体を観察する方法等によって確認することができる。
≪非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法≫
実施形態の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法は、本発明の一実施形態のカイコに、非天然アミノ酸を投与する工程を有する。
実施形態の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法は、本発明の一実施形態のカイコに、非天然アミノ酸を投与する工程を有する。
本明細書において「非天然アミノ酸含有タンパク質」とは、タンパク質が、非天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基を含有することを意味する。
本実施形態で製造されるタンパク質は、タンパク質の本来のチロシン残基の位置の一部又は全部に、非天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基を含有してもよい。
実施形態のカイコは、上記≪カイコ≫で例示したものが挙げられる。
前記カイコは、前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有するものであることが好ましい。
非天然アミノ酸とは、通常はタンパク質を構成しないアミノ酸を意味する。タンパク質を構成するアミノ酸とは、20種の標準天然アミノ酸、セレノシステイン、及びピロリジンを意味する。すなわち、本明細書において、非天然アミノ酸とは、タンパク質を構成するこれらアミノ酸の類縁体(修飾アミノ酸)、又はタンパク質を構成するこれらアミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。
実施形態の非天然アミノ酸含有タンパク質に含まれるアミノ酸はL体であってよい。
実施形態のカイコは、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現する。そのため、用いられる非天然アミノ酸はチロシン類縁体であることが好ましい。チロシン類縁体としては、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることが好ましく、チロシン側鎖のベンゼン環の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることがより好ましい。前記置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子;アセチル基等のアシル基;エチニル基;シアノ基;アジド基;ニトロ基等が挙げられ、ハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基が好ましく、ハロゲン原子又はアジド基がより好ましい。
チロシン類縁体としては、下記一般式(1)で表されるチロシン類縁体が好ましい。
[式(1)中、Rはハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
nは1~3のいずれかの整数であってよく、1又は2であってよく、1であってよい。
式(1)中、Rはハロゲン原子、アセチル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基であることが好ましい。
式(1)中、Rはハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基であることがより好ましく、ハロゲン原子又はアジド基であることがさらに好ましい。
前記Rのハロゲン原子としては、塩素、臭素、又はヨウ素が好ましい。
前記Rのハロゲン原子としては、塩素、臭素、又はヨウ素が好ましい。
前記一般式(1)で表されるチロシン類縁体としては、下記一般式(1-1)で表されるチロシン類縁体であることが好ましい。
[式(1-1)中、R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。ただし、R1、R2及びR3の全てが水素原子となることはない。]
前記式(1-1)における前記R1、R2及びR3としては、それぞれ独立して、ハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基であることが好ましく、ハロゲン原子又はアジド基であることがより好ましい。
前記一般式(1-1)で表されるチロシン類縁体としては、下記一般式(1-2)で表されるチロシン類縁体であることが好ましい。
[式(1-2)中、R2はハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基を表す。]
前記式(1-2)における前記R2としては、ハロゲン原子、又はアジド基が好ましい。
製造される非天然アミノ酸含有タンパク質は特に制限されることはなく、遺伝子組換え等によって導入されるなどして、絹糸腺で発現させた任意のタンパク質を含んでよく、カイコが絹糸腺において生産するシルクタンパク質が好ましい。シルクタンパク質としては、フィブロイン及び/又はセリシンを含むものが挙げられ、フィブロインを含むものが好ましい。前記フィブロインとしては、フィブロインL鎖及び/又はフィブロインH鎖を含む。
絹糸腺において任意のタンパク質をコードする外来性のポリヌクレオチドを強制発現させ、任意のタンパク質を絹糸腺に生産させてもよい。
絹糸腺において任意のタンパク質をコードする外来性のポリヌクレオチドを強制発現させ、任意のタンパク質を絹糸腺に生産させてもよい。
絹糸腺で作られるタンパク質は繭糸としてカイコ体外に分泌されるため、特別の回収方法を用いずとも回収が容易であり、また多量のタンパク質を容易に得ることができる。
実施形態のカイコを用いた非天然アミノ酸含有タンパク質の製造にあたって、タンパク質に含有される非天然アミノ酸の種類及び含有量を確認する方法としては、種々の方法を選択できるが、質量分析法による分析を行うのが好ましく、MALDI-TOF-MS法により質量スペクトルを測定する方法が特に好ましい。
本実施形態の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法によれば、製造される非天然アミノ酸含有タンパク質に、本来のタンパク質の性質や機能を向上又は改変させることができる。更には、本来のタンパク質にない新たな性質や機能を付与することができる。例えば、非天然アミノ酸の導入手法をシルクタンパク質に適用することで、シルクタンパク質に非天然アミノ酸を含有させ、本来のシルクにはない性質や機能を付与することができる。
本実施形態の非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法を用いることで、従来の改変手法における問題点を解決できる。例えば、化学反応にともなう毒性の懸念が小さい、「後加工」であるため機能性分子が失活しないなどの利点があり、特異的な化学反応が可能な官能基の導入により、従来の「化学的方法」によらない精密かつクリーンなタンパク質の化学改変を行うことが可能である。例えば、アジド基又はエチニル基を有する非天然アミノ酸をシルクタンパク質にとりこませることで、アジド基又はエチニル基との反応を介して、任意のタンパク質、ペプチド、薬剤、色素、糖鎖、架橋分子、キレート分子等の分子をシルクに結合させることが可能である。このような改変により、シルクの物性そのものを変化させることが可能である。従って、カイコが絹糸腺において生産するタンパク質の有用性を飛躍的に増大させる。また、シアノ基やフッ素など特徴的な赤外吸収や核磁気共鳴を示す原子(団)を残基特異的に導入することで、これまで不可能であった局所的なシルクの構造情報が得られる。
前記非天然アミノ酸含有タンパク質を含む材料、又は前記非天然アミノ酸含有タンパク質からなる材料の形態は特に制限されず、例えば、溶液状、パウダー状、繊維状、スポンジ状、フィルム状、ブロック状などの形態が挙げられる。
本発明の一実施形態のカイコに、非天然アミノ酸を投与することとしては、経口投与が挙げられる。経口投与としては、非天然アミノ酸を含有する飼料を、前記カイコに給餌することが挙げられる。
本実施形態で投与する非天然アミノ酸は、天然アミノ酸と同時に与えることができ、用いる非天然アミノ酸は1種類のみでもよく、2種類以上の非天然アミノ酸を同時に与えることもできる。
本実施形態におけるカイコの飼育方法は、当業者において一般的なカイコの飼育方法に従い、非天然アミノ酸を含有する飼料を与え、行うことができる。例えば、「文部省(1978) 蚕種製造.pp193、実教出版社、東京」に記載の方法に従って飼育を行うことができる。
また、光によって化学反応が引き起こされる官能基を有する非天然アミノ酸をカイコに給餌する場合、非天然アミノ酸に光が照射されない条件下で、カイコを飼育することが好ましい。好ましい飼育方法として、光を一切照射しない連続暗期環境下でカイコを飼育する方法が挙げられる。または、カイコには光が照射されていてもよいが、前記の光によって化学反応が引き起こされる官能基を有する非天然アミノ酸には光が照射されない条件下で、カイコを飼育する方法が挙げられ、例えば、給餌する餌の周囲の空間を物理的に光源から遮蔽し、該非天然アミノ酸をカイコに与え、さらに、カイコが絹糸腺から該非天然アミノ酸を含有するタンパク質を生産する際に、該タンパク質に光が照射されない環境でカイコを飼育する等の方法が挙げられる。
本実施形態のカイコを用いたタンパク質製造方法は、残基特異的非天然アミノ酸導入法である。したがって、本実施形態によれば該カイコに投与する非天然アミノ酸の種類を変えるだけで、同一の系統のカイコから任意の種類の非天然アミノ酸を含有するタンパク質を製造することができる。
≪シルクタンパク質≫
本発明の一実施形態として、チロシン類縁体を含有するシルクタンパク質を提供する。
本発明の一実施形態として、チロシン類縁体を含有するシルクタンパク質を提供する。
本明細書において、シルクタンパク質がチロシン類縁体を含有することとは、シルクタンパク質が、チロシン類縁体に由来するアミノ酸残基を含有することを意味する。
実施形態のシルクタンパク質は、シルクタンパク質の本来のチロシン残基の位置の一部又は全部に、前記チロシン類縁体に由来する残基を含有してもよい。
チロシン類縁体としては、上記の≪カイコ≫及び≪非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法≫で例示したものが挙げられる。
チロシン類縁体としては、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることが好ましく、チロシン側鎖のベンゼン環の少なくとも一つ以上の水素原子が置換基によって置換されていることがより好ましい。前記置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子;アセチル基等のアシル基;エチニル基;シアノ基;アジド基;ニトロ基等が挙げられ、ハロゲン原子、アジド基、又はニトロ基が好ましく、アジド基がより好ましい。
チロシン類縁体としては、下記一般式(1)で表されるチロシン類縁体が好ましい。
[式(1)中、Rはハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
nはRの数を表し、1~4のいずれかの整数であり、nが2以上である場合、R同士は互いに同一でも異なっていてもよい。]
nは1~3のいずれかの整数であってよく、1又は2であってよく、1であってよい。
前記Rにおけるハロゲン原子としては、塩素、臭素、又はヨウ素が好ましい。
実施形態のシルクタンパク質において、前記Rは、アジド基であることが好ましい。
また、実施形態のシルクタンパク質における好ましいチロシン類縁体として、上記の≪カイコ≫及び≪非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法≫で例示した、前記一般式(1-1)で表されるチロシン類縁体や、前記一般式(1-2)で表されるチロシン類縁体を例示できる。
前記式(1-1)中、R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アシル基、エチニル基、シアノ基、アジド基、又はニトロ基を表す。ただし、R1、R2及びR3の全てが水素原子となることはない。
実施形態のシルクタンパク質において、前記式(1-1)における、前記R1、R2及びR3は、アジド基であることが好ましい。
実施形態のシルクタンパク質において、前記式(1-2)における、前記R2は、アジド基であることが好ましい。
シルクタンパク質としては、フィブロイン及び/又はセリシンを含むものが挙げられ、フィブロインを含むものが好ましく、前記シルクタンパク質を含むシルクを例示できる。前記フィブロインとしては、フィブロインL鎖及び/又はフィブロインH鎖を含む。
シルクタンパク質がフィブロインを含む場合、フィブロインへの前記チロシン類縁体の導入量の指標として、フィブロインL鎖に由来するペプチド断片SVTINQYSDNEIPRに対する質量分析で得られた、質量スペクトルのピークの強度比(チロシン類縁体を含有する前記ペプチド断片に由来するピーク強度/チロシン類縁体を含有しない前記ペプチド断片に由来するピーク強度)を採用できる。
当該ピーク強度比の値としては、0.01以上であってよく、0.01以上1以下であってよく、0.02以上0.7以下であってよく、0.05以上0.5以下であってよい。
当該ピーク強度比の値としては、0.01以上であってよく、0.01以上1以下であってよく、0.02以上0.7以下であってよく、0.05以上0.5以下であってよい。
実施形態のシルクタンパク質は、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子がハロゲン原子によって置換されている(例えば、前記式(1)におけるRがハロゲン原子を有する)ハロゲン化チロシン等のチロシン類縁体を含有することにより、耐熱性を向上可能である。
実施形態のシルクタンパク質は、フィブロインの昇温速度2℃/分、窒素雰囲気下におけるDSC(示差走査熱量測定)で得られる吸熱ピークが、300℃以上であってよく、300~320℃であってよい。
実施形態のシルクタンパク質は、フィブロインの昇温速度2℃/分、窒素雰囲気下におけるDSC(示差走査熱量測定)で得られる吸熱ピークが、300℃以上であってよく、300~320℃であってよい。
実施形態のシルクタンパク質は、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子がアジド基によって置換されている(例えば、前記式(1)におけるRがアジド基を有する)アジド化チロシン等のチロシン類縁体を含有することにより、物性を改変可能である。
実施形態のシルクタンパク質は、シルクタンパク質を含む生糸を繰製して撚糸し、60℃に加熱した7%(w/w)ラーゼンパワーII(幸新堂化学工業所製)および2%(w/w)ラーゼンパワー(幸新堂化学工業所製)を含む水溶液中で15分間前処理し、液量に対して1体積%のアルカラーゼ2.5L(幸新堂化学工業所製)を添加して55℃で30分間酵素精練処理した後に乾燥して得られた精練糸(試験糸(繊度9.95デニール[d]であってよい。))の力学物性を、温度20℃、湿度65%RH環境下で、テンシロン万能材料試験機で計測した最大点応力が440MPa以上であってよく、440~600MPaであってよく、450~550MPaであってよく、ヤング率が13GPa以上であってよく、13~16GPaであってよく、13.5~15GPaであってよい。
実施形態のシルクタンパク質は、シルクタンパク質を含む生糸を繰製して撚糸し、60℃に加熱した7%(w/w)ラーゼンパワーII(幸新堂化学工業所製)および2%(w/w)ラーゼンパワー(幸新堂化学工業所製)を含む水溶液中で15分間前処理し、液量に対して1体積%のアルカラーゼ2.5L(幸新堂化学工業所製)を添加して55℃で30分間酵素精練処理した後に乾燥して得られた精練糸(試験糸(繊度9.95デニール[d]であってよい。))の力学物性を、温度20℃、湿度65%RH環境下で、テンシロン万能材料試験機で計測した最大点応力が440MPa以上であってよく、440~600MPaであってよく、450~550MPaであってよく、ヤング率が13GPa以上であってよく、13~16GPaであってよく、13.5~15GPaであってよい。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
<カイコTyrRS変異体の作製>
カイコTyrRSの遺伝子はカイコ幼虫の絹糸腺から既存の手法でクローニングして取得した。塩基配列から予測されるTyrRSのアミノ酸配列(配列番号2)はデータベースに登録されている配列(Acc. No. AQM56846)と完全に一致した。
カイコTyrRSの遺伝子はカイコ幼虫の絹糸腺から既存の手法でクローニングして取得した。塩基配列から予測されるTyrRSのアミノ酸配列(配列番号2)はデータベースに登録されている配列(Acc. No. AQM56846)と完全に一致した。
以下の手順により、カイコTyrRSのアミノ酸配列において、36位のYをGに置換したY36G変異体を作製した。
<組換えベクターの作製>
当業者の常識の範囲である既存の手法に準じ、配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号3に示される塩基配列からなるDNA(BmTyrRS*)を有するpiggyBacベクター(5塩基の5’UTR配列を含む)(図1)をそれぞれ作製した。
なお、上記ベクターにはフィブロインL鎖(FibL)由来のプロモーターの配列(配列番号4)および3’UTR配列をそれぞれ、上記BmTyrRS*の5’および3’側に付加した。FibL由来のプロモーター配列を付加することにより、目的遺伝子を後部絹糸腺で特異的に発現させることが可能である。これにより、変異型遺伝子が幼虫の全身で発現することで生じると想定される幼虫の発育不全を回避することができた。
当業者の常識の範囲である既存の手法に準じ、配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号3に示される塩基配列からなるDNA(BmTyrRS*)を有するpiggyBacベクター(5塩基の5’UTR配列を含む)(図1)をそれぞれ作製した。
なお、上記ベクターにはフィブロインL鎖(FibL)由来のプロモーターの配列(配列番号4)および3’UTR配列をそれぞれ、上記BmTyrRS*の5’および3’側に付加した。FibL由来のプロモーター配列を付加することにより、目的遺伝子を後部絹糸腺で特異的に発現させることが可能である。これにより、変異型遺伝子が幼虫の全身で発現することで生じると想定される幼虫の発育不全を回避することができた。
<トランスジェニックカイコの作出と組換え遺伝子の発現確認>
[実施例1]
受精卵へのpiggyBacベクターのインジェクションおよびその後の組換え体のスクリーニング等は、当業者の常識の範囲である既存の方法に準じて行った。なお、白/CS(系統名:MCS601)は休眠卵を産下し、前述の低温暗催青法による非休眠化ができない系統であるため、前述の浸酸処理によって卵の休眠打破を行った。ゲノム中に挿入された変異型遺伝子のコピー数を、リアルタイムPCR法を用いて解析し、変異型遺伝子をホモで有する、実施例1のトランスジェニックカイコの系統を確立した。このトランスジェニックカイコの系統を、H10と名付けた。
[実施例1]
受精卵へのpiggyBacベクターのインジェクションおよびその後の組換え体のスクリーニング等は、当業者の常識の範囲である既存の方法に準じて行った。なお、白/CS(系統名:MCS601)は休眠卵を産下し、前述の低温暗催青法による非休眠化ができない系統であるため、前述の浸酸処理によって卵の休眠打破を行った。ゲノム中に挿入された変異型遺伝子のコピー数を、リアルタイムPCR法を用いて解析し、変異型遺伝子をホモで有する、実施例1のトランスジェニックカイコの系統を確立した。このトランスジェニックカイコの系統を、H10と名付けた。
<3-AzTyr含有シルクタンパク質の製造>
(実験1)
実施例1のトランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00又は0.25重量%(dry diet換算)の3-AzTyr(前記一般式(1-2)で表されるアミノ酸において、R2=N3)を含む人工飼料を給餌した。カイコの一頭当たりのフィブロイン生産量(4回実験の平均値)を図2に示す。
(実験1)
実施例1のトランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00又は0.25重量%(dry diet換算)の3-AzTyr(前記一般式(1-2)で表されるアミノ酸において、R2=N3)を含む人工飼料を給餌した。カイコの一頭当たりのフィブロイン生産量(4回実験の平均値)を図2に示す。
フィブロイン中の3-AzTyrの存在を確認するため、3-AzTyr中のアジド(N3)基に特異的な化学反応(クリック反応)を用いて以下の方法でフィブロインを蛍光標識した。
繭層を尿素精練して得たフィブロインを、50mg/mLの濃度になるように8M LiBr水溶液に35℃で2時間加熱して溶解させた。この溶解液1.6μLを18.4μLの反応溶液(16.4μLの8M尿素水溶液、1μLの1Mトリス塩酸緩衝液(pH8)、1μLの5mM carboxyrhodamine 110 DBCO (Click Chemistry Tools)の混合溶液)と混合し、室温で一晩インキュベートした。反応溶液7.5μLを12.5μLの8M尿素水溶液および10μLの6×サンプルバッファーと混合して1mg/mLの濃度に調製した後、50℃で15分加熱して還元処理を行った。還元処理した試料液をSDS-PAGEで分離した。ゲルは4~15%(w/v)濃度のMini-PROTEAN TGXプレキャストゲル(Bio-Rad)を用い、泳動電圧は100Vとした。
ゲルを純水中で洗浄した後、蛍光シグナルをFusion FX7イメージングシステム(Vilber)で撮影した。同じゲルをBio-Safe CBB stain(Bio-Rad)で染色し、同イメージングシステムで撮影した。
ゲルを純水中で洗浄した後、蛍光シグナルをFusion FX7イメージングシステム(Vilber)で撮影した。同じゲルをBio-Safe CBB stain(Bio-Rad)で染色し、同イメージングシステムで撮影した。
図3に、撮影した蛍光シグナルおよびCBB染色像を示す。バンドはフィブロインL鎖に対応する。
H10系統に3-AzTyrを含む人工飼料を給餌して得られたフィブロインL鎖において、アジド基の存在に由来する蛍光シグナルが確認され、3-AzTyrを含有するフィブロインが得られたことが確認できた。
(実験2)
トランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00,0.10,0.25,0.50,0.75又は1.00重量%(dry diet換算)の3-AzTyrを含む人工飼料を給餌した。
トランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00,0.10,0.25,0.50,0.75又は1.00重量%(dry diet換算)の3-AzTyrを含む人工飼料を給餌した。
図4に、カイコの一頭当たりのフィブロイン生産量を示す。飼料への3-AzTyr添加量が増すにしたがいフィブロイン生産量が低下した。
フィブロイン中の3-AzTyrの存在を確認するため、上述と同様の方法でフィブロインを蛍光標識した。
フィブロイン中の3-AzTyrの存在を確認するため、上述と同様の方法でフィブロインを蛍光標識した。
図5に、撮影した蛍光シグナルおよびCBB染色像を示す。飼料への3-AzTyrの添加量が多いほど、蛍光シグナルの強度が強いことが分かる。この結果は、飼料への3-AzTyrの添加量によってフィブロイン中への3-AzTyrの導入量を制御できることを示している。
<3-AzTyr含有シルク精練糸の力学解析>
図4および図5の結果から、フィブロイン中に適度な量の3-AzTyrが導入され、かつ、フィブロインの生産量が極端に小さくならない条件として、dry diet換算で0.50重量%の3-AzTyr添加条件を設定した。
トランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00又は0.50重量%(dry diet換算)の3-AzTyrを含む人工飼料を給餌した。収穫した繭を乾燥した後、既存の方法で生糸を繰製して撚糸し、60℃に加熱した7%(w/w)ラーゼンパワーII(幸新堂化学工業所製)および2%(w/w)ラーゼンパワー(幸新堂化学工業所製)を含む水溶液中で15分間前処理し、液量に対して1体積%のアルカラーゼ2.5L(幸新堂化学工業所製)を添加して55℃で30分間酵素精練処理した後に乾燥して得られた精練糸(試験糸、3-AzTyrを含まない対照(none)の試験糸の繊度は24.6デニール[d]であり、3-AzTyrを含む試験糸の繊度は9.95[d])の力学物性を、温度20℃、湿度65%RH環境下で、テンシロン万能材料試験機(エー・アンド・デイ製、型番:RTG-1210)で計測した(n=30)。
図4および図5の結果から、フィブロイン中に適度な量の3-AzTyrが導入され、かつ、フィブロインの生産量が極端に小さくならない条件として、dry diet換算で0.50重量%の3-AzTyr添加条件を設定した。
トランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00又は0.50重量%(dry diet換算)の3-AzTyrを含む人工飼料を給餌した。収穫した繭を乾燥した後、既存の方法で生糸を繰製して撚糸し、60℃に加熱した7%(w/w)ラーゼンパワーII(幸新堂化学工業所製)および2%(w/w)ラーゼンパワー(幸新堂化学工業所製)を含む水溶液中で15分間前処理し、液量に対して1体積%のアルカラーゼ2.5L(幸新堂化学工業所製)を添加して55℃で30分間酵素精練処理した後に乾燥して得られた精練糸(試験糸、3-AzTyrを含まない対照(none)の試験糸の繊度は24.6デニール[d]であり、3-AzTyrを含む試験糸の繊度は9.95[d])の力学物性を、温度20℃、湿度65%RH環境下で、テンシロン万能材料試験機(エー・アンド・デイ製、型番:RTG-1210)で計測した(n=30)。
図6及び表1に、各試験糸の力学物性解析結果を示す。3-AzTyrの導入によって最大点応力等が向上するなど、物性の改変が示された。
この結果は、Tyrをターゲットとした遺伝暗号拡張手法が、従来のPhe及びMetをターゲットとする手法では確認されない顕著な改変効果をシルクに及ぼすことを示している。
<ハロゲン化Tyr含有シルクタンパク質の製造>
トランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00又は0.25重量%(dry diet換算)のハロゲン化Tyr(前記一般式(1-2)で表されるアミノ酸において、R2=Cl、Br、又はI)を含む人工飼料を給餌した。カイコの一頭当たりのフィブロイン生産量(6回実験の平均値)を図7に示す。
トランスジェニックカイコH10系統を、5齢起蚕から2日目まで通常組成の人工飼料を給餌した後、3日目以降、前記人工飼料の総重量100重量%に対して、0.00又は0.25重量%(dry diet換算)のハロゲン化Tyr(前記一般式(1-2)で表されるアミノ酸において、R2=Cl、Br、又はI)を含む人工飼料を給餌した。カイコの一頭当たりのフィブロイン生産量(6回実験の平均値)を図7に示す。
フィブロイン中へのハロゲン化Tyr導入量は以下の方法で算出した。
繭層を約50 mg/mLの濃度になるように8M LiBr水溶液に35℃で40分間加熱して溶解させた。この溶解液を8M 尿素水溶液に約4.5 mg/mLの濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約3 mg/mLの濃度に調整した後、室温で30分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をSDS-PAGEで分離し、FibLのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより37℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、0.1%(v/v)TFA水溶液とアセトニトリルの、体積比2:1混合液に溶解した。この溶解液をHCCAで飽和させた0.1%(v/v)TFA水溶液とアセトニトリルの、体積比2:1混合液と混合し、MALDIターゲットプレート上に滴下して乾燥させ、質量分析データを取得した。
FibLのトリプシン消化で生じたペプチド断片のうち、Tyrを1つ含む断片SVTINQYSDNEIPR (1636 Da)に着目し、Tyrがハロゲン化Tyrに置換されることによって生じた新たなピーク(3-ClTyr:1670 Da、3-BrTyr:1714 Da、3-ITyr:1762 Da)が確認された。
これらの結果から、H10系統のカイコにハロゲン化Tyrを含む人工飼料を給餌して、ハロゲン化Tyrを含有するフィブロインを製造可能であることが確認できた。
繭層を約50 mg/mLの濃度になるように8M LiBr水溶液に35℃で40分間加熱して溶解させた。この溶解液を8M 尿素水溶液に約4.5 mg/mLの濃度になるように希釈し、さらに還元剤を含むサンプルバッファーと混合して約3 mg/mLの濃度に調整した後、室温で30分以上静置して還元処理を行った。還元処理した試料液をSDS-PAGEで分離し、FibLのバンドを切り出して脱色・洗浄・乾燥処理した後、トリプシンにより37℃で一晩ゲル内消化した。生じたペプチド断片を抽出して乾燥固化した後、0.1%(v/v)TFA水溶液とアセトニトリルの、体積比2:1混合液に溶解した。この溶解液をHCCAで飽和させた0.1%(v/v)TFA水溶液とアセトニトリルの、体積比2:1混合液と混合し、MALDIターゲットプレート上に滴下して乾燥させ、質量分析データを取得した。
FibLのトリプシン消化で生じたペプチド断片のうち、Tyrを1つ含む断片SVTINQYSDNEIPR (1636 Da)に着目し、Tyrがハロゲン化Tyrに置換されることによって生じた新たなピーク(3-ClTyr:1670 Da、3-BrTyr:1714 Da、3-ITyr:1762 Da)が確認された。
これらの結果から、H10系統のカイコにハロゲン化Tyrを含む人工飼料を給餌して、ハロゲン化Tyrを含有するフィブロインを製造可能であることが確認できた。
また、上記元ピークとハロゲン化Tyrに置換されることによって生じた新たなピークとの強度比からハロゲン化Tyrの導入量を見積もった。
図8に、上記の質量分析ピークの強度比(チロシン類縁体を含有する前記ペプチド断片に由来するピーク強度/チロシン類縁体を含有しない前記ペプチド断片に由来するピーク強度)の結果を示す。
以上のとおり、チロシンをターゲットとする遺伝暗号拡張手法をカイコに適用することにより、上記の各種の非天然チロシンが導入されたシルクを製造可能であること、更にはシルクの物性を改変可能であることが示された。
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項(クレーム)の範囲によってのみ限定される。
Claims (13)
- 以下の(a1)~(a3)のいずれか一つのアミノ酸配列を含み、チロシン特異的tRNAに所望の非天然アミノ酸を結合させる活性を有するアミノアシル-tRNA合成酵素を、絹糸腺に発現する、カイコ。
(a1)配列番号1に示されるアミノ酸配列
(a2)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、1~数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
(a3)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号36位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 前記非天然アミノ酸はチロシン類縁体である、請求項1に記載のカイコ。
- 前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する、請求項1~3のいずれか一項に記載のカイコ。
- 前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、前記ポリヌクレオチドを後部絹糸腺特異的に発現させるプロモーターである、請求項4に記載のカイコ。
- 前記ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターは、フィブロインL鎖、フィブロインH鎖、又はP25/fhx由来のプロモーターである、請求項4に記載のカイコ。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載のカイコに、非天然アミノ酸を投与する工程を有する、非天然アミノ酸含有タンパク質の製造方法。
- 前記カイコが、前記アミノアシル-tRNA合成酵素をコードするポリヌクレオチド、並びに、該ポリヌクレオチドを絹糸腺特異的に発現させるプロモーターを有する、請求項7に記載の製造方法。
- 前記非天然アミノ酸はチロシン類縁体である、請求項7に記載の製造方法。
- 前記非天然アミノ酸含有タンパク質が、シルクタンパク質である、請求項7に記載の製造方法。
- チロシン類縁体を含有し、前記チロシン類縁体は、チロシンの側鎖の少なくとも一つ以上の水素原子がアジド基によって置換されている、シルクタンパク質。
- 前記シルクタンパク質がフィブロインを含む、請求項12に記載のシルクタンパク質。
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