JP2005333913A - 核多角体病ウイルスに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコ、およびその製造方法 - Google Patents
核多角体病ウイルスに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコ、およびその製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】NPVの増殖に不可欠な遺伝子に対してRNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAを発現可能に保持するトランスジェニックカイコを作成した。トランスジェニックカイコにおけるNPV増殖を調べた結果、ウイルスの増殖を抑制できることが明らかになった。
【選択図】なし
Description
近年、トランスポゾンやマーカー遺伝子を利用した新しいトランスジェニックカイコの作出方法が開発された(非特許文献3〜9)。該方法は、DNA型のトランスポゾンpiggyBacをベクターとして用いており、マーカー遺伝子としては緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子が用いられている。この方法は効率良く組み換え体を作ることができることから、有用なタンパク質の生産や新しい繊維の生産、ウイルス抵抗性を付与した品種の作出など多くの実用的な面で利用することができ、その研究の一部については既に着手されている。
〔1〕 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAを発現可能に保持する、核多角体病ウイルスに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコ。
〔2〕 RNA分子をコードするDNAが、ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAである、〔1〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔3〕 ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAが、核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子をコードするmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードするセンスコードDNAと、該DNAと相補的なDNAとを、リンカーを挟んで対向するように連結させたDNAである、〔2〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔4〕 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子がlef1遺伝子である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔5〕 センスRNAをコードするDNAが、以下の(a)または(b)に記載のDNAである、〔4〕に記載のトランスジェニックカイコ。
(a)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および/または付加した塩基配列からなるDNA
〔6〕 RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAが、配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAである、〔4〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔7〕 以下の(a)および(b)の工程を含む、核多角体病ウイルスに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコの製造方法。
(a)核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAを、カイコの卵に導入する工程
(b)該DNAが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程
〔8〕 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAをカイコ細胞内で発現させる工程を含む、カイコを核多角体病ウイルスに対して抵抗性とする方法。
〔9〕 RNA分子をコードするDNAが、ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAである、〔7〕または〔8〕に記載の方法。
〔10〕 ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAが、核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子をコードするmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードするセンスコードDNAと、該DNAと相補的なDNAとを、リンカーを挟んで対向するように連結させたDNAである、〔9〕に記載の方法。
〔11〕核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子がlef1遺伝子である、〔7〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕 トランスポゾンの逆位末端反復配列の間に、核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAであって、該遺伝子をコードするmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードするセンスコードDNAと、該DNAと相補的なDNAとを、リンカーを挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に結合させたDNAが挿入されたベクター。
〔13〕 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子がlef1遺伝子である、〔12〕に記載のベクター。
〔14〕 センスRNAをコードするDNAが、以下の(a)または(b)に記載のDNAである、〔13〕に記載のベクター。
(a)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および/または付加した塩基配列からなるDNA
〔15〕 RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAが、配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAである、〔13〕に記載のベクター。
〔16〕 〔12〕〜〔15〕のいずれかに記載のベクターとトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクターを含むキット。
〔17〕 〔12〕〜〔15〕のいずれかに記載のベクター、または〔16〕に記載のキットを含む、カイコを核多角体病ウイルスに対して抵抗性とするための薬剤。
NPVに対して抵抗性を示すカイコが作出できれば、蚕糸業の現場において、最も問題となるNPVによる被害が防げるため蚕種製造の効率化、飼育の省力化、優良生糸の生産等はかり知れない効果がある。
本発明は、この知見に基づき、NPVの増殖に不可欠な遺伝子に対してRNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAを発現可能に保持するトランスジェニックカイコであって、NPVに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコを提供する。
AGTC (センス鎖)
::::
TCAG (アンチセンス鎖)
である場合には、上記のセンスRNAをコードするDNA配列が、リンカーを挟んで、逆方向反復配列を形成した構造は、
AGTC-LLL-GACT
:::: ::::
TCAG-LLL-CTGA
と表わすことができる。(上記の「L」はリンカーの任意の塩基であり、「:」は水素結合を表す。)
リンカーを構成するDNAの塩基配列は、特に限定されず、任意の配列とすることができる。また、上記のように逆方向反復配列間で水素結合を形成し得るものであれば、特にリンカーは必要とせず、リンカーを有しない場合であっても、本発明のDNAに含まれる。
また本発明において、RNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、不対合部分が含まれていてもよい。不対合部分はRNA形成に支障がない範囲で設けることができる。
ウイルスの増殖を抑制するため、ウイルス由来の遺伝子を組み換えて、ヘアピン構造のmRNAをつくる遺伝子を作製した。作製した遺伝子とベクターの構造を図1に示した。
遺伝子lef1はカイコのNPV DNAの複製に関連した遺伝子であり、ウイルスの増殖には必須な遺伝子である。この遺伝子の転写方向を逆にしたものを繋ぎ合わせ、そのプロモーターには培養細胞等で強い活性を示す SK18を用いた。また、この遺伝子を導入したトランスジェニックカイコを識別するためのマーカーとして、全身で蛍光タンパク質を発現し、実体蛍光顕微鏡で容易に遺伝子を導入した個体を識別できるA3GFP遺伝子をマーカー遺伝子として用いた。
以上の結果から、ウイルス遺伝子を組み換えた遺伝子を導入したトランスジェニックカイコを作ることにより、ウイルス抵抗性のカイコが作出できることが明らかになった。
Claims (17)
- 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAを発現可能に保持する、核多角体病ウイルスに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコ。
- RNA分子をコードするDNAが、ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAである、請求項1に記載のトランスジェニックカイコ。
- ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAが、核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子をコードするmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードするセンスコードDNAと、該DNAと相補的なDNAとを、リンカーを挟んで対向するように連結させたDNAである、請求項2に記載のトランスジェニックカイコ。
- 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子がlef1遺伝子である、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
- センスRNAをコードするDNAが、以下の(a)または(b)に記載のDNAである、請求項4に記載のトランスジェニックカイコ。
(a)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および/または付加した塩基配列からなるDNA - RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAが、配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAである、請求項4に記載のトランスジェニックカイコ。
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、核多角体病ウイルスに対して抵抗性を示すトランスジェニックカイコの製造方法。
(a)核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAを、カイコの卵に導入する工程
(b)該DNAが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程 - 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAをカイコ細胞内で発現させる工程を含む、カイコを核多角体病ウイルスに対して抵抗性とする方法。
- RNA分子をコードするDNAが、ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAである、請求項7または8に記載の方法。
- ヘアピン構造型のRNA分子をコードするDNAが、核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子をコードするmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードするセンスコードDNAと、該DNAと相補的なDNAとを、リンカーを挟んで対向するように連結させたDNAである、請求項9に記載の方法。
- 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子がlef1遺伝子である、請求項7〜10のいずれかに記載の方法。
- トランスポゾンの逆位末端反復配列の間に、核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子に対して、RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAであって、該遺伝子をコードするmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードするセンスコードDNAと、該DNAと相補的なDNAとを、リンカーを挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に結合させたDNAが挿入されたベクター。
- 核多角体病ウイルスの増殖に不可欠な遺伝子がlef1遺伝子である、請求項12に記載のベクター。
- センスRNAをコードするDNAが、以下の(a)または(b)に記載のDNAである、請求項13に記載のベクター。
(a)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および/または付加した塩基配列からなるDNA - RNAi効果を有するRNA分子をコードするDNAが、配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項12〜15のいずれかに記載のベクターとトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクターを含むキット。
- 請求項12〜15のいずれかに記載のベクター、または請求項16に記載のキットを含む、カイコを核多角体病ウイルスに対して抵抗性とするための薬剤。
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