JP5177431B2 - TRACP5bの製造方法 - Google Patents
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Description
そのため、これまでに多くの研究者が、有用なヒトTRACP5bの作製を試みてきた。しかしながら、in vivoで直接TRACP5bを発現させた成功例はなく、大量の破骨細胞腫から精製する(非特許文献1)か、新鮮かつ大量の血清から単離せざるをえなかった(非特許文献2)。一方、昆虫細胞にTRACP5を発現させ(非特許文献3)、得られるTRACP5をin vitroでプロテアーゼを作用させてTRACP5bを作製しようという試みが知られている。しかしながら、極めてわずかしか目的物を得ることができないのが実状である(非特許文献4)。
一方、組換えバキユロウイルスを用いて、ウイルス感染のカイコ幼虫を作製し、その体液から、インターフェロン等の医薬品(抗腫瘍・抗ウイルス剤等)等に用いられる有用蛋白質を得る方法もいくつか知られている。これも、カイコの蛋白質生成能力を生かした新たな蛋白質製造の方法を提供したといえる。
〔1〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、TRACP5bの製造方法;
(a)TRACP5をコードするDNAが導入されたカイコを製造する工程、
(b)製造されたカイコから、TRACP5bを回収する工程、
〔2〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、TRACP5bの製造方法;
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコを製造する工程、
(b)製造されたカイコから、該TRACP5bを回収する工程、
〔3〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するカイコである、〔2〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、
〔4〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、〔2〕に記載の方法、
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ、
〔5〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔3〕又は〔4〕に記載の方法、
〔6〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔2〕から〔5〕のいずれかに記載の方法、
〔7〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔6〕に記載の方法、
〔7−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔7〕に記載の方法;
(a)配列番号:7に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:7に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔7−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔7〕に記載の方法;
(a)配列番号:8に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:8に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔8〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔6〕に記載の方法、
〔8−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔8〕に記載の方法;
(a)配列番号:9に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:9に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔9〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔1〕から〔8−1〕のいずれかに記載の方法、
〔10〕TRACP5をコードするDNAをカイコに導入する工程を含む、TRACP5bを分泌するカイコの製造方法、
〔11〕TRACP5をコードするDNAをカイコ卵に導入する工程を含む、TRACP5bを分泌するカイコの製造方法、
〔12〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコの製造方法、
〔13〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するカイコである、〔12〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、
〔14〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、〔12〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ、
〔15〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔13〕又は〔14〕に記載の方法、
〔16〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔12〕から〔15〕のいずれかに記載の方法、
〔17〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔16〕に記載の方法、
〔17−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔17〕に記載の方法;
(a)配列番号:7に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:7に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔17−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔17〕に記載の方法;
(a)配列番号:8に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:8に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔18〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔16〕に記載の方法、
〔18−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔18〕に記載の方法;
(a)配列番号:9に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:9に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔19〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔10〕から〔18−1〕のいずれかに記載の方法、
〔20〕TRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを分泌するカイコ、
〔21〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコ、
〔22〕以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、〔21〕に記載のカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、
〔23〕以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、〔21〕に記載のカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ、
〔24〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔22〕又は〔23〕に記載のカイコ、
〔25〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔21〕から〔24〕のいずれかに記載のカイコ、
〔26〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔25〕に記載のカイコ、
〔26−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔26〕に記載のカイコ;
(a)配列番号:7に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:7に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔26−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔26〕に記載のカイコ;
(a)配列番号:8に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:8に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔27〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔25〕に記載のカイコ、
〔27−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔27〕に記載のカイコ;
(a)配列番号:9に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:9に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔28〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔20〕から〔27−1〕のいずれかに記載のカイコ、
〔29〕転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ、
〔30〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔29〕に記載のカイコ、
〔31〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔29〕又は〔30〕に記載のカイコ、
〔32〕TRACP5bがTRACP5bの特異的阻害剤、活性化剤、又はモジュレーターの候補化合物のスクリーニングに使用される、〔1〕から〔9〕のいずれかに記載の方法、
〔33〕TRACP5bの特異的阻害剤、活性化剤、又はモジュレーターが骨吸収の増加に関連する疾患の治療に使用される、〔32〕に記載の方法、
〔34〕骨吸収の増加に関連する疾患が組織障害、骨代謝病、又は骨粗鬆症からなる群より選択される疾患である、〔33〕に記載の方法、
〔35〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、TRACP5bの製造方法;
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを脂肪体に分泌するカイコを製造する工程、
(b)製造されたカイコから、該TRACP5bを回収する工程、
〔36〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するカイコである、〔35〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、
〔37〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、〔35〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5bをコードするDNAを有するカイコ、
〔38〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔36〕又は〔37〕に記載の方法、
〔38−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔38〕に記載の方法;
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:10に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔39〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔35〕から〔38−1〕のいずれかに記載の方法、
〔40〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、TRACP5bを脂肪体に分泌するカイコの製造方法、
〔41〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するカイコである、〔40〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、
〔42〕カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、〔40〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ、
〔43〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔41〕又は〔42〕に記載の方法、
〔43−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔43〕に記載の方法;
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:10に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔44〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔40〕から〔43−1〕のいずれかに記載の方法、
〔45〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを脂肪体に分泌するカイコ、
〔46〕以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、〔45〕に記載のカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、
〔47〕以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、〔45〕に記載のカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ、
〔48〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔46〕又は〔47〕に記載のカイコ、
〔48−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔48〕に記載のカイコ;
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:10に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA、
〔49〕TRACP5がシグナル配列を有する、〔45〕から〔48−1〕のいずれかに記載のカイコ。
本発明は、カイコを利用したTRACP5bの製造方法に関する。本発明は、本発明者らが、カイコの体内において活性を有するTRACP5bを産生させることに成功したことに基づく。すなわち本発明は、以下の(a)及び(b)の工程を含む、TRACP5bの製造方法を提供する。
(a)TRACP5をコードするDNAが導入されたカイコを製造する工程。
(b)製造されたカイコから、TRACP5bを回収する工程。
また本発明の好ましいシグナル配列として、例えば、TRACP5のシグナル配列が挙げられる。TRACP5の由来は特に制限されず、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ由来のTRACP5が挙げられる。本発明においてヒトTRACP5bを製造する場合、特に好ましいシグナル配列は、ヒトTRACP5のシグナル配列である。これらのシグナル配列を用いることにより、発現したTRACP5bを効率よく製造させることができる。
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、TRACP5bを絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する方法(第一例)、
(ii)TRACP5をコードするDNAを含むウイルスを作成しそれをカイコ生体内に感染させて製造する方法(第二例)
等を例示することができるが、これらに限定されない。
また第二例を用いる場合、製造されたカイコからTRACP5bを回収する方法としては、カイコの体液を抽出してTRACP5bを回収する方法が挙げられる。具体的には、例えば、カイコの腹部を切り、冷水で体液を抽出し精製することにより、TRACP5bを回収することができる。
なお本発明のTRACP5bの製造方法においては、TRACP5bを大量にかつ簡単に製造することができる点で、前記第一例が好ましい。これ以降、第一例に関して詳細に説明する。
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコを製造する工程。
(b)製造されたカイコから、該TRACP5bを回収する工程。
次いで、製造されたカイコ卵から生じたカイコの中から、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコを選択することにより、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコを製造する。
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、転写制御因子をコードするDNAが機能的に結合したDNA、及び
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、TRACP5をコードするDNAが機能的に結合したDNA、
を有するカイコ卵が挙げられる。
なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAは、TRACP5bの分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していてもよい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
絹糸腺から抽出したタンパク質溶液からTRACP5bを精製するには、例えば、以下のようにすると良い。抽出液をCM-Sepharoseカラムにアプライし、塩濃度を変化させたリニアグラジエントで溶出し、この溶出画分のTRACP5b活性を測定し、TRACP5b活性のあるフラクションを回収し、スピンカラムで濃縮する。続いて、得られるTRACP5b活性液をSuperdex200カラムでゲルろ過を行い、同様にTRACP5b活性を有する画分を回収し濃縮する。さらに、ヘパリンカラム(HiTrap Heparin HP、 GEヘルスケア社)で塩濃度を変化させたリニアグラジエントで精製し、同様にTRACP5b活性を有するフラクションをスピンカラムで濃縮する。これらのフラクションは、例えば、酸性電気泳動でTRACP5bの有無、精製状況を確認できる。
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを脂肪体に分泌するカイコを製造する工程。
(b)製造されたカイコから、該TRACP5bを回収する工程。
なお本発明においては、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAは、シグナル配列を有していてもよい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
また、TRACP5bとTRACP5aの分離も、上述の方法によって行うことが可能である。
なお、本発明の方法によって製造されるTRACP5bは、本発明の方法によって製造される限りなんら限定されず、シグナル配列を有していても、有していなくてもよい。即ち、本発明のTRACP5bの製造方法によって製造されるTRACP5bには、シグナル配列を有しているTRACP5b、シグナル配列を有していないTRACP5bの両方が含まれる。
なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAは、TRACP5bの分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していてもよい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
なお本発明においては、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAは、TRACP5bの分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していてもよい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。また本発明のカイコには、その卵も含まれる。
なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAは、TRACP5bの分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していてもよい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
なお、転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA、及び、セリシン又はフィブロインをコードするDNAのプロモーターの下流に、TRACP5をコードするDNAが機能的に結合したDNAは、TRACP5bの分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していてもよい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
(a)TRACP5bに対する基質の存在下において、本発明の方法によって製造されたTRACP5bと被検化合物を混合する工程
(b)TRACP5b活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下と比較して、TRACP5b活性を変化させた被検化合物を選択する工程
また、TRACP5bに対する基質としてはp-ニトロフェニルリン酸エステル等の合成基質が挙げられるが、これに限定されない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
材料と方法
[ベクター構築]
本発明ではまず、ヒトTRACPを組換えカイコに発現させるために使用するプラスミドベクターpBMCSUASsigTRACP(図1および配列番号:1)を作成した。この組換えカイコ作出のためのベクターは、酵母の転写制御因子GAL4の存在下で遺伝子発現を促すプロモーターUASの下流に、トランスポゾンpiggyBacの逆位末端反復配列の間に挿入されたヒトTRACP遺伝子を有する。またこのベクターは、組換えカイコを同定するためのマーカー遺伝子として、胚の単眼や蛾の複眼、神経由来の組織での発現を促すプロモーターに連結された緑色蛍光タンパク質遺伝子3xP3GFPを有している(Horn, C., and E. A. Wimmer,(2000)Dev Genes Evol 210: 630-637;Murizio et al.(1994) Protein Science,3:1476-1484)。
組換えカイコの作出のため、プラスミドベクターpBMCSUASsigTRACPとヘルパープラスミドをカイコ初期胚461個にインジェクションした。60の探卵蛾数からマーカー遺伝子を持つ初期胚を調べた結果、5蛾区の組換えカイコを確認した(表1)。最終的に、この中から3蛾区の組換え体を系統化する事ができた。本発明においては、ヒト酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ遺伝子を絹糸腺に発現させるためのGAL4系統として、既に系統化されているSer1-GAL4系統(田村ら、日蚕講要74、p51)を用いた。この組換えカイコは胚の単眼および蛾の複眼に赤色蛍光タンパク質を発現する。さらにこの組換えカイコは、中部絹糸腺でのみGAL4遺伝子を発現していることから、UASに制御される導入遺伝子を発現することが確認されている(田村ら、2004)。そこで、図2に示すように、導入したヒトTRACP遺伝子を発現させるため、得られたUAS-TRACP系統の3蛾区の中から2系統を、上記のSer1-GAL4系統と交配した。ここで用いたSer1-GAL4系統は、胚の単眼で赤色蛍光タンパク質を発現している。UAS-TRACP系統とSer1-GAL4系統を交配して得られた次世代の産卵後6日目の卵を、実体蛍光顕微鏡で観察し、赤色蛍光タンパク質と緑色蛍光タンパク質の両方を持つSer1-GAL4/UAS-TRACP個体を同定した(図3)。Ser1-GAL4/UAS-TRACP個体を飼育して、5令吐糸期のカイコから絹糸腺を摘出し、20mM Tris-HCl 100mM NaCl pH7.4で蛋白質を抽出した。同様に、コントロールとしてヒトTRACP遺伝子を持たないSer1-GAL4系統の5令吐糸0日目のカイコについても絹糸腺を摘出し蛋白質を抽出した。
ヒトTRACP遺伝子の転写を確認するため、RT-PCRは以下のように行った。上述した通り、GAL4とUASの両方の遺伝子を持つ個体を飼育し、5令吐糸期のカイコから中部絹糸腺を摘出した。同様に、コントロールとしてSer1-GAL4系統の5令吐糸0日目のカイコについても絹糸腺を摘出した。次いで、摘出した中部絹糸腺をガラスホモジナイザー(WHEATON社)へ移し、ISOGEN(ニッポンジーン社)を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAをDPEC水で50μg/20μlに調製し、First-strand cDNA Synthesis Kit(GEヘルスケア社)を使用し、添付文書に従ってcDNAへの逆転写を行った。この逆転写産物を鋳型として以下のPCRを行った。すなわち、TaKaRa Ex Taq HS(タカラバイオ社)に添付の10×PCRバッファーを5μl、150μMのプラスミドベクターpBMCSUASsigTRACP(配列番号:1)、150μMのプライマー(配列番号:2および3)、0.2mM dNTPsを、2単位EX Taq HSとなるように加え、全量50μlとした。eppendorf社のDNAサーマルサイクラーにて98℃ 2min 1回、98℃ 10sec、57.5℃ 30sec、72℃ 30secのサイクルを40回、72℃ 4min 1回の伸長反応を行った。
TRACP5bは、次のようにして測定した。ヒトTRACP5bを認識するモノクローナル抗体Trk62(受託番号IPOD FERMBP7890)を感作したマイクロプレートに、Ser1-GAL4/UAS-TRACP個体あるいはコントロールであるSer1-GAL4個体の絹糸腺から抽出したタンパク質溶液を室温で1時間反応させた。続いて洗浄操作を行った後、酒石酸およびクロロニトロフェニルリン酸を含む基質緩衝液を加え37℃で1時間インキュベーションし、405nmの吸光度を測定することによりTRACP5bを測定した(表2)。
Acidicディスク電気泳動は、以下の手順で行った。ディスク電気泳動装置(ATTO社)のキャピラリーガラス管に7.5%アクリルアミド分離ゲルを45mm積層し、その上に2.5%アクリルアミド濃縮ゲル4mmを重層した。これに、Ser1-GAL4/UAS-TRACP個体、すなわち本発明のカイコの絹糸腺から抽出したタンパク質溶液をCM-Sepharoseカラムにアプライし、10mM Tris-HCl pH7.2、NaCl 0-0.5Mのリニアグラジエントで溶出した。この溶出画分のTRACP活性を測定し、TRACP活性のあるフラクションを回収し、スピンカラムで濃縮した。続いて、Superdex200カラムでゲルろ過を行い、同様にTRACP活性を有する画分を回収し濃縮した。さらに、TRACP活性を有する画分をヘパリンカラム(HiTrap Heparin HP、 GEヘルスケア社)を使用し、NaClを含む20mM Tris-HCl pH7.2のリニアグラジエント(0.35M - 1M)で精製した。同様にTRACP活性を有するピーク1およびピーク2からなるフラクションをそれぞれスピンカラムで20U/Lとなるよう濃縮した。この濃縮サンプル50μLにBSAおよびグリセロールを加え、キャピラリ上部にアプライした。そして、35mM β-アラニンpH4.0 の泳動バッファーにてキャピラリ上部が陽極となるように4mA/キャピラリで90分間通電した。通電終了後、α-ナフチル酸、Fast Garnet GBC、酒石酸を含む0.1M クエン酸緩衝液(pH5.0)からなる染色液中に浸し、活性染色を行った。同様に、コントロールとしてヒト血清についても同様の電気泳動を行った。この結果、図5に示すようにSer1-GAL4/UAS-TRACP個体から抽出した組換え蛋白質は、ヒト骨由来TRACP5bあるいはヒト血清と同じくTRACP5bを産生している事が明らかとなった。
図1はヒト酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ遺伝子組換えカイコを作出するためのプラスミドベクターである。このプラスミドベクターとヘルパープラスミドpA3PIG (Tamura et al., Nature Biotechnology (2000) 18,81-84.)を461個のカイコ卵に注射した。次世代の胚の単眼に発現した緑色蛍光タンパク質を蛍光顕微鏡で観察した結果、5蛾区の組換え体を確認することが出来た(表1)。これらの組換えカイコを飼育し、3蛾区について系統化する事ができた。図2に示すように、得られたUAS-TRACP系統をSer1-GAL4系統と交配し、組換えヒト酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを発現するSer1-GAL4/UAS-TRACP系統を樹立した。ここで交配した雌蛾が産卵した産卵後6日目の胚を実体蛍光顕微鏡で観察し、図3のように単眼に緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質の両方を有する個体を確認した。このSer1-GAL4/UAS-TRACP系統を飼育し、5令吐糸期の絹糸腺からtotalRNAを抽出した。得られたtotalRNAについてRT-PCRを行ったところ、図4の通りGAL4遺伝子とTRACP遺伝子の転写が確認された。
まず、TRACP5bを製造するカイコは、蛋白質を作るのに相応しい絹糸腺という器官を持ち、一匹当たり数百mgのタンパク質を作る能力がある。さらにカイコは、人工飼料による清浄飼育が可能で、数万頭規模での大量飼育を容易に行うことができる。加えて、カイコの大量飼育は自然界に豊富にある桑の葉を用いて行うことが出来るため、安価にTRACP5bを製造することが可能である。
本発明の方法によって得られるTRACP5bは、例えば、TRACP5bの特異的阻害剤、活性化剤、又はモジュレーターの候補化合物のスクリーニングに使用可能である。
Claims (30)
- 以下の(a)及び(b)の工程を含む、TRACP5bの製造方法;
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコを製造する工程、
(b)製造されたカイコから、該TRACP5bを回収する工程。 - カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するカイコである、請求項1に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA。 - カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、請求項1に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項2又は3に記載の方法。
- 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項2又は3に記載の方法。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項6に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項6に記載の方法。
- TRACP5がシグナル配列を有する、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコの製造方法。
- カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するカイコである、請求項10に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA。 - カイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、請求項10に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項11又は12に記載の方法。
- 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項11又は12に記載の方法。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項10から14のいずれかに記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項15に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項15に記載の方法。
- TRACP5がシグナル配列を有する、請求項10から17のいずれかに記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるTRACP5をコードするDNAを有するカイコであって、TRACP5bを絹糸腺に分泌するカイコ。
- 以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、請求項19に記載のカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNA。 - 以下の(i)及び(ii)に記載のカイコを交配させることで製造される、請求項19に記載のカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したTRACP5をコードするDNAを有するカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項20又は21に記載のカイコ。
- 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項20又は21に記載のカイコ。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項19から23のいずれかに記載のカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項24に記載のカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項24に記載のカイコ。
- TRACP5がシグナル配列を有する、請求項19から26のいずれかに記載のカイコ。
- TRACP5bがTRACP5bの特異的阻害剤、活性化剤、又はモジュレーターの候補化合物のスクリーニングに使用される、請求項1から請求項9のいずれかに記載の方法。
- TRACP5bの特異的阻害剤、活性化剤、又はモジュレーターが骨吸収の増加に関連する疾患の治療に使用される、請求項28に記載の方法。
- 骨吸収の増加に関連する疾患が組織障害、骨代謝病、又は骨粗鬆症からなる群より選択される疾患である、請求項29に記載の方法。
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