CN102911937B - 肌肉增强子序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种来自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增强子及其应用。本发明的增强子可提升启动子活性，可用于制备转殖基因动物及应用于生物反应器中。

Description

肌肉增强子序列及其应用

技术领域

本发明是关于一种来自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增强子及其应用。

背景技术

基因转殖是现今生物技术领域广泛应用的技术，其是经由遗传工程技术将可表达特定基因产物的核酸分子导入细胞，以修饰其基因表达、给予新的表现性状或作为大量生产特定基因产物的工具。例如，针对牛、羊、猪、鱼、虾等经济动物，可用以改良品种、改良肉质、增加生长率、提高抗病能力及适应力、或提升观赏价值等。以鱼而言，水族产业消费型态由传统蓄养观赏，渐渐提升趋向艺术化、精致化与生活化。而生物科技的发展与创新运用促成了“荧光鱼”的诞生，荧光鱼产业具有技术密集、高附加价值等特性，因此具有庞大的发展潜力与商机。

一般而言，欲使导入细胞的核酸分子在细胞内表达出所欲的基因产物需要适当的启动子序列调控，以达所欲效果，例如，组织专一性表达、诱导性表达、或提升的蛋白质表达量，而增强子序列可再进一步增强启动子活性。以鱼类而言，目前常用于基因转殖荧光观赏鱼的启动子包括来自斑马鱼肌凝蛋白轻炼2(myosin light chain 2，mylz2)的2.2kb启动子。然而，斑马鱼mylz2启动子在斑马鱼种外的其它鱼种和物种的活性仍有改善加强的空间。

因此，在此领域中，仍有需要一种可提升启动子活性的增强子序列，以应用于动物，特别是鱼类的转殖基因技术，。

发明内容

本发明是从斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因分离出一段肌肉增强子序列，其具有明显提高启动子活性的效果，并进一步利用该增强子序列结合启动子制备转殖基因动物(如荧光鱼)，不仅可于不同目(Order)鱼种中应用，亦有应用到其它脊椎动物如哺乳类的肌肉细胞中的潜力，有利于在生物反应器中的应用。

因此，在一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列所组成，其具有增强子的活性。

在另一方面，本发明提供一种重组表达框，其包括：

(a)第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQ ID NO：1的核苷酸序列；及

(b)第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。

根据本发明，该含启动子的核苷酸序列是衍生自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一具体实例中，该含启动子的核苷酸序列是选自SEQ ID NOS：2至11所组成的群的任一序列。在另一具体实例中，该第一核苷酸片段是选自SEQ ID NO：2、3、12及13所组成的群的任一序列。

在一具体实例中，其中该外源蛋白是荧光蛋白。

在又一方面，本发明提供一种表达载体，其包括上述重组表达框。

本发明还提供一种宿主细胞，其包括上述表达载体。

本发明亦提供一种制备转殖基因动物的方法，其包括将前述表达载体导入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使该表达载体所含的核苷酸片段在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞中表达；其中该动物不包含人类。

根据本发明的具体实施例，本发明的方法可用于制备转殖基因鱼，特别是荧光鱼。其是使用显微注射技术将该表达载体导入鱼的受精卵中。其中该鱼是斑马鱼或神仙鱼。

本发明亦提供一种分离的核酸分子，其具有选自SEQ ID NOS：2至13所组成的群的任一核苷酸序列。

附图说明

上述发明内容及以下具体实施方式与所附图式一并阅读将更增了解。为达阐明本发明的目的，图式中所示具体实例为目前最佳实施方式。然而，应了解本发明并不限于所示的特定排列及结构。

图1为pT2-mylz2-P2.0-AmCyan1载体结构示意图；

图2为pT2-mylz2-P2.0-TcFP-11载体结构示意图；

图3为pT2-mylz2-P2.0-TcFP-13载体结构示意图；

图4为根据本发明的ckmb-P2363片段(-1202/+1161)；由ATG(+1162)转译起始点往前进行选殖2363bp片段，序列中标示重要肌肉生长相关转译因子结合位置；+1为转译起始位置，*为第二个转译起始位置，↓和↑代表1.2kb启动子是列删减位置。下半部阴影部位表示335bp增强子片段；

图5为根据本发明以载体(a)pT2-ckmb-P2363-TcFP-13及(b)pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段(one-cell stage)受精卵，以荧光显微镜观察2天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达，其中左图是经HcRed1滤镜观察，右图是亮视野合并图。曝光时间1000msec，比例尺为1mm；

图6为根据本发明以载体(a)pT2-ckmb-P2363-TcFP-13及(b)pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段受精卵，以荧光显微镜观察3天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达，其中左图是经AmCYAN1滤镜观察，右图是亮视野合并图；曝光时间500msec，比例尺为1mm；

图7为片段系列删减的启动子构建示意图及活性分析结果；虚线部分为未选殖区段，实线部分为实际选殖区段，各形状区块表示转译因子结合位置，位于实线上方代表顺向，位于实线下方代表反向；启动子活性及专一性依照强度划分为五个等级，以正号表示，+/-代表与其它组别相比趋近于不表达，但仍具有微弱表达。

表示MyoD家族，

表示MEF2，

表示E-盒子，

表示TATA盒子，

表示TREX/SIX4，

表示MAZ，

表示外显子1，表示外显子2(在ATG之前)；

图8为pT2-ckmb-P1343-TcFP-13载体构建示意图；

表示MyoD家族，

表示MEF2，

表示E-盒子，表示SIX4/MEF3，

表示MAZ，

表示TATA盒子，

表示外显子1，表示外显子2(在ATG的前)；

图9为根据本发明以载体pT2-ckmb-P1271-TcFP-13及pT2-ckmb-P1343-TcFP-13利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段受精卵，以荧光显微镜观察3天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达；曝光时间500msec，比例尺为1mm；

图10为以各种载体利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段受精卵，使用商业套组进行冷光活性分析的结果；

图11为根据本发明制备的基因转殖荧光观赏鱼Tg(ckmb-P2363：TcFP-13)F1子代；

图12为根据本发明以斑马鱼ckmb调节序列表达台湾珊瑚红色荧光蛋白(TcFP-11)的亲代神仙鱼(F0，二个月)，其肌肉可见镶嵌性表达红色荧光；

图13为根据本发明以pT2-EnIn1-ckmb-P2363-TcFP-11载体导入小鼠C2C12肌母细胞，经诱导分化成肌管细胞后，观察到强烈的荧光蛋白表达，其中(a)是可见光图，(b)是荧光图以及(c)是合并图；

图14为本发明的335bp核苷酸片段(SEQ ID NO：1)；

图15为本发明的ckmb-P1343核苷酸片段(SEQ ID NO：2)；

图16为本发明的ckmb-P2363片段核苷酸片段(SEQ ID NO：3)；

图17为本发明的ckmb-P69片段核苷酸片段(SEQ ID NO：4)、ckmb-P183片段(SEQ ID NO：5)、ckmb-P227片段(SEQ ID NO：6)及ckmb-P251片段(SEQID NO：7)；

图18为本发明的ckmb-P371片段核苷酸片段(SEQ ID NO：8)及ckmb-P511片段(SEQ ID NO：9)；

图19为本发明的ckmb-P1079片段核苷酸片段(SEQ ID NO：10)；

图20为本发明的ckmb-P1271片段核苷酸片段(SEQ ID NO：11)；

图21为本发明的EnIn1-ckmb-P371片段核苷酸片段(SEQ ID NO：12)；

图22为本发明的EnIn1-ckmb-P2363片段片段核苷酸片段(SEQ ID NO：13)；

图23为斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子(对照组)核苷酸片段(SEQ ID NO：14)。

本发明的各个具体实例的细节说明如后。本发明的其它特征将会经由以下各个具体实例中的详细说明及申请专利范围而清楚呈现。

无须进一步的阐述，相信本发明所属技术领域中技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明，而非以任何方式限制本发明范围。

具体实施方式

除非另有指明，所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属领域技术人员一般所了解的意义。

本文所使用的“一”的表述方式，如未特别指明，是指至少一个(一个或一个以上)的数量。

本文所使用的“核酸分子”或“核酸”一词是指核苷酸单体的聚合体，其可以是单股或双股、直线型或环状、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸单体包括磷酸基部分、糖基部分及碱基部分。常见的核苷酸的碱基部分包括鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其中腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶配对，以及鸟嘌呤与胞嘧啶配对。

本文所使用的“分离的核酸分子”是指从天然生物体来源纯化而来的核酸，或以化学合成法或PCR扩增技术所制得的核酸。核酸的纯化方法、化学合成法及PCR扩增技术可参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Sambrook J等人编著，1989，以及CurrentProtocols in Molecular Biology，Frederick M.A.等人编著，2001，John Wiley & Sons，Inc.。此一领域的技术人员可依据惯知的技术获得本发明的核酸分子，详细方法描述于以下实例中。

本文所使用的“可操作性地连接”或类似用语是指调节序列与另一编码特定基因产物的核苷酸序列的连接方式，使得该核苷酸序列接受调节序列的控制或调节，而在适当条件下表达出该基因产物。

本文所使用的“重组”是用以描述核酸分子含有非天然连接的序列。重组核酸分子可为载体形式，其可包括一或多个编码基因的结构序列及用于表达该基因的调节序列，例如，启动子序列。载体的种类包括但不限于质体、黏质体、噬菌体、YAC或PAC等。重组载体可用于表达或复制所导入的基因序列。典型地，在重组载体中，编码基因的结构序列是操作性地连结于调节序列，使得重组载体导入适当宿主中时，编码基因的结构序列在该调节序列的调控下表达。调节序列可包括但不限于启动子序列、起始密码子、复制起始点、增强子序列或分泌讯息序列等。

本文所使用的“核酸分子编码...”或其类似用语是指，该核酸分子带有一或多个编码特定基因产物的核苷酸序列，而可在适当条件下作为模板表达出该基因产物。应了解的是，由于基因密码(由三个核苷酸所组成)的简并性，故不同的基因密码可编码相同的氨基酸残基，例如，GAU与GAC，两者在核苷酸序列上不同，但均编码相同氨基酸残基，即天门冬酸(Asp)。针对相同的多肽产物，所属领域技术人员可运用例行技术及已知的基因密码偏好性(codonusage)，获得对应的核苷酸序列及其简并序列。因此，本文所述编码特定基因产物的核苷酸序列尚包括其简并序列(可编码相同基因产物)。

本文所使用的“重组表达框”一词是指一通过重组技术或合成产生的核苷酸序列，得以在宿主细胞中进行基因表达。表达框可嵌入质体或染色体中。典型地，一重组表达框包含欲转录的核苷酸序列及调节序列。

在一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列所组成，其具有增强子的活性。具体而言，本发明的分离的核酸分子是分离自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的下游序列，长度为335bp，具有强烈提升启动子活性的效果。

在另一方面，本发明提供一种重组表达框，其包括：

(a)第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQ ID NO：1的核苷酸序列；及

(b)第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。

根据本发明，SEQ ID NO：1的核苷酸序列可与任何适当的含启动子的核苷酸序列组合形成第一核苷酸片段，以调节第二核苷酸片段编码的外源蛋白的表达。在一具体实例中，该含启动子的核苷酸序列是衍生自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一特定实例中，该含启动子的核苷酸序列是选自SEQ ID NOS：2至11所组成的群的任一者。在另一特定实例中，SEQ ID NO：1的核苷酸序列与该含启动子的核苷酸序列所形成的第一核苷酸片段是选自SEQ ID NO：2、3、12及13所组成的群的任一者。表1列出SEQ ID NOS：1至11对应于ckmb基因的位置。

根据本发明，该第二核酸片段编码的外源蛋白的表达是由第一核酸片段调控。可依需要选择所欲表达的外源蛋白实施本发明。在一具体实例中，该外源蛋白是荧光蛋白，包括但不限于绿荧光蛋白(GFP)、蓝绿荧光蛋白(CFP)、红荧光蛋白(RFP)、黄荧光蛋白(YFP)及其修饰形式，例如，强化型绿荧光蛋白(EGFP)、强化型蓝绿荧光蛋白(ECFP)、强化型红荧光蛋白(ERFP)及强化型黄荧光蛋白(EYFP)，以及台湾珊瑚桃红荧光蛋白TcFP-11，其可由多孔轴孔珊瑚(Acropora millepora)所选殖出，与台湾珊瑚青绿荧光蛋白TcFP-13，其可由轴孔珊瑚(Acropora sp.)所选殖出。在一特定实例中，本发明使用的荧光蛋白是TcFP-11及TcFP-13。

本发明的重组表达框可并入载体，进而导入适当宿主细胞内，以进行转殖动物的制备或用于生产特定蛋白。

因此，在另一方面，本发明提供一种表达载体，其包括上述重组表达框。

在又一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有前述表达载体。

典型地，本发明的表达载体导入细胞，可在细胞中表达外源蛋白。在一具体实例中，本发明的表达载体导入小鼠肌母细胞，当其受诱导分化成肌管细胞后，会强烈活化表达所编码的荧光蛋白。因此，本发明可应用于生物反应器(bioreactor)的开发，在动物的肌肉细胞或组织生产所需的外源蛋白。

本发明的载体尚可视需要地包括其它具有特定功能的序列，例如，复制起始点、终止序列、供筛选用途的标记基因，例如，抗生素抗性基因等。此本领域技术人员可依现有知识选择适当的序列，使用惯知的遗传工程技术构建本发明的载体。构建重组载体所需使用的遗传工程技术，例如，聚合酶连锁反应(PCR)扩增技术、核酸纯化、载体及核酸片段的酵素处理及测序技术，可参见前述Molecular Cloning：A Laboratory Manual及Current Protocols in Molecular Biology(同上)。具体的载体构建细节说明于以下的实例中。

在又一方面，本发明提供一种制备转殖基因动物的方法，其包含将此处所述的表达载体导入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使该表达载体所含的核苷酸片段在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞上表达所编码的外源蛋白；其中该动物不包含人类。

根据本发明，此处所述“转殖基因动物”包括但不限于牛、羊、猪、鱼、虾等不包含人类的动物。特定而言，根据本发明的转殖基因动物是鱼类，更特定而言，为科学上或商业上有应用价值的鱼种，包括但不限于斑马鱼(Zebrafish，如Danio rerio)、神仙鱼(angelfish，如Pterophyllum、七彩神仙(discuss))、青鳉鱼(medaka)、金鱼(goldfish)、鲤鱼(carp)、锦鲤(koi)、吴郭鱼(tilapia)、孔雀鱼(guppy)及剑鱼(Xiphophorus)、南美慈鲷(South America Cichlid)如白狮头(Convict Cichlid)、红魔鬼(Midas Cichlid)、紫红火口(Redheadedcichlid)等。

在一特定实例中，根据本发明的转殖基因动物是斑马鱼。又一特定实例中，根据本发明的转殖基因动物是神仙鱼。

本发明的方法可利用已知的转殖基因标准技术，例如显微注射(microinjection)、电破法(electroporation)、病毒载体法(virus infection)及精子载体法(sperm-mediated gene transfer)等方法，使本发明的核酸分子进入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使本发明核酸分子能在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞中表达，制得转殖基因动物。

在一特定实例中，根据本发明的转殖基因动物是斑马鱼，其是使用显微注射技术将表达载体导入鱼卵细胞中而制得。进一步说明，使用玻璃毛细针吸取适当体积的表达载体，将其注射于单细胞时期的斑马鱼受精卵，将注射完的鱼卵集中于干净培养皿里，至于28℃培养箱培养，每日换水并定期观察。每一批显微注射胚胎经分析后确认转殖是统成功作用，即可将此批鱼卵养大后进行亲代(founder)挑选，再与野生型斑马鱼交配，挑选符合转殖的组织专一性表达的鱼只，并进行品系维持

此一领域已发展出各种已知方法辨别或筛选带有转殖基因的动物。例如，设计可辨认转殖基因的探针，以北方墨渍法(Northern blotting)或南方墨渍法(Southern blotting)来侦测候选动物中是否具有转殖基因的序列，或以PCR针对特定核酸序列放大的方式进行侦测。特定而言，表达荧光蛋白的动物可直接用眼睛观察。

在一特定实例中，本发明的方法是将编码荧光蛋白的重组载体导入受精鱼卵中，经培养后孵化，直接用眼睛筛选发出荧光的转殖基因鱼。

本发明亦提供一种分离的核酸分子，其具有选自SEQ ID NOS：2至13所组成的群的核苷酸序列。此等分离的核酸分子具启动子/增强子活性，可用以实施前述发明。

本发明的各个具体实例的细节说明如后。本发明的技术特征将会经由以下各个具体实例中的详细说明及申请专利范围而更清楚呈现。

实施例

实施例1：台湾珊瑚新型荧光蛋白基因TcFP-11与TcFP-13表达载体的构建

本实验利用台湾珊瑚荧光蛋白基因TcFP-13及TcFP-11的cDNA序列设计引物，PCR反应条件如下：94℃变性2分钟；94℃变性2分钟；94℃变性30秒；55℃退火复性30秒；68℃合成1分钟；变性、退火复性、延伸步骤重复35个循环；最后延伸反应为72℃10分钟，最后保存在4℃下。反应产物经由胶体萃取后与选殖载体(pGEM-T-easy vector)进行接合反应，再转入受体细胞中；经由小量培养后提取选殖载体进行测序，将序列资料与原始序列资料进行比对，并抽取中量高纯度质体保存。将接合好的载体利用先前设计的限制性酶切位点把TcFP-13及TcFP-11依次次插入到pT2-mylz2-P2.0-AmCyan1(图1，含斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子)取代AmCyan1，完成荧光表达载体的构建：pT2-mylz2-P2.0-TcFP-11(图2)及pT2-mylz2-P2.0-TcFP-13(图3)。

实施例2：斑马鱼ckmb基因调节序列的分子选殖及表达载体的构建

本实验利用基因组浏览器Ensembl Genome Browse(http://www.ensembl.org)搜寻斑马鱼ckmb基因，由起始密码子(ATG)往5’端方向预测与肌肉生长相关的转录因子结合位置，以在线资料库的程序(Genomatix，www.genomatix.de，MatInspector program)进行搜寻和预测，以可信度达80％做为挑选指标；选取以下三个片段做为夹取范围并以此设计引物进行扩增：2363bp片段(-1202/+1161)、1271bp片段(-1202/+69)及1343bp片段(-182/+1161)(序列位置参见图4)，设定以下条件反应：94℃变性2分钟；94℃变性30秒；55℃退火复性30秒；68℃合成2.5分钟；变性、退火复性、合成步骤重复35个循环；延伸反应为72℃10分钟，最后保存在4℃下。反应产物经由胶体萃取后与选殖载体(pGEM-T-easy vector)进行接合反应，再转型入受体细胞中；经由小量培养后提取选殖载体进行测序，将序列资料与原始序列资料进行比对。以上述步骤选殖出ckmb-P2363片段、ckmb-P1271片段及ckmb-P1343片段，利用限制性酶切位点分别依次插入到表达载体pT2-mylz2-P2.0-TcFP-13中，取代mylz2-P2.0启动子，完成以下荧光表达载体：pT2-ckmb-P2363-TcFP-13、pT2-ckmb-P1271-TcFP-13及pT2-ckmb-P1343-TcFP-13。亦可以相同方式构建以下TcFP-11表达载体：pT2-ckmb-P2363-TcFP-11。

实施例3：斑马鱼卵的荧光定性实验

使用实施例2的荧光表达载体，以Tol2转殖系统于斑马鱼卵进行荧光定性实验，分析ckmb-P2363片段、ckmb-P1271片段及ckmb-P1343片段的表达活性。

收集斑马鱼(Danio rerio)排列在置卵盘中，将含有载体DNA的显微注射溶液(100ng/μL)与Tol2转位子mRNA(100ng/μL)以1∶1的比例混和，以显微注射器(IM-300Microinjector，Narishige)配合显微镜(LEICAEZ4，LEICA)进行注射，注射条件设定为注射压力7～10psi，注射时间为100msec，并视实际条件略为调整，注入的溶液(以pheno red染剂颜色观察)约占卵的1/4，针以45度角自胚胎细胞刺入，注射位置在细胞中或细胞与卵黄界面附近，待进入二细胞期即停止注射，将鱼卵置于10公分培养皿，于28℃培养箱发育，以Leica Z16APO荧光显微镜观察。

图5及6分别显示以载体pT2-ckmb-P2363-TcFP-13及

pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用显微注射至单一细胞阶段(one-cell stage)斑马鱼受精卵，以荧光显微镜观察2天及3天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达。结果显示ckmb-P2363片段及ckmb-P1271片段在组织专一性方面都具有良好的表现，且具一定程度的启动子活性，其中ckmb-P2363片段又较ckmb-P1271片段的活性强。

实施例4：片段系列删减的启动子活性分析

针对ckmb-P1271片段进行系列删除，通过启动子活性分析找出重要的肌肉生成转录因子结合位置。

以pT2-ckmb-P1271-TcFP-13为模板进行PCR，设计引物以产生ckmb-P1271片段及其删减片段如表2所示。

PCR反应条件如下：94℃变性2分钟；94℃变性30秒；55℃退火复性30秒；68℃合成1.5分钟；变性、退火复性、合成步骤重35个循环；延伸反应为72℃10分钟，最后保存在4℃下。反应产物经由胶体萃取，利用ApaI和BamHI限制性内切酶进行酶切反应后，再次纯化DNA片段，将DNA片段分别与含有TcFP-13荧光基因的Tol2载体进行接合反应，再转型入受体细胞中；将正确的选殖载体经由中量培养，提取高纯度质体保存，以显微注射技术方式区分启动子活性。将启动子活性及专一性分为五个等级，以正号表示。图7显示结果。

结果显示，ckmb-P1271片段表达强度最强，逐渐删减ckmb-P371片段时，强度明显下降的趋势，而删减至ckmb-P251片段时，强度比ckmb-P371片段略强，删减至ckmb-P183片段时强度明显变弱但仍具有肌肉专一性，持续删减至ckmb-P69片段，其与其它组别相比几乎没有表达，但以放大图检视仍具有微弱激活子活性和一定程度的组织表达专一性。

实施例5：增强子的选殖

另以前述ckmb P251片段为起始，往下游设计ckmb-P1343片段(-182/+1161)，构建荧光表达载体pT2-ckmb-P1343-TcFP-13，图8显示载体构建示意图。

接着，以Tol2转殖是统表达TcFP-13荧光蛋白基因进行定量分析，比较ckmb-P1343片段与ckmb-P1271片段的活性。如图9显示，ckmb-P1343片段表达较ckmb-P1271片段强。显示P251下游1kb内含子1内具有活性较P251上游1kb强的增强子。进一步分析ckmb-P1343片段的序列结构，发现在内含子1中具有335bp(SEQ ID NO：1)密集的转录因子结合位点，推测具有增强子活性。

为证实335bp片段的增强子活性，依先前定性分析结果挑选具代表性的载体，将此335bp片段次选殖至此等载体，其中将荧光蛋白TcFP-13置换成冷光酶(luciferase，Luc)，进行利用冷光定量分析，同时比对不含335bp片段的载体，通过此测试335bp片段提升启动子强度的能力。

测试载体及其序列片段如表3所示。

将上述表达载体分别以50ng/μL与10ng/μL与内部对照质体pRL-TK以1∶1比例混合，以显微注射方式送入斑马鱼的单一细胞阶段受精卵中。待28℃孵化72小时后，每组各取10个发育正常的小鱼，使用商业试剂盒(Dual-Luciferase reporter assay system kit，Promega)进行冷光活性分析。图10显示结果。

如图10所示，以pT2-ckmb-P69-Luc所得冷光活性值当做1倍做为数据标准，pT2-EnIn1-ckmb-P2363-Luc(含二段335bp片段)产生最高为647倍的冷光活性，与不含335片段的pT2-ckmb-P2363-Luc及pT2-mylz2-P2.0-Luc相比高出许多，亦比pT2-ckmb-P1343-Luc(含一段335bp片段)高；且pT2-ckmb-P1343-Luc(含一段335bp片段)和pT2-ckmb-P1271-Luc(不含335bp片段)两组个别相比，两者具有共同的ckmb-251片段(参见图8)，前者为后者的6.3倍；又pT2-EnIn1-ckmb-P371-Luc(含一段335bp片段)与pT2-ckmb-P371-Luc(不含335bp片段)两组个别相比，前者为后者的23倍。以上结果证明335bp片段是一段增强子片段，具有相当强烈的增强活性。

实施例6：TcFP-13荧光斑马鱼品系

将含有一个335bp增强子片段的ckmb-P2363构建的载体pT2-ckmb-P2363-TcFP-13，以Tol 2转位子转殖是统建立基因转殖荧光观赏鱼Tg(ckmb-P2363：TcFP-13)，将F0亲代与野生型斑马鱼做交配挑选具有生殖细胞遗传的亲代，F1转基因鱼子代透过肉眼即可观察到强烈荧光表达(图11)。

实施例7：不同鱼种及物种的试验

将335bp片段选殖于pT2-ckmb-P2363-TcFP-11，构建含此增强子片段的载体pT2-EnIn1-ckmb-P2363-TcFP-11，以显微注射法打入一个细胞期神仙鱼受精卵中，在亲代神仙鱼(F0)肌肉可见镶嵌性表达红色荧光，证实本研究开发的鲤形目鲤科斑马鱼ckmb启动子及增强子片段可强烈专一性表达于不同目(order)的鲈形目慈鲷科神仙鱼肌肉(图12)。

此外，测试本发明的pT2-EnIn1-ckmb-P2363-TcFP-13载体在不同物种细胞的活性。使用小鼠C2C12肌母细胞(myoblasts)，其在2％马血清培养可诱导分化，形成肌管细胞(myotubes)。将pT2-EnIn1-ckmb-P2363-TcFP-13载体导入小鼠C2C12肌母细胞，当改变培养条件使细胞分化成肌管细胞后，会强烈活化表达荧光蛋白，见图13，显见根据本发明的ckmb启动子及增强子片段除可在鱼类肌肉中表达外，亦有应用到其它其它脊椎动物如哺乳类肌肉表达的潜力。另外斑马鱼mylz2启动子只在骨骼肌表达，但本发明的ckmb启动子及增强子片段不只在骨骼肌强烈表达亦可在心肌表达，因此本发明的ckmb启动子及增强子片段可同时应用于骨骼肌及心肌的功能性基因研究，亦可应用于以鱼类肌肉做为生物反应器(bioreactor)的开发。

Claims (12)

1.一种分离的核酸分子，其由SEQ ID NO:1的核苷酸序列所组成，具有增强子的活性。

2.一种重组表达框，其包括：

（a）第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQ ID NO:1的核苷酸序列；及

（b）第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。

3.如权利要求2的重组表达框，其中该含启动子的核苷酸序列是选自SEQID NOS:2至11所组成的群的任一序列。

4.如权利要求2的重组表达框，其中该第一核苷酸片段是选自SEQ ID NO:2、3、12及13所组成的群的任一序列。

5.如权利要求2的重组表达框，其中该外源蛋白是荧光蛋白。

6.一种表达载体，其包括如权利要求2至5项中任一项的重组表达框。

7.一种宿主细胞，其包括如权利要求6的表达载体。

8.一种制备转殖基因动物的方法，其包括将如权利要求6的表达载体导入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使该表达载体所含的核苷酸片段在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞上表达所编码的外源蛋白；其中该动物不包含人类。

9.如权利要求8的方法，其是用于制备转殖基因鱼。

10.如权利要求9的方法，其是使用显微注射技术将该表达载体导入鱼的受精卵中。

11.如权利要求9的方法，其中该鱼是斑马鱼或神仙鱼。

12.一种分离的核酸分子，其由选自SEQ ID NOS:2、3、12及13所组成的群的任一核苷酸序列所组成，具有启动子活性。

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