CN106222204B - 一种黄鳝基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄鳝基因编辑的方法，其步骤：1，通过建立室内黄鳝全人工繁殖技术，获得人工授精的黄鳝1细胞期胚胎。2，构建靶基因的类转录激活样效应因子核酸酶基因编辑载体，体外转录合成mRNA后，采用显微注射方法导入黄鳝1细胞期的受精胚中。3，靶基因发生突变的黄鳝可通过三引物检测方法筛选获得，并可通过测序确定靶基因的突变类型。该方法是第一次建立黄鳝胚胎的显微操作技术，第一次建立黄鳝内源基因精准编辑技术，为开展黄鳝基因的功能研究和黄鳝养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

Description

一种黄鳝基因编辑的方法
技术领域
本发明涉及水产动物遗传育种和功能基因验证研究的技术领域，更具体涉及一种黄鳝基因编辑的方法。
背景技术
黄鳝(Monopterus albus)俗称鳝鱼，为合鳃鱼目、合鳃鱼科、黄鳝属。黄鳝的肉味鲜美，营养价值高，是我国水产养殖的名特优对象，具有重要的经济价值。统计资料表明，国内外对黄鳝的需求量在300万吨以上，但是，2014年全国黄鳝养殖产量仅为35.7万吨(2015中国渔业统计年鉴)。随着人民生活水平的提高，对黄鳝的市场需求还在逐年增加。但是，黄鳝具有雌雄同体、先雌后雄的性逆转生物学特性，其性腺发育在生命过程经历雌性、间性和雄性3种性腺分化，导致人工繁殖过程中通常遇到雌雄亲鱼发育不同步、难以获得稳定的雌雄两性亲本群体等难题，难以进行黄鳝的规模化人工繁殖；养殖黄鳝所需要的苗种主要来自于捕捞野生苗种。采用仿生态的“有土人工繁育”和“无土人工繁育”技术虽然降低了自然繁殖鳝苗的成本，但是，由于黄鳝天然性反转仍然不可避免地进行，因此雌性亲本通常因个体小而怀卵量少。据测算，全国黄鳝苗种缺口至少在200亿尾以上。黄鳝性反转特性造成的苗种短缺一直是制约黄鳝养殖业可持续发展的瓶颈。因此，研究黄鳝性反转的遗传机理，探索调控黄鳝性反转的分子设计育种技术，以培育性腺分化发育可调控的黄鳝养殖新品种，不仅在鱼类生殖发育机理研究方面具有重要理论意义，而且是从根本上解决黄鳝养殖业苗种短缺问题的关键。但是，黄鳝的基因功能研究和遗传改良育种一直受制于缺乏有效的技术手段。
近年来出现的类转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs)技术，已经成功应用于斑马鱼(Danio rerio)(Chu Lianhe,Li Jia nzhen,Liu Yun,Hu Wei,Cheng Christopher H.K..Targeted gene disruptionin zebrafis h reveals noncanonical functions of Lh signaling inreproduction.Molecular Endocrinology,2014,28(11):1785-95.)、青鳉(Oryziaslatipes)(Luo Daji,Liu Yun,Chen Ji,Xia Xiaoqin,Cao Mengxi,Cheng Bin,WangXuejuan,Gong Wuming,Qiu Chao,Zhang Yunsheng,Cheng Christopher Hon Ki,ZhuZuoyan&Hu Wei*.Direct production of XYDMY-sex reversal female medaka(Oryziaslatipes)by embryo microinjection of TALENs.Scientific Reports,5:14057,DOI:10.1038/srep14057)、黄颡鱼(Tachysurus F ulvidraco)(Dong Z J,Ge J J,Xu Z Q,etal.Generation of myostatin b knockout yellow catfish(Tachysurus Fulvidraco)using transcription activator-like effector nucleases.Zebrafish,2014,11:265-274)和罗非鱼(Oreochromis niloticus)(Li M H,Yang HH,Li M R,et al.Antagonisticroles of Dmrt1and Foxl2in sex differentiation via estrogen production intilapia as emonstrated by TALENs.Endocrinology,2013,154(12):4814-4825)等模式鱼和经济性养殖鱼类的基因功能研究。但是，迄今没有在黄鳝中建立基因编辑技术。
因此，建立黄鳝基因编辑技术，一方面可以用于黄鳝功能基因的验证，探索黄鳝性反转的遗传机理；另一方面可以用于探索研制性别发育可控的黄鳝新品系，为黄鳝养殖的可持续发展提供遗传改良的优良品种。
发明内容
本发明提供了一种黄鳝基因编辑的方法，通过构建靶基因的类转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)基因编辑载体，体外转录合成mRNA。按100ng/μL浓度将靶基因的TALENs mRNA的左右臂混合后，采用显微注射方法导入黄鳝1细胞期的受精胚动物极，孵化后可获得靶基因基因突变的黄鳝。
为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种黄鳝基因编辑的方法，其步骤是：
1.构建靶基因的TALENs载体：
确定基因编辑靶点序列(即靶基因序列)以及其左右臂的识别序列，利用GoldenGate克隆方法制备TALENs左臂表达质粒和TALENs右臂表达质粒，体外转录成TALENs mRNA后保存。
优选的，所述的Golden Gate克隆方法参考：Liu Yun,Luo Daji,Lei Yong,HuWei,Zhao Hui,Cheng Christopher H.K..A highly effective TALEN-mediatedapproach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis andzebrafish.Methods,2014,69:58-66。
2.显微注射黄鳝1细胞期的胚胎
将靶基因的左右臂混合后，利用显微注射注射到黄鳝1细胞期受精卵的动物极中；
黄鳝1细胞期受精胚的制备过程包括：
在室内养殖系统中进行黄鳝人工催产繁殖，雌鳝(50-100g)的注射剂量按每100g雌鳝体重同时注射3mg的鲤鱼脑垂体(PG)、10μg的促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)和500IU的绒毛膜促性腺激素(HCG)。雌鳝注射24h后，雄鳝(>200g)按5μg/100g体重注射LHRH-A2。雌鳝注射40h后，挤出卵子；同时获取雄鳝精子，精子置于Danieal缓冲液(1.74mol/L NaCl,0.02mol/L KCl,0.01mol/L MgSO4·7H2O,0.02mol/L Ca(NO3)2·4H2O,0.15mol/L Hepes,pH7.2)中后立即倒入卵子，轻轻摇动混匀，静置5min完成受精过程。曝气水洗去杂质，就可获得黄鳝1细胞期的受精胚。
黄鳝1细胞期受精胚的显微注射过程包括：
在直径为9cm培养皿底部倒一层1％琼脂，然后放置40枚黄鳝1细胞期的受精卵。在体式显微镜(Olympus,日本)下调整黄鳝胚胎动物极朝上；将TALENs mRNA的左右臂混合，使混合后的终浓度为100ng/μL；用氮气加压的定量显微注射系统(Warner PLI-100A，USA)逐枚注射到黄鳝1细胞期受精卵的动物极中，每枚受精卵注射体积为2nL。
3.筛选靶基因突变的黄鳝
将显微注射后的黄鳝养至三个月，利用三引物检测方法(Liu et al.,2013；Liuet al.,2014)，筛选靶基因发生突变的黄鳝。
优选的，显微注射后的黄鳝的养殖过程包括：将显微注射后的黄鳝受精胚转移至玻璃培养皿(直径20cm)室温静置孵化。Danieal缓冲液(1.74mol/L NaCl,0.02mol/L KCl,0.01mol/L MgSO4·7H2O,0.02mol/L Ca(NO3)2·4H2O,0.15mol/L Hepes,pH 7.2)孵化4天后，更换为曝气水孵化，直到幼苗孵化出膜。孵化过程中，每天换水三次，剔除死亡的胚胎，防止水质变坏。出膜后的黄鳝幼苗转移到塑料盒中养殖，塑料盒网箱规格为40cm×20cm×10cm，投喂鸡蛋黄和水蚯蚓。当幼苗生长至1个月时，转移到室外网箱中进行养殖，网箱规格为1m×1m×1m，网目大小为100目，设置水葫芦作为黄鳝的栖息地，投喂水蚯蚓和商业化的黄鳝配合饲料，直至当黄鳝生长至3个月后，利用三引物检测方法(Liu et al.,2013；Liuet al.,2014)，筛选靶基因发生突变的黄鳝。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
目前没有任何进行黄鳝胚胎的显微操作技术，更没有进行黄鳝内源基因精准编辑的技术。本发明是第一次在黄鳝胚胎的显微操作技术方面取得突破，第一次建立黄鳝内源基因精准编辑技术，为开展黄鳝基因的功能研究和黄鳝养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。
通过建立室内黄鳝全人工繁殖技术，获得人工授精的黄鳝1细胞期胚胎。构建靶基因如Dmrt1的类转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectornucleases,TALENs)基因编辑载体，体外转录合成mRNA。按100ng/μL浓度将靶基因的TALENs mRNA的左右臂混合后，采用显微注射方法导入黄鳝1细胞期的受精胚中，可以获得靶基因突变的黄鳝，从而建立黄鳝靶基因精准编辑技术。靶基因发生突变的黄鳝可通过三引物检测方法筛选获得，并可通过测序确定靶基因的突变类型。该技术既可以用于研究黄鳝基因的功能，又可以用于精准修饰黄鳝内源靶基因，培育遗传改良的黄鳝养殖新品系。
附图说明
图1为黄鳝Dmrt1基因的结构及TALENs靶位点；
灰色实心背景的为外显子，灰框之间的为内含子，“ATG”和“TAA”分别为起始密码子和终止密码子，加下划线的碱基为TALENs的左右臂识别位点，左右臂中间的碱基为靶位点。
图2为黄鳝Dmrt1基因突变检测结果示意图。
其中图2中A：检测引物F1，F2和R1所处的位置，“Left”和“Right”为TLAENs左右臂的位置，“Spacer”为靶位点的位置；
图2中B：菌落PCR琼脂糖凝胶电泳，F1/R1和F2/R1扩增的目的片段长度分别为190bp和113bp；
图2中C：Dmrt1基因突变的测序结果，突变效率为87.5％，划横线处为TALENs的左右臂识别位点，WT为正常序列，“-”为碱基删除；“+”为碱基插入，括号内的为相同序列次数。
具体实施方式：
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明以编辑黄鳝Dmrt1基因为例，对本发明的方法进行说明。本发明以靶基因Dmrt1为例，建立了黄鳝内源基因精准的基因编辑技术，该技术可以用于研究黄鳝基因的功能和黄鳝品种的遗传改良。
实施例1：
黄鳝1细胞期受精胚的获得：
在室内养殖系统中进行黄鳝人工催产繁殖，催产激素为宁波三生制药有限公司产品。雌鳝(50-100g)的注射剂量按每100g雌鳝体重同时注射3mg的鲤鱼脑垂体(PG)、10μg的促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)和500IU的绒毛膜促性腺激素(HCG)。雌鳝注射24h后，雄鳝(>200g)按5μg/100g体重注射LHRH-A2。雌鳝注射40h后，挤出卵子；同时获取雄鳝精子，精子置于Danieal缓冲液(1.74mol/L NaCl,0.02mol/L KCl,0.01mol/L MgSO4·7H2O,0.02mol/LCa(NO3)2·4H2O,0.15mol/L Hepes,pH 7.2)中后立即倒入卵子，轻轻摇动混匀，静置5min完成受精过程。曝气水洗去杂质，就可获得黄鳝1细胞期的受精胚。
实施例2：
构建黄鳝靶基因(Dmrt1)的TALENs载体：
以黄鳝的靶基因Dmrt1为例，利用TALENs靶位点设计网站(https://tale-nt.cac.cornell.edu/)，选择Dmrt1基因的“AGGACAAGCAGCGCAA”序列作为基因编辑靶点，其中TALENs左臂的识别序列为TTACTTCCACTATGAACA，TALENs右臂的识别序列为GCAGGTGCTGGACTGC(图1)。根据文献报道的优化后的“Golden Gate”克隆方法，组装构建针对黄鳝Dmrt1基因的TALENs表达载体(Liu et al.,2014)。各重复片段的质粒(pNI1-pNI10对应于碱基A1-A10，pNN1-pNN10对应于碱基G1-G10，pHD1-pHD10对应于碱基C1-C10，pNG1-pNG10对应于碱基T1-T10)，以及对应于最后一个碱基的质粒(pLRNI对应于碱基A，pLRNN对应于碱基G，pLRHD对应于碱基C，pLRNG对应于碱基T)均为“Golden Gate”试剂盒(Addgene，美国)提供。
具体步骤为：
首先，分别构建包含识别第1-10bp(TTACTTCCAC)的A质粒和识别第11-17bp(TATGAAC)的B质粒：
Pfu-A是构建A质粒所用的骨架，pfu-B是构建B质粒所用的骨架，此骨架质粒在文献中已经公布(Liu Yun,Luo Daji,Lei Yong,Hu Wei,Zhao Hui,Cheng ChristopherH.K.A highly e ffective TALEN-mediated approach for targeted gene disruptionin Xenopus tropicalis and zebrafish.Methods,2014,69:58-66.)。
A质粒构建的反应体系包括：Buffer 4(NEB)1μl，pfu-A(100ng/μl)1μl，对应于识别第1-10bp碱基的质粒(pNG1，pNG2，pNI3，pHD4，pNG5，pNG6，pHD7，pHD8，pNI9，pHD10)各60ng，ATP(25mM,Epicentre)0.4μl，BsaI(10000U/ml,NEB,R0535L)0.6μl，T4Ligase(2000U/μl，NEB,M0202M)0.6μl，加水至10μl。反应条件为：37℃12min,16℃12min，6个循环；16℃15min，50℃10min，80℃5min。反应结束后加入Plasmid safe enzyme(Epicentre,E3110K)1μl，37℃60min。取5μl反应产物加入到100μl Top10感受态细胞中，转化，在含壮观霉素(Spectinomycin)LB平板上挑单克隆，各12个，摇菌，PCR检测，引物为PCR8F(TTGATGCCTGGCAGTTCCCT)和PCR8R(CGAACCGAACAGGCTTATGT)，反应条件为94℃5min；(94℃30s，52℃20s，72℃1min)，30个循环；72℃5min。各挑两个阳性克隆摇菌过夜，再按常规方法制备质粒。
B质粒的制备除骨架，以及识别第11-17bp碱基的质粒(pNG1，pNI2，pNG3，pNN4，pNI5，pNI6，pHD7)不同外，其余与A质粒构建相同。
TALENs的左右臂表达质粒的构建：
pCS2-TALENs-DEL(5’-)和pCS2-TALENs-KKR(3’-)分别为TALENs的左右臂表达质粒，已有文献报道(Liu Yun,Luo Daji,Lei Yong,Hu Wei,Zhao Hui,Cheng ChristopherH.K.A hig hly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruptionin Xenopus tropicalis and zebrafish.Methods,2014,69:58-66.)。
TALENs左臂表达质粒的构建：质粒A和质粒B各60ng，Buffer 3(NEB)1μl，目标序列最后一个碱基A所对应的质粒pLRNI60ng，BsmBI(10000U/ml,NEB,R0580L)0.5μl，pCS2-TALENs-DEL(5’-)质粒60ng，加水到10μl。反应条件为：55℃,30min；加入ATP(25mM,Epicentre)0.4μl，T4Ligase(2000U/μl,NEB,M0202M)0.4μl，(37℃10min,16℃10min)3个循环，16℃20min，55℃20min，80℃5min。转化，氨苄抗性。各挑12个单克隆，摇菌，PCR检测，引物：NTalF和CTalR，反应条件为94℃5min；(94℃30s,52℃20s,72℃2min)，30个循环；72℃5min。各挑两个阳性克隆摇菌过夜。再按常规方法制备TALENs左臂表达质粒。
TALENs右臂表达质粒的构建过程同左臂一样，区别在于连接入的表达质粒为pCS2-TALENs-KKR(3’-)。
TALENs左臂表达质粒和TALENs右臂表达质粒分别经Not I限制性内切酶(Takara,日本)线性化，经胶回收试剂盒进行纯化(Qiagen,美国)。按照mMESSAGE mMACHINE SP6试剂盒(Ambion,美国)的使用说明书，进行mRNA的体外转录，然后经RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,美国)进行纯化获得注射用的TALENs mRNAs。采用Nanodrop ND-2000分光度计(ThermoFisher,美国)测定浓度，然后保存于-80℃备用。
实施例3，显微注射黄鳝1细胞期胚胎
在直径为9cm培养皿底部倒一层1％琼脂，然后放置40枚黄鳝1细胞期的受精卵。在体式显微镜(Olympus,日本)下调整黄鳝胚胎动物极朝上；将Dmrt1的TALENs mRNA的左右臂混合，使混合后的终浓度为100ng/μL；用氮气加压的定量显微注射系统(Warner PLI-100A，USA)逐枚注射到黄鳝1细胞期受精卵的动物极中，每枚受精卵注射体积为2nL。
实施例4，显微注射黄鳝胚胎的孵化与养殖
将显微注射后的黄鳝受精胚转移至玻璃培养皿(直径20cm)室温静置孵化。用Danieal缓冲液孵化4天后，更换为曝气水直到幼苗孵化出膜。孵化过程中，每天换水三次，剔除死亡的胚胎，防止水质变坏。出膜后的黄鳝幼苗转移到塑料盒中养殖，塑料盒网箱规格为40cm×20cm×10cm，投喂鸡蛋黄和水蚯蚓。当幼苗生长至1个月时，转移到室外网箱中进行养殖，网箱规格为1m×1m×1m，网目大小为100目，设置水葫芦作为黄鳝的栖息地，投喂水蚯蚓和黄鳝商业化配合饲料。
实施例5，筛选靶基因Dmrt1突变的黄鳝
当黄鳝生长至3个月时，剪取约0.5-1cm2的黄鳝尾鳍组织，按“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”操作指南(北京天根生物技术公司产品)，提取基因组DNA。根据文献报道的三引物检测方法(Liu et al.,2013；Liu et al.,2014)，筛选靶基因Dmrt1发生突变的黄鳝。黄鳝靶基因Dmrt1的引物F1(5’-GTACGCAGATTGGAAGACA-3’)和R1(5’-AATACCAGACAGAGTGAGGC-3’)位于分别靶位点上下游，F2位于靶位点区域(5’-CCACTTACCAAAACCCGG-3’)。采用外引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒(Qiagen,美国)进行目的片段回收，连接入pMD18-T载体(Takara,日本)，转化Top10感受态细胞，随机挑24个克隆。37℃恒温摇床培养3h，然后分别采用F1/R1和F2/R1进行菌落PCR检测，如果F1/R1可以扩增出条带，而F2/R1未能扩增出，表明其为阳性突变克隆，阳性克隆占总克隆数目的比例即为基因敲除突变效率。对阳性克隆进行测序(铂尚生物技术上海有限公司)，确定靶基因的突变类型。引物由北京擎科生物有限公司合成，PCR反应条件均为：95℃3min；(95℃20s，55℃20s，72℃20s)，35个循环；72℃5min。菌落PCR琼脂糖凝胶电泳及测序验证的突变如图2所示。由此筛选出靶基因Dmrt1发生精准突变的黄鳝。根据三引物PCR检测结果，Dmrt1的突变效率为87.5％。通过DNA测序确定P0代胚胎发生基因突变的类型，主要为碱基缺失，少部分为碱基插入，可以造成移码突变或非移码突变(图2)。
本发明以靶基因Dmrt1为例，建立了黄鳝内源基因精准的基因编辑技术，该技术可以用于研究黄鳝基因的功能和黄鳝品种的遗传改良。

Claims (1)

1.一种黄鳝基因编辑的方法，其步骤是：
1).构建靶基因的TALENs载体：
确定基因编辑靶点序列以及其左右臂的识别序列，利用Golden Gate克隆方法制备TALENs左臂表达质粒和TALENs右臂表达质粒，体外转录成TALENs mRNA后保存；
2).显微注射黄鳝1细胞期的胚胎
靶基因的左右臂混合后的终浓度为100ng/μL，利用显微注射注射到黄鳝1细胞期受精卵的动物极中，每枚受精卵注射体积为2nL；
黄鳝1细胞期受精胚的制备过程包括：
在室内养殖系统中进行黄鳝人工催产繁殖，雌鳝的注射剂量为按每100g雌鳝体重同时注射3mg的鲤鱼脑垂体、10μg的促黄体素释放激素A2和500IU的绒毛膜促性腺激素；雌鳝注射24h后，雄鳝按5μg/100g体重注射LHRH-A2；雌鳝注射40h后，挤出卵子；同时获取雄鳝精子，精子置于Danieal缓冲液中后立即倒入卵子，轻轻摇动混匀，静置5min完成受精过程；曝气水洗去杂质，就可获得黄鳝1细胞期的受精胚；
所述的雌鳝的规格为50-100g；
所述的雄鳝的规格为>200g；
3).筛选靶基因突变的黄鳝
将显微注射后的黄鳝受精胚转移至玻璃培养皿室温静置孵化，Danieal缓冲液孵化4天后，更换为曝气水孵化，直到幼苗孵化出膜；将显微注射后的黄鳝养至三个月，利用三引物检测方法，筛选靶基因发生突变的黄鳝；
所述的Danieal缓冲液为：1.74mol/L NaCl,0.02mol/L KCl,0.01mol/L MgSO4·7H2O,0.02mol/L Ca(NO3)2·4H2O,0.15mol/L Hepes,pH 7.2。
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