CN105039402A - 一种改良猪肌肉品质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种改良猪肌肉品质的方法。本发明的特证是：将PPARγ基因作为提升肌肉品质的重要候选基因，建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，通过电转染的方法将SwaI线性化的pN1-MCK-PPARγ2表达载体转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，使用体细胞核移植的方法制备PPARγ转基因猪，在转基因猪中验证肌肉组织超表达PPARγ基因对肌内脂肪沉积等肉质性状的影响，克服了传统的动物育种中同时选择肉质和肉量的矛盾，为培育出良好肌肉品质的瘦肉猪新品种提供一种新的方法。

Description

一种改良猪肌肉品质的方法

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种改良猪肌肉品质的方法。本发明构建了猪骨骼肌特异性启动子MCK与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)结合p-N1载体构造为肌肉特异性诱导PPARγ超表达系统，通过电转染的方式导入猪胚胎成纤维细胞，并通过体细胞核移植技术制备转基因猪，在转基因猪个体水平上验证其对肌内脂肪和猪肉品质的影响，为培育出良好肌肉品质的瘦肉猪新品种奠定技术基础。

背景技术

转基因动物(Transgenicanimal)是指运用生物工程的方法将构建好的外源目的基因片段导入并稳定整合到受体染色体基因组内，从而制备的可稳定遗传给下一代的动物。1980年Gordon等人使用显微注射方法首次成功制备了转基因小鼠动物模型带有外源基因HSV和SV40。1982年Palmiter等人运用显微注射方法将大鼠的生长激素基因显微注射进入小鼠受精卵中，获得所谓的“超级大鼠”，曾经引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鼠、鱼、兔、羊、牛和猪等转基因动物。

体细胞核移植技术是指将外源目的基因通过电转染或脂质体转染等方式导入到供体细胞中，选择稳定整合带有外源基因的供体单克隆细胞进行扩增，然后将供体细胞的细胞核注入一个去核的未受精的成熟卵母细胞中，融合并激活后体外培养重构胚，待重构胚胎发育到桑椹胚或囊胚后移植入生理同步的假孕动物输卵管中，使其妊娠直至分娩。1997年Wilmut等人利用此方法制备了转基因羊Dolly。此后获得了转基因小鼠(Wakyamaetal.,1998)、转基因猪(Polejaevaetal.,2000)等多种转基因动物。此方法的操作复杂，胚胎发育率也较低，但转基因效率显著超过显微注射，可以方便的建立生产畜群。

利用转基因动物可提高动物的繁育及生长速度，转基因动物在改良动物品种中也有着较好的应用。1982年Palmiter等通过原核显微注射的方法将大鼠生长激素基因导入小鼠的基因组后获得转基因巨型小鼠。1988年Vizge等人将猪源生长激素导入猪受精卵中，获得日增重增加的转基因猪。将人的生长激素基因导入猪的基因组中，制备出的转基因猪的生长周期显著缩短，具有非常高的经济价值，并且瘦肉率和饲料利用率大幅提高。将人生长激素基因导入鲤鱼的基因组中，外源的生长激素基因可以在转基因鱼体内有效表达，并且可以充分发挥导入的外源基因的功能，使转基因鱼能够较快速的生长。这些研究均表明外源生长激素的表达可以大大促进转基因动物的繁育及生长速度。

启动子作为真核生物基因表达调控的顺式作用元件，其含有基因表达调控网络的重要信息，决定了基因表达的强度及特异性(Kimetal.，2005)。外源基因在细胞或生物体中的表达需要进行严格控制，在保证具有生物有效性的同时，一方面需要保证对生物体没有毒副作用以及基因的稳定表达，另一方面需要解决的问题是要定时定量的调控外源基因的表达，即具备严格的时间和空间的特异性。因此，分离和构建较高活性组织特异性启动子调控外源基因进行表达的诱导系统成为研究的热点。肌肉肌酸激酶(MuscleCreatineKinase，MCK)，被证实在骨骼肌和心肌组织中高水平的表达，一些体外转染骨骼肌肌细胞和成纤维细胞的研究，已鉴定出2个MCK增强子元件和一个近端启动子元件，这些元件只在分化的骨骼肌细胞中表达，一个包含MCK5’端序列3300个核苷酸的整合基因显示出氯霉素乙酰基转移酶的活性水平在骨骼肌中，比其它肌肉组织，如肾、肝和脾高10⁴，在心肌中的表达也比其它非肌肉组织高2-3个数量级。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)作为脂肪细胞形成的关键调节因子，在脂肪组织的形成过程中是必须的。但PPARγ2在肌肉中的表达量仅是脂肪的5-10％(Loviscachetal.,2000)。骨骼肌中特异性的敲除PPARγ引起严重的胰岛素抵抗，对脂肪组织和肝脏也有些不利影响(Heveneretal.,2003)。研究证明肌肉细胞培养时异位表达PPARγ和C/EBPα，可以使成肌细胞转分化为成熟的脂肪细胞(Huetal.,1995)。此外，之前有研究证实超表达并激活PPARγ2可使成肌细胞转分化，促进脂肪细胞的形成(Rosenetal.,1999；Formanetal.,1995)。

国外血统的长白猪和杜洛克猪两个品种在脂肪沉积方面有很大差异，长白猪比杜洛克猪有更多的内部脂肪、较少的皮下脂肪和肌内脂肪(Edwardsetal.,1992；Kolstadetal.,1996)。1998年Grindflek等研究了两个品种间PPARγ的表达模式，不同龄的猪的组织之间有很大的差异。在1日龄时两个猪种的PPARγmRNA水平没有差异，但是相对于长白猪，5周龄和体重100Kg杜洛克猪的PPARγ表达量特别高，发现脾脏组织中的表达模式也相似。在年幼的长白猪肌内脂肪中PPARγ2的表达量较高，因此我们推断PPARγ2是影响IMF发育和沉积的重要基因(Grindfleketal.,1998；2001)。研究发现PPARγ2基因在猪群体内存在多个SNPs，启动子区存在Bsr-PCR-RFLP多态性位点(Fanetal.,2011；Grindfleketal.,2004)，该多态性位点在杜洛克猪、长白猪和金华猪(中国地方猪品种)等很多猪种中存在，与猪肉的嫩度和背膘厚之间呈显著相关，对脂肪相关性状的表达有影响(Chenetal.2011；Emnettetal.,2000)。而在挪威的商品猪中此位点和脂肪性状的相关性却不显著(Grindfleketal.,2004)。2013年朱云等研究发现“PPARγ2基因BsrI位点的不同基因型所对应的脂肪性状如肌内脂肪含量和剪切力都存在显著差异，但是大理石纹不存在显著性差异”。在牛、羊等动物肌内脂肪的研究也证明PPARγ和肌内脂肪的沉积相关。PPARγ2基因是影响畜禽肉质性状的主要候选基因(Rebeeeaetal.,2000)。

猪肉是人类摄取动物蛋白的主要方式。随着人们对猪肉品质的要求的增高和品质的注重，肉质改良是现今时代猪育种的重要任务。影响猪肉质性状的因素很多，肌内脂肪含量与肌肉的嫩度、肉色和多汁性直接相关，肌内脂肪含量是影响猪肉品质的重要性状之一(Woodetal.,1998)，肌内脂肪含量在2-3％时肉质的口感是最佳的(Bejerholm和Barton-Gade,1986)。然而为了提高瘦肉率，现如今瘦肉型猪的平均肌内脂肪含量降至1.5％左右。肌内脂肪含量的遗传改良是可行的，因为肌内脂肪是高度可遗传的性状(Hovenieretal.,1992)。不同猪种间的肌内脂肪含量不等，这些差异不仅与饲养和管理有关，还和猪种间的遗传背景相关。当肌内脂肪含量增多时，肌肉的断面呈现较多的大理石状花纹，肌肉剪切力下降，进而嫩度增加(VanLaack,2001)。对杜洛克猪肉质性状进行关联研究分析，发现当肌内脂肪含量提升时，肉的系水力提高，肉色变亮(Suzukietal.,2005)。

与本发明密切相关的文献是本申请人所在猪遗传育种农业部重点实验室构建对PPARγ2基因的分离克隆以及构建的pN1-MCK-PPARγ2表达载体(JinliangHuangetal.即，黄锦亮l，2012)显微注射的方法获得了了模式动物转基因小鼠，在小鼠上初步验证了PPARγ2基因的功能，结果发现小鼠的骨骼肌中脂肪合成及转运等相关基因的表达出现不同程度的增加。但是该pN1-MCK-PPARγ2载体的构建使用的外源基因为猪源的PPARγ2基因，并没有在转基因猪个体上进行过生物学功能的验证。

迄今为止，尚未见到有关转PPARγ2基因培育改良猪肌肉品质的方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种改良猪肌肉品质的方法。本发明将过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(即PPARγ基因)作为改良猪肌肉品质和提高猪肌内脂肪含量的重要候选基因，通过构建猪骨骼肌特异性启动子MCK，构建与PPARγ基因结合p-N1载体的肌肉特异性诱导PPARγ的超表达系统，建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，利用电转染的方法将SwaI线性化的表达载体pN1-MCK-PPARγ2转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，通过体细胞核移植得到肌肉超表达PPARγ基因的转基因猪。

本发明的技术方案如下所示：

图1是本发明的总体技术路线图。

一种改良猪肌肉品质的方法，其步骤包括克隆PPARγ基因(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)、制备调控该PPARγ基因的启动子(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)，通过构建猪骨骼肌中超表达PPARγ基因的表达载体和体细胞核移植技术获得转PPARγ基因猪，具体步骤如下：

取大白猪胚胎期30天子宫，建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系。通过电转染的方法将SwaI线性化的pN1-MCK-PPARγ2表达载体转化大白猪30日龄胚胎成纤维细胞，经G418(浓度500μg/ml)筛选后，获得转基因单细胞克隆，以PPARγ2转基因阳性单克隆为核供体，通过体细胞核移植方法注入去核的大白猪卵母细胞构建得到转基因重构胚胎，然后将重构的胚胎移植到同步发情的受体猪输卵管内，经妊娠、分娩后，获得转PPARγ2基因克隆猪。利用PCR和SouthernBlot的方法对阳性转PPARγ2基因猪进行测定，以阴性猪为对照，对七月龄的转基因猪进行屠宰测定，并从形态学、DNA、RNA和蛋白水平上对转PPARγ2基因猪对肌内脂肪含量和肌肉肉质性状的相关效应进行检测分析。试验结果表明，本发明利用肌肉特异性启动子MCK在转基因猪中启动超表达PPARγ2基因的方法可以提高肌内脂肪含量和改善猪肉的品质

申请人提供了一种超表达PPARγ基因的表达载体pN1-MCK-PPARγ在转基因猪中的应用，该表达载体包含有一种在猪肌肉组织中超表达PPARγ基因的启动子MCK，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。和PPARγ基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明克隆PPARγ基因可以在猪肌肉组织中超表达转化中的应用。

其中的应用还包括在改良猪肉质性状中的应用。

上述猪肉质性状的应用中的猪肉质性状包括肌内脂肪含量、嫩度、大理石纹评分、滴水损失、肉的亮度和增加氧化型肌纤维类型性状。

本申请克隆得到的肌肉组织中超表达PPARγ基因可在高肌内脂肪转基因猪遗传改良中的应用。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》的内容。

本发明的优点在于：

(1)本发明利用肌肉特异性启动子MCK驱动转基因猪肌肉组织中超表达PPARγ2基因，可以提高猪肌内脂肪含量并改善肌肉品质。

(2)本发明克服传统的动物育种中在高瘦肉率的前提下提高IMF的难题，将为培育高肌内脂肪的瘦肉猪新品种(系)提供技术支撑。

表1本发明与现有技术与效果的比较

表1说明：PPARγ2转基因小鼠的制备方法参见文献：JinliangHuangetal.,2012。

附图说明

序列表SEQIDNO：1是本发明克隆的PPARγ基因的核苷酸序列，序列长度为1516bp。

序列表SEQIDNO：2是本发明分离、克隆的启动子MCK(或称MCK启动子)的核苷酸序列，序列长度为7071bp(该序列分离、克隆自另一个基因，见文献：JinliangHuangetal.,2012)。

图1：是本发明的总体技术路线图。

图2：是本发明涉及的原始质粒与制备的pN1-MCK-PPARγ线性化的表达载体的图谱。

图3：是本发明胎儿成纤维细胞及制备的PPARγ转基因猪制备过程相关图谱。附图标记说明：图3中的A图是大白猪30日龄胎儿成纤维细胞F1代；图3中的B图是稳筛10天后的转基因单细胞克隆；图3中的C图是本发明构建的转PPARγ基因的转基因首建猪。

图4：是本发明构建的PPARγ2转基因猪的PCR鉴定结果的电泳图，扩增长度为1023bp。附图标记说明：图4中的A图是原代PPARγ2转基因猪的部分PCR鉴定结果；图4中的B图是F1代PPARγ2转基因猪的部分PCR鉴定结果；图4中的C图是F2代PPARγ2转基因猪的PCR鉴定结果。

图5：是本发明构建的转PPARγ2基因的转基因猪的southern-blot鉴定结果电泳图。附图标记说明：图5中的A图是原代PPARγ2转基因猪的部分southern-blot鉴定结果，泳道说明：1：野生型(非转基因猪)对照，2-5：F0首建猪；6：质粒对照；图5中的B图是F1代PPARγ2转基因猪的部分southern-blot鉴定结果，泳道说明：1：野生型(非转基因猪)对照，2-7：F1代转基因猪；8：质粒对照，Southern-blot条带为1.0Kb。

图6：是本发明的转基因猪的外观形态观察的细胞切片图。附图标记说明：图7中的A图是猪背最长肌的外观形态观察，从左至右分别是转基因猪背最长肌和非转基因猪的背最长肌切片；图7中的B图是猪骨骼肌的HE染色结果，从左至右分别是转基因和非转基因猪的样本，由上至下分别是背最长肌和股二头肌切片。放大倍数：×40。

图7：是PPARγ2基因在转基因猪中的组织表达谱。纵坐标是PPARγ2基因mRNA相对表达水平。横坐标分别代表脂肪、肌肉等17种组织。

图8：转基因猪背最长肌的蛋白印迹分析。附图标记说明：图8中的A图是特异性抗体检测PPARγ，PGC1α，Myoglobin，MyHC2A和TnniⅠ在转基因猪和阴性对照中的蛋白表达；图8中的B图是各蛋白经Tubulin内参校正后的相对表达量。

图9：是转基因猪比目鱼肌的蛋白印迹分析。附图标记说明：图9中的A图是特异性抗体检测PPARγ，PGC1α，Myoglobin和MyHC2A在转基因猪和阴性对照中的蛋白表达；图9中的B图是各蛋白经Tubulin内参校正后的相对表达量。

图10：是转基因猪腓肠肌的蛋白印迹分析。附图标记说明：图10中的A图表示特异性抗体检测PPARγ，PGC1α，Myoglobin和MyHC2A在转基因猪和阴性对照中的蛋白表达；图10中的B图是各蛋白经Tubulin内参校正后的相对表达量。

具体实施方式

本发明的前期研究中的PPARγ2基因的分离克隆，构建超表达PPARγ2基因启动子MCK的方法和相关信息，参见：JinliangHuang(黄锦亮)etal.,2012，猪PPARγ2基因肌肉超表达真核表达载体构建以及在转基因小鼠中的功能验证.[博士学位论文]，2012中相关信息，为了节约篇幅，本实施例不再重述。

实施例1：猪胚胎成纤维细胞系的建立

取大白猪胚胎期30天的子宫，存于保温箱，2h之内带回实验室。将胎儿从子宫内分离出来放到一个装有含1×双抗磷酸盐缓冲液即PBS(配方为8.0gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa₂HPO₄.12H₂O，0.2gKH₂PO₄，双蒸水1000ml：双抗为10,000units/ml的青霉素和10,000ug/ml的链霉素)的烧杯中，然后转移到超净台操作，用眼科剪去胎儿头、四肢、内脏，置于2mlEP管中保存于-80℃备用，用所述的含有双抗的PBS清洗三次，尽量清洗至无血迹，然后使用二甲亚砜(DMEM)溶液洗一次去除双抗的影响；移至新培养皿中将胎儿剩余组织剪成糊状，剪得越碎越好。

加入1ml细胞培养液(配方为82％DMEM,15％FBS,1％Gln,1％NFAA,1％SP,2ng/mlbFGF)在细胞培养瓶的底壁上悬浮组织块，使其均匀的分布，将铺有组织块的一面向上，加入10ml细胞培养液，放入培养箱(37℃，5％CO₂)饱和湿度环境中培养。及时观察细胞生长状态，及时更换培养液。待细胞生长80-90％汇合度时，进行传代培养或者进行冷冻保存。将猪胎儿成纤维细胞(见图3中的A图)用G418进行毒性筛选。具体步骤为：将细胞按照10％左右的比例接种到48孔板中，分为7组，每组3个生物学重复，24h更换一次G418培养液。设置G418浓度梯度，当浓度为500μg/ml时细胞在第七天时几乎死光，所以将500μg/ml的浓度定位为最适G418筛选浓度。

实施例2：转基因细胞系的建立与检测

取出一瓶培养的猪30日龄胎儿成纤维细胞，经过消化、漂洗并离心后，加入350μl无血清培养基(invitrogen，购自武汉大风生物科技有限公司)，再加入5μg线性化好的pN1-MCK-PPARγ载体(载体的构建见图2，该载体构建方法是以真核表达载体pEGFP-N1为框架去除GFP基因后，从猪MCK基因的BAC中采用基因抓捕技术，钓取了7Kb的启动子MCK序列，构建载体pN1-MCK，用SalI和NotI进行双酶切，得到大片段pN1-MCK。以人工合成的PPARγ2cDNA全长质粒(pMD-18-PPARγ2)为材料，分别用SalI和NotI进行双酶切，得到PPARγ2基因片段。将前述得到的大片段pN1L-MCK和PPARγ2cDNA进行连接，得到真核表达载体pN1-MCK-PPARγ2。通过载体部分测序，PCR检测，以及酶切等方式进行鉴定，证明真核表达载体pN1-MCK-PPARγ2构建成功)，混合均匀，置于Bio-radGenePulserXcell电击杯中(避免出现气泡)，测得的电阻10-30之间为正常，电击程序电压为260V，电容为900μF，比色皿为2mm。电击后吸出表面的小气泡(因含有大量死细胞必须移除)。将剩余的液体全部转移至六孔板中，加培养液(配方：82％DMEM,15％FBS,1％Gln,1％NFAA,1％SP,2ng/mlbFGF)补足至2ml培养。

观察细胞的贴壁生长，细胞生长至90％汇合时，转移至48孔板，使用G418(浓度为500μg/ml)的培养基筛选6天，期间用PBS清洗死细胞。第七天换液时，G418浓度减半培养4天，将长大的单克隆细胞消化传至新的48孔板。当单克隆细胞生长至90％汇合时，传至24孔板，将PCR鉴定为阳性的细胞(图3中的B图)传至48孔，进行PCR鉴定，PPAR载体的引物为，F：5’-CATGAGCCTTCACCCACTCCTACA-3’，R：5’-AGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT-3’。等细胞长满后培养接触抑制2天，采用常规方法消化和离心。加入200μl显微操作液(在600ml去离子水中，按顺序加入9.500gTCM-199，0.050g碳酸氢钠，0.750gHEPES，1.855g氯化钠、0.050g青霉素、0.060g链霉素、3.0gBSA(使用前现加)，溶解后将pH调节为7.2-7.4，用去离子水定容至1L，并确保渗透压为280mOsm，接着用0.22μm的滤器过滤，用封口膜封存后于4℃备用，重悬细胞沉淀，作为供体细胞进行后续显微操作。

实施例3：转基因猪的制备

取刚屠宰的母猪卵巢，放入装有38℃含有青/链霉素的生理盐水的保温杯中，2h内运回实验室。抽取卵泡液，在体视镜下挑选形态规则、外围有3层以上的卵丘细胞紧密包围、胞质致密均匀的卵丘卵母细胞复合体，置于体外成熟培养液(配方为MAT母液8.5ml，500ul半胱氨酸(0.0070g溶于5mlMAT母液)、1mlpFF、10ulEGF(0.05mg/ml，成熟液溶解)、10ulLH(0.5mg/ml，DPBS溶解)10ulFSH(0.5mg/ml，DPBS溶解)。)中漂洗3次后，再转入矿物油覆盖、至少已在CO₂培养箱中平衡3-4h的体外成熟培养液内培养42h，一般按照50COCs/500μl的数量进行聚集培养。取出用卵泡液稀释的0.1％透明质酸酶，消化成熟后的COCs，在体视镜下挑选排出第一极体、卵黄膜完整、卵周隙清晰、胞质均匀的卵母细胞。

将浓度为7.5μg/ml的细胞松弛素B溶解于操作液中(配方为在600ml去离子水中，按顺序加入9.500gTCM-199，0.050g碳酸氢钠，0.750gHEPES，1.855g氯化钠、0.050g青霉素、0.060g链霉素、3.0gBSA(使用前现加)，溶解后将pH调至7.2-7.4，用去离子水定容至1L，并确保渗透压为280mOsm，接着用0.22μm滤器过滤，封口膜封存后于4℃备用中，制作成显微操作滴。使用纺锤体成像系统定位极体，用注射针去核，并将供体细胞注入透明带下。然后将卵移入盖有石蜡油的4滴PZM-3培养液(配方为60mL去离子水中，按照顺序加入0.6312g氯化钠、0.0746g氯化钾、0.0048g磷酸二氢钾、0.0099g七水硫酸镁、0.2106g碳酸氢钠、0.0022g丙酮酸钠(Na-pyruvate)、0.0617g五水乳酸钙(Ca-lactate·5H₂O)、0.0146g谷氨酰胺、0.0546g亚牛磺酸、5mg庆大霉素、fattyacidfreeBSA0.3g。调pH至7.2-7.4后，用去离子水定容至100ml，并确保渗透压为286-290mOsm，接着用0.22μm滤器过滤除菌，每10ml分装1瓶，用封口膜封存后于4℃下贮存备用)中的一滴进行平衡，38℃，5％CO2，100％湿度培养箱中平衡10min。

将在PZM-3培养液中平衡好的合子转移到清洗FM中，然后移入到装有融合液(配方为80ml去离子水中，按先后加入5.46g甘露醇(Ma-nnitol)、1ml二水氯化钙浓储、1ml六水氯化镁(MgCl₂·6H₂O)浓储、0.013g羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，调节PH至7.0-7.4，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，每50ml分装后用封口膜封存，置于4℃备用，使用前放入水浴锅39℃预热)的融合槽中，每次放10个平衡好的重构卵，使用拨卵针(外径30-40μm)将重构卵中的极体方位拨至与融合槽垂直，再用ECM2001融合仪施加一个30μs，120V/mm，2D的直流电脉冲诱导融合并同时激活。将融合后的合子在其余三滴PZM-3中依次清洗，转移到新的PZM-3培养皿中置于三气培养箱中培养。

选择同期发情处理母猪进行常规输卵管移植，经过妊娠、分娩后，获得首建转基因克隆猪(见图3中的C图)。将首建阳性转基因猪与英系野生型(非转基因)大白猪交配，获得F1代转基因猪。

实施例4：转基因猪的检测

剪取0.5cm猪尾放入EP管中，使用QiagenDNA提取试剂盒(货号69504，购自安特捷生物技术有限公司)，按照该试剂盒的说明书进行操作。使用PPARγ载体引物进行PCR鉴定，扩增长度为1023bp(图4)。

使用Roche的地高辛标记检测试剂盒进行转基因猪的SouthernBlot检测，用DraⅢ酶切猪基因组DNA，利用SouthernBlot探针扩增引物genesouthernF：5’-ATTGACCCAGAAAGCGATGC-3’，genesouthernR：5’-GTGGACGCCATACTTTAGGA-3’，PCR产物长度1023bp。对首建猪和F1代PPARγ2转基因猪进行SouthernBlot鉴定，以此确定外源基因的插入，结果如图5。

使用绝对定量PCR的方法检测外源基因拷贝数，将表达载体pN1-MCK-PPARγ(核苷酸序列见SEQIDNO:1所示与野生型英系大白猪(为常用品种)基因组DNA混合均匀，配制含有一定浓度比率(含有1个、2个、4个、8个和16个外源基因拷贝)的阳性对照标准样品，根据阳性标准样品建立标准曲线和回归方程。本实施例中建立的标准曲线和回归方程为y＝-0.9094x+4.1092，R²＝0.9956。根据标准样品建立的标准直线和回归方程，以及待测样品测得的Ct值，计算获得不同转基因猪的拷贝数，另一方面也可确认表达载体的整合。结果如表2所示，首建阳性转基因猪的拷贝数在5-55拷贝不等，传代后转基因猪的拷贝数发生一定程度的下降。

表2PPARγ2转基因猪的拷贝数测定

耳号	表型	代数	母系	PPARγ基因拷贝数
					WT1	WT	F0	-	0
199-4	TG	F0	-	33
					199-2	TG	F0	-	32
199-5	TG	F0	-	34
					303-3	TG	F0	-	5

290-1	TG	F0	-	20
					290-2	TG	F0	-	19
144-1	TG	F0	-	16
					144-2	TG	F0	-	23
2	TG	F0	-	55
					4	TG	F0	-	53
6	TG	F0	-	47
					8	TG	F0	-	41
10	TG	F0	-	42
					89	TG	F1	10	20
91	TG	F1	10	24
					93	WT	F1	10	0
95	WT	F1	10	0
					97	TG	F1	10	24
99	TG	F1	10	27
					101	WT	F1	10	0
103	TG	F1	10	30
					82	TG	F1	2	25
107	TG	F1	2	31
					131	TG	F1	6	33
138	TG	F1	6	31
					133	TG	F1	8	27
143	TG	F1	8	30
					145	TG	F1	8	26
148	TG	F1	8	34
					244	TG	F1	10	32
246	TG	F1	10	26
					36	TG	F2	244	18
48	TG	F2	246	17
					61	TG	F2	244	21

将F1代转基因猪和同窝F1代阴性猪在同一条件下进行常规饲养，定量采食。屠宰同窝的3头7月龄体重110Kg左右的F1代雄性转PPARγ2基因猪及3头F1代阴性猪，解剖分离不同的骨骼肌和脂肪等组织，根据不同实验需选择合适的保存方法分类保存。屠宰解剖后，对背最长肌和股二头肌等骨骼肌进行形态学观察，结果如图6A所示，PPARγ转基因猪背最长肌中大理石纹增多。得到此结果后，申请人进一步对背最长肌和股二头肌进行石蜡包埋、切片，然后使用HE染色的方法观察其形态学变化，结果证明本发明的PPARγ转基因猪中肌肉中脂肪细胞增多，结缔组织变大，肌内脂肪含量明显增加(见图6中的B图)。

对屠宰后对转基因猪的一些主要性能指标进行了测定。结果如表3所示，转基因猪与同窝的阴性猪相比，转基因猪平均初生重为1.125kg，阴性猪为1.117kg；7月龄时转基因猪体重为116.0±4.8kg；同窝F1代阴性猪为110.2±11.9kg，转基因猪生长速率略快。转PPARγ基因猪在保持高瘦肉率的前提下，肌内脂肪含量比对照组含量提高0.8个百分点，嫩度提高30.1N，滴水损失明显下降，大理石纹评分升高。与阴性对照组相比，其他指标出现了些许浮动，但未达到显著水平。

表3PPARγ转基因猪的生产性能测定结果

为了检测目的基因PPARγ2在各个组织器官中的转录情况及相对转录强度，申请人使用常规RT-PCR的方法对转PPARγ2基因猪的17种组织器官(心；肝；脾；肺；肾；胃；小肠；大脑；背最长肌；股二头肌；腓肠肌；比目鱼肌；睾丸；附睾脂；背脂；腹脂；胰)进行了转录鉴定分析。具体方法为：提取7月龄的组织样品RNA，使用阴性猪作为对照，采用实时定量PCR的方法(PPARγ2上游引物TCCCGCTGACCAAAGCAAAGGC，PPARγ2下游引物CCACGGAGCGAAACTGACACCC)，检测PPARγ2在各组织的mRNA表达水平。由于PPARγ2基因是猪的内源性基因，本身在阴性猪中就有一定水平的转录。经过肌肉特异性启动子MCK超表达目的基因后，目的基因PPARγ2在转基因猪中的部分组织器官中的表达出现了差异。结果如图7所示，PPARγ2基因在转基因猪脂肪和肌肉组织中出现了明显的上调表达趋势，尤其是在背最长肌、股二头肌和腓肠肌中达到了显著水平，其中背最长肌上调表达4.32倍，股二头肌中上调表达3.28倍，腓肠肌中上调表达2.26倍，比目鱼肌中上调表达1.40倍。在心、肾、小肠和脑中的表达量也有所提升，在脑中的表达量增加4.24倍，并达到极显著水平。在脾、肺和胃等组织中表达量呈下调表达。

本发明从转基因猪和野生型猪(非转基因)中各分离并提取了三种骨骼肌组织蛋白，进行WesternBlot检测分析。对PPARγ2转基因猪背最长肌中相关蛋白进行表达分析后发现，相对于阴性对照，PPARγ蛋白相对表达量上调，PGC1α和TnniⅠ的表达量显著上调，其中PGC1α蛋白表达量提高1.99倍，差异达到极显著水平；TnniⅠ蛋白表达量提高1.56倍，差异达到显著水平(见图8)。

对PPARγ2转基因猪比目鱼肌中相关蛋白的表达进行分析，结果发现，相对于阴性对照，PPARγ蛋白相对表达量显著上调1.46倍，差异达到显著水平；PGC1α的表达量略降低；Myoglobin蛋白表达量提高1.22倍，差异达到显著水平(图9)。

对PPARγ2转基因猪腓肠肌中相关蛋白的表达进行分析，结果发现，相对于阴性对照，PPARγ及与红肌类型相关的PGC1α和MyHC2A蛋白相对表达量均显著上调，其中PPARγ蛋白表达量相对显著上调1.58倍，PGC1α蛋白表达量相对显著上调1.73倍，MyHC2A上调3.59倍且差异达到极显著水平；Myoglobin蛋白表达量提高1.29倍，但差异不显著(图10)。

参考文献

1、黄锦亮(JinliangHuang).猪PPARγ2基因肌肉超表达真核表达载体构建以及在转基因小鼠中的功能验证.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2012(http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？QueryID＝0&CurRec＝1&recid＝&filename＝1012458081.nh&dbname＝CDFD1214&dbcode＝CDFD&pr＝&urlid＝&yx＝&v＝MTg3MTZWTHZKVkYyNkhMZTlGdEhFcnBFYlBJUjhlWDFMdXhZUzdEaDFUM3FUcldNMUZyQ1VSTCtmYitac0Z5bmc＝)。

Claims (7)

1.一种改良猪肌肉品质的方法，包括克隆如SEQIDNO：1所示序列的PPARγ基因，制备调控PPARγ基因的如SEQIDNO：2所示序列的启动子MCK，构建得到超表达PPARγ基因的载体pN1-MCK-PPARγ2；其特征在于，还包括通过体细胞核移植获得转PPARγ基因猪，其制备步骤如下：

(1)建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，通过电转染的方法将SwaI线性化的pN1-MCK-PPARγ2表达载体转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，作为体细胞核移植的供体细胞；

(2)利用浓度为500μg/ml的G418对电转染后的猪胎儿成纤维细胞进行毒性筛选；

(3)当阳性PPARγ单克隆细胞长满后培养接触抑制2天后，采用消化和离心方法，加入200μl显微操作液重悬细胞沉淀，作为供体细胞进行后续显微操作；

(4)采卵后，挑选形态规则、外围有3层以上的卵丘细胞紧密包围、胞质致密均匀的卵丘卵母细胞复合体，以50COCs/500μl的数量进行聚集培养；取出后用卵泡液稀释的0.1％浓度的透明质酸酶、消化成熟后的COCs，在体视镜下挑选排出具有第一极体、卵黄膜完整、卵周隙清晰、胞质均匀的卵母细胞；将浓度为7.5μg/ml的细胞松弛素B溶解于操作液中，制成显微操作滴；同时采用纺锤体成像系统定位极体，用注射针去核，并将供体细胞注入透明带下；将重构卵移入盖有石蜡油的胚胎培养液PZM-3中进行平衡，于38℃，5％CO₂和100％相对湿度的培养箱中平衡10min；

(5)向细胞融合仪施加一个30μs，120V/mm，2D的直流电脉冲诱导融合并同时激活重构卵，然后进行胚胎移植，获得转PPARγ2基因克隆猪；

(6)在形态学、DNA、RNA和蛋白水平上对转PPARγ2基因猪的肌内脂肪含量和肌肉肉质性状进行检测分析；

其中：

步骤(1)中所述的超表达PPARγ基因的pN1-MCK-PPARγ2载体包含有如序列表SEQIDNO：1所述的序列和SEQIDNO：2所述的序列；

步骤(3)所述的显微操作液按如下方法配制：在600ml的去离子水中，按顺序加入9.500g的TCM-199，0.050g的碳酸氢钠，0.750g的HEPES，1.855g的氯化钠、0.050g的青霉素、0.060g的链霉素、3.0g的牛血清白蛋白，使用前现加；溶解后将pH调至7.2-7.4，用去离子水定容至1L，保持渗透压为280mOsm，接着用0.22μm滤器过滤，用封口膜封存后于4℃备用；

步骤(4)中所述的胚胎培养液PZM-3按如下方法配制：在60mL的去离子水中，按顺序加入0.6312g的氯化钠、0.0746g的氯化钾、0.0048g的磷酸二氢钾、0.0099g的七水硫酸镁、0.2106g的碳酸氢钠、0.0022g的丙酮酸钠、0.0617g的五水乳酸钙、0.0146g的谷氨酰胺、0.0546g的亚牛磺酸、5mg的庆大霉素、fattyacidfree牛血清白蛋白0.3g；调pH至7.2-7.4，用去离子水定容至100ml，保持渗透压为286-290mOsm，接着用0.22μm滤器过滤除菌，分装后用封口膜封存于4℃下保藏。

2.根据权利要求1所述的一种改良猪肌肉品质的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的电转染方法如下：取出培养的大白猪30日龄胎儿成纤维细胞，经消化、漂洗并离心后，加入350μl的OPTI-MEM培养基，再加入5μg线性化的pN1-MCK-PPARγ表达载体，混合均匀，置于Bio-radGenePulserXcell电击杯中，避免出现气泡，保持10-30Ω正常电阻，用于电击程序的电压为260V，电容为900μF，比色皿为2mm，电击处理后将剩余的底部液体全部转移至六孔板中进行常规细胞培养。

3.一种超表达PPARγ基因的表达载体pN1-MCK-PPARγ2在转基因猪中的应用，其特征在于，该表达载体包含有在猪肌肉组织中超表达PPARγ基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，及其调控该基因的启动子MCK，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

4.权利要求1所述的启动子MCK在培育转基因猪或猪肌肉组织中超表达转化中的应用。

5.权利要求1所述的PPARγ基因在培育转基因猪或猪肌肉组织中超表达转化中的应用。

6.如权利要求5所述的的应用，其中还包括在改良猪肉质性状中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的猪肉质性状包括肌内脂肪含量、嫩度、大理石纹评分、滴水损失、肉的亮度和增加氧化型肌纤维类型。