CN105850812A - 一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法 - Google Patents

一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法。首先通过属间远缘杂交组合(“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌)获得耐低氧鲂鮊杂种F1，利用流式细胞术、ssr技术及染色体制备技术鉴定出二倍体的耐低氧鲂鮊杂种F1；然后，耐低氧鲂鮊杂种F1经2年的精心喂养达到性成熟，以耐低氧鲂鮊杂种F1与翘嘴鮊进行回交，获得了回交鲌，经流式细胞术鉴定回交鲌为二倍体。利用本发明方法获得的回交鲌具有相对生长率高、耐低氧、营养价值高、体型好等特点。

Description

一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法
技术领域
本发明涉及鱼类养殖技术领域，具体地说，是一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法。
背景技术
远缘杂交是鱼类育种的重要手段之一，可以把亲本的优势性状结合到一起，从而获得优良杂交新品种，但鱼类远缘杂交往往得不到子代，能表现出生长优势的杂交组合则更少。鱼类杂交育种研究在我国比较多，从上世纪50年代末至今，共有100多个杂交组合用于实验，涉及范围涵盖3个目、7个科，共计40多种鱼类，迄今已获得了3个鲌亚科鱼类属间杂交组合。目前，关于团头鲂(Megalobrama amblycephala)与翘嘴鲌(Erythroculter ilishaeformis)的杂交研究还比较少。金万昆等曾对团头鲂♀×翘嘴红鲌♂杂种F1的含肉率等进行过测定，并对其鱼肉品质做了初步评价；葛瑞玲等曾利用团头鲂♀和翘嘴红鲌♂进行杂交，并获得了二倍体及三倍体的鲂鲌。而在其反交方面，顾志敏等对翘嘴红鲌♀×团头鲂♂杂种F1做过形态及RAPD方面的研究。
虽然鱼类远缘杂交操作相对简单，但是通过对大量的杂交组合分析来看，能够从受精卵经胚胎发育而达到成鱼的组合很少。导致该结果的根本原因是双亲的不相容性，一般来说亲缘关系越近相容性越好，反之则相容性差。造成远缘杂交不相容的原因大致有三个：首先是双亲染色体数目或组型差别过大，因为染色体上携带着大量的基因，若亲本的染色体数目不相同，则基因的种类、数目甚至功能就不对等，导致雌雄原核形成的合子中基因调控紊乱，从而使胚胎发育不正常，最后造成畸形或死亡，如草鱼×鲤鱼的杂交。其次是酶基因座位的差异或表达的时空差异，因为基因表达的时间顺序受到同工酶的调控，同工酶谱的差异导致胚胎组织和器官的发生不协调，使胚胎发育异常，最后畸形或死亡。最后一个原因是核质互不相容，因为胚胎发育的正常与否主要受卵子细胞质的控制，若精子的核DNA不被卵子的细胞质所接受，就会导致杂交胚胎发育异常，最终畸形或死亡。在许多杂交组合中，其正交实验能获得正常发育的鱼苗，而反交实验却不能，说明原因与双亲的核DNA无关，而是由核质不相容导致，如团头鲂×草鱼的正反交、鲫×鲤的正反交等。
团头鲂和翘嘴鲌分属鲌亚科的鲂属和鲌属，是我国2种重要的经济养殖鱼类。两者在形态、生理和养殖生态上有较大差异，其杂交后代的遗传组成也可能比较复杂。中国专利2012105345466公开了一种团头鲂与翘嘴红鲌间杂交品系的建立方法，以团头鲂为母本，翘嘴红鲌为父本，经远缘杂交后获得鲂鲌杂交F1，对F1进行饲养及检测，获得两性可育的F1；然后以该F1为对象进行培育，使两性可育的F1进行自交，再经孵化、养殖，获得二倍体鲂鲌F2；对F2的倍性、育性进行检测，获得两性可育的F2，至此获得了遗传稳定、两性可育的异源鲂鲌品系；利用前述建立方法中获得的两性可育的二倍体鲂鲌杂交F1和二倍体鲂鲌F2，与团头鲂进行回交育种，获得杂交鱼翘嘴鳊。湖南师范大学2011年6月公开的硕士学位论文《团头鲂(♀)×翘嘴红鲌(♂)杂交F1的生物学特征及遗传分析》，并具体公开了：团头鲂(♀)×翘嘴红鲌(♂)杂交F1的获得，对所述的鲂鲌F1进行饲养，进一步对团头鲂(♀)×翘嘴红鲌(♂)杂交F1的倍性检测，团头鲂(♀)×翘嘴红鲌(♂)杂交F1的性腺显微观察，结果表明，利用团头鲂(♀)×翘嘴红鲌(♂)杂交，成功获得了雌雄可育的二倍体鲂鲌杂交F1。而关于本发明生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，包括如下步骤：
1)以耐低氧团头鲂为母本，以翘嘴鲌为父本，经杂交后获得两性可育的耐低氧鲂鮊杂种F1；
2)在鲂鮊杂种F1中选择鲂鲌杂种A型与翘嘴鲌进行回交育种，获得回交鮊。
所述步骤1)的耐低氧团头鲂来源如下：由团头鲂“浦江1号”经过2次低氧胁迫后选择出耐低氧群体，然后利用该耐低氧群体建立100个选育家系，最后从这100个家系中选择出兼具生长优势和耐低氧性状的个体，并以此为亲本进行扩繁进而获得的耐低氧团头鲂。
所述步骤2)的鲂鲌杂种A型形态特征如下：形态特征介于父母本之间，身体扁平、体型较长，后背仅有轻微的隆起，与父本翘嘴鲌相似。
所述步骤1)具体如下：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出成熟卵子的性成熟耐低氧团头鲂为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的翘嘴鲌为父本，对亲本进行人工催产，按照1:2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜；待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到大塘进行培育。
所述人工催产包括如下步骤：于下午4时先对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)进行催产，绒毛膜促性腺激素(HCG)的用量为1000U/kg，促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。
所述步骤2)具体采用下述两种方式之一：
第一种，所述步骤2)具体如下：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出卵子的性成熟鲂鲌杂种A型为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的的翘嘴鲌为父本，对亲本进行人工催产，按照1:2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜；待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m的水泥池培育。
第二种，所述步骤2)具体如下：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出卵子的性成熟的翘嘴鲌为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的鲂鲌杂种A型为父本，对亲本进行人工催产，按照1:2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜；待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m的水泥池培育。
所述人工催产包括如下步骤：先对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)进行催产，绒毛膜促性腺激素(HCG)的用量为1000U/kg，促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。
本发明通过属间远缘杂交组合(“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌♂)获得耐低氧鲂鮊杂种F1，利用流式细胞术、ssr技术及染色体制备技术鉴定出二倍体的耐低氧鲂鮊杂种F1。然后，耐低氧鲂鮊杂种F1经2年的精心喂养达到性成熟，以耐低氧鲂鮊杂种F1与翘嘴鮊进行回交，获得了回交鲌，经流式细胞术鉴定回交鲌为二倍体。本发明的方法获得的回交鲌具有相对生长率高、耐低氧、营养价值高、体型好等特点。
本发明优点在于：
1、本发明的回交鮊是利用二倍体可育的耐低氧鲂鮊杂种F1与翘嘴鮊回交而得，该回交鮊的获得为鱼类遗传育种提供了宝贵的实验材料；也说明生物在进化方式的选择上又多了一种可能，增加了进化方式的多样性。由于该回交鮊均为二倍体，可以推测其具有可育性，因此可进一步进行雌核发育研究和多倍体研究，为回交鮊种质的纯化和多倍体育种奠定基础。
2、经60日的同池培育，回交鮊(“耐低氧鲂鲌”♀×翘嘴鮊♂、翘嘴鮊♀ד耐低氧鲂鲌”♂展现出一定的生长优势，其增重率均高于翘嘴鲌。60日龄的耐低氧鲂鮊♀×翘嘴鮊♂和翘嘴鮊♀×耐低氧鲂鮊♂的平均相对增重率分别为2.04和2.03，而60日龄的翘嘴鮊的增重率分别为1.59。说明回交鮊的相对生长速率均高于翘嘴鮊群体(P<0.01)，且回交鮊(耐低氧鲂鮊♀×翘嘴鮊♂)具有最高的生长速率。
附图说明
附图1为“耐低氧团头鲂”♀、翘嘴鲌♂亲本及杂交子代的形态。其中A：耐低氧团头鲂；B：翘嘴鲌；C：鲂鲌杂种A型；D：鲂鲌杂种B型。
附图2为“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌♂杂交子代的DNA含量分析。其中A：耐低氧团头鲂；B：翘嘴鲌；C：鲂鲌杂种A型；D：鲂鲌杂种B型。
附图3为耐低氧团头鲂、翘嘴鲌及其杂交子代的核型。其中A：耐低氧团头鲂；B：翘嘴鲌；C：鲂鲌杂种A型；D：鲂鲌杂种B型。
附图4为TTF10、TTF6引物在鲂鲌杂种A型和B型中的PAGE图谱。上图为引物TTF10，下图为引物TTF6；M：50bp DNALadder；1-4：鲂鲌杂种B型；5-30：鲂鲌杂种A型。
附图5为回交鲌及其亲本的形态。
附图6为回交鲌的DNA含量。
附图7为翘嘴鲌、耐低氧鲂鲌及其杂交子代的核型。其中A-B：翘嘴鲌；C-D：翘嘴鲌；E-F：翘嘴鲌♀×耐低氧鲂鲌♂；G-H：耐低氧鲂鲌♀×翘嘴鲌♂。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1耐低氧团头鲂与翘嘴鲌远源杂交群体的建立
1.1材料
1.1.1亲本来源及繁殖流程
实验使用的母本为“耐低氧团头鲂”，是由团头鲂“浦江1号”经过2次低氧胁迫后选择出耐低氧群体，然后利用该耐低氧群体建立100个选育家系，最后从这100个家系中选择出兼具生长优势和耐低氧性状的个体，并以此为亲本进行扩繁进而获得了“耐低氧团头鲂”；父本为正常翘嘴鲌，父母本均为3龄，性成熟且发育良好。
“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌♂的杂交实验于上海海洋大学青浦鱼类育种实验站进行。选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出成熟卵子的性成熟“耐低氧团头鲂”为母本，同样，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的的翘嘴鮊为父本。于下午4时先对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)进行催产，绒毛膜促性腺激素(HCG)的用量为1000U/kg，促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。然后按照1：2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；次日早上捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜。待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到大塘进行培育。
1.1.2实验试剂
LRH-A、HCG(催产用激素)、超纯水、细胞核提取液DAPI(nuclei extraetionsolution,德国Partec公司)、PHA(上海阳光试剂有限公司)、肝素、秋水仙素、氯化钠、氯化钾、Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O、Giemsa染液、甘油、CH3OH、乙醇、冰醋酸等购于上海生工生物有限公司，DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。
试剂具体配法如下：
0.75％的生理盐水：称取7.5g的NaCl溶于l000ml超纯水；
PHA：配成4mg/ml；
秋水仙素：用无菌生理盐水配成浓度为1mg/ml；
低渗溶液：用超纯水配成浓度为0.5％KCI；
磷酸缓冲液(PBS)：[36mlA液+14mlB液]，PH＝7.2；
A液：取35.82g Na2HPO4·12H2O溶解于500ml的超纯水中；
B液：取6.242g NaH2PO4.2H2O溶解于200ml的超纯水中；
Giemsa工作液：将Giemsa母液用磷酸缓冲液(PBS)稀释10倍即可；
卡诺氏固定液：将甲醇、冰醋酸以3：1的比例配制，现配现用。
1.2方法
1.2.1耐低氧鲂鮊杂种F1的形态和生长测量
将同期的耐低氧鲂鮊杂种F1鱼苗1000尾、耐低氧团头鲂自交和翘嘴鲌自交子代的鱼苗各200尾放于600m2的养殖塘，经180天的喂养后，对其进行拉网起捕，随机取样30尾进行了全长、体长、体高和体重的测量，设置3个平行并拍照。采用t检验(t-test)2个平均值之间的差异显著性，P<0.01为存在显著性差异，P>0.01为不存在显著性差异。
1.2.2耐低氧鲂鮊杂种F1的倍性检测
用肝素钠浸润注射器抗凝后，从鲂鲌杂交子代尾部脊柱下静脉采血，然后取3～5μL血样加入到1ml DAPI染液中，避光染色30～60s，用500目过滤管过滤到上样管内。然后用Partec流式细胞仪对鲂鲌杂交后代进行了DNA含量检测，检测到3000～10000个细胞时即停止检测。以标准二倍体耐低氧团头鲂、翘嘴鲌为参照。为减小误差，检测样本数均大于10，然后取平均值。
1.2.3耐低氧鲂鮊杂种F1的染色体制备
1.实验用鱼缸加满水，用加热棒升温至～24℃，实验前鱼暂养3天，不投喂。
2.PHA注射：下午4-5点注射，每管PHA加2ml鱼用生理盐水稀释(0.75％NaCl，需灭菌)，每条鱼注射0.5ml/50g鱼，根据鱼体重调节用量。
3.秋水仙素(用无菌水配成1mg/ml母液备用)注射：第2天上午8点注射秋水仙素，注射剂量为1-2ug/g鱼体重，每条鱼的注射体积控制在0.2ml。
4.解剖：注射秋水仙素3-4小时后，立即剪断鱼两侧鳃耙，放于水中放血20min，解剖，取鱼头肾；头肾放于4ml鱼用生理盐水中漂洗一次，去除表面血液。
5.低渗：头肾放于4ml鱼用生理盐水中，用2把镊子反复撕扯，直至淋巴细胞充分释放；将细胞悬浮液移入离心管中(用300目的筛网过滤)，1000转离心5分钟，吸去上清；然后加入6ml0.5％的KCl低渗液(37℃预热，现配)，立即混匀，于37℃静置低渗60分钟；低渗结束后，1000转离心5分钟，吸去上清。
6.固定：加入6ml冰冻(-20℃)固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1，现配)，用吸管小心混匀，固定20分钟，吸去上清。再以同样的方法各固定、离心两次；最后，加入或剩余适量的冰冻固定液(1-2ml)，混匀后，进行滴片。
7.滴片：新玻片浸泡于无水乙醇中1天以上，用前用干净纱布按同一个方向擦干，然后放于无菌水中，在-20℃冰箱中放置10-30分钟，待水面表层冻结后，用手捏住玻片两侧，玻面朝上取出(尽量在玻面上保留冰水，有利于染色体展开)。用吸管在玻片滴三滴，滴管距玻片50公分以上(需操作练习)。
8.干燥：玻片倾斜放置于搪瓷盘沿上，室温或37℃烘箱放一小时，干燥后即可。
9.染色：玻片正面朝上，架于两根玻片或大号离心管架上(防止染色液渗于玻片反面)，滴上约2ml 4％的Giemsa染色液(用PH＝7.2的PBS稀释，现用现配)，平铺，室温染色15分钟，之后用自来水冲洗一下。玻片倾斜放于搪瓷盘上，37℃烘箱放置1小时，干燥后即可镜检。
10.镜检：先用10倍物镜观察，找出清晰、分散良好的分裂相后，用油镜观察，调整到合适的亮度后，拍摄照片并保存。
1.2.4耐低氧鲂鮊杂种F1的微卫星分析
耐低氧鲂鮊杂种F1随机取自单养池塘(20m×30m)，包括鲂鲌中间型(杂种A型)个体100尾和偏母本型(杂种B型)个体4尾用于实验。从20对团头鲂微卫星引物中，筛选出2对在翘嘴鲌基因组中也能扩增出条带的微卫星引物TTF6和TTF10(表1-1)对鲂鲌杂交子代进行微卫星分析。
表1-1微卫星引物序列
DNA的提取使用北京天根生物科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。具体步骤如下：
1)剪取不多于30mg的鱼鳍，放入含有200μL GA缓冲液的离心管中，用组织研磨器研磨45-60s至磨碎。
2)加入20μL蛋白酶K溶液，将离心管置于56℃气浴恒温振荡器中消化，直至鱼鳍完全溶解。
3)加入200μL GB，彻底摇匀，置于70℃水浴锅加热10min，简短离心。
4)加入200μL乙醇，充分颠倒混匀，会有絮状沉淀，简短离心。
5)将前一步所得物转加入吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，倒掉废液。
6)加入500μL GD，12000rpm离心1min，倒掉废液。
7)加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液。
8)重复上一步。
9)再次12000rpm离心2min，倒掉废液。
10)将CP3转入一个新的干净的离心管中，室温放置2-5min。
11)向离心柱中央悬空滴加50μL DEPC水于CP3，室温放置5min，12000rpm离心2min，将DNA洗脱到离心管中。
PCR反应体系10ul，包括5ul含染料的2×Taq PCR MasterMix(Taq DNAPolymerase:0.1U/ul；MgCl2:4mmol/L；dNTPs each:0.4mmol/L)，上下游引物各0.5ul(10umol/L)，0.5ul模板DNA(30-50ng)，3.5ul ddH2O。PCR反应在EppendorfMastercycler ep gradients型PCR仪上进行，反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，50-65℃(据引物调整)30s，30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，上样产物量为0.8ul，DNA Marker(50bp DNA Ladder)上样量为1ul。电泳条件：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳1.6h。电泳完成后，进行硝酸银染色，最后将胶片平铺于干净的观灯箱上，拍照分析。
1.3结果
1.3.1耐低氧鲂鲌杂种F1的形态特征
“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌♂杂交的受精率为90.0％，孵化率为80.6％。且耐低氧鲂鮊杂种F1中存在形态明显不同的2个群体(图1)，其中，96.2％为鲂鲌中间型(杂种A型)，形态特征介于父母本之间(图1C)，3.8％为杂种B型，形态特征与母本“耐低氧团头鲂”相似(图1D)。鲂鲌杂种A型的身体扁平、体型较长，与父本翘嘴鲌相似，而其体厚、体高又显著提高，趋向于母本“耐低氧团头鲂”。此外，鲂鲌杂种A型的头较母本稍大，头后背部不似团头鲂急剧隆起，仅有轻微的隆起；其嘴部虽有上翘，但不如父本翘嘴鲌明显。鲂鲌杂种A型的体色介于父母本之间，背部呈青灰色，两侧银灰色，腹部银白；其鳞片较大，类似母本，但薄软程度有倾向于父本。
1.3.2耐低氧鲂鲌杂种F1的倍性分析
用Partec流式细胞仪测定了“耐低氧团头鲂”、翘嘴鲌及其杂交子代耐低氧鲂鮊杂种F1的DNA含量。表2结果显示：鲂鲌杂种A型的DNA平均相对含量为47.85，是耐低氧团头鲂的0.95倍，是翘嘴鲌的1.04倍，介于耐低氧团头鲂和翘嘴鲌之间，应为二倍体(图2)。鲂鲌杂种B型的DNA平均相对含量为50.35，介于耐低氧团头鲂和翘嘴鲌之间，且与母本更为相似，也应为二倍体(表1-2)。
表1-2“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌♂杂交子代的DNA含量
1.3.3耐低氧鲂鲌杂种F1的核型分析
实验共获得杂种A型的染色体中期分裂相109个，其中染色体数为48的分裂相占总分裂相的70.1％，该染色体数目与团头鲂的染色体数目相同，证明该杂种A型为二倍体；同样的方法证明杂种B型也是二倍体。所以杂种A型和杂种B型的染色体数都为2n＝48(图3)。对其中期分裂相的染色体进行核型分析，表明其染色体都是以中部着丝点染色体(m)、亚中部着丝点染色体(sm)和亚端部着丝点染色体(st)为主，在sm染色体中发现最大染色体，说明鮊亚科鱼类的同源性程度很大。由于每个物种的染色体数目是基本稳定不变的，所以实验中发现的染色体缺少的分裂相，很可能是在染色体制备过程中发生染色体丢失或实验条件准备不充分导致。
1.3.4耐低氧鲂鲌杂种F1的微卫星鉴定
利用引物TTF6和TTF10对耐低氧鲂鲌杂种F1中的杂种A型和杂种B型进行了遗传分析(图4)。结果显示：鲂鲌杂种A型从其父母本中各获得一条带，证实其为二倍体杂交种；而鲂鲌杂种B型的带型则与母本团头鲂“浦江1号”完全一致，应是雌核发育后代。
1.3.5耐低氧鲂鲌杂种F1的生长性能
经1龄阶段的同塘土池培育，鲂鲌杂种A型展现出良好的生长优势。其全长、体长和体重指标均显著高于母本团头鲂“浦江1号”和父本翘嘴鲌(表1-3)。1龄鲂鲌杂种A型的体重平均为341.7±51.5g，分别是对照团头鲂“浦江1号”(均重213.4±30.3g)、翘嘴鲌(均重101.0±15.1g)的1.6倍和3.4倍，鲂鲌杂种A型在1龄阶段具有显著(P<0.01)的超亲生长优势。
表1-3“耐低氧团头鲂”♀×翘嘴鲌♂杂交子代的生长性能
1.4讨论
结果表明，通过鲂鲌属间杂交的形式就能进行团头鲂雌核发育群体的构建，有利于团头鲂遗传育种的种质纯化研究；也说明鱼类远缘杂交子代的组成具有随机性和不可预见性。该属间杂交的成功为生物进化和鱼类遗传育种研究提供了依据。
实施例2具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建
1.1材料
1.1.1亲本来源及繁殖流程
回交实验于选择在繁殖季节(5-6月)在上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心进行，通过耐低氧鲂鲌杂种F1(鲂鲌杂种A型)和翘嘴鲌回交的方法来获得回交鲌。繁殖实验如下：
“耐低氧鲂鲌”♀×翘嘴鲌♂：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出卵子的性成熟耐低氧鲂鲌杂种F1(以下简称“耐低氧鲂鲌”)为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的的翘嘴鲌为父本。先对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)进行催产，绒毛膜促性腺激素(HCG)的用量为1000U/kg，促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。然后按照1：2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激，最后挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜。待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m的水泥池培育。
翘嘴鲌♀ד耐低氧鲂鲌”♂：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出卵子的性成熟翘嘴鲌为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的的耐低氧鲂鲌为父本。先对母本亲鱼注射HCG与LHRH-A2进行催产，HCG的用量为1000U/kg，LHRH-A2的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。然后按照1：2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激，最后挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜。待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m的水泥池培育。
1.2方法
1.2.1回交鲌的形态观察
回交试验的受精率、孵化率和成活率均很高，每个回交组合约得到了50万正常水花鱼苗，然后选留2000尾放于水泥池培育成夏花，最后夏花经分池进而培育为一龄鱼种。为获得回交鱼苗的胚胎发育情况，从受精卵开始一直到一龄鱼种均进行了跟踪观察，并拍照保存。
1.2.2回交鲌的的倍性检测
吸去少量肝素钠润湿注射器，从回交鲌尾下静脉采血，然后取3～5μL血样加入到1mL DAPI染液中，避光染色30～60s，用500目过滤管过滤到上样管内。然后用Partec流式细胞仪对鲂鲌回交后代进行了DNA含量检测，检测到细胞数达到3000时峰值达到稳定。以正常的二倍体翘嘴鲌为对照。为避免误差，尽量检测足够多的样本数，然后取平均值。
1.2.3回交鲌的染色体制备
回交鲌的染色体制备方法同实施例1。
1.2.4回交鲌的生长性能
为了获得回交鲌在一龄阶段的生长速率，特开展了生长对比试验。试验在4m×6m的水泥池中进行，水深1.2m，试验期间曝气充氧，使溶解氧保持在6.0mg/L以上。将回交鲌及翘嘴鲌自交群体各50尾于水泥池喂养，通过剪鳍进行标记，设置3个平行组，每个平行组均投喂蛋白含量为45％的同种颗粒饲料。鱼的初始体重控制在3-5g，试验期为60天。最后用电子天平测量体质量(bodyweight,BW)，精确到0.01g。
相对生长率按下式计算：
相对生长率(％)＝[(W2-W1)/W1]×100％
式中W1、W2分别为试验初平均体重和试验末平均体重。
1.3结果
1.3.1回交鲌的形态特征
回交鲌的形态特征如图5所示，回交鲌的体型相对耐低氧鲂鲌而言变得更为细长，其体高明显小于其亲本耐低氧鲂鲌，更加接近于亲本翘嘴鲌的体型，但嘴部上翘仍然没有翘嘴鲌明显，鳞片趋于薄软但仍稍厚于翘嘴鲌。
1.3.2回交鲌的倍性分析
如图6所示，以标准的二倍体翘嘴鲌的对照，用Partec流式细胞仪测定了回交鮊(“耐低氧鲂鲌”♀×翘嘴鮊♂、翘嘴鮊♀ד耐低氧鲂鲌”♂)的DNA相对含量。结果显示：回交鮊的DNA相对含量与二倍体翘嘴鮊的一致，说明回交鮊均为二倍体。
1.3.3回交鲌的核型分析
实验发现染色体数为2n＝48的分裂相占总分裂相的71.2％，该染色体数目与父母本的染色体数目相同，证明该回交鲌为二倍体(图7)。对其染色体相对长度的臂比测定结果，回交鲌的染色体组型可分为3种：中部着丝点染色体(m)、亚中部着丝点染色体(sm)和亚端部着丝点染色体(st)。其中，翘嘴鲌♀×耐低氧鲂鲌♂的核型为16m+28sm+4st，耐低氧鲂鲌♀×翘嘴鲌♂的核型为16m+28sm+4st。
1.3.4回交鲌的生长性能
经60日的同池培育，回交鮊(“耐低氧鲂鲌”♀×翘嘴鮊♂、翘嘴鮊♀ד耐低氧鲂鲌”♂展现出一定的生长优势。其增重率均高于翘嘴鲌(表2-1)。60日龄的耐低氧鲂鮊♀×翘嘴鮊♂和翘嘴鮊♀×耐低氧鲂鮊♂的平均相对增重率分别为2.04和2.03，而60日龄的翘嘴鮊的增重率分别为1.59。说明回交鮊的相对生长速率均高于翘嘴鮊群体(P<0.01)，且回交鮊(耐低氧鲂鮊♀×翘嘴鮊♂)具有最高的生长速率。
表2-1回交鲌的生长性能
1.4讨论
本发明中的回交鮊是利用二倍体可育的耐低氧鲂鮊杂种F1与翘嘴鮊回交而得，该回交鮊的获得为鱼类遗传育种提供了宝贵的实验材料；也说明生物在进化方式的选择上又多了一种可能，增加了进化方式的多样性。由于该回交鮊均为二倍体，可以推测其具有可育性，因此可进一步进行雌核发育研究和多倍体研究，为回交鮊种质的纯化和多倍体育种奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以耐低氧团头鲂为母本，以翘嘴鲌为父本，经杂交后获得两性可育的耐低氧鲂鮊杂种F1；
2)在鲂鮊杂种F1中选择鲂鲌杂种A型与翘嘴鲌进行回交育种，获得回交鮊。
2.根据权利要求1所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述步骤1)的耐低氧团头鲂来源如下：由团头鲂“浦江1号”经过2次低氧胁迫后选择出耐低氧群体，然后利用该耐低氧群体建立100个选育家系，最后从这100个家系中选择出兼具生长优势和耐低氧性状的个体，并以此为亲本进行扩繁进而获得的耐低氧团头鲂。
3.根据权利要求1所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述步骤2)的鲂鲌杂种A型的形态特征如下：形态特征介于父母本之间，身体扁平、体型较长，后背仅有轻微的隆起，与父本翘嘴鲌相似。
4.根据权利要求1所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述步骤1)具体如下：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出成熟卵子的性成熟耐低氧团头鲂为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的翘嘴鲌为父本，对亲本进行人工催产，按照1:2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜；待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到大塘进行培育。
5.根据权利要求4所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述人工催产包括如下步骤：于下午4时先对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)进行催产，绒毛膜促性腺激素(HCG)的用量为1000U/kg，促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。
6.根据权利要求1所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述步骤2)具体如下：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出卵子的性成熟鲂鲌杂种A型为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的的翘嘴鲌为父本，对亲本进行人工催产，按照1:2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜；待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m的水泥池培育。
7.根据权利要求1所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述步骤2)具体如下：选择腹部饱满，双手轻压腹部能流出卵子的性成熟的翘嘴鲌为母本，选择双手轻压腹部能自然流出白色精液的鲂鲌杂种A型为父本，对亲本进行人工催产，按照1:2的雌雄比例放入产卵池中，持续流水刺激；捞起亲鱼挤取卵子和精子进行人工干法授精，受精卵放入孵化桶中孵化至出膜；待鱼苗卵黄囊消失，并能够平游时，将鱼苗转移到4m×6m的水泥池培育。
8.根据权利要求6-7所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述人工催产包括如下步骤：先对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)进行催产，绒毛膜促性腺激素(HCG)的用量为1000U/kg，促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)的用量为5μg/kg；再对父本注射HCG与LHRH-A2催产，所注射剂量较母本减半。
9.根据权利要求1所述具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法，其特征在于，所述回交鮊在一龄阶段的60日增重率为2.04。
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