CN101946738B - 日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鱼类的品种间近缘杂交方法，具体公开了一种日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法，包括以下步骤：首先，以日本白鲫和红鲫作为亲鱼进行专池培育，然后在繁殖季节对所述亲鱼进行人工催产，挑选催产效果良好的亲鱼进行人工干法授精，对授精完成后的受精卵进行流水孵化，对孵化后的鱼苗进行饲养，对饲养后的杂交鱼进行检测、筛分，获得日本白鲫和红鲫杂交鱼。本发明方法制得的杂交鱼不仅表现出杂交优势性状，而且两性可育，其自交后代性状基本保持稳定，没有出现大量性状分离的现象，在生物进化和鱼类遗传育种方面具有重要的意义。

Description

日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法

技术领域

本发明涉及一种鱼类杂交的方法，尤其涉及一种鲫鱼品种间近缘杂交的方法。

背景技术

怎样利用现有的鱼类自然资源，快速的培育具有优良性状的新品种，是遗传育种工作者需要解决的问题。杂交技术是改良鱼类性状常用的方法之一。目前，世界上通过人工杂交途径培育了很多新养殖对象。杂交的主要特点在于可以快速获得杂种优势。通过杂交，可以改变鱼类的遗传特性，将亲本的优点集中于杂种后代，通过进一步选育可获得新品种或新品系。近缘杂交(即种内杂交)，是指同一物种内不同亚种之间的杂交或同一物种内不同品种之间的杂交，所得杂种后代称为近缘杂种。近缘杂交由于亲缘相近，一般不会出现不可交配性及杂种育性困难现象。然而，如何利用和改进现有的生物学技术和方法，挑选合适的亲本鱼进行近缘杂交，对其进行遗传改良以获得性状更为优良、品种更加丰富和对遗传研究更有意义的新品种或新品系，已成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种受精率高、孵化率高、能整合父母本优良性状且性状能稳定遗传、对遗传育种具有重要意义的日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法，包括以下步骤：首先，以日本白鲫和红鲫作为亲鱼进行专池培育，然后在繁殖季节对所述亲鱼进行人工催产，挑选催产效果良好的亲鱼进行人工干法授精(进行正反交试验)，对授精完成后的受精卵进行流水孵化，对孵化后的鱼苗进行饲养，对饲养后的杂交鱼进行检测、筛分，获得日本白鲫和红鲫杂交鱼(两种新型的杂交鱼)。

作为对上述技术方案的进一步改进，上述的日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法，具体包括以下步骤：

1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前4～5个月，挑选体重500g以上、性成熟特征明显、体征良好(体征良好的亲鱼一般表现为体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤)的日本白鲫和红鲫作为杂交的亲鱼进行专池培育；在繁殖期前一个月，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

2)人工催产：在当年的4月上旬至5月上旬，当水温稳定在20℃～24℃时，为上述亲鱼注射黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素与地欧酮的混合催产剂进行催产，所述黄体素释放激素类似物的用量为8μg/kg～10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为500IU/kg～800IU/kg，地欧酮的用量为1mg/kg～2mg/kg；先注射母本亲鱼，4h～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶(1.5～2.0)的数量比将母、父本四种亲鱼放入同一产卵池中，然后视水情及时向池中冲水，在产卵前3h～4h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率；

3)授精孵化：挑选产卵量大、产卵质量高的母本亲鱼，然后与产精量大的父本亲鱼进行干法人工授精，得到的受精卵置于水温为20℃～24℃的培养皿中进行流水孵化；

4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，每天定时沿池堤泼洒豆浆，上下午各一次，鱼苗长成后经检测、筛分获得日本白鲫和红鲫杂交鱼。

上述技术方案中，日本白鲫(Carassius auratus，cuviers)和红鲫(Carassius auratus，redvarity)属于鲫鱼中的两个品种，日本白鲫属于鲤科(Cyprinidae)、鲫属(Carassius)、鲫种(Carassius auratus)中的二倍体鱼(2n＝100)，其体形高而侧扁，其背部隆起较明显，头稍小，尾柄较细长，体色银白，适应性强，耐寒、耐高温、性成熟早、繁殖率高、养殖成本低；红鲫同样隶属于鲤科(Cyprinidae)、鲫属(Carassius)、鲫种(Carassius auratus)中的二倍体鱼(2n＝100)，其体形优美，抗逆性强，肉质细嫩。与现有技术相比，本发明的优点在于通过反复实验最终选择日本白鲫和红鲫作为亲本来生产优质、高产的新品种鱼类，相比同类杂交试验，其受精率和孵化率得到了显著提高，其杂交后代整合了父母本体形优美、生长迅速、肉质细嫩、营养价值高、抗逆性强等优良性状，而且两性可育，杂交鱼的自交后代并未出现大量性状分离现象，表现出较好的遗传稳定性。在本方法中，日本白鲫和红鲫种的杂交后代除具有生长速度快、抗逆性强、经济性状整齐、外形优美等特点外，其自交后代并未出现大量性状分离的现象。本发明方法获得的新型品种间杂交鱼在鱼类育种和生物进化方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中日本白鲫的外形照片；

图2为本发明实施例中红鲫的外形照片；

图3为本发明实施例中日本白鲫(♀)×红鲫

杂交鱼的外形照片；

图4为本发明实施例中日本白鲫(♀)×红鲫杂交鱼的染色体图(2n＝100)；

图5为本发明实施例中红鲫(♀)×日本白鲫

杂交鱼的外形照片；

图6为本发明实施例中红鲫(♀)×日本白鲫

杂交鱼的染色体图(2n＝100)；

图7为本发明实施例中日本白鲫的DNA含量图；

图8为本发明实施例中红鲫的DNA含量图；

图9为本发明实施例中日本白鲫(♀)×红鲫

杂交鱼的DNA含量图；

图10为本发明实施例中红鲫(♀)×日本白鲫

杂交鱼的DNA含量图。

具体实施方式

实施例

在繁殖期前4～5个月，挑选体重500g以上、性成熟特征明显、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤的日本白鲫(见图1)和红鲫(见图2)作为杂交的亲鱼进行专池培育，合理投喂饲料，特别是在繁殖期前一个月左右每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺良好发育。

在当年的4月上旬至5月上旬，当水温稳定在20℃～24℃时，挑选体征良好、性腺发育良好的上述亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)、绒毛膜促性腺激素(HCG)与地欧酮(DOM)的混合催产剂进行催产，所述LRH-A的用量为8μg/kg，HCG的用量为500IU/kg，DOM用量为1mg/kg；先注射母本亲鱼，4h～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶(1.5～2.0)的数量比将母、父本四种亲鱼放入同一水面面积为80m²左右的圆形产卵池中，然后据水情及时向池中冲水，尤其在产卵前3h～4h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。同时，水面吊一纱窗网片，以检测亲鱼的发情产卵情况；注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率。

当发现亲鱼在产卵池中呈“螺旋状”追逐、且纱窗网片上沾有适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼进行检测(注意要用软质网，操作要轻，水中检测)，挑选产卵量大、产卵质量高的母本亲鱼，然后与产精量大的父本亲鱼进行干法人工授精(人工干法授精的父母本亲鱼应为不同品种的亲鱼)，把精卵挤入干净的瓷盆中，用干净的羽毛不停地搅拌2min～3min，然后迅速用羽毛将受精卵均匀铺设于事先准备好的装有少量水的直径约为24.5cm的干净培养皿中，密度控制在600～800粒/培养皿左右，当受精卵粘于培养皿上后用清水轻轻漂洗一遍，然后马上放入室温为20℃～24℃的孵化房中进行流水孵化。

鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，每天定时沿池堤泼洒豆浆，上下午各一次，直至鱼苗长到能正常摄食后经检测、筛分获得如图3、图5所示的日本白鲫和红鲫杂交鱼。

第二年繁殖季节(4月上旬到5月上旬)，对上述制得的杂交鱼进行自交繁殖试验，人工催产、授精、孵化及饲养方法与上述亲本的操作方法一致，以观察其后代的性状分离情况。

孵化期间，统计胚胎的受精率和孵化率。日本白鲫(♀)和红鲫杂交的受精率和孵化率分别为90.2％和81.5％；红鲫(♀)和日本白鲫

杂交的受精率和孵化率分别为90.％和82.3％。相比同类杂交试验，其受精率和孵化率得到了显著地提高。日本白鲫(♀)×红鲫

杂交鱼自交的受精率和孵化率分别为91.6％和83.8％；红鲫(♀)×日本白鲫

杂交鱼自交的受精率和孵化率分别90.7％和81.9％。这表明杂交鱼自身两性可育，并具有较高的受精率和孵化率。

再用外周血细胞培养方法和染色体制片法对本实施例得到的日本白鲫和红鲫杂交鱼的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现杂交后代均为二倍体(2n＝100)，未出现多倍体，染色体图分别如图4和图6所示。

同时，以红鲫为参照，用流式细胞仪测定日本白鲫、红鲫及它们杂交后代红细胞中的DNA含量，结果分别如图7～图10所示。分析图中数据可知，日本白鲫、红鲫、日本白鲫(♀)×红鲫

杂交鱼和红鲫(♀)×日本白鲫杂交鱼的DNA平均含量分别为109.18、103.49、106.54、和107.11，红鲫(♀)×日本白鲫

与对照红鲫的DNA平均含量比值为1.035，该比值与预计的1∶1理论比值间无显著差异；日本白鲫(♀)×红鲫

与对照红鲫的DNA平均含量比值为1.029，该比值与预计的1∶1理论比值间同样无显著差异。这些试验结果与外周血细胞培养方法和染色体制片法获得的结果是一致的。

上述杂交鱼的鱼苗饲养3～4个月后，随即抽样、测量分析其生物学性状相关数据，并分别与亲本的各项已知数据进行比较，结果如下表1所示：

表1：日本白鲫、红鲫及杂交后代的可数性状比较(单位：片或条)

注：1、^*标示栏的前者为母本，后者为父本；2、上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。

上述表1中可数性状相关数据表明：两种杂交后代鱼在外型上基本上整合了其父母本日本白鲫和红鲫的特征，如日本白鲫(♀)×红鲫

与红鲫(♀)×日本白鲫

的侧线鳞数均为为30～32，介于日本白鲫的32～34和红鲫的28～30之间；另外，在体色上，两种杂交后代鱼均为银白色，没有出现红色的杂交后代鱼，表明红色基因相对于银白色基因可能为隐性(参见图3、图5)。此外，杂交鱼自交后代外形与亲本相似，其所有可数性状与亲本无显著差异，其体色同样是银白色，并未出现大量性状分离的现象。

本实施例中，外周血细胞培养的染色体倍性检测方法操作步骤为：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84ml RPMI-1640，15ml小牛血清，2支PHA，1ml 0.1％的肝素钠，以7.5％NaHCO₃(无菌)或1N HCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养基中，于24℃5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68h～72h，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前24h，在培养液中用1ml注射器滴加10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05μg/ml～0.07μg/ml；以上步骤1～4均需无菌操作；5)将培养物全部转入洁净的10ml离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清液；6)向离心管中加入低渗液9ml，混匀，低渗25min～30min；7)加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5min，弃上清液；8)加入4ml固定液，轻轻混匀，静置20min后1000rpm离心5min，弃上清液；9)重复步骤8一次；10)视最后细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1ml～2ml)后，吸取细胞悬液自20cm～30cm高处滴片，轻吹散，空气中自然干燥；11)Giemsa染液染色20min～40min，细水流冲洗载玻片背面去除染液，气干后镜检、拍照。

本实施例中，流式细胞DNA含量测定法的操作步骤为：用经肝素钠润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10min～15min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5min～10min，然后上机检测。

本实施例方法获得了两种新型的品种种间杂交鱼，新品种不仅整合了父母本亲鱼的多项优良性状，表现出明显的杂交优势，还显著提高了杂交的受精率和孵化率，提供了一种快速形成优良新品种鱼的途径，在生物进化研究和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。

Claims (2)

1.一种日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法，包括以下步骤：首先，以日本白鲫和红鲫作为亲鱼进行专池培育，然后在繁殖季节对所述亲鱼进行人工催产，挑选催产效果良好的亲鱼进行人工干法授精，对授精完成后的受精卵进行流水孵化，对孵化后的鱼苗进行饲养，对饲养后的杂交鱼进行检测、筛分，获得日本白鲫和红鲫杂交鱼。

2.根据权利要求1所述的日本白鲫和红鲫品种间杂交的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前4～5个月，挑选体重500g以上、性成熟特征明显、体征良好的日本白鲫和红鲫作为杂交的亲鱼进行专池培育；在繁殖期前一个月，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

2)人工催产：在当年的4月上旬至5月上旬，当水温稳定在20℃～24℃时，为上述亲鱼注射黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素与地欧酮的混合催产剂进行催产，所述黄体素释放激素类似物的用量为8μg/kg～10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为500IU/kg～800IU/kg，地欧酮的用量为1mg/kg～2mg/kg；先注射母本亲鱼，4h～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶(1.5～2.0)的数量比将四种亲鱼放入同一产卵池中，然后视水情及时向池中冲水，在产卵前3h～4h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；

3)授精孵化：挑选产卵量大、产卵质量高的母本亲鱼，然后与产精量大的父本亲鱼进行干法人工授精，得到的受精卵置于水温为20℃～24℃的培养皿中进行流水孵化；

4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，每天定时沿池堤泼洒豆浆，上下午各一次，鱼苗长成后经检测、筛分获得日本白鲫和红鲫杂交鱼。

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