CN110214753B - 选育四倍体金冠鱼的方法及其品系的建立方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法，包括如下步骤：以雌性改良异源四倍体鲫鲤为母本，雄性二倍体鲤鲫F2为父本，在繁殖季节进行人工催产，人工干法授精，将得到的受精卵置于孵化槽中以流水孵化，待鱼苗全部孵化、出现腰点后进行饲养，再对饲养后的鱼苗通过生物学方法进行检测及筛分，即得到四倍体金冠鱼。该方法得到的四倍体金冠鱼具有两性可育、生长速度快、体形优美、体色独特、繁殖力好、抗逆能力强等优点，不仅可作为漂亮的观赏鱼类，而且提供了宝贵的四倍体鱼资源。本发明还提供该四倍体金冠鱼品系的建立方法以及该四倍体金冠鱼的应用，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于鱼类远缘杂交技术领域，尤其涉及一种通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法及四倍体金冠鱼品系的建立方法和应用。
背景技术
通过长期系统的研究，本研究团队利用雌性普通红鲫和雄性湘江野鲤远缘杂交，在F1代获得了鲫鲤F1，鲫鲤F1群体中存在部分的可育雌、雄性个体，将选育出来的可育的雌、雄鲫鲤F1再进行自交获得了鲫鲤F2，鲫鲤F2群体的可育雌、雄个体非常少，并且大部分精液都是水样精液，通过在成千上万的鲫鲤F2群里中进行筛选，将获得的极少的可育雌雄个体进行自交，获得了异源四倍体鲫鲤。利用异源四倍体鲫鲤产生的二倍体卵子，进行不经过染色体加倍的操作处理获得了雌核发育二倍体体鲫鲤克隆品系。利用雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系产生的二倍体卵子与异源四倍体鲫鲤产生的二倍体精子受精，获得了在生长速度、繁殖力等方面具有明显改善的改良异源四倍体鲫鲤群体。
以优质橙黄色的锦鲤和优质彩色的雄性花鲫远缘杂交，在F1代获得了二倍体鲤鲫，鲤鲫 F1雌雄两性可育，选育优质健壮的鲤鲫F1自交获得了二倍体鲤鲫F2。二倍体鲤鲫F2具有独特的外形特征，其头部颜色金灰相间，鳞片外缘呈金黄色，背部呈整齐的金黄色，有口须，头部有一个明显黑色斑点，体形优美，体色独特，具有很高的观赏价值。但是二倍体鲤鲫F2的繁殖力相对较差，生长速度慢，制约了二倍体鲤鲫F2的规模化生产。
远缘杂交是指种间、属间乃至亲缘关系更远的生物类型之间的杂交。远缘杂交可以使基因组从一个物种转移到另一个物种中，从而导致杂交后代的基因型和表现型都发生变化。在基因型方面，远缘杂交能导致杂交后代在染色体组水平上的改变，从而产生杂交二倍体、三倍体、四倍体后代；在表现型方面，远缘杂交能整合双亲的优点，使杂交后代在外形、生长速度、存活率及抗病能力等方面均表现出杂种优势。因此，如果将改良异源四倍体鲫鲤群体与二倍体鲤鲫F2进行远缘杂交，将有望得到兼具两性可育、生长速度快、体形优美、体色独特、繁殖力好、抗逆能力强等优点的杂交后代。然而，这两种鱼在分类、倍性、体形等生物学特性方面存在较大差异，尤其是二倍体鲤鲫F2的繁殖能力差，很难产生乳白色的精液，并且大部分是水样精液，难以得到存活的杂交后代，导致二者间的远缘杂交存在较大困难。
此外，两性可育的四倍体鱼品系是大规模制备100％不育三倍体鱼(通常在生长速度、抗病性、抗逆性以及肉质等方面表现出显著的杂种优势)的核心亲本种质资源，尽管目前已研制出一些四倍体鱼品系，但两性可育的四倍体鱼品系种质资源仍非常少，一直以来存在供不应求的境况，严重制约了不育三倍体鱼的规模化生产。开发研制新的四倍体鱼品系种质资源，对鱼类育种领域具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法及四倍体金冠鱼品系的建立方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法，包括如下步骤：以雌性改良异源四倍体鲫鲤为母本亲鱼，雄性二倍体鲤鲫F2为父本亲鱼，分别进行专池培育，在繁殖季节对所述母本亲鱼和父本亲鱼进行人工催产，人工干法授精，将得到的受精卵置于孵化槽中以流水孵化，待鱼苗全部孵化、出现腰点后进行饲养，再对饲养后的鱼苗通过生物学方法进行检测及筛分，得到的四倍体鱼即为四倍体金冠鱼。
上述的方法，优选的，所述母本亲鱼、父本亲鱼分别进行专池培育的具体操作包括如下步骤：在当年的2月初，拉网打鱼，从中挑选性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的雌性改良异源四倍体鲫鲤和雄性二倍体鲤鲫F2作为远缘杂交的亲本，置于专池进行培育，在培育期间，时刻注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，保证繁殖期的亲本具有良好的状态，做好饲养管理工作，在繁殖期前一个月，每天以流水刺激，促进亲鱼性腺发育成熟。
优选的，所述人工催产的具体操作包括如下步骤：在当年的4月底至5月初，当水温稳定在22-24℃时，从专池培育后得到的亲鱼中挑选出腹部膨大、松软且有弹性的雌性改良异源四倍体鲫鲤作为母本，和轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性二倍体鲤鲫F2作为父本，进行人工催产，采用两针注射法，第一针于下午4-5点注射，对母本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物(LRH-A)10-12μg/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物5-6 μg/kg，间隔6-8h后再进行第二针注射，对母本注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素(HCG) 20-25μg/kg、促黄体素释放激素类似物20-25μg/kg以及垂体后叶素为1g/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12μg/kg；注射完毕后按2:1的数量比将父本、母本亲鱼放入同一产卵池中，并以流水刺激，直至第二天顺利产精和产卵。
优选的，所述人工干法授精的具体操作包括如下步骤：挑选能够顺利产卵的雌性改良异源四倍体鲫鲤，将其卵子挤到干净干燥的盆中，同时将雄性二倍体鲤鲫F2精液挤到同一盆中，用羽毛搅匀，以进行人工干法授精。
优选的，所述流水孵化的水温为20-24℃。
优选的，所述饲养的具体操作包括如下步骤：待鱼苗全部孵化、出现腰点后转入事先用豆浆已培肥的水泥池中饲养，放苗后每天向水泥池中泼洒豆浆两次，放入圆藻，以保证鱼苗的营养供给，待鱼苗长到5-8cm长后开始喂饲料粉。
优选的，所述生物学方法包括：外周血细胞培养法、流式细胞法、血涂片法和外形测量法。
为了克服雌性改良异源四倍体鲫鲤与雄性二倍体鲤鲫F2远缘杂交存在的困难，我们运用了群体选育法，雄性二倍体鲤鲫F2不注射催产药物的情况下，很难挤出乳白色的精液，并且大部分是水样精液，为了能够找到精液丰富的二倍体鲤鲫F2，我们对大量的二倍体鲤鲫F2进行人工催产，一方面要研究新的催产药物组合及注射方法和用量，以增加亲鱼的产精量；另一方面尽量避免通过人工挤压的方法来辨别雌雄性别的区分，以减少对亲鱼的伤害，增加亲鱼的存活率。为了获得高质量的卵子和精子，我们采用了两针注射法，并选择了最佳的催产药物组合、剂量、注射时间和催产水温，以便获得优质的卵子和精子，进而明显提高四倍体金冠鱼的成活率。在辨别二倍体鲤鲫F2雌雄性别时，通过鱼的外部形态来辨别，性成熟的雌性个体鳃盖是光滑的，没有追星，而雄性个体的鳃盖是粗糙的，有追星，这一方法的运用对亲本鱼的保护有重要作用。
基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种四倍体金冠鱼品系的建立方法，包括如下步骤：在上述方法选育得到的四倍体金冠鱼中，选择腹部膨大、松软的雌性四倍体金冠鱼和生长健壮、挤压腹部能看到明显精液的雄性四倍体金冠鱼进行催产，采用两针注射法，第一针于下午4-5点注射，对母本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12μg/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物5-6μg/kg，间隔6-8h后再进行第二针注射，对母本注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素20-25μg/kg、促黄体素释放激素类似物20-25μg/kg以及垂体后叶素为1g/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12μg/kg；然后按雌雄配比1:2放入到水泥池中，控制水温24-25℃，直至顺利产精和产卵，进行人工干法授精，得到自交后代至少再通过两代连续自交，获得遗传性状稳定、两性可育的四倍体金冠鱼品系。
基于一个总的技术构思，本发明还相应提供上述方法获得的四倍体金冠鱼的应用，利用所述四倍体金冠鱼与二倍体鱼杂交培育得到三倍体鱼。
上述的应用，优选的，所述四倍体金冠鱼与二倍体鱼杂交培育得到三倍体鱼的具体方法包括如下步骤：选择腹部膨大、松软的雌性二倍体锦鲫为母本，采用一针注射法进行人工催产，注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素600μg/kg、促黄体素释放激素类似物6μg/kg、地欧酮1μg/kg；选择体型健壮、发育良好、细长的雄性四倍体金冠鱼为父本，采用一针注射法进行人工催产，注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素300μg/kg、促黄体素释放激素类似物 4μg/kg，注射之后按雌雄数量比例为1:2搭配放入产卵池中进行催产，池中放入网片和棕片，当网片或棕片上出现卵粒时，半小时之后，打网捕捞亲本鱼进而收集精子和卵子以进行人工干法授精，然后将受精卵均匀铺撒在网片上放入流水中进行孵化，控制水温为24-25℃，孵化后即得到三倍体鱼。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法，首次利用雌性改良异源四倍体鲫鲤与雄性二倍体鲤鲫F2进行亚科间的远缘杂交，并成功选育获得一种具备杂交优势的新型四倍体杂交鱼，该方法杂交形成的可育新型四倍体金冠鱼具有两性可育、生长速度快、体形优美、体色独特、繁殖力好、抗逆能力强等优点，不仅可用来作为漂亮的观赏鱼类，而且提供了宝贵的四倍体鱼资源，为鱼类多倍化研究提供了很好的材料，为今后大规模制备三倍体鱼提供了重要的亲本来源，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。
2、本发明四倍体金冠鱼品系的建立方法，方法简单，能够成功建立遗传性状稳定、两性可育的四倍体金冠鱼品系，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义，在生产应用上，为培育新型金冠鱼提供了优质的种质资源库。
3、本发明的应用，利用四倍体金冠鱼与二倍体鱼杂交成功培育得到生长速度快、抗逆性强、不育的三倍体鱼，为获得大量的生长速度快、抗逆性强的观赏鱼提供了一种有效的途径，同时由于三倍体的不育性，对于观赏鱼的种质资源保护具有重要作用，非富了三倍体鱼的类型，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1得到的四倍体金冠鱼外形照片；
图2是本发明实施例1得到的四倍体金冠鱼外周血细胞培养有丝分裂中期染色体图；
图3是本发明实施例1采用的二倍体鲤鲫F2的DNA含量图；
图4是本发明实施例1得到的四倍体金冠鱼的DNA含量图；
图5是本发明实施例1采用的二倍体红鲫的血涂片图；
图6是本发明实施例1得到的四倍体金冠鱼的血涂片图；
图7是本发明实施例1得到的四倍体金冠鱼的精子扫描电子显微镜图1；
图8是本发明实施例1得到的四倍体金冠鱼的精子扫描电子显微镜图2；
图9是本发明实施例1采用的二倍体鲤鲫F2的精子扫描电子显微镜图1；
图10是本发明实施例1采用的二倍体鲤鲫F2的精子扫描电子显微镜图2。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法，包括如下步骤：
(1)亲鱼的挑选与培育：在当年的2月1日至2月10日，拉网打鱼，从中挑选性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的雌性改良异源四倍体鲫鲤和雄性二倍体鲤鲫F2作为远缘杂交的母、父本置于专池进行培育，专池培育期间，注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，做好饲养管理工作，特别是在繁殖期前一个月左右，每天以流水刺激，促进亲鱼性腺发育成熟；
(2)对亲鱼进行人工催产：在当年的4月21日至5月10日，当水温稳定在22℃左右时，从专池培育的亲鱼中挑选轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性二倍体鲤鲫F2作为父本和腹部膨大、松软且有弹性的雌性改良异源四倍体鲫鲤作为母本，进行人工催产，采用两针注射法，第一针于下午4-5点对母本注射促黄体素释放激素类似物12μg/kg，对父本注射促黄体素释放激素类似物6μg/kg，间隔7h后再进行第二针注射，对母本注射绒毛膜促性腺激素 22μg/kg、促黄体素释放激素类似物23μg/kg以及垂体后叶素1g/kg，对父本注射促黄体素释放激素类似物10μg/kg，具体注射量根据亲鱼体型大小进行适量调整；注射完毕后按2:1的数量比将父、母本亲鱼放入同一水面面积为80m2左右的产卵池中，并以流水刺激，直至第二天顺利产出卵子和精子；
(3)授精孵化：次日挑选能够顺利产卵的雌性改良异源四倍体鲫鲤作为母本，将其卵子挤到干净无水的盆中，同时选择产精量大雄性的二倍体鲤鲫F2作为父本，并将精液挤到同一盆中，羽毛轻轻搅匀，以进行人工干法授精，最后将受精卵置于水温为22℃的孵化槽中进行流水孵化；
(4)鱼苗的饲养：待鱼苗脱膜且全部孵出后，在孵化槽中继续培育，直至鱼苗点腰后方可将鱼苗转入用豆浆事先已培肥的水泥池中饲养，每天向水泥池中泼洒豆浆2次，放入圆藻，以保证鱼苗的营养供给，待鱼苗长到约5-8cm长后可开始喂饲料粉，鱼苗长到约10-12cm长后利用外周血细胞培养法、流式细胞法、血涂片法以及外形测量法对制备的杂交鱼进行染色体数目、DNA含量、血细胞大小以及外形等生物学特征的检测，对杂交后代进行筛分，杂交后代鱼中的四倍体鱼即为四倍体金冠鱼(如图1所示)。
对本实施例得到的雄性二倍体鲤鲫F2与雌性改良异源四倍体鲫鲤杂交后代经5-6个月的精心喂养，随机取样15尾，采用传统的测量方法，用电子称、两角规和游标卡尺等分别测量全长、体长、头长、头高、尾柄长、体高等可量性状；对背鳍条、臀鳍条、侧线鳞等可数性状进行记数。为消除不同个体大小对可量性状值的影响，我们将抽样所得的可量性状的比值进行计算并整理，计算了体长/全长、体高/体长、头长/体长、尾柄长/尾柄高等数值，输入Excel 中用生物学统计方法对每项比值进行统计处理，处理后的数据如表1、2所示。
表1：四倍体金冠鱼与母本改良异源四倍体鲫鲤和父本二倍体鲤鲫F2可数性状比较
表2：四倍体金冠鱼与母本改良异源四倍体鲫鲤和父本二倍体鲤鲫F2可量性状比较
由以上表1可以得出，在可数性状中，雄性二倍体鲤鲫F2与雌性改良异源四倍体鲫鲤所形成的杂交鱼，其腹鳍条、臀鳍条均与父母本无显著性差异(P>0.05)，但四倍体金冠鱼的侧线鳞、侧线上鳞介于父本二倍体鲤鲫F2和母本改良异源四倍体鲫鲤之间，而侧线下鳞和腹鳍条偏向父本。上述结果表明了杂交后代四倍体金冠鱼的可数性状介于父、母本之间，略偏向于父本。
由以上表2可以得出，在可量性状中，杂交后代四倍体金冠鱼的体高/体长、尾柄高/尾柄长均介于父母本之间，而四倍体金冠鱼的体长/全长、头高/体高均高于亲本；四倍体金冠鱼的头长/体长与父本二倍体鲤鲫F2相似。上述结果显示四倍体金冠鱼的可数性状大部分处于双亲之间。
随后，用外周血细胞培养的方法对杂交鱼的染色体数目进行鉴定，证明了雄性二倍体鲤鲫F2与雌性改良异源四倍体鲫鲤杂交后代中所产生的四倍体金冠鱼的染色体数目为200(如图2所示)。
雄性二倍体鲤鲫F2与雌性改良异源四倍体鲫鲤杂交后代，经5-6个月的养殖后，随即从后代中随机抽取十三条鱼采用流式细胞仪测定其后代的倍性。统计其后代倍性如表3所示。
表3：二倍体鲤鲫F2和四倍体金冠鱼的DNA平均含量
注：a表示比值的观察值与期待值没有显著性差异(P>0.05)
以亲本二倍体鲤鲫F2作为对照，用流式细胞仪测定雄性二倍体鲤鲫F2与雌性改良异源四倍体鲫鲤杂交后代中杂交鱼的红细胞中的DNA含量，结果分别如图3、图4所示。分析图中结果可知，图4所示杂交后代DNA平均荧光值含量约为200，该数值是图3所示对照组(对照组为二倍体)的两倍，由此可以得出杂交后代鱼的倍性为四倍体。
与此同时，通过用血涂片制片来观察杂交后代中红细胞的情况，我们用红鲫的血涂片(如图5)作为对照，对杂交鱼的血涂片进行比较，通过比较发现杂交后代血细胞中有“哑铃状”细胞核血细胞(如图6中箭头所指处)，由此可以推断出杂交后代为多倍体鱼，结合流式细胞鉴定结果和染色体制片结果，证明了雌性改良异源四倍体鲫鲤与雄性二倍体鲤鲫F2杂交产生的后代是一种四倍体鱼。
在繁殖期间，用无菌、干净的注射器吸取雄性四倍体金冠鱼的乳白色精液，注入提前预冷(4℃)的3％的戊二醛溶液中，并做好备份，放在4℃冰箱固定3～8h；然后将上述固定好的混合液轻轻摇匀后，滴一滴在提前用多聚赖氨酸处理过的载玻片中央；将上述滴加了样品的载玻片用磷酸缓冲液进行冲洗，连续3次，每次冲洗10min；随后在1％的锇酸中固定1.5 小时，用磷酸缓冲液再次冲洗3次；用提前配好的不同梯度的酒精溶液进行脱水处理后，然后用叔丁醇浸泡3h，在冷冻环境下进行干燥处理后再进行离子溅射镀金；最后用X-650(HIT- ACHI)SEM扫描电镜观察并摄影。通过精子扫描电子显微镜得到的结果如图7、图8所示，通过图7、图8可以得到四倍体金冠鱼的雄性个体能产生大小(精子头部平均直径)在2.65μm 的精子，其体积为9.63μm3，而雄性二倍体鲤鲫F2产生的精子头部平均直径为2.64μm，相应的体积为9.34μm3(如图9、图10)，这一结果为证明四倍体金冠鱼产生二倍体精子提供了重要依据。
由此可见，通过外周血细胞培养的染色体、流式细胞仪DNA含量测定、血涂片制备以及电镜扫描技术等方法说明了雄性二倍体鲤鲫F2与雌性改良异源四倍体鲫鲤的杂交后代是一种四倍体金冠鱼。
在外形方面，该四倍体金冠鱼头部有金色斑纹及体色为金黄色(四倍体金冠鱼因该特征而得名)，其还有一对较短口须，侧线鳞为30-31，鳃耙数为30-32，下咽齿式为1.4-4.1；雄性二倍体鲤鲫F2有一对短口须，侧线鳞为29-30，鳃耙数为32-35，下咽齿式为1.4-4.1；改良异源四倍体鲫鲤体色暗灰色，具有两对短须，侧线鳞为30-34，鳃耙数为32-35，下咽齿式为 1.4-4.1。
在繁殖特性上，雄性四倍体金冠鱼性成熟时间(一年)比雄性二倍体鲤鲫鱼F2性成熟时间(两年)明显提前一年，四倍体金冠鱼具有可育、生长速度快、体形优美、体色独特、抗逆能力强等优点，是一种宝贵的新型四倍体鱼种质资源，既可以用之来选育优良三倍体鱼，也可用来作为漂亮的观赏鱼类。本发明获得的四倍体金冠鱼在鱼类遗传育种等方面具有重要价值。
总的来说，本发明首次利用雌性改良异源四倍体鲫鲤与雄性二倍体鲤鲫F2进行亚科间的远缘杂交，并成功选育获得一种具备杂交优势的新型四倍体杂交鱼。该方法杂交形成的可育新型四倍体金冠鱼具有两性可育、生长速度快、体形优美、体色独特、抗逆能力强等优点，不仅可用来作为漂亮的观赏鱼类，而且提供了宝贵的四倍体鱼资源，为鱼类多倍化研究提供了很好的材料，为今后大规模制备三倍体鱼提供了重要的亲本来源，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。
利用上述得到的四倍体金冠鱼与二倍体鱼杂交培育得到三倍体鱼。
各生物学方法的实施步骤如下：
1.外周血细胞培养的染色体倍性检测法：
1)在超净工作台中配制培养基，100mL培养基含以下成分：84mL RPMI-1640，15mL小牛血清，2支PHA，1mL 0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2～ 7.4；
2)用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；
3)按每10mL培养液中加入约0.2mL抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68～72小时，培养期间，定期轻轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；
4)终止培养前24小时，在培养液中用1mL注射器滴加入10μg/mL的秋水仙碱，使终浓度为0.05～0.07μg/mL。以上步骤均需无菌操作；
5)取杂交鱼的培养物经处理后转入无菌洁净的10mL离心管中，以1500rpm离心5分钟，弃上清液；
6)向离心管中加入低渗液5mL，用吸管轻轻吹打使其混匀，然后加至9mL后，低渗45～ 60分钟；
7)加入1mL固定液(甲醇：冰醋酸约3:1)，用吸管轻轻吹打使其混匀1500rpm离心5分钟，弃上清液；
8)加入5mL固定液，轻轻混匀，静置10分钟后1000rpm离心5分钟，弃上清液；
9)重复步骤4)一次；
10)最后根据细胞数量加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1～2mL)后，然后吸取细胞悬液从50cm高处滴片，平直端起，用酒精灯外焰缓慢烘干；
11)Giemsa染液染色40～60分钟，细流水冲洗载玻片背面洗去染液，自然干燥后镜检、拍照。
2.流式细胞仪DNA含量测定法：
先用络合碘纱布将实验鱼尾静脉部位擦拭干净，用经抗凝剂润湿的1mL一次性注射器从实验鱼尾静脉血管部采血约0.2mL，注入Eppendorf管中，用移液枪将被测样品加入到新的 Eppendorf管中并将其稀释至淡黄色，然后再加入1mL细胞核提取液DAPI-A，避光条件下，反应15-20分钟。然后将样品导入20μm尼龙滤器中过滤，最后上机检测。
3.血涂片法步骤为：
1)用棉签蘸取75％酒精擦拭鱼尾静脉部位，用经抗凝剂润湿的1mL一次性注射器取 0.5mL血液，注入到无菌干燥并且装有抗凝剂的Eppendorf管中，用移液枪取一滴血液滴于玻片的一侧；
2)取一个新的无菌玻片压在血液上迅速推到载玻片的一端，使血滴均匀的铺在玻片上成一直线；
3)经空气中干燥后，滴加瑞氏染色液，使涂片被染色液覆盖；4)染色5～10分钟后，再加入磷酸缓冲液继续染3～6分钟，最后用流水轻轻冲洗载玻片背面，空气中自然晾干后，镜检。
实施例2：
一种本发明的四倍体金冠鱼品系的建立方法，包括如下步骤：在实施例1选育得到的四倍体金冠鱼中，选择腹部膨大、松软的雌性四倍体金冠鱼和生长健壮、挤压腹部能看到明显精液的雄性四倍体金冠鱼进行催产，采用两针注射法，第一针于下午4-5点对母本注射促黄体素释放激素类似物12μg/kg，对父本注射促黄体素释放激素类似物6μg/kg，间隔6h后再进行第二针注射，对母本注射绒毛膜促性腺激素24μg/kg、促黄体素释放激素类似物24μg/kg 以及垂体后叶素为1g/kg，对父本注射促黄体素释放激素类似物10μg/kg，具体注射量根据亲鱼体型大小进行适量调整；然后按雌雄配比1:2放入到水泥池中，控制水温24-25℃，直至顺利产精和产卵，进行人工干法授精，得到自交后代至少再通过两代连续自交，获得遗传性状稳定、两性可育的四倍体金冠鱼品系。
实施例3：
利用上述四倍体金冠鱼与二倍体锦鲫杂交培育得到三倍体鱼，具体方法包括如下步骤：
在繁殖期间，选择腹部膨大、松软的雌性二倍体锦鲫为母本，采用一针注射法进行催产，绒毛膜促性腺激素为600μg/kg，促黄体素释放激素类似物为6μg/kg，地欧酮为1μg/kg；选择体型健壮、发育良好、细长的雄性四倍体金冠鱼为父本，采用一针注射法，绒毛膜促性腺激素为300μg/kg，促黄体素释放激素类似物为4μg/kg，注射之后将雌雄比例为1:2搭配放入直径为15m的圆形产卵池中进行催产，池中放入一些网片和棕片，水温24℃，第二天清晨观察网片和棕片，当发现上面有大量卵子时，半小时之后，打网捕捞亲本鱼，将雌、雄鱼体表擦试干净，先将二倍体锦鲫的卵子挤入到干燥干净的瓷盆中，然后一滴一滴的挤入四倍体金冠鱼的精液，并用羽毛轻轻的搅拌，让其人工干法授精；充分授精之后，将受精卵均匀铺撒在网片上，其后将网片放入流水中进行孵化，维持水温24℃，得到三倍体鱼。
四倍体金冠鱼由于独特的体色及花纹，可以通过花色漂亮的二倍体观赏鱼进行杂交获得具有生长速度快，抗逆性强，不育的新型三倍体鱼，为获得大量的生长速度快，抗逆性强的观赏鱼提供了一种有效的途径，同时由于三倍体的不育性，对于观赏鱼的种质资源保护具有重要作用，非富了三倍体鱼的类型，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。
Claims (9)
1.一种通过远缘杂交选育四倍体金冠鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：以雌性改良异源四倍体鲫鲤为母本亲鱼，雄性二倍体鲤鲫F2为父本亲鱼，分别进行专池培育，在繁殖季节对所述母本亲鱼和父本亲鱼进行人工催产，人工干法授精，将得到的受精卵置于孵化槽中以流水孵化，待鱼苗全部孵化、出现腰点后进行饲养，再对饲养后的鱼苗通过生物学方法进行检测及筛分，得到的四倍体鱼即为四倍体金冠鱼；
所述改良异源四倍体鲫鲤由以下方法选育得到：利用雌性红鲫和雄性湘江野鲤远缘杂交，在F1代获得鲫鲤F1，将选育出来的可育的雌、雄鲫鲤F1再进行自交获得鲫鲤F2，将获得的可育雌雄个体进行自交，获得异源四倍体鲫鲤，利用所述异源四倍体鲫鲤产生的二倍体卵子，进行不经过染色体加倍的操作处理获得雌核发育二倍体鲫鲤克隆品系，利用所述雌核发育二倍体鲫鲤克隆品系产生的二倍体卵子与所述异源四倍体鲫鲤产生的二倍体精子受精，获得所述改良异源四倍体鲫鲤；
所述二倍体鲤鲫F2由以下方法选育得到：以橙黄色的锦鲤和彩色的雄性花鲫远缘杂交，获得二倍体鲤鲫F1，选育优质健壮的鲤鲫F1自交，获得所述二倍体鲤鲫F2；
所述人工催产的具体操作包括如下步骤：在当年的4月底至5月初，当水温稳定在22-24℃时，从专池培育后得到的亲鱼中挑选出腹部膨大、松软且有弹性的雌性改良异源四倍体鲫鲤作为母本，和轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性二倍体鲤鲫F2作为父本，进行人工催产，采用两针注射法，第一针于下午4-5点注射，对母本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12 μg/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物5-6 μg/kg，间隔6-8h后再进行第二针注射，对母本注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素20-25μg/kg、促黄体素释放激素类似物20-25 μg/kg以及垂体后叶素为1g/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12μg/kg；注射完毕后按2:1的数量比将父本、母本亲鱼放入同一产卵池中，并以流水刺激，直至第二天顺利产精和产卵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母本亲鱼、父本亲鱼分别进行专池培育的具体操作包括如下步骤：在当年的2月初，拉网打鱼，从中挑选性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的雌性改良异源四倍体鲫鲤和雄性二倍体鲤鲫F2作为远缘杂交的亲本，置于专池进行培育，在培育期间，时刻注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，保证繁殖期的亲本具有良好的状态，做好饲养管理工作，在繁殖期前一个月，每天以流水刺激，促进亲鱼性腺发育成熟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工干法授精的具体操作包括如下步骤：挑选能够顺利产卵的雌性改良异源四倍体鲫鲤，将其卵子挤到干净干燥的盆中，同时将雄性二倍体鲤鲫F2精液挤到同一盆中，用羽毛搅匀，以进行人工干法授精。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流水孵化的水温为20-24℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲养的具体操作包括如下步骤：待鱼苗全部孵化、出现腰点后转入事先用豆浆已培肥的水泥池中饲养，放苗后每天向水泥池中泼洒豆浆两次，放入圆藻，以保证鱼苗的营养供给，待鱼苗长到5-8cm长后开始喂饲料粉。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学方法包括：外周血细胞培养法、流式细胞法、血涂片法和外形测量法。
7.一种四倍体金冠鱼品系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：在所述权利要求1～6中任一项所述方法选育得到的四倍体金冠鱼中，选择腹部膨大、松软的雌性四倍体金冠鱼和生长健壮、挤压腹部能看到明显精液的雄性四倍体金冠鱼进行催产，采用两针注射法，第一针于下午4-5点注射，对母本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12 μg/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物5-6 μg/kg，间隔6-8h后再进行第二针注射，对母本注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素20-25μg/kg、促黄体素释放激素类似物20-25 μg/kg以及垂体后叶素为1g/kg，对父本注射的催产素为促黄体素释放激素类似物10-12μg/kg；然后按雌雄配比1:2放入到水泥池中，控制水温24-25℃，直至顺利产精和产卵，进行人工干法授精，得到自交后代至少再通过两代连续自交，获得遗传性状稳定、两性可育的四倍体金冠鱼品系。
8.一种由权利要求1-6中任一项所述方法获得的四倍体金冠鱼的应用，其特征在于，利用所述四倍体金冠鱼与二倍体鱼杂交培育得到三倍体鱼。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述四倍体金冠鱼与二倍体鱼杂交培育得到三倍体鱼的具体方法包括如下步骤：选择腹部膨大、松软的雌性二倍体锦鲫为母本，采用一针注射法进行人工催产，注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素600μg/kg、促黄体素释放激素类似物6μg/kg、地欧酮1μg/kg；选择体型健壮、发育良好、细长的雄性四倍体金冠鱼为父本，采用一针注射法进行人工催产，注射的催产素包括绒毛膜促性腺激素300μg/kg、促黄体素释放激素类似物4μg/kg，注射之后按雌雄数量比例为1:2搭配放入产卵池中进行催产，池中放入网片和棕片，当网片或棕片上出现卵粒时，半小时之后，打网捕捞亲本鱼进而收集精子和卵子以进行人工干法授精，然后将受精卵均匀铺撒在网片上放入流水中进行孵化，控制水温为24-25℃，孵化后即得到三倍体鱼。
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