CN109496922A - 一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法，在10.5℃水温条件下，在受精后的420～440分钟内，即胚胎发育的有效积温为4410～4620℃·min的范围内，在65～68.9Mpa静水压下进行压力休克处理，处理时间为5分钟，休克处理完毕后将受精卵移入至10～11℃的淡水中流水孵化。本发明的有益效果是操作简单、处理时间短、对受精卵的损伤较低，成活率高。
Description
技术领域
本发明属于鱼类多倍体育种技术领域，涉及一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法。
背景技术
虹鳟(Onchorynchus mykiss)隶属鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、大马哈鱼属(Onchorynchus)，因其性成熟个体体侧有一条宽而鲜艳的彩虹带而得名，英文名为rainbow trout，原产于北美地区，为典型的冷水性鱼类，是世界性重要经济养殖鱼类之一和水产遗传育种领域的重要研究对象。我国1959年开始引进和养殖虹鳟，由于长期的近亲繁殖以及缺乏系统的选育，导致养殖个体出现了性早熟、个体小型化、病害频发等问题，特别是近年来受进口大规格三文鱼的影响，小规格鲑鳟鱼在中国的市场价位很低，养鳟者只能进口不育的、大个体的全雌三倍体虹鳟发眼卵进行养殖以满足市场要求，因为我们目前不具备规模化生产全雌三倍体虹鳟的能力。可见，全雌三倍体虹鳟卵的规模化生产已成为虹鳟养殖业的瓶颈。
三倍体虹鳟雌性个体完全不育，避免了因性腺发育造成鱼体生长性能与肉质降低的风险，养殖效益较高；同时，不育的三倍体虹鳟逃逸到自然水域中不会形成种群，可以维持渔业生态环境的稳定，同时避免性腺成熟个体常有的死亡现象，具有市场与生态双重效益。目前，常用的鱼类多倍体诱导方法包括直接法，即采用生物法、物理法和化学法直接诱导三倍体鱼类，其中物理方法中的温度休克法和静水压法最为常用；间接法是指四倍体与二倍体杂交生产三倍体的诱导方法，间接法要求获得一定数量的四倍体虹鳟群体，相比于直接法诱导虹鳟三倍体，间接法可以持续稳定地进行100％三倍体虹鳟苗种生产；鱼类四倍体的诱导方法又包括化学方法和物理方法，化学方法使用的药物有秋水仙素、细胞松弛素B和聚乙二醇等；国内外多采用温度休克法诱导虹鳟四倍体，该方法优点是处理设备简单易于装备，缺点是对卵的伤害严重，且并不稳定，四倍体诱导率低。与热休克法相比，静水压法对受精卵的刺激相对较小，处理时间较短，也更加稳定，效果优于热休克。然而，目前我国仍然没有形成较为成熟的虹鳟多倍体诱导技术体系。
因此，基于上述的问题，本发明提供一种四倍体虹鳟制种技术方法，通过静水压法提高四倍体虹鳟诱导率、存活率，并建立我国自己成熟稳定的多倍体虹鳟优质苗种生产体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法，本发明的有益效果是在人工授精后对虹鳟受精卵实施静水压处理，阻止了受精卵第一次卵裂过程，成功得到四倍体虹鳟苗种。本发明建立了采用静水压生产虹鳟四倍体的方法，确定了四倍体虹鳟诱导的适宜起始时间、压力大小和持续时间等参数；并建立了四倍体鱼苗鉴定的方法。该方法操作简单、处理时间短、对受精卵的损伤较低，成活率高。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1，对雌、雄虹鳟分别进行人工采卵、采精，将卵子采集到盛有单盐等渗液的塑料盆中，精液采到干燥的塑料盆中，使用雌、雄亲鱼数量比例为2:1；
步骤2，人工授精，将精液倒入到盛有卵子的塑料盆中，用羽毛轻轻搅拌15～20秒使精卵混合均匀，并开始计时，作为受精的起点；
步骤3，静置3～5分钟充分受精后，加少许清水多次洗卵，洗卵过程中尽可能去除过量的精液、未受精的死卵和血块等杂物；
步骤4，对受精卵实施10.5℃冷流水吸水膨胀；
步骤5，待受精后420～440分钟时，实施梯度升压法，即将受精卵倒入自制的塑料小桶内，提前一分钟放入盛有清水的加压室内，每加压10Mpa，暂停10秒，以减少压力对受精卵的损伤；
步骤6，实施65～68.9Mpa的压力大小、持续时间5分钟，阻止受精卵第一次卵裂过程，诱导产生四倍体受精卵；
步骤7，实施梯度降压，即每降压10Mpa，暂停10秒；
步骤8，实施冷流水10.5℃孵化至孵化积温达220度日，胚胎出现黑色眼点，在此期间孵化室内进行遮光处理，保证受精卵在孵化阶段所需要的暗光条件，并减少对卵的震动，每周使用甲基蓝对受精卵进行杀菌处理；
步骤9，实施冷流水10.5℃至孵化积温达600度日仔鱼孵化出膜；
步骤10，在流水环境下对初浮仔鱼实施开食驯饲30天，育成四倍体稚鱼。
进一步，水温为恒定的10.5℃，温差在±0.5℃。
进一步，四倍体鱼苗采用流式细胞仪(CytoFLEX S)进行四倍体虹鳟的倍性鉴定，采用正常二倍体虹鳟作对照，通过分析红细胞细胞核中相对DNA含量确定倍性，四倍体虹鳟红细胞的DNA含量为二倍体的2.0倍。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
选择在68.9Mpa的压力大小、持续5分钟的诱导强度下，在10.5℃的水温条件下进行起始时间的确定，起始时间选择在240～520分钟范围，每20分钟一个实验梯度，统计发眼率、上浮率、四倍体率。结果表明，68.9Mpa的压力大小、持续5分钟的诱导强度对胚胎的致死作用较为显著，各实验组发眼率与对照组存在显著性差异，其中对照组的发眼率为92.4％，实验组中第7组(起始时间为360分钟)的发眼率最高，为26.8％；起始时间在240～320分钟的各处理组的胚胎均未出现眼点，具体表现为部分胚胎发白死亡，仍有部分胚胎呈透明状的死卵；340～440分钟各组发眼率较高，平均在20％以上，但在除去440分钟处理组其余各组仔鱼在上浮阶段后陆续死亡；检测440～520分钟各组31尾仔鱼，四倍体率为58％，嵌合体率为13％。综合发眼率、上浮率、四倍体率三个数据，可以得出初步结论，在340～520分钟的起始时间范围内对虹鳟四倍体诱导能够获得一定数量的存活仔鱼，且最优诱导虹鳟四倍体的起始时间在440分钟附近，即最佳诱导有效积温为4620℃·min。
选择在65Mpa的压力大小、持续5分钟的诱导强度下，在10.5℃的水温条件下进行起始时间的确定，起始时间选择在240～520分钟范围内，每20分钟一个实验梯度，统计发眼率、上浮率、四倍体率。结果表明，与68.9Mpa的压力大小相比，在65Mpa的压力大小下各组发眼率有了显著地提高；各组之间子代存活率差异明显，在孵化前期，第1～5(起始时间为240～320分钟)组死亡率较高，第6～10组(起始时间为340～420分钟)几乎没有死卵，第11～15组(起始时间为440～520分钟)只有少量死卵，因此在受精后340～420分钟的时间范围内诱导四倍体的效果最优；至发眼期时，四倍体1～5组(起始时间为240～320分钟)发眼率为0，6～10组(起始时间为340～420分钟)发眼率均在20％以上，第6组(起始时间为340分钟)发眼率最高，为37.1％，四倍体11～15各组(起始时间为440～520分钟)发眼率为0；检测第6～10组(起始时间为340～420分钟)15尾仔鱼倍性，四倍体率为20％，嵌合体率为47％，因此最优的四倍体诱导处理起始时间在340～420min范围内，即最佳诱导有效积温范围为3570～4410℃·min。
最后，采取正交实验法，选择在受精后的不同时间(340、380、420分钟)，对虹鳟受精卵施加(60、65、70Mpa)的压力大小，持续时间设定为(3、5、7分钟)进行四倍体诱导，实验在10.5℃的水温条件下进行，统计发眼率、上浮率和四倍体率。结果显示，第1～3处理组(起始时间为340分钟)在出现眼点之前全部死亡，第4～6处理组(起始时间为380分钟)仅有少量胚胎出现眼点，且在上浮以后陆续死亡，第7～9处理组(起始时间为420分钟)的存活率最高，表明三个实验因素中的起始时间对子代存活率的影响作用最大，且在420分钟进行诱导的效果最优；检测第7组中7尾仔鱼倍性，有2尾为四倍体虹鳟，其诱导条件为起始时间420分钟、压力大小60、持续时间7分钟。
四倍体虹鳟的鉴定方法：
通过DNA含量鉴定四倍体；
采用流式细胞仪(CytoFLEX S)进行四倍体虹鳟的倍性鉴定，采用正常二倍体虹鳟作对照，通过分析红细胞细胞核中相对DNA含量确定倍性，四倍体虹鳟红细胞的DNA含量为二倍体的2.0倍左右；具体实施步骤包括：
(1)单细胞悬液的制备：将虹鳟鱼苗的尾柄剪断，迅速插入到盛有1mL0.01M的PBS缓冲溶液的分子管中(pH7.2-7.4)，轻轻挤压鱼身，使血液缓慢流出，取血量在10μL左右，然后摇匀，在3000rpm下离心10s，洗涤血细胞，倒掉PBS，再加入1mL的PBS，混匀。
(2)单细胞悬液的固定：使用一次性塑料吸管吸取单细胞悬液，缓慢滴加到3mL预冷的无水乙醇中，4℃过夜保存(至少固定3h)。
(3)染色：将收集到的细胞悬液2000rpm离心10min，弃上清液，PBS洗涤2次,显微镜下将细胞浓度调至1×106个/mL，加入20μL，50μg/mL的RNA酶，30min后再加入20-50μL，1g/L的PI染液，置于4℃冰箱中染色30min，使用300目筛绢过滤。
(4)上机检测，每个样本检测的细胞数目>104个，测量所得的数据和结果由计算机进行处理。
综上，在10.5℃水温条件下，虹鳟四倍体鱼苗的最佳诱导条件是在受精后420～440分钟(有效积温为4410～4620℃·min)范围内将受精卵放置在65～68.9Mpa压力的环境下持续处理5分钟。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1，对雌、雄虹鳟分别进行人工采卵、采精，将卵子采集到盛有单盐等渗液的塑料盆中，精液采到干燥的塑料盆中，使用雌、雄亲鱼数量比例为2:1；
步骤2，人工授精，将精液倒入到盛有卵子的塑料盆中，用羽毛轻轻搅拌15～20秒使精卵混合均匀，并开始计时，作为受精的起点；
步骤3，静置3～5分钟充分受精后，加少许清水多次洗卵，洗卵过程中尽可能去除过量的精液、未受精的死卵和血块等杂物；
步骤4，对受精卵实施10.5℃冷流水吸水膨胀；
步骤5，待受精后420～440分钟时，实施梯度升压法，即将受精卵倒入自制的塑料小桶内，提前一分钟放入盛有清水的加压室内，每加压10Mpa，暂停10秒，以减少压力对受精卵的损伤；
步骤6，实施65～68.9Mpa的压力大小、持续时间5分钟，阻止受精卵第一次卵裂过程，诱导产生四倍体受精卵；
步骤7，实施梯度降压，即每降压10Mpa，暂停10秒；
步骤8，实施冷流水10.5℃孵化至孵化积温达220度日，胚胎出现黑色眼点，在此期间孵化室内进行遮光处理，保证受精卵在孵化阶段所需要的暗光条件，并减少对卵的震动，每周使用甲基蓝对受精卵进行杀菌处理；
步骤9，实施冷流水10.5℃至孵化积温达600度日仔鱼孵化出膜；
步骤10，在流水环境下对初浮仔鱼实施开食驯饲30天，育成四倍体稚鱼。
2.按照权利要求1所述一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法，其特征在于：水温为恒定的10.5℃，温差在±0.5℃。
3.按照权利要求1所述一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法，其特征在于：所述四倍体鱼苗采用流式细胞仪进行四倍体虹鳟的倍性鉴定，采用正常二倍体虹鳟作对照，通过分析红细胞细胞核中相对DNA含量确定倍性，四倍体虹鳟红细胞的DNA含量为二倍体的2.0倍。
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