CN114467808A - 源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法，以鳙鱼为母本，黄尾密鲴为父本，在繁殖季节对母本注射促黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素和垂体的混合催产剂，然后对父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产；注射完毕后待亲鱼发情后进行人工授精，流水孵化，饲养，检测筛分，即获得所述的天然雌核发育鳙鱼。本发明无需进行精子灭活及卵子加倍等技术处理就能得到雌核发育后代，明显的优势是受精率高，孵化率高，能获得大量的两性可育的天然雌核发育鳙鱼，极大的减少了育种工作量；通过该方法制备获得生长速度快，抗病强，肉质好，杂食性的两性可育的天然雌核发育鳙鱼。
Description
技术领域
本发明属于鱼类远缘杂交育种的技术领域，尤其涉及一种源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法。
背景技术
远缘杂交是指不同种间或者属间及其以上的物种之间的杂交，它可以整合不同物种的基因组，从而使杂交后代在染色体组水平上产生变化。可产生基因型和表型发生改变的杂交后代。远缘杂交也可以产生雌核发育后代，是产生天然雌核发育后代的一个重要途径。且这个方法产生的天然雌核发育后代会出现异精杂交效应，从而获得在肉质、抗病性、抗逆性及生长速度等方面都有良好表现的后代，因此可以通过远缘杂交来形成新型两性可育的天然雌核发育后代，为鱼类遗传育种提供了独特的种质资源库。而在如何用现有的技术上研究形成新型天然雌核发育鱼，是我们亟须解决的问题。
鳙鱼(Aristichthvs nobilis)属鲤形目，鲤科，鳙属，又称花鲢、胖头鱼，广泛分布于中国淡水水域，是最常见的重要经济鱼种之一，有“水中清道夫”的雅称，能调节水质。同时是中国四大家鱼之一，且是中国特有鱼类。具有丰富的营养成分，是属于高蛋白、低脂肪、低胆固醇的鱼类，其中大部分蛋白质是人体必需氨基酸的理想来源，大部分脂肪是不饱和脂肪酸的理想来源。每100克鳙鱼中含蛋白质15.3克、脂肪0.9克。另外，鳙鱼还含有维生素B2、维生素C、钙、磷、铁等营养物质。2020年鳙鱼的年产量(3130301吨)比2019年鳙鱼年产量同比增加0.92％，2019年鳙鱼的年产量(3101637吨)比2018年(3096426吨)同比增长了0.17％，仅次于草鱼的年产量。以上一系列数据表明市场对鳙鱼的需求在正在大幅度的增加。但是，由于鳙鱼以往都是以浮游动物为主，但水体天然饵料资源缺乏的限制，鳙鱼产量及商品规格远远不能满足市场对商品鳙鱼日益增长的需求。
且在之前的研究技术中，要得到天然的雌核发育后代操作过程繁琐，对精源亲本、精子灭活方法和染色体加倍方法的选择要求十分严格，且得到的雌核发育后代都是雌性后代。因此，研究鳙鱼与黄尾密鲴之间远缘杂交获得新型的两性可育的天然雌核发育鳙鱼在鱼类生产实践与遗传育种具有重要的研究意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种操作简单、可规模化获得两性可育的天然雌核发育鳙鱼的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法，以鳙鱼为母本，黄尾密鲴为父本，在繁殖季节选择腹部膨胀、松软且富有弹性的母本亲鱼进行人工催产，母本注射促黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素和垂体的混合催产剂，其促黄体素释放激素类似物的剂量为7-11μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为300-600IU/kg，垂体的剂量为1-2mg/kg；然后对父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，绒毛膜促性腺激素的用量为200-300IU/kg，促黄体素释放激素类似物的剂量为5-6μg/kg；注射完毕后将亲鱼放入产卵池中，待亲鱼发情后进行人工授精，然后将受精卵在孵化池中进行流水孵化，待鱼苗孵化完后进行饲养，再对饲养后的鱼进行检测筛分，从鳙鱼和黄尾密鲴的杂交后代中获得所述的天然雌核发育鳙鱼。
黄尾密鲴(Xenocypris daviodi Bleeker)属鲤形目，鲤科，密鲴亚科；黄尾密有鱼肉质细嫩可口、饲养简易、生长快、耐寒、耐低氧等优良特性。以黄尾密鲴作为杂交父本与杂交母本鳙鱼通过远缘杂交产生雌核发育后代，通过产生异精效应可以使杂交后代天然雌核发育鳙鱼拥有黄尾密鲴的多种优良特性，进而获得生长速度快、肉质好、抗病、食性为杂食性的两性可育的天然雌核发育鳙鱼。
在本发明中，通过筛选不同的父本亲鱼与母本亲鱼鳙鱼杂交的受精率，孵化率，杂交后代的存活率得到了黄尾密鲴与鳙鱼这一对好的杂交体系。再结合改变催产剂的种类和注射剂量，进而获得高质量的母本卵子及父本精子，进而通过新型的授精、孵化等养殖技术，最终在杂交后代中形成一种受精率高，孵化率高，存活率高的新型的两性可育的天然雌核发育鳙鱼。在对杂交后代通过一系列的试验证实，在杂交后代中的天然雌核发育鳙鱼中发现了来自父本亲鱼黄尾密鲴的染色体片段，即在天然雌核发育过程中产生了异精效应，异精效应会使天然雌核发育鳙鱼具有了父本亲鱼黄尾密鲴的一些优良特性，主要是在养殖过程中表现出来，这对改良鳙鱼的种质资源是至关重要的。
上述的规模化制备方法，优选的，在进行人工催产之前，在繁殖季节前繁殖期前2-3个月，挑选性成熟特征明显、体格健硕、体表无伤、无传染病史的雌性鳙鱼及雄性黄尾密鲴作为亲本投放在水池中单独饲养，在繁殖期前的1至2个月，喂食调整为精饵喂食，并每天用流水进行刺激，以促进亲本鱼性腺的成熟。
优选的，在当年的5月下旬到6月上旬，当水温稳定在20℃以上时进行人工催产。
优选的，先注射母本亲鱼，在3h后挑选状态好，轻挤腹部有白色精液挤出的父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产；对母本亲鱼和父本亲鱼注射完催产剂之后，按雌鱼和雄鱼1︰3-5的数量比例将亲鱼放在同一产卵池内，等待产卵产精。
优选的，所述人工干法授精的具体操作包括如下步骤：擦去父本亲鱼和母本亲鱼体表覆盖的水，将精液和卵子挤入干燥受精盆中，同时用羽毛快速搅拌。
优选的，所述流水孵化受精卵时控制水温在19-20℃；待鱼苗完全孵化后，在孵化池中培育2-3天，等到鱼苗出现腰点后转移至预先育肥的水池中进行饲养；观察鱼苗的生长情况，在鱼苗下池2-3天后即可泼洒现磨豆浆进行饲养。
优选的，所述检测筛分的方法包括鱼体外形测量法、肾脏组织和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法、血细胞的形态鉴定以及流式细胞DNA含量测定法。
为了满足市场的需求，我们通过远缘杂交的育种技术，选择鳙鱼作为杂交母本亲鱼，黄尾密鲴作为杂交父本亲，制备得到的雌核发育鳙鱼就很大程度的解决食性这一难题。该发明省略了灭活精子，对卵子加倍的人工雌核发育操作，在正常的授精中获得两性可育的天然雌核发育鳙鱼，很大程度上解决了这一难题，解决了天然雌核发育鳙鱼在生产实践中应用的限制，可轻松获得大量的两性可育的天然雌核发育鳙鱼，同时也获得了少量的鳙鲴杂交。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的制备方法，无需进行精子灭活及卵子加倍等技术处理就能得到雌核发育后代，明显的优势是受精率高(90.56％)，孵化率高(87.36％)，能获得大量的两性可育的天然雌核发育鳙鱼，极大的减少了育种工作量；通过该方法制备获得生长速度快，抗病强，肉质好，杂食性，调节水质的两性可育的天然雌核发育鳙鱼。
2、本发明获得的天然雌核发育鳙鱼继承了鳙鱼蛋白质、脂质和矿物质丰富的优良性状，还拥有了抗病性，杂食性等杂交优势；本发明不仅能够使得到的杂交后代同时拥有天然的雌核发育鳙鱼，为广大市场提供了新的优良鱼类品种，更为淡水鱼类品种培养和选育提供了珍惜的资源，在研究淡水鱼类物种进化和遗传育种方面具有重要的生物学意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是鳙鱼的照片；
图2是黄尾密鲴的照片；
图3是天然雌核发育鳙鱼的照片；
图4是鳙鲴杂交鱼的照片；
图5是鳙鱼的染色体图；
图6是黄尾密鲴的染色体图；
图7是天然雌核发育鳙鱼的染色体图；
图8是鳙鲴杂交鱼的染色体图；
图9是鳙鲂杂交鱼的照片；
图10是鳙鲌杂交鱼的照片；
图11是鲤鱼和黄尾密鲴杂交鱼的图片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法，包括如下步骤：
(1)在繁殖期前2-3个月，挑选性成熟特征明显、体格健硕、体表无伤、无传染病史的雌性鳙鱼及雄性黄尾密鲴作为亲本投放在水池中单独饲养，在繁殖期前的1到2个月，喂食调整为精细饵料进行专门喂食，并每天用流水进行刺激，以促进亲鱼性腺的发育成熟。
(2)在同年的5-6月，其水温持续稳定在20℃以上时对亲鱼进行人工催产，用人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，所述促黄体素释放激素类似物的剂量为7-11μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为300-600IU/kg；在注射母本亲鱼的3h后对父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂，其注射剂量是母本亲鱼的一半。全部注射完毕后按雌雄亲鱼1：3或1：5的数量比，把母本亲鱼和父本亲鱼放入面积为80cm2-90cm2的同一产卵池中观察。
(3)在观察步骤(2)处理过的亲鱼发情后用质地柔软的网打捞上来，用人工干法授精。即在发情的母本亲鱼中选择腹部膨大、轻挤腹部有卵粒流出、产卵顺利、产卵量大的雌性鳙鱼，用手腹轻挤母本亲鱼腹部，把成熟的卵子挤入干净的授精盆中，同时选择轻挤精液流出，产精量大的黄尾密鲴，轻挤腹部，使白色精液挤入盆中，用干燥的羽毛快速轻轻的搅匀1-2min，完成授精。迅速将得到的受精卵放置于水温恒定在19℃-20℃的孵化槽中进行流水孵化，孵化后得到的鳙鱼与黄尾密鲴的杂交后代鱼苗。
(4)将步骤(3)得到的鱼苗在完全出苗后，在孵化池中再培育2-3天，待鱼苗出现腰点后转移至事先育肥的池塘当中；在鱼苗下池2天后开始泼洒豆浆，要求豆浆磨碎均匀、质地细粒，喂食频率为每天1-2次，直到鱼苗有自主摄食的能力。
对杂交鱼苗饲养3-4个月后，随机捞取鱼苗对其生物学相关的数据进行测量分析，然后分别与母本鳙鱼和父本黄尾密鲴成鱼大的各项已生物学数据进行比较，结果如表1，表2所示：
表1：鳙鱼、黄尾密鲴及杂交后代的可数性状比较(单位：片或条)
表2：鳙鱼、黄尾密鲴及杂交后代的可量性状比较(单位：片或条)
鳙鱼、黄尾密鲴、雌核发育鳙、鳙鲴杂交鱼的实物照片分别如图1、图2、图3和图4所示。鳙鱼、黄尾密鲴、雌核发育鳙、鳙鲴杂交鱼的染色体图分别见图5、图6、图7和图8。此外，通过染色体实验和血涂片实验证明了天然雌核发育鳙鱼(2n＝48)和鳙鱼(2n＝48)杂交鱼为二倍体。通过养殖实验发现，天然雌核发育鳙鱼具有生长速度快，抗性强，肉质好等优点。
作为对比试验，本发明还采用了鳙鱼作为母本与团头鲂作为父本，其杂交后代中出现二倍体鳙鲂杂交鱼(见图9)，未见天然雌核发育后代；鳙鱼作为母本与翘嘴红鲌作为父本进行了杂交，后代只出现鳙鲌杂交鱼(见图10)，也未见天然雌核发育后代；同时本发明也以鲤鱼为母本，黄尾密鲴为父本进行远缘杂交，杂交后代中只有同源二倍体类红鲫(见图11)，没有出现天然雌核发育鲤鱼。只有鳙鱼与黄尾密鲴远缘杂交才出现了大量的天然的雌核发育鳙鱼。
此外，本发明还针对催产剂及其注射剂量进行了多种不同剂量的搭配方式的对比试验，发现以母本的剂量7-11μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为500-600IU/kg，垂体的剂量为1.5-1.8mg/kg；父本绒毛膜促性腺激素的用量为250-300IU/kg，促黄体素释放激素类似物的剂量为5-6ug/kg，此时获得的天然雌核发育鳙鱼的产量是较高的。
本发明的制备方法，通过利用鳙鱼和黄尾密鲴远缘杂交获得了大量的天然雌核发育鳙鱼和鳙鲴杂交鱼。操作简单，后代能够规模化生产。并结合催产剂注射次数和种类剂量，进而获得高质量的母本卵子及父本精子，进而通过授精、孵化等养殖技术，在杂交后代中形成一种新型的两性可育的天然雌核发育鳙鱼，通常雌核发育创造的后代少，时间成本大，人力耗费大，技术没有完全突破。但这整个制备过程中不需实行精子灭活及卵子加倍等技术处理，而且这个制备方法在受精率、繁殖率和孵化率都明显的提高了。这在很大程度减少了工作量，加快了制备新鱼的研究进程。
此外，通过本发明的制备方法得到的新型天然雌核发育鳙鱼，在外形及生物学特性上与母本鳙鱼比较相近，其上下咽齿与母本鳙鱼一致，为齿面扁平光滑，只有一行齿，其齿式为4/4。其天然雌核发育鳙鱼的新型优良性状为两性可育，具有生长速度快，抗病强，肉质好，杂食性，调节水质等。远缘杂交雌核发育获得后代，是具有纯合效应和杂交效应，这在遗传育种与生产实践等方面具有重要意义；本发明获得的两性可育的天然雌核发育鳙鱼是一种优秀的种质资源，为大规模制备鳙鱼提供了大量的亲本来源，可以经过自交，杂交再获得另外的改良鳙鱼品系，为改良鳙鱼的种质资源提供了非常可观的科研前景。
Claims (8)
1.一种源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法，其特征在于，以鳙鱼为母本，黄尾密鲴为父本，在繁殖季节选择腹部膨胀、松软且富有弹性的母本亲鱼进行人工催产，母本注射促黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素和垂体的混合催产剂，其促黄体素释放激素类似物的剂量为7-11μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为300-600IU/kg，垂体的剂量为1-2mg/kg；然后对父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，绒毛膜促性腺激素的用量为200-300IU/kg，促黄体素释放激素类似物的剂量为5-6μg/kg；注射完毕后将亲鱼放入产卵池中，待亲鱼发情后进行人工授精，然后将受精卵在孵化池中进行流水孵化，待鱼苗孵化完后进行饲养，再对饲养后的鱼进行检测筛分，从鳙鱼和黄尾密鲴的杂交后代中获得所述的天然雌核发育鳙鱼。
2.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，所述母本注射促黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素和垂体的混合催产剂，其促黄体素释放激素类似物的剂量为7-11μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为500-600IU/kg，垂体的剂量为1.5-1.8mg/kg；然后对父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，绒毛膜促性腺激素的用量为250-300IU/kg，促黄体素释放激素类似物的剂量为5-6μg/kg。
3.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，在进行人工催产之前，在繁殖季节前繁殖期前2-3个月，挑选性成熟特征明显、体格健硕、体表无伤、无传染病史的雌性鳙鱼及雄性黄尾密鲴作为亲本投放在水池中单独饲养，在繁殖期前的1至2个月，喂食调整为精饵喂食，并每天用流水进行刺激，以促进亲本鱼性腺的成熟。
4.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，在当年的5月下旬到6月上旬，当水温稳定在20℃以上时进行人工催产。
5.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，先注射母本亲鱼，在3h后挑选状态好，轻挤腹部有白色精液挤出的父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产；对母本亲鱼和父本亲鱼注射完催产剂之后，按雌鱼和雄鱼1︰3-5的数量比例将亲鱼放在同一产卵池内，等待产卵产精。
6.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，所述人工干法授精的具体操作包括如下步骤：擦去父本亲鱼和母本亲鱼体表覆盖的水，将精液和卵子挤入干燥受精盆中，同时用羽毛快速搅拌。
7.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，所述流水孵化受精卵时控制水温在19-20℃；待鱼苗完全孵化后，在孵化池中培育2-3天，等到鱼苗出现腰点后转移至预先育肥的水池中进行饲养；观察鱼苗的生长情况，在鱼苗下池2-3天后即可泼洒现磨豆浆进行饲养。
8.根据权利要求1所述的规模化制备方法，其特征在于，所述检测筛分的方法包括鱼体外形测量法、肾脏组织和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法。
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